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KR101324828B1 - 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체 - Google Patents

면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체 Download PDF

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KR101324828B1
KR101324828B1 KR1020100054067A KR20100054067A KR101324828B1 KR 101324828 B1 KR101324828 B1 KR 101324828B1 KR 1020100054067 A KR1020100054067 A KR 1020100054067A KR 20100054067 A KR20100054067 A KR 20100054067A KR 101324828 B1 KR101324828 B1 KR 101324828B1
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Abstract

본 발명은 단쇄 인슐린 아날로그(single-chain insulin analog), 비 펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 단쇄 인슐린 아날로그 결합체 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체는 생체내에서 인슐린과 유사한 활성을 나타내고, 혈중 반감기가 현저히 증가 된 인슐린 아날로그 지속형 제형으로 인슐린 치료의 단점인 저 혈당을 유도하지 않는 획기적인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체{An single chain-insulin analog complex using an immunoglobulin fragment}
본 발명은 단쇄 인슐린 아날로그 (single-chain insulin analog), 비 펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 단쇄 인슐린 아날로그 결합체 및 그 이용에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 생체 내에서 인슐린과 유사한 활성을 나타내고, 혈중 반감기가 현저히 증가 된 인슐린 아날로그 지속형 제형으로서, 인슐린 치료의 단점인 저혈당을 유도하지 않으며 지속성 특성이 부여되어 인슐린 치료의 부작용 및 투여 편의성을 향상시킨 획기적인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여 인슐린이 정상적인 기능을 나타내지 않아 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하고 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 되며 여러 합병증과 연계되어 있다. 따라서 인슐린이 부족하거나 정상적인 기능을 나타내지 못하는 당뇨 환자에게는 인슐린 치료가 필수적이며, 인슐린 투여 시 정상 수준으로 혈당을 조절 할 수 있다.
인슐린제제는 선천적으로 인슐린 생성에 이상이 있는 일형 (Type Ⅰ) 당뇨 환자나, 인슐린 내성, 인슐린 분비 부족 등에 의해 2차적으로 혈당치가 상승하는 이형 (Type Ⅱ) 당뇨이면서 경구용 당뇨약으로 조절이 잘 안되거나 금기인 환자, 임신성 당뇨환자에게 투여하는 혈당 조절제이다.
초기에는 소나 돼지의 인슐린을 정제하여 쓰는 방법을 이용했지만, 유전공학 및 DNA 조작 기술의 발달로 세균, 효모 등을 이용하여 사람 인슐린의 대량 생산이 가능하게 되었고(참조: EP 0055945), 사람 인슐린을 변형시켜 작용시간 등을 개선한 인슐린 아날로그 등을 생산할 수 있게 되었다.
유전자 재조합 기술에 의한 최초의 사람 인슐린 변형체는 일라이릴리사(Eli lilly)의 인슐린 리스프로(Lispro)로 B쇄 카복실말단 두 번째 라이신 잔기와 세 번 째 프롤린 잔기를 순서를 바꾸어 인슐린 이량체 및 육량체의 형성을 막아 주사 투여시 혈당 강하 활성이 좋은 단량체 인슐린의 양을 늘린 인슐린 변형체이다. 노보노디스크사(Novo Nordisk)의 인슐린 아스파트(aspart)는 B쇄 28번 프롤린 잔기를 아스파틱산 잔기로 치환하여, 전하의 반발력(repulsion)을 증가시켜 인슐린 육량체의 형성을 막아 초속효성 활성을 나타내도록 만들어진 변형체이다. 사노피 아벤티스사의 인슐린 글루이진(Glulisine)은 B쇄 3번 아스파라진(asparagine) 잔기를 라이신(Lysine) 잔기로 치환하고, B쇄 29번 라이신(Lysine) 잔기를 글루탐산(glutamic acid) 잔기로 치환하여 빠른 혈당 강하 효과를 나타내도록 만들어진 변형체이다.
그러나, 인슐린의 경우 다른 단백질 및 펩타이드 호르몬과 마찬가지로 체내의 반감기가 극히 짧아 치료학적 효과를 지속적으로 나타내기 힘들며, 효과를 나타내기 위해서는 지속적으로 반복투여를 해야 한다는 단점이 있다. 또한 단백질 및 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 따라서 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위하여 자주 주사하게 되는데, 이는 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 따라서, 단백질의 생체내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 치료학적 효과를 높이며 환자의 삶의 질을 높이기 위해 여러 단백질 제형화 연구와 화학변형이 연구되어 왔다.
이러한 인슐린 제제의 투여상의 문제점을 극복하기 위하여 다양한 시도 중 하나로 인슐린 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 인슐린 약물을 체내로 전달하는 시도가 있었다. 화이자사의 흡입형 당뇨병 인슐린 치료제 '엑수베라(Exubera)'는 주사투여의 불편함을 개선한 획기적인 흡입형 속효성 인슐린 제제로 주사형 인슐린제제와 유사한 혈당강하 효과를 나타내어 주목 받았으나, 폐암 발병 위험 등의 안전성 문제 및 매출 부진으로 인하여 시장에서 철수 되었다. 또한 노보노디스크사, 릴리사등 여러 제약회사에서 흡입형 인슐린 개발에 착수하였다가 중단한 바 있다.
이러한 흡인형 투여 방법은 간단하고 환자 스스로도 고통 없이 투여할 수 있는 방법을 제공하여 기존의 주사 투여 보다는 확실하게 선호 되고 있지만 주사제에 비해 약물의 체내 전달 효율이 낮으며 약물의 체내 활성을 요구되는 조건으로 유지하는데 아직까지는 어려움이 많다. 또한 미생물 및 병원균에의한 오염, 안정성 및 내구성등 흡입형 투여에 알맞은 조성물을 준비하는데 어려움이 있다. 그리고 흡입형 제품을 폐로 전달하는 것은 부종, 세포손상 및 조직에 염증을 유발할 수 있는 부작용으로 인하여 폐 흡수 메카니즘에 대한 연구가 더 필요하며, 현재 흡수 메커니즘, 흡수율 및 범위를 예측하는 능력은 초기 단계에 있다.
그러나 아직도 많은 연구자 및 제약사들은 인슐린제제의 호흡기 전달을 가능한 것으로 보고 계속해서 개발 노력을 쏟고 있으며, 현재 엑수베라의 단점을 극복 한 맨카인드(mannkind)사의 흡입형 인슐린제제 아프레자(Afrezza)가 FDA 승인 대기 중에 있다.
이외 투여 편의성을 향상시키고 효과적인 치료에 충분한 수준의 생물학적 이용 가능성을 가진 투여 방법의 개발은 지난 수년간 진행 되어 왔으며, 경구, 비강 및 경피 흡수등의 투여 경로가 인슐린 제제가 현재 임상 시험 진행 중에 있다. (E.-S. Khafagy et al. , Advanced Drug Delivery Reviews ; 59, (2007) 15211546)
한편, 인슐린 제제 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효 극대화 및 투여 편의성을 향상 시키려는 노력이 계속되어 왔는데, 인슐린 약물의 지속형 제제는 인슐린의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되고, 환자에게 저 혈당 반응을 유발하지 않아야 한다.
현재 시판중인 지속형 인슐린 제제는 사노피-아베티스사(sanofi-aventis)의 인슐린 글라진(insulin glargine, lantus)과 노보노디스크사(Novo Nordisk)의 인슐린 디터미르(insulin detemir, levemir)가 있다. 사노피-아벤티스사의 인슐린 글라진은 최초의 지속형 인슐린으로 A쇄의 21번째 아스파라진을 글라이신으로 치환하고, B쇄에 2개의 아르지닌 잔기를 추가하여 산성 pH에서 가용성 성질을 가지며 생체내의 pH에서는 낮은 가용성 성질을 나타내어, 피하 투여시에 인슐린의 침전을 유도하여 천천히 흡수 되도록 제조 되었다. 인슐린 글라진의 지속 시간은 약 20~22시간으로 속효성(5~8시간) 및 초 속효소성(3~5시간) 인슐린 대비 작용시간이 길고 인슐린 농도의 피크가 없어 저혈당이 발생하지 않는다는 장점을 가지고 있다. 노보노디스크사의 인슐린 디터미르는 가장 최근에 개발 된 지속형 인슐린 제제로 B쇄의 30번째 트레오닌 잔기를 제거하고 B쇄의 29번 라이신 잔기에 아실화를 시켜 인체 투여 시에 알부민과 결합할 수 있도록 제작하여 지속형의 특성을 부여하였다(Allison J. et al, DM. 148-162, 2010). 지속 시간은 인슐린 글라진보다 약간 짧은 18~22시간으로 하루 1회 또는 2회 제형으로 개발 되었다. 이들 지속성 인슐린들은 혈중 인슐린 농도의 피크가 없어 기저 인슐린으로 적합하다. 그러나 이러한 지속형 인슐린들은 충분히 반감기가 길지 않아 매일 1회 또는 2회 투여해야 하는 불편함이 여전히 존재하여 장기간 투여해야 하는 당뇨병 환자의 경우 투여 빈도를 획기적으로 낮추어 환자의 편의성을 증가시킬 수 있는 제제의 필요성이 매우 요구되고 있다.
인슐린 제제의 지속형 및 저혈당 문제를 해결하기 위한 방법으로 단쇄 인슐린 아날로그를 사용할 수 있다. 단쇄 인슐린은 기존의 A 쇄와 B 쇄로 구성된 인슐린을 단쇄로 제조하여 사용함으로써 반감기 및 효력을 조절 할 수 있다. 단쇄 인슐린은 A 쇄와 B 쇄순으로 연결하거나 B 쇄와 A 쇄 순으로 연결할 수 있으며 각 쇄의 연결 시 펩타이드가 링커로 삽입될 수 있다. 또한 A 쇄와 B 쇄 어느 하나만을 사용할 수 있으며 이의 아날로그도 이에 포함된다.
인슐린 제제의 지속형을 향상시키기 위한 다른 방법은 인슐린의 전구물질인 프로 인슐린의 이용이다. 프로 인슐린 그 자체는 약한 인슐린 아고니스트로서 인슐린에 비하여 활성은 낮지만 인슐린 대비 더 긴 반감기를 가진다 (William F. et al., The journal of biological chemistry, vol. 267; 419-425, 1992). 프로 인슐린은 인슐린과 달리 B쇄와 A쇄가 인슐린의 안정성 유지에 중요한 역할을 하는 C 펩타이드에 의해 연결되어 있어 혈중 반감기가 인슐린대비 더 길다. 따라서 많은 연구자들에 의해 프로 인슐린을 지속형 인슐린으로 개발하려는 여러 시도가 있었다. 그러나 활성에 중요한 역할을 하는 A쇄의 아미노말단 글라이신 잔기가 C 펩타이드에 가려져 있어 인슐린에 비해 활성이 낮은 단점이 있어(William F. et al., The journal of biological chemistry, vol. 267; 419-425, 1992) 아직 약물로 개발되지 못하였다.
이에, 본 발명자들은 프로인슐린 아날로그의 혈당강화 효과 및 혈중 지속성 향상으로 투여의 편의성을 증대시키고, 생체 내 활성 유지 및 인슐린의 부작용인 저 혈당 효과를 감소시킬 수 있는 프로인슐린 아날로그 결합체를 제작하였다. 프로인슐린 아날로그 결합체에 새로운 특성을 부여하기 위한 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 프로 인슐린 아날로그를 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결시키는 제조방법을 사용하였고, 그 결과 인슐린 아날로그 결합체의 혈중 반감기를 획기적으로 증가시켜 기존의 지속형 인슐린 제제보다 월등히 개선된 혈중반감기 증가효과 및 저혈당 감소 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인슐린과 유사하거나 또는 우월한 생체 내 혈당 강하 효력을 유지하면서 혈중 반감기를 월등히 연장시켜 투여의 편의성 향상 및 인슐린의 부작용을 개선한 우수한 단쇄 인슐린 아날로그 지속형 제제 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단쇄 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 양 말단에 반응기를 갖는 비 펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 결합체 및 그의 변이체 그리고 이의 제조 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 프로인슐린 아날로그 (pro-insulin analog) 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 링커를 통해 연결된 프로인슐린 아날로그 결합체를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 단쇄 인슐린 아날로그 결합체를 제공하며 보다 구체적으로 프로인슐린 아날로그 결합체를 제공한다.
본 발명은 단쇄 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 양 말단에 반응기를 갖는 비 펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 결합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 프로인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 양 말단에
반응기를 갖는 비 펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 지속형 프로인슐린 아날로그 결합체에 관한 것이다.
본 발명의 “단쇄 인슐린”은 천연형 인슐린과 유사한 생체 내 혈당 강화 특성을 보유하며 A 쇄와 B 쇄가 하나의 쇄로 연결된 인슐린 아날로그이다. 바람직하게 본 발명의 단쇄 인슐린 아날로그는 프로인슐린 아날로그이다.
본 발명의 “프로인슐린 아날로그”는 프로인슐린과 유사한 생체 내 혈당 강하 특성을 보유한 사람의 프로인슐린 변이체로서, 천연형 프로인슐린과 A쇄, B쇄, 그리고 C 펩타이드 배열이 하나 이상 다른 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 프로 인슐린 아날로그는 A쇄, B쇄, C 펩타이드 각각의 아미노산 서열은 천연형이거나 아미노산이 추가 또는 삭제 된 형태 모두 가능하다. 바람직하게 본 발명의 프로인슐린 아날로그는 인슐린과 유사한 생체 내 혈당 강하 특성을 보유한 사람의 프로인슐린 변이체로서, 천연형 프로인슐린의 B쇄- C 펩타이드- A쇄의 배열과 달리 A쇄- C 펩타이드 -B쇄의 배열을 가지며, A쇄의 아미노 말단 부위가 자유롭다.
본 발명의 프로인슐린 아날로그는 상기 기술한 프로인슐린과 동일한 생체내의 혈당 조절기능을 보유한 펩타이드로서, 이러한 펩타이드는 프로인슐린 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 프로인슐린 아고니스트는 프로인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명의 프로인슐린 아날로그는 천연형 프로 인슐린의 A쇄, B쇄 그리고 C 펩타이드와 각각 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예;deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 프로인슐린 단편은 프로인슐린에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산) 도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
본 발명의 프로인슐린 변이체는, 프로인슐린과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 아미노말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination) 된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 프로인슐린 아날로그는 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, Solid phase 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다.
바람직하게 본 발명에서 사용된 프로인슐린 아날로그 결합체는 프로인슐린 아날로그의 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 한다.
바람직하게 본 발명에서 사용된 프로인슐린 아날로그 결합체는, A쇄- C 펩타이드 -B쇄의 배열을 가지며 A쇄의 아미노말단 부위가 자유로운 프로인슐린의 A쇄의 아미노말단에 비펩타이드성 중합체가 결합된 것을 특징으로 한다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단 에 PEG를 결합시키고 여기에 프로인슐린 아날로그 특정 라이신 잔기에 선택적으로 커플링하여 프로인슐린 아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하였다.
또 다른 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단에 PEG를 결합시키고 여기에 프로인슐린 아날로그 A쇄의 아미노 말단에 선택적으로 커플링하여 프로인슐린 아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조하였다.
본 발명에서 제조한 프로인슐린 아날로그-PEG-면역글로불린 Fc 결합체 및 프로인슐린 아날로그 (55번 라이신 잔기와 56번 아르기닌 잔기가 제거된 프로인슐린 아날로그)-PEG-면역글로불린 Fc 결합체의 혈중반감기는 천연형 인슐린 및 프로인슐린 대비 월등히 증가 하였고, 질환모델 동물에서 혈당강하 효과를 보여 생체 내 활성이 유지된 새로운 지속형 인슐린제형을 제조할 수 있었다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조,정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다
본 발명에서 사용되는 단쇄 인슐린 아날로그는 캐리어 물질과 비펩타이드성
중합체로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로
필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리
올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락
트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성 된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체를 제조할 수 있다.
이러한 본 발명의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체는 에너지 대사 및 당 대사와 같은 기존의 인슐린의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인슐린 아날로그의 혈중 반감기 및 이로 인한 상기 펩타이드의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가하게 하므로, 당뇨(Diabetes)의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 프로인슐린 아날로그의 아민 그룹 또는 티올그룹에 공유결합으로 연결하는 단계; (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 아미노말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 단쇄 인슐린 아날로그를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린 아날로그와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 프로인슐린 아날로그 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 단쇄 인슐린 아날로그 만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 단쇄 인슐린 아날로그가 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 프로인슐린 아날로그의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 프로인슐린 아날로그를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린 분비 펩타이드와 결합된 단백질결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 프로인슐린 분비 펩타이드의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 프로인슐린 아날로그 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 결합체는 당뇨 치료에 유용한바, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 상기 질환의 치료를 도모할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체는 생체 내에서 안정적인 혈당 강하 효과를 유지하고, 혈중 반감기가 현저히 증가하여 인슐린의 투여 편의성 및 부작용을 개선하는 효과가 있다.
도 1은 프로인슐린 아날로그 유전자 증폭 모식도이다.
도 2는 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 RP HPLC로 분석한 결과이다.
도 3은 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 SE HPLC로 분석한 결과이다.
도 4는 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 RP HPLC로 분석한 결과이다.
도 6는 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 SE HPLC로 분석한 결과이다.
도 7은 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 8은 A-C△KR-B 프로인슐린-PEG-Fc의 STZ 랫트에서의 효력 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 단쇄 인슐린 아날로그의 발현 벡터의 제작
1. 프로인슐린 아날로그 (A-C-B 프로인슐린 아날로그) 발현 벡터의 제작
사람의 인슐린 아날로그, 프로인슐린 아날로그를 암호화하는 발현 벡터를 제작하였다. 상기 발현 벡터는 인슐린 A쇄의 아미노 말단을 자유롭게 하기 위하여 천연 프로인슐린 유전자의 서열 (B쇄-C 펩타이드-A쇄, 서열 번호 1, 2)과 다른 프로인슐린 아날로그 (A쇄-C 펩타이드-B쇄, 서열 번호 3, 4)을 암호화하는 유전자 서열을 포함하며, 다음과 같이 제조하였다.
86개의 아미노산을 암호화하는 프로인슐린 아날로그 발현 벡터의 제작을 위하여, 보고 된 프로인슐린 유전자 서열(NM_000207.2, from NCBI)을 바탕으로 아래와 같은 6개의 올리고 뉴클레오타이드를 합성하고, 프로인슐린 cDNA (입수처 : Origene)를 주형으로 하여 A쇄 및 C 펩타이드 그리고 B쇄를 PCR 방법으로 각각 증폭한 뒤, 3개의 PCR 증폭 산물과 올리고 뉴클레오타이드를 함께 섞어 PCR 수행하여 프로인슐린 아날로그 유전자를 합성하였다.
먼저, 프로인슐린 아날로그 유전자의 A쇄 합성을 위하여, 순방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 7)는 개시 ATG 코돈 및 NdeI 제한 효소 부위를 포함하도록 합성하고, 역방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 8)는 A쇄의 3‘ 말단 부위 서열과 C 펩타이드 5’ 부위 서열을 삽입하도록 합성하였다. C 펩타이드를 암호화하는 유전자를 합성하기 위하여 순방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 9)는 A쇄의 아미노말단 서열 및 C 펩타이드의 서열을 그리고 역방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 10)는 C 펩타이드 3‘ 말단 서열 및 B쇄의 5‘ 말단 서열을 포함하도록 합성하였다. B쇄를 암호화하는 유전자를 합성하기 위하여 순방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 11)는 C 펩타이드의 3’ 말단 서열과 B쇄의 서열을 그리고 역방향 올리고 뉴클레오타이드(서열번호: 12)는 B쇄의 5‘ 말단 서열과 제한 효소 BamH I 서열을 포함하도록 합성하였다.
상기의 올리고 뉴클레오타이드를 이용하여 각각의 유전자를 증폭한 뒤, 각각의 PCR 증폭 산물과 서열 번호 7로 기재되는 올리고 뉴클레오타이드와 서열번호 12로 기재되는 올리고 뉴클레오타이드를 함께 섞어서 최종 A쇄- C 펩타이드 -B쇄의 서열을 가지는 프로인슐린 아날로그를 합성하였다 (도 1).
상기의 프로인슐린 아날로그의 증폭을 위한 PCR 조건은 어닐링 온도 60℃에서 20초로 하였으며, 연장은 68℃에서 20초로 진행하였다.
5‘ GGAATTCCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGT 3’ (서열 번호 7)
5‘ CTGCCTCCCGGCGGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG 3’ (서열 번호 8)
5‘ GAACTACTGCAACCGCCGGGAGGCAGAGGACCTG 3’ (서열 번호 9)
5‘ GTTGGTTCACAAAACGCTTCTGCAGGGACCCCTC 3’ (서열 번호 10)
5‘ CCTGCAGAAGCGTTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3’ (서열 번호 11)
5‘ CGCGGATCCCTAGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAG 3’ (서열 번호 12)
상기에서 얻어진 프로인슐린 아날로그 단편 DNA(285bp)을 pET22b 벡터(입수처: Novagen)에 클로닝하였다. 프로인슐린 아날로그를 세포내의 봉입체의 형태로 발현시키기 위하여 pET22b 벡터를 제한 효소 NdeI 및 BamHI로 처리하여 신호 서열을 제거하고, 프로인슐린 아날로그 PCR 산물을 동일한 제한효소 Nde I과 BamHI으로 처리하고 분리된 각각의 DNA를 T4 DNA 리가제를 이용하여, pET22b 클로닝 벡터에 삽입하였다. 상기 결과로 얻어진 발현벡터를 p22b-InvPI 명명하였다.
상기 p22b-InvPI 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 암호화하며, 숙주 세포 내에서 프로인슐린 아날로그 단백질을 봉입체의 형태로 발현시켰다.
2. 55번 라이신 잔기와 56번 아르기닌 잔기가 제거 된 프로인슐린 아날로그 (A-C△KR-B 프로인슐린) 발현 벡터의 제작
55번 라이신 잔기와 56번 아르기닌 잔기를 제거한 프로인슐린 아날로그 (A-C△KR-B 프로인슐린; 서열 번호 5, 6)을 제작하기 위하여, 아래와 같은 2개의 추가적인 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다.
5‘ GGGGTCCCTGCAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3’ (서열번호 13)
5‘ GTTGGTTCACAAACTGCAGGGACCCCTCCAGGGC 3’ (서열번호 14)
서열 번호 13으로 기재되는 순 방향 올리고 뉴클레오타이드 및 서열 번호 14으로 기재되는 역 방향 올리고 뉴클레오타이드는 C 펩타이드의 3‘ 말단 서열 중 라이신과 아르기닌을 암호화하는 AAG CGT 서열을 제거하고 합성하였다. B쇄 34번 라이신 잔기와 35번 아르기닌 잔기가 제거된 변이체의 증폭 및 발현 벡터의 제작은 상기 실시예에 기재 된 조건과 동일한 내용으로 진행 하였다. 상기의 방법으로 제작한 프로인슐린 아날로그 발현벡터를 22b-InvPI △KR 이라고 명명하였다.
상기 p22b-InvPI △KR 발현 벡터는 T7 프로모터의 조절 하에 서열번호: 6의 아미노산 서열을 암호화하며, 숙주 세포내에서 프로인슐린 아날로그 단백질을 봉입체의 형태로 발현시켰다.
실시예 2: 재조합 융합 펩타이드의 발현
T7 프로모터 조절하의 재조합 프로인슐린 아날로그 발현을 수행 하였다. 각각의 재조합 프로인슐린 아날로그 발현 벡터로 E.coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λ(DE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 이용하였다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50ug/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1ml씩 cryo-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 프로인슐린 아날로그들의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 비알을 녹여 500ml의 2X LB에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD.600nm의 값이 5.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5L 발효기(MDL-8C, B.E.MARUBISHI, 일본)를 이용하여 종 배양액을 1.7L의 발효 배지에 접종하고 초기 배스 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 20 sL/분(1vvm), 교반 속도 500rpm 그리고 30% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)을 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 70이상에서 최종 농도 100uM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 재조합 프로인슐린 아날로그의 회수 및 설폰화( sulfonation )
상기 실시예 2에서 발현시킨 재조합 프로인슐린 아날로그들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 세포 펠렛 200g(wet weight)을 3L 용해 완충액(50mM Tris-HCl (pH9.0), 1mM EDTA(pH8.0), 0.2M NaCl 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(Microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 7,000rpm으로 4℃에서 20분 원심분리하여 상층액을 버리고, 3L 세척완충액(0.25% 트리톤 X-100 및 20mM Tris-HCl (pH7.5), 1M NaCl)에 재부유하였다. 7,000rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛을 20mM 트리스-HCl(pH7.5) 또는 증류수에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 2L 가용화 완충액(8M 우레아, 20mM 트리스-HCl (pH9.0, 1mM EDTA))에 재부유하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 가용화된 재조합 프로인슐린 아날로그의 설폰화(sulfonation)를 위하여 7,000rpm으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여, 여기에 최종 농도 0.3M의 아황산 나트륨(sodium sulfite)와 0.1M 사티온산 나트륨(sodium tetrathionate)을 넣어주고 3시간 동안 추가로 교반하여 프로인슐린 아날로그의 시스테인잔기들을 설폰화 시켰다. 20L의 완충액(10mM ammonium acetate, pH7.4)을 연동 펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1000ml/hr의 유속으로 20시간 동안 첨가 한 후, 6N HCl을 첨가하여 pH를 3.6으로 낮추어 반응을 정지시켰다.
실시예 4: 시아노겐 브로마이드 처리
침전된 프로인슐린 아날로그을 1.8L의 70% 개미산(formic acid)으로 용해시키고, 단백질양의 100몰비에 해당하는 시아노겐 브로마이드(CNBr)을 첨가하여 25℃의 암실에서 16시간이상 반응 하였다. 반응 종료 후, 감압증류 장치(Rotavapor R210)를 이용하여 완전히 건조 시킨 다음 요소가 포함 된 완충액(7.5M urea, 20mM Bis-Tris, pH6.0)으로 용해시켰다. 프로인슐린 아날로그의 정제를 위하여 요소 완충액으로 용해시킨 시료를 0.45um의 크기를 가진 필터를 통과시켜 이물질을 제거하였다.
실시예 5: 음이온 크로마토그래피 정제
상기 실시예 4에서 수득한 시료에서 시아노겐 브로마이드로 절단한 프로인슐린 아날로그 S-설포네이트만을 순수 분리하기 위해 음이온 교환 컬럼(HiTrap Q HP; Amersham Bioscience AB)으로 정제하였다. 먼저, 완충 용액 A(7.5M urea, 20mM Bis-Tris, pH6.0)를 약 5ml/min의 유속으로 컬럼으로 흘려 평형을 시킨 뒤, 시아노겐 브로마이드 절단 시료를 컬럼에 흘려 레진에 결합시키고, 완충 용액 B (7.5M urea, 20mM Bis-Tris, pH6.0, 0.5M NaCl)를 0-100% 구배로 10 컬럼 볼륨만큼 흘려주어 재조합 프로인슐린 아날로그를 용출하였다. 용출 구간은 10-20 ms/cm 이었다.
실시예 6: 프로인슐린 아날로그의 재접힘( refolding )
디솔팅 컬럼(Desalting column)으로 용출 된 시료에서 염을 제거하고, 완충 용액(1M urea, 50mM Glycine, ph10.6)으로 교체하였다. 완충 용액내의 프로인슐린 아날로그의 농도는 1mg/ml이 되도록 정용 여과법(Diafiltration)을 이용하여 조절하였다. 완충 용액으로 전환 된 프로인슐린 아날로그 S-설포네이트 시료의 재 접힘(refolding)을 통한 프로인슐린 아날로그의 전환을 위하여, 시스테인 또는 시스테인 염화수소(Cystein-HCl)를 최종 농도 1mM 되도록 첨가한 후, 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 24시간 후, 6N HCl을 첨가하여 pH를 3.0으로 낮추어 반응을 종료한 뒤, HPLC 및 SDS-PAGE로 재 접힘을 분석하였다.
실시예 7: 소수성 컬럼 크로마토그래피 정제
디솔팅 컬럼(Desalting column)으로 용출 된 시료에서 염을 제거하고, 완충 용액(1M urea, 50mM Glycine, ph10.6)으로 교체하였다. 이 시료를 소수성 성질을 이용한 페닐 컬럼(phenyl HP; Amersham Bioscience AB)에 적용하여 프로인슐린 아날로그을 정제 하였다.
완충 용액 A(10mM Tris-Hcl, pH 7.5, 0.6M ammonium sulfate)으로 평형화된 Phenyl HP 컬럼에 로딩하고 완충 용액 B(10mM Tris-Hcl pH 7.5)을 100-0% 구배로 10 컬럼 볼륨 흘려주어 단백질을 용출하였다. 용출 구간은 52-20 ms/cm 이었다.
실시예 8: 양이온 결합 크로마토그래피 정제
30 % 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH2.0) 완충액으로 평형화된 Source S (25 mm/20 cm, GE healthcare사) 컬럼에 소수성 컬럼에서 용출된 시료를 5∼10배 희석하여 6 ml/min 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 염화칼륨 0.5 M 과 30 % 에탄올이 포함된 20 mM 소디움 사이트레이트 (pH2.0) 완충액을 사용하여 농도가 0 % 에서 100 % 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로써 프로인슐린 아날로그 단백질을 용출하였다.
실시예 9: 역상 크로마토그래피 정제
10 ％ 아세토니트릴 및 0.1 % 트리프루오로아세트산으로 평형화된 C18 300 컬럼 (10 mm /25 cm, 페노메넥스사) 컬럼에 양이온 결합 크로마토그래피 컬럼에서 용출된 시료를 2 ml/min 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 80 ％ 아세토니트릴 및 0.1 % 트리프루오로아세트산까지 10 컬럼 용량의 선형 농도구배를 이용하여 목적 단백질을 용출하였다.
상기 역상 크로마토그래피에 따라 최종 정제된 프로인슐린 아날로그를 RP-HPLC, SE-HPLC, SDS PAGE 로 분석하여 각각 도 1, 2, 3에 나타내었다.
실시예 10: 프로인슐린 아날로그 페길화(Pegylation)
상기 실시예의 공정으로 고 순도로 정제된 프로인슐린 아날로그를 100 mM 포타슘포스페이트(pH 6.0)으로 버퍼 교환 후 5 mg/mL로 농도를 맞추고, 3.4 kDa PropionylALD2 PEG를 프로인슐린 아날로그의 아미노 말단에 페길화시키기 위하여 인터페론과 PEG의 몰비 1 : 10 이 되도록 PEG를 첨가한 후 완전히 녹였다. 이후 환원제인 소디움시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)를 20mM이 되도록 넣어준 후 상온에서 70 분 동안 반응시켰다. 이후 30 % 에탄올이 포함된 10 mM 소디움 사이트레이트, pH 2.0 버퍼로 10 배 희석한 후 Source S 컬럼(25 mm/ 20 cm, GE Healthcare사)에 주입하였다. Source S 컬럼은 30 % 에탄올이 포함된 10 mM 소디움 사이트레이트, pH 2.0 버퍼로 평형이 잡힌 컬럼이며, 유속은 6 mL/min으로 하였다. 하나의 페길화 인터페론을 정제하기 위해 30 % 에탄올이 포함된 10 mM 소디움 사이트레이트, pH 2.0, 0.5 M KCl 버퍼를 0에서 50 %가 되도록 10 컬럼 부피를 흘려주어 하나 페길화된 프로인슐린 아날로그를 정제하였다.
실시예 11. 프로인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체 제조
실시예 5의 방법을 이용하여 얻은 하나 페길화된 프로인슐린 아날로그을 면역글로블린 Fc와 커플링 시켰다. 프로인슐린 아날로그과 면역글로블린 Fc 몰 비를 1:4 으로 하였으며, 전체단백질농도를 50 mg/mL로 하여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이때 환원제로 20 mM 이 되도록 소디움시아노보로하이드라이드(NaCNBH3)를 넣어주었다. 이후 20 mM Tris, pH 7.5 버퍼로 10 배 희석한 후 Source Q 컬럼(70 mm/ 26 cm, GE Healthcare사)에 주입하였다. Source Q 컬럼은 20 mM Tris, pH 7.5 버퍼로 평형이 잡힌 컬럼이며, 유속은 30 mL/min으로 하였다. 커플링 단백질을 용출하기 위해 20 mM Tris, pH 7.5 , 0.5 M NaCl 버퍼를 0 %에서 40 %까지 선형적으로 4 컬럼 부피를 흘려주어 용출하였다. Source Q 컬럼으로 미 반응한 면역글로블린 Fc를 제거할 수 있었다. 상기 Source Q에서 용출된 커플링 단백질 용액에 1.5 M 암모늄설페이트를 첨가하여 Source iso 컬럼(35 mm/ 18 cm, GE Healthcare사)에 주입하였다. Source iso 컬럼은 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.5 M 암모늄설페이트 버퍼로 평형이 잡힌 컬럼이며, 유속은 10 mL/min으로 하였다. 프로인슐린 아날로그-PEG-면역글로블린 Fc를 정제하기 위해 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 버퍼를 0 %에서 100 %까지 선형적으로 17 컬럼 부피를 흘려주었다.
상기 Source iso 컬럼에서 최종 정제된 프로인슐린 아날로그-면역글로블린 Fc 결합체를 RP-HPLC, SE-HPLC, SDS PAGE 로 분석하여 각각 도4, 5, 6에 나타내었다.
실시예 12: 지속형 프로인슐린 아날로그 결합체의 in vivo PD 측정
지속형 프로인슐린 아날로그 결합체의 효력을 검증하기 위하여 당뇨모델 랫드를 이용하여 효력을 검증하였다. 당뇨모델은 정상 랫드에 Streptozotocin (STZ)을 투여하여 췌장내의 beta cell을 특이적으로 파괴하여 혈당을 지속적으로 증가시키는 방법을 이용하여 만들어졌다. STZ 투여에 따른 혈당증가가 발생한 모델 랫드에 지속형 프로인슐린 아날로그 결합체를 투여용량을 프로인슐린 아날로그 용량으로써 2 - 8 mg/kg으로 증가시켜 단회로 피하경로를 이용하여 투여하였다. 투여 전, 투여 후 매일동안 혈당을 측정하여 지속형 프로인슐린 아날로그 결합체의 효력을 측정하였다(Figure 8).
투여결과 지속형 프로인슐린 아날로그의 투여용량에 따른 혈당강하 현상이 나타났다. 투여용량에 효력지속기간이 최고 10일까지 도달하는 결과를 보였다.
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Claims (21)

  1. 단쇄 인슐린 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르 ,생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결되는 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단쇄 인슐린 아날로그는 천연형 프로인슐린, 천연형 프로인슐린에서 일부 아미노산의 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 배열 순서의 변환 중에서 선택되는 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조된 아날로그, 변이체, 또는 이들의 단편인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단쇄 인슐린 아날로그는 C 펩타이드의 55번 라이신 잔기 및 56번 아르기닌 잔기가 제거된 단쇄 프로인슐린 아날로그 (A-CΔKR-B)인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 각 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 단쇄 인슐린 아날로그의 아민 그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합된 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  7. 제6항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  9. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  10. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  11. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  12. 제11항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  13. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  14. 제13항에 있어서, 석시니미드 유도체가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 하이드록시 석시니미딜 또는 석시니미딜 카보네이트인 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  15. 제13항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 단쇄 인슐린 아날로그 결합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 단쇄 인슐린 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 단쇄 인슐린 지속성 제제.
  17. 제16항에 있어서, 당뇨병 치료용인 지속성 제제.
  18. (1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 면역글로불린 Fc 영역의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 면역 글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 프로인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린과 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체의 제조방법.
  19. (1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 면역글로불린 Fc의 N-말단에 pH6.0에서 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 프로인슐린을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린과 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체의 제조방법.
  20. (1) 각 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 프로인슐린의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 프로인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린과 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체의 제조방법.
  21. (1) 각 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 프로인슐린의 아민 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 프로인슐린을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 프로인슐린과 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 단쇄 인슐린 아날로그 결합체의 제조방법.
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