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CN107531806B - 融合蛋白 - Google Patents

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CN107531806B CN201680023998.4A CN201680023998A CN107531806B CN 107531806 B CN107531806 B CN 107531806B CN 201680023998 A CN201680023998 A CN 201680023998A CN 107531806 B CN107531806 B CN 107531806B
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J.W.戴
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Abstract

本发明涉及包含通过使用肽接头融合至人IgG Fc区的胰岛素受体激动剂的融合蛋白，以及此类融合蛋白在糖尿病治疗中的用途。本发明的融合蛋白具有延长的时间作用概况并且可用于提供延长时段的基础血糖控制。

Description

融合蛋白
本发明涉及用于治疗糖尿病的融合蛋白。更具体而言，本发明涉及包含用肽接头融合至人IgG Fc区的胰岛素受体激动剂的融合蛋白，以及此类蛋白在糖尿病治疗中的用途。本发明的融合蛋白具有延长的时间作用概况并且可用于提供延长的基础葡萄糖控制和肝葡萄糖排出的抑制。
糖尿病是一种慢性病症，其特征在于由于胰岛素分泌、胰岛素作用或者两者的缺陷而导致的高血糖。1型糖尿病特征在于几乎没有胰岛素分泌能力或者没有胰岛素分泌能力，并且患有1型糖尿病的患者需要胰岛素来生存。2型糖尿病特征在于由于受损的胰岛素分泌、胰岛素抗性、过多的肝葡萄糖排出和/或来自上述所有的贡献而导致的升高的血糖水平。在患有2型糖尿病的患者的至少三分之一中，疾病进展至绝对需要胰岛素疗法。
为了实现正常的血糖，需要使胰岛素替代疗法尽可能接近地类似于正常个体中的内源性胰岛素分泌的模式。胰岛素的每日生理需要量存在波动并且可分成两个阶段；(a)进餐时阶段，其需要脉冲量(大剂量)的胰岛素来处理与进餐相关的血糖激增(surge)；和(b)进餐间阶段，其需要维持(基础)量的胰岛素来调节肝葡萄糖排出，用于维持最佳的空腹血糖。
因为1型糖尿病患者几乎不产生胰岛素或者不产生胰岛素，所以用于1型糖尿病的有效胰岛素疗法一般涉及使用两种类型的外源施用的胰岛素：通过大剂量注射提供的速效进餐时胰岛素，和每日施用一或两次以控制进餐之间的血糖水平的长效基础胰岛素。患有2型糖尿病的患者的治疗通常以规定的体重减轻、锻炼和糖尿病饮食开始，但是当这些措施未能控制升高的血糖时，则口服用药和基于肠降血糖素的疗法，诸如施用实现升高的肠降血糖素水平的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂和/或二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂，可能是必要的。当这些用药仍然不足时，考虑用胰岛素进行治疗。疾病已经进展到需要胰岛素疗法的点的2型糖尿病患者一般以每日单次注射长效的基础胰岛素开始治疗，尽管在一些情况下，可根据需要包括速效胰岛素的进餐时间注射。
几种类型的基础胰岛素是当前可用的。以商品名LANTUS®销售的甘精胰岛素包含修饰的胰岛素结构，其中胰岛素A链中位置21处的天冬酰胺由甘氨酸取代，并且两个精氨酸被添加至B链的C末端。以商品名LEVEMIR®销售的地特胰岛素包含修饰的胰岛素结构，其中B链中的位置30处的苏氨酸已经缺失并且B链中的位置29处的赖氨酸已经通过14-碳、肉豆蔻酰脂肪酸与B29处的赖氨酸的ε-胺基的共价键而衍生化。可在欧洲和日本以商品名TRESIBA®得到的德谷胰岛素(Insulin degludec)包含修饰的胰岛素结构，其中B链中的位置30处的苏氨酸已经缺失，并且B链中的位置29处的赖氨酸的ε-氨基经由γ-L-谷氨酸接头与十六烷二酸共价地衍生化。所有这些胰岛素都被指示为每日施用一次。
涉及每日注射现有胰岛素疗法的治疗方案可以是施用复杂和痛苦的并且可导致不期望的副作用，诸如低血糖和体重增加。因此，许多糖尿病患者不愿意或不能够遵从，或者不会遵从维持血糖水平的密切控制所必需的胰岛素疗法。不良的血糖控制增加了患者发展出严重的糖尿病相关并发症(包括心脏病、中风、神经损伤、下肢截肢、视力丧失和肾病)的风险。正在进行研究以鉴定具有较长作用持续时间；因此需要比当前可用的胰岛素产品更少的注射以改善可接受性和遵从性的胰岛素产品。
CN103509118描述了蛋白，其具有通过4至50个氨基酸C-肽连接序列接合的人胰岛素B链和人胰岛素A链，且胰岛素A链直接附接(无额外的接头)至免疫球蛋白Fc片段，并且记载小鼠中的测试表明此类蛋白具有长达约3天的体内半衰期。KR101324828描述了通过使用非肽基接头连接至免疫球蛋白Fc区的胰岛素原类似物，并且记载此类蛋白提供相比于现有疗法延长的血清半衰期。该公开记载非肽基接头表示对肽接头的改善，认为使用肽接头的融合蛋白无法延长活性药物在血液中的半衰期，因为肽接头容易被体内的酶切断。
尽管存在上述和/或任何其他出版物中的公开内容，本发明人克服了多个障碍来发现包含胰岛素受体激动剂、肽接头和人IgG Fc区的融合蛋白，其满足对具有延长的作用持续时间的降血糖产品的不断需要，足以比当前可用的胰岛素产品频率更低地给药，包括不频繁至一周一次地给药。例如，为了实现所期望的延长的时间作用概况，有必要工程改造具有衰减功效以避免快速的受体介导的清除(胰岛素清除的主要途径)、但仍然具有足够的功效来提供充分降血糖的融合蛋白。此外，为了使肾清除(胰岛素清除的另一种主要途径)最小化并且为了通过流体动力学尺寸限制的细胞旁路扩散调节外周暴露，必须将融合蛋白工程改造为足够大并且胰岛素受体激动剂不会在施用后被从人IgG Fc区蛋白水解切割，因为即使人IgG Fc区在循环中保留，此类切割会导致对胰岛素受体激动剂比所需更快的肾清除。此外，IgG Fc结构域已经进化成自缔合以形成稳定的二聚体，并且当此类二聚体由两种融合蛋白(其各自包含与IgG Fc区融合的胰岛素部分)形成时，使两种胰岛素部分彼此紧邻，使得通过胰岛素B链自缔合区介导的胰岛素部分能够自缔合或二聚化。此类胰岛素二聚体是无活性的，因此必须工程改造胰岛素受体激动剂部分自缔合减少的融合蛋白。克服了许多额外的挑战来产生适合于商业制造和配制作为治疗剂的融合蛋白。本发明提供融合蛋白，其相比于现有胰岛素疗法具有延长的作用持续时间，允许比现有胰岛素产品更不频繁地注射(包括长达每周一次)，因此减少与涉及更频繁的注射的现有治疗方案相关的复杂性和疼痛。本发明的融合蛋白具有平坦的药代动力学概况和有限的外周暴露，导致低逐日变化性和最小的低血糖症发病率，包括当与额外的糖尿病药疗法(诸如基于肠降血糖素的疗法)组合提供时。本发明的融合蛋白也可提供延长的作用持续时间，而不引起体重增加。
本发明提供融合蛋白，其包含：
a) 胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中
i) Z1是胰岛素B链类似物，包含以下氨基酸序列：
Figure 355831DEST_PATH_IMAGE001
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是该胰岛素B链类似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰(SEQ ID NO: 1)；
ii) Z2是第一肽接头，其包含5至10个氨基酸，其中所述氨基酸中的至少5个是G残基；且
iii) Z3是胰岛素A链类似物，其包含以下氨基酸序列：
Figure 272972DEST_PATH_IMAGE002
X1是T或I；X2是D、Y、Q或E；X3是G、N、S或A；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸(SEQ ID NO: 2)；
b)第二肽接头；以及
c)人IgG Fc区；
其中胰岛素受体激动剂的C末端残基直接融合至第二肽接头的N末端残基，并且第二肽接头的C末端残基直接融合至IgG Fc区的N末端残基。
本发明还提供融合蛋白，其由以下组成：
a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中
i) Z1是胰岛素B链类似物，其具有以下氨基酸序列：
Figure 52709DEST_PATH_IMAGE003
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是该胰岛素B链类似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰(SEQ ID NO: 1)；
ii) Z2是第一肽接头，其包含5至10个氨基酸，其中所述氨基酸中的至少5个是G残基；且
iii) Z3是胰岛素A链类似物，其具有以下氨基酸序列：
Figure 447918DEST_PATH_IMAGE004
X1是T或I；X2是D、Y、Q或E；X3是G、N、S或A；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸(SEQ ID NO: 2)；
b)第二肽接头；以及
c)人IgG Fc区；
其中胰岛素受体激动剂的C末端残基直接融合至第二肽接头的N末端残基，并且第二肽接头的C末端残基直接融合至IgG Fc区的N末端残基。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供治疗患有糖尿病、肥胖症、异常血脂症或代谢综合症的患者的方法，其包括向有治疗的患者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。本发明还提供治疗或预防选自以下的糖尿病相关病况的方法：心脏病、中风、肾病、视网膜病以及肾病，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。
本发明还提供用于疗法中的本发明的融合蛋白。
本发明还提供本发明的融合蛋白在制造药物中的用途。
本发明还提供编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。
本发明还提供用于产生本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1.在使得本发明的融合蛋白表达的条件下培养包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸的哺乳动物宿主细胞；以及
2. 从所述宿主细胞回收融合蛋白。
本发明还提供由上述方法产生的融合蛋白。
图1. 图1提供本发明的示例性融合蛋白在链脲佐菌素(STZ)治疗的大鼠糖尿病模型中的药效动力学数据。
图2. 图2提供本文描述的蛋白的构型的示意图。应注意，在图2中的图示中使用的特定形状(例如，椭圆形、半圆形等)并非意欲描述或表征，并且不应用于解释本发明的融合蛋白的个别组分的含义或结构。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4或X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰，以及在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少两种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8和X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，其中X6-X9各自为G。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4和X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的位置X4、X5、X6、X7、X8和X9中的每一位置对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包含SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；且X6-X9各自是G。
在某些实施方案中，胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中X3是N并且其中X4是除了G、N、S、V、L或P以外的氨基酸。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4或X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰，以及SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少两种修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO:2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8和X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，其中X6-X9各自为G；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4和X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包含SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的位置X4、X5、X6、X7、X8和X9中的每一位置对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且X6-X9各自为G；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1或X2处对人胰岛素A链的氨基酸序列的至少一种修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4或X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰，以及在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少两种修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO:2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8和X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，其中X6-X9各自为G；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4和X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包含SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的位置X4、X5、X6、X7、X8和X9中的每一位置对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且X6-X9各自为G；并且胰岛素A链类似物包括在SEQ ID NO: 2的X1和X2两者处对人胰岛素A链的氨基酸序列的修饰。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4或X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰，以及在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少两种修饰；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X6、X7、X8和X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，其中X6-X9各自为G，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的X4和X5处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包含SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的位置X4、X5、X6、X7、X8和X9中的每一位置对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的修饰；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，胰岛素B链类似物具有SEQ ID NO: 1的序列，其中：X1是F；X2是V；X3是N或D；X4是E；X5是H；并且X6-X9各自为G；并且胰岛素A链类似物具有SEQ ID NO: 2的序列，其中：X1是I或T；X2是D；X3是G；并且X4不存在。
在某些实施方案中，第一肽接头(Z2)包含以下氨基酸序列：
Figure 199974DEST_PATH_IMAGE005
，其中X1是G或不存在；并且X2是G、S或不存在(SEQ ID NO: 3)。
在某些实施方案中，胰岛素受体激动剂，即上述融合蛋白中的Z1-Z2-Z3，包含以下氨基酸序列：
Figure 22436DEST_PATH_IMAGE006
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在；X10是G或不存在；X11是G、S或不存在；X12是T或I；X13是D、Y、Q或E；X14是G、N、S或A；并且X15是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是X4、X5、X6、X7、X8或X9 中的至少一个必须是与在人胰岛素分子的B链的位置B16、B25、B27、B28、B29或B30处分别发现的氨基酸不同的氨基酸，并且进一步条件是如果X14是N，则X15必须是除G或N以外的氨基酸(SEQ ID NO: 4)。
在某些优选实施方案中，胰岛素受体激动剂，即上述融合蛋白中的Z1-Z2-Z3具有以下氨基酸序列：
Figure 476420DEST_PATH_IMAGE007
(SEQ ID NO:5)。
在某些实施方案中，第二肽接头是具有10至25个氨基酸的肽，其中所述氨基酸中的至少50%是G残基。在某些实施方案中，第二肽接头是包含氨基酸序列[GGGGX] n 的肽，其中X是Q、E或S；并且其中 n 是2-5。在某些实施方案中，第二肽接头包含以下氨基酸序列：
Figure 675320DEST_PATH_IMAGE008
其中X1是Q或E；X2是Q或E；X3是Q或E；X4是G、E、Q或不存在；X5是G或不存在；并且X6是G或不存在(SEQ ID NO: 6)。
在某些优选实施方案中，第二肽接头具有以下氨基酸序列：
Figure 344199DEST_PATH_IMAGE009
。
在某些实施方案中，人IgG Fc区包含来自IgG抗体的一条重链的片段。包含此类IgG区的融合蛋白的示意图提供于图2中的图示(A)中。在其他实施方案中，人IgG Fc区包含来自IgG抗体的两个重链的片段。包含此类IgG区的融合蛋白的示意图提供于图2中的图示(B)中。
在某些实施方案中，人IgG Fc区是来自IgG1、IgG2或IgG4抗体的Fc区。
在某些实施方案中，人IgG Fc区是来自IgG1抗体的Fc区，其包含以下氨基酸序列：
Figure 337563DEST_PATH_IMAGE010
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；并且X6是K或不存在。(SEQ ID NO: 8)。
在某些实施方案中，IgG Fc区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列并且进一步在SEQID NO: 8中的位置1处的C残基的N末端侧包含在野生型IgG1 Fc序列中将发现的一些或所有氨基酸。
优选地，人IgG Fc区来自IgG2或IgG4抗体。
在某些实施方案中，人IgG Fc区是来自IgG4抗体的Fc区，其包含以下氨基酸序列：
Figure 29575DEST_PATH_IMAGE011
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；X6是R或K；X7是K或不存在。(SEQ ID NO: 9)。
在某些实施方案中，IgG Fc区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列并且进一步在SEQID NO: 9中的位置1处的C残基的N末端侧包含在野生型IgG4 Fc序列中将发现的一些或所有氨基酸。在某些实施方案中，人IgG Fc区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列，其中X1是F；X2是F；X3是V；X4是V；X5是N；X6是R；并且X7不存在。
在某些实施方案中，人IgG Fc区是来自IgG2抗体的Fc区，其具有以下氨基酸序列：
Figure 766587DEST_PATH_IMAGE012
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；并且X6是K或不存在。(SEQ ID NO: 10)。
在某些实施方案中，IgG Fc区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列并且进一步在SEQID NO: 10中的位置1处的E残基的N末端侧包含在野生型IgG2 Fc序列中将发现的一些或所有氨基酸。在某些实施方案中，人IgG Fc区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，其中X1是F；X2是F；X3是V；X4是V；X5是N；并且X6不存在。
在某些实施方案中，融合蛋白包含以下氨基酸序列：
Figure 289972DEST_PATH_IMAGE013
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是X4、X5、X6、X7、X8或X9中的至少一个是除了在人胰岛素B链的位置B16、B25、B27、B28、B29或B30处分别存在的氨基酸以外的氨基酸；X10是G或不存在；X11是G、S或不存在；X12是T或I；X13是D、Y、Q或E；X14是G、N、S或A；X15是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X14是N，则X15必须是除G或N以外的氨基酸；X16是Q或E；X17是Q或E；X18是Q或E；X19是G、E、Q或不存在；X20是G或不存在；X21是G或不存在；X22是E或P；X23是E或P；X24是A或V；X25是G或不存在；X26是Q或H；X27是Y或F；X28是L或V；X29是S或A；X30是S或P；X31是A或T；X32是Q或R；X33是V或M；X34是R或K；X35是E或Q；并且X36是L或P (SEQ ID NO: 11)。
在某些实施方案中，本发明提供选自以下的融合蛋白：SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24。
在一个优选实施方案中，融合蛋白具有以下氨基酸序列：
Figure 719817DEST_PATH_IMAGE014
Figure 148393DEST_PATH_IMAGE015
。
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白以二聚体形式存在。此类二聚体的示意图提供于图2中的图示(C)中。在某些实施方案中，二聚体是同型二聚体，其中构成二聚体的两个融合蛋白的氨基酸序列是相同的。在某些实施方案中，二聚体是异型二聚体，其中构成二聚体的两个融合蛋白的氨基酸序列是不同的。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的融合蛋白、缓冲剂、表面活性剂和等渗剂。在某些实施方案中，所述缓冲剂是柠檬酸和/或柠檬酸盐，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80，并且所述等渗剂是甘露醇。在某些实施方案中，所述组合物的pH范围为约5.5至约8.0。在某些实施方案中，pH范围为约6.0至约7.4。在某些实施方案中，pH范围为约6.0至6.75。
在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含额外的活性成分。在某些实施方案中，额外的活性成分是基于肠降血糖素的疗法。在某些优选实施方案中，基于肠降血糖素的疗法是GLP-1R激动剂。优选地，所述GLP-1R激动剂是度拉糖肽(dulaglutide)。
在某些实施方案中，本发明的方法包括每日一次施用治疗有效量的融合蛋白。在优选实施方案中，每周一次施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，每个月一次施用治疗有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了治疗患有糖尿病的患者、同时降低低血糖和/或体重增加的风险的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白。
本发明还提供治疗患有糖尿病、肥胖症、异常血脂症和/或代谢综合症的患者的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的融合蛋白以及额外的活性成分。在此类实施方案中，所述融合蛋白和额外的活性成分可同时施用、相继施用或者在单一组合制剂中施用。在某些实施方案中，额外的活性成分是基于肠降血糖素的疗法。在某些优选实施方案中，基于肠降血糖素的疗法是GLP-1R激动剂。优选地，GLP-1R激动剂是度拉糖肽。在某些实施方案中，每日一次施用该组合。在某些优选实施方案中，每周一次施用该组合。在某些实施方案中，每个月一次施用该组合。
在某些实施方案中，本发明提供用于治疗糖尿病、肥胖症、异常血脂症或代谢综合症的本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗或者预防选自以下的糖尿病相关的病况的本发明的融合蛋白：心脏病、中风、肾病变、视网膜病以及肾病。在某些实施方案中，本发明提供本发明的融合蛋白，其用于治疗患有糖尿病的患者、同时降低低血糖和/或体重增加的风险，其包括向患者施用本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白提供为与另一活性成分同时、分开或者相继组合使用。在某些实施方案中，额外的活性成分是基于肠降血糖素的疗法。在某些优选实施方案中，基于肠降血糖素的疗法是GLP-1R激动剂。
在某些实施方案中，本发明提供本发明的融合蛋白在制造用于治疗糖尿病、肥胖症、异常血脂症或代谢综合症的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供本发明的融合蛋白在制造用于治疗或者预防选自以下的糖尿病相关的病况的药物中的用途：心脏病、中风、肾病变、视网膜病以及肾病。在某些实施方案中，本发明提供本发明的融合蛋白在制造药物中的用途，所述药物用于治疗糖尿病、同时降低低血糖和/或体重增加的风险，其包括向患者施用本发明的融合蛋白。在某些实施方案中，本发明提供本发明的融合蛋白在制造用于治疗糖尿病、肥胖症、异常血脂症或代谢综合症的药物中的用途，其中该药物与另一活性成分同时、分开或者相继组合施用。
当在本文中使用时，术语“胰岛素受体激动剂”是指结合至并且活化胰岛素受体、导致血糖水平下降和/或肝葡萄糖排出抑制的蛋白，其特征在于其可使用已知技术(诸如在下文描述的研究中显示的那些)进行测试和测量。
本发明的融合蛋白的胰岛素受体激动剂部分包括胰岛素B链的类似物和胰岛素A链的类似物。当在本文中使用时，术语“胰岛素A链”和“胰岛素B链”是指人胰岛素分子(CAS号11061-68-0)的A链和B链，其天然野生型序列是众所周知的。人胰岛素A链由21个氨基酸组成，在本领域中被称为A1-A21，其具有以下序列：
Figure 423516DEST_PATH_IMAGE016
。
人胰岛素B链由30个氨基酸组成，在本领域中被称为B1-B30，具有以下序列：
Figure 66987DEST_PATH_IMAGE017
。
在人胰岛素分子中，A链和B链通过两个二硫键CysA7-CysB7与CysA20-CysB19接合。A链在CysA6-CysA11处具有链内二硫键。
为了实现所需的延长的时间作用概况，本发明的融合蛋白的胰岛素受体激动剂必须在循环中保留，并且能够在延长的时间段内与胰岛素受体相互作用。为了使本发明的融合蛋白在循环中保留所需时段，必须使融合蛋白的清除衰减。胰岛素清除的两种主要途径是肾清除和胰岛素受体介导的清除。参见Iglesias P,等人Diabetes Obes. Metab. 2008;10:811-823。为了使肾清除最小化，需要具有至少约人血清白蛋白的大小的流体动力学大小的分子，并且此类流体动力学大小在本发明的融合蛋白由人IgG Fc区提供。关于受体介导的清除，融合蛋白不可在胰岛素受体处有效，使得导致比所期望更快的受体介导的清除，但该融合蛋白然而必须足够有效以在商业上可行的剂量下提供充分的葡萄糖控制。因此，必须小心平衡融合蛋白的功效，并且本发明的融合蛋白的结构使得其实现此类平衡。
胰岛素分子具有自缔合成二聚体和六聚体的倾向。已经针对胰岛素的进化上保守的、自缔合倾向提出了许多作用，包括：(1)在细胞内的泡贮存期间分子的化学和热稳定化；(2)保护单体胰岛素免于体内原纤化作用；(3)在细胞内表达期间替代伴侣蛋白辅助的稳定化和折叠；和/或(4)对于分泌输送是关键的。然而，胰岛素的活性形式是单体。
胰岛素分子的自缔合倾向和此类自缔合分子的无活性与本发明相关，因为人IgGFc区也倾向于自缔合以形成二聚体，通常在铰链区中通过二硫键共价缔合，并且此类二聚体由本发明的融合蛋白中的人IgG Fc区形成。作为人IgG Fc区的二聚化的结果，两个胰岛素受体激动剂“臂”彼此紧邻，并且由此以相对高的局部浓度存在。在人胰岛素的情况下，此类紧邻将倾向于促成胰岛素部分的自缔合或二聚化，从而影响分子的活性。具有已经变成自缔合或二聚化的胰岛素部分臂的Fc融合蛋白二聚体的示意图提供于图2的图示(D)中。胰岛素分子的自缔合倾向也可导致来自多于一个Fc融合蛋白二聚体的胰岛素部分的自缔合或者二聚化；具有自缔合或二聚化的胰岛素部分的两个Fc融合蛋白二聚体的二聚体的示意图提供于图2的图示(E)中。此外，多于两个Fc融合蛋白二聚体中的胰岛素部分也可以此方式自缔合，以形成例如由三个二聚体组成的三聚体，或者由多于三个二聚体组成的更高等级的聚合体。
然而，本发明的融合蛋白的胰岛素受体激动剂部分具有降低的自缔合或者二聚化倾向，因此由本发明的融合蛋白组成的融合蛋白二聚体倾向于促成图2的图示(C)中所描绘的结构，与图2的图示(D)和(E)中描绘的结构不同。因此，虽然本发明提供两个融合蛋白的二聚体，但是该二聚体中的每一融合蛋白的胰岛素受体激动剂“臂”维持主要单体状态，如例如在图1的图示(C)中所描绘，并且因此更加能够与胰岛素受体相互作用。
在本发明的融合蛋白中，胰岛素受体激动剂中胰岛素B链的类似物包括对人胰岛素B链的氨基酸序列的一种或多种修饰。具体而言，为了降低胰岛素受体激动剂部分自缔合或二聚化的倾向，胰岛素B链类似物包括对人胰岛素分子的B链的位置B16、B25或B27-30处的一种或多种修饰，所述位置在SEQ ID NO: 1中分别被表示为位置X4、X5和X6-9。例如：X4(其对应于人胰岛素分子的B链中的B16)可被修饰成E、Q或H；X5(其对应于人胰岛素分子的B链中的B25)可被修饰成H；X6(其对应于人胰岛素分子的B链中的B27)可缺失或被修饰成G、S、H或V；X7(其对应于人胰岛素分子的B链中的B28)可缺失或被修饰成G、E、K、D、S或H；X8(其对应于人胰岛素分子的B链中的B29)可缺失或被修饰成G、E、P、Q、D或H；并且X9(其对应于人胰岛素分子的B链中的B30)可缺失或被修饰成G、S、E或K。除了降低胰岛素受体激动剂部分自缔合倾向的外，也可对胰岛素B链类似物上的位置B16和B25-分别为SEQ ID NO: 1的X4和X5-进行修饰以调节功效，改善表达，改善化学和/或物理稳定性，改善融合蛋白可与其他常用赋形剂一起配制的容易度和/或以消除脱酰胺作用。胰岛素B链类似物也可包括出于这些原因进行的额外修饰。参照SEQ ID NO: 1中的变量，此类额外修饰包括以下：将X1(其对应于人胰岛素分子的B链中的B1)修饰成Q或者A；将X2(其对应于人胰岛素分子的B链中的B2)修饰成G；和/或将X3(其对应于人胰岛素分子的B链中的B3)修饰成K、D或G。
在某些优选实施方案中，胰岛素B链类似物包括在SEQ ID NO: 1的位置X4、X5和X6-9处对人胰岛素B链的氨基酸序列的多于一种修饰。在一个优选实施方案中，X4是E并且X5是H。在某些实施方案中，SEQ ID NO: 1的X6-X9的氨基酸序列选自：GGES、GGGS、GGDS、GGEG、GGGG、SSES、SSGS、GGEE、GGGE、GGEK、GGGK、TPGS、TGGS、HGES、GHES、GGHS、GGEH、HGGS、GHGS、GGGH、GGDD、VGES、TEET、TKPT、GGGG、TGGG、TPGG、EPKT、TDKT、TPGS、EGGS、EGES、EEES、EPES、EPEP和GGDD。在优选实施方案中，该四个氨基酸的序列是GGGS、GGGG或TEET。在特别优选的实施方案中，X4是E，X5是H并且X6-9是GGGG。
应注意，尽管SEQ ID NO: 1的X6-X9如上描述为包含胰岛素B链类似物(Z1)的C末端，但是这些氨基酸对于融合蛋白对胰岛素受体的活性并不关键，并且因此可替代地被视为第一肽接头(Z2)的延伸。例如，在SEQ ID NO: 4的上下文中，X6-X9可被视为胰岛素B链类似物的任一部分或者该胰岛素受体激动剂中的第一肽接头。
在本发明的融合蛋白中，该胰岛素受体激动剂部分中的胰岛素A链类似物可包括对人胰岛素A链的氨基酸序列的一种或多种修饰，所述修饰意欲改善化学和物理稳定性、调节功效和/或增强表达。参照SEQ ID NO: 2中的变量，这些修饰包括以下：将X1(其对应于人胰岛素分子的A链中的A10)修饰成T；将X2(其对应于人胰岛素分子的A链中的A14)修饰成D、Q或E；和/或将X3(其对应于人胰岛素分子的A链中的A21)修饰成G、S或A。在一个优选实施方案中，X1是T，X2是D，并且X3是G。
此外，为了避免脱酰胺作用以及化学和/或蛋白水解性裂解，如果胰岛素受体激动剂中的胰岛素A链类似物中的位置21处的氨基酸(即，SEQ ID NO: 2中的X3)是N-在人胰岛素分子中的相应位置处存在的氨基酸-则在C末端侧处不能紧接某些氨基酸，诸如G或N，或者在某些实施方案中P、S、V或L。参见例如Vlasak J, Ionescu R., MAbs. 2011 May-Jun;3(3):253-63. Fragmentation of Monoclonal Antibodies。应注意，尽管在用于属于胰岛素A链类似物的SEQ ID NO: 2中的位置X4和X5的选项的情况下在如上所述的第一融合蛋白中记载了此要求，但在被视为胰岛素受体激动剂的部分的胰岛素A链类似物中的位置21处的天冬酰胺残基之后为非甘氨酸残基并不关键，与第二肽接头不同。例如，在SEQ ID NO:11的上下文中，与A链类似物部分中的位置21相对应的残基由X14表示，并且随后氨基酸X15可被视为胰岛素受体激动剂的部分或者第二肽接头。
如上所述，在本发明的融合蛋白中，胰岛素B链类似物的C末端残基直接融合至第一肽接头的N末端残基，并且第一肽接头的C末端残基直接融合至胰岛素B链类似物的N末端残基。第一肽接头必须为胰岛素A链和胰岛素B链的类似物提供充分的柔性，以实现结合至胰岛素受体所必需的结构，但是不能长到其过度干扰该结合。可调节第一肽接头的长度和组成以便调节融合蛋白的功效和/或表达。在一些实施方案中，第一肽接头为5至10个氨基酸长，所述氨基酸中的至少5个为G残基。在某些实施方案中，第一肽接头的氨基酸序列选自：GGGGGG、GGGGG、EGGGGG、GEGGGG、GGEGGG、GGGEGG、GGGGEG、GGGGGE、KGGGGG、GKGGGG、GGKGGG、GGGKGG、GGGGKG、GGGGGK、HGGGGG、GHGGGG、GGHGGG、GGGHGG、GGGGHG、GGGGGH、GGGGGA、GGGGGR、SGGGGG、GSGGGG、GGSGGG、GGSGGGK、GGSGGGG和GGSGGG。在某些优选实施方案中，第一肽接头的序列包含SEQ ID NO: 3。最优选地，第一肽接头的序列为GGSGGGG(SEQ ID NO:15)。本发明的融合蛋白的胰岛素受体激动剂部分也包括在如上所述的人胰岛素分子中存在的二硫键，即在CysA7-CysB7和CysA20-CysB19处接合胰岛素A链和胰岛素B链的类似物的两个二硫键；以及在胰岛素A链的类似物中CysA6-CysA11处的链内二硫键。
如上所述，本发明的融合蛋白的胰岛素受体激动剂部分的C末端残基融合至第二肽接头的N末端残基，并且该第二肽接头的C末端残基直接融合至Fc部分的N末端残基。优选的是，第二肽接头富含甘氨酸，以提供充分的构象柔性。优选地，第二肽接头为小于30个氨基酸长。在某些优选实施方案中，第二肽接头为10至25个氨基酸长，其中所述氨基酸的至少50%是甘氨酸残基。优选的第二肽接头包括序列(GGGGX15)n，其中X15是Q、E或S并且n=2-5。更优选的第二肽接头具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。最优选的第二肽接头具有氨基酸序列
Figure 402154DEST_PATH_IMAGE018
。
如本文所用，术语“人IgG Fc区域”具有该术语在免疫学领域中通常给定的含义。特别地，该术语是指通过从抗体移除两个抗原结合区(Fab片段)而获得的人IgG抗体片段。具体而言，Fc区包括抗体的CH2和CH3恒定区结构域，并且也可包括一些或所有铰链区。
如上所述，在本发明的融合蛋白的某些实施方案中，人IgG Fc区包含来自IgG抗体的一条重链的恒定区的片段，所述片段的示意性描述提供于图2的图示(A)中，并且在其他实施方案中，人IgG Fc区包含来自IgG抗体的两条重链的恒定区的片段，所述片段的示意性描述提供于图2的图示(B)中。在此实施方案中，该两条重链的恒定区通过非共价的相互作用和二硫键而彼此缔合。
存在四种IgG子类(G1、G2、G3和G4)，其各自具有不同的结构和被称为效应物功能的生物学功能。这些效应物功能一般通过与Fc受体(FcγR)相互作用或者通过结合补体因子C1q来介导。结合至FcγR可导致抗体依赖性的细胞介导的细胞裂解，而结合至补体因子可导致补体介导的细胞裂解。IgG子类的Fc区的结构和性质是本领域中已知的。本发明的融合蛋白可含有来自任何IgG子类的Fc区，尽管G2和G4比G1和G3抗体具有更低的受体结合和效应物功能活性，因此是优选的。
当在本文中使用时，术语人IgG Fc区还包括此类抗体片段的已经修饰、延伸和/或截短以例如改变性质或特征的版本，所述性质或特征诸如补体和/或Fc受体结合功能、效应物功能、二硫键形成、糖基化、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、可制造性和/或稳定性。例如，本发明的融合蛋白的人IgG Fc区可进行修饰以减少或移除N-连接的糖基化位点，其将降低C1q结合亲和力和细胞毒性，并且可有助于免疫原性，影响构象稳定性和体内清除率和/或改变效应物功能。本发明的融合蛋白的人IgG Fc区也可将一些或所有铰链区移除，以便简化二硫化物介导的Fc二聚化。变化的其他实例包括磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、乙酰化、酰胺化和/或能够产生异型二聚体分子的修饰。用于改变IgG子类的人IgG Fc区的结构和性质的技术是本领域中已知的。
不论融合蛋白的最终结构，人IgG Fc区必须用于延长胰岛素受体激动剂的体内血浆半衰期。在制备其中Fc部分出于其延长半衰期的能力而被利用的异源Fc融合蛋白中，最小化任何效应物功能是重要的。此外，融合的胰岛素受体激动剂必须保持能够结合并且活化胰岛素受体，以导致血糖水平的降低和/或肝葡萄糖排出的抑制，所述融合的胰岛素受体激动剂的特征可使用已知的技术(诸如在下文所描述的研究中显示的那些技术)来测试和测量。本发明的融合蛋白的长半衰期可使用例如下文所描述的方法来证明。
一种优选的人IgG Fc区是IgG4 Fc区，其经修饰以进一步降低效应物功能、促进同型二聚体形成并且其铰链的一部分缺失，如SEQ ID NO: 9中所示，其中X1是F；X2是F；X3是V；X4是V；X5是N；X6是R；并且X7不存在。
另一种优选的人IgG Fc区是IgG2 Fc区，其铰链的一部分缺失，如SEQ ID NO: 10中所示，其中X1是F；X2是F；X3是V；X4是V；X5是N；并且X6不存在。
应注意，尽管上文叙述的优选人IgG Fc区的氨基酸序列的铰链区的部分被移除以简化二硫化物介导的二聚化，但在某些实施方案中那些铰链区可存在。例如，野生型IgG2Fc区在其N末端处包括六个氨基酸序列ERKCCV，并且尽管这些氨基酸在SEQ ID NO: 10中给出的IgG2 Fc区序列中未叙述，但预期包含SEQ ID NO: 10中给出的氨基酸序列的人IgG Fc区可进一步在其N末端处包含六个氨基酸序列ERKCCV中的一些或所有。类似地，包含SEQ IDNO: 9中给出的氨基酸序列的人IgG Fc区可进一步包含在IgG4 Fc区的N末端处存在的六个氨基酸(即ESKYGP)的一些或者所有。类似地，包含SEQ ID NO: 8中给出的氨基酸序列的人IgG Fc区可进一步包含在IgG1 Fc区的N末端处存在的十个氨基酸(即EPKSCDKTHT)中的一些或者所有。此外，构成第二肽接头的C末端的氨基酸与构成人IgG Fc区的N末端的氨基酸之间的精确界限划定(precise delineation)对于本发明的融合蛋白的结构或功能不是关键的。例如，在SEQ ID NO: 11的情况中，与位置X19-X22相对应的残基可被描述为第二肽接头的C末端或者人IgG Fc区的N末端延伸。
如上所述，本发明还涉及编码本发明的融合蛋白中的任一者的多核苷酸。编码上述融合蛋白的多核苷酸可以是RNA或DNA的形式，其包括cDNA和合成DNA，并且其可以是双链或单链的。编码本发明的蛋白的编码序列可由于遗传密码的冗余或简并性而变化。
编码本发明的融合蛋白的多核苷酸可包括以下：仅蛋白的编码序列，蛋白的编码序列和额外编码序列(诸如前导或分泌序列或前蛋白序列)；蛋白的编码序列和非编码序列(诸如内含子或蛋白的编码序列的5'和/或3'端的非编码序列)。因此，术语“编码蛋白的多核苷酸”不仅涵盖可包括蛋白的编码序列的多核苷酸，而且涵盖包括额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸将在序列已经可操作连接至表达控制序列后在宿主细胞中表达。表达载体一般可在宿主生物体中作为附加体或者作为宿主染色体DNA的组成部分来复制。通常，表达载体将含有选择标记以允许检测转化有所需DNA序列的那些细胞。
本发明的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如CHO、NSO、HEK293、BHK或者COS细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中已知的技术培养。然而，昆虫和酵母或其他真菌细胞产生非人N-聚糖，因此在此类细胞中产生的具有N-连接糖基化的蛋白如果施用至患者则可引起免疫原性反应。此类细胞中的生产因此需要消除N-连接的糖基化位点和/或对所述细胞进行基因工程改造，以使用本领域中已知的技术来产生人N-聚糖。参见例如Hamilton SR, 等人, Production of complex human glycoproteins in yeast, 301 Science (5637): 1244–6 (2003年8月)。在哺乳动物细胞中进行生产是优选的，并且优选的哺乳动物宿主细胞是含有谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统的CHOK1SV细胞系(参见美国专利号5,122,464)。
可通过众所周知的方法将包含目标多核苷酸序列(例如，融合蛋白和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞内，所述方法可根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转化通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。
可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中已知的并且描述于例如Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, N.Y. (1994)。
如上所述，本发明的融合蛋白在某些实施方案中作为二聚体产生。在此类二聚体中，融合蛋白的人IgG Fc区域通过非共价相互作用和二硫键而彼此缔合。此类二聚体的示意图提供在图2的图示(C)中。当组成此类二聚体的两个融合蛋白-例如，图2的图示(C)中描绘的二聚体中的融合蛋白A和融合蛋白B-的氨基酸序列相同时，该二聚体在本文中被称为“同型二聚体”。如上所述，本发明的融合蛋白在哺乳动物细胞中表达是优选的，并且在此类细胞中的表达产生同型二聚体。此类同型二聚体中的融合蛋白通过Fc部分中的非共价相互作用和分子间二硫键来缔合。例如，由编码SEQ ID NO: 12的融合蛋白的基因产生的蛋白将是通过链内二硫键(即C80至C80和C83至C83)共价键合的同型二聚体。
当组成二聚体的两个融合蛋白-例如，图2的图示(C)中的融合蛋白A和融合蛋白B-的氨基酸序列不同时，该二聚体在本文中被称为“异型二聚体”。此类异型二聚体可通过本领域中已知的技术来制备。参见例如Lewis SM, 等人
Figure 131075DEST_PATH_IMAGE019
32(2):191-8(2014); Carter, J.
Figure 209890DEST_PATH_IMAGE020
248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. 等人
Figure 707867DEST_PATH_IMAGE021
9(7):617-2 (1996)。
在本文中提及包含融合蛋白的药物组合物包括：含有该融合蛋白的同型二聚体和/或含有异型二聚体的药物组合物，其中该异型二聚体的一个成员是该融合蛋白。类似地，本文提及包括施用融合蛋白的方法包括包括以下步骤的方法：施用该融合蛋白的同型二聚体和/或施用异型二聚体，其中该异型二聚体中的一个成员是该融合蛋白。类似地，提及用于疗法的融合蛋白和/或用于制造药物的融合蛋白包括：该融合蛋白的同型二聚体和/或其中异型二聚体的一个成员是该融合蛋白的异型二聚体，其用于治疗和/或药物制造。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指管理和护理患有糖尿病或高血糖或者具有其他病况的患者，对于所述病况出于对抗或减轻那些病况的症状和并发症的目的而指示施用胰岛素。治疗包括施用本发明的融合蛋白以预防或延迟症状或并发症的发作，减轻症状或并发症，或者消除疾病、病况或病症。待治疗的患者是哺乳动物，并且优选地为人类。
如本文所用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指降低一种或多种病况、症状、并发症或病症的风险或发病率，或者消除或减缓一种或多种病况、症状、并发症或病症的进展。
本发明的融合蛋白可用于治疗患有各种疾病和病况的主体。包括患有高血糖、胰岛素依赖型糖尿病的主体和患有非胰岛素依赖型糖尿病的主体，包括未经治疗的主体(treatment naïve subject)以及用口服药物(诸如，磺酰脲、二甲双胍、噻唑烷二酮诸如吡格列酮、α-葡糖苷酶抑制剂诸如阿卡波糖)和/或非胰岛素可注射剂(包括基于肠降血糖素的疗法，诸如DPP-4抑制剂和GLP-1R激动剂)治疗的主体。本发明的融合蛋白可用于调节此类患者中的血糖，并且可治疗由于不足的血糖控制导致的病况或并发症，诸如视网膜病、神经性病变或肾病。
在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白每天施用、每隔一天施用、每周施用两次、每周施用三次、每周施用一次、每月施用两次或每月施用一次。在优选实施方案中，作用的持续时间被足够延长以允许每周给药一次。然而，甚至对于此类长效分子，本领域技术人员将认识到，也可通过使用更频繁的治疗方案(诸如，每日一次)，逐渐剂量累积具有长时药代动力学概况的药物，来提供有效的血糖控制。参见例如Heise T和Meneghini LF, 20
Figure 479514DEST_PATH_IMAGE022
p75-83 (2014)。
在某些实施方案中，将本发明的融合蛋白与额外的活性成分组合施用，所述额外的活性成分诸如胰岛素或胰岛素类似物、基于肠降血糖素的疗法，或者口服糖尿病药物(诸如，磺酰脲、二甲双胍、噻唑烷二酮诸如吡格列酮，或α-葡糖苷酶抑制剂诸如阿卡波糖)。
术语“基于肠降血糖素的疗法”包括：包括施用被称为肠降血糖素的代谢激素的群组或者促进、实现、增强和/或模拟所述代谢激素的群组的效应的任何治疗，所述群组包括GLP-1和胃抑制肽(GIP)。当前可用的基于肠降血糖素的疗法包括DPP-4抑制剂和GLP-1R激动剂。
“DPP-4抑制剂”是阻断DPP-4酶的化合物，所述DPP-4酶负责降解肠降血糖素。当前可用的DPP-4抑制剂包括西他列汀(sitagliptin)(Januvia®)和利格列汀(linagliptin)(Tradjenta®)。
“GLP-1R激动剂”被定义为包含天然人GLP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)的化合物，GLP-1类似物，GLP-1衍生物或GLP-1融合蛋白，其维持对GLP-1受体的活性。GLP-1R活性可通过本领域中已知的方法来测量，包括使用测量GLP-1受体结合活性或者受体活化的体内实验和体外测定，例如采用胰岛细胞或胰岛瘤细胞的测定，分别如EP 619,322和美国专利号5,120,712所述。GLP-1类似物是当与天然人GLP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)相比时具有修饰的分子，所述修饰包括一种或多种氨基酸取代、缺失、倒置或添加。GLP-1衍生物是具有天然人GLP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)或者GLP-1类似物的氨基酸序列、但另外具有其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或者末端羧酸基团的一个或多个的至少一种化学修饰的分子。GLP-1融合蛋白是包含GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物部分以及第二多肽的异源蛋白。当前可用的GLP-1R激动剂包括艾塞那肽(Byetta®和Bydureon®)、利拉鲁肽(Victoza®)、阿必鲁肽(Tanzeum®)以及度拉糖肽(Trulicity®)，其结构是本领域中已知的。参见例如US 5,424,286(艾塞那肽)；US 6,268,343(利拉鲁肽)；US 2014044717(阿必鲁肽)；以及US 7,452,966(度拉糖肽)。
在其中将本发明的融合蛋白与额外的活性成分组合提供的实施方案中，所述融合蛋白和额外的活性成分可同时施用，依次施用，或者在单一、组合的制剂中施用。
本发明的融合蛋白可通过向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白来有效治疗此类疾病和病况。如本文所用，用语“治疗有效量”是指本发明的融合蛋白足以调节患者中的血糖、而不会引起不可接受的副作用的量。施用至主体的融合蛋白的治疗有效量将取决于疾病的类型和严重程度以及主体的特征，诸如总体健康、年龄、性别、体重和耐药性。技术人员将能够根据这些和其他因素来确定合适的剂量。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约0.01nmol/kg至约100nmol/kg。更优选地，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约1nmol/kg至约50nmol/kg。更优选地，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约16nmol/kg至约25nmol/kg。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约1mg至约200mg。更优选地，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约25mg至约175mg。更优选地，本发明的融合蛋白当每周施用一次时的治疗有效量范围为约100mg至约160mg。
本领域技术人员将理解当将本发明的融合蛋白与另一种活性成分(诸如，GLP-1R激动剂)组合施用时，可调节剂量，使得两种治疗的组合活性足以调节患者中的血糖。因此，必须以此类组合施用来调节血糖水平所的融合蛋白的量可小于该融合蛋白作为单一疗法施用时所需的量。例如，当本发明的融合蛋白与GLP-1R激动剂组合提供时，以每周一次剂量提供的融合蛋白的量相比于相同融合蛋白用作单一疗法的量(诸如在前一段中所描述的剂量)可减少多达50%。
优选地，在一些实施方案中施用治疗有效量的本发明的融合蛋白将提供有效的血糖控制，同时相比于现有治疗减少低血糖和/或体重增加的风险。由对胰岛素受体有激动作用的糖尿病疗法引起的低血糖症的发病率可通过避免治疗剂的浓度在施用后快速激增(rapid spike)来最小化。本发明的融合蛋白具有延时作用概况，而在施用后浓度不会快速飙升。
此外，在其中本发明的融合蛋白与另一种活性成分(特别地，GLP-1R激动剂)组合提供的实施方案中，本发明的融合蛋白的肝脏优先(hepatopreferential)活性也可降低低血糖症的风险，同时控制血糖水平。因为本发明的融合蛋白可轻易地通过有孔血窦内皮进入肝脏，所以该分子可控制肝葡萄糖排出，对外周具有很少的活性(如果有)，同时GLP-1R激动剂促进来自胰腺的内源性胰岛素的葡萄糖依赖型分泌，所述内源性胰岛素能够轻易地散布到外周中以控制肌肉和脂肪中的葡萄糖摄取。
本发明的融合蛋白肠胃外、通过鼻腔施用或肺部吸入进行施用。肠胃外施用是优选的，并且可包括例如全身施用，诸如通过肌内注射、静脉内注射、皮下注射或腹膜内注射。
可将融合蛋白在药物组合物中施用至主体，所述药物组合物包含本发明的融合蛋白以及至少一种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物通常本质上(但不必然)是肠胃外的，并且可使用肠胃外产品的常规赋形剂，通过各种技术中的任一技术来制备，所述技术是本领域中众所周知的。参见例如，Remington: the Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, Editor, 第21版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。如上所述，本发明的融合蛋白当在哺乳动物细胞中表达时是同型二聚体。因此，当在本文中使用时，术语“包含融合蛋白的组合物”包括含有融合蛋白的同型二聚体的组合物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物包括其中本发明的融合蛋白以以下浓度存在的组合物：至少1mg/mL，至少2mg/mL，至少5mg/mL，至少10mg/mL，至少20mg/mL，至少25mg/mL，至少30mg/mL，至少35mg/mL，至少50mg/mL，至少55mg/mL，至少50mg/mL，至少65mg/mL，至少75mg/mL，至少100mg/mL或更大。在优选实施方案中，融合蛋白以10-100mg/mL的浓度存在。在更优选实施方案中，融合蛋白以15-75mg/mL的浓度存在，并且在最优选实施方案中，融合蛋白以20-65mg/mL的浓度存在。
术语“赋形剂”意味着添加至该组合物中的除了融合蛋白或任何其他额外活性成分以外的任何物质。可在本发明的组合物中使用的此类赋形剂的实例包括缓冲剂、表面活性剂、等渗剂和防腐剂。
在某些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种缓冲剂来控制组合物的pH。“缓冲剂”是通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH变化的物质。在某些实施方案中，本发明的组合物具有约5.5至约8.0，优选地在约6.0和约7.4之间，更优选地在约6.0和6.75之间的pH。适用于将本发明的组合物的pH控制在所需范围内的缓冲剂包括但不限于试剂诸如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或其酸，精氨酸、TRIS，以及组氨酸缓冲剂，以及其组合。“TRIS”是指2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇，和其任何药理学上可接受的盐。游离碱和盐酸盐形式(即，TRIS-HCl)是TRIS的两种常见形式。TRIS也在本领域中被称为三羟甲基氨基甲烷(trimethylol aminomethane)、氨丁三醇(tromethamine)，以及三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl) aminomethane)。本发明的组合物中的优选缓冲剂是柠檬酸盐或柠檬酸，以及磷酸盐。
在某些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种等渗剂以最小化注射后由于细胞肿胀(cellular swelling)或者细胞破裂(cellular rupture)导致的疼痛。“等渗剂”是生理学上耐受并且为制剂赋予合适的张力以防止跨细胞膜的水的净流的化合物，所述细胞膜与所施用的药物组合物接触。已知的等渗剂包括甘油、盐类诸如氯化钠，以及单糖，包括但不限于甘露醇、右旋糖和乳糖。优选的等渗剂是甘露醇和氯化钠。
在某些实施方案中，本发明的组合物包括表面活性剂。“表面活性剂”是降低液体的表面张力的物质。在药物组合物中使用并且可在本发明的某些组合物中使用的表面活性剂的实例包括：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇(例如，PEG 400、PEG 3000、TRITONX-100)、聚乙二醇烷基醚(例如，BRIJ)、聚丙二醇、嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆，PLURONICF68；泊洛沙姆407，PLURONIC F127；TETRONICS)、脱水山梨糖醇烷基酯(例如，SPAN)、聚乙氧基蓖麻油(例如，KOLLIPHOR，CREMOPHOR)，以及海藻糖。
本发明的药物组合物也可含有防腐剂。术语“防腐剂”是指添加至药物制剂中以充当多用途和/或可滴定组合物中的抗微生物剂的化合物。在本领域中已知在肠胃外制剂中有效和可接受的防腐剂是苯扎氯铵、苄乙铵(benzethonium)、氯己啶、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯或者对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。酚类防腐剂包括化合物苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯及其混合物。如果防腐剂是必需的，则在本发明的组合物中使用的防腐剂优选为酚类防腐剂，优选地间甲酚或苯酚。
某些酚类防腐剂，诸如苯酚和间甲酚，已知结合至胰岛素和胰岛素六聚体并且由此使增强物理或化学稳定性或两者的构象变化稳定化。然而，在包含其他蛋白的组合物中，此类防腐剂可有助于蛋白聚集体或者高分子量聚合物(HMWP)的形成。参见例如，Maa YF和Hsu CC, Int J Pharm 140: 155–168 (1996); Fransson J, 等人, Pharm. Res., 14:606–612 (1997); Lam XM, 等人, Pharm. Res., 14: 725–729 (1997); Remmele RL Jr,等人, Pharm Res 15: 200–208. (1998); Thirumangalathu R, 等人, J Pharm Sci 95:1480–1497 (2006)。治疗制剂中的此类蛋白聚集体是不期望的，因为其倾向于诱导免疫反应。
在某些优选实施方案中，将本发明的融合蛋白的氨基酸序列优化以增强还含有酚类防腐剂的组合物中的融合蛋白的物理稳定性。例如，本发明人意外地发现，胰岛素A链的类似物中的位置10(SEQ ID NO: 2中所示的胰岛素A链的类似物中的变量X1)处的氨基酸突变的存在减少了在酚类防腐剂存在的情况下融合蛋白聚集体的积聚，如以下的稳定性研究中所示。
本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应被视为限制性的。
融合蛋白的表达和纯化
本发明的融合蛋白使用CHO谷氨酰胺合成酶(GS)敲除(GSKO)细胞系在哺乳动物细胞表达系统中产生。GS基因敲除通过消除可允许低生产性或非生产性细胞在选择条件下存活的内源GS背景活性来实现变紧的选择严格性。将编码融合蛋白的基因亚克隆至含有谷氨酰胺合成酶(GS)的表达质粒内。将编码融合蛋白的cDNA序列与增强融合蛋白到细胞培养基内的分泌的信号肽的编码序列同框(in frame)融合。表达由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。使用电穿孔和适量的重组表达质粒来稳定地转染CHO GSKO细胞。
转染的细胞在无谷氨酰胺的培养基中经历集团选择(bulk selection)。将转染的合并物以低密度铺板，以允许稳定表达细胞的近克隆生长(close-to-clonal outgrowth)。筛选主要孔的融合蛋白表达，并且在待用于生产的无血清悬浮培养物中按比例扩大。
可遵循标准色谱技术通过蛋白A亲和色谱、随后为大小排阻色谱来纯化分泌到培养基中的融合蛋白。简言之，通过已经用磷酸盐缓冲盐水pH 7.4平衡的Mab选择蛋白A(GE)来捕获来自澄清培养基的融合蛋白。在用磷酸盐缓冲盐水pH 7.4的洗涤步骤之后，用10mM柠檬酸pH 3.0洗脱结合的融合蛋白。合并含有融合蛋白的级分，并且通过添加1/10体积的1M Tris pH 8.0来中和。可溶的聚集体和多聚体可通过常用技术来有效地移除，所述常用技术包括大小排阻、疏水性相互作用或者离子交换色谱。将如通过大小排阻色谱所确定的含有单体融合蛋白(共价连接的同型二聚体)的级分合并、灭菌过滤，并且储存。
本发明的示例性融合蛋白的氨基酸序列如下所示：
实施例1:
Figure 430152DEST_PATH_IMAGE023
实施例2:
Figure 437292DEST_PATH_IMAGE024
实施例3:
Figure 789776DEST_PATH_IMAGE025
实施例4:
Figure 732324DEST_PATH_IMAGE026
实施例5:
Figure 170258DEST_PATH_IMAGE027
实施例6
Figure 590875DEST_PATH_IMAGE028
实施例7
Figure 1128DEST_PATH_IMAGE029
实施例8
Figure 114578DEST_PATH_IMAGE030
实施例9
Figure 39808DEST_PATH_IMAGE031
实施例10
Figure 264116DEST_PATH_IMAGE032
体外活性
在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)或10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.5)中制备实施例1-3、5和9的测试批次，并在4℃下储存。在0.01N HCl中制备生物合成的人胰岛素 (EliLilly and Company)，并作为冷冻等分试样储存，或者在含有间甲酚、锌、氯化钠和TRIS缓冲液(pH 7.3)的配制混合物中以100单位/mL的浓度制备，并在4℃下储存。
在P1膜上进行的受体结合测定法中测定融合蛋白的亲和力，所述P1膜从过表达在C末端含有C9表位标签的人胰岛素受体同种型A(hIR-A)或人胰岛素受体同种型B(hIR-B)的稳定转染的293EBNA细胞(表达EBNA-1的293HEK人胚肾细胞)制备。从使用人重组体(3-[125I]-碘酪氨酰-A14)-胰岛素在稳态下进行的竞争性放射配体结合测定法来测定结合亲和力。测试样品的值被计算为相对于未标记人胰岛素的活性的百分比。从4参数逻辑的非线性回归分析(XLFit版本4.0，IDBS)测定IC50值。如果必要，将曲线顶端或底端参数分别设定为100或者0。
亲和常数(Ki)基于方程Ki = IC50 / (1 + D /Kd)从IC50值计算，其中D等于在实验中使用的放射-配体的浓度，并且Kd等于从饱和结合分析测定的放射-配体对其同源受体的平衡结合亲和力常数(hIR-A = 0.205 nM；hIR-B = 0.251 nM)。Ki的报告值显示为几何平均数±平均值的标准误差(SEM)，其中重复测定的次数通过“n”指示(表1)。
例举的融合蛋白对hIR-A和hIR-B两者都具有亲和力。相比于人胰岛素，例举的融合蛋白显示对hIR-A和hIR-B降低的结合亲和力(表1)。
表1：
Figure 512564DEST_PATH_IMAGE033
Ki值为几何平均值。SEM为平均值的标准误差。n为观察次数。
体内研究
链脲佐菌素(STZ)处理的大鼠糖尿病模型中的研究
在STZ处理的大鼠糖尿病模型中研究融合蛋白的效应。将体重400-425克的雄性Sprague-Dawley大鼠用异氟烷麻醉，并给予单次注射Zanosar® (STZ 项 # 89256, TevaParenteral Medicines, 40 mg/kg IV)。在注射Zanosar®后3天将大鼠用于研究中；仅将非禁食血糖在400-550mg/dL之间的动物用于这些研究中。
将所述大鼠分组以提供相当的血糖和体重变化，然后随机化。使用AccucheckAviva血糖仪(Roche)测量血糖。向STZ处理的大鼠给予30nmol/kg剂量的单次皮下(SC)注射。
通过尾部取血来收集用于葡萄糖测量的血样。动物在整个实验中自由获取食物和水。血糖数据提供于图1中。图1中显示的数据为平均值±SEM(对于实施例1和8，n=6；对于剩余的实施例，n=3)。收集初始喂饲期(在0和24小时之间)期间的时间点的血糖数据，但是为了便于视觉表示，该血糖数据不包括在图1中。如图1中所示，实施例1-10各自提供延长时段的血糖下降。
实施例1、3-6和9-10的药代动力学特性也在向如上所述STZ处理的大鼠中皮下(SC)给药后进行表征。数据使用胰岛素受体ELISA测定产生，所述胰岛素受体ELISA测定需要能够结合胰岛素受体的胰岛素的存在。胰岛素受体ELISA利用人胰岛素受体(R&DSystems#1544-IR/CF aa28-944)作为捕获物。人胰岛素受体通过小鼠抗6x HisTag抗体(Novagen 70796)附接至Immunlon 4 HBX平板。将融合蛋白标准曲线和样品稀释于100%大鼠K3 EDTA血浆中，并通过小鼠抗人IgG Fc辣根过氧化物酶(SouthernBiotech 9040-05)检测。在336小时时间点处实施例3-6和9-10的浓度都在22.1 ± 9.8 mg/mL和1498 ± 690mg/mL之间。表3显示实施例1随着时间推移的浓度，并且表4显示在对实施例1的数据进行非隔室分析(non-compartmental analysis)后的药代动力学参数。该数据支持本发明的融合蛋白的生物利用度的延长的持续时间。
表3
时间 (小时) 浓度(mg/mL)
1 335 ± 104
6 3559 ± 447
12 5991 ± 1578
24 10614 ± 1334
48 12629 ± 1811
96 8766 ± 2028
168 5017 ± 253
240 3682 ± 509
336 2014 ± 134
数据表示n=3的平均值和标准偏差。
表4
PK参数 结果
AUC<sub>0-∞</sub> (µg*hr/mL) 1066 ± 363
C<sub>max</sub> (µg/mL) 6.81 ± 1.62
T<sub>max</sub> (hr) 40 ± 14
CL或CL/F (mL/hr/kg) 2.15 ± 0.91
t<sub>1/2 </sub>(hr) 82 ± 12
%F 147
数据表示n=3的平均值和标准偏差。缩写：AUC0-∞–从0至无穷大的曲线下面积，C最大-最大浓度，T最大-最大浓度处的时间，CL-清除率，F-生物利用度，t1/2-半衰期。
正常大鼠中的血糖钳夹研究
进行雄性Sprague-Dawley大鼠中的血糖钳夹研究以理解实施例1对葡萄糖利用的整体体内活性并且以测定实施例1在肝脏相对于外周组织中的活性。在长期插管、禁食过夜的大鼠中开始3-3H-葡萄糖的大剂量/连续输注，以测定基础条件下的内源葡萄糖生产(EGP)。然后施用测试制品(7nmol/kg[大剂量]和1nmol/kg/hr[连续速率])或赖脯胰岛素比较物(comparator)([非大剂量]和0.75mU/kg/min[连续速率])的大剂量/连续的静脉内输注，并且开始和定期调节20%葡萄糖的可变静脉内输注，以将血糖浓度维持在100-110mg/dL。选择大剂量/输注速率以在每组中在血糖钳夹条件下实现相当的葡萄糖输注速率(GIR)和相当的EGP抑制。施用促生长素抑制素以抑制内源胰岛素分泌。在实验期间获取动脉血样品以监测红细胞比容、血浆胰岛素和游离脂肪酸、C-肽以及基础和钳夹EGP。在实验结束时，施用2-[1-14C]-脱氧葡萄糖以测量稳态葡萄糖浓度下的组织葡萄糖摄取。在这些匹配条件下，将测试制品和比较物的外周活性作为比目鱼肌中的葡萄糖摄取和血浆游离脂肪酸(FFA)的抑制来分析。使用单向方差分析，用Dunnett氏事后检验(Dunnett's post-hoctest)，使用赖脯胰岛素组作为对照比较物(control comparator)来分析所有数据。
实施例1的大剂量和输注剂量导致在钳夹实验的过程中274±57nM的稳定血浆浓度。如表5中所示，两组动物都在实验的钳夹阶段期间实现了相当的GIR。实施例1组中的平均血糖略高于赖脯胰岛素组。两组具有类似的基础和钳夹EGP速率(表5)。此外，实施例1组中自基础EGP的变化百分比与赖脯胰岛素对照组相当(表5)。为了评价等效钳夹条件下的外周活性，测量血浆FFA的抑制和肌肉葡萄糖摄取。赖脯胰岛素导致钳夹实验过程中血浆FFA水平下降，而实施例1则不会(表5)。此外，实施例1的输注导致比目鱼肌中的葡萄糖摄取相比于赖脯胰岛素下降33%(表5)。总而言之，这些数据指示实施例1相比于赖脯胰岛素展现降低的外周活性。
表5：
Figure 796915DEST_PATH_IMAGE034
值表示为赖脯胰岛素的13个动物和实施例1的17个动物的平均值±SEM。Rg=葡萄糖代谢指数。统计分析通过单向ANOVA和随后的Dunnett氏事后检验来完成。*=显著不同于赖脯胰岛素(p<0.05)。
食蟹猴(Cynomolgus Monkeys)中的体内效力
在食蟹猴中施用1.5nmol/kg的单次静脉内剂量和3nmol/kg的单次皮下剂量后评估实施例1的药代动力学(PK)参数。在3周过程中，从每组/途径三个动物收集用于PK分析的血浆样品。利用两种测定法用于PK分析：胰岛素受体ELISA和总IgG Fc ELISA。胰岛素受体ELISA利用人胰岛素受体(R&D Systems1544-IR/CF)作为捕获物。人胰岛素受体通过小鼠抗HisTag抗体(Novagen 70796)附接至Immunlon 4 HBX平板。将实施例1标准曲线和样品稀释于100%食蟹猴血浆(抗凝剂为K3 EDTA)中，并且通过小鼠抗人IgG Fc辣根过氧化物酶(SouthernBiotech 9040-05)检测。总IgG ELISA利用抗人IgG2(Abcam ab1933)作为捕获试剂。将实施例1稀释于100%食蟹猴血浆中，并且检测抗体与胰岛素受体ELISA中是相同的。两种测定法的结果显示在表6中，并且相关的PK参数显示在表7中。实施例1在猴中显示完全生物利用度，并且活性胰岛素测定和总Fc测定给出类似的结果。
表6. 实施例1在正常食蟹猴中的PK。
Figure 209441DEST_PATH_IMAGE035
数据表示n=3的平均值和标准偏差。缩写：IV=静脉内；SD=标准偏差；NC=未计算。
表7. 从表6中的非隔室分析推导的PK参数。
Figure 237440DEST_PATH_IMAGE036
数据表示n=3的平均值和标准偏差。缩写：AUC0-inf -从0至无穷大的曲线下面积，Cmax-最大的浓度(对于IV施用，Cmax是外推的时间0处的浓度)，Tmax-最大浓度处的时间，CL-清除率，F-生物利用度，t1/2-半衰期，Vss-稳态分布体积，NA-不适用。
稳定性
实施例1的非保存的65mg/mL制剂
将实施例1以65mg/mL在10mM柠檬酸盐、46.4mg/mL甘露醇、0.02%聚山梨醇酯80(pH6.5)中配制，并在30℃下储存。在0、2和4周时通过注射1μL的65mg/mL样品通过大小排阻色谱(SEC)分析样品的高分子量百分比。在装备有TSKgel SuperSW3000 (Tosoh Bioscience)柱和以0.4mL/min流动的50mM磷酸钠、300mM NaCl(pH 7.0)流动相的Agilent 1100系统上进行分析型SEC 15分钟。在280nm的吸光度下检测峰，并且使用ChemStation软件分析色谱图。时间零处的高分子量百分比为1.13%，两周时的高分子量百分比为1.68%，并且四周时的高分子量百分比为1.74%。这些结果支持实施例1在65mg/mL浓度时的稳定性，其中在30℃下4周后的可溶聚集体的生长最小。
实施例1和3的保存和非保存的1mg/mL制剂
实施例1和3在30mM间甲酚存在或不存在的情况下在10mM柠檬酸盐(pH 6.5)中以1mg/mL配制，并且在30℃下储存。在时间0和2周时通过注射10μL的1mg/mL样品通过大小排阻色谱(SEC)分析样品的高分子量百分比。在装备有TSKgel G3000SWxl (TosohBioscience)柱和以0.5mL/min流动的PBS+350mM NaCl(pH 7.4)流动相的Agilent 1100系统上分别对间甲酚存在或不存在的情况下的样品进行分析型SEC 35分钟或45分钟。在214nm的吸光度下检测峰，并且使用ChemStation软件分析色谱图。对于实施例3，在不具有和具有间甲酚的情况下，时间零处的高分子量百分比分别为0.2%和3.06%。在不具有和具有间甲酚的情况下，2周时的高分子量百分比分别为0.2%和1.73%。这些结果显示对于实施例3在零时添加间甲酚后可溶聚集体直接增多。对于实施例1，在间甲酚不存在和存在的情况下，时间零处的高分子量百分比分别为0.16%和0.15%。在间甲酚不存在和存在的情况下，2周时的高分子量百分比分别为0.18%和0.31%。这些结果表明在防腐剂存在的情况下实施例1相对于实施例3的稳定性，所述实施例1包括在胰岛素A链的类似物中的位置10(SEQ IDNO: 2中的变量X1，如上所述的第一融合蛋白中的Z3)处的氨基酸修饰成T残基，所述实施例3在该位置处包括天然I残基，但其另外包含与实施例1相同的胰岛素受体激动剂氨基酸序列。
序列
SEQ ID NO: 1-胰岛素B链的类似物
Figure 419023DEST_PATH_IMAGE037
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是所述胰岛素B链类似物包括对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的X4、X5、X6、X7、X8或X9处的至少一种修饰
SEQ ID NO: 2-胰岛素A链的类似物
Figure 546379DEST_PATH_IMAGE038
X1是T或I；X2是D、Y、Q或E；X3是G、N、S或A；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸
SEQ ID NO: 3-第一肽接头
Figure 446202DEST_PATH_IMAGE039
，其中X1是G或不存在；并且X2是G、S或不存在
SEQ ID NO: 4-胰岛素受体激动剂
Figure 12312DEST_PATH_IMAGE040
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在；X10是G或不存在；X11是G、S或不存在；X12是T或者I；X13是D、Y、Q或者E；X14是G、N、S或者A；并且X15是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是X4、X5、X6、X7、X8或X9中的至少一个必须是与在人胰岛素分子的B链的位置B16、B25、B27、B28、B29或B30处分别发现的氨基酸不同的氨基酸，并且进一步条件是如果X14是N，则X15必须是除G或者N以外的氨基酸
SEQ ID NO: 5-胰岛素受体激动剂
Figure 313981DEST_PATH_IMAGE041
SEQ ID NO: 6-第二肽接头
Figure 861506DEST_PATH_IMAGE042
其中X1是Q或E；X2是Q或E；X3是Q或E；X4是G、E、Q或不存在；X5是G或不存在；并且X6是G或不存在
SEQ ID NO: 7-第二肽接头
Figure 248625DEST_PATH_IMAGE043
SEQ ID NO: 8-人IgG Fc区
Figure 618426DEST_PATH_IMAGE044
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；并且X6是K或不存在
SEQ ID NO: 9-人IgG Fc区域
Figure 509022DEST_PATH_IMAGE045
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；X6是R或K；X7是K或不存在
SEQ ID NO: 10-人IgG Fc区
Figure 243760DEST_PATH_IMAGE046
其中X1是F、Q或E；X2是F、Q或E；X3是V或T；X4是V或T；X5是N、D或Q；并且X6是K或不存在
SEQ ID NO: 11-融合蛋白
Figure 852595DEST_PATH_IMAGE047
其中X1是F、Q或A；X2是V或G；X3是N、K、D、G、Q、A或E；X4是E、Y、Q或H；X5是H或F；X6是G、T、S、H、V或不存在；X7是G、E、P、K、D、S、H或不存在；X8是G、E、K、P、Q、D、H或不存在；X9是G、T、S、E、K、A或不存在，条件是X4、X5、X6、X7、X8或X9中的至少一个是除了在人胰岛素B链的位置B16、B25、B27、B28、B29或B30处分别存在的氨基酸以外的氨基酸；X10是G或不存在；X11是G、S或不存在；X12是T或I；X13是D、Y、Q或E；X14是G、N、S或A；X15是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X14是N，则X15必须是除G或N以外的氨基酸；X16是Q或E；X17是Q或E；X18是Q或E；X19是G、E、Q或不存在；X20是G或不存在；X21是G或不存在；X22是E或P；X23是E或P；X24是A或V；X25是G或不存在；X26是Q或H；X27是Y或F；X28是L或V；X29是S或A；X30是S或P，X31是A或T；X32是Q或R；X33是V或M；X34是R或K；X35是E或Q；并且X36是L或P
SEQ ID NO: 12-融合蛋白
Figure 26088DEST_PATH_IMAGE048
SEQ ID NO:13 –人胰岛素A链
Figure 36769DEST_PATH_IMAGE049
SEQ ID NO:14 –人胰岛素B链
Figure 4725DEST_PATH_IMAGE050
SEQ ID NO:15 –第一肽接头
Figure 287808DEST_PATH_IMAGE051
SEQ ID NO:16 –融合蛋白
Figure 999412DEST_PATH_IMAGE052
SEQ ID NO:17 –融合蛋白
Figure 864600DEST_PATH_IMAGE053
SEQ ID NO:18 –融合蛋白
Figure 3457DEST_PATH_IMAGE054
SEQ ID NO:19 –融合蛋白
Figure 524568DEST_PATH_IMAGE055
SEQ ID NO:20 –融合蛋白
Figure 774284DEST_PATH_IMAGE056
SEQ ID NO:21 –融合蛋白
Figure 759557DEST_PATH_IMAGE057
SEQ ID NO:22 –融合蛋白
Figure 69316DEST_PATH_IMAGE058
SEQ ID NO:23 –融合蛋白
Figure 140040DEST_PATH_IMAGE059
SEQ ID NO:24 –融合蛋白
Figure 380398DEST_PATH_IMAGE060
SEQ ID NO:25 – GLP-1
Figure 220178DEST_PATH_IMAGE061
序列表
<110> Eli Lilly and Company
<120> 融合蛋白
<130> X20356
<150> 62/158079
<151> 2015-05-07
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Phe, Gln或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Val或Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Glu, Tyr, Gln或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> 位置25处的Xaa是His或Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是Gly, Thr, Ser, His, Val或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala或者不存在
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是Thr或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (14)..(14)
<223> 位置14处的Xaa是Asp, Tyr, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (21)..(21)
<223> 位置21处的Xaa是Gly, Asn, Ser或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> 位置22处的Xaa是任何天然存在的氨基酸或者不存在
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys Ser Leu Xaa Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa
20
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Gly, Ser或者不存在
<400> 3
Xaa Gly Xaa Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Phe, Gln或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Val或Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Glu, Tyr, Gln或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> 位置25处的Xaa是His或Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是Gly, Thr, Ser, His, Val或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> 位置31处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (33)..(33)
<223> 位置33处的Xaa是Gly, Ser或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (47)..(47)
<223> 位置47处的Xaa是Thr或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (51)..(51)
<223> 位置51处的Xaa是Asp, Tyr, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (58)..(58)
<223> 位置58处的Xaa是Gly, Asn, Ser或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (59)..(59)
<223> 位置59处的Xaa是任何天然存在的氨基酸或者不存在
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
20 25 30
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys
35 40 45
Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
50 55
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (5)..(5)
<223> 位置5处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (10)..(10)
<223> 位置10处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (15)..(15)
<223> 位置15处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (20)..(20)
<223> 位置20处的Xaa是Gly, Glu, Gln或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (21)..(21)
<223> 位置21处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> 位置21处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (22)..(22)
<223> 位置22处的Xaa是Gly或者不存在
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa
20
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (18)..(18)
<223> 位置18处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> 位置37处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (39)..(39)
<223> 位置39处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (72)..(72)
<223> 位置72处的Xaa是Asn, Asp或Gln
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (222)..(222)
<223> 位置222处的Xaa是Lys或者不存在
<400> 8
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215 220
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (17)..(17)
<223> 位置17处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (19)..(19)
<223> 位置19处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (38)..(38)
<223> 位置38处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> 位置40处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (73)..(73)
<223> 位置73处的Xaa是Asn, Asp或Gln
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (185)..(185)
<223> 位置185处的Xaa是Arg或Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (223)..(223)
<223> 位置223处的Xaa是Lys或者不存在
<400> 9
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Xaa Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
210 215 220
<210> 10
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (18)..(18)
<223> 位置18处的Xaa是Phe, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (37)..(37)
<223> 位置37处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (39)..(39)
<223> 位置39处的Xaa是Val或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (72)..(72)
<223> 位置72处的Xaa是Asn, Asp或Gln
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (222)..(222)
<223> 位置222处的Xaa是Lys或者不存在
<400> 10
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Xaa
1 5 10 15
Leu Xaa Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Xaa Val Xaa Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Xaa
210 215 220
<210> 11
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1)..(1)
<223> 位置1处的Xaa是Phe, Gln或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (2)..(2)
<223> 位置2处的Xaa是Val或Gly
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (3)..(3)
<223> 位置3处的Xaa是Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (16)..(16)
<223> 位置16处的Xaa是Glu, Tyr, Gln或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (25)..(25)
<223> 位置25处的Xaa是His或Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (27)..(27)
<223> 位置27处的Xaa是Gly, Thr, Ser, His, Val或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (28)..(28)
<223> 位置28处的Xaa是Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (29)..(29)
<223> 位置29处的Xaa是Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> 位置30处的Xaa是Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (31)..(31)
<223> 位置31处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (33)..(33)
<223> 位置33处的Xaa是Gly, Ser或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (47)..(47)
<223> 位置47处的Xaa是Thr或Ile
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (51)..(51)
<223> 位置51处的Xaa是Asp, Tyr, Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (58)..(58)
<223> 位置58处的Xaa是Gly, Asn, Ser或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (59)..(59)
<223> 位置59处的Xaa是任何天然存在的氨基酸或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> 位置64处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (69)..(69)
<223> 位置69处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (74)..(74)
<223> 位置74处的Xaa是Gln或Glu
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (79)..(79)
<223> 位置79处的Xaa是Gly, Glu, Gln或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (80)..(80)
<223> 位置80处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (81)..(81)
<223> 位置81处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (82)..(82)
<223> 位置82处的Xaa是Glu或Pro
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (90)..(90)
<223> 位置90处的Xaa是Glu或Pro
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (91)..(91)
<223> 位置91处的Xaa是Ala和Val
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (94)..(94)
<223> 位置94处的Xaa是Gly或者不存在
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (125)..(125)
<223> 位置125处的Xaa是Gln或His
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (157)..(157)
<223> 位置157处的Xaa是Tyr或Phe
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (166)..(166)
<223> 位置166处的Xaa是Leu或Val
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (187)..(187)
<223> 位置187处的Xaa是Ser或Ala
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (188)..(188)
<223> 位置188处的Xaa是Ser或Pro
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (196)..(196)
<223> 位置196处的Xaa是Ala或Thr
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (212)..(212)
<223> 位置212处的Xaa是Gln或Arg
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (254)..(254)
<223> 位置254处的Xaa是Val或Met
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (266)..(266)
<223> 位置266处的Xaa是Arg或Lys
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (276)..(276)
<223> 位置276处的Xaa是Glu或Gln
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (302)..(302)
<223> 位置302处的Xaa是Leu或Pro
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
20 25 30
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Xaa Cys
35 40 45
Ser Leu Xaa Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Gly Gly Gly Gly Xaa Xaa
65 70 75 80
Xaa Xaa Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa Xaa Ala Gly Xaa Pro Ser
85 90 95
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
100 105 110
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Xaa Glu Asp Pro
115 120 125
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
130 135 140
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Xaa Arg Val Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Val Xaa His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
165 170 175
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Xaa Xaa Ile Glu Lys Thr
180 185 190
Ile Ser Lys Xaa Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
195 200 205
Pro Pro Ser Xaa Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
210 215 220
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
225 230 235 240
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Xaa Leu Asp
245 250 255
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Xaa Leu Thr Val Asp Lys Ser
260 265 270
Arg Trp Gln Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
275 280 285
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Xaa Gly
290 295 300
<210> 12
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 14
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 16
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Glu Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
85 90 95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
100 105 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
115 120 125
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
130 135 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145 150 155 160
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
165 170 175
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
180 185 190
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
195 200 205
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
245 250 255
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
260 265 270
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
275 280 285
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 17
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 18
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Cys Pro Pro
65 70 75 80
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
100 105 110
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
115 120 125
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
130 135 140
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
145 150 155 160
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
165 170 175
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
180 185 190
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
195 200 205
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
210 215 220
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
225 230 235 240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
260 265 270
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
275 280 285
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 19
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 20
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Phe Val Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
65 70 75 80
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
85 90 95
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
100 105 110
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
115 120 125
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
130 135 140
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
145 150 155 160
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170 175
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
180 185 190
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
210 215 220
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
245 250 255
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
260 265 270
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
275 280 285
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
290 295 300
<210> 21
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Ala Gly Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Glu Cys Pro Pro
65 70 75 80
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
85 90 95
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
100 105 110
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
115 120 125
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
130 135 140
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
145 150 155 160
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
165 170 175
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
180 185 190
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
195 200 205
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
210 215 220
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
225 230 235 240
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
245 250 255
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
260 265 270
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
275 280 285
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 22
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
85 90 95
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
100 105 110
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
115 120 125
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
130 135 140
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
145 150 155 160
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
165 170 175
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
180 185 190
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
210 215 220
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
245 250 255
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
260 265 270
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 23
<211> 298
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Glu Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
35 40 45
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Pro
65 70 75 80
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
100 105 110
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
115 120 125
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
130 135 140
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
145 150 155 160
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
165 170 175
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
245 250 255
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
260 265 270
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
275 280 285
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 24
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Phe Val Gly Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys
65 70 75 80
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
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Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
195 200 205
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
275 280 285
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
290 295
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30

Claims (22)

1.融合蛋白，其包含：
a)胰岛素受体激动剂，其具有通式Z1-Z2-Z3，其中：
i) Z1是胰岛素B链类似物，其由以下氨基酸序列组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(SEQ ID NO: 1)
其中X1是F或A；X2是V或G；X3是N或G；X4是E或Y；X5是H或F；X6是G或T；X7是G、E或P；X8是G、E或K；X9是G或T，条件是所述胰岛素B链类似物包括在X4、X5、X6、X7、X8或X9处对人胰岛素分子的B链的氨基酸序列的至少一种修饰；
ii) Z2是包含5至10个氨基酸的第一肽接头，其中所述氨基酸中的至少5个是G残基；且
iii) Z3是胰岛素A链类似物，其由以下氨基酸序列组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(SEQ ID NO: 2)
其中X1是T或I；X2是D或Y；X3是G或N；并且X4是任何天然存在的氨基酸或不存在，条件是如果X3是N，则X4必须是除G或N以外的氨基酸；
b)第二肽接头，其中所述第二肽接头是具有10至25个氨基酸的肽，其中所述氨基酸中的至少50%是G残基；和
c)人IgG Fc区；
其中所述胰岛素受体激动剂的C末端残基直接融合至所述第二肽接头的N末端残基，并且所述第二肽接头的C末端残基直接融合至所述人IgG Fc区的N末端残基；
其中所述融合蛋白的氨基酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO: 12、16、17、18、19、20、21、22、23和24。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述胰岛素受体激动剂具有以下氨基酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(SEQ ID NO:5)。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述第二肽接头具有以下氨基酸序列：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
4.权利要求1的融合蛋白，其中所述人IgG Fc区是来自IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。
5.权利要求1的融合蛋白，其中所述人IgG Fc区包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO: 8、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10。
6.融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12。
7.两个权利要求1-6中任一项的融合蛋白的同型二聚体。
8.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的融合蛋白，或权利要求7的同型二聚体，以及至少一种赋形剂。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种缓冲剂、一种或多种表面活性剂和一种或多种等渗剂。
10.权利要求8的药物组合物，其进一步包含柠檬酸盐、柠檬酸、聚山梨醇酯80和甘露醇。
11.权利要求8-10中任一项的药物组合物，其中pH范围为5.5至8.0。
12.权利要求8-10中任一项的药物组合物，其中pH范围为6.0至6.75。
13.权利要求8-10中任一项的药物组合物，其进一步包含额外的活性成分。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述额外的活性成分是用于基于肠降血糖素的疗法的成分。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述基于肠降血糖素的疗法是施用GLP-1R激动剂。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述GLP-1R激动剂是度拉糖肽。
17.药物组合物，其包含权利要求7的同型二聚体和度拉糖肽。
18.权利要求1-6中任一项的融合蛋白在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
19.权利要求1-6中任一项的融合蛋白与额外的活性成分的组合在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
20.权利要求1-6中任一项的融合蛋白与度拉糖肽的组合在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
21.权利要求7的同型二聚体在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途，其中所述同型二聚体用于与度拉糖肽以同时、分开或者依次组合使用。
22.多核苷酸，其编码权利要求1-6中任一项的融合蛋白。
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