JPH04164098A - 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１］

【産業上の利用分野】

この発明は、アミノ酸が置換された顆粒球コロニー刺激
因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）ポリペプチド誘導体の化学修飾に関
し、この修飾はＧ−Ｃ３Ｆの化学的及び／又は生理学的
性質を変えることのできるものである。 ［０００２］

【従来の技術】

ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆは、造血促進因子の一つであり、ヒト膀
胱癌細胞系５６３７　（ＡＴＣＣＨＴ８−９）の培養液
中に存在していることが示されている（ウェルト等：Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ
、Ａ、　８２．１５２６−１５３０．　（１９８５））
　。またこの遺伝子をコードするＤＮＡ配列が決定され
（特表昭６３−５００６３６　）、遺伝子組換えによる
ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆの生産が可能となっている。 ［０００３］ ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆは、通常の造血障害の治療や化学療法又
は放射線療法による造血障害の治療、骨髄移植時或は創
傷治癒熱症治療及び細菌性炎症治療に有効である（ウェ
ルト等；前述）。 肋間＋４−１６４０９８　（３） ［０００４］ 一方、一般に生理活性蛋白質を投与した時に、生体内に
おけるクリアランスが速いために、その薬効が短時間し
か得られないことがある。また、蛋白質の疎水性が高い
場合には、その安定性に問題が生じる場合がある。 ［０００５］ この様な血中停滞時間の延長や安定性の改善、或いは抗
原性の消失を目的として、ポリエチレングリコールで生
理活性蛋白質を修飾する方法が知られている。 例えば、特開昭６２−２８９５２２では、ポリエチレン
グリコール等で修飾したＴＮＦの免疫原性の低下につい
て開示されている。また、特表昭６２−５０３１７１で
は、ポリエチレングリコール等で修飾したＩＬ−２、Ｉ
ＦＮ−βの水溶液中での凝集性の低下、血中半減期の延
長、免疫原性の減少が開示されている。この他にもプラ
スミノーゲン活性化因子（特開昭６３−６０９３８）や
ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＳＯＤ　（特開昭６３−１０８
００）並びにＩＡＰ（特開昭６３−１２６９００）で、
ポリエチレングリコール修飾による血中半減期の延長或
は抗原性、免疫原性の消失が開示されている。また、Ｇ
−Ｃ３Ｆについても、ポリエチレングリコール修飾によ
る保存安定性の向上、血中停滞時間の延長等についての
報告がなされている（特開平１−３１６４００）。 ［０００６］

【発明が解決しようとする課題】

ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆを体内に投与した時、生体内における血
中停滞時間を延長し、その結果、期待し得る薬効の持続
性をより高めること、熱安定性及び収率を向上させるこ
とが望まれている。 ［０００７］

【課題を解決するための手段】

ヒトＧ−Ｃ３Ｆにおけるこの様な問題を解決すべく、本
発明者等は検討を重ねた結果、１７位のシスティンを他
のアミノ酸に置換したヒトＧ−Ｃ５Ｆポリペプチド誘導
体（以下、単に「Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体」という）にポリエ
チレングリコールを結合させることによって、上記課題
を解決できることを見出し、本発明に到達した。 ［０００８］ ［具体的な説明］ 本発明におけるヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体は、遺伝子組換え
によって大腸菌、動物細胞等の宿主を形質転換して得た
形質転換体から産生せしめ単離精製して得られたもので
あれば、いずれのものでも使用することができる。しか
し、それらの中でも純度良く均質大量に入手できる、配
列番号１のアミノ酸配列（但し、Ｎ末端側の先頭に更に
Ｍｅｔが結合していてもよく、１７番目のＸａａはＣｙ
ｓ以外のアミノ酸を指す）を有する遺伝子組換え大腸菌
により産生されたヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体が特に好ましい
。更には、Ｎ末端側の先頭に更にＭｅｔが結合し、かつ
、１７番目のアミノ酸がアラニンである誘導体（Ｇ−Ｃ
Ｓ　Ｆ−Ａ１ａ１７　）が好ましい。 ［０００９３ 本発明において、前記ヒトＧ−Ｃ３Ｆ誘導体とポリエチ
レングリコールとは、ポリペプチドのアミノ酸残基を介
して互いに共有結合しているのが好ましい。該残基は遊
離アミノ基等を有する任意の反応性アミノ酸であり、活
性化されたポリエチレングリコールの反応性基がこれら
遊離アミノ基等に連結される。遊離アミン基を有するア
ミノ酸残基としてはリジン或いはＮ末端アミノ酸残基が
挙げられる。 ［００１０］ 使用するポリエチレングリコールの分子量は特定のもの
に限定されないが、通常的５００〜３０．０００、好ま
しくは約４．０００〜２０．０００のものが用いられる
。 ［００１１］ ポリエチレングリコールは、末端反応性基（スペーサー
）を介してヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体上に結合される。スペ
ーサーを有するポリエチレングリコールを、活性型ポリ
エチレングリコールと称する。スペーサーは、例えば遊
離アミノ基とポリエチレングリコールとの結合を仲介す
るもの等が挙げられる。遊離アミノ基と結合する活性型
ポリエチレングリコールとして、例えば次式で表される
、［００１２］

【化１】 ［００１３］ メトキシポリエチレングリコールのコハク酸エステルを
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化したメトキ
シポリエチレングリコールスクシニミジルスクシネート
が使われる。 ［００１４］ または、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルと
塩化シアヌール酸より合成された、下式に示す活性型ポ
リエチレングリコール（２，４−ビス（Ｏ−メトキシポ
リエチレングリコール）−６−クロロ−３−）リアジン
）が使われる。 ［００１５］

【化２】 ［００１６］ 共有結合修飾反応は、生物学的に活性な材料を活性型ポ
リエチレングリコールと反応せしめるために一般に使用
される適当な任意の方法により実施し得る。ヒトＧ−Ｃ
３Ｆ誘導体上の反応性アミノ酸が遊離アミノ基を有する
アミノ酸残基である場合には、好ましくはｐＨ７，５〜
１０．０において行われる。該反応は、例えばリン酸塩
、ホウ酸塩等の緩衝液中ｐＨ７，５〜１０．０、温度４
〜３７℃で１〜５時間行なう。ヒトＧ−Ｃ３Ｆの遊離ア
ミノ基に対し、活性型ポリエチレングリコールを１〜２
００倍モル量、好ましくは５〜５０倍モル量用いる。 ［００１７］ なお、アミノ酸残基の修飾率は、上記の活性型ポリエチ
レングリコールの使用量に応じ自由に変動させることが
できる。 ［００１８］ 所望により、反応液は、透析、塩析、限外ろ過、イオン
交換クロマトグラフィゲルろ過、電気泳動なと、通常の
蛋白質の精製法で精製し、目的とするポリエチレングリ
コール修飾ヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体を得ることができる。 特にイオン交換クロマトグラフィーは、ポリエチレング
リコール及び未修飾のヒトＧ−Ｃ３Ｆ誘導体の除去に有
効である。また、所望によりイオン交換クロマトグラフ
ィーあるいはゲルろ過クロマトグラフィー等を用いるこ
とにより、修飾の程度（結合数）が均一なポリエチレン
グリコール修飾ヒトＧ−Ｃ３Ｆ誘導体を精製することが
できる。 ［００１９］

【作用】

本発明のポリエチレングリコール修飾ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ誘
導体は、ポリエチレングリコール修飾Ｇ−Ｃ５Ｆ以上に
熱安定性の増大や収率の向上などの顕著な効果が認めら
れている。本発明のポリエチレングリコール修飾ヒトＧ
−Ｃ３Ｆ誘導体は、未修飾ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体、並び
に未修飾ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆと本質的に同様の生物学的活性
を有しているため、未修飾ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆと同様の用途
に有効である。即ち、好中球を増加させるという生物学
的活性により、通常の造血障害の治療や化学療法又は放
射線療法による造血障害の治療、骨髄移植時或は感染症
治療に有効である。 ［００２０］ ポリエチレングリコール修飾ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体は、
医学上許容可能な希釈剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等と調
合することにより、患者に投与可能な製剤として用いる
ことができる。 ［００２１］ ポリエチレングリコール修飾ヒトＧ−Ｃ３Ｆ誘導体を有
効成分とする製剤の投与方法は、治療目的に応じて変化
し得るが、皮下、筋肉内及び静脈への注射、或は経口に
よって実施される。投与量は、その対象となる疾患及び
患者の病状に合わせて決めることができるが、注射の場
合はヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体重量として通常成人−人当た
り０．１μｇ〜５　ｍｇ、経口の場合には同じ＜　０．
１ｍｇ〜５ｇを投与することができる。 ［００２２］

【実施例】

以下の実施例で本発明を具体的に説明するが、本発明は
これらによって制限されるものではない。 ［００２３］ 後述の参考例で得られた、１７番目のシスティンがアラ
ニンに置換されたヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体（以下［ヒトＧ
−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７　Ｊという）を修飾対象とした
。 修飾にはポリエチレングリコールを原料とし、そのコハ
ク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活
性化して得た平均分子量が約４．５００のメトキシポリ
エチレングリコールスクシニミジルスクシネート（日本
油脂製）（活性化ＰＥＧ１と称する）を使用した。 ［００２４］ ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７を０．２５Ｍホウ酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８，０）中で、活性化ＰＥＧＩと４
℃で１時間反応させた。活性化ＰＥＧ１量は、ヒ）Ｇ−
Ｃ３Ｆ−Ａ１ａ１７中の遊離アミノ基に対して４０倍量
を用いた。生成物は、予め１０ｍＭ　　ＮＨＨＣＯで平
衡化させた５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　２５で緩衝液交換
をした後、ＤＥＡＥイ第ン交換クロマトグラフィーを用
いて、種々の形のポリエチレングリコール修飾Ｇ−Ｃ３
Ｆ−Ａｌａ１７　　（ＰＥＧ修飾Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ
１７　）を試薬及び必要に応じ未反応Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａ
１ａ１７から分離した。この反応で得られたＰＥＧ修飾
Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体を、Ｐ　Ｅ　Ｇ　（４５００）　Ｇ−
ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７という。 ［００２５］ 反応物を、Ｌａｅｍｍｌ　ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　
２２７　　ｐｐ、　６８０　（１９７０）　）に準じて
５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色を行なった。染色
の後に、各ゲルの各レーンについてスキャニングを行な
った。測定には高滓クロマトスキャナ（Ｃ３−９３０）
を用いた。スキャニングの結果から求めた平均分子量は
４７にであり、その分布は２６Ｋ（１８％）　、３４Ｋ
　（３１％）　、５４Ｋ　（３１％）及び７４Ｋ　（２
０％）であった。なお、これらは、と）　Ｇ−ＣＳ　Ｆ
−Ａｌａ１７に１分子〜多分子の活性型ＰＥＧが結合し
たものの混合物であり、イオン交換クロマトグラフィー
　あるいはゲルろ過クロマトグラフィー等を用いること
により、修飾の程度（結合数）に応じて更に分離するこ
とができる。 ［００２６］ 修飾対象のヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７は、実施例１
に示したものと同じである。 修飾には原料のポリエチレングリコールをポリエチレン
グリコールモノメチルエーテルとし塩化シアヌール酸と
反応させた、化２に示す平均分子量的１０．０００の活
性型ポリエチレングリコール（生化学工業製）（活性化
ＰＥＧ２と称する）を使用した。 ［００２７］ ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７２０ｍｇを、０．ＩＭホ
ウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ１０，０）中で、活性化Ｐ
ＥＧ２と室温で１時間反応させた。活性化ＰＥＧ２量ば
、ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ中の遊離アミノ基に対して５倍量を用
いた。生成物は、予め１０ｍＭ　　ＮＨ４ＨＣＯ３で平
衡化させた５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　２５で緩衝液交換
をした後、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを用
いて、ＰＥＧ修飾ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７を試薬
及び未反応ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７から分離し、
ＰＥＧ修飾ヒトＧ−Ｃ５Ｆ−Ａｌａ１７　２．３ｍｇ　
（収率１１．５％）を得た。同時にヒトＧ−Ｃ５Ｆを活
性化ＰＥＧ２と反応させ、分離しＰＥＧ修飾Ｇ−Ｃ５Ｆ
　　１．Ｏｍｇ　（収率５．０％）を得た。この結果よ
り、ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７の方カドヒトＧ−Ｃ
３Ｆよりも収率よ＜ＰＥＧ修飾体が得られることが判明
した。 ［００２８］ この反応で得られたＰＥＧ修飾ヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体を
、以降ＰＥＧ　（１００００）Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１
７という。反応物にライて、実施例１と同様に５ＤＳ−
ＰＡＧＥ上ニテ分子量の推定を行なったところ、Ｐ　Ｅ
　Ｇ　（１００００）　Ｇ−ＣＳ　Ｆ　−Ａ１ａ１７の
平均分子量は５１にであり、その分布は３ＱＫ　（２３
％）　、４２Ｋ　（２５％）　、５９Ｋ　（２７％）及
び７２Ｋ　（２５％）であった。なお、これらはヒトＧ
−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７に１分子〜多分子の活性型ＰＥ
Ｇが結合したものの混合物であり、イオン交換クロマト
グラフィー　あるいはゲルろ過クロマトグラフィー等を
用いることにより、修飾の程度（結合数）に応じて更に
分離した。 ［００２９］ ヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７５　ｍｇを、実施例２と
同様の条件で活性化ＰＥＧ２と反応させ、５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ　２５及びＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフ
ィーを用いて、ＰＥ　Ｇ　（１００００）　Ｇ−ＣＳ　
Ｆ−Ａｌａ１７を得た。これを１００　ｍＭリン酸緩衝
液、１５０　ｍＭ塩化ナトリウＡ　（ｐＨ７，０）で平
衡化したＴ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷＸＬ　（
東ソー社製）（７，５ｍｍＸｍｍＸ６Ｏに、流速１　ｍ
ｌ／ｍｉｎでかげた。 ［００３０］ ＰＥＧ２三分子結分子結合体ｉ体）は保持時間約１５分
のあたりに溶出され（収量０、１３ｍｇ、収率２．６％
）、ＰＥＧ２二分子結分子結合体体）は保持時間約１７
分のあたりに溶出され（収量０．１６ｍｇ、収率３．２
％）、次いでＰＥＧ２−分子結合体（Ｍｏｎ。 体）が保持時間約１８分のあたりに溶出された（収量０
．１２ｍｇ、収率２．４％）。得られた化学修飾体はＭ
ｏｎｏ体ではヒトＧ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７−分子に対
し、ＰＥＧ２が一分子結合しており、Ｄｉ体では結分子
結合しており、Ｔｒｉ体では結分子結合していることが
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認された
。それぞれの純度は９０％以上であった。 特開平４−１６４０９８　（１Ｑ） ［００３１］ 実施例１．２で作成したＰ　Ｅ　Ｇ　（４５００）　Ｇ
−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７及びＰ　Ｅ　Ｇ　（１００００
）Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７について、マウスにおける
薬理効果を調べた。マウス（ＩＣＲ（♂））７週令に試
料を１０μｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｋｇの用量で静脈内に
投与し、２４．４８及び７２時間後にマウスの眼窩静脈
叢より採血し、自動血球計数装置（Ｅ−２５００゜東亜
医用電子）にて白血球数を測定した。また、同時に血液
塗末標本をライト染色し、自動血球分類装置（ＭＩＣＲ
ＯＸ、立方電機）にて白血球分画を測定し、好中球数を
求めた。その結果を、表１に示す。 ［００３２］ Ｐ　Ｅ　Ｇ　（４５００）　Ｇ−ＣＳ　Ｆ　−Ａｌａ１
７　、及びＰ　Ｅ　Ｇ　（１００００）　Ｇ−ＣＳ　Ｆ
　−Ａｌａ１７では、未修飾Ｇ−Ｃ３Ｆ、並びにポリエ
チレングリコール修飾Ｇ−Ｃ３Ｆに比べ、好中球数が増
加し、４８時間、７２時間後まで好中球増加作用が持続
していることが認められた。また、修飾に用いるＰＥＧ
の分子量の大きい方が薬理効果が大きいことが推定され
た。 ［００３３］

【表１］　　ＰＥＧ修飾Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７のｉ
ｎ　ｖｉｖｏ薬理効果ベヒクル −Ｃ３Ｆ Ｇ−Ｃ３Ｆ−Ａｌａ１７ ＰＥＧ　（４５００）Ｇ−Ｃ３Ｆ−Ａｌａ１７ＰＥＧ　
（１００００）Ｇ−Ｃ３Ｆ−Ａ１ａ１７９．４（１，５
１１，７（１，２ ２２，３（３，４１１，３（２，１ ２４，２（２，８１０，８（１，７ ２５，６（６，１１８，０（２，８ ８７，０（７，１４４，９（４，２ １１、７（１，８ ９，７（０，９ ８，０（０，７ １５，１（１，０ １７、０（１，２ ＊投与量：　　１０μｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ＊マウ
スの四散：　各６匹 平均（標準偏差） 実施例２で作成したＰ　Ｅ　Ｇ　（１００００）　Ｇ−
ＣＳ　Ｆ　−Ａｌａ１７の熱安定性を、ＰＥＧ（１００
００）　Ｇ−ＣＳ　Ｆと比較した。各試料を濃度０．１
ｍｇ／ｍｌとなるように、１０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に溶解し、５３℃で６時間加温した後、溶液
中のＧ−Ｃ５Ｆ残存活性を測定した。Ｇ−Ｃ３Ｆの活性
は、Ｐ、ラルフらの方法（ブラッド（１９８６）６８．
６３３−６３９）及びＲ，Ｎ、ムーアらの方法（ジャー
ナル　オブ　イムノロジー（１９８３）　１３１．２３
７４−２３７８）に準じて、マウスの骨髄細胞への３Ｈ
−チミジンの取り込みを指標として測定した。その結果
を、表２に示す。残存活性（％）は、加温前の初期活性
に対する相対割合であり、以下の式で定義される。 ［００３４］ 【数１】　残存活性（％）＝（加温後の活性）／（初期
活性）ｘｌＯＯＰ　Ｅ　Ｇ　（１００００）　Ｇ−ＣＳ
　Ｆ　−Ａ１ａ１７ば、Ｐ　Ｅ　Ｇ　（１００００）　
Ｇ−ＣＳ　Ｆに比べ、残存活性が高く、熱安定性が向上
している事が確認された。 ［００３５］

【表２］　　ＰＥＧ（１００００）Ｇ−Ｃ３Ｆ−Ａｌａ
１７の熱安定性（５３℃、６ｈｒ）ＰＥＧ　（１０００
０）Ｇ−Ｃ３Ｆ　　　　　　　　　　　　８Ｐ　Ｅ　Ｇ
　　１００００）　Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａ１ａ１７　　　　
　　　６１（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）参考
男 １７位のシスティンをアラニンに置換したＧ−Ｃ３Ｆ誘
導体（Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７）を以下のようにして
得た。 ［００３６］ 上記のＧ−Ｃ３Ｆ誘導体をコードするＤＮＡを含むプラ
スミドｐ　Ｓ　Ａ２１１６　（特開平２−１０４５９８
）を保有する大腸菌（ｐ　Ｓ　Ａ２１１６／　ＡＭ　７
　）を、アンピシリン及びカナマイシンを含むし培地に
て２８℃で一晩振盪培養した。この培養液２５ｍ１を５
００ｍ１のＬ培地に加え、２８℃で４時間、振盪培養し
た。予め６０℃にしておいたし培地５００ｍ１を培養液
に加え、４２℃にして更に３時間振盪培養した。 ［００３７］ 更に培養液を遠心分離して約２０ｇの菌体を得た。１４
０ｍ１の蒸溜水を加え懸濁した後、最終濃度１ｍＭとな
る様にＩＭＤＴＴを加えた。この間溶液は４℃に保持し
た。フレンチプレスを用いて菌体を破砕し、沈澱を集め
た。この沈澱から、タナ力らの方法［Ｈ，Ｔａｎａｋａ
ら：　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃｓ　２５１．１１９９（１９９０）　
］によりＧ−Ｃ５Ｆ誘導体を抽出・精製・可溶化・再生
した。 ［００３８］ 【発明の効果】 以上の結果より本発明が提供するポリエチレングリコー
ル修飾ヒ）Ｇ−Ｃ５Ｆ誘導体は、未修飾Ｇ−Ｃ３Ｆ及び
未修飾Ｇ−ＣＳ　Ｆ−Ａｌａ１７と比較して、血中半減
期が伸長し、薬効（好中球の増加作用）がより長く持続
することにより、生体内投与の際に、より少量でのより
少ない回数の投与が可能となった。また、本発明のポリ
エチレングリコール修飾ヒトＧ−Ｃ５Ｆ誘導体は、ポリ
エチレングリコール修飾Ｇ−Ｃ５Ｆと比較して、収率が
向上しており、更には熱安定性の向上が認められた。こ
れら発明の効果は、ヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆを用いた治療に一層
貢献し得ることが期待される。 ［００３９］

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ＝１７４ 配列の型ニアミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓｌ　　　　　　　　５　　
　　　　　　　１０　　　　　　　　　１５Ｘａａ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ
　Ｌｅｕ　ＧｌｎＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａ
ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｈｉ
ｓＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　ＡｌａＰｒｏ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｎ　ＡｌａＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎＰｈ
ｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ
　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｍｅ
ｔ　Ｐｒｏ　ＡｌａＧｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　５
ｅｒＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ
　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｓｅｒ　ＣｙｓＳｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓ
ｅｒＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ＳｅｒＬｅｕ　
Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅ
ｔ　Ａｌａ　Ｐｒ。 Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅｌ４０ Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅｌ６０ Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列（但し、Ｎ末端
   側の先頭に更にＭｅｔが結合していてもよく、１７番目
   のＸａａはＣｙｓ以外のアミノ酸を指す）を有し、外来
   性ＤＮＡ配列の宿主細胞による発現産物であることを特
   徴とするポリペプチドにポリエチレングリコールを結合
   してなる化学修飾蛋白質。
2. 【請求項２】上記Ｃｙｓ以外のアミノ酸がＡｌａである
   請求項１に記載の化学修飾蛋白質。
3. 【請求項３】ポリエチレングリコールが、ポリペプチド
   のアミノ酸のアミノ基を介して結合する請求項１または
   ２に記載の化学修飾蛋白質。