MD3292141T2

MD3292141T2 - Proteine de fuziune

Info

Publication number: MD3292141T2
Application number: MDE20180255T
Authority: MD
Inventors: David Bruce Baldwin; John Michael Beals; Jonathan Wesley Day; Craig Duane Dickinson; Andrew Ihor Korytko; Gregory Alan Lazar
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2020-07-31
Also published as: RS60044B1; PH12017502025B1; CN107531806A; MY183025A; US20180177851A1; AR105616A1; PT3292141T; US9855318B2; SI3292141T1; US20160324932A1; WO2016178905A1; ME03709B; US11253574B2; CL2017002761A1; AU2016257659A1; CR20170469A; PE20180507A1; US20200390865A1; KR20170134614A; TW201712029A

Abstract

Prezenta invenţie se referă la proteine de fuziune care cuprind un agonist al receptorului de insulină fuzionat la o regiune lG Fc umană prin utilizarea unei agent de legătură peptidic, şi utilizarea unor astfel de proteine de fuziune în tratamentul diabetului. Proteinele de fuziune ale prezentei invenţii au un profil de acţiune extins în timp şi sunt utile în furnizarea controlului glucozei de bază pe o perioadă extinsă de timp.

Description

Prezenta invenţie se referă la proteine de fuziune pentru utilizare în tratamentul diabetului. Mai special, invenţia se referă la proteine de fuziune care cuprind un agonist al receptorului pentru insulină fuzionat la o regiune IgG Fc umană cu un agent de legătură peptidic, şi utilizarea de astfel de proteine în tratamentul diabetului. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie au un profil de acţiune extins în timp şi sunt utile pentru asigurarea controlului prelungit al glucozei de bază şi suprimarea producţiei de glucoză hepatică.

Diabetul zaharat este o tulburare cronică caracterizată prin hiperglicemie care rezultă din defecte în secreţia insulinei, acţiunea insulinei, sau a ambelor. Diabetul zaharat de tip 1 este caracterizat printr-o mică capacitate, sau fără capacitatea de a secreta insulină, şi pacienţii cu diabet zaharat de tip 1 necesită insulină pentru supravieţuire. Diabetul zaharat de tip 2 este caracterizat prin niveluri ridicate de glucoză în sânge care rezultă din alterarea secreţiei de insulină, rezistenţă la insulină, producţie excesivă de glucoză hepatică, şi/sau forme de contribuţie ale tuturor celor de mai sus. La cel puţin o treime din pacienţii cu diabet zaharat de tip 2, boala progresează pȃnă la o cerinţă absolută pentru terapia cu insulină.

Pentru a obţine o glicemie normală, este dorită în paralel, cȃt mai strȃns posibil, terapia cu înlocuirea insulinei, tiparul secreţiei endogene de insulină la indivizii normali. Cererea fiziologică zilnică de insulină fluctuează şi poate fi separată în două faze: (a) faza din timpul mesei care necesită un impuls (bolus) de insulină pentru a elimina valul de glucoză legată de masă din sânge, şi (b) faza dintre mese care necesită o cantitate susţinută (de bază) de insulină pentru reglarea producţiei de glucoză hepatică pentru a menţine staţionară glucoza optimă în sânge.

Deoarece pacienţii cu diabet de tip 1 produc puţină sau nu produc deloc insulină, terapia eficientă cu insulină pentru diabeticii de tip 1, implică în general utilizarea a două tipuri de insulină administrată exogen: o insulină care acţionează rapid, în timpul mesei furnizată prin injecţii bolus, şi o insulină de bază care acţionează pe termen lung, administrată o dată sau de două ori zilnic pentru a controla nivelurile de glucoză în sânge între mese. Tratamentul pacienţilor cu diabet de tip 2 începe de obicei cu prescrierea pierderii în greutate, exerciţii, şi o dietă diabetică, dar când aceste măsuri eşuează în controlul zaharurilor ridicate din sânge, atunci pot fi necesare medicaţii orale şi terapii pe bază de incretin, cum ar fi administrarea de agonişti receptori ai peptidei-1 cum ar fi glucagon (GLP-1) şi/sau inhibitori ai dipeptidil peptidazei 4 (DPP-4) care permit niveluri crescute de incretin. Când aceste medicaţii sunt încă insuficiente, este luat în considerare tratamentul cu insulină. Pacienţii cu diabet de tip 2 a căror boală a avansat pȃnă la punctul în care este necesară terapia cu insulină, încep în general cu o singură injecţie zilnică cu insulină de bază care acţionează pe termen lung, deşi dacă este necesar, în unele cazuri, pot fi incluse şi injecţii cu insulină în timpul mesei care acţionează rapid.

Câteva tipuri de insuline de bază sunt disponibile în prezent. Insulina glargină, vândută sub marca LANTUS®, cuprinde o structură de insulină modificată în care asparagina la poziţia 21 în catena A de insulină este înlocuită cu glicină, şi două arginine se adaugă la C-terminalul catenei B. Insulina detemir, vândută sub marca LEVEMIR®, cuprinde o structură de insulină modificată în care treonina la poziţia 30 a catenei B a fost ştearsă şi lizina la poziţia 29 a catenei B a fost derivatizată prin legătura covalentă a unui carbon 14, acid gras al miristoilului la gruparea ε-amină a lizinei la B29. Insulina degludec, disponibilă în Europa şi Japonia sub marca TRESIBA®, cuprinde o structură de insulină modificată în care treonina la poziţia 30 a catenei B a fost ştearsă, şi gruparea ε-amino a lizinei la poziţia 29 a catenei B este derivatizată covalent cu acid hexadecandioic printr-un agent de legătură al acidului γ-L-glutamic. Toate aceste insuline sunt indicate pentru administrare o dată pe zi.

Regimurile de tratament care implică injecţii zilnice ale terapiilor cu insulină existente, pot fi complicate şi dureroase pentru administrare şi pot conduce la efecte secundare nedorite, cum ar fi hipoglicemia şi câştigul în greutate. Prin urmare, mulţi pacienţi diabetici nu dorec sau nu pot respecta, sau sunt incapabili să se conformeze, cu terapia cu insulină necesară pentru a menţine un control strȃns al nivelurilor de glucoză în sânge. Slabul control glicemic creşte riscul pacientului de a dezvolta complicaţii serioase legate de diabet, incluzând boli de inimă, accident vascular cerebral, deteriorare nervoasă, amputarea membrelor inferioare, pierderea vederii, şi boli renale. Cercetarea a fost efectuată pentru a identifica produse de insulină cu durată de acţiune mai lungă; astfel, necesitând mai puţine injecţii decât produsele de insulină disponibile în prezent pentru a îmbunătăţi acceptarea şi conformitatea.

CN103509118 descrie proteine cu o catenă B de insulină umană şi o catenă A de insulină umană unite printr-o secvenţă de conexiune cu 4 până la 50 de C-peptide de aminoacizi, şi cu catena A de insulină ataşată direct, fără un agent de legătură suplimentar, la un fragment Fc de imunoglobulină, şi afirmă că testarea pe şoareci arată că astfel de proteine au perioada de înjumătăţire in vivo de aproximativ 3 zile. KR101324828 descrie analogi de proinsulină legaţi la regiunile Fc de imunoglobulină prin utilizarea de agenţi de legătură non-peptidili, şi afirmă că astfel de proteine furnizează o perioadă de înjumătăţire crescută a serului faţă de terapiile existente. Publicaţia afirmă că agenţii de legătură non-peptidili reprezintă o îmbunătăţire faţă de agenţii de legătură peptidici, afirmȃnd că proteinele de fuziune care utilizează agenţi de legătură peptidici nu pot creştere perioada de înjumătăţire a unei medicaţii active în sânge deoarece agenţii de legătură peptidici sunt separaţi uşor de enzime în corp.

În ciuda dezvăluirilor de mai sus, şi/sau în orice alte publicaţii, prezenţii inventatori au depăşit multiple obstacole pentru a descoperi proteinele de fuziune care cuprind agonişti receptori de insulină, agenţi de legătură peptidici, şi regiuni IgG Fc umane care întȃmpină necesitatea continuă pentru produse cu glucoză scăzută cu o durată crescută de acţiune, suficientă pentru o dozare mai puţină frecventă decât la produsele de insulină disponibile în prezent, incluzând dozarea rărită, cum ar fi o dată pe săptămână. De exemplu, pentru a obţine un profil de acţiune dorit prelungit în timp, a fost necesară modificarea genetică a proteinelor de fuziune cu potenţă atenuată pentru a evita eliberarea rapidă mediată de receptor, a căii majore de eliberare a insulinei, dar care au încă destulă potenţă pentru a furniza scăderea suficientă a glucozei. În plus, pentru a minimiza eliberarea renală, cealaltă cale majoră de eliberare a insulinei, şi pentru a regla expunerea periferică prin difuzie paracelulară limitată la dimensiuni hidrodinamice, proteinele de fuziune care au fost suficient de mari, şi care nu ar fi trebuit să aibă agonistul receptor pentru insulină clivat proteolitic din regiunea IgG Fc umană după ce au fost administrate, au trebuit să fie modificate genetic, deoarece o astfel de clivare ar conduce la o eliberare renală mai rapidă ca cea dorită a agonistului receptor al insulinei, chiar dacă regiunea IgG Fc umană a rămas în circulaţie. În plus, domeniile IgG Fc au evoluat la autoasocieri pentru a forma dimeri stabili, şi când un astfel de dimer este format din două proteine de fuziune, cuprinzȃnd fiecare un radical de insulină fuzionat cu o regiune IgG Fc, cei doi radicali de insulină sunt aduşi într-o proximitate strȃnsă unul cu celălalt, permiţȃnd autoasocierea, sau dimerizarea, radicalilor de insulină, mediaţi prin regiunile autoasociate ale catenei B de insulină. Astfel de dimeri de insulină sunt inactivi, deci proteinele de fuziune cu autoasociere redusă a radicalilor agonişti ai receptorului de insulină au trebuit să fie modificate genetic. Au fost depăşite multiple provocări suplimentare pentru a crea o proteină de fuziune adecvată pentru fabricare comercială şi formulare ca terapeutic. Prezenta invenţie furnizează proteine de fuziune care au durată de acţiune prelungită în comparaţie cu tratamentele cu insulină existente, permiţând injecţii mai puţin frecvente decât produsele de insulină existente, incluzând până la o dată săptămânal, reducȃnd astfel complexitatea şi durerea asociate cu regimurile de tratament existente care implică injectarea mai frecventă. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie au un profil farmacocinetic plat şi o expunere periferică restricţionată, conducând la o variabilitate scăzută zi de zi, şi la o incidenţă minimă asupra hipoglicemiei, inclusiv când sunt furnizate în combinaţie cu o medicaţie suplimentară pentru diabet, cum ar fi o terapie pe bază de incretin. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot furniza de asemenea o durată de acţiune prelungită fără să cauzeze câştig în greutate.

Prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune care cuprinde:

a) un agonist receptor pentru insulină care are formula generală Z1-Z2-Z3, în care

i) Z1 este un analog al catenei B de insulină, care cuprinde secvenţa de aminoacizi: X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9 în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia ca analogul catenei B de insulină să includă cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 (SEQ ID NO:1);

ii) Z2 este un prim agent de legătură peptidic care cuprinde 5 până la 10 aminoacizi, în care cel puţin 5 din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G; şi

iii) Z3 este un analog al catenei A de insulină cuprinzând secvenţa de aminoacizi: GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4 X1 este T sau I; X2 este D, Y, Q sau E; X3 este G, N, S sau A; şi X4 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X3 este N, atunci X4 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N (SEQ ID NO:2);

a) un al doilea agent de legătură peptidic care are între 10 şi 25 aminoacizi, în care cel puţin 50% din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G; şi

b) o regiune IgG Fc umană;

în care reziduul C-terminal al agonistului receptor al insulinei este direct fuzionat la reziduul N-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic, şi reziduul C-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic este direct fuzionat la reziduul N-terminal al regiunii IgG Fc.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o proteină de fuziune care constă din:

a) un agonist receptor al insulinei având formula generală Z1-Z2-Z3, în care

i) Z1 este un analog al catenei B de insulină, având secvenţa de aminoacizi: X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9 în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia că analogul catenei B de insulină să includă cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 (SEQ ID NO:1);

iii) Z3 este un analog al catenei A de insulină care are secvenţa de aminoacizi: GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4

X1 este T sau I; X2 este D, Y, Q sau E; X3 este G, N, S sau A; şi X4 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X3 este N, atunci X4 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N (SEQ ID NO:2);

b) un al doilea agent de legătură peptidic având între 10 şi 25 aminoacizi, în care cel puţin 50% din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G; şi

c) o regiune IgG Fc umană;

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o compoziţie farmaceutică care cuprinde o proteină de fuziune din prezenta invenţie şi cel puţin un excipient acceptabil farmaceutic.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea diabetului zaharat, obezităţii, dislipidemiei sau sindromului metabolic. Prezenta invenţie furnizează de asemenea o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea sau prevenirea afecţiunilor asociate cu diabetul selectate din grupul care constă din boli de inimă, accident vascular cerebral, nefropatie, retinopatie, şi boli renale.

Invenţia furnizează de asemenea o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în terapie.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea utilizarea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie în fabricarea unui medicament.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea polinucleotide care codifică o proteină de fuziune din prezenta invenţie.

De asemenea este furnizat aici este un procedeu pentru producerea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie, respectivul procedeu cuprinzând etapele de:

1. cultivare a unei celule gazdă de mamifer cuprinzând o polinucleotidă care codifică o proteină de fuziune din prezenta invenţie în condiţii astfel încât respectiva proteină de fuziune să fie exprimată; şi

2. recuperare din respectiva celulă gazdă a proteinei de fuziune;

De asemenea este furnizată aici o proteină de fuziune produsă prin procedeul descris mai sus.

Figura 1. Figura 1 furnizează date farmacodinamice pentru exemple de proteine de fuziune din prezenta invenţie într-un model de diabet pe şobolan tratat cu streptozotocin (STZ).

Figura 2. Figura 2 furnizează o diagramă schematică de configuraţii ale proteinelor descrise aici. Ar trebui să se observe că formele particulare (de exemplu, ovale, semicercuri, etc.) utilizate în diagramele din Figura 2 nu sunt destinate să descrie sau să caracterizeze, şi nu ar trebui să fie utilizate pentru a interpreta înţelesul sau structura componentelor individuale de proteine de fuziune din prezenta invenţie.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 sau X5 din SEQ ID NO:1, şi cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin două modificări din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 în care X6-X9 sunt fiecare G.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 şi X5 din SEQ ID NO:1.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificarea din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la fiecare din poziţiile X4, X5, X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi X6-X9 sunt fiecare G.

În anumite realizări, analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care X3 este N şi în care X4 este un aminoacid altul decât G, N, S, V L sau P.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 sau X5 din SEQ ID NO:1, şi cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin două modificări din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:1 în care X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 şi X5 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificarea din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la fiecare din poziţiile X4, X8, X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 sau X5 din SEQ ID NO:1, şi cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin două modificări din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:1 în care X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 şi X5 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificarea din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la fiecare din poziţiile X4, X5, X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la ambele X1 şi X2 din SEQ ID NO:2.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 sau X5 din SEQ ID NO:1, şi cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include cel puţin două modificări din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, sau X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:1 în care X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2 în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificările din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4 şi X5 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină include modificarea din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la fiecare din poziţiile X4, X5, X6, X7, X8, şi X9 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, analogul catenei B de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi X6-X9 sunt fiecare G; şi analogul catenei A de insulină are secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

În anumite realizări, primul agent de legătură peptidic (Z2) cuprinde secvenţa de aminoacizi: X1GX2GGGG, în care X1 este G sau este absent; şi X2 este G, S sau este absent (SEQ ID NO:3).

În anumite realizări, agonistul receptorului pentru insulină, adică, Z1-Z2-Z3 în proteina de fuziune descrisă mai sus, cuprinde secvenţa de aminoacizi: X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9X10GX11GGGGGIVEQCCTSX12CSL X13QLENYCX14X15

în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent; X10 este G sau este absent; X11 este G, S sau este absent; X12 este T sau I; X13 este D, Y, Q sau E; X14 este G, N, S sau A; şi X15 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că atunci cel puţin unul dintre X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 trebuie să fie un aminoacid diferit decât cel găsit, respectiv, la poziţiile B16, B25, B27, B28, B29 sau B30 ale catenei B a unei molecule de insulină umană, şi în plus cu condiţia că dacă X14 este N, atunci X15 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N (SEQ ID NO:4).

În anumite realizări preferate, antagonistul receptor pentru insulină, adică, Z1-Z2-Z3 în proteina de fuziune descrisă mai sus are următoarea secvenţă de aminoacizi: FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG (SEQ ID NO:5).

În proteinele de fuziune din prezenta invenţie, al doilea agent de legătură peptidic este o peptidă care are între 10 şi 25 aminoacizi, în care cel puţin 50% din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G. În anumite realizări, al doilea agent de legătură peptidic este o peptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi [GGGGX]n, în care X este Q, E sau S; şi în care n este 2-5. În anumite realizări, al doilea agent de legătură peptidic cuprinde secvenţa de aminoacizi: GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6 în care X1 este Q sau E; X2 este Q sau E; X3 este Q sau E; X4 este G, E, Q sau este absent; X5 este G sau absent; şi X6 este G sau este absent (SEQ ID NO:6).

În anumite realizări preferate, al doilea agent de legătură peptidic are secvenţa de aminoacizi:

GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO:7).

În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană cuprinde fragmente dintr-un lanţ greu al unui anticorp IgG. O diagramă schematică a unei proteine de fuziune care cuprinde o astfel de regiune IgG este prevăzută în diagrama (A) din Figura 2. În alte realizări, regiunea IgG Fc umană cuprinde fragmente din două lanţuri grele ale unui anticorp IgG. O diagramă schematică a unei proteine de fuziune care cuprinde o astfel de regiune IgG este prevăzută în diagrama (B) din Figura 2.

În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană este o regiune Fc de la un anticorp IgG1, IgG2 sau IgG4.

În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană este o regiune Fc de la un anticorp IgG1 care cuprinde următoarea secvenţă de aminoacizi:

în care X1 este F, Q sau E; X2 este F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; şi X6 este K sau este absent. (SEQ ID NO:8)

În anumite realizări, regiunea lgG Fc cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:8 şi cuprinde în plus unii sau toţi aminoacizii care ar fi găsiţi într-o secvenţă lgG1 Fc de tip sălbatic la partea N-terminală a reziduului C la poziţia 1 în SEQ ID NO:8.

Preferabil, regiunea IgG Fc umană este fie dintr-un anticorp IgG2, fie dintr-un anticorp IgG4.

În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană este o regiune Fc de la un anticorp IgG4 care cuprinde următoarea secvenţă de aminoacizi:

în care X1 este F, Q sau E; X2 F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; X6 este R, sau K; X7 este K sau este absent. (SEQ ID NO:9)

În anumite realizări, regiunea lgG Fc cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:9, şi cuprinde în plus unii sau toţi aminoacizii care ar fi găsiţi în secvenţa lgG4 Fc de tip sălbatic la partea N-terminală a reziduului C la poziţia 1 în SEQ ID NO:9. În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:9, în care X1 este F; X2 este F; X3 este V; X4 este V; X5 este N; X6 este R; şi X7 este absent.

În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană este o regiune Fc de la un anticorp IgG2 având următoarea secvenţă de aminoacizi:

în care X1 este F, Q sau E; X2 este F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; şi X6 este K sau absent. (SEQ ID NO: 10)

În anumite realizări, regiunea IgG Fc cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 10, şi cuprinde în plus unii sau toţi aminoacizii care ar fi găsiţi în secvenţa lgG2 Fc de tip sălbatic la partea N-terminală a reziduului E la poziţia 1 în SEQ ID NO:10. În anumite realizări, regiunea IgG Fc umană cuprinde secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:10, în care X1 este F; X2 este F; X3 este V; X4 este V; X5 este N; şi X6 este absent.

În anumite realizări, proteina de fuziune cuprinde secvenţa de aminoacizi:

în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia că atunci cel puţin unul dintre X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 este un aminoacid altul decât cel care este prezent, respectiv, în poziţiile B16, B25, B27, B28, B29 sau B30 dintr-o catenă B de insulină umană; X10 este G sau este absent; X11 este G, S sau este absent; X12 este T sau I; X13 este D, Y, Q sau E; X14 este G, N, S sau A; X15 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X14 este N, atunci X15 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N; X16 este Q sau E; X17 este Q sau E; X18 este Q sau E; X19 este G, E, Q sau este absent; X20 este G sau absent; X21 este G sau este absent; X22 este E sau P; X23 este E sau P; X24 este A sau V; X25 este G sau este absent; X26 este Q sau H; X27 este Y sau F; X28 este L sau V; X29 este S sau A; X30 este S sau P; X31 este A sau T; X32 este Q sau R; X33 este V sau M; X34 este R sau K; X35 este E sau Q; şi X36 este L sau P (SEQ ID NO:11).

În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune selectată din grupul constând din SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, şi SEQ ID NO:24.

Într-o realizare preferată, proteina de fuziune are secvenţa de aminoacizi:

În anumite realizări, proteinele de fuziune din prezenta invenţie sunt prezente sub forma unui dimer. O diagramă schematică a unui astfel de a dimer este prevăzută în diagrama (C) din Figura 2. În anumite realizări, dimerul este un homodimer, în care secvenţele de aminoacizi ale celor două proteine de fuziune care foemează dimerul sunt aceleaşi. În anumite realizări, dimerul este un heterodimer, în care secvenţele de aminoacizi ale celor două proteine de fuziune care formează dimerul sunt diferite.

În anumite realizări, compoziţia farmaceutică din prezenta invenţie cuprinde o proteină de fuziune din prezenta invenţie, un agent de tamponare, un surfactant, şi un agent de izotonicitate. În anumite realizări, agentul de tamponare este acidul citric şi/sau citratul, surfactantul este polisorbatul 80, şi agentul de izotonicitate este manitolul. În anumite realizări, pH-ul compoziţiei variază de la aproximativ 5,5 până la aproximativ 8,0. În anumite realizări, pH-ul variază de la aproximativ 6,0 până la aproximativ 7,4. În anumite realizări, pH-ul variază de la aproximativ 6,0 până la 6,75.

În anumite realizări, compoziţia farmaceutică cuprinde în plus un ingredient activ suplimentar. În anumite realizări, ingredientul activ suplimentar este o terapie pe bază de incretin. În anumite realizări preferate, terapia pe bază de incretin este un agonist GLP-1R. Preferabil, agonistul GLP-1R este dulaglutidă.

În anumite realizări, utilizarea terapeutică din prezenta invenţie cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-o proteină de fuziune o dată pe zi. În realizările preferate, o cantitate eficientă terapeutic de proteina de fuziune este administrată o dată pe săptămână. În anumite realizări, o cantitate eficientă terapeutic de proteină de fuziune este administrată o dată pe lună. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea diabetului zaharat în timp ce reduce riscul de hipoglicemie şi/sau câştig în greutate.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea diabetului zaharat, obezităţii, dislipidemiei, şi/sau sindromului metabolic în combinaţie cu un ingredient activ suplimentar. Proteina de fuziune şi ingredientul activ suplimentar în astfel de realizări pot fi administrate simultan, secvenţial sau într-o singură formulare combinată. În anumite realizări, ingredientul activ suplimentar este o terapie pe bază de incretin. În anumite realizări preferate, terapia pe bază de incretin este un agonist GLP-1R. Preferabil, agonistul GLP-1R este dulaglutidă. În anumite realizări, combinaţia este administrată o dată zilnic. În anumite realizări preferate, combinaţia este administrată o dată săptămânal. În anumite realizări, combinaţia este administrată o dată lunar.

În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratamentul diabetului zaharat, obezităţii, dislipidemiei sau sindromului metabolic. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea sau prevenirea unei afecţiuni asociate cu diabetul selectată din grupul care constă din boli de inimă, accident vascular cerebral, nefropatie, retinopatie, şi boli renale. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune din prezenta invenţie pentru utilizare în tratarea unui pacient cu diabet zaharat în timp ce reduce riscul de hipoglicemie şi/sau câştig în greutate, cuprinzând administrarea la pacient a unei proteine de fuziune din prezenta invenţie. În anumite realizări, proteina de fuziune din prezenta invenţie este prevăzută pentru utilizare simultană, separată sau în combinaţie secvenţială cu un alt ingredient activ. În anumite realizări, ingredientul activ suplimentar este o terapie pe bază de incretin. În anumite realizări preferate, terapia pe bază de incretin este un agonist GLP-1R.

În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează utilizarea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie în fabricarea unui medicament pentru tratamentul diabetului zaharat, obezităţii, dislipidemiei sau sindromului metabolic. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează utilizarea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie în fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau prevenirea unei afecţiuni asociate diabetului selectată din grupul care constă din boli de inimă, accident vascular cerebral, nefropatie, retinopatie, şi boli renale. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează utilizarea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie în fabricarea unui medicament pentru tratarea diabetului zaharat în timp ce reduce riscul de hipoglicemie şi/sau câştig în greutate, cuprinzând administrarea la pacient a unei proteine de fuziune din prezenta invenţie. În anumite realizări, prezenta invenţie furnizează utilizarea unei proteine de fuziune din prezenta invenţie în fabricarea unui medicament pentru tratamentul diabetului zaharat, obezităţii, dislipidemiei sau sindromului metabolic, în care medicamentul este pentru administrarea simultană, separată sau secvenţială în combinaţie cu un alt ingredient activ.

Când s-a utilizat aici, termenul „agonist receptor pentru insulină» s-a referit la o proteină care se leagă la şi activează receptorul pentru insulină, conducând la o scădere a nivelurilor de glucoză în sânge şi/sau la o supresie a producţiei de glucoză hepatică, caracteristici care pot fi testate şi măsurate utilizând tehnici cunoscute, cum ar fi cele prezentate în studiile descrise mai jos.

Porţiunea de agonist receptor pentru insulină a proteinelor de fuziune din prezenta invenţie include un analog al unei catene B de insulină şi un analog al unei catene A de insulină. Când s-au utilizat aici, termenii „catenă A de insulină» şi „catenă B de insulină» se referă la catenele A şi B ale moleculei de insulină umană (CAS nr. 11061-68-0), ale căror secvenţe native de tip sălbatic sunt bine cunoscute. Catena A de insulină umană constă din 21 de aminoacizi, la care se face referire în domeniu ca A1-A21, având următoarea secvenţă:

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO:13).

Catena B de insulină umană constă din 30 de aminoacizi, la care se face referire în domeniu ca B1-B30, având următoarea secvenţă:

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYIPKT (SEQ ID NO:14).

Într-o moleculă de insulină umană, catenele A şi B sunt unite prin două legături disulfură, CisA7-CisB7 şi CisA20-CisB19. Catena A are o legătură disulfură intra-catenară la CisA6-CisA11.

Pentru a obţine profilul de acţiune dorit extins în timp, agonistul receptor pentru insulină al proteinei de fuziune din prezenta invenţie trebuie să rămână în circulaţie, şi să fie capabil să interacţioneze cu receptorul pentru insulină, pe o perioadă de timp extinsă. Pentru ca proteinele de fuziune din prezenta invenţie să rămână în circulaţie pe o perioadă dorită de timp, eliminarea proteinelor de fuziune trebuie să fie atenuată. Cele două căi primare de eliminare a insulinei sunt eliberarea renală şi eliberarea mediată de receptorul pentru insulină. Vezi Iglesias P, şi colab. Diabet Obes. Metab. 2008;10:811-823. Pentru a minimiza eliberarea renală, este necesară o moleculă cu dimensiune hidrodinamică de cel puţin aproximativ dimensiunea albuminei din serul uman, şi o astfel de dimensiune hidrodinamică este prevăzută în fuziunile de proteine din prezenta invenţie prin regiunea IgG Fc umană. Ca şi pentru eliberarea mediată de receptor, proteina de fuziune nu poate fi atȃt de potentă la receptorul pentru insulină astfel încȃt să conducă la eliberarea mai rapidă mediată de receptor decât cea dorită, dar proteina de fuziune trebuie să fie suficient de potentă totuşi, pentru a furniza un control suficient al glucozei la doze care sunt realizabile comercial Astfel, potenţa proteinei de fuziune trebuie să fie echilibrată cu grijă, şi structura proteinei de fuziune din prezenta invenţie trebuie să permită obţinerea unui astfel de echilibru.

Moleculele de insulină au o tendinţă de a se autoasocia în dimeri şi hexameri. Au fost propuse numeroase roluri pentru tendinţele de conservare evoluţionară, de autoasociere ale insulinei, incluzând: (1) stabilizarea chimică şi termică a moleculei în timpul depozitării vacuolelor intracelulare; (2) protecţia insulinei monomerice de fibrilaţia in vivo; (3) substituţie pentru stabilizarea asistată de haperone şi pliere în timpul exprimării intracelulare; şi/sau (4) esenţial pentru traficul secretor. Forma activă de insulină totuşi, este monomerul.

Tendinţa moleculelor de insulină de a se autoasocia, şi inactivitatea unor astfel de molecule autoasociate, este relevantă pentru prezenta invenţie, deoarece regiunile IgG Fc umane tind de asemenea să se autoasocieze pentru a forma dimeri, de obicei asociaţi covalent prin legături disulfură în regiunea balama, şi astfel de dimeri sunt formaţi din regiunile IgG Fc umane în proteinele de fuziune din prezenta invenţie. Ca rezultat al dimerizării regiunilor IgG Fc umane, cele două „braţe» ale agoniştilor receptori pentru insulină sunt în strȃnsă proximitate unul cu celălalt, şi prin urmare există la o concentraţie locală relativ ridicată. În cazul insulinei umane, o astfel de strȃnsă proximitate ar tinde să favorizeze autoasocierea, sau dimerizarea radicalilor de insulină, afectând activitatea moleculei. O diagramă schematică a unui dimer proteic de fuziune Fc cu braţele radicalului de insulină care au devenit autoasociate, sau dimerizate, este prevăzută în diagrama (D) din Figura 2. Tendinţa moleculelor de insulină de a se autoasocia ar putea de asemenea conduce la autoasociere, sau dimerizare, a radicalilor de insulină de mai mult de un dimer proteic de fuziune Fc; o diagramă schematică a unui dimer din doi dimeri proteici de fuziune Fc cu radicali de insulină autoasociaţi, sau dimerizaţi este prevăzută în diagrama (E) din Figura 2. În plus, radicalii de insulină în mai mult de doi dimeri proteici de fuziune Fc ar putea de asemenea să se autoasocieze într-o astfel de manieră pentru a forma, de exemplu, un trimer care cuprinde trei dimeri, sau chiar agregate de ordin mai ridicat care sunt compuse din mai mult de trei dimeri.

Porţiunea de agonist receptor pentru insulină a proteinei de fuziune din prezenta invenţie are totuşi, o tendinţă redusă de a se autoasocia sau dimeriza, şi astfel dimerii proteici de fuziune cuprinşi ai proteinelor de fuziune din prezenta invenţie tind să favorizeze structura reprezentată în diagrama (C) din Figura 2, spre deosebire de structurile reprezentate în diagramele (D) şi (E) din Figura 2. Astfel, în timp ce prezenta invenţie furnizează un dimer a două proteine de fuziune, „braţul» agonistului receptor pentru insulină al fiecărei proteine de fuziune în dimer, menţine o stare predominant monomerică, cum s-a reprezentat de exemplu în diagrama (C) din Figura 1, şi este astfel mai capabil să interacţioneze cu receptorul pentru insulină.

În proteinele de fuziune din prezenta invenţie, analogul catenei B de insulină în agonistul receptor pentru insulină include una sau mai multe modificări la secvenţa de aminoacizi a catenei B de insulină umană. În particular, pentru a reduce predilecţia porţiunilor de agonist receptor al insulinei de a se autoasocia, sau dimeriza, analogul catenei B de insulină include una sau mai multe modificări din catena B a unei molecule de insulină umană la poziţiile B16, B25 sau B27-30, care sunt reprezentate în SEQ ID NO:1 ca poziţiile X4, X5 şi respectiv X6-9. De exemplu: X4 (care corespunde cu B16 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi modificat la E, Q sau H; X5 (care corespunde cu B25 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi modificat la H; X6 (care corespunde cu B27 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi şters sau modificat la G, S, H sau V; X7 (care corespunde cu B23 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi şters sau modificat la G, E, K, D, S sau H; X8 (care corespunde cu B29 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi şters sau modificat la G, E, P, Q, D sau H; şi X9 (care corespunde cu B30 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) poate fi şters sau modificat la G, S, E sau K. În plus pentru o reducere a predilecţiei porţiunilor de agonişti receptori ai insulinei de a se autoasocia, modificările la poziţiile B16 şi B25 pe analogii - X4 şi respectiv X5 ai catenei B de insulină din SEQ ID NO:1 - pot fi de asemenea făcute pentru ajustarea potenţei, îmbunătăţirea exprimării, îmbunătăţirea stabilităţii chimice şi/sau fizice, îmbunătăţirea uşurinţei cu care proteinele de fuziune poate fi formulate cu alţi excipienţi utilizaţi în mod obişnuit şi/sau pentru a elimina deamidarea. Analogul catenei B de insulină poate include de asemenea modificări suplimentare din aceste motive. Referindu-ne la variabilele din SEQ ID NO:1, astfel de modificări suplimentare includ următoarele: modificarea lui X1 (care corespunde cu B1 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) la Q sau A; modificarea lui X2 (care corespunde cu B2 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) la G; şi/sau modificarea lui X3 (care corespunde cu B3 în catena B dintr-o moleculă de insulină umană) la K, D sau G.

În anumite realizări preferate, analogul catenei B de insulină include mai mult de o modificare la secvenţa de aminoacizi a catenei B de insulină umană în poziţiile X4, X5 şi X6-9 din SEQ ID NO:1. Într-o realizare preferată, X4 este E şi X5 este H. În anumite realizări, secvenţa de aminoacizi de X6-X9 din SEQ ID NO:1 este selectată din grupul care constă din: GGES, GGGS, GGDS, GGEG, GGGG, SSES, SSGS, GGEE, GGGE, GGEK, GGGK, TPGS, TGGS, HGES, GHES, GGHS, GGEH, HGGS, GHGS, GGGH, GGDD, VGES, TEET, TKPT, GGGG, TGGG, TPGG, EPKT, TDKT, TPGS, OUĂ, EGES, EEES, EPES, EPEP şi GGDD. În realizările preferate, secvenţa de aceşti patru aminoacizi este GGGS, GGGG sau TEET. În realizări în special preferate, X4 este E, X5 este H şi X6-9 este GGGG.

Ar trebui să se observe că, în timp ce X6-X9 din SEQ ID NO:1 sunt descrişi mai sus ca cuprinzând capătul C-terminal al analogului catenei B de insulină (Z1), aceşti aminoacizi nu sunt critici la activitatea proteinelor de fuziune la receptorul pentru insulină, şi astfel pot fi consideraţi alternativ o extensie a primului agent de legătură peptidic (Z2). De exemplu, în contextul din SEQ ID NO:4, X6-X9 poate fi considerată parte fie a analogului catenei B de insulină, fie a primului agent de legătură peptidic în acel agonist receptor pentru insulină.

În proteinele de fuziune din prezenta invenţie, analogul catenei A de insulină în porţiunea agonistului receptor pentru insulină poate include una sau mai multe modificări la secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană destinată a îmbunătăţi stabilitatea chimică şi fizică, a ajusta potenţa, şi/sau a intensifica exprimarea. Referindu-ne la variabilele din SEQ ID NO:2, aceste modificări includ următoarele: modificarea lui X1 (care corespunde cu A10 în catena A dintr-o moleculă de insulină umană) la T; modificarea lui X2 (care corespunde cu A14 în catena A dintr-o moleculă de insulină umană) la D, Q sau E; şi/sau modificarea lui X3 (care corespunde cu A21 în catena A dintr-o moleculă de insulină umană) la G, S sau A. Într-o realizare preferată, X1 este T, X2 este D, şi X3 este G.

În plus, pentru a evita deamidarea precum şi clivarea chimică şi/sau proteolitică, dacă aminoacidul la poziţia 21 în analogul catenei A de insulină în agonistul receptor pentru insulină, adică, X3 în SEQ ID NO:2, este un N - aminoacid care este prezent la poziţia corespunzătoare dintr-o moleculă de insulină umană - ar trebuie să nu fie urmat imediat la partea C-terminală de anumiţi aminoacizi, cum ar fi un G sau un N, sau, în anumite realizări, un P, S, V sau L. Vezi, de exemplu, Vlasak J, Ionescu R., MAbs. 2011 mai-iunie;3(3):253-63. Fragmentation of Monoclonal Antibodies. Ar trebui să se observe că în timp ce această cerinţă este relatată în prima proteină de fuziune descrisă mai sus în contextul opţiunilor pentru poziţiile X4 şi X5 în SEQ ID NO:2, care se referă la analogul catenei A de insulină, nu este critică pentru reziduurile non-glicină după un reziduu de asparagină la poziţia 21 în analogul catenei A de insulină pentru a fi considerat parte a agonistului receptor pentru insulină, spre deosebire de al doilea agent de legătură peptidic. De exemplu, în contextul din SEQ ID NO:11, reziduul corespunzător poziţiei 21 în porţiunea analogă a catenei A este reprezentat de X14, şi următorul aminoacid, X15, ar putea fi considerat fie parte a agonistului receptor al insulinei, fie a celui de al doilea agent de legătură peptidic.

Cum s-a descris mai sus, în proteinele de fuziune din prezenta invenţie, reziduul C-terminal al analogului catenei B de insulină este direct fuzionat la reziduul N-terminal al unui prim agent de legătură peptidic şi reziduul C-terminal al primului agent de legătură peptidic este direct fuzionat la reziduul N-terminal al analogului catenei B de insulină. Primul agent de legătură peptidic trebuie să asigure suficientă flexibilitate pentru analogii catenei A şi catenei B de insulină pentru a obţine structura necesară pentru a se lega la receptorul pentru insulină, dar nu trebuie să fie atȃt de lung încȃt să interfereze excesiv cu acea legătură. Lungimea şi compoziţia primului agent de legătură peptidic poate fi ajustată pentru a ajustează potenţa şi/sau exprimarea proteinelor de fuziune. În unele realizări, primul agent de legătură peptidic este de 5 până la 10 aminoacizi în lungime, din care cel puţin 5 sunt reziduuri G. În anumite realizări, secvenţa de aminoacizi a primului agent de legătură peptidic este selectată din grupul care constă din: GGGGGG, GGGGG, EGGGGG, GEGGGG, GGEGGG, GGGEGG, GGGGEG, GGGGGE, KGGGGG, GKGGGG, GGKGGG, GGGKGG, GGGGKG, GGGGGK, HGGGGG, GHGGGG, GGHGGG, GGGHGG, GGGGHG, GGGGGH, GGGGGA, GGGGGR, SGGGGG, GSGGGG, GGSGGG, GGSGGGK, GGSGGGG şi GGSGGG. În anumite realizări preferate, secvenţa primul agent de legătură peptidic cuprinde SEQ ID NO:3. Cel mai preferabil, secvenţa primului agent de legătură peptidic este GGSGGGG (SEQ ID NO:15). Porţiunea agonistului receptor pentru insulină al proteinelor de fuziune din prezenta invenţie include de asemenea legăturile disulfură găsite într-o moleculă de insulină umană cum s-a descris mai sus, şi anume, două legături disulfură care unesc analogii catenei A şi catenei B de insulină la CisA7-CisB7 şi CisA20-CisB19, şi o legătură disulfură intra-catenară în analogul catenei A de insulină la CisA6-CisA11.

Cum s-a descris mai sus, reziduul C-terminal al porţiunii de agonist receptor al insulinei proteinelor de fuziune din prezenta invenţie este fuzionat la reziduul N-terminal al unui al doilea agent de legătură peptidic, şi reziduul C-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic este fuzionat direct la reziduul N-terminal al porţiunii Fc. Este preferat ca al doilea agent de legătură peptidic să fie bogat în glicină, pentru a furniza suficientă flexibilitate conformaţională. Al doilea agent de legătură peptidic este între 10 şi 25 de aminoacizi în lungime, cu cel puţin 50% din aminoacizi fiind reziduuri de glicină. Un al doilea agent de legătură peptidic preferat include secvenţa (GGGGX15)n în care X15 este Q, E sau S şi n = 2-5. Un al doilea agent de legătură peptidic mai preferat are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:6. Cel mai preferat al doilea agent de legătură peptidic are secvenţa de aminoacizi GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO:7).

Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul „regiunea IgG Fc umană» are înţelesul dat în mod obişnuit de termen în domeniul imunologiei. Specific, acest termen se referă la un fragment de anticorp lgG uman care este obţinut prin îndepărtarea cele două regiuni de legare la antigen (fragmentele Fab) de anticorp. În particular, regiunea Fc include domeniile regiunilor constante CH2 şi CH3 ale anticorpului, şi poate include de asemenea unele sau toate regiunile balama.

Cum s-a descris mai sus, în anumite realizări ale proteinei de fuziune din prezenta invenţie, regiunea IgG Fc umană cuprinde fragmente ale regiunii constante dintr-un lanţ greu al unui anticorp IgG, a cărei descriere schematică este furnizată în diagrama (A) din Figura 2, şi în alte realizări, regiunea IgG Fc umană cuprinde fragmente ale regiunilor constante din două lanţuri grele ale unui anticorp IgG, a cărei descriere schematică este furnizată în diagrama (B) din Figura 2. În această realizare, regiunile constante ale celor două lanţuri grele sunt asociate unele cu altele prin interacţiuni non-covalente şi legături disulfură.

Există patru subclase de IgG (G1, G2, G3, şi G4) din care fiecare are structuri şi funcţii biologice diferite cunoscute ca funcţii efectoare. Aceste funcţii efectoare sunt în general mediate prin interacţiunea cu receptorul Fc (FcγR) sau prin legarea factorului complementar C1q. Legarea la FcγR poate conduce la citolize mediate de celule dependente de anticorp, în timp ce legarea la factorii complementari poate conduce la o lizare celulară mediată de complement. Structurile şi proprietăţile regiunilor Fc ale subclaselor de IgG sunt cunoscute în domeniu. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot conţine regiuni Fc din oricare din subclasele de IgG, deşi G2 şi G4 şi au activităţi de legare la receptor şi activităţi ale funcţiilor efectoare mai scăzute decât ale anticorpilor G1 şi G3, şi sunt astfel preferaţi.

Când s-a utilizat aici, termenul regiune IgG Fc umană include de asemenea versiuni ale unor astfel de fragmente de anticorp care au fost modificate, alungite şi/sau trunchiate, de exemplu, pentru a altera proprietăţile sau caracteristicile cum ar fi funcţiile de legare la complement şi/sau la receptorul Fc, funcţiile efectoare, formarea legăturii disulfură, glicozilarea, citotoxicitate mediată celular dependentă de anticorp (ADCC), manufacturabilitatea, şi/sau stabilitatea. De exemplu, regiunile IgG Fc umane ale proteinelor de fuziune din prezenta invenţie pot fi modificate pentru a reduce sau îndepărta situsurile de glicozilare legate N, care vor reduce afinitatea şi citotoxicitate de legare la C1q, şi care ar putea ajuta la imunogenicitate, afectarea stabilităţii conformaţionale şi rata de eliberare in vivo, şi/sau modificarea funcţiilor efectoare. Regiunile IgG Fc umane ale proteinelor de fuziune din prezenta invenţie pot avea de asemenea unele sau toate regiunile balama îndepărtate pentru a simplifica dimerizarea Fc mediată de disulfură. Alte exemple de alterări includ fosforilarea, sulfatarea, acilarea, glicozilarea, metilarea, acetilarea, amidarea, şi/sau modificările pentru a permite producţia de molecule heterodimere. Tehnicile pentru modificarea structurilor şi proprietăţilor regiunilor IgG Fc umane ale subclaselor de IgG sunt cunoscute în domeniu.

Indiferent de structura finală a proteinei de fuziune, regiunea IgG Fc umană trebuie să servească la prelungirea perioadei de înjumătăţire a plasmei in vivo a agonistului receptor pentru insulină. În prepararea proteinelor de fuziune Fc heterologe în care porţiunea Fc este utilizată pentru abilitatea sa de a extinde perioada de înjumătăţire, este important să se minimizeze orice funcţii efectoare. Mai mult, agonistul receptor fuzionat pentru insulină trebuie să rămână capabil să se lege la şi să activeze receptorul pentru insulină pentru a conduce la o scădere a nivelurilor de glucoză în sânge şi/sau la o supresie a producţiei de glucoză hepatică, caracteristici care pot fi testate şi măsurate utilizând tehnici cunoscute, cum ar fi cele prezentate în studiile descrise mai jos. O perioadă de înjumătăţire lungă a proteinelor de fuziune din prezenta invenţie poate fi demonstrată utilizând, de exemplu, metodele descrise mai jos.

O regiune IgG Fc umană preferată este o regiune IgG4 Fc modificată pentru a reduce suplimentar funcţiile efectoare, pentru a promova formarea de homodimeri, şi a avea o porţiune din balama ştearsă, ca în SEQ ID NO:9 în care X1 este F; X2 este F; X3 este V; X4 este V; X5 este N; X6 este R; şi X7 este absent.

O altă regiune lgG Fc umană preferată este o regiune IgG2 Fc care are o porţiune din balama ştearsă, ca în SEQ ID NO:10 în care X1 este F; X2 este F; X3 este V; X4 este V; X5 este N; şi X6 este absent.

Ar trebui să se observe că, deşi secvenţele de aminoacizi ale regiunilor lgG Fc umane preferate relatate mai sus au porţiuni de regiuni balama îndepărtate pentru a simplifica dimerizarea mediată de disulfură, acele regiuni balama pot fi prezente în anumite realizări. De exemplu, o regiune lgG2 Fc de tip sălbatic include cele şase secvenţe de aminoacizi ERKCCV la capătul său N-terminal, şi deşi aceşti aminoacizi nu sunt relataţi în secvenţa regiunii IgG2 Fc stabilită în SEQ ID NO:10, se are în vedere că o regiune IgG Fc umană care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SEQ ID NO:10 poate cuprinde suplimentar unele sau toate din cele şase secvenţe de aminoacizi ERKCCV la capătul său N-terminal. În mod similar, o regiune IgG Fc umană care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SEQ ID NO:9 poate cuprinde suplimentar unii sau toţi din cei şase aminoacizi găsiţi la capătul N-terminal al unei regiuni IgG4 Fc, şi anume ESKYGP. În mod asemănător, o regiune IgG Fc umană care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SEQ ID NO:8 poate cuprinde suplimentar unii sau toţi din cei zece aminoacizi găsiţi la capătul N-terminal al unei regiuni IgG1 Fc, şi anume: EPKSCDKTHT. Mai mult, conturarea precisă între care aminoacid constituie capătul C-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic şi care aminoacid constituie capătul N-terminal al regiunii IgG Fc umane nu este critică pentru structura sau funcţionarea proteinei de fuziune din prezenta invenţie. De exemplu, în contextul din SEQ ID NO:11, reziduurile corespunzătoare poziţiilor X19-X22 ar putea fi descrise ca fiind capătul C-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic sau o extensie a N-terminalului regiunii IgG Fc umane.

Cum s-a descris mai sus, prezenta invenţie se referă de asemenea la polinucleotidele care codifică oricare din proteinele de fuziune din prezenta invenţie. Polinucleotidele care codifică proteinele de fuziune descrise mai sus, pot fi în formă de ARN sau ADN, care include ADNc şi ADN sintetic, şi care pot fi dublu catenare sau monocatenare. Secvenţele codificatoare care codifică proteinele din prezenta invenţie pot varia ca rezultat al redundanţei sau degenerării codului genetic.

Polinucleotidele care codifică proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot include următoarele: numai secvenţa codificatoare pentru proteine, secvenţa codificatoare pentru proteine şi secvenţa codificatoare suplimentară, cum ar fi o secvenţă lider sau secretoare sau o secvenţă proproteică; secvenţa codificatoare pentru secvenţele proteice şi necodificatoare, cum ar fi intronii sau secvenţele necodificatoare 5' şi/sau 3' ale secvenţei codificatoare pentru proteine. Astfel, termenul „polinucleotidă care codifică o proteină» cuprinde o polinucleotidă care poate include nu numai secvenţa codificatoare pentru proteine ci şi de asemenea o polinucleotidă care include suplimentar secvenţa codificatoare şi/sau necodificatoare.

Polinucleotidele din prezenta invenţie vor fi exprimate într-o celulă gazdă după ce secvenţele au fost legate operabil la o secvenţă de contol a exprimării. Vectorii de exprimare sunt de obicei replicabili în organismele gazdă fie ca epizomi, fie ca o parte integrală din ADN-ul cromozomial al gazdei. În mod obişnuit, vectorii de exprimare vor conţine markeri de selecţie pentru a permite detecţia acelor celule transformate cu secvenţele ADN dorite.

Proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot fi cu uşurinţă produse în celule de mamifer cum ar fi CHO, NSO, HEK293, BHK, sau celule COS; în celulele bacteriene cum ar fi E. coli, Bacillus subtilis, sau Pseudomonas fluorescenţă; în celule de insecte, sau în celule de ciuperci sau de drojdie, care sunt cultivate utilizând tehnici cunoscute în domeniu. Insectele, şi drojdia sau alte celule de ciuperci, produc totuşi, N-glicani neumani, astfel încȃt proteinele cu glicozilare N-legate produse în astfel de celule pot cauza reacţii imunogenice dacă sunt administrate pacienţilor. Producţia în astfel de celule necesită astfel eliminarea situsurilor de glicozilare N-legate şi/sau modificarea genetică a celulelor pentru a produce N-glicani umani utilizând tehnici cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Hamilton SR, şi colab., Production of complex human glycoproteins in yeast, 301 SCIENCE (5637): 1244-6 (August 2003). Este preferată producţia în celulele de mamifer, şi celula gazdă de mamifer preferată este linia celulară CHOK1 SV care conţine un sistem de exprimare (GS) al sintetazei de glutamină (vezi US. Pat nr. 5.122.464).

Vectorii care conţin secvenţele de polinucleotide de interes (de exemplu, proteinele de fuziune şi secvenţele de control ale expresiei) pot fi transferaţi în celula gazdă prin metode bine cunoscute, care variază depinzând de tipul celulei gazdă. De exemplu, transformarea clorurii de calciu este utilizată în mod obişnuit pentru celulele procariote, în timp ce tratamentul sau electroporaţia fosfatului de calciu poate fi utilizată pentru alte celule gazdă.

Pot fi utilizate diferite metode de purificare a proteinei şi astfel de metode sunt cunoscute în domeniu şi descrise, de exemplu, în Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, ediţia a 3-a, Springer, N.Y. (1994).

Cum s-a descris mai sus, proteina de fuziune din prezenta invenţie în anumite realizări este produsă ca dimer. Într-un astfel de dimer, regiunile IgG Fc umane ale proteinelor de fuziune sunt asociate una cu alta prin interacţiuni non-covalente şi legături disulfură. O descriere schematică a unui astfel de dimer este prevăzută în diagrama (C) din Figura 2. Când secvenţele de aminoacizi ale celor două proteine de fuziune care alcătuiesc un astfel de dimer - de exemplu, proteina de fuziune A şi proteina de fuziune B în dimerul reprezentat în diagrama (C) din Figura 2 - sunt aceleaşi, dimerul este referit aici ca „homodimer». Cum s-a observat mai sus, este preferată exprimarea proteinelor de fuziune din prezenta invenţie în celulele de mamifer, şi exprimarea în astfel de celule conduce la homodimeri. Proteinele de fuziune în astfel de homodimeri sunt asociate prin interacţiuni non-covalente şi legături disulfură intermoleculare în porţiunea Fc. De exemplu, proteina produsă de o genă care codifică proteina de fuziune din SEQ ID NO:12 ar fi un homodimer legat covalent prin legături disulfură intercatenare, şi anume C80 pȃnă la C80 şi C83 pȃnă la C83.

Când secvenţele de aminoacizi a celor două proteine de fuziune care alcătuiesc un dimer - de exemplu, proteina de fuziune A şi proteina de fuziune B în diagrama (C) din Figura 2 - sunt diferite, dimerul este referit aici ca „heterodimer». Un astfel de heterodimer poate fi preparat prin tehnici cunoscute în domeniu. Vezi, e.g, Lewis SM, şi colab. NAT. BIOTECHNOL. 32(2):191-8 (2014); Carter, J. IMMUNOL. METHODS, 248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. PROTEIN ENG. 9(7):617-2 (1996).

Referirile de aici la compoziţii farmaceutice care cuprind o proteină de fuziune includ compoziţii farmaceutice care conţin un homodimer din acea proteină de fuziune, şi/sau care conţin un heterodimer, în care un membru al heterodimerului este o proteină de fuziune. În mod asemănător, referirile la o proteină de fuziune pentru utilizare în terapie şi/sau o proteină de fuziune pentru utilizare în fabricarea unui medicament includ un homodimer din acea proteină de fuziune, şi/sau un heterodimer în care un membru al heterodimerului este o proteină de fuziune, pentru utilizare în terapie şi/sau în fabricarea unui medicament.

Termenii „tratament» sau „tratare», aşa cum s-au utilizat în acest document, se referă la gestiunea şi grija faţă de un pacient care are diabet sau hiperglicemie, sau altă afecţiune pentru care este indicată administrarea de insulină în scopul combaterii sau atenuării simptomelor şi complicaţiilor acelor afecţiuni. Tratarea include administrarea proteinelor de fuziune din prezenta invenţie pentru a preveni sau întârzia debutul simptomelor sau complicaţiilor, atenuarea simptomelor sau complicaţiilor, sau eliminarea bolii, afecţiunii, sau tulburării. Pacientul care trebuie tratat este un mamifer, şi preferabil, o fiinţă umană.

Termenii „previne» sau „prevenirea», aşa cum s-au utilizat în acest document, se referă la reducerea riscului sau incidenţei de, sau eliminării sau încetinirii progresului, unuia sau mai multor afecţiuni, simptome, complicaţii sau tulburări.

Proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a trata subiecţii cu o largă varietate de boli şi afecţiuni. Sunt incluşi subiecţii cu hiperglicemie, cu diabet dependent de insulină precum şi subiecţi cu diabet nedependent de insulină, incluzând tratamentul subiecţilor naivi precum şi subiecţii care sunt trataţi cu medicaţii orale, cum ar fi o sulfoniluree, metformină, tiazolidinedionă cum ar fi pioglitazona, inhibitorul α-glucosidază cum ar fi acarboza, şi/sau injectabilele neinsulinice, incluzând terapiile pe bază de incretin, cum ar fi inhibitorii DPP-4 şi agoniştii GLP-1R. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie pot fi utilizate pentru reglarea glucozei în sânge la astfel de pacienţi, şi pot trata afecţiunile sau complicaţiile care rezultă din controlul insuficient al glucozei în sânge cum ar fi retinopatia, neuropatia sau boala renală.

În anumite realizări, proteina de fuziune din prezenta invenţie este administrată în fiecare zi, în fiecare altă zi, de două ori pe săptămână, de trei ori pe săptămână, o dată pe săptămână, de două ori pe lună sau o dată pe lună. În realizările preferate, durata de acţiune este extinsă suficient pentru a permite dozarea o dată pe săptămână. Chiar pentru astfel de molecule care acţionează pe termen lung totuşi, se va recunoaşte de către cei calificaţi în domeniu că controlul eficient al glucozei poate fi de asemenea furnizat prin acumularea dozală graduală a unui medicament cu un profil farmacocinetic lung utilizând un regim de tratament mai frecvent, cum ar fi o dată zilnic. Vezi, de exemplu, Heise T şi Meneghini LF, 20 ENDOCR. PRACT. p75-83 (2014).

În anumite realizări, proteina de fuziune din prezenta invenţie este administrată în combinaţie cu un ingredient activ suplimentar, cum ar fi insulina sau un analog al insulinei, o terapie pe bază de incretin, sau o medicaţie orală pentru diabet, cum ar fi o sulfoniluree, metformină, tiazolidinedionă cum ar fi pioglitazonă sau un inhibitor α-glucosidază cum ar fi acarboza.

Termenul „terapie pe bază de incretin" include orice tratament care cuprinde administrarea de, sau promovarea, permisia, ameliorarea şi/sau simularea efectelor, unui grup de hormoni metabolici cunoscuţi ca incretini, care grup include GLP-1 şi o peptidă inhibitoare gastrică (GIP). Terapiile pe bază de incretin care sunt în prezent disponibile includ inhibitori DPP-4 şi agonişti GLP-1R.

Un „inhibitor DPP-4» este un compus care blochează enzima DPP-4, care este responsabilă pentru degradarea incretinilor. Inhibitorii DPP-4 disponibili în prezent includ sitagliptin (Januvia®), şi linagliptin (Tradjenta®).

Un „agonist GLP-1R» este definit ca un compus care cuprinde secvenţa de aminoacizi de GLP-1 uman nativ (SEQ ID NO:25), un analog GLP-1, derivat GLP-1 sau proteină de fuziune GLP-1, care menţine activitatea la receptorul GLP-1. Activitatea GLP-1R poate fi măsurată prin metode cunoscute în domeniu, incluzând utilizarea de experimente in vivo şi teste in vitro care măsoară activitatea de legare a receptorului GLP-1 sau activarea receptorului, de exemplu, teste care utilizează celulele islet pancreatice sau celulele insulinome, cum s-a descris în EP 619.322 şi respectiv brevetul S.U.A. nr. 5.120.712. Un analog GLP-1 este o moleculă care are o modificare care include una sau mai multe substituţii, deleţii, inversiuni, sau adăugări de aminoacizi, când se compară cu secvenţa de aminoacizi a GLP-1 uman nativ (SEQ ID NO:25). Un derivat GLP-1 este o moleculă având secvenţa de aminoacizi de GLP-1 uman nativ (SEQ ID NO:25) sau a unui analog GLP-1, dar avȃnd suplimentar cel puţin o modificare chimică dintr-una sau mai multe din grupările sale laterale aminoacide, atomi α-carbon, grupare amino terminală, sau grupare acid carboxilică terminală. O proteină de fuziune GLP-1 este o proteină heterologă care cuprinde un GLP-1, un analog GLP-1 sau o porţiune derivată GLP-1 şi o a doua polipeptidă. Agoniştii GLP-1R disponibili în prezent includ exenatidele (Byetta® şi Bydureon®), liraglutidele (Victoza®), albiglutidele (Tanzeum®) şi dulaglutidele (Trulicity®), structuri care sunt cunoscute în domeniu vezi, de exemplu, US 5.424.286 (exenatide); US 6.268.343 (liraglutide); US 2014044717 (albiglutide); şi US 7.452.966 (dulaglutide).

În realizările în care o proteină de fuziune din prezenta invenţie este prevăzută în combinaţie cu un ingredient activ suplimentar, proteina de fuziune şi ingredientul activ suplimentar pot fi administrate simultan, secvenţial sau într-o singură, formulare combinată.

Proteinele de fuziune din prezenta invenţie sunt eficiente în tratarea unor astfel de boli şi afecţiuni prin administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie. Aşa cum s-a utilizat în acest document, exprimarea „cantitate eficientă terapeutic» se referă la acea cantitate dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie, suficientă pentru reglarea glucozei în sânge la un pacient fără să cauzeze efecte secundare inacceptabile. O cantitate eficientă terapeutic de proteină de fuziune administrată la un subiect va depinde de tipul şi severitatea bolii şi de caracteristicile subiectului, cum ar fi sănătatea generală, vârsta, sexul, greutatea corporală, şi toleranţa la medicamente. Specialistul calificat va fi capabil să determine dozajul adecvat depinzând de aceşti şi alţi factori. În anumite realizări, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 0,01 nmol/kg până la aproximativ 100 nmol/kg. Mai preferabil, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 1 nmol/kg până la aproximativ 50 nmol/kg. Mai preferabil, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 16 nmol/kg până la aproximativ 25 nmol/kg. În anumite realizări, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 1 mg până la aproximativ 200 mg. Mai preferabil, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 25 mg până la aproximativ 175 mg. Mai preferabil, o cantitate eficientă terapeutic dintr-o proteină de fuziune din prezenta invenţie când este administrată o dată pe săptămână variază de la aproximativ 100 mg până la aproximativ 160 mg.

Persoanele calificate în domeniu vor înţelege că, atunci când proteina de fuziune din prezenta invenţie este administrată în combinaţie cu un alt ingredient activ, cum ar fi un agonist GLP-1R, doza poate fi ajustată astfel încât activitatea celor două tratamente combinate să fie suficientă pentru reglarea glucozei în sânge la un pacient. Astfel, cantitatea de proteină de fuziune care trebuie să fie administrată pentru reglarea nivelurilor de glucoză în sânge în astfel de combinaţii poate fi mai mică decȃt cea care ar fi necesară dacă proteina de fuziune ar fi administrată ca monoterapie. De exemplu, când proteina de fuziune din prezenta invenţie este prevăzută în combinaţie cu un agonist GLP-1R, cantitatea de proteină de fuziune care trebuie să fie furnizată într-o doză o dată pe săptămână poate fi redusă cu până la 50%, în comparaţie cu cantitatea din aceeaşi proteină de fuziune utilizată ca monoterapie, cum ar fi dozele descrise în paragraful precedent.

Preferabil, administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de proteină de fuziune din prezenta invenţie în unele realizări va furniza controlul eficient al glucozei în timp ce reduce riscul de hipoglicemie şi/sau câştig în greutate în comparaţie cu tratamentele existente. Incidenţa hipoglicemiei cauzate de o terapie a diabetului care agonizează receptorul pentru insulină poate fi minimizată prin evitarea unui vȃrf rapid în concentraţia de agent terapeutic după administrare. Proteinele de fuziune din prezenta invenţie au un profil de acţiune extins în timp, fără un vȃrf rapid în concentraţie după administrare.

Mai mult, în realizările în care proteinele de fuziune din prezenta invenţie sunt furnizate în combinaţie cu un alt ingredient activ, în particular, un agonist GLP-1R, activitatea hepatopreferenţială a proteinelor de fuziune din prezenta invenţie poate de asemenea reduce riscul de hipoglicemie în timp ce controlează nivelurile de glucoză. Deoarece proteina de fuziune din prezenta invenţie poate accesa cu uşurinţă ficatul prin endoteliul sinusoid fenestrat, molecula poate controla producţia de glucoză hepatică, cu o mică, dacă există, activitate la periferie, în timp ce agonistul GLP-1R promovează secreţia dependentă de glucoză a insulinei endogene din pancreas, care este cu uşurinţă capabilă să perfuzeze în periferie pentru a controla absorbţia de glucoză în muşchi şi grăsime.

Proteinele de fuziune din prezenta invenţie sunt administrate parenteral, prin administrare nazală sau inhalare pulmonară. Este preferată administrarea parenterală, şi poate include, de exemplu, administrarea sistemică, cum ar fi prin injectare intramusculară, intravenoasă, subcutanată, sau intraperitoneală.

Proteinele de fuziune pot fi administrate subiectului într-o compoziţie farmaceutică, care cuprinde o proteină de fuziune din prezenta invenţie şi cel puţin un excipient acceptabil farmaceutic. Astfel de compoziţii farmaceutice sunt de obicei, deşi nu în mod necesar, parenterale în natură şi pot fi preparate prin oricare dintr-o varietate de tehnici care utilizează excipienţi convenţionali pentru produse parenterale, care sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, a 21-a ediţie, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). Cum s-a descris mai sus, proteina de fuziune din prezenta invenţie este un homodimer când este exprimată în celulele de mamifer. Astfel, când este utilizat aici, termenul „compoziţie care cuprinde o proteină de fuziune» include o compoziţie, care conţine un homodimer al unei proteine de fuziune. În anumite realizări, o compoziţie farmaceutică din prezenta invenţie include o compoziţie cu proteina de fuziune din prezenta invenţie prezentă într-o concentraţie de cel puţin 1 mg/mL, cel puţin 2 mg/mL, cel puţin 5 mg/mL, cel puţin 10 mg/mL, cel puţin 20 mg/mL, cel puţin 25 mg/mL, cel puţin 30 mg/mL, cel puţin 35 mg/mL, cel puţin 50 mg/mL, cel puţin 55 mg/mL, cel puţin 50 mg/mL, cel puţin 65 mg/mL, cel puţin 75 mg/mL, cel puţin 100 mg/mL sau mai mare. În realizările preferate, proteina de fuziune este prezentă într-o concentraţie de 10-100 mg/mL. În mai multe realizări preferate, proteina de fuziune este prezentă într-o concentraţie de 15-75 mg/mL, şi în cele mai multe realizări preferate, proteina de fuziune este prezentă într-o concentraţie de 20-65 mg/mL.

Termenul „excipient» înseamnă orice substanţă adăugată la compoziţie, alta decât proteina de fuziune sau orice alt ingredient activ suplimentar. Exemple de astfel de excipienţi care pot fi utilizaţi în compoziţiile prezentei invenţii includ agenţi de tamponare, surfactanţi, agenţi pentru izotonicitate şi conservanţi.

În anumite realizări, compoziţia din prezenta invenţie include unul sau mai mulţi agenţi de tamponare pentru a controla pH-ul compoziţiei. Un „agent de tamponare» este o substanţă care rezistă modificărilor în pH prin acţiunea componentelor sale conjugate acid-bază. În anumite realizări, compoziţia din prezenta invenţie are un pH de la aproximativ 5,5 până la aproximativ 8,0, preferabil, între aproximativ 6,0 şi aproximativ 7,4, mai preferabil între aproximativ 6,0 şi 6,75. Agenţii de tamponare adecvaţi pentru controlarea pH-ului compoziţiilor din prezenta invenţie în intervalul dorit includ, dar nu se limitează la, agenţi cum ar fi fosfatul, acetatul, citratul, sau acizi ai acestuia, arginina, TRIS, şi tampoane de histidină, precum şi combinaţii ale acestora. „TRIS» se referă la 2-amino-2-hidroximetil-1,3,-propandiol, şi la orice sare acceptabilă farmacologic a acestuia. Baza liberă şi forma clorhidrată (adică, TRIS-HCl) sunt două forme comune de TRIS. TRIS este de asemenea cunoscut în domeniu ca trimetilol aminometan, trometamină, şi tris(hidroximetil) aminometan. Agenţii de tamponare preferaţi în compoziţia din prezenta invenţie sunt citratul, sau acidul citric, şi fosfatul.

În anumite realizări, compoziţiile prezentei invenţii includ unul sau mai mulţi agenţi de izotonicitate pentru a minimiza durerea după injecţie din cauza umflării celulare sau rupturii celulare. Un „agent de izotonicitate» este un compus care este tolerat fiziologic şi conferă o tonicitate adecvată unei formulări pentru a preveni curgerea netă a apei prin membranele celulare care sunt în contact cu compoziţia farmaceutică administrată. Agenţii de izotonicitate cunoscuţi includ glicerolul, sărurile cum ar fi clorura de sodiu, şi monozaharidele care includ, dar nu se limitează la, manitol, dextroză şi lactoză. Agenţii de izotonicitate preferaţi sunt manitolul şi clorura de sodiu.

În anumite realizări, compoziţiile prezentei invenţii includ un surfactant. Un „surfactant» este o substanţă care scade tensiunea superficială a unui lichid. Exemple de surfactanţi utilizaţi în compoziţiile farmaceutice şi care pot fi utilizaţi în anumite compoziţii ale prezentei invenţii includ polisorbat 20, polisorbat 80, polietilen glicoli (de exemplu, PEG 400, PEG 3000, TRITON X-100), polietilen glicol alchil eteri (de exemplu, BRIJ), polipropilen glicoli, copolimeri bloc (de exemplu, poloxamer, PLURONIC F68; poloxamer 407, PLURONIC F127; TETRONICS), sorbitan alchil esteri (de exemplu, SPAN), ulei de ricin polietoxilat (de exemplu, KOLLIPHOR, CREMOFOR), şi trehaloză.

Compoziţiile farmaceutice din prezenta invenţie pot conţine de asemenea un conservant. Termenul „conservant» se referă la un compus adăugat la o formulare farmaceutică pentru a acţiona ca un agent anti-microbian în compoziţii multi-utilizare şi/sau titratabile. Printre conservanţii cunoscuţi în domeniu ca fiind eficienţi şi acceptabili în formulările parenterale sunt clorura de benzalconiu, benzetoniul, clorohexidina, fenolul, m-cresolul, alcoolul benzilic, metil sau propil-parabenul, clorobutanolul, o-cresolul, p-cresolul, clorocresolul, nitratul fenilmercuric, timerosalul, acidul benzoic, şi diferite amestecuri ale acestora. Conservantul fenolic include compuşii fenol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, metilparaben, şi amestecuri ale acestora. Dacă un conservant este necesar, conservantul utilizat în compoziţiile prezentei invenţii este preferabil un conservant fenolic, preferabil m-cresol sau fenol.

Anumiţi conservanţi fenolici, cum ar fi fenolul şi m-cresolul, sunt cunoscuţi pentru legarea la insulină şi la hexameri de insulină şi stabilizȃnd prin urmare o modificare conformaţională care creşte stabilitatea fie fizică, fie chimică, sau pe ambele. În compoziţiile care cuprind alte proteine totuşi, astfel de conservanţi pot contribui la formarea de agregate proteice, sau de polimeri cu masă moleculară mare (HMWP). Vezi, de exemplu, Maa YF şi Hsu CC, Int J Pharm 140: 155-168 (1996); Fransson J, şi colab., Pharm. Res., 14: 606-612 (1997); Lam XM, şi colab., Pharm. Res., 14: 725-729 (1997); Remmele RL Jr, şi colab., Pharm Res 15: 200-208. (1998); Thirumangalathu R, şi colab., J Pharm Sci 95: 1480-1497 (2006). Astfel de agregate proteice în formulările terapeutice sunt indezirabile din cauza tendinţei lor de a induce un răspuns imun.

În anumite realizări preferate, secvenţa de aminoacizi a proteinei de fuziune din prezenta invenţie este optimizată pentru a ameliora stabilitatea fizică a proteinei de fuziune în compoziţiile care conţin de asemenea un conservant fenolic. De exemplu, prezenţii inventatori au descoperit în mod surprinzător că prezenţa unei mutaţii de aminoacid la poziţia 10 în analogul catenei A de insulină (X1 variabil în analogul catenei A de insulină relatată în SEQ ID NO:2) reduce acumularea agregatelor de proteină de fuziune în prezenţa conservanţilor fenolici, aşa cum se arată în studiile de stabilitate de mai jos.

Invenţia este mai departe ilustrată prin următoarele exemple, care nu trebuie să fie interpretate ca limitative.

Exprimarea şi purificarea proteinelor de fuziune

Proteinele de fuziune din prezenta invenţie sunt produse într-un sistem de exprimare a celulei de mamifer utilizând linia celulară (GSKO) doborȃtă (GS) de sintetază a glutaminei CHO. Gena GS doborȃtă permite selecţia strȃnsă a stringenţei prin eliminarea acctivităţii de fundal a GS endogenă, care poate permite supravieţuirea celulelor slab sau ne-productive în condiţii de selecţie. Genele care codifică proteinele de fuziune sunt sub-clonate în sintetaza glutaminei (GS) care conţine plasmidă exprimată. Secvenţa ADNc care codifică proteinele de fuziune este fuzionată în cadru cu secvenţa codificatoare a unei peptide semnal care ameliorează secreţia de proteină de fuziune în mediul de cultură celulară. Exprimarea este dirijată de promotorul citomegalovirus (CMV). Celulele CHO GSKO sunt transfectate stabil utilizând electroporaţia şi cantitatea adecvată de plasmidă recombinantă exprimată.

Celule transfectate suferă o selecţie în masă în mediu fără glutamină. Acumulările transfectate sunt placate la densitate scăzută pentru a permite extinderea aproape clonală a celulelor exprimate stabil. Godeurile de frunte sunt analizate pentru eprimarea proteinelor de fuziune şi extinse în culturi de suspensie fără ser pentru a fi utilizate pentru producţie.

Proteinele de fuziune secretate în mediu pot fi purificate prin cromatografie de afinitate a proteinei A, urmată de cromatografie de excludere dimensională după tehnici cromatografice standard. Pe scurt, proteinele de fuziune din mediul limpezit sunt capturate de proteina A de selecţie Mab (GE) care a fost echilibrată cu soluţie salină tamponată cu fosfat pH 7,4. După o etapă de spălare cu soluţie salină tamponată cu fosfat pH 7,4, proteinele de fuziune legate sunt eluate cu 10 mM acid citric pH 3,0. Fracţiunile care conţin proteină de fuziune sunt acumulate şi neutralizate prin adăugare de 1/10 volum de 1M Tris pH 8,0. Agregatele solubile şi multimerii pot fi îndepărtate eficient prin tehnici obişnuite, incluzând excluderea dimensională, interacţiunea hidrofobă sau cromatografia cu schimb de ioni. Fracţiunile care conţin proteină de fuziune monomerică (homodimer legat covalent), după cum s-a determinat prin cromatografia de excludere dimensională, sunt acumulate, filtrate steril, şi depozitate.

Secvenţele de aminoacizi din exemplele de proteine de fuziune din prezenta invenţie sunt prezentate mai jos:

Exemplul 1:

Exemplul 2:

Exemplul 3:

Exemplul 4:

Exemplul 5:

Exemplul 6

Exemplul 7

Exemplul 8

Exemplul 9

Exemplul 10

Activitate in vitro

Loturile de test din exemplele 1-3, 5 şi 9 sunt preparate în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS, pH 7,4) sau 10 mM tampon citrat (pH 6,5) şi depozitate la 4°C. Insulina umană biosintetică (Eli Lilly and Company) este preparată în 0,01 N HCl şi depozitată ca alicote congelate, sau preparate într-un amestec formulat care conţine m-cresol, zinc, clorură de sodiu, şi tampon Tris (pH 7,3) la 100 unităţi/mL şi depozitat la 4°C.

Afinităţile proteinelor de fuziune sunt determinate în teste de legare la receptor efectuate pe membrane P1 preparate din celule 293EBNA transfectate stabil (celule de rinichi embrionar uman 293HEK care exprimă EBNA-1) care supraexprimă fie izoforma A a receptorului de insulină umană (hIR-A), fie izoforma B a receptorului de insulină umană (hIR-B) conţinând o etichetă epitop C9 la C-terminal. Afinităţile de legare sunt determinate din teste de legare competitive a radio-liganzilor, efectuate în starea de echilibru utilizând (3-[125I]-iodotirosil-A14)-insulină recombinantă umană. Valorile pentru mostrele de test sunt calculate ca procentaj faţă de activitatea unei insuline umane neetichetate. Valorile IC50 sunt determinate din analiza de regresie neliniară logistică cu 4 parametri (XLFit versiunea 4.0, IDBS). Dacă este necesar, parametrii de la partea superioară sau inferioară a curbei sunt setaţi până la 100 sau respectiv la 0.

Constanta de afinitate (Ki) este calculată din valoarea IC50 pe baza ecuaţiei Ki = IC50 / (1 + D /Kd) unde D este egal cu concentraţia de radio-liganzi utilizaţi în experiment şi Kd este egal cu constanta de afinitate de legare la echilibru a radio-liganzilor pentru receptorul său cognat, determinată din analiza de legare saturată (hIR-A = 0,205 nM; hIR-B = 0,251 nM). Valorile raportate pentru Ki sunt prezentate ca medie geometrică ± eroarea standard a mediei (SEM), cu numărul de determinări replicate indicat prin „n» (Tabelul 1).

Proteinele de fuziune exemplificate au afinitate atȃt la hIR-A cȃt şi la hIR-B. În comparaţie cu insulina umană, proteinele de fuziune exemplificate prezintă afinitate de legare redusă la hIR-A şi la hIR-B (Tabelul 1).

Tabelul 1:

Mostră Afinitate de legare la receptor, Ki, nM (SEM, n) hIR-A hIR-B Exemplul 1 24,9 (4,3, n=10) 26,2 (4,3, n=10) Exemplul 2 1,61 (0,06, n=3) 4,60 (0,86, n=3) Exemplul 3 10,1 (1,5, n=4) 14,5 (2,3, n=4) Exemplul 5 35,6 (10,4, n=4) 24,6 (3,4, n=4) Exemplul 9 3,74 (1,20, n=2) 4,71 (1,78, n=2) Insulină umană 0,166 (0,008, n=10) 0,202 (0,007, n=10)

Valorile Ki sunt medii geometrice. SEM este eroarea standard a mediei. n este numărul de observaţii.

Studii in vivo

Studii pe modelul de diabet pe şobolanii trataţi cu streptozotocin (STZ)

Efectele proteinelor de fuziune sunt investigate pe modelul de diabet pe şobolanii trataţi cu STZ. Şobolanii Sprague-Dawley masculi, cu greutatea corporală de 400-425 grame, sunt anesteziaţi cu isofluran şi le este dată o singură injecţie de Zanosar® (STZ item # 89256, Teva Parenteral Medicines, 40 mg/kg IV). Şobolanii sunt utilizaţi în studii la 3 zile după injectarea cu Zanosar®; în aceste studii sunt utilizate doar animalele hrănite, cu glucoza în sânge între 400-550 mg/dL.

Şobolanii sunt distribuiţi în grupuri pentru a furniza o varianţă comparabilă a glucozei în sânge şi greutăţii corporale şi apoi sunt randomizaţi. Glucoza în sânge este măsurată utilizând un glucometru Accucheck Aviva (Roche). Şobolanilor trataţi cu STZ le este dată o singură injecţie subcutanată (SC) în doză de 30 nmol/kg.

Probele de sânge pentru măsurătorile de glucoză sunt colectate din sȃngerarea cozii. Animalele au acces liber la alimente şi apă în experiment. Datele referitoare la glucoza din sânge sunt furnizate în Figura 1. Datele prezentate în figura 1 sunt media ± SEM (n=6 pentru Exemplele 1 şi 8; n=3 pentru exemplele rămase). Datele referitoare la glucoza din sânge pentru momentele de timp din timpul perioadei de alimentaţie iniţială (între 0 şi 24 ore) sunt colectate, dar nu sunt incluse în Figura 1 pentru uşurinţa reprezentării vizuale. Aşa cum se arată în Figura 1, Exemplele 1-10 furnizează fiecare scăderea glucozei pentru o perioadă prelungită de timp.

Proprietăţile farmacocinetice din exemplele 1, 3-6 şi 9-10 sunt de asemenea caracterizate după dozarea subcutanată (SC) a şobolanilor trataţi cu STZ cum s-a descris mai sus. Datele sunt generate utilizând un test ELISA pentru receptorul de insulină, care necesită prezenţa insulinei care este capabilă să lege receptorul pentru insulină. Receptorul pentru insulină ELISA utilizează ca captură receptorul pentru insulină uman (R&D Systems#1544-IR/CF aa28-944). Receptorul pentru insulină uman este ataşat la o placă Immunlon 4 HBX prin anticorpul anti-6x HisTag de şoarece (Novagen 70796). Curba standard a proteinei de fuziune şi mostrele sunt diluate în 100% plasmă K3 EDTA de şobolan şi detectate de peroxidaza eliberată de lgG Fc anti-umană de şoarece (SouthernBiotech 9040-05). Concentraţiile din exemplele 3-6 şi 9-10 la momente de timp de 336 de ore sunt toate între 22,1 ± 9,8 mg/mL şi 1498 ± 690 mg/mL. Tabelul 3 prezintă concentraţiile din exemplul 1 în timp, şi Tabelul 4 prezintă parametrii farmacocinetici după analiza non-compartimentală a datelor din exemplul 1. Datele susţin o durată extinsă a biodisponibilităţii pentru proteinele de fuziune din prezenta invenţie.

Tabelul 3

Timp (Ore) Concentraţie (mg/mL) 1 335 ± 104 6 3559 ± 447 12 5991 ± 1578 24 10614 ± 1334 48 12629 ± 1811 96 8766 ± 2028 168 5017 ± 253 240 3682 ± 509 336 2014 ± 134

Date reprezintă media şi deviaţia standard a n=3.

Tabelul 4

Parametru PK Rezultat AUC0-∞ (µg*ore/mL) 1066 ± 363 Cmax (µg/mL) 6,81 ± 1,62 Tmax (ore) 40 ± 14 CL sau CL/F (mL/ore/kg) 2,15 ± 0,91 t1/2 (ore) 82 ± 12 %F 147

Datele reprezintă media şi deviaţia standard a n=3. Abrevieri: AUC0-∞ - aria de sub curba de la 0 la infinit, Cmax- concentraţie maximă, Tmax - timp la concentraţia maximă, CL - eliberare, F - biodisponibilitate, t1/2 - perioadă de înjumătăţire.

Studiu de acumulare euglicemică la şobolanii normali

Este efectuat un studiu de acumulare euglicemică pe şobolanii Sprague-Dawley masculi pentru a se înţelege activitatea globală in vivo din exemplul 1 asupra utilizării glucozei şi pentru a determina activitatea din exemplul 1 în ficat versus ţesuturile periferice. O perfuzie bolus/continuă de 3-3H-glucoză este iniţiată la şobolanii cateterizaţi cronic, nehrăniţi peste noapte, pentru a determina producţia de glucoză endogenă (EGP) în condiţii de bază. O perfuzie intravenoasă bolus/continuă a articolului de test -7nmol/kg [bolus] şi 1nmol/kg/oră [rată continuă] - sau comparator de insulină lispro - [fără bolus] şi 0,75 mU/kg/min [rată continuă] - este apoi administrată şi este iniţiată o perfuzie intravenoasă variabilă de 20% glucoză şi ajustată periodic pentru a menţine concentraţia de glucoză din sânge la 100-110 mg/dL. Ratele de bolus/perfuzie sunt selectate pentru a obţine rate comparabile de perfuzie cu glucoză (GIR) şi supresie comparabilă de EGP în condiţii de acumulare euglicemică la fiecare grup. Este administrat somatostatin pentru a inhiba secreţia de insulină endogenă. Probele de sânge arterial sunt obţinute în timpul experimentului pentru a analiza hematocritul, insulina plasmatică, şi acizii graşi liberi, C-peptidele, şi EGP de bază şi acumulată. La sfȃrşitul experimentului, este administrată 2-[1-14C]-deoxiglucoză pentru a măsura absorbţia glucozei de către ţesut sub concentraţii de glucoză în stare stabilă. În aceste condiţii de potrivire, activitatea periferică a articolului de test şi comparatorilor este analizată din punctul de vedere al absorbţie de glucoză în muşchiul soleus şi supresia de acizi graşi liberi din plasmă (FFA). Toate datele sunt analizate utilizând o analiză unidirecţională a varianţei cu testul post-hoc al lui Dunnett, utilizând grupul de insulină lispro ca comparator de control.

Dozele bolus şi de perfuzie din exemplul 1 au condus la concentraţia de echilibru în plasmă de 274 ± 57 nM în decursul unui experiment de acumulare. Aşa cum se arată în Tabelul 5, ambele grupuri de animale au obţinut GIR comparabile în timpul fazei de acumulare a experimentului. Media glucozei din sânge a grupului din exemplul 1 este puţin mai ridicată decât cea a grupului de insulină lispro. Ambele grupuri au rate EGP de bază şi cumulată, similare (Tabelul 5). Mai mult, procentajul de modificare faţă de EGP de bază în grupul din exemplul 1 este comparabil cu cel al grupului de control de insulină lispro (Tabelul 5). Pentru a evalua activitatea periferică în condiţii de acumulare echivalente, sunt măsurate supresia plasmei FFA şi absorbţia de glucoză în muşchi. În timp ce insulina lispro a condus la o reducere în nivelurile FFA de plasmă în decursul experimentului de acumulare, Exemplul 1 nu a făcut acest lucru.(Tabelul 5). În plus, perfuzia din exemplul 1 a condus la o scădere cu 33% în absorbţia de glucoză în muşchiul soleus în comparaţie cu insulina lispro (Tabelul 5). Colectiv, aceste date au indicat că Exemplul 1 afişează activitate periferică redusă în comparaţie cu insulina lispro.

Tabelul 5:

Insulină lispro Exemplul 1 Glucoza în sânge (mg/dL) 106,3 ± 2,2 111,8 ± 1,2* GIR (mg/kg/min) 4,71 ± 0,46 4,72 ± 0,13 Rata EGP (mg/kg/min) de bază 5,062 ± 0,141 5,004 ± 0,093 acumulat 3,607 ± 0,241 3,509 ± 0,160 % Modificare faţă de EGP de bază -29,3 ± 3,5 -30,1 ± 2,5 % Supresia plasmei FFA faţă de bază -14,5 ± 4,1 9,9 ± 2,4* Rg (µmol/100mg/min) 11,34 ± 1,73 7,66 ± 1,38

Valorile sunt afişate ca medie ± SEM a 13 animale pentru insulina lispro şi 17 animale pentru Exemplul 1. Rg = indice metabolic al glucozei. Analiza statistică a fost completată de ANOVA unidirecţională urmată de testul post-hoc al lui Dunnett. * = diferenţe semnificative faţă de insulina lispro (p<0,05).

Eficacitatea in vivo la maimuţa cynomolguss

Parametrii farmacocinetici (PK) din exemplul 1 sunt evaluaţi după o singură doză intravenoasă de 1,5 nmol/kg şi o singură doză subcutanată de 3 nmol/kg la maimuţa cynomolguss. Mostrele de plasmă pentru analiza PK sunt colectate de la trei animale pe grup/cale, în decursul a 3 săptămâni. Două teste sunt utilizate pentru analiza PK: receptorul pentru insulină ELISA şi IgG Fc totală ELISA. Receptorul pentru insulină ELISA utilizează receptorul uman pentru insulină (R&D Systems 1544-IR/CF) ca captură. Receptorul uman pentru insulină este ataşat la o placă Immunlon 4 HBX de anticorpul anti-HisTag de şoarece (Novagen 70796). Curba standard şi mostrele din Exemplul 1 sunt diluate în 100% plasmă de maimuţă cynomolgus (anticoagulantul a fost K3 EDTA) şi detectate de peroxidaza din hrean lgG Fc anti-umană de şoarece (SouthernBiotech 9040-05). lgG totală ELISA utilizează IgG2 anti-uman (Abcam ab1933) ca reagent de captură. Exemplul 1 este diluat în 100% plasmă de maimuţă cynomolgus şi anticorpul de detecţie este acelaşi ca la receptorul pentru insulină ELISA. Rezultatele ambelor teste sunt prezentate în Tabelul 6, şi parametrii PK asociaţi sunt prezentaţi în Tabelul 7. Exemplul 1 prezintă biodisponibilitatea completă la maimuţe, şi testul de insulină activă şi testul de Fc total, care au dat rezultate similare.

Tabelul 6. PK din Exemplul 1 la maimuţele cynomolguss normale.

Timp (ore) Concentraţie ± SD (ng/mL) Receptor pentru insulină ELISA Fc total ELISA IV SC IV SC 1,5 nmol/kg 3,0 nmol/kg 1,5 nmol/kg 3,0 nmol/kg 0,083 1213 ± 212 NA 2190 ± 1369 NA 1 1172 ± 182 <43,75 ± NC 1708 ± 1219 <43,75 ± NC 3 863 ± 114 87 ± 25 798 ± NC 92 ± 22 6 726 ± 119 272 ± 31 688 ± 96 209 ± 116 12 576 ± 88 579 ± 78 457 ± 178 409 ± 145 24 422 ± 67 788 ± 69 332 ± 95 685 ± 359 48 299 ± 39 805 ± 55 260 ± 19 802 ± 64 72 219 ± 42 651 ± 83 199 ± 34 770 ± 83 96 173 ± 26 544 ± 89 159 ± 25 703 ± 390 120 146 ± 28 452 ± 55 152 ± 27 574 ± 160 168 83 ± 13 289 ± 54 126 ± NC 395 ± 70 216 48 ± NC 183 ± 44 99 ± NC 208 ± 123 240 <43,75 ± NC 145 ± 25 80 ± NC 242 ± NC 336 <43,75 ± NC 63 ± NC 47 ± NC NC 504 <43,75 ± NC <43,75 ± NC <43,75 ± NC <43,75 ± NC

Datele reprezintă media şi deviaţia standard de la n=3. Abrevieri: IV = intravenoasă; SD = deviaţie standard; NC = necalculat

Tabelul 7. Parametrii PK derivaţi din analiza non-compartimentală a datelor din Tabelul 6.

Receptor pentru insulină ELISA Fc total ELISA IV SC IV SC Doză (nmol/kg) 1,5 3,0 1,5 3,0 AUC0-inf(µg*ore/mL) 51,1 ± 6,4 127 ± 7 62,7 ± 5,8 171 ± 17 Cmax (µg/mL) 1,22 ± 0,22 0,82 ± 0,06 2,24 ± 1,38 0,90 ± 0,21 Tmax (ore) 0 48 ± 24 0 64 ± 28 CL sau CL/F (mL/ore/kg) 1,99 ± 0,24 1,59 ± 0,09 1,61 ± 0,15 1,19 ± 0,11 T1/2 (ore) 61 ± 9 70 ± 2 127 ± 18 148 ± 53 Vss (mL/kg) 164 ± 31 NA 256 ± 47 NA %F NA 125 NA 136

Datele reprezintă media şi deviaţia standard de la n=3. Abrevieri: AUC0-inf- aria de sub curba de la 0 la infinit, Cmax- concentraţie maximă (pentru administrare IV Cmax este concentraţia extrapolată la momentul 0), Tmax - timp la concentraţie maximă, CL - eliberare, F - biodisponibilitate, t1/2 - perioadă de înjumătăţire, Vss - volum de distribuţie în stare de echilibru, NA - neaplicabil.

Stabilitate

Formularea de 65 mg/mL neconservată din exemplul 1

Exemplul 1 este formulat la 65 mg/mL în 10 mM citrat, 46,4 mg/mL manitol, 0,02% polisorbat 80, pH 6,5 şi depozitat la 30°C. Mostrele sunt analizate pentru procentajul de masă moleculară mare prin cromatografie de excludere dimensională (SEC) la 0, 2, şi 4 săptămâni prin injectarea a 1 µL de mostră de 65 mg/mL. SEC analitică este efectuată pe un sistem Agilent 1100 echipat cu o coloană TSKgel SuperSW3000 (Tosoh Bioscience) şi 50 mM fosfat de sodiu, 300 mM NaCl, pH 7,0 faza mobilă curgând la 0,4 mL/min timp de 15 minute. Maximele sunt detectate la o absorbanţă de 280 nm şi cromatogramele sunt analizate utilizând software-ul ChemStation. Procentajul de masă moleculară mare la momentul zero este 1,13%, după două săptămâni este 1,68%, şi după patru săptămâni este 1,74%. Aceste rezultate susţin stabilitatea din exemplul 1 la concentraţia de 65 mg/mL cu creşterea minimă a agregatului solubil după 4 săptămâni la 30°C.

Formulări de 1 mg/mL conservate şi neconservate din exemplele 1 şi 3

Exemplele 1 şi 3 sunt formulate la 1 mg/mL în 10 mM citrat, pH 6,5 în prezenţa sau absenţa a 30 mM m-Cresol şi depozitate la 30°C. Mostrele sunt analizate pentru procentajul de masă moleculară mare prin cromatografie de excludere dimensională (SEC) la momentul zero şi la 2 săptămâni prin injectarea a 10 µL de mostră de 1 mg/mL. SEC analitică este efectuată pe un sistem Agilent 1100 echipat cu o coloană TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience) şi PBS + 350 mM NaCl, pH 7,4 fază mobilă curgând la 0,5 mL/min timp de 35 minute sau 45 minute pentru mostre în absenţa sau respectiv prezenţa de m-cresol. Maximele sunt detectate la o absorbanţă de 214 nm şi cromatogramele sunt analizate utilizând software-ul ChemStation. Pentru exemplul 3, fără şi cu m-cresol, procentajul de masă moleculară mare la momentul zero este 0,2% şi respectiv 3,06%. Procentajul de masă moleculară mare la 2 săptămâni fără şi cu m-cresol a fost 0,2% şi respectiv 1,73%. Aceste rezultate arată o creştere imediată a agregatului solubil după adăugarea de m-cresol pentru exemplul 3 la momentul zero. Pentru exemplul 1, în absenţa şi prezenţa de m-cresol, procentajul de masă moleculară mare la momentul zero a fost 0,16% şi respectiv 0,15%. Procentajul de masă moleculară mare la 2 săptămâni în absenţa şi prezenţa de m-cresol a fost 0,18% şi respectiv 0,31%. Aceste rezultate demonstrează stabilitatea, în prezenţa conservantului, din exemplul 1, care include modificarea aminoacidului la poziţia 10 în analogul catenei A de insulină (X1 variabil în SEQ ID NO:2, Z3 în prima proteină de fuziune descrisă mai sus) la un reziduu T, faţă de exemplul 3, care include reziduul I nativ la acea poziţie, dar care altfel cuprinde aceeaşi secvenţă de aminoacizi a agonistului receptor pentru insulină ca în exemplul 1.

Secvenţe

SEO ID NO:1 - Analog al catenei B de insulină

XIX2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9 în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia că analogul catenei B de insulină să includă cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4, X5, X6, X7, X8, sau X9

SEQ ID NO:2 - Analog al catenei A de insulină

GIVEQCCTSX1 CSLX2QLENYCX3X4 X1 este T sau I; X2 este D, Y, Q sau E; X3 este G, N, S sau A; şi X4 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X3 este N, atunci X4 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N

SEQ ID NO:3 - Primul agent de legătură peptidic

XIGX2GGGG, în care X1 este G sau este absent; şi X2 este G, S sau este absent

în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent; X10 este G sau este absent; X11 este G, S sau este absent; X12 este T sau I; X13 este D, Y, Q sau E; X14 este G, N, S sau A; şi X15 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că atunci cel puţin unul dintre X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 trebuie să fie un aminoacid diferit de cel găsit, respectiv, la poziţie B16, B25, B27, B28, B29 sau B30 ale catenei B a unei molecule de insulină umană, şi în plus cu condiţia că dacă X14 este N, atunci X15 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N.

SEQ ID NO:5 - Agonist receptor pentru insulină

FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCG

SEQ ID NO:6 - Al doilea agent de legătură peptidic

GGGGX1GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6 în care X1 este Q sau E; X2 este Q sau E; X3 este Q sau E; X4 este G, E, Q sau este absent; X5 este G sau absent; şi X6 este G sau este absent

SEQ ID NO:7 - Al doilea agent de legătură peptidic

GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG

în care X1 este F, Q sau E; X2 este F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; şi X6 este K sau este absent

în care X1 este F, Q sau E; X2 F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; X6 este R, sau K; X7 este K sau este absent

SEQ ID NO:10 - Regiunea lgG Fc umană

în care X1 este F, Q sau E; X2 este F, Q sau E; X3 este V sau T; X4 este V sau T; X5 este N, D sau Q; şi X6 este K sau absent

în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia că atunci cel puţin unul dintre X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 este un aminoacid altul decât cel care este prezent, respectiv, la poziţiile B16, B25, B27, B28, B29 sau B30 ale unei catene B de insulină umană; X10 este G sau este absent; X11 este G, S sau este absent; X12 este T sau I; X13 este D, Y, Q sau E; X14 este G, N, S sau A; X15 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X14 este N, atunci X15 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N; X16 este Q sau E; X17 este Q sau E; X18 este Q sau E; X19 este G, E, Q sau este absent; X20 este G sau absent; X21 este G sau este absent; X22 este E sau P; X23 este E sau P; X24 este A sau V; X25 este G sau este absent; X26 este Q sau H; X27 este Y sau F; X28 este L sau V; X29 este S sau A; X30 este S sau P; X31 este A sau T; X32 este Q sau R; X33 este V sau M; X34 este R sau K; X35 este E sau Q; şi X36 este L sau P.

SEQ ID NO:13 - Catena A de insulină umană

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

SEQ ID NO:14 - Catena B de insulină umană

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT

SEQ ID NO:15 - Primul agent de legătură peptidic

GGSGGGG

SEQ ID NO:24 - Proteină de fuziune

SEQ ID NO:25 - GLP-1

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

LISTĂ DE SECVENŢE

<110> Eli Lilly şi Company

<120> PROTEINE DE FUZIUNE

<130> X20356

<150> 62/158079 <151> 2015-05-07

<160> 25

<170> Versiune Patentln 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (1)..(1)

<223> Xaa la poziţia 1 este Phe, Gln sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (2)..(2)

<223> Xaa la poziţia 2 este Val sau Gly

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (3)..(3)

<223> Xaa la poziţia 3 este Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (16)..(16)

<223> Xaa la poziţia 16 este Glu, Tyr, Gln sau His

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (25)..(25)

<223> Xaa la poziţia 25 este His sau Phe

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (27)..(27)

<223> Xaa la poziţia 27 este Gly, Thr, Ser, His, Val, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (28)..(28)

<223> Xaa la poziţia 28 este Gly, Glu, Pro, Lys, Asp, Ser, His, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (29)..(29)

<223> Xaa la poziţia 29 este Gly, Glu, Lys, Pro, Gln, Asp, His, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (30)..(30)

<223> Xaa la poziţia 30 este Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, sau este absent

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (10)..(10)

<223> Xaa la poziţia 10 este Thr sau Ile

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (14) .. (14)

<223> Xaa la poziţia 14 este Asp, Tyr, Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (21) .. (21)

<223> Xaa la poziţia 21 este Gly, Asn, Ser, sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (22)..(22)

<223> Xaa la poziţia 22 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (1)..(1)

<223> Xaa la poziţia 1 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (3)..(3)

<223> Xaa la poziţia 3 este Gly, Ser, sau este absent

<400> 3

<210> 4

<211> 59

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (1)..(1)

<223> Xaa la poziţia 1 este Phe, Gln, sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (2)..(2)

<223> Xaa la poziţia 2 este Val sau Gly

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.<222> (3)..(3)

<223> Xaa la poziţia 3 este Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (16)..(16)

<223> Xaa la poziţia 16 este Glu, Tyr, Gln, sau His

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (25)..(25)

<223> Xaa la poziţia 25 este His sau Phe

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (27)..(27)

<223> Xaa la poziţia 27 este Gly, Thr, Ser, His, Val, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (28)..(28)

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (29)..(29)

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (30)..(30)

<223> Xaa la poziţia 30 este Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (31) .. (31)

<223> Xaa la poziţia 31 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (33)..(33)

<223> Xaa la poziţia 33 este Gly, Ser, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (47)..(47)

<223> Xaa la poziţia 47 este Thr sau Ile

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (51) .. (51)

<223> Xaa la poziţia 51 este Asp, Tyr, Gln, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (58)..(58)

<223> Xaa la poziţia 58 este Gly, Asn, Ser, sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (59)..(59)

<223> Xaa la poziţia 59 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent

<400> 4

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (5)..(5)

<223> Xaa la poziţia 5 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (10) .. (10)

<223> Xaa la poziţia 10 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (15) .. (15)

<223> Xaa la poziţia 15 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (20)..(20)

<223> Xaa la poziţia 20 este Gly, Glu, Gln, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (21) .. (21)

<223> Xaa la poziţia 21 este Gly sau absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (22)..(22)

<223> Xaa la poziţia 21 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (22)..(22)

<223> Xaa la poziţia 22 este Gly sau este absent

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 7

<210> 8

<211> 222

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (16)..(16)

<223> Xaa la poziţia 16 este Phe, Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (18) .. (18)

<223> Xaa la poziţia 18 este Phe, Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (37)..(37)

<223> Xaa la poziţia 37 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (39)..(39)

<223> Xaa la poziţia 39 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (72)..(72)

<223> Xaa la poziţia 72 este Asn, Asp sau Gln

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (222) .. (222)

<223> Xaa la poziţia 222 este Lys sau este absent

<400> 8

<210> 9

<211> 223

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (17) .. (17)

<223> Xaa la poziţia 17 este Phe, Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (19) .. (19)

<223> Xaa la poziţia 19 este Phe, Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (38)..(38)

<223> Xaa la poziţia 38 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (40)..(40)

<223> Xaa la poziţia 40 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (73)..(73)

<223> Xaa la poziţia 73 este Asn, Asp sau Gln

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (185) .. (185)

<223> Xaa la poziţia 185 este Arg sau Lys

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (223) .. (223)

<223> Xaa la poziţia 223 este Lys sau este absent

<400> 9

<210> 10

<211> 222

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (16)..(16)

<223> Xaa la poziţia 16 este Phe, Gln, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (18) .. (18)

<223> Xaa la poziţia 18 este Phe, Gln, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (37)..(37)

<223> Xaa la poziţia 37 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (39)..(39)

<223> Xaa la poziţia 39 este Val sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (72)..(72)

<223> Xaa la poziţia 72 este Asn, Asp, sau Gln

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (222) .. (222)

<223> Xaa la poziţia 222 este Lys sau este absent

<400> 10

<210> 11

<211> 303

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (1)..(1)

<223> Xaa la poziţia 1 este Phe, Gln, sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (2)..(2)

<223> Xaa la poziţia 2 este Val sau Gly

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (3)..(3)

<223> Xaa la poziţia 3 este Asn, Lys, Asp, Gly, Gln, Ala, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (16)..(16)

<223> Xaa la poziţia 16 este Glu, Tyr, Gln, sau His

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (25)..(25)

<223> Xaa la poziţia 25 este His sau Phe

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (27)..(27)

<223> Xaa la poziţia 27 este Gly, Thr, Ser, His, Val, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (28)..(28)

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (29)..(29)

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (30)..(30)

<223> Xaa la poziţia 30 este Gly, Thr, Ser, Glu, Lys, Ala, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (31) .. (31)

<223> Xaa la poziţia 31 este Gly, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (33)..(33)

<223> Xaa la poziţia 33 este Gly, Ser, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (47)..(47)

<223> Xaa la poziţia 47 este Thr sau Ile

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (51) .. (51)

<223> Xaa la poziţia 51 este Asp, Tyr, Gln, sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (58)..(58)

<223> Xaa la poziţia 58 este Gly, Asn, Ser sau Ala

<220>

<221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (59)..(59)

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (64)..(64)

<223> Xaa la poziţia 64 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (69)..(69)

<223> Xaa la poziţia 69 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (74)..(74)

<223> Xaa la poziţia 74 este Gln sau Glu

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (79)..(79)

<223> Xaa la poziţia 79 este Gly, Glu, Gln, sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (80)..(80)

<223> Xaa la poziţia 80 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (81)..(81)

<223> Xaa la poziţia 81 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (82)..(82)

<223> Xaa la poziţia 82 este Glu sau Pro

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (90)..(90)

<223> Xaa la poziţia 90 este Glu sau Pro

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (91)..(91)

<223> Xaa la poziţia 91 este Ala şi Val

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (94)..(94)

<223> Xaa la poziţia 94 este Gly sau este absent

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (125)..(125)

<223> Xaa la poziţia 125 este Gln sau His

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (157)..(157)

<223> Xaa la poziţia 157 este Tyr sau Phe

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (166)..(166)

<223> Xaa la poziţia 166 este Leu sau Val

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (187)..(187)

<223> Xaa la poziţia 187 este Ser sau Ala

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (188)..(188)

<223> Xaa la poziţia 188 este Ser sau Pro

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (196)..(196)

<223> Xaa la poziţia 196 este Ala sau Thr

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (212)..(212)

<223> Xaa la poziţia 212 este Gln sau Arg

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (254)..(254)

<223> Xaa la poziţia 254 este Val sau Met

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (266)..(266)

<223> Xaa la poziţia 266 este Arg sau Lys

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (276)..(276)

<223> Xaa la poziţia 276 este Glu sau Gln

<220> <221> CARACTERISTICĂ_DIV.

<222> (302)..(302)

<223> Xaa la poziţia 302 este Leu sau Pro

<400> 11

<210> 12

<211> 299

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 12

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 15

<210> 16

<211> 300

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 16

<210> 17

<211> 302

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 17

<210> 18

<211> 297

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 18

<210> 19

<211> 302

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 19

<210> 20

<211> 302

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 20

<210> 21

<211> 297

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 21

<210> 22

<211> 299

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 22

<210> 23

<211> 298<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 23

<210> 24

<211> 299

<212> PRT

<213> Secvenţă artificială

<220> <223> Construcţie sintetică

<400> 24

<210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Claims

1. O proteină de fuziune care cuprinde:

a) un agonist receptor pentru insulină având formula generală Z1-Z2-Z3, în care: i) Z1 este un analog al catenei B de insulină, cuprinzând secvenţa de aminoacizi: X1X2X3QHLCGSHLVEALX4LVCGERGFX5YX6X7X8X9 în care X1 este F, Q sau A; X2 este V sau G; X3 este N, K, D, G, Q, A sau E; X4 este E, Y, Q, sau H; X5 este H sau F; X6 este G, T, S, H, V sau este absent; X7 este G, E, P, K, D, S, H sau este absent; X8 este G, E, K, P, Q, D, H sau este absent; X9 este G, T, S, E, K, A sau este absent, cu condiţia ca analogul catenei B de insulină să includă cel puţin o modificare din secvenţa de aminoacizi a catenei B a unei molecule de insulină umană la X4, X5, X6, X7, X8, sau X9 (SEQ ID NO:1); ii) Z2 este un prim agent de legătură peptidic care cuprinde 5 până la 10 aminoacizi, în care cel puţin 5 din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G; şi iii) Z3 este un analog al catenei A de insulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi: GIVEQCCTSX1CSLX2QLENYCX3X4 în care X1 este T sau I; X2 este D, Y, Q sau E; X3 este G, N, S sau A; şi X4 este orice aminoacid care apare natural, sau este absent, cu condiţia că dacă X3 este N, atunci X4 trebuie să fie un aminoacid altul decât G sau N (SEQ ID NO:2); b) un al doilea agent de legătură peptidic având între 10 şi 25 aminoacizi, în care cel puţin 50% din respectivii aminoacizi sunt reziduuri G; şi c) o regiune IgG Fc umană; în care reziduul C-terminal al agonistului receptor de insulină este direct fuzionat la reziduul N-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic, şi reziduul C-terminal al celui de al doilea agent de legătură peptidic este direct fuzionat la reziduul N-terminal al regiunii IgG Fc umane.

2. Proteina de fuziune conform revendicării 1, în care: analogul catenei B de insulină include cel puţin o modificare faţă de secvenţa de aminoacizi a catenei B de insulină umană la X4 sau X5 din SEQ ID NO:1; şi analogul catenei A de insulină include cel puţin o modificare faţă de secvenţa de aminoacizi a catenei A de insulină umană la X1 sau X2 din SEQ ID NO:2.

3. Proteina de fuziune din oricare dintre revendicările 1 sau 2, în care: analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care: X1 este F; X2 este V; X3 este N sau D; X4 este E; X5 este H; şi analogul catenei A de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:2, în care: X1 este I sau T; X2 este D; X3 este G; şi X4 este absent.

4. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-3, în care analogul catenei B de insulină cuprinde secvenţa din SEQ ID NO:1, în care X6-X9 sunt fiecare G.

5. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-4, în care primul agent de legătură peptidic cuprinde următoarea secvenţă de aminoacizi: X1 GX2GGGG în care X1 este G sau este absent; şi X2 este G, S sau este absent (SEQ ID NO:3).

6. Proteina de fuziune conform revendicării 5, în care X1 şi X2 din SEQ ID NO:3 sunt G şi respectiv S.

7. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-6, în care agonistul receptor de insulină are următoarea secvenţă de aminoacizi:

8. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-7, în care al doilea agent de legătură peptidic cuprinde o peptidă având secvenţa [GGGGX]n în care X este Q, E sau S; şi în care n este 2-5.

9. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-8, în care al doilea agent de legătură peptidic cuprinde următoarea secvenţă de aminoacizi: GGGGX1 GGGGX2GGGGX3GGGGX4X5X6 X1 este Q sau E X2 este Q sau E X3 este Q sau E X4 este G, E, Q sau este absent X5 este G sau absent; şi X6 este G sau este absent (SEQ ID NO:6).

10. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-9, în care al doilea agent de legătură peptidic are următoarea secvenţă de aminoacizi: GGGGQGGGGQGGGGQGGGGG (SEQ ID NO:7).

11. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-10, în care regiunea IgG Fc umană este o regiune Fc de la un IgG1, IgG2 sau IgG4.

12. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-11, în care regiunea IgG Fc umană cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul care constă din SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 şi SEQ ID NO:10.

13. O proteină de fuziune care are secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO:12.

14. Un homodimer a două proteine de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13.

15. O compoziţie farmaceutică care cuprinde fie o proteină de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13, fie un homodimer conform revendicării 14, şi cel puţin un excipient.

16. Compoziţia farmaceutică în conformitate cu revendicarea 15, care cuprinde în plus citrat, acid citric, polisorbat 80, şi manitol.

17. Compoziţia farmaceutică în conformitate cu revendicarea 15 sau revendicarea 16 în care pH-ul variază de la aproximativ 6,0 până la aproximativ 6,75.

18. Compoziţia farmaceutică conform oricăreia dintre revendicările 15 până la 17 cuprinzând în plus dulaglutidă.

19. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13 pentru utilizare în terapie.

20. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13 pentru utilizare în tratamentul diabetului zaharat.

21. Proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13 pentru utilizare simultană, separată sau în combinaţie secvenţială cu dulaglutide, în tratamentul diabetului zaharat.

22. Homodimerul conform revendicării 14 pentru utilizare simultană, separată sau în combinaţie secvenţială cu dulaglutide, în tratamentul diabetului zaharat.

23. O polinucleotidă care codifică proteina de fuziune conform oricăreia dintre revendicările 1-13.