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KR20140015208A - 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제 - Google Patents

지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제 Download PDF

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KR20140015208A
KR20140015208A KR1020130087917A KR20130087917A KR20140015208A KR 20140015208 A KR20140015208 A KR 20140015208A KR 1020130087917 A KR1020130087917 A KR 1020130087917A KR 20130087917 A KR20130087917 A KR 20130087917A KR 20140015208 A KR20140015208 A KR 20140015208A
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KR
South Korea
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insulin
liquid formulation
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김현욱
이미경
이종수
배성민
권세창
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한미약품 주식회사
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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린, 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제 및 상기 액상 제제의 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 액상 제제는 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없이 고농도의 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 나타낸다.

Description

지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제 {A liquid formulation of long acting insulin and insulinotropic peptide}
본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린, 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제 및 상기 액상 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
인슐린은 췌장의 베타세포에서 분비되는 펩타이드로서 체내의 혈당을 조절하는데 매우 중요한 역할을 담당하는 물질이다. 이러한 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않아 혈중 포도당의 농도가 높아지는 대사질환을 당뇨병이라 한다. 인슐린이 제대로 분비되지 않거나 분비된 인슐린이 체내에서 제대로 작용하지 못하여 체내의 혈당이 조절되지 못하고 상승하는 경우를 제 2형 당뇨병이라고 하며, 췌장에서 인슐린을 분비하지 못하여 혈당이 상승하는 경우를 제 1형 당뇨병이라고 한다. 제 2형 당뇨병의 경우 화학물질을 주성분으로 하는 경구용 혈당 강하제를 이용하여 치료를 하며 일부 환자에는 인슐린을 사용하여 치료하기도 한다. 반면 제 1형 당뇨병의 경우에는 인슐린의 투여가 필수적으로 요구된다.
현재 많이 사용되고 있는 인슐린 치료법은 식사 전, 후에 주사를 통하여 인슐린을 투여하는 방법이다. 인슐린은 현재 주사약으로 나와 있으며, 피하주사로 투여하는 것을 원칙으로 하고 있고, 작용 시간에 따라 투여방법이 다르다. 인슐린 주사 투여는 먹는 약에 비해서 혈당 강하 효과가 더 빠르게 나타나고, 먹는 약을 사용할 수 없는 환경에서도 안정하게 사용할 수 있으며, 용량의 제한도 없지만, 하루에 3번씩 지속적으로 사용되어야 하기 때문에 주사침에 대한 거부감, 투여방법의 어려움, 저혈당 증상, 장기적인 인슐린 투여에 의해 발생하는 체중증가 현상 등이 단점으로 꼽히고 있다. 체중증가 현상은 심장혈관 질환의 위험도를 높이며, 혈당 조절기능을 저하시키는 부작용으로 이어질 수 있다. 한편, 인슐린 펩타이드 약물이 체내로 흡수된 이후, 약물의 혈중 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔으며, 그 예로 란투스 (Lantus, Insulin glargine; Sanofi Aventis)와 레버미어 (Levemir, Insulin detemir; Novo Nordisk) 등 지속성 인슐린이 개발되어 시판 및 상용화되었다. 상기 지속성 약물들은 인슐린 NPH(Neutral Protamine Hagedorn)와 다르게 수면상태의 저혈당 위험도를 낮추었고, 특히 레버미어의 경우 체중증가 현상을 완화시켰다. 하지만 여전히 하루 1회에서 2회의 투여용법이 단점으로 여겨지고 있다.
한편 인슐린 분비 펩타이드의 일종인 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon like peptide 1, GLP-1)은 회장과 대장의 L-세포에서 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬이다. 글루카곤 유사 펩타이드-1의 주요한 작용은 인슐린 분비를 증가시키며, 포도당의 농도에 따른 인슐린 분비(Glucose dependent secretion)가 이루어져 저혈당이 발생하지 않는다. 이런 특징으로 제 2형 당뇨병의 치료방법으로 적용되나, 혈중 반감기가 2분 내외로 매우 짧기 때문에 약제로 개발하는데 큰 제약을 갖고 있다. 이에 따라 개발되어 시판되는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 작용제(아고니스트)로서는 글리아 몬스터 도마뱀(Glia monster)의 침샘으로부터 정제된 글루카곤 유사 펩타이드-1 유사체인 엑센딘(Exendin)-4가 있다. 이는 DPP-IV(Dipeptidyl peptidase-4)에 대한 저항성과 함께 글루카곤 유사 펩타이드-1 보다 높은 생리 활성을 가지며, 따라서 체내 반감기가 2 ~ 4시간으로 글루카곤 유사 펩타이드-1에 비해 길어진 체내 반감기를 가진다 (미국등록특허 US 5,424,286). 그러나 DPP-IV의 저항성을 증가시키는 방법만으로는 충분한 생리활성의 지속기간을 기대할 수 없는데, 예를 들어 현재 시판되고 있는 엑센딘-4(엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하며, 투여에 따른 구토유발 및 메스꺼움 현상이 환자에게 큰 부담으로 작용되는 단점이 여전히 남아있다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 단백질 약물의 활성을 유지하고 생체 내 안정성 향상을 동시에 달성하는 기술로서, 본 발명자들은 종래 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 상호 공유결합에 의해 연결시킨 지속형 단백질 결합체를 제안한 바 있고(대한민국 등록특허 10-0725315), 특히 지속형 인슐린 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체 각각의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인한바 있다 (대한민국 등록특허 10-1058290 및 공개특허 10-2011-0134210). 그러나 여전히 안정적인 혈당 변화를 가져오는 양의 인슐린 또는 엑센딘-4의 투여 시, 체중 증가 현상이 나타나거나 구토 및 메스꺼움 현상이 나타나는 문제점이 있어, 약물의 투여량과 횟수를 줄이면서도 당뇨병 치료효과가 우수한 치료방법의 개발이 필요하다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물을 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 보관할 수 있는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정한 액상 제제를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 안정화제를 이용하여 상기 병용물의 안정성을 증대시킴으로써, 경제적이고 안정한 액상 제형을 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 펩타이드인 인슐린, 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 액상 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성 펩타이드인 인슐린, 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제를 제공한다. 본 발명의 액상 제제는 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드가 병용 투여되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어, "복합체"는 "병용물"과 혼용된다.
상기 인슐린은 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체 형태로 액상 제제에 포함될 수 있다. 상기 인슐린분비 펩타이드는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 형태로 액상 제제에 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "지속형 인슐린 결합체"는 유도체, 변이체, 전구물질, 그리고 단편 등을 포함하는 생리활성 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 결합체로서, 천연형 인슐린에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미할 수 있다. 본 발명에서 용어, 지속형 인슐린 결합체는 인슐린이 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드 링커를 통하여 연결된 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 용어 "지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체"는 유도체, 변이체, 전구물질, 그리고 단편 등을 포함하는 생리활성 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 결합체로서, 천연형 인슐린분비 펩타이드에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 가진 결합체를 의미할 수 있다. 본 발명에서 용어, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 인슐린분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드 링커를 통하여 연결된 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체 또는 인슐린분비 펩타이드 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 인슐린 결합체 또는 인슐린분비 펩타이드 결합체는 천연형 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 생분해성 중합체가 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드에 결합된 결합체, 알부민이나 면역글로불린과 같은 지속성이 뛰어난 단백질이 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드에 결합된 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드에 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드를 포함할 수 있으나, 지속형 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드 결합체는 합성하여 제조한 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조한다. 이 때 이용되는 결합 방법으로, 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 인슐린 또는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린"은 체내의 혈당이 높을 때 췌장에서 분비되어 간, 근육, 지방 조직에서 당을 흡수하여 글리코겐으로 저장하며, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당을 조절하는 기능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 천연형 인슐린, 기초 인슐린(basal insulin), 인슐린 아고니스트(agonist), 전구물질(precursor), 유도체 (derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린"은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린 아미노산 서열은 아래와 같다:
알파 체인:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호 1)
베타 체인:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly- Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호 2)
본 발명에서 용어, "기초 인슐린(basal insulin)"은 정상적인 하루의 혈중 글루코스 변동을 조절하는 펩타이드로서, 그 예로 levemir, lantus 및 degludec 등이 있다. 본 발명에서 용어, "인슐린 아고니스트"는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다. 본 발명에서 용어, "인슐린 변이체"는, 인슐린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다. 본 발명에서 용어, "인슐린 유도체"는 천연형 인슐린과 비교 시 아미노산 서열에서 최소한 80% 이상 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 용어, "인슐린 단편"은 인슐린의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
인슐린 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)된 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
본 발명에서 사용한 인슐린은 재조합 방법을 통하여 생산될 수 있으며, Solid phase 합성법을 통하여 합성하는 방법으로도 생산 가능하다. 또한, 본 발명에서 사용된 인슐린은 비펩타이드성 중합체가 결합될 수 있고 이와 같은 비펩타이드성 중합체는 본 발명에서 링커로 사용될 수도 있다. 상기 비펩타이드성 중합체를 링커로 연결함으로서 인슐린의 활성을 유지시키면서, 안정성을 향상시킬 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 펩타이드를 링커도 적용이 가능하다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 1개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있다.
바람직하게는 상기 비펩타이드성 중합체는 인슐린 베타 체인의 N-말단에 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 인슐린은 비펩타이드성 중합체로 개질된 형태일 수 있다.
면역글로불린 단편을 이용한 지속형 인슐린 결합체의 개발 시, 저혈당 증상을 나타내지 않으면서 보다 긴 약물 지속시간을 나타내기 위하여 폴리에틸렌글리콜로 생리활성 폴리펩타이드를 수식할 경우 역가가 줄어드는 현상이 오히려 지속형 인슐린 결합체에 있어서는 특수하게 장점으로 사용되므로, 폴리에틸렌글리콜 수식된 인슐린을 비펩타이드성 중합체를 통하여 면역글로불린 Fc 영역과 결합시킬 수도 있다. 인슐린 개질에 사용할 수 있는 비펩타이드성 중합체의 종류는 상기에서 설명한 바와 같으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 상기 폴리에틸렌글리콜 수식된 인슐린에서 폴리에틸렌글리콜의 수식은, 폴리에틸렌글리콜이 인슐린의 알파 체인 N-말단 또는 베타 체인 특정 라이신 잔기에 선택적으로 결합한 것을 특징으로 한다. 상기 인슐린을 수식하는 폴리에틸렌글리콜은 바람직하게 말단에 알데히드 및 숙신 반응기를 포함하고, 더욱 바람직하게 숙신 반응기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜이다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체의 자세한 제조방법 및 효력은 대한민국 공개특허 10-2011-0134210, 10-2011-0134209, 10-2011-0111267등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌들에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 인슐린 결합체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 모노 페길 화(mono-PEGylation)한 다음, 이를 인슐린의 베타 체인의 1번 페닐알라닌에 수식시켜 지속형 인슐린 결합체를 제조하는 방법을 제공한 바 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 분비 펩타이드"는 인슐린 분비 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 또는 발현을 자극할 수 있다. 상기 인슐린 분비 펩타이드는 바람직하게는 GLP(Glucagon like 펩타이드)-1, GLP-2, 엑센딘-3(Exendin-3) 또는 엑센딘-4(Exendin-4)이나 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 분비 펩타이드에는 천연형 인슐린 분비 펩타이드 뿐만 아니라, 그의 전구물질(precursors), 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments) 및 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 유도체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 아미노(또는 아민) 그룹이 제거된 유도체(Desamino-histidyl 유도체), 아미노 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 유도체(beta-hydroxy imidazopropionyl-유도체), 아미노 그룹에 2개의 메틸(methyl) 잔기로 수식된 유도체(Dimethyl-histidyl-유도체), 아미노 말단의 아미노 그룹을 카복실 그룹으로 치환한 유도체(betacarboxyimidazopropionyl-유도체) 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 삭제하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨두어 아미노 그룹의 양전하(positive charge)를 제거한 유도체(Imidazoacetyl-유도체) 등이 포함될 수 있으며, 또한 기타 다른 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변이 유도체가 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 인슐린분비 펩타이드 유도체는 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기를 화학적으로 변이시킨 유도체이며, 더욱 바람직하게는 엑센딘-4의 아미노 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 존재하는 알파 아미노 그룹 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 엑센딘-4 유도체이며, 더욱더 바람직하게는 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(Desamino-histidylexendin-4, DA-엑센딘-4), 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4), 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4), 2개의 메틸 잔기로 수식한 디메틸-히스티딜-엑센딘-4(Dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4), 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(Imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4)이다.
GLP-1은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩타이드로 분해되는데, 글루카곤, GLP-1, GLP-2이다. 여기서 GLP-1 은 GLP-1(1-37)을 의미하며 인슐린 분비기능이 없는 형태이고, GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱 되어 활성형 GLP-1(7-37)이 된다. GLP-1(7-37) 아미노산 서열은 아래와 같다:
GLP-1(7-37):
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (서열번호 3)
본 발명에서 용어, "GLP-1 유도체"는, GLP-1과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 화학적으로 수식된 형태일 수도 있고, 인슐린 분비 기능도 최소한 동등 또는 그 이상을 나타내는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 용어, "GLP-1 단편"은, 천연형 GLP-1의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능하다. 본 발명에서 용어, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인슐린분비 펩타이드에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체는 천연형 인슐린분비 펩타이드의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 생분해성 중합체가 인슐린에 결합된 결합체, 알부민이나 면역글로불린 및 그 단편과 같이 지속성이 뛰어난 단백질이 인슐린에 결합된 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 인슐린분비 펩타이드에 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 인슐린분비 펩타이드를 포함할 수 있으나, 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
본 발명에서 용어, "GLP-1 변이체"는, 천연형 GLP-1과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘-3와 엑센딘-4는, GLP-1과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39개 아미노산으로 이루어진 인슐린 분비 펩타이드이며, 엑센딘-3와 엑센딘-4의 아미노산서열은 아래와 같다:
엑센딘-3:
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 4)
엑센딘-4:
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 5)
엑센딘 아고니스트는 엑센딘의 구조와 상관없이 엑센딘의 생체 내 수용체에 결합하여 엑센딘과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 엑센딘 유도체는, 천연형 엑센딘과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예: alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예: deamination) 또는 수식(예: N-methylation)된 형태일수 있고, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
엑센딘 단편은, 천연형 엑센딘의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 엑센딘 단편은 인슐린 분비기능을 보유한다.
엑센딘 변이체는, 천연형 엑센딘과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 상기 엑센딘 변이체는 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산인 라이신이 세린(serine) 또는 알지닌(arginine)으로 치환된 펩타이드를 포함한다. 엑센딘 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)된 인슐린 분비 펩타이드도 포함된다. 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩타이드와 변형된 인슐린 분비 펩타이드는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린 분비 펩타이드를 포함한 대부분의 천연형 펩타이드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
본 발명에서 사용된 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 인슐린 분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc와 같은 면역글로불린 단편을 비펩타이드성 링커 또는 유전자 재조합 기술을 이용하여 petide linker를 통하여 연결된 형태를 의미한다. 상기 비펩타이드성 링커에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 지속형 인슐린 결합체와 같이 면역글로불린 단편을 이용한 결합체로서, 인슐린 합성 및 분비 촉진, 식욕억제, 체중감소, 베타 세포 혈중 글루코스 민감도 증가, 베타세포 증식(beta cell proliferation) 촉진, 위내 정체(gastric emptying) 지연, 글루카곤 억제와 같은 기존의 인슐린 분비 펩타이드의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인슐린 분비 펩타이드의 혈중 반감기 및 이로 인한 상기 펩타이드의 생체 내 효력 지속 효과를 획기적으로 증가하게 하므로, 당뇨 및 비만의 치료에 유용하다.
본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 제조를 위해 대한민국 등록특허 10-0725315, 공개특허 10-2009-0008151, 등록특허 10-1058290 등이 참고문헌으로서 본 발명에 해당된다. 당업자들은 상기의 문헌들에 의해 본 발명에 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4)의 라이신(lysine, Lys)에 PEG로 수식시켰으며, PEG 수식된 엑센딘-4를 면역글로불린 Fc에 연결하여 지속형 엑센딘-4 결합체를 제조하는 방법을 확인한 바 있다.
본 발명에서 사용되는 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드는 캐리어 물질과 비펩타이드성 중합체를 링커로 사용하여 연결된다. 본 발명에 사용가능한 캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 PEG로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명의 상기 지속성 인슐린 결합체 및 지속성 인슐린분비 펩타이드 결합체는 각각 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역과 비펩티이드성 링커를 통해 연결된 형태로서, 지속성 및 안전성을 나타낸다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc는 면역글로불린 단편과 혼용하여 사용될 수 있다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열 뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능(effector function)을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 WO 97/34631, 국제특허공개 WO 96/32478 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화 되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 복합체(병용물)의 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린 결합체의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이고, 바람직하게는 10 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이다. 본 발명에서 사용되는 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 농도는 0.1 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이고, 바람직하게는 0.5 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖이다. 본 발명의 상기 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 결합체 고농도 액상 제제는 기존의 저농도 액상 제제에 비해 단위 제형 당 인슐린 결합체가 고농도로 존재하여 안정적으로 생체 내로 인슐린을 공급할 수 있으며 기존의 액상 제제와 달리 고농도의 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드가 병용으로 제공될 수 있도록 복합체를 이루며 이를 침전없이 안정적으로 저장할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 용어 "안정화제"는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린분비 펩타이드가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미하는데, "안정화"는 일정한 시간 동안 특정 저장 조건하에서 활성 성분의 손실이 특정량 미만, 일반적으로 10% 미만임을 의미한다. 보통, 5±3℃에서 2년, 25±2℃에서 6개월 또는 40±2℃에서 1 내지 2주 동안 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린분비 펩타이드가 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 92-95% 정도의 잔존율을 유지하는 경우 이러한 제제는 안정한 것으로 이해된다. 지속형 인슐린 결합체 또는 지속형 인슐린분비 펩타이드와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서 뿐만 아니라, 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린분비 펩타이드에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 저장 동안 지속형 인슐린 결합체 또는 지속형 인슐린분비 펩타이드가 10% 정도의 손실을 나타내는 것은 조성물 내에서 응집체나 단편 등을 야기하여 항원성 화합물로 전환되지 않는 한 실질적인 투여 시 허용할 만한 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 상기 안정화제는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물에 안정성을 부여하기 위해 완충용액, 당알코올, 등장화제로서의 염화나트륨 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하며, 추가적으로 메티오닌을 포함할 수 있다.
완충용액은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물이 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 한다. 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 나트륨 시트레이트/시트르산 (구연산 나트륨/구연산), 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약 상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 그러한 완충용액의 바람직한 예로는 구연산 완충용액(Citrate buffer), 아세트산 완충용액, 인산 완충용액(Phosphate buffer) 등을 들 수 있으며, 아세트산 나트륨 완충용액(Na-Acetate buffer) 또는 구연산 나트륨 완충용액 (Na-Citrate)이 바람직하다. 아세트산 나트륨 완충용액을 구성하는 아세트산염의 농도는 전체 용액 대비 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 이고, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 50mM이다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 5.0 내지 6.5 이다.
당알코올은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성을 증대시키는 역할을 하는데, 본 발명에 사용되는 당알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1 내지 20%(w/v), 더욱 바람직하게는 1 내지 15%(w/v)이다. 그러한 당알코올의 대표적인 예로는 만니톨, 소르비톨을 들 수 있으며, 바람직한 예로는, 만니톨을 들 수 있다.
등장화제는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체 병용물을 용액 상에서 체내에 투여할 때 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하며, 상기 병용물을 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 그러한 등장화제의 대표적인 예로는 수용성 무기염을 들 수 있으며, 그 예로 염화나트륨, 황산나트륨, 구연산나트륨을 들 수 있으며, 바람직한 예로는, 염화나트륨을 들 수 있다. 상기 등장화제는 제형에 포함된 성분들의 종류 및 양 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다. 이와 같은 등장화제의 농도는 전체 용액 대비 0.5 ㎎/㎖ 내지 30 ㎎/㎖일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
비이온 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착되거나 응집되는 것을 방지하여 준다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제 및 플록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들이 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용 될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 20이 바람직하다.
상기 비이온 계면활성제를 액상 제제에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 못한데, 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.2%(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.05%(w/v)로 포함된다.
본 발명의 안정화제에 포함되는 메티오닌은 용액 상태에서 단백질의 산화 반응 등에 의해 일어날 수 있는 불순물 생성을 억제시켜 대상 단백질을 더욱 안정화시키는 효과가 있다. 메티오닌의 농도는 전체 용액 대비 0.005 내지 0.1%(w/v)이며, 바람직하게는 0.01 내지 0.1%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제 존재 하에서, 등장화제로서의 염화나트륨을 포함시키는 경우 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 저장 안정성을 현저히 증가시킨다. 이는 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제와 등장화제로서의 염화나트륨의 동시 사용이 시너지 효과를 나타내어 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물에 특별한 안정성을 부여한다는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
또한, 본 발명의 상기 안정화제는 당류, 다가 알코올 또는 중성 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스 ,푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당알코올, 및 비이온 계면활성제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체 병용물에 안정성을 제공하는 본 발명에 따른 알부민-비함유 지속형 복합제 액상 제제는 바이러스 감염의 우려가 없을 뿐만 아니라, 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다.
또한, 본 발명의 액상 제제는 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드를 포함하고 있으므로 통상적인 인슐린 및 인슐린분지 펩타이드 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있으며, 고농도의 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체에 대해서도 우수한 안정성을 제공하는 제제이다.
바람직하게 본 발명의 액상 제제는 인슐린과 인슐린분비 펩타이드가 각각 폴리에틸렌 글리콜에 의해 면역글로불린 단편에 결합된 지속형 인슐린 결합체, 지속형 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하되, 상기 안정화제가 아세트산 완충용액, 만니톨, 폴리소르베이트 20 및 염화나트륨을 포함하는 액상 제제일 수 있다. 또한 추가적으로 메티오닌을 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 액상 제제의 제조방법을 제공한다.
인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드를 제조하는 단계 및 상기 단계에서 제조된 지속형 인슐린 및 인슐린분비 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 통하여 안정한 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체의 복합체인 액상 제제를 제조할 수 있다. 상기 안정화제에는 메티오닌이 추가로 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명의 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하면 상기 지속형 인슐린 결합체는 인슐린 수용체에, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체에 동시에 작용하여 각각의 투여시보다 혈중 당의 농도를 감소시키고, 안정적인 변화추이를 보인다. 또한 상기 결합체를 병용 투여하는 경우, 인슐린 단독 투여 시 나타날 수 있는 저혈당의 위험을 낮출 수 있으며, 체중을 감소시키는 효과가 있고, 인슐린 분비 펩타이드에 의해 전체 인슐린 투여량을 낮출 수 있다. 또한 엑센딘-4와 같은 인슐린 분비 펩타이드의 용량을 낮출 수 있어 엑센딘-4 단독 치료 시 나타날 수 있는 메스꺼움, 구토 등의 부작용을 낮출 수 있는 장점이 있다. 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 사용은 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여해야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 당뇨병의 치료에 큰 도움을 준다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하고 병용투여 방법을 이용하여 용량을 현저하게 감소시킬 수 있다.
지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 또한 바람직하게는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 하나의 용기에 보관된 후 동시 병용 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 병용 투여용 조성물인 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 하나의 용기에 포함된 당뇨병 치료용 키트의 형태일 수 있다. 이와 같은 키트는 약학적으로 허용 가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
STZ (Streptozotocin) 약물로 유도된 고혈당 마우스에 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여한 후, 혈당의 변화 추이를 관찰한 결과, 상기 결합체를 병용 투여한 경우, 그렇지 않은 경우보다 혈당의 변화가 안정적인 추이를 보인 것을 확인하였다. 또한, 제2 형 당뇨 모델 마우스에서 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 주1회씩 병용 투여한 경우, 투여 전후의 공복 혈당 차이를 비교한 결과 상기 결합체를 각각 투여한 경우에 비해 혈당 개선 효과가 우수하였으며, 인슐린 투여에 따른 체중증가 부작용도 나타나지 않아 인슐린에 의한 체중증가 부작용도 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환(metabolic disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 병용 투여함으로써, 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병을 방지하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 본 발명의 조성물의 병용투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류 뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떤 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 당뇨병에 걸릴 위험이 있거나 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 투여하는 단계는 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것에 의해 수행될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다.
지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 모두 포함하는 본 발명의 조성물은 투여 빈도를 줄이더라도 혈당을 우수하게 낮추면서 체중 증가의 부작용을 가지고 오지 않는바, 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 지속형 인슐린 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물은 우수한 당뇨병 치료 효능을 나타내며, 본 발명에 따른 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 액상 제제는 완충용액, 당알코올, 등장화제로서 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 안정화제를 포함하고 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아, 바이러스 감염의 우려가 없고, 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 제공한다. 특히, 상기 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 병용물에 우수한 안정화된 액상 제제를 제공한다. 이와 같은 본 발명의 액상 제제는 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내어 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 제제이다. 또한, 통상적인 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있다.
도 1은 표 3의 조성에 따른 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40에서 1주간 동안 침전 발생 결과를 육안으로 확인한 도이다.
도 2는 표 4의 조성에 따른 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40에서 4주간 보관 후, IE-HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 표 4의 조성에 따른 지속형 인슐린 결합체 및 인슐린분비 펩타이드 결합체의 40에서 4주간 보관 후, RP-HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 각 조성에서 단독제 대비 복합제의 단백침전 발생 유무를 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 지속형 인슐린 결합체의 안정성 평가
지속형 인슐린 결합체는 혈중 반감기 증가 및 생체 내 저혈당 증상을 나타내지 않는 방법으로 개발된 것으로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 인슐린을 공유 결합에 의해 부위 선택적으로 상호 연결시킨 인슐린 결합체가 혈중 반감기 및 저혈당 위험을 획기적으로 줄여준다.
이와 같은 지속형 인슐린 결합체의 안정성을 확인하기 위해 하기 표 1과 같은 조성으로 40℃에서 2주 동안 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법 (Ion Exchange Chromatography, IE-HPLC)을 이용해 분석하였다.
이때 pH, 완충용액의 종류 및 농도, 등장화제의 종류, 만니톨 (Mannitol)로 이루어진 당알코올의 농도, 계면활성제의 종류, 폴리소르베이트 20 (Polysorbate 20)으로 이루어진 계면활성제의 농도, 기타 첨가제의 유무, 메티오닌 (Methionine)과 염화나트륨의 병용 첨가 등을 주요 인자로 설정하여 비교하였다. 각각의 조성에서 지속형 인슐린 결합체의 농도는 61.1 ㎎/㎖로 제조하여 실험을 수행하였다.
표 1의 IE-HPLC(%)는 (Area %/Start Area %)로서, 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린 결합체의 잔존율을 나타낸다.
주요인자 IE-HPLC(%)
pH 5.0 ~ 5.4 단백 침전
5.6 87.9
6.0 88.1
6.5 81.9
7.0 70.4
완충용액 종류 아세트산 나트륨 91.5
구연산 나트륨 90.5
인산 나트륨 89.4
히스티딘 단백 침전
완충용액 농도 5mM 아세트산 나트륨 83.2
10mM 아세트산 나트륨 83.6
20mM 아세트산 나트륨 83.5
40mM 아세트산 나트륨 83.4
등장화제 종류 염화나트륨 83.5
글리세린 81.7
소르비톨 81.6
만니톨 농도 2.5% 74.4
5.0% 76.1
10.0% 76.8
계면활성제 종류 폴리소르베이트 20 83.5
폴리소르베이트 80 83.3
폴록사머 188 83.0
폴리소르베이트 20
농도		 0.005% 88.4
0.01% 88.5
0.02% 88.9
기타 첨가제 유무 w/o 염화아연 77.9
w/ 20 ㎍/㎖ 염화아연 70.9
w/o 페놀 74.4
w/ 1.5 ㎎/㎖ 페놀 73.5
w/o 메티오닌 74.4
w/ 0.1 ㎎/㎖ 메티오닌 77.0
pH 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
#1 5.6 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#2 6.0 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
분석 결과, 상기 표 2와 같이, 지속형 인슐린 결합체에 있어서 아세트산 나트륨으로 이루어진 완충용액, 염화나트륨으로 이루어진 등장화제, 만니톨로 이루어진 당알코올, 폴리소르베이트 20으로 이루어진 계면활성제로 이루어진 액상 제제가 가장 안정하며 이때 pH는 5.6 또는 6.0 모두 안정하였다.
실시예 2: 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 안정성 평가
지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 pH 및 기타 안정화제 유무에 따른 용해도를 확인하기 위해 하기 표 3과 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 액상 제제로 사용하여 40℃에서 1주간 보관 후 육안관찰을 이용한 단백침전 유무로서 안정성을 비교하였다. 각각의 조성에서 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 농도는 10 ㎎/㎖로 제조하여 실험을 수행하였다.
pH 완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제
#1 5.0 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#2 5.2 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#3 5.4 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#4 5.6 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#5 5.6 10mM
아세트산 나트륨		 10 ㎎/㎖
NaCl		 5% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
#6 5.6 10mM
아세트산 나트륨		 - 10% 만니톨 0.02%
폴리소르베이트 20
도 1의 단백침전 저해 지속기간(일)은 40℃ 보관 후 단백침전이 발생하지 않은 시점을 나타낸다. 상기 결과에서 보듯이, 아세트산 나트륨, pH 5.0 내지 5.4일 때(#1, #2, #3), 또는, 5%(w/v) 만니톨일 때(#5), 40에서 4일 이내 단백침전이 발생하였다. 그러나, pH 5.6이고, 10% (w/v) 만니톨이 첨가된 제제의 경우는 용해도가 향상되어 7일간 침전이 생성되지 않았다 (도 1).
실시예 3: 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성 평가
각각의 단독제 액상 제제를 기초하여 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성을 비교하였다. 또한, 지속형 인슐린 결합체 안정성을 위해 중요한 염화나트륨과 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 안정성을 위해 중요한 메티오닌의 추가가 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성에 어떤 영향을 미치는지 비교하였다.
하기 표 4와 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체, 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 액상 제제로 사용하여 40℃에서 4주간 보관 후, 단백 침전 여부 및 이온교환 크로마토그래피법 (Ion Exchange Chromatography, IE-HPLC)과 크기 배제 크로마토그래피법 (Size Exclusion Chromatography, SE-HPLC), 역상 크로마토그래피법 (Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)을 이용해 단독제 대비 병용물의 안정성 평가를 하였다.
각 액상 제제 내의 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 (대조군-1, #1~#4) 및 지속형 인슐린 결합체 (대조군-2, #1~#4)의 농도는 각각 10 ㎎/㎖ 및 61.1 ㎎/㎖이다.
완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제 그 외
대조군-1
(지속형 인슐린 분비
펩타이드 결합체 단독)		 20 mM
구연산 나트륨 (pH 5.6)		 - 10%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
대조군-2
(지속형 인슐린
결합체 단독)		 10 mM
아세트산 나트륨 (pH 6.0)		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 -
#1 20 mM
구연산 나트륨 (pH 5.6)		 - 10%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#2 20 mM
구연산 나트륨 (pH 5.6)		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10%
만니톨		 0.005%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#3 10 mM
아세트산 나트륨 (pH 6.0)		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 -
#4 10 mM
아세트산 나트륨 (pH 6.0)		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
그 결과, 도 2 내지 3은 각 조성에서 IE-HPLC, RP-HPLC의 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과 값에 대비한 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 잔존율을 나타냈다. 그 중에서도, 도 2는 지속형 인슐린 결합체의 IE-HPLC 및 RP-HPLC 결과를 나타내고, 도 3은 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 IE-HPLC 및 RP-HPLC 결과를 나타낸다.
상기 결과에서 보듯이, 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 복합제의 안정성을 각각 지속형 인슐린 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 측면에서 비교할 때, 3번 제형과 4번 제형에서 지속형 인슐린 결합체는 단독제와 유사한 정도의 순도 및 안정성을 유지하였다 (도 2).
그러나, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20 액상 제제에 메티오닌이 0.01%(w/v) 되도록 포함한 경우(#4)가 메티오닌이 포함되지 않은 제제에 비해 안정성이 향상되는 것을 확인하였다 (도 3). 이는 메티오닌이 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 산화를 방지하기 때문으로 보인다. 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 단독제와의 비교는 단독제의 과도한 침전 발생으로 수행하지 못하였다.
도 4에서 나타난 바와 같이 단독제는 2주 이내 단백 침전이 발생하였고, 지속형 인슐린 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 복합체인 경우 (#3, #4)는 용해도가 증가하여 4주까지 침전 생성이 상대적으로 저해되었다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 액상 제제의 조성이 인슐린분비 펩타이드 결합체 및 인슐린 결합체 복합체의 농도가 고농도로 높은 안정성을 유지시킬 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.
실시예 4: 등장화제 및 당알코올의 농도 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성 평가
상기 실시예 3에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20, 0.01%(w/v) 메티오닌)를 기초하여 등장화제로서 4.8 ㎎/㎖ 내지 6.7 ㎎/㎖ 염화나트륨, 당알코올로서 1 %(w/v) 내지 2 %(w/v) 만니톨의 조합에 따른 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 안정성을 비교하였다.
하기 표 5와 같은 조성을 각각 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 액상 제제로 사용하여 25℃에서 4주간 보관 후, 이온교환 크로마토그래피법, 크기 배제 크로마토그래피법 및 역상 크로마토그래피법을 이용해 안정성 평가를 하였다.
표 6 내지 7의 IE-HPLC(%) 및 RP-HPLC(%)는 (Area% / Start Area%) %로서 초기 결과값에 대비한 지속형 인슐린 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 병용물의 잔존율을 나타낸다. 그 중에서도, 표 6은 지속형 인슐린 결합체의 IE-HPLC 및 RP-HPLC 결과를 나타내고, 표 7은 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 IE-HPLC 및 RP-HPLC 결과를 나타낸다.
완충용액 등장화제 당알코올 계면활성제 그 외
대조군 10 mM
아세트산 나트륨
(pH 6.0)		 10 ㎎/㎖
NaCl		 10%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#1 10 mM
아세트산 나트륨
(pH 6.0)		 4.8 ㎎/㎖
NaCl		 1%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#2 10 mM
아세트산 나트륨
(pH 6.0)		 4.8 ㎎/㎖
NaCl		 2%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#3 10 mM
아세트산 나트륨
(pH 6.0)		 6.7 ㎎/㎖
NaCl		 1%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
#4 10 mM
아세트산 나트륨
(pH 6.0)		 6.7 ㎎/㎖
NaCl		 2%
만니톨		 0.02%
폴리소르베이트 20		 0.01%
메티오닌
IE-HPLC (%) RP-HPLC (%)
초기 1주 2주 3주 4주 초기 1주 2주 3주 4주
대조군 100 98.20 95.50 94.78 94.05 100 100 99.63 99.40 99.17
#1 100 98.21 96.84 95.26 94.68 100 99.92 99.32 99.20 99.07
#2 100 98.18 96.80 95.18 93.56 100 99.99 98.86 98.81 98.75
#3 100 96.85 94.70 93.62 93.53 100 99.93 99.44 99.30 99.15
#4 100 97.74 95.78 95.28 94.8 100 99.88 99.33 99.19 99.06
IE-HPLC (%) RP-HPLC (%)
초기 1주 2주 3주 4주 초기 1주 2주 3주 4주
대조군 100 96.32 92.53 88.61 84.69 100 94.93 94.16 89.68 85.19
#1 100 96.48 92.61 89.83 85.78 100 94.95 92.37 88.71 85.05
#2 100 97.20 93.40 90.34 87.78 100 95.29 94.19 90.01 87.43
#3 100 96.86. 93.61 91.15 87.61 100 95.82 95.17 90.12 88.06
#4 100 97.02 93.95 91.41 87.94 100 94.93 93.85 90.02 87.70
상기 결과에서 보듯이, 실시예 3에서 확인된 액상 제제 (10mM 아세트산나트륨, pH 6.0, 10 ㎎/㎖ 염화나트륨, 10%(w/v) 만니톨, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20, 0.01%(w/v) 메티오닌)를 기초로, 염화나트륨 농도가 4.8 ㎎/㎖, 만니톨 농도가 1%(w/v) 내지 2%(w/v) 되도록 감소한 경우(#1, #2), 염화나트륨 농도가 6.7 ㎎/㎖, 만니톨 농도가 1%(w/v) 내지 2%(w/v) 되도록 감소한 경우(#3, #4) 모두에서 실시예 3에서 확인된 액상 제제와 유사한 높은 안정성을 나타냈다.
이와 같은 결과들은 본 발명의 액상 제제의 조성은 등장화제인 염화나트륨 및 당알코올인 만니톨의 농도가 각각 낮은 경우에도, 액상 제제의 조성물로 등장화제인 염화나트륨 및 당알코올인 만니톨이 구성으로 포함되면 인슐린 결합체 및 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 병용물의 안정성에 영향이 없다는 것을 뒷받침한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> A liquid formulation of long-acting insulin and insulinotropic peptide <130> PA130617/KR <150> KR10-2012-0081478 <151> 2012-07-25 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exendin-3 <400> 4 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> exendin-4 <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (30)

  1. 생리활성 펩타이드인 인슐린, 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인슐린 및 인슐린분비 펩타이드의 복합체 액상 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 인슐린과 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체이고, 인슐린분비 펩타이드는 인슐린분비 펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인슐린분비 펩타이드 결합체인 액상 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린과 동일한 아미노산 서열을 갖는 액상 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린의 아미노산 치환, 추가, 제거 또는 수식에 의해 변이된 인슐린 유도체 또는 천연형 인슐린과 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체인 액상 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인슐린분비 펩타이드는 GLP (Glucagon like 펩타이드)-1, GLP (Glucagon like 펩타이드)-2, 엑센딘-3 (exendin-3), 엑센딘-4 (exendin-4), 이들의 전구물질 (precursor), 아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragment), 변이체 (variants) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 것인 액상 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인슐린 분비펩타이드 변이체는 이미다조아세틸-엑센딘-4 (Imidazoacetyl excendin-4)인 액상 제제.
  7. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 액상 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 액상 제제.
  9. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 액상 제제.
  10. 제7항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 액상 제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 액상 제제.
  12. 제2항에 있어서, 상기 결합체의 결합 방법이 비펩타이드성 중합체를 이용하거나, 재조합기술을 이용하여 결합된 액상 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 액상 제제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 액상 제제.
  15. 제2항에 있어서, 상기 약리학적 유효량의 지속형 인슐린 결합체의 농도가 10 ㎎/㎖ 내지 200 ㎎/㎖이고, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 150 ㎎/㎖인 액상 제제.
  16. 제1항에 있어서, 상기 당알코올이 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 액상 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 당알코올의 농도가 전체 용액 대비 1%(w/v) 내지 15%(w/v)인 액상 제제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 완충용액이 구연산, 아세트산 또는 인산 완충용액인 액상 제제.
  19. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 농도가 전체 용액 대비 5 mM 내지 50 mM인 액상 제제.
  20. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 5 내지 6.5인 액상 제제.
  21. 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨 (Sodium chloride), 황산나트륨 (Sodium sulfate) 및 구연산 나트륨 (Sodium citrate)로 이루어진 군에서 선택된 것인 액상 제제.
  22. 제1항에 있어서, 상기 등장화제의 농도가 0.5 ㎎/㎖ 내지 30 ㎎/㎖인 액상 제제.
  23. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머 (poloxomer)인 액상 제제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)인 액상 제제.
  25. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 메티오닌을 추가로 포함하는 것인 액상 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 메티오닌의 농도가 전체 용액 대비 0.005%(w/v) 내지 0.1%(w/v)인 액상 제제.
  27. 제1항에 있어서, 상기 안정화제가 당류, 다가알코올 및 아미노산으로 구성되는 군 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 제제.
  28. 제1항에 있어서, 상기 인슐린과 인슐린분비 펩타이드가 각각 폴리에틸렌 글리콜에 의해 면역글로불린 단편에 결합된 지속형 인슐린 결합체, 지속형 인슐린분비 펩타이드, 및 알부민-비함유 안정화제를 포함하되, 상기 안정화제가 아세트산 완충용액, 만니톨, 폴리소르베이트 20 및 염화나트륨을 포함하는 액상 제제.
  29. 제28항에 있어서, 메티오닌을 추가로 포함하는 것인 액상 제제.
  30. a) 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드를 제조하는 단계; 및
    b) a) 단계에서 제조된 인슐린 및 인슐린 분비 펩타이드를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 액상 제제의 제조 방법.
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