FI120354B - DNA-polymeraaseja, joilla on modifioitu nukleotidisitoutumiskohta, DNA-sekvensointia varten - Google Patents

Description

DNA-polymeraaseja, joilla on modifioitu nukleotidisitou-tumiskohta, DNA-sekvensointia varten Tämä patenttihakemus: on osittaista jatkoa hakemuk-5 seen Tabor ja Richardson, "DNA-polymerases Having Modified Nucleotide Binding Site for DNA Sequencing", joka jätettiin 17. lokakuuta 19:94, ja joka kokonaisuudessaan (piirrokset mukaan lukien) sisällytetään tähän viitteeksi.

Keksinnön tausta 10 Tämä keksintö tehtiin hallituksen tuella mukaan lukien apuraha taholta U.S. Dept of Energy,: sopimusnumero DE - FGO 2-8 BERSQ 6 8 8, USA: n hallituksella saattaa olla tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Tämä keksintö koskee DNÄ-polymeraaseja;, jatka sois pivat DNA-sekvensointiin, sekä automatisoituja ja manuaalisia menetelmiä DNA-sekvensointiin.

Seuraava on suppea kuvaus DNA-sekvensointitekniikan oleellisesta alasta. Tämä esitetään vain yleisen ohjauksen antamiseksi tämän hakemuksen lukijoille, eikä myönnetä, 20 että mikään, mitä tässä esitetään tai mihin tässä viitataan eksplisiittisesti tai implisiittisesti vastaisi oheisia vaatimuksia edeltävää alan teknistä tasoa.

DNA-sekvensointiin liittyy yleensä neljän populaation yksisäikeisiä DNA-fragmentteja muodostaminen, joilla 2 5 on yksi määrätty pää ja yksi vaihteleva pää, Vaihteleva pää yleensä päättyy spesifisiin nukleotidiemäksiin [joko guaniini (G) , adeniini (A) , tyrniini (T) tai sytosiini (C) ] . Nämä neljä eri fragmenttisarjaa erotetaan kukin pituutensa nojalla, jolloin yksi menettely on korkean ero-30 tuskyvyn polyakryyliamiäigeeli; kukin nauha geelillä vastaa kolineaarisesti spesifistä nukleotidiä DNA-sekvans-sissä identifioiden siten tietyn nukleotidiemäksen asemat sekvenssissä. Katso Tabor ja Richardson, us-patenfetijulkaisut 4 942 130 ja 4 962 020, 2

On olemassa kaksi yleistä menetelmää DNA-sekvensointiin. Yhdessä menetelmässä (Maxam ja Gilbert -sekvensointi) eristetyt DNA-fragmentit hajotetaan kemiallisesti ja kukin leimataan yksittäisellä 5 radioleimalla määrätyssä päässään, jolloin kussakin reaktiossa saadaan rajoitettu pilkkominen spesifisesti yhden tai useamman neljästä emäksestä (G, A, T tai Cj kohdalla. Toisessa menetelmässä (dideoksi- tai ketjupääsekvensointi) syntetisoidaan entsymaattisesti DNA-10 säie. Sanger et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463. Yleensä suoritetaan neljä erillistä synteesiä, jolloin kukin reaktio saadaan päättymään spesifiseen emäkseen (G, A, T tai C) inkorporoimalla sopiva ketjun päättävä nukleotidi, kuten dideoksinukleotidi. Viime 15 mainittu menetelmä on edullinen, sillä DNA-fragmentit voidaan leimata tasaisesti (pään leimaamisen asemesta) sisällyttämällä mukaan radioaktiivisesti leimattu nukleo-siditrifosfaafcti, jolloin suuremmat DNA.-fragment it sisältävät kasvavasti enemmän radioaktiivisuutta. Edelleen 35S~ 2Q leimattuja nukleotidejä voidaan käyttää 33P-leimattujen nukleotidien tilalla, mikä johtaa terävämpään määrittelyyn; reaktiotuotteiden tulkinta on helpompaa, koska kukin vyöhyke vastaa vain joko G:tä, Aita, T: ta tai C:tä. Useimpiin dideoksisekvensointeihin käytettyjä, entsyymejä ovat 25 T7-DNA~polymeraasi ja DNA-polymeraasit, jotka on eristetty termofiilisistä organismeista, kuten Tag, Vent, Tth ja muut. Muita vähemmässä määrin käytettyjä polymeraaseja ovat AMV-käänteiskopioijaentsyymi ja Sk. coli DNÄ-polyme-raasi-I:n Klenow-fragmentti, 30 Dideoksiketjupäämenetelmässä lyhyt yksisäikeinen aluke juotetaan yksisäikeiseen templaattiin. Äluketta pidennetään sen 3'-päästä inkorporoimalla deoksinukleotidejä (dNMP: t) kunnes dideoksinukleotidi (ddNMP) tulee inkor-poroiduksi. Kun ddNMP tulee inkorporoiduksi, pidentyminen 35 päättyy tuohon emäkseen. Muita ketjun päättäviä aineita 3 voidaan, käyttää ddNTPrn tilalla ja ddNTP voidaan leimata kuten alla esitetään.

Edeltävää metodologiaa käyttäen on kehitetty automatisoituja systeemejä DNA-sekvenssianalyysiin. Yhdessä 5 laitteessa, jota valmistaa EG & G, käytetään tavanomaisia dideoksiketjupääreaktioita ja radioaktiivisesti leimattua nukleotidiä. Saadut DNA-tuotteet erotetaan geelielektro-foreegilla, Toneguzzo et ai., Biotechnlcrues 6, (1988) 460. Detektori pyyhkäisee radioaktiivisuuden kulkiessaan geelin 10 pohjan läpi. Neljä synteesireaktiota tarvitaan kutakin sekvensoitavaa templaattia kohden, sekä neljä vyöhykettä kullakin geelillä, jolloin erillistä: vyöhykettä käytetään tuotteille, jotka päättyvät kuhunkin spesifiseen ketjupää-aineeseen.

15 Kambara et ai., Biotechnology 6 (1988) 816, ovat käyttäneet fluoresoivasta leimattua aluketta. Saadut fluoresoivasta- leimatut tuotteet viritetään laserilla geelin pohjasta käsin ja fluoresenssi todetaan CRT-monitor il la . Tämä menettely edellyttää samoin, neljää syntee-20 s.ireaktiota ja neljää vyöhykettä geelillä kohden kutakin sekvensoitavaa templaattia.

Applied Biosystems valmistaa laitetta, jossa käytetään neljää eri aluketta, joista kukin on leimattu erilaisella fluoresoivalla leimalla. Smith et ai,. Nucl. 25 Acids Res. 13 (1985) 2399; ja Nature 321 (1986) 674. Ku takin aluketta käytetään erillisessä reaktiossa, joka sisältää yhtä neljästä dideoksinukleotidistä. Kun nämä neljä reaktiota on suoritettu, seokset yhdistetään ja DNA-fragmentit fraktioidaan yksittäisellä vyöhykkeellä geelissä. 30 Kun fluoresoivat DNA-fragmentit ovat kulkeneet elektrofo-reettisesti geelin läpi, fluoresoivat tuotteet todetaan laserilla geelin pohjasta käsin. Tämä systeemi vaatii neljä erillistä juotto-reaktiota- ja neljä erillistä synteesi-reaktiota kutakin templaattia kohden, mutta vaan yhden 4 vyöhykkeen geelillä. Sekvenssi tietokoneanalyysi helpottuu kaikkien neljän nauhan ollessa yhdessä vyöhykkeessä.

DuPont myi laitetta, jossa erilainen fluoresoiva leima oli kiinnitetty kuhunkin neljään dideoksinukleosidi-5 trifosfaattiin. Prober et ai., Science 238 (1987) 336.

Tarvitaan yksi juottovaihe, yksi polymeräasireaktio (joka sisältää kutakin neljää leimattua dideoksinukleosiditri-fosfaattia. Neljä eri fluoresoivaa leimaa DNA-tuotteissa todetaan erikseen niiden kulkiessa elektroforeettisesti ID geelin läpi.

Englert et ai. . US-patenttijulkaisu nro 4 707 235 (1987), kuvaavat monikanavaista elektroforeesilaitetta, jossa oh detektiolaite, joka on sijoitettu oleellisesti poikki geeliriköko leveyden, ja joka kykenee toteamaan 15 leimattuja DNA-tuotteita niiden kulkiessa detektiolaitteen ohi neljässä erillisessä vyöhykkeessä, ja joka identifioi kanavan tai vyöhykkeen, jossa näyte sijaitsee. Edullisesti käytetään radioisotooppileimoja.

Inherenttiä tällä hetkellä DNA-sekvenssianalyysiin 20 käytetyille menettelyille on välttämättömyys erottaa joko radioaktiivisesti tai fluoresoivasti leimatut DNA-tuotteet geelipermeaatiomeriettelyllä kuten polyäkryyliamidigeeli-elektroforeesi ja sitten todeta niiden sijainnit suhteessa toisiinsa liikkeen geelin läpi akselin pituudella. Tämän 25 menettelyn tarkkuuden määrittää osltaan signaalin yhtenäisyys nauhoissa, jotka ovat kulkeneet suunnilleen saman etäisyyden geelin läpi. Erot tai variaatiot signaali-intensiteeteissä likeisten nauhojen välillä tuottavat lukuisia ongelmia. Ensiksi ne laskevat menetelmän herkkyyttä, 30 jota rajoittaa kyky todeta heikoimmat signaalit sisältävät nauhat. Toiseksi ne tuottavat vaikeuksia sen määrityksessä, onko heikon signaalin sisältävä nauha todellinen signaali, joka johtuu ketjupääaineen inkorpoiaatiästä, vai valesignaali, joka johtuu taUkokohdasta DNArssa, josta 35 polymeraasi on irronnut. Kolmanneksi ne laskevat tarkkuut- 5 ta DNA-sekvenssin määrityksessä ].ikellä toisiaan sijaitsevien nauhojen välillä, koska yhden nauhan voimakas signaa-11 voi peittää naapurinsa heikon signaalin. Katso Tabor ja Ri chards on, supra.

5 Vaihtelu na uha in t ens i t ee t i s s ä voi syntyä useimpien DNA-polymeraasien luontaisesta ominaisuudesta. Useimmat DNA-polyraeraasit diskriminoivat vastaan DNA-sekvenssiana-lyysissä käytettujä ketjupäädideoksinukleotidejä. T4-DNA-pOlymeraasi diskriminoi vastaan dcLMTP: eitä siinä määrin, 10 ettei sitä voida käyttää DNA-sekvensointiin. Sh coli DNA-polymex'aasi -1, Taq- ja Vent-DNA-polymeraasi samoin diskriminoivat voimakkaasti ddNTP;eitä vastaan, jolloin hiistä kukin inkorporoi ddNMP:n tukat kertaa hitaammin kuin vastaavan dNTFm. Tabor jä Richardson, supra (kum-15 matkin sisällytetään tähän viitteiksi) ovat osoittaneet, että T7-DNA-polymeraasi on spektrin toisessa päässä diskriminoiden ddNTP:eitä vastaan vain usea-kertaisesti. Jos DNA-palymeraasi diskriminoisi vastaan ddNTP:tä samassa määrin kaikissa sekvensseissä, tämä ongelma voitaisiin 20 voittaa yksinkertaisesti muuttamalla ddNTP/dNTP-suhdetta.

Tällaista lähestymistapaa on käytetty coli DNA-polyme-raasi-I:llä ja Taq-NA-polymeraasilia. Kuitenkin diskriminaation laajuus vaihtelee viereisten DNA-sekvenssien välillä, mikä johtaa laajamittaiseen vaihteluun viereisten 25 vierekkäisten radioaktiivisten fragmenttien intensitee tissä. Spesifisten fragmenttien intensiteetti voi vaihdella 50-kertaisesti coli DNÄ-palymeraasi-I:Ile mutta vain usea-kertaisesti T7-DNÄ-pqlymeraasille. Näin muodoin T7-DNA-polymeraasilla tuotettujen nauhojen intensiteetti 3 0 DNÄ-sekvensointigeelissä on samankaltainen, mikä siten helpottaa niiden toteamista ja analyysia automatisoiduilla: ] menettelyillä. Lisäksi on kuvattu menettelyjä, jotka jopa edelleen vähentävät T7-DNÄ-polymeraasin diskriminaatiota dideoksinukleotidejä vastaan, siten, että polymeraasi in-35 korporoi dideoksinukleotidejä yhtä hyvin kuin deoksinuk- 6 leotidejä. Nämä menettelyt ja olosuhteet samoin vähentävät mutta poista diskriminaatiota muilla DNA-polymeraaseilla kuten Klenow- ja Taq-DNA-polymeraasit. Esimerkiksi käyttämällä mangaania magnesiumin tilalla tai lisäksi reaktio-5 seoksessa voidaan vähentää dideoksinukleotidivastaista diskriminaatiota tai poistaa se kokonaisuudessaan. Tällaisissa olosuhteissa T7-DNA-pQlymeraasi ei erottele näiden kahden molekyylin välillä kun taas muut DNA-polymeraasit kuten Klenow-fragmentti, Taq ja Vent edelleen diskriminoi-.10 vat jossain määrin. Esimerkiksi Klenow diskriminoi edel leen vastaan ddNTPreitä aina nelinkertaisesti mangaanin läsnä ollessa. Mikä merkittävämpää, vaikka diskriminaation kokonaisasta sellaisilla entsyymeillä kuten Klenow- ja Taq-DNA-polyraeraasit laskee, spesifisten fragmenttien in-15 tensxteetti voi vaihdella paljon enemmän kuin nelinkertaisesti johtuen: korkeasta diskriminaatiosta tietyissä sekvensseissä DNA:ssa. Näitä polymeraaseja ja menettelyjä käytetään nykyään lähes yleismaailmallisesti manuaalisessa DNA-sekvensoinnissa {eli käyttämättä edellä kuvatun 20 kaltaisia sekvensoihtikoneita) ja niitä käytetään laajalti automatisoiduissa menetelmissä. Mangaanin käyttö ja diskriminaation puuttuminen ddNTPteitä vastaan kaikissa kohdissa johtaa nauhoihin, joiden intensiteetit ovat tasaiset, mikä siten helpottaa sekvensointigeelien 25 lukemista joko manuaalisilla tai automaattisilla menettelyillä. Lisäksi diskriminaation puuttuminen tekee mahdolliseksi käyttää uusia menettelyjä sekvenssianalyysiin (Tabor ja Richardson, supra). Annetaan käyttöön tähän havaintoon perustuva menetelmä DNA- 30 sekvenssin määrittämiseksi yhdessä reaktiossa, joka si sältää kaikkia neljää ddNTP:tä eri suhteissa, mittaamalla kunkin piikin suhteellinen intensiteetti geelielektrofo-reesin jälkeen. Tämän kirjoittajat esittävät: Tämän keksinnön mukaiset DNA-polymeraasit eivät 35 erottele merkittävästi dideoksinukleotidianalogien ja 7 normaalien nukleotidien välillä. Toisin sanoen mahdollisuus analogin tulla inkorporoiduksi on likimäärin sama kuin mahdollisuus normaalin nukleotidin: tulla inkorporoiduksi tai ainakin analogi tulee inkorporoiduksi vähintään 5 1/10 teholla normaalin analogin vastaavasta. Tämän kek sinnön mukaiset polymeraasit eivät myöskään diskriminoi merkittävästi vastaan joitakin muita analogeja. Tämä on tärkeätä, koska neljän normaalin deoksitrifosfaatin (dGTP, &ATP, dTTP ja dCTP) lisäksi sekvensointireaktiot edellytit] tävät muuntyyppisten nukleotidijohdannaisten inkorporaa-tiofea, kuten radioaktiivisesti tai fluoresoivas.ti leimatut nukleosiditrifosfaatit, tavallisesti syntetisoitujen säikeiden leimaamiseksi “S:11a, 22P:llä tai muilla kemiallisilla aineilla. Kun DNA-polymeraasi ei diskriminoi vastaan 15 analogeja, on olemassa sama todennäköisyys analogin kuin normaalin nukleotidin inkorporaatiolle, Leimatuille nuk-leosiditrifosfasteille tämä on tärkeätä syntetisoitujen DNA-säikeiden tehokkaaksi leimaamiseksi käyttäen minimimäärää radioaktiivisuutta. [4 942 130 COL 5:5].

20 Kirjoittajat mainitsevat myös:

Kyky tuottaa likeisiä nauhoja, joiden intensiteetti on likimäärin, sama, on edullinen, sillä se sallii minkä tahansa sekvensointireaktion tulosten lukemisen helpommin ja suuremmalla varmuudella. Edelleen koska DNA-tuotteet 25 sekvensointireaktiosta spesifisellä ketjupääaineella muodostavat nauhoja, joiden intensiteetti on likimäärin sama kuin likeisten nauhojen, nauhaintensiteetti sinänsä tuottaa spesifisen leiman näin muodostuneelle nauhasarjalle. Tietyn ketjupääaineen tuottamien DNA-tuotteiden, joiden 30 molekyylipaino: on likimäärin sama, lukumäärä vaihtelee riippuen ketjupääaineen pitoisuudesta. Täten käyttämällä kunkin neljän ketjupääaineen eri pitoisuutta synteesiin DNA-tuotteet, jotka sisältävät yhtä ketjupääainetta, eroa-: vat DNA,-tuotteista, joiden molekyylipaino on likimäärin 35 sama mutta jotka sisältävät toista ketjupääainetta, sikä- 8 li, että niiden sekä lukumäärä että määrä vaihtelee; täten DNA-tuotenauhat voidaan identifioida mitä tulee ketjupää-aineeseen yksinkertaisesti niiden intensiteetistä verrattuna likeisten nauhojen intensibeetteihin. Tästä seurauk-5 sena kaksi tai useampi sarja DNA-tuotteita kunkin sarjan sisältäessä eri ketjupääainetta voidaan alistaa geeliper-meaatioon yhdessä vyöhykkeessä ja identifoida, eli erottaa muista, kunkin nauhan intensiteetistä verrattuna likeisten nauhojen intensiteettiin. Lisäksi DNA-tuotteiden synteese-10 jä, jotka sisältävät eri ketjupääaineita, ei tarvitse suorittaa erikseen erillisissä astioissa, vaan ne kaikki voidaan suorittaa samanaikaisesti yhdessä reaktiosastiassa, ja samaa leimaa, esim. radioisotooppia tai fluoresoivaa leimaa jne., voidaan haluttaessa käyttää kaikille ketju-15 pääaineille eri leiman kullekin asemesta, mikä siten yksinkertaistaa menettelyä,. [4 962 020, co. 3:1-351.

Katso myös Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Soi. USA 86 (1989) 4 076 - 4080, jossa esitetään, että korvaamalla magnesiumionit mangaani-ioneilla katalyysissä 20 T7-DNA~polymeraasilla tai EL Goli DNA-polymeraasilla vä hentää näiden polymeraasien diskriminaatiota ddNTP:eiden suhteen 4-100-kertaisesti, ja Tabor ja, Richardson, J. Bio!. Chem 265 (1990) 8322 - 8328, jossa kuvataan pyro- fosfataasin ja mangaani-ionien käyttöä intensiteetiltään 25 yhtenäisten dideoksipäätteisten fragmenttien muodostami seksi T7-DNÄ“polymeraasia käyttäen.

Keksinnön yhteenveto

Hakija uskoo, että joidenkin DNA-polymeraasien vähäisempi käyttökelpoisuus didecksi-DNA-sekvensoint iin 30 johtuu osittain noiden polymeraasien laskeneesta kyvystä inkorporoida ddNMP:tä (tai muuta nukleotidianalogia) dNME:n asemesta. Kuten edellä mainittiin, kyky olla diskriminoimatta tekee mahdolliseksi matalampien ddNTP-pi--toisuuksien käytön kuin entsyymeillä, jotka diskriminoi-35 vat, ja mikä tärkeintä, se tuottaa sekvensointigeeleihin 9 nauhanmuodostuskuvicita, jotka ovat yhtenäisempiä intensiteetiltään pituudellaan. Molemmat nämä tulokset tekevät automatisoidusta sekvensoinnista entsyymillä helpompaa ja edullisempaa sikäli, että pitempiä DNA-sekvenssejä voidaan 5 määrittää paremmalla luotettavuudella.

Keksintö koskee menetelmää tuottaa sellaista lämpöstabiilia DNA-polymeraasia, jolle on tunnusomaista se, että deoksinukleotidia sitova kohta käsittää sekvenssin K Ni N2 N3 N4 % Ns N7 Y G/Q, jossa kukin N on 10 muista riippumatta mikä tahansa aminohappo lukuun ottamatta N4:ää, joka on polaarinen aminohappotähde.

Menetelmä käsittää vaiheet, joissa tarjotaan käyttöön nukleiinihappömolekyyli, joka koodaa lämpöstabiilia DNA-polymeraasia, joka sisältää sekvenssin K Ni N2 N3 N4 N5 Ns 15 N7 Y G/Q, jossa kukin N on muista riippumatta jokin aminohappo, ja rr.u t a g e n .1 s o i d a a n mainittu nukleiinihappömolekyyli yhden tai useamman emäsmuutoksen inkprporoimiseksi nukleotidin emässekvenssiin polaarisen aminohapon koodaamiseksi asemassa N,;. Menetelmän avulla 20 muutoin diskriminatorinen DNA-polymeraasi voidaan muuttaa vähemmän diskriminoivaksi ddNTPreiden suhteen kuin vastaava luonnollisesti esiintyvä entsyymi. Tässä menetelmässä polymeraasia modifioidaan geneettisesti aminohappotähteiden tuottamiseksi avainkohtiin, jotka tehostavat 25 polymeraasien kykyä inkorporoida dNMTP-analogeja. Hakija on määrittänyt, että aminohappomuutoksilla DNA-polymeraa-sien spesifisellä alueella on dramaattinen vaikutus noiden DNA-polymeraasien kykyyn inkorporoida dideoksinukleotide-jä; spesifinen insertoitu aminohappotähde määrittää, onko 30 polymeraasi enemmän tai vähemmän diskriminatorinen ddNTP:eläen suhteen. Hakija on määrittänyt,-että DNA-polymeraasien modifioinnilla siten, etttä ne inkorporoivat | dideoksinukleotidejä tehokkaammin on valtaisa vaikutus niiden käyttökelpoisuuteen DNA-sekvensoinnissa.

35 Mahdollista on, että tällaiset modifioidut DNA-polymeraa- 10 sit osoittautuvat samoin käyttökelpoisiksi muihin tavallisiin molekyylibiologian menettelyihin kuten DNA:n monistaminen (esimerkiksi polymeraasiketjureaktiolla) , in vitro -mutagenisointi ja DNA-fragmenttien päiden täyttö.

5 Tämän teknologian yhdistäminen olemassa olevaan tietoon DNA-polymeraasin (kuten Taborin ja Richardsonin, supra. kuvaama T7 - DNA-po lyme r aa s i) 3 1 - 5' -eksonukleaasiaktiivi- suuden muuttamiseksi sekä mangaanin ja pyrofosfataasin käyttö sekvensointireaktioissa mahdollistaa huomattavasti 10 parempien entsyymien tuotannon kuin tällä hetkellä tunnetut. DNA-palymeraasia modifioidaan edullisesti substi-tuoimalla yksi tai useampi aminohappo, mutta se voi tapahtua insertoimalla yksi tai Useampi ylimääräinen aminohappo tai deletoimälla yksi tai useampi aminohappo.

15 DNA-sekvensoinnissa termofiiliset entsyymit kykenevät katalysoimaan nukleotidien polymerisaatiota yli 50 °C:n lämpötiloissa, ja erityisesti yli SO, 70 tai jopa 80 °G:Ssa DNA-sekvensointiin käytetyissä olosuhteissa kuten alalla tuttua. Tällaisia entsyymejä esiintyy yleensä 20 näissä lämpötiloissa, kasvavissa organismeissa. Kuitenkin hakija uskoo, että monet näistä entsyymeistä kärsivät rajoituksista, mukaan lukien rajoitettu kyky inkorporoida dideoksinukleotidejä. Modifioimalla näitä entsyymejä alla esitettyjä menetelmiä käyttäen alan ammattilaiset voivat 25 nyt modifioida mitä tahansa haluttua termofiilistä DNA-polymeraasia sen saamiseksi inkörporoimaan dideoksinukleotidejä tehokkaammin. Tällaiset entsyymit ovat parempia kuin tällä hetkellä DNA-sekvensoinfciin olemassa olevat sekä automaattisiin koneisiin ja manuaaliseen sekvensoin-30 ti.in, etenkin syklisekvensointlna tunnetuissa menette lyissä. SyklisekvensoinnisSa Suoritetaan useita DNA-syn-teesikierroksia samasta templaatista, jolloin syntetisoitu säie poistetaan kunkin syklin jälkeen lämpödenaturoih-nilla,· tämä tekee mahdolliseksi paljon pienempien DNÄ-35 templaattimäärien käytön sekvensointireaktiossa.

11

Hakija on määrittänyt kokeellisesti, että aminohappotähde 526 suhteellisen ei-diskriminoivassa, entsyymissä T7-DNA-palymeraasissa tuottaa sille tämän ominaisuuden. Hakija on määrittänyt, että modifioimalla tähdettä 5 526 on mahdollista lisätä T7*DNA-polyriieraasin diskriminaa- tiokykyä moninkertaisesti. T7-DNA-palyme:raasin ja muiden DNÄ-polymeraasien välisten amiriohapp.ohomolagia iden nojalla hakija on määrittänyt:, että tähteen muuttaminen homologisessa kohdassa muissa DNA-polymeraaseissa samoin vaikuttaa 10 niiden, kykyyn diskriminoida dideoksinukleotidejä vastaan. Esimerkkejä tällaisista homologisista kohdista ovat tähde 762 E coli DNA-polymeraasi-I:ssä ja tähde 667 Taq-DNA-po-lymeraasissa. Näissä kaikissa kolmessa esimerkissä hakija on osoittanut olevan tärkeätä, että tähde tässä kohdassa 15 on muu kuin f enyyli ai aniini (F) , esim., se voi olla tyro-siini (Y) kuten T7-DMÄ-polymeraasissa, Yllättäen tämän yksittäisen aminohappotähteen modifiointi: jopa lisäämällä yksi hydroksyyliryhmä tuottaa hyvin suuren muutoksen (250 - 8 000-kertaisen} diskriminaatiotasoihin. Hakija on 20 todennut, että T7-DNA-polymeraasin modifiointi 13 muussa kohdassa samoin johtaa entsyymin lisääntyneeseen kykyyn diskriminoida ddNTP:eitä vastaan, kuitenkin muutoksien näissä kohdissa vaikutus on paljon, pienempi, vain 5 - 20-kertainen. Käyttämällä analogisia menettelyjä muita 25 kohtia, jotka vaikuttavat diskriminaatioon ddNTP:eitä vastaan, voidaan helposti identifioida muissa DNA-polymeraa-seissa niiden tekemiseksi käyttökelpoisemmiksi DNA-sekvensointiin. Tällaisia muita kohtia ovat aminohappotähteet alueilla, jotka ovat hyvin homologisia 3 0 Ek coli DNA-polymeraasi-I m ja T7-DNA-polymeraasin välillä, koska nämä alueet todennäköisesti muodostavat osaltaan sitoutumisdomeenin döNTP:eille,· col ί DNA- polymeraasi-I : ssä nämä alueet sisältävät aminohapot alueilla, jotka ovat analogisia T7-DNA^polymeraasialueis-35 iin nähden, säilyvistä tai ei - säilyvistä' aminohapoista 12 alueilla 665 - 681 ja 754 - 783, ja mahdollisesti alueilla 709 - 734, 797 - 866 ja 913 - 927. Äminohappomuutos halutun funktion tuottamiseksi voidaan valita olemaan identtinen vastaaviin aminohappoihin nähden ei-diskrimi-5 natorisessa entsyymissä kuten T7-DNA-polymeraasi, tai muita funktionaalisesta ekvivalenttisia; aminohappoj a, jotka voidaan valita rutiinikokeilla. Muuttamalla ei-säilyviä aminohappoja saadaan perusteellisempi muutos dis-kriminautiokykyyn. Ei-säilyviä aminohappoja ovat ne, jotka 10 vaihtelevat yhdestä polymeraasilajista toiseen {eli joita tavataan alle 50 %: ssa polymeraaseista;} . Ilmaisua "analoginen" käytetään sen yleisesti hyväksyttyyn tapaan. Täten ®ol-I-polymeraasin analogi on polymeraasi, jolla on aminohapposekvenssi, jota kuvaavat Braithwaite ja Ito, 15 infra, joka on edullisesti yhtä sukua Pol-I-ryhmän poly-meraaseja muille jäsenille kuin Spo 2-DNA-po1ymeraas i. Tällaisia analyysejä voidaan suorittaa käyttäen Felsen-steinin PHYLIP-ohjelmaa. Id.

keksintö koskee myös lärnpöstabiilia DJ3A-20 polymeraasia, jolle on tunnusomaista se, että deoksinukleotidia sitova kohta käsittää sekvenssin K N2 N2 Mj Μ,ι lv, Mg M7 Y G/Q, jossa kukin N on muista riippumatta mikä tahansa aminohappo lukuun ottamatta N,i: ää, joka on polaarinen aminohappotähde. DNA-polymeraasilla on 25 verrattuna vastaavaan luonnollisesti esiintyvään tai ei- modifioituun DNA-polymeraaslin nähden on kasvanut kyky inkorporoida dideoksinukleotidi deoksinukleot idiin verrattuna.

"Kasvaneella kyvyllä" tarkoitetaan, että DNA-poly-30 meraasi kykenee paremmin inkorporoimaan dideoksinukleoti-din. Toisin sanoen se diskriminoi vähemmässä määrin kuin vastaava luonnollisesti esiintyvä DNA-polymeraasi vastaan dideoksinukleotidiä deoksinukleotidiin verrattuna. Spesifisia menetelmiä tällaisen diskriminaation mittaamiseksi 35 esitetään alla. Ilmaisulla "kasvanut" tarkoitetaan mitat- 13 tavaa eroa kyvyssä inkorporoida tällaisia dideoksinukleo-tidejä. Edullisissa suoritusmuodoissa tämä on ainakin 10 %:n kasvu verrattuna luonnollisesti esiintyvään entsyymiin, vaikka edullisesti diskriminaation dideoksinukleo-5 tideja vastaan taso laskee ainakin 10 - TQO-kertaisesti ja edullisesti 100 ~5ÖQ-kertaisesti, Yksi esimerkki tällaisesta entsyymistä on Ek. coli DNA-polymeraasi-1, joka {kuten tässä mainitaan) diskriminoi noin 140 ~ 1 100-kertai-sesti dideoksinukleotidien inkorporaatiota vastaan deoksi-10 nukleotideihin verrattuna. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan saada entsyymi {muuttamalla vain yhtä tai kahta aminohappoa), joka itse asiassa suosii ddNTP:eitä cLNTP:eiden kustannuksella - toisin sanoen polymeraasin kyky inkorporoida dideaksinukleotidejä on 15 kasvanut noin 1 ÖÖO-kertaisesti.

Ilmaisu "vastaava luonnollisesti esiintyvä DNA-polymer aasi " on alalla tuttu ja viittaa luonnossa tavattuun polymeraas.iin,: jota edullisesti ei ole muutettu in vitro-tai in vivo -manipulaatioilla laboratoriossa. Vastaavasti 20 vastaava nukleiinihappo on luonnossa tavattua DNA-polyme-raasia koodittava nukleiinihappo. Tätä käytetään yksinkertaisesti perustasona tällaisia poiymeraaseja koodattavien modifioitujen nukleiinihappojen vertaamiseksi. Täten perustaso Thermus aquatiGuksen DNA-poTymeraasille (kutsutaan 25 myös nimellä ,rTaq") on nukleiinihappo:, joka luonnollisesti koodittaa Taq-DNA-polymeraasiay joka esiintyy bakteerissa Thermus acruaticus.

Keksinnön tässä kuvatuissa suoritusmuodoissa DNA-polymeraasia modifioidaan substituoimalla yksi tai useampi 30 aminohappo. Kuitenkin voidaan ehkä todeta, että modifikaatio voi olla yhden tai. useamman aminohapon insertio tai yhden tai useamman aminohapon deleetio.

Tämän keksinnön mukaisia DNA-poiymeraaseja voidaan myös modifioida eksonukleaasidomeenin: poistamiseksi tai | 35 muuttamiseksi, kuten 3’-51-eksonukleaaslaktiivisuus, jota j | 14 kuvaavat Tabor ja Richardson, suora, tai 51-31-eksonuk-leaasiaktiivisuus Tagiissa, jota kuvaaa Barnes (W0 92/ 06 188), Mutaatiot, jotka muuttavat tämän keksinnön mukaisten DNA-polymemasien kykyä diskriminoida vastaan 5 ddfiTP:eitä, eivät edullisesti vaikuta eksonukieaasiaktii-visuuteen oleellisesti; tällä tarkoitetaan, että mutaatiot ovat entsyymin polymeraasidomeenissa, lähellä polymerisaa-tion aktiivista kohtaa, eivätkä laske diskriminaatiota vain laskemalla polymeraasin kykyä poistaa inkorporoituja 10 analogeja eksonukleaasiaktiivisuudellaan:. Erityisen sopivia tämän keksinnön mukaisia DNA-polymeraaseja ovat Pol T -tyypin polymeraasit, joita kuvaavat Braithwaite ja Ito,

Nucl. Acids Res. 21 (1993) 787, joka sisällytetään täten tähän viitteeksi, ja joihin viitataan ryhmänä A* Eri-15 tyisesti hakija on todennut, että polaarisen, hydroksyy-lipitoisen aminohappotähteen läsnäolo asemassa lähellä sitoutumiskohtaa cLNTP-substraatille on tärkeä, jotta po-lymeraasi kykenisi tehokkaasti inkorporoinaan dideoksi-nukleotidin. Sitoutumatta mihinkään teoriaan hakija uskoo, 20 että tämä havainto on vastakkainen sille odotetulle tulokselle, että korkea diskriminaatio vastaan riboosiyk-sikön 3'-asemassa hydroksyyliryhmää vailla olevaa nukleotidia (eli ddNTP) vaatii hydroksyyliryhmän samanaikaisen puuttumisen aminohappotähteestä tässä kriittisessä 25 kohdassa· Toisin sanoen molempien hydroksyyliryhmien puuttumisen jättämän aukon esiintyminen johtaa analogin vastaiseen diskriminaatioon. Tämän tuloksen tietäminen suo lähestymistavan: kriittisen tähteen löytämiseksi jopa kaukaista sukua olevissa DNA-polymeraaseissa,* polaarisen 3Ö ryhmän käsittävän tähteen lisääminen ei-polaarisen tilalle alueella, johon dNTP sitoutuu, on käyttökelpoinen ami-nohappomuutosehdokas polymeraasin kyvyn diskriminoida ddNTP:eitä vastaan laskemiseksi. Esimerkiksi fenyyliala-niini rotta-DNA-polymeraasi-b:n, joka on DNA-polymeraasi,

35 jolla on vähän jos lainkaan homplogiaa ryhmien A tai B I

15 pölyrneraaseihin nähden, asemassa 272 on osoitettu rönt-gensädediffraktiotUtkimuksilla olevan yhteydessä ddCTP-tähteen 3’-asemaan ternaarisessa kompleksissa aluke-temp-laatin kanssa [Pelletier et ai. , Science 264 (1994) 189] .

5 Tässä keksinnössä kuvattujen tulosten tunteminen tekee tämän tähteen modifioinnista tyrosiiniksi loogisen vaihtoehdon seulottaessa rotta-DNA-polymeraasi-b:n mutantteja, jotka inkorporoivat dideOksinukleotidejä tehokkaammin. Alan ammattilaiset kykenevät täten todennäköisesti 1.0 muuttamaan minkä tahansa DNA-poIymeraasin diskriminato- rista fenotyyppiä käyttämällä tässä esitettyä informaa-t iota, Tämän keksinnön mukaisten joiden polymeraasien kyky inkorporoida dideOksinukleotidejä tehokkaammin voi olla 15 spesifinen (eli vaikutus dideoksianalogeihin on paljon suurempi kuin muihin analogeihin). Kuitenkin jotkut poly-meraasit ovat. myös käyttökelpoisia muiden emäsmodifioitu-jen analogien [esim. deoksi-inosiinitrifosfaatti (dlTP) ja .2 ' -deoksi-7-deatsaguanosiini-5' -trifosfaatti (dc7GTP) nau-2 0 hojen yhteen puristumien elektroforeesissa poistamiseksi, ja fluoresoivaati leimatut deoksinukleotidit tai dideoksi-nukleotidit käytettäviksi automatisoiduissa menettelyissä] inkorporaation helpottamiseksi. Lisäksi tällaiset polyme-raasit voivat kyetä inkorporoimaan ribonukleotidejä tehok-25 kaatumin mahdollistaen täten. RNA:n synteesin ilman promoottoria. Spesifisesti säilyvät motiivit yhden alayksikön DNA-riippuva!Sten RNA-polymeraasien kuten T7~RNA-polyme-raasi ja ryhmän A (Pol I -tyypin DNA-polymeraasit) DNA-polymeraasien välillä viittaavat siihen, että mutaatiot 30 tällä alueella (tähteet 758 - 767 Ph, coli DNA-polymeraasi-I;ssä) todennäköisesti muuttavat spesifisyyttä rNTP:eitä kohtaan, Tämä tekee mahdolliseksi rakentaa RNA-polymeraa-seja, jotka tehokkaasti aloittivat synteesin alukkeesta poistaen vaatimuksen promoottorista RNA;:n syntetisoimisek-35 si. Analogisesti tässä annetut tiedot viittaavat siihen, 16 että T7-RNA-polymeraasin tähteiden 631 - 640 modifiointi muuttaa sen spesifisyyttä dNTPreitä kohden. Tämä tekee mahdolliseksi uusien DNA-polymeraasin rakentamisen, joka aloittaa DNA-synteesin de novo promoottorisekvenssistä 5 eikä pysty käyttämään aluketta.

Edullisissa suoritusmuodoissa modifioidulla DNA-polymeraasilla on riittävästi DNA-palymeraasiaktiivisuutta (esim. ainakin se, mitä käytetään t avanoma. i s e s s a sekvenso-intireaktiossa, ja edullisesti ainakin 100 yksikköä/mg 10 entsyymiä kuten alalla määritellään; edullisesti mutaatio polymeraasissa ei muuta aiempaa tasoa enempää kuin 5— 10-kertaisesti) käytettäväksi DNA-sekvensointiin (yhdistettynä mihin tahansa isäntätekijään, joka on välttämätön tuolle DNA-polymeraasiaktilvisuudeIle) ; ja sillä on riittävän 15 matala eks onukleaasiaktiivisuus (esim. alle 500 yksik-köä/mg, katso Tabor ja Richardson, supra) mahdollistamaan; polymeraasin käytön DNA-sekvensoinnissa,· DNA-polymeraasil~ la on yksi tai useampi aminohappo: T7-tyypin DNA-polymeraa-s in dideoksinukieotidisitoutumiskohdassa (esim. joku, joka 20 valitaan.; ryhmästä, jonka muodostavat T7, T3, QI, QIX H, W31, gh-l, Y, A1122 ja SP6) , Edullisesti modifioitua DNA-polymeraasia modifioidaan lämpöstabiilista entsyymistä, kuten DNA-polymeraasi, jota koodittaa Thermus aquaticus,

Thermus thermophllus, Thermus flavus. Bacillus sterother-25 mophilus ja Vent-bakteerit; ja polymeraasin kyky inkorpo-roida dideoksinukleotidi on ainakin 10~kertainen; 50-ker-tainen tai edullisimmin ainakin iOO-kertainen verrattuna vastaavaan luonnollisesti esiintyvään DNA-polymeraasiin, esim. muuttamalla vain yksi aminohappo. ] 30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä tuotetaan j modifioitua DNA-polymeraasia, j onka. kyky inkorporoida dideoksinukleotidia on kasvanut verrattuna vastaavan luonnollisesti esiintyvän DNA-polymeraasin kykyyn.

Menetelmässä annetaan käyttöön nukleiinihappomolekyyli, 35 joka koodittaa DNA-polymeraasia, ja mutagenisoidaan tai 17 muutoin muutetaan nukleiinihappomolekyylin nukleotidi-etnässekvenssiä yhden tai useamman emäsmuutoksen inkorpo-roimiseksi nukleotidiemässekvenssiin yhteen tai useampaan kohtaan, jotka merkittävästi (eli ainakin 10, 50 tai edul-5 lisimmin 100 - 500-kertaisesti) muuttavat nukleiinihapon koodittämän polymeraasin kykyä inkorporoida dideoksinuk-leotidi.

Keksintöä voidaan hyödyntää DNA-molekyylin nukleotidiemässekvenssin määrittämisessä. Menetelmässä 10 annetaan käyttöön alukemolekyyliin juotettu DNA-molekyyii, joka kykenee hybridisoitumaan DNA-molekyyliin; juotettuja molekyylejä inkuboidaan astiassa, joka sisältää ainakin yhtä deoksinukleotiditrifosfaattia, DNA-polymeraasia, joka on modifioitu luonnollisesti esiintyvästä DNA-15 polymeraasista omaamaan kasvaneen kyvyn inkorporoida diöeoksinukleotidi luonnollisesti esiintyvään poly-meraasiin verrattuna. (Polymeraasiila on riittävästi DNA-polymeraasiaktiivisuutta ja riittävän matala eksonukleaa-siaktiivisuus ollakseen käyttökelpoinen DNA-sekvensoin-20 tiin.) Samoin annetaan käyttöön ainakin yksi DNA-synteesin päättävä aine,, joka päättää DNA-synteesin spesifiseen nuk-leotidiemäkseen. Menetelmä käsittää edelleen inkubointi-r-eaktion DNA-tuotteiden erotuksen koon mukaan, jolloin ainakin osa DNA-molekyylin mikleotidiemässekvenssistä voi-25 daan määrittää.

Edullisissa suoritusmuodoissa DNA-polymeraasi on lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja sekvensointi suoritetaan lämpötilassa yli 50, 60 tai 70 °C, ja DNA-polymeraasi on peräisin (eli sillä on ainakin 50 %:n identtisyys amino-30 happotähteissä) polymeraasista, jonka koodittaa Thermus aguaticus, Thermus thermonhilus, Thermus flavus, Bacillus sterothermophllus. Thermococcus lltoralis (Vent), Pyrococ-cus furlosus (Pfu) tai Sulfolobus solfataricus.

Muissa edullisissa suoritusmuodoissa DNA-polyme-35 raasilla on alle 1 000, 250, 100, 50, 3.0 tai jopa 2 yk- 18 sikköä eksonukleaasiaktiivisnutta kohden milligrammaa po-lymeraasia ja se kykenee käyttämään alukkeita, joissa on vain 4:, 6 tai 10 emästä; ja kaikkien neljän deoksinukleo- siditrif osf aatin pitoisuus inkubo in t ivaiheen alussa on 5 riittävä mahdollistamaan DNA-synteesin jatkumisen kunnes aine:, esim. ddNTP, päättää sen.

Syklisekvensointiin esillä olevan keksinnön mukaiset poiymeraasit tekevät nyt mahdolliseksi merkittävästi pienempien määrien dideoksinukleotidejä käyttämisen muihin 10 entsyymeihin verrattuna. Toisin sanoen menetelmässä sykli-sekvensointireaktioon sisällytetään ylimäärä deoksinukleo-tidejä kaikkiin neljään dideoksinukleotidiin nähden, ja suoritetaan syklisekvensointireaktio. Muille entsyymeille oli tarpeen lisätä ylimäärin ainakin yhtä ddNTP:ta tällai-15 siin reaktioihin. Esimerkiksi Sears et ai. , BioTechniques 13 (1992) 62 6 kuvaavat noin 10-kertaisen ylimäärän ddNTP:eitä käyttöä dNTP:eihin verrattuna Vent-polymeraasin kanssa, ja Carothers gt ai.. Bio techniques 7. (1989) 494, kuvaavat ainakin 2-kertaisen ylimäärän ddNTP:eitä käyttöä; 20 dNTPieihin verrattuna Taq-polymeraasille. Esillä olevassa keksinnössä tällaista ylimäärää ei tarvita. Edullisesti yli 2-, 5- tai jopa 10-kertainen ylimäärä dNTP.tä käytetään vastaavaan ddNTPthen verrattuna. Spesifisessä esimerkissä alle 10 mM ddNTP:tä: käytetään tämän keksinnön mukai-25 sen modifioidun Taq:ih kanssa.

Keksintö koskee lisäksi sellaista pakkausta DNA-sekvensointiin, joka sisältää edellä kuvatun mukaista modifioitua. DNA-polymeraasia ja reagenssia, joka on välttämätön: sekvensointiin ja valitaan ryhmästä, j onka 3 0 muodostavat dlTP, deatsa-GTP, ketjupääaine kuten ddNTP, ja mangaania sisältävää liuosta tai jauhetta.

Keksintö koskee myös: liuosta, joka sisältää edellä kuvatun DNA-polymeraasin lisäksi pyrofosfataasia.

Keksintö antaa käyttöön menetelmän modifioidun DNA-35 polymeraasin saamiseksi, jolla on vastaavaan 19 luonnollisesti esiintyvään DNA-polymeraasiin nähden kasvanut kyky inkorporoida dideoksinukleotidi, jonka menetelmän mukaan hankitaan modifioitua DNA-polymeraasia, koodittava nukleiinihapposekvenssi, ilmennetään nuk-5 leiinihappo isäntäsolussa ja puhdistetaan DNA-polymeraasi isäntäsolusta.

Keksintö on käyttökelpoinen DNA-säikeen sekvensoimisessa oleellisesti kuten kuvataan edellä yhdellä tai useammalla (edullisesti 2, 3, tai 4) 10 deoksiribonukleasiditrifosfaatilla, DNA-polymeraasilla edellä kuvatun mukaisesti ja ensimmäisellä ketjupääaineella. DNA-polymeraasi saa alukkeen pitenemään ensimmäisen sarjan ensimmäisiä DNA-tuotteitä muodostamiseksi, jotka poikkeavat pituudeltaan pidenne--15 tystä alukkeesta, jolloin kullakin ensimmäisellä DNA- tuotteella on ketjupääaine pidennetyssä päässään, ja molekyylien lukumäärä kussakin ensimmäisessä DNA-tuotteessa on likimäärin sama oleellisesti kaikille DNA-tuotteille, jotka eroavat pituudeltaan ei enempää kuin 20 emästä, Me-20 netelmässä annetaan niinikään käyttöön toinen ketjupääaine hybridi soi due s a seoksessa, jonka aineen pitoisuus poikkeaa ensimmäisestä ketjupääaineesta, jolloin DNA-polymeraasi saa aikaan toisen sarjan toisia DNA-tuotteita tuotannon, jotka poikkeavat pidennetyn alukkeen pituudessa, jolloin 25 kullakin toisella DNA-tuotetella on toinen ketjupääaine pidennetyssä päässään. Molekyylien lukumäärä kussakin toisessa DNA-tuotteessa on likimäärin sama oleellisesti kaikille toisille DNA-tuotteille,: jotka poikkeavat pituudeltaan toisistaan 1 - 20 emäksellä, ja se on selvästi eri 30 kuin molekyylien lukumäärä kaikissa ensimmäisissä DNA- tuotteissä, jotka pituudeltaan eivät poikkea enempää kuin 20 emästä mainittujen toisten DNA-tuotteiden pituudesta.

Edullisissa suoritusmuodoissa kolmea tai neljää tällaista ketjupääainetts voidaan käyttää eri tuotteiden 35 valmistamiseksi kuten kuvataan julkaisussa Tabor ja Rich- 20 ardson, supra; ja sekvensointireaktioon lisätään magne-siumionia, tai jopa mangaani- tai rautaionia (esim. pitoisuutena 0,05 - 100 mM, edullisesti 1 - 10 mi'·'!) ; ja DNA-tuottaet erotetaan molekyylipainon multaan alle neljässä 5 vyöhykkeessä geelillä.

Keksintö on myös käyttökelpoinen nukleiinihapon sekvensoimisessa yhdistämällä oiigonukleotidialuke, sekvensoitava nukleiinihappo, yhdestä neljään deoksiribonukleosiditrifosfaattia, edellä kuvatun mukainen 10 polymeraas.i, ja ainakin kaksi ket jupääainetta ex~i määrissä, olosuhteissa, jotka suosivat oligonukleotidialukkeen laajenemista nukleiinhappo-fragmenttien muodostamiseksi, jotka ovat komplementaarisia sekvensoitavaan nukleiinihappoon nähden. Menetelmässä 15 edelleen erotetaan nukleiinihappofragmentit koon mukaan ja määritetään nukeliinhapposekvenssi, Aineet erotetaan toisistaan leiman alukelaajermustuofcteissa intensiteetistä.

Vaikka yleisesti käytetään geelielektroforeesia DNA-s ekvens ointireaktion DNA-tuotteiden erot t ami seksi, 20 alan ammattilaiset huomaavat, että muitakin menetelmiä voidaan käyttää. Täten on mahdollista todeta kukin erilainen fragmentti käyttäen menettelyjä kuten aikapakornas-saspektrometria,: elektronimikroskopia ja yhden molekyylin detektiomenetelmät.

25 Muissa näkökohdissa keksinnön hyödyntäminen käsittää: (a) menetelmän kloonatun DNA-fragmentin in vitro -mutagenisointiin antamalla käyttöön kloonattu fragmentti ja edellä kuvatun mukainen DNA-polymeraasi, saattamalla kloonattu fragmentti kosketuksiin polymeraasin kanssa 30 olosuhteissa DNA-säikeen syntetisoimiseksi fragmentista.:

Olosuhteet saavat aikaan DNA-säikeen - muodostumisen monilukuisen määrän yksittäisiä vierekkäisiä emäksiä, jotka kykenevät muodostamaan emäsparin fragmentin kanssa, inkorporaatiolla ja nukleotidiemäksen inkorporaatiolla, 35 joka ei kykene muodostamaan emäsparia fragmentin kanssa; 2.1 (b) 'menetelmän t emp .1. a a 11 i - DNA -fragmentin In vitro -mutagenisointiin antamalla käyttöön aluke ja templaatti, jolloin alukkeessa on vierekkäisiä emäksiä, jotka kykenevät muodostamaan emäsparin templaatin vierekkäisten 5 emästen kanssa, lukuun ottamatta ainakin yhtä emästä, joka ei kykene muodostamaan emäsparia templaatin kanssa. Menetelmässä laajennetaan aluketta edellä kuvatun mukaisella DNA-polymeraasilla; (c) menetelmän tasapäisen kaksisäikeisen DNA:n tuottamiseksi lineaarisesta DNA-mole-10 kyylistä, jonka 5'-päässä on yksisaikeinen alue. Molekyylin 31-pää on kaksi sä ikeinen eikä siinä ole esiin työntyvää 3' -päätä. Menetelmän mukaan DNA-molekyyliä inkuboidaan edellä kuvatun mukaisella DNA-polymeraasilla, joka vaikuttaa yksisäikeiseen alueeseen tasapäisen 15 kaksisäikeisen DNA-molekyylin tuottamiseksi; (dj menetelmän DNA-fragmentin 3'-pään leimaamiseksi inkuböimaila DNA-fragmenttia edellä kuvatun mukaisella DNA-polymeraasilla ja limatulla deoksinukleotidilajilla olosuhteissa, joissa polymeraasi laajentaa DNA-fragmentin 20 3’-päätä, joka tulee siten leimatuksi leimatun deoksinukleotidin lisäyksellä DNA-fragmenttiin; (e) menetelmän DNA-sekvenssin monistamiseksi juottamalla ensimmäinen ja toinen.; aluke kaksisäikeisen DNA-sekvenssin vastakkaisiin säikeisiin ja inkuböimaila juotettua seosta 25 edellä kuvatun mukaisella DNA-polymeraasilla. Ensimmäinen ja toinen aluke tulevat juotetuiksi DNA-sekvenssin vastakkaisiin säikeisiin siten, että niiden 3'-päät ovat toisiaan, kohti juottamisen jälkeen ja monistettava DNA-sekvenssi sijaitsee kahden juotetun alukkeen välissä.

30 Edelleen muissa näkökohdissa keksintö koskee spe sifisiä DNA-polymeraaseja kuten: Thermus aquablcus DNA-polymeraasi, jossa on tyrosiini tähteenä 667, |h_ call DNA- \ polymeraasi-T, jossa on tyrosiini tähteenä 762, ja mikä j tahansa Pol I -tyypin DNA-polymeraasi, jossa on tyrosii- j 35 nitähde Ek coli DNA-polymeuaasiin nähden analogisessa | 22 asemassa 762, esim. N^ asemassa aminohapposekvenssisä K Kf2 N, N- Ns Nc N, G, jossa kujiin N on muista riippumatta jokin aminohappo, keksintö antaa käyttöön myös nukleiinihapon, joka koodit taa jotain tällaista DNA-polymeraasia.

5 Liittyvinä näkökohtina keksintö· käsittää DNA-poly- meraaseja lukuun ottamatta käänteiskopioijaentsyymi, jolla magnesiumin läsnä ollessa ainoana lisättynä kaksivaienssi-sena kationina on alle 100:n keskimääräinen prosessiivisuus ja joka diskriminoi alle 100 kertaa vastaan ddNMPm 10 inkorporaatiota dNMP:hen verrattuna, tai jolla magnesiumin läsnä ollessa ainoana lisättynä kaksi'vaienssisena kationina on alle 50:n keskimääräinen prosessiivisuus ja joka diskriminoi alle 50 tai 5 kertaa vastaan ddNMP:n inkorporaatiota dNMPihen verrattuna. Alan ammattilaiset huomaa-15 vät, että prosessiivisuus -voidaan mitata· millä tahansa tavanomaisella menettelyllä:, joka osoittaa, että T7-DNA-polymeraasin keskimääräinen prosessiivisuus on ainakin 500, Klenov/-fragment in on noin 4 - 40, ja käänteiskopioi-jaentsyymin on noin 150 - 200. Tällaiset mittaukset voi-2 0 daan suorittaa kuten kuvaavat Tabor et ai. . J. Biol. Chem. | 262 {1987} 16212, joka sisällytetään täten tähän viitteek- | si, Taq-DNA-polymeraasin keskimääräisen prosessiivisuuden odotetaan näissä olosuhteissa olevan ainakin 100.

Erityisen edullisina näkökohtina keksintö käsittää 25 termofiilisiä DNA-polymeraaseja, jotka diskriminoivat esim. magnesiumin läsnä ollessa ddNMP:ta vastaan dNMPihen verrattuna alle tekijällä 1.00, ja joiden keskimääräinen prosessivisuus on edullisesti alle 100, ja jotka kiertävät: yhdestä aluke-templaatista toiseen yli kerran yhdessä tai 30 jopa 10 sekunnissa. Tällaisen kiertäminen voidaan mitata tavanomaisilla menettelyillä..

Keksintöä voidaan hyödyntää myös syklisekvensoinnissa käyttäen edellä kuvatun mukaista DNA-polymeraasia, ja antaa samoin käyttöön solu-35 (vastakkaisesti virus- tai mitokondrio-j DNA- 23 polymeraaseja, joissa on tyrosiini .luonnollisesti esiintyvän aminohapon tilalla asemassa, joka saa polymerassin olemaan diskriminoimatta ddNMPjtä vastaan dNMP:hen verrattuna enempää kuin 50-kertaisesti, S: Muissa näkökohdissa aminohapon substituutio mai nittuihin kohtiin johtaa muutokseen vastaavan luonnollisen polymeraasin muissa ominaisuuksissa. Lisäksi, tämän keksinnön mukaisia polymeraaseja voidaan yhdistää muihin polyme-raaseihin tässä kuvatuissa menetelmissä kunkin polymeraa-10 sin seoksessa hyvien ominaisuuksien hyödyntämiseksi.

Keksinnön muut piirteet ja: edut ilmenevät seuraa-vasta sen edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta ja patenttivaatimuksista .

Kuvaus edullisista suoritusmuodoista 15 .Ensiksi kuvataan lyhyesti piirroksia.

Piirrokset

Kuvio 1 on kaaviollinen esitys DNA-polymeraasin aminohapposekvenssistä, jonka koodittaa bakteriofagin T7 geeni 5, jolloin esityksessä on merkitty kämmen- ja sor-20 midomeenit, sekä erilaisten dideoksiresistenttien (DR) mutanttien sijainnit, A - E merkittyjen alueiden sijainti ja yhden ddUTP-diskriminaatioon liittyvän kohdan sijainti.

Kuvio 2 on kolmiulotteinen esitys DMA-polymeraasi-I:n rakenteesta, jossa näkyvät alueiden A - E sijainnit.

25 Kuvio 3 on kaaviollinen esitys Pol I -tyypin DNA-

polymeraasien riboselektiivisyysalueesta, jossa aminohapot on merkitty yleisellä yksikirj ainkoodilla. Alustava amino-happonumero on merkitty vasemmalla kuviossa ja dideoksi- I

nukleotidien vastaisen diskriminaation määrä verrattuna 30 deoksinukleotideihin on merkitty oikealla.

Kuviot 4, 5 ja 6 ovat kaaviollisia esityksiä, joissa esitetään modifikaatioita riboselektiivisyys-alueesta Ek. col i DNA-polymeraasi-Ilie, T7-DNA-polyme-raasille ja vastaavasti Taq-DNA-polymeraasille.

35 24

Dideokslresisfcenttejä mutantteja

Seuraava on suppea esitys jossain määrin merkittävistä julkaisuista.

Reha-Krantz et ai., "Mutational Analysis of Bac-5 teriophage T4 DNA Polymerase", tiivistelmä posteriesityk-siin, joka esitettiin kokouksessa, jonka nimi on "The Fidelity of DNA Synthesis; Structural and Mechanistic Perspectives", Beaufort, North Carolina, 24. - 29. syyskuuta, 1989, kuvaavat C-päämutantteja, joiden däNTP-käyttö 10 on kasvanut .. Kuitenkin Reha-Krantz et ai. , J, Virology 67 (1993) 60 - 66, mainitsevat, että vaikka Ki ddGTP: 11 e oli 50 kertaa matalampi mutantilla L412M villityypin T4-DNA-polymeraasiin verrattuna, mitään eroa tehokkuudessa ddGTP:n inkorporaatios.sa ei havaittu mutantin ja villi-15 tyyppi-T4 DNA-polymeraasin välillä. Sivulla 63 mainitaan,: että "huolimatta L412M-DNA-polymeraasin herkkyydestä ddGTP:Ile mitään eroa ei havaittu ddNTP:eiden inkorporaatiossa viliityyppi- ja L412M-DNA-polyineraaseille". Siinä mainitaan myös, että "ei vaikuta siltä, että mikään yksit-20 täinen alue olisi ainoa sitoutumiskohta sen paremmin PPi:lie kuin nukleotideillekaan". Lisäksi Reha-karntz ja Nonay, J. Biol. Cliem. 269 (1994) 5635 - 5643, esittävät tutkimuksen mutantista L412M ja muista mutantti-T4-DNÄ-polymeraaseista.

25 Gibbs et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 {1988} 6672 - 6676, ja Larder et ai.. EMBO J. 6 (1987) 169 - 175, kuvaavat mutaatiospekfcriä, joka saadaan herpes-DNA-poly-meraasille valikoitaessa resistenssin suhteen lukuisille nukleotidianaiogellle: pyrofosfaatti, fosfonoetikkahappo 30 ja f os f onomuur ahai sha.ppo, acyclovir, vidarabiini, ganciclovir ja broraivinyylideoksiuridiini. Siinä mainitaan, että monet yhdelle lääkkeelle resistentit mutantit ovat myös resistenttejä muille lääkkeille, jopa kun ne ovat analogeja substraatin eri alueille.

ί | 25

Der s e jät J. Biol. Chen-. 257 (1982} 10251 - 10260, kuvaavat viittä herpes simplex -DNA-polymeraasin mutanttiluokkaa, jotka eristettiin valikoimalla kasvun suhteen fosfonomuurahaishapon läsnä ollessa, joka on py-5; rofosf aatti^ inhibi.it tori. Kunkin, luokan mutanteille he vertaavat resistenssiä ddGTP:Ile (sivu 10256, taulukko 111} . Kaikki nostavat Ki:ta ddGTP:lie 20 - lOÖ-kertaisesti .

Prasad et ai. , Proc. Mäti. Acad'. Sei, OS,A 88 (1991} 10 11363 - 11367, käyttävät suoraa seulontastrategiaa ja osoittavat, että yksittäinen mutaatio HlV-käänteiskopioi-jaentsyymissä (Glu 89:n muuttaminen: glysiiniksi) tekee polymeraasista resistentimmän ddGTPille (vaaditaan noin 10 kertaa enemmän ddGTP:tä saman inhibitioasteen saamiseksi) . 15 Tämä muaafcxo. tuottaa laajan resistenssin lukuisille analogeille, mukaan lukien fosfonomuurahaishappo, joka on pyro-£osfaattianalogi. Vaikka mutantti oli yhtä resistentti ddTTP:lle, ddGTP:Ile ja ddGTP:Ile, se oli paljon vähemmän resistentti ddATP:lle.

20 Song et ajL·, J. Virol. 66 (1992) 7568 - 7571, mu- tagenisoivat ihmisen immuunikatovirustyypin 1 käänteisko-pioijaentsyymin glu-89:n 9 erilaiseksi aminohappotähteeksi ja mittaavat leunkin mutanttientsyymin resistenssin ddGTP:lie ja fosfonomuurahaishapolle, joka on pyrofos-25 faattianalogi. Mutaatiot kuuluvat kahteen luokkaan, Glu- 89:n korvaaminen alaniinilla, glysiinillä, valiinilla tai treoniinilla johti entsyymeihin, jotka olivat hyvin resistenttejä sekä ddGTP:lie että fosfonomuurahaishapolle villityyppientsyymiin verrattuna, kun taas mutagenisointi 30 seriiniksi, glutamiiniksi, asparagiiniksi, asparagiiniha- poksi ja lysiiniksi. johti entsyymeihin, joilla oli vain kohtalainen resistenssi tai ei lainkaan resistenssiä ddGTP:Ile. Mikään mutanteista ei tehnyt entsyymiä vähemmän resistentiksi ddGTP:Ile kuin viilityyppientsyymi (taulukko 35 I, sivu 7569) . Kirjoittajat arvelevat saamiensa tulosten 26 ja käänteiskopiqijaentsyymin kiderakenteen nojalla, että kään t e i s kop x o 1 j aen t syyniin tähteet 89 ja 90 muodostavat osan dNTP - s i t ou tiimi s t a s k us t a.

Julkaisuja, jotka käsittelevät Jk coli DNA-poly-5 meraasi-I-mutanttiproteiinien ominaisuuksia, kun mutaatiot ovat lähellä mutaatiota, joka johtaa ddNTP-seiektiivisyyteen, ovat seuraavat;

Carroll et ai. > Biochemistry 30 (1991) 804 - 813, tutkivat kahta mutanttia: Tyr766Ser ja Tyr766Phe normaa- 10 lien deoksinukleotidien virheellisen inkorporaation osalta. Polesky et ai. , J, Biol. Chem. 265 (1990) 14579 -14591, karakterisoivat mutaatioita, joilla on kaksi eri ominaisuutta: (i) tyrosiini 766, arginiini 841 ja aspara- giini 845; joista kirjoittajat esittävät, että nämä täh-15 teet tapaavat tulevan dNTPtn. (2) Glutamiini 849, arginiini 668 ja asparagiinihappo 882, joista kirjoittajat esittävät, että nämä tähteet osallistuvat katalyysiin. Polesky gt ai. . J. Biol. Chem, 267 (1992) 8417, edelleen karakterisoivat muaatioita arginiinissa 668, glutamiinissa 20 849 ja asparagiinihapossa 882, ja myös mutaatioita aspara giinihapossa 705 ja glutamiinihax^ossa 710. Täsäs tutkimuksessa kirjoittajat tutkivat alfa-tiosubstituoitujen dNTPleiden inkorporaatiota, eli analogeja fosfaattiryhmässä. Pandey et ai, , J. Biol. Chem. 269 81994 ) 13259 - 25 13265 tarkastelevat |h. coli DNA-polymeraasi-l:n kahta mu tant ti a·:, joissa lysiini 758 on vaihdettu alaniiniksi ja arginiiniksi. Kirjoittajat mainitsevat, että Basu et ai., Biochemistry 26 (1987) 1704 - 1709, mainitsevat .samasta, lysiinistä 758 dNTP-sitoutumisessa.. Tämä osoitettiin ke-30 miallisesti; DNA-polyrneraasi-I:tä modifioitiin kovalent-tisesti käyttäen pyridoksaali-S' -fosfaattia-, joka on nuk-leotidianalogi, ja lyslinin 758 sanottiin: olevan modifioitu tähde.

Beese et. ai., Biochemistry 321 (1993) 14 095 - 35 14101,: kuvaavat DNA-polymeraasi-l:n Klenow-fragmentin 27 dNTP: hen tai pyrofosf aattiin kompleksoidun kokristallin rakennetta. Kirjoittajat mainitsevat, että dNTP sitoutuu 0-he.eliksin viereen. Kirjoittajat mainitsevat seuraajaa: (a) "Mg-dCTP-kompieksissa sytosiini on vuorovaikutuksessa 5 His 8:61:n kanssa, kun taas sokeri on vuorovaikutuksessa Phe 764: n kanssa tsic. . 762] (kuviot 3 ja S} . " (b) "Kui tenkin päättelemme, että dNTP:n ainakin dNMP-ryhmän asema, binaarisessa kompleksissa ei todennäköisesti ole sama kuin sen katalyyttisesti oleellisessa kompleksissa aluke-temp-10 laatti-DNÄ:n kanssa." (g) Koska emäksen dNTP sitoutumiskohdan kokonaisuudessaan muodostavat sen Watson-Criek-ve-tysillat templaattisäikeeseen ja sen pakkautuminen aluke-säikeen 3'-emäkselle, ei ole epätodennäköistä, että sitoutumiskohta emäkselle binaarisessa kompleksissa on täysin 15 "kuvitteellinen, mikä sopii havaintoomme siitä, että se: voi sitoutua useisiin kohtiin olosuhteista riippuen." (dj "Binaarisen kompleksin kiteissä dNTP:Ile havaittu sitoutumiskohta on sama kuin liuostutkimuksissa todettu. Kuitenkin ekstrapolointiin tästä binaarisesta kompleksista malliin 20 kompleksille dNTP:n kanssa alukkeen ja templaatti-DNÄ:n läsnä ollessa: edellyttää huomattavaa varovaisuutta. Oletamme, että dNTP:n sokeri- ja emäsryhmä edellyttävät alu-ke-templaatti-DNA:n sitoutumista oikeassa konformaatios-sa." 25 Joyce ja S teit z, Ann. Rev. Bioc. 63 (1994} 777 (jota julkaisua ei myönnetä esillä olevan keksinnön alan aiemmaksi tekniseksi tasoksi), käsittelevät eri DNA- ja RNA-po1ymeraas ien suhdetta. Siinä mainitaan kolme funktiota DNA-polymeraasi-I:n- "kämmen" (paremminkin kuin 30 "sormi"-) aladomeenille - nimittäin katalyyttinen keskus, sitoutumiskohta alukkeen 3'-päälle ja dNTP-sitoutumiskoh-ta. HIV-1-käänteiskopioij aentsyymistä se mainitsee, että mutaatiot, jotka vaikuttavat DMA-polymeraasi-inhibiittorien sitoutumiseen, ovat tähteiden 67 - 70 ympärillä. Sii-35 nä mainitaan myös, että "vaikka mitään hyödyllisiä johto- 28 päätöksiä ei voitu vetää sokerin nukleotidiemäksen asemista, on mahdollista, että kiteinen binaarikompleksi voi sisältää: tietoa Klenow-fragmentin ja dNTP-fosfaattiryhmien välisten kontaktien identifioimiseksi." Edeltävässä kappa-5 leessa siinä mainitaan, että "vaikka voidaan muodostaa polymeraasi-dNTP-binaarikompleksi, tällainen kompleksi ei ole katalyyttisenti pätevä." Siina mainitaan edelleen, että tulostiedot "sijoittaisivat deoksiriboosin lähelle Phe 762:ta" ja että "Tyr 766:n (Klenow-fragmentin O-hee-10 liksissä) imitaatio, joka sijaitsee sormidomeenissa malli-rakennetun tmeplaattisäikeen läheisyydessä, vaikuttaa deoksi- ja dideoksinukleotidisubstraattien väliseen diskriminaatioon ..." Kuitenkin siinä mainitaan myös, että "Klenow-fragmentissa mutaatiot, joiden on todettu vaikut-15 tavan dNTP:n sitoutumiseen ternaarisessa kompleksissa [mikä heijastuu arvossa] , sijaitsevat polymeraasi- loven yhdellä puolella sormialadomeenissa tai lähellä sitä. Tähän mennessä identifioidut asemat käsittävät hee ·· liksin Q N-pään (Arg 841 ja Asn 845), heeliksin O paljaan 20 puolen (Tyr 766, Phe 762 ja Ärg 754) ja viereiset tähteet lähempänä katalyyttistä keskusta (Asp 705 ja Glu 710) ...

Kineettisen lähestymistavan etu on, että se seuloo ter-naarista kompleksia; kuitenkin kuten edellä mainittiin, on mahdotonta muun rakenteellisen todistusaineiston puuttues-25' sa erottaa suoria vaikutuksia tempiaattivuorovaikutusten välittämistä. Lisiksi edellä mainitut sivuketjut käsittä- ! vät dMTP-molekyyliä paljon suuremman alan, minkä vuoksi ne kaikki eivät voi olla siihen suorassa kosketuksessa. Koska näihin tutkimuksiin liittyvän Klenow-fragmenttialueen ar-30 vellaan olevan mittavassa kosketuksessa templaattisäikee-seen, kohtuullinen tulkinta on, että edellä mainittujen tähteiden alaryhmä on suorassa kosketuksessa dNTP:hen loppujen sitoessa templaatti-DNA:ta."

Pelletier et ai. . Science 264 1891, ja Sawaya et 35 ai. , Science 264 (1994) 1930 (ei myönnetä oheisten pa- 29 tenttivaatimusten alan aiemmaksi tekniseksi tasoksi), sitä vastoin mainitsevat, että tähteet 271 ~ 274 Polficn heelik-seissä M - N (jotka ovat analogisia Klenow-heelikseihin J - K) "suorittavat yhteisen funktion, nukleotidien dis -5 kriminaation."

Sousa et ai. . Nature 364 (1993) 593 (ei myönnetä oheisten patenttivaatimusten alan aiemmaksi tekniseksi tasoksi), kuvaavat T7-RNA-polymeraasin kolmiulotteista rakennetta ja sen homologiaa Ek coli DNA-polymeraasi-Ireen 10 nähden. He mainitsevat, että heidän havaintonsa viittaavat siihen, että 11KF: n [Kl enow-fragmentti] C-pääelementit (b~ säie 14 [tähteet 916 - 928] ja C-pää) ovat kosketuksissa dNTP:n deoksiriboosiryhmään polymer!säätiön aikana rNTP -ja dNTP^substraattien väliseksi diskriminoimiseksi." 15 Dideoksinukleosidit kuten dideoksitymidiini ovat

T7-fagikasvun tehokkaita inhibiittoreita. Kokeet osoittavat, että DMA-synteesin inhibitio on seurausta dideoksi-nukleotidin inkorporaatiosta T7-DNAthan. Dideoksinukleo- I

sidit eivät ole inliibitorisia ei-tartutetulle Ek_ colille. ΐ 2 0 Emme tiedä selitystä· Ek. coli DNA-synteesin inhibition puuttumiselle, mutta se voitaisiin selittää soluotolla, korkealla diskriminaatiotasoila vastaan niiden inkorpo-raatiota Ek. coli DNA-poIymeraasi-IIItlla, tehottomalla fosforylaatiolla trifosfaatiksi tai tehokkaalla poistolla.

25 Joka tapauksessa toteamme, että T7-mutanttifageja, jotka voivat muodostaa normaaleja plakkeja dideoksinukleosidejä sisältäville agar-maljoille, syntyy tiheydellä noin 10'3.

Monien näistä mutaatioista: sijainti esitetään kuviossa 1.

Ne ovat geeni-5-proteiinissa. Mutanttigeeni-5-proteiinit 30 ovat diskriminatorisempia (muutama kertaisesti) ddNTP:eitä vastaan kuin natiivi geeni-5-proteiini. Jotkut tämän mu-tanttiluokan jäsenet voivat rajata polymeraasin sen alueen, joka on tärkeä dNTPrn riboosiyfesikön tunnistuksessa .

30

On tärkeätä huomata, että tällä valikoinnilla dldte-oksinukleotIdejä käyttäen saadut mutaatiot perustuvat muutokseen geeni-S-proteiinialueella, joka tunnistaa riboosi-ryhmän. kuitenkin on mahdollista, että tällaisilla mutaa-5 tioilla on myös dramaattisia vaikutuksia muihin nukleotidi analogeihin. Lisäksi on mahdollista käyttää samaa menettelyä muiden T7-mutanttien suhteen valikoimiseksi, jotka diskriminoivat voimakkaasti vastaan muita nukleotidianalo-geja, fagikasvun perusteella muiden analogien läsnä .oiles -10 sa.

Taulukossa I mainitaan erilaisia DR-mutantteja taulukkoon merkittyine aminohapposubstituutioineen. Ami-nohapposubstituutiota karakterisoidaan edelleen taulukon oikeanpuoleisessa osassa. 'Häiden mu.tantt.ien sijainti esi-15 te tään kuviossa I kautta T7-DNÄ:-polymeraasin kämmen- ja sormialueiden. Peukaloalue on joustava alue, joka on vuorovaikutuksessa vähäisen loven kanssa tuotedupleksi-DNÄ:ssa; kämmenalue on katalyyttinen keskus, sitoutumiskohta alukkeen 3'-päälle, ja se myötävaikuttaa dNTP-si-20 toutumiseen; sormialueet ovat vuorovaikutuksessa templaa-tin kanssa lähellä synteesikohtaa ja myötävaikuttavat dNTP-sitoutumiseen. Nämä mutantit ovat hyvin hajallaan kautta polymeraasin ja kaikilla on suhteellisen vähäinen vaikutus dideoksinukleotidien inkorporaatioon niiden las-25 kiessa kykyä inkorporoida dideoksinukleotidi vain 5 - 20-kertaisesti. Lisäksi jotkut näistä mutanteista sijaitsevat suhteellisen epähomo1ogian alueilla DNA-polymeraasi-1:een nähden. Täten ne eivät anna osoitusta kohtien sijainnista muissa ddNTP-diskriminaatioon liittyvissä Pol I -entsyy-3 0 meissä.

31

Taulukko 1

Yhteenveto T7-DNA-polymeraasidideoksires13tenteistä mut an --teista

Mu- Iso- Modifikaatio tantti laatti-nro DRl I Ala 425 Thr hydrofobinen, polaarinen DR2 1 Phe 434 Ser hydrofobinen, polaarinen

Gly 442 Ser hydrofobinen, polaarinen DR3 1 Vai 443 He hydrofobinen, hydrofobinen DR4 2 Arg 444 His voimakas emäs, heikko emäs •DR5 1 Arg 444 Cys voimakas emäs, neutraali, polaarinen DR6 3 Sei” 477 Phe polaarinen, hydrofobinen DR7 4 Asp 504 Asn emäksinen, neutraali DR6 2 Ala 513 Thr hydrofobinen, polaarinen DR9 2 Thr 517 Ile polaarinen, hydrofobinen DR10 1 Ala 532 Ser hydrofobinen, polaarinen DR11 1 Arg 566 Cys voimakas emäs, neutraali, polaarinen DR12 1 Ala 619 Thr hydrofobinen, polaarinen DR.13 3 Ala 700 Thr hydrofobinen, polaarinen 5 i

Yhteenveto 7 hydrofobinen, polaarinen 3 voimakkasti emäksinen, neutraali, polaarinen tai heikosti emäksinen 10 2 polaarinen, hydrofobinen 1 hydrofobinen, hydrofobinen

In vitro -mutagenisoinfci TV: n kloonatun geenin 5 in vitro -mutagenisointia 15 käytettiin geeni-5-proteiinien rakentamiseksi, joissa E. coli DNA-polymeraasi-I:n eri alueita sijoitettiin analogisten tai homologisten alueiden 77-geeni-5-proteiinissa 32 tilalla. Kuten on mainittu, olimme erityisen kiinnostuneita näiden entsyymien kyvyn inkorporoida nukleotidianaloge-ja määrityksestä ja siitä, missä määrin ne diskriminoivat vastaan näitä analogeja. Kuviossa 2 alueet, joilla T7-DNA-5 polymeraasin ja Et coli DNA-polymeraasi-I:n välisiä hybridejä muodostui, on esitetty merkittyinä alueiksi A - E.

Kuviossa 3 hakija on määrittänyt, että alue C antaa käyttöön riboselektiivisyysalueen, jolla on huomattavasti suurempi vaikutus kuin muilla alueilla polymeraasissa, 10 Jotkut näistä muista alueista on spesifisesti merkitty kuvioon 3.

Kuvioissa 4 - S (ja taulukossa 2) määritettiin, että aminohappojen substituutio tällä alueella mahdollisti polymeraasin r ibosel ekt i.i. vi syyden muutoksen Sh. coli DNA 15 Pol I -tyypistä T7-DNÄ-polymeraasityypiksi ja päinvastoin.

Täten Pol I -tyypin polymeraasien tämän alueen kohdennetulla mutagenisoinnilla polymeraasin riboselektiivisyyttä voidaan merkittävästi muuttaa. Vaikutustaso on ainakin 50 - 100 -kertainen, ja yleensä yli 500-kertainen.

2 0 DNA-polymeraasit Tässä keksinnössä käyttökelpoisia DNA-polymeraaseja ovat ne, jotka kuuluvat homologisten polymeraasien luokkaan nimeltä "Pol I -tyypin DNA-polymeraasit" mukaan lukien T7-tyypin DNA-polymeraasit, Eh_ coli DNÄ-polymeraasi-25 I:ii suuri fragmentti ja Taq-polymeraasi.

Tässä keksinnössä käyttökelpoisia DNA-polymeraaseja ovat ne, jotka kuuluvat homologisten polymeraasien luokkaan mukaan lukien T7-tyypin DNA-polymeraasit (kuten T7, T3, QI, QII, H W31, gh-1, Y, AI122 tai SP6). Homologisilla 30 polyraeraaseilla tarkoitetaan sellaista entsyymiä kuten Delaruen et ai., Protein Engineering 3 (19-90) 461 - 467, kuvaamat, joka osoittaa Pol I -ryhmän DNA-polymeraasien rinnanasettelua. Se osoittaa myös säilyvien sekvenssimo-tiivien kuudesta eri ryhmästä polymeraasej a rinnanasette-35 lua: DNA-polymeraasit Pol I -, Pol-alfa- ja Pol-beta-ryh- t 33 niistä, DNA- riippuvaiset KNA-polymeraasit, käänteiskopioi-jaeiitsyymit ja RNA-riippuvaiset RNA-polymeraasit; heidän tuloksena viittaavat siihen, että muutama tähde säilyy kaikissa polymeraaseissa. Heidän rinnanasettelunsa mukaan 5 (kuvio 3, sivu 463) tässä identifioitu selektiivisyystähde (fenyylialani ini 762 Ek coli DNA-polymeraasi-I:ssä) on "motiivissa B". DNA-polymeraasien Pol I -ryhmän lisäksi motiivi B tavataan DNA-polymeraasien pol-alfa-ryhmässä ja DNA-riippuvaisten RNA-polymeraasien. T7-ryhmässä; täten 10 tämä rinhänasettelu viittaa voimakkaasti niihin tähteisiin , j otkä tuli s i mutageni soi da näi s s ä.

Taulukko 2

Domeenivaihtojen Ek coli DNA-polymeraasi-I:n, T7-15 DNA-polymeraasin ja Taq-DNA-polymeraasin välillä vaikutus heeliksin G puitteissa ddNTP-vastaiseeh diskriminaatioön.

Näiden kolmen polymeraasin sekvenssi esitetään ylhäällä mainiten ensimmäisen tähteen järjestysluku. Konsensus-sekvenssin alapuolella näille kolmelle polymeraasille esite-2 O: tään mutant it, jotka karakterisoidaan T 7 - DNA - pol yme r a a s ik - si (T7} , Ek, coli DNA-polymera.asi-1: ksi (Pol) ja Tag-DNÄ-polymeräasiksi (Tag) , jolloin mutagenisoidut tähteet on ai leyi ivattu. Testattiin kurikin mutant in suhteellista ddMP-inkörporaationopeutta dNMP:hen verrattuna SDS-aktii-25 visuusgeeliähalyysillä kuten kuvataan esimerkissä 2 ja mainitaari oikealla. Mu tantit T7 C-T8:, Pol 1 C-K6 ja Taq C-Q5 puhdistettiin villityyppiproteiiiiieh ohella jatko-analyysiin.

30 Entsyymi Sekvenssi Diskriminaatio

Pol I 754 r R S A K A I N F G h I Y G korkea

Taq 658 R R A A K T I N F G V L Y G

Ί"7 517 R D jj ä K T F I V G F L Y G

Konsensus R A K G Y G i 34 T7 WT RDNAKTFIYGFLYG matala T7 C-T2 R S_£ A K A I N F G kJl Y G korkea T7 C-T3 R E__£ ÄKTFIYGFLYG matala T7 C-T4 R D N A K A I KT F G F L Y G korkea T7 C-T5 R D K A K &_J. I Y G F L Y G matala T7 C-T6 R D N A K T F HJE G F L Y G korkea T7 C-T7 RDRAKTFHYGFLYG matala T7 C-T8 RDNAKTFXZGFLYG korkea

Pol I MT RRSAKAINFGLIYG korkea

Po! I OKI R A K T F I Y G Y G matala

Pol I C-K2 R R S A K T F I Y GLIYG matala

Pol I C-K3 R R S A K .XJE N F G 1 I Y G korkea

Pol I C-K4 R R S A K A I I Y GLIYG matilla

Pol I C-K5 RRSAKAIIF GLIYG korkea

Pol I C-K6 RRSAKAINFGLIYG matala

Tag WT RRAAKTINFGVLYG korkea

Taq C-Ql R A K T I N F G V L Y G korkea 30

Tag C-Q2 R R A A K T ZJLX G £ L Y G matala

Tag C-Q3 R R A A K T I £_£ G V L Y G matala

Tag C-Q4 RRAAKT11FGVLYG korkea

Tqa C.-Q5 RRAÄXTINSGVLYG matala 4 0 t 35

Spe s if isyystähde muissa polymeraasiryhmissä, joihin lukeutuvat T4-DNÄ-poly~ meraasi, herpes DNA-polymeraasi, Q29-DNA~poiymetaasi, 5 vent-DNA-polymeraasi ja Pfu-DNA-polymeraasi.

Lisäksi Joyce, Current Opinion in Structural Biology 1 SISSI) 123 - 129, vertaa DMA-sekvenssejä monista polymeraaseista, ja esittää, että pieni lukumäärä tärkeitä aktiivisen kohdan tähteitä säilyy. Erityisesti käsitellään 1:0 samankaltaisuuksia pol X -ryhmän (T7, pol I, Taq) ja pol alfa: -ryhmän (T4, Q25, herpes): polymeraasien välillä. Kuviossa, 1 (sivu 124:) Joyce: mainitsee viiden näissä kahdessa ryhmässä tavatun muuttumattoman tähteen asemat; niihin lukeutuvat lysiini 75B, tyrosiini 766 ja glysiini 767; 15 nämä ovat kaikki hyvin lähellä tässä identifioituun selek-tiivisyystähteeseen fenyylialaniini 762.

Näitä polymeraaseja käytetään DNA-sekvensointi- j x-eaktiossä olosuhteissa, joissa ne edullisesti tuottavat j likeisiä, intensiteetiltään suunnilleen yhtenäisiä nauhoja i 20 (noin 1,5 - 2,0-kertäinen vaihtelu intensiteetissä} ajet- j taessa sekvensointireaktiotuotteet geelissä. "Likeisen" ]

tarkoitetaan kattavan nauhat, jotka edustavat DNA-tuotte!- I

ta, jotka molekyylipainoltaan poikkeavat niinkin paljon kuin 6 000, eli 20 emästä. Tämän intensiteetin tosiasia!-25 linen arvo laskee geelin pituuden mittaan kuten kuvaavat Tabor ja Richardson, supra. Nauhaintensiteetti heijastaa DNA-tuotteiden lukumäärää tietyssä nauhassa. Leimoja kuten fluoroforit tai radioisotoopit käytetään helposti todettavan intensiteettinauhan tuottamiseksi, joka heijastaa täl-30 laisten DNA-tuotteiden lukumäärää. Täten tässä keksinnössä likeiset nauhat, jotka saadaan yhdestä sekvensointireak-tiosta yhdellä ketjupääaineella, käsittävät likimäärin saman lukumäärän DNA-tuotteita ja täten niiden nauhaintensiteetti on yhtenäinen. Sekvensointiolosuhteisiin kuu-35 luu polymeraasin inkubointi spesifisten kaksivalenssisten 36 tai koImivalenssisten kationien läsnä ollessa kuten mangaani {II ja III), rauta(2)- ja rauta(3)-ionit; yksiva-lenssisia ja kaksivalenssisiä kationeja, joilla ei ole todettavaa vaikutusta tai jotka ovat tuhoisia DNA-syntee-5 sille, ovat: K, Ha, Ba, Be, Ca, Cc, Cr, Co, Cu, Hi, Si ja Zn> Anioni on vailla merkitystä, esimerkiksi kloridi, ase-taatti ja sulfaatti sopivat. Häissä olosuhteissa vaatimusta ketjupääaineista kuten dideoksinukleosidit voidaan laskea useakertaisesti tämän keksinnön mukaisille entsyytneil-10 le. Tämä liuos voi sisältää myös kelatoivaa ainetta saatavilla olevien kaksivalenssisten metalli-ionien pitoisuuden säätelyssä avustamiseksi. Esimerkiksi voidaan käyttää sit-raattia tai isosit.raattia. Häiden kelaattien arvellaan: pitävän esimerkiksi vapaiden mangaani-ionien tason pitoi-15 suudessa 10 - 100 mM laajalla mangaanipitoisuusalueella.

Toisin sanoen kelatoiva aine toimii puskurina.

Tämän keksinnön mukaiset DHA-polymeraasit eivät diskriminoi 'merkittävästi dideoksinukleotidianalogien ja deoksinukleotidien välillä DHA-templaatin pituudella. Toi-20 sin sanoen nämä polymeraasit eivät kykene diskriminoimaan merkittävästi nukleotidin, jolla on 3'-hydoksyyliryhmä, ja nukleotidi, jolla sitä ei ole (eli jolla on kaksi vetyä riboosin 3'-asemassa) , välillä. Kuitenkin nämä polymeraasit voivat diskriminoida vastaan modifikaatioita muissa 25 asemissa nukleosideissa jopa mangaanin tai raudan läsnä ollessa. Esimerkiksi polymeraasit voivat diskriminoida vastaan joitakin dideoksimikleotidianalogeja, joihin on kiinnittynyt fluoresoivia ryhmiä, deoksinukleotideihin verrattuna. Kuitenkaan polymeraasit eivät diskriminoi eri 30 määrässä naapuri-, tai läheisissä, nukleotideissä modifi kaation dideoksinukleotidiin läsnäolon tai puuttumisen perusteella. Täten vaikka ne diskriminoivat voimakkaasti vastaan näitä analogeja vaatien korkeita pitoisuuksia DNA-sekvensointireaktioon ei-modifioituihin dideoksinukieosi- j 37 deihin verrattuna likeisten nauhojen intensiteetti on silti yhtenäinen.

Täten tämän keksinnön mukaiset polymeraasit tarjoavat ketjupääaineiden inkorporaation yhtenäisen tehok-5 kuuden, vaikka ne diskriminoivat vastaan kokona!sinkorpo-raatiota. Lisäksi muut tämän keksinnön mukaiset polyrae-raasit antavat yhtenäisempiä nauhoja fluoresoivilla ddHTP:eillä kuin vastaava luonnollisesti esiintyvä entsyymi, vaikkakaan ei yhtä yhtenäisiä kuin ei~leiraatuilla 10 tai radioaktiivisestx leimatuilla ddiJTP.eiXlä* Tässä keksinnössä käyttökelpoisia ketjupääaineita ovat dideoksinukleosidit, joilla on 2' , 31-dideoksirakenne. Muita keksinnössä käyttökelpoisia aineita ovat aineet, jotka kykenevät spesifisesti päättämään DNA-sekvensointi-15 reaktion spesifiseen emäkseen, ja joita vastaan polymeraa-si ei diskriminoi edeltävissä olosuhteissa.

Sen määrittämiseksi, onko jokin nimenomainen DNA-polymeraasi yhdistettynä johonkin nimenomaiseen ketjupää-aineeseen tai sekvensointireaktioseoksen muuhun kompo-20 nenttiin käyttökelpoinen tässä keksinnössä-, suoritetaan tavanomainen sekvensointireaktio kuten kuvaavat Tabor ja Richardson, supra, ja tarkastellaan nauhamuodostuksen laajuutta ja likeisten nauhojen yhtenäisyyttä sekvensoin-tigeelissä. Jos polymeraasireaktio ei laajenna aluketta 25 ainakin 20 emäksellä, se ei sovellu käytetyissä olosuhteissa. Viereisten nauhojen yhtenäisyys, joka on 2-kertaisen puitteissa tai alle, on käyttökelpoinen tässä keksinnössä, edullisesti yhtenäisyys on 1,0 - 1,5-kertainen. Vastaavasti optimaalisen kationipitoisuuden tai muiden 30 keksinnössä mahdollisesti käyttökelpoisten kationien mää ritys suoritetaan käyttämällä tätä sekvensointireäktiota eri olosuhteissa. Esimerkiksi kationeja testataan alueella 0,005 - 100 mM, Esimerkki tällaisesta kokeesta seuraa:

Kyky inkorporoida jotain tiettyä ddNMP:ta verrat-35 tuna vastaavaan dNMPihen mille tahansa tietylle entsyymi1- 38 le mitataan ddNTP/dNTP-suhteena, joka tarvitaan DNA-synteesin mahdollistamiseksi, joka päättyy tietyllä alueella, todettuna nauhoja tuottavana, jotka eivät ole suurempia kuin jokin kiinteä molekyyli-paino. Toisin sanoen reaktios-5 sa tuotetut nauhat päättyvät spesifioidulla alueella sekvensointi-geelissä-. Täten jos yksi entsyymi diskriminoi 1 000 kertaa voimakkaammin vastaan tiettyä ddNTP:tä verrattuna muuhun entsyymiin, vaaditaan 1 000 kertaa korkeampi ddNTP/dNTP-suhde nauhojen saamiseksi, jotka päätty-10 vät vastaaviin kohtiin samalla geelialueella.

Eksonukle aas iakt iivisuus keksinnön mukaisilla DNA-polymeraaseilla on edullisesti alle 50 %, edullisesti alle 1 %, ja edullisimmin alle 0,1 %, eksonukleaasiaktiivisuuden normaalista tai 15 luonnolliseen liittyvästä tasosta (aktiivisuuden määrä polymeraasirnolekyyliä kohden). Normaalilla tai luonnolliseen liittyvällä tasolla tarkoitetaan esim. ei-modifioidun T7-tyypin polymeraasin eksonukleaasiaktiivisuutta. Normaa listi liittyvä aktiivisuus on noin 5 000 yksikköä eksonuk-20 leaasiaktiivisuutta kohden milligrammaa polymeraasia mi tattuna kuten alla kuvataan modifikaatiolla Chasen ej: ai. menettelystä [J. Biol. Chem. 249 (1974) 4545] . Eksonukle- aasit lisäävät DNÄ-synteesiuskollisuutta leikkaamalla mahdolliset vastasyntetisoidut emäkset, jotka ovat muodosta- ! 25 neet virheellisen emäsparin templaattiin. Tällaiset liittyvät eksonukleaasiaktiivisuudet voivat olla tuhoisia DNÄ-sekvensaintireaktioiden laadulle. Ne nostavat nukleotidi-prekursorien sitä: minimissään vaadittua pitoisuutta, joka on lisättävä reaktioon, sillä kun nukleotidipitoisuus las-30 kee, polymeraasiaktiivisuus hidastuu eksonukleaasiaktiivi- suuteen verrattavaan nopeuteen, mikä johtaa nolla-netto-DNA-synteesiin, tai jopa syntetisoidun DNA:n hajoamiseen.

Mikä merkittävämpää, liittyvä eksonukleaasiaktii-visuus voi saada DNA-polymeraasin viipymään templaatti-3 5 alueilla.,: joissa on sekundaarirakenne-esteitä. Kun poly- 39 meraasi lähestyy tällaista rakennetta, sen synteesinopeus laskee sen pyrkiessä ohitukseen. Liittyvä eksonukleaasi leikkaa vastasyntetisoidun DNA:n polymeraasin pysähtyessä.

Seurauksena tapahtuu lukuisia synteesi- ja leikkaussykle-5 jä. Tämä saattaa johtaa siihen, että polymeraasi lopulta syntetisoi hiusneulan ohi {ilman tuhoa sekvenso i n t i reak ~ tion laadulle) ; tai polymeraasi voi irrota syntetisoidusta säikeestä (mikä johtaa valenauhaan samassa asemassa kaikissa neljässä sekvensointireaktiossa); tai ketjupääaine 10 voi tulla inkorporoiduksi korkealla tiheydellä, mikä tuottaa laajan vaihtelevuuden eri fragmenttien intensiteetissä sekvensöintigeelissä. Mäin tapahtuu, koska ketjupääaineen inkorporaation missä tahansa tietyssä kohdassa tiheys kasvaa mahdollisuuksien lukumäärän mukana, jotka polymeraa-15 silla on inkorporoida ketjupäähukleotidi.

Ihanteellinen sekvensointireaktio tuottaa fragmentteja, jotka antavat intensiteetiltään yhtenäisiä nauhoja kautta geelin. Tämä on oleellista röntgenfilmin optimaalisen valotuksen saamiseksi kullekin radioaktiivi-20 selie fragmentille. Jos radioaktiivisten nauhojen inten- I

siteettä vaihtelee, heikommat nauhat voivat jäädä toteamatta. Kaikkien fragmenttien yhtenäisen radioaktiivisen intensiteetin saamiseksi DNA-polymeraasin tulisi viettää sama aika DNA:n kussakin asemassa, jolloin se ei suosi 25 nukleotidien sen paremmin lisäystä kuin poistumistakaan jossain tietyssä kohdassa. Mäin tapahtuu, jos DNA-polyme-raasista puuttuu liittynyt eksonukleaasi siten, että sillä on vain yksi tilaisuus inkorporoida ketjupääaine kussakin kohdassa templaatin pituudella.

3 0 Lyhyet alukkeet

Keksinnön mukainen DMA-polymeraasi kykenee edullisesti käyttämään 10 emäksen tai alle alukkeita sekä pitempiä, edullisimmin 4 - 20 emästä, esim. 6 emästä (joita voidaan käyttää kolmen ryhmissä 18-meeriekviva1entin muo-35 dostamiseksi). Kyky käyttää lyhyitä alukkeita tarjoaa lu~ | | 40 kuisia merkittäviä etuja DNA-sekvensointi in. Lyhyemmät alukkeet ovat halvempia ja helpompia syntetisoida kuin tavalliset 17-meerialukkeet. Ne myös tulevat nopeammin juotetuiksi komplementaarisiin kohtiin ÖNÄ-templaatilla 5 nopeuttaen siten sekvensointireaktiota. Edelleen kyky käyttää pieniä (esim. 6 tai 7 emästä} oligonukleotidi-alukkeita DNA-sekvensointiin mahdollistaa muutoin ei mahdollisia strategioita pitkien DNA-fragmenttien sekvensointiin. Esimerkiksi voitaisiin muodostaa pakkaus, 10 joka sisältää 80 - 4 000 satunnaista heksameeriä, joista mikään el ole komplementaarinen mihinkään kohtaan kloonausvektorissa. Tilastollisesti yksi 80 heksameerisekvenssistä esiintyy keksimäärin joka 50. emäs sekvensoitavan DNA-fragmentin pituudella. 3 000 emäksen 15 skevenssin määritys vaatisi vain viisi sekvensointisykliä.

Ensiksi käytettäisiin "yleis"-aluketta (esim. New England Biolabs #1211, sekvenssi 5' GTAÄÄAEGAACGGCCAGT 3') noin 6.00, emäksen sekvensoimiseksi .insertin yhdessä päässä.

Käyttäen tuloksia tästä sekvensointireaktiosta 20 pakkauksesta noukittaisiin uusi aluke, joka on homologinen alueeseen nähden lähellä määritetyn sekvenssin päätä.

Toisessa: syklissä määritettäisiin seuraavien {500 emäksen sekvenssi tätä aluketta käyttäen. Toistamalla tämä menetelmä 5 kertaan määritettäisiin 3 000 emäksen 25 täydellinen sekvenssi tarvitsematta alakloonausta, ja | ilman minkään uusien oligonukleotidialukkeiden kemiallista synteesiä. Tällaisten lyhyiden alukkeiden käyttöä voidaan tehostaa sisällyttämällä sekvensointireaktioon T7:n geeni :2:.5 - ja geeni 4 -proteiini.

30 Mutagenisointi in vitro

Polymeraasigeenien mutagenisointi - suoritettiin käyttäen tavanomaisia PER-tekniikoita (katso alla)* d&NTP-vastainen diskriminaatio

Magnesiumin läsnä ollessa ainoana kaksivalenssisena 35 kationina T7-DNA-polymeraasi diskriminoi noin 3 - 4-ker- 41 taisesti ddNTP:eit.ä vastaan, joka on vähemmän kuin millään muulla tunnetulla polymeraasilla. Lähimmäksi pääsee kään-teiskopioijaentsyymi, joka diskriminoi noin 10 - 50-ker taisesti ddNTP: eitä vastaan (3 - 10 kertaa enemmän kuin 5 T7-DNÄ-polymeraasi). Näiden kahden jälkeen kaikki muut tunnetut DNA-polymeraasit, joita kirjallisuudessa karakterisoidaan, diskriminoivat ainakin 100-kertaisesti ddNTP:eitä vastaan, ja usein 10 OOO-kertaisesti ta,i .eneni-män, 10 Mangaanin läsnä ollessa diskriminaatio T7-DNA-po- lymeraasin ja coli DNA-poIymeraasi-T:n toimesta laskee; T7-DNÄ-pQlymeraas.in kohdalla se laskee 3,7:stä 1:een, ja Έ. coli DNA-polymeraasi-I mi kohdalla se laskee 5:5 0 :stä 3,9:äin (ddATP:n suhteen). Hakija on ensimmäinen antamassa 15 käyttöön DNA-polymer aa s in., jolla magnesiumianien läsnä ollessa ainoina kaks ivalens s isinä kationeina on prosessiivisuus alle 100 (määritellään laajennuksen keskimääräiseksi pituudeksi jostain tietystä alukkeesta ennen irtoamista aluke-templaatista; käänteiskopioijaentsyymin tämän maäri-20 telmän mukainen prosessiivisuus on noin 150 - 200, ja T7-PNA-polymeraasin prosessiivisuus on suurempi kuin tämä) ja joka diskriminoi alle 100-kertaisesti ddNMP:n inkorporaa-tiota vastaan. Sitä vastoin useimmat tunnetut DNA-polymeraasit, kuten Taq, joiden prosessiivisuus on alle 100, 25 diskriminoivat yli 100-kertaisesti ddNMP:n inkorporaatiota vastaan.

Aiemmin uskottiin, että kun polymeraasit, joiden prosessiivisuus on korkea, kuten T7-DNA-polymeraasi, pysyvät sidottuina aluke-templaattiin aina usean minuutin 30 ajan, polymeraasit, joiden prosessiivisuus on alhainen, kuten EL. coli DNA-polymeraasi-I, kiertävät -yhdestä aluke-templaatista toiseen aina joka 2. - 3. sekunti (tai yli 100 kertaa tiheämmin). Katso esimerkiksi Tabor et ai. , J. Biol. Chem. 26:2 (1987) 16212 - 16223. Vaikka prosessiivi- 35 suus on edullista DNA-sekvensointiin, kuten laskiessaan ei 42

Videoksi-inkorporaatiosta johtuvien päätteiden aiheuttamaa taustaa,: hidas kiertoaika on haitta. Esimerkiksi jos polymeraasi irtoaa spesifisten sekvenssien kohdalla, seurauksena on voimakkaita valenauhoja sekvensointigeeliin, ellei 5 polymeraasia ole läsnä suuri ylimäärä. Toisaalta polyme-raasin kanssa, joka kiertää nopeasti, voidaan käyttää paljon vähemmän polymeraasia, sillä yksi yksittäinen entsyy-mimplekyyli ulottuu moneen eri alukkeeseen sekvensointi-reaktion aikana, ja jollain tietyllä alukepäällä on mah-10 dollisuus laajentua monilla eri polymeraasiffiplekyyleillä, mikä laskee voimakkaiden spesifisten pysähdysten esiinty-mistodennäköisyyttä

Kuitenkin en parempi, että polymeraasi, joka kiertää nopeasti, myös inkorporoi dcMNlP:eitä tehokkaasti in-15 tensiteeltiltään: yhtenäisten nauhojen saamiseksi ja ddNTP; e iden vähäisemmän käytön mahdollistamiseksi. Samoin edullisesti tällaisella polymeraasilla on matala tai ei lainkaan eksonukleaasiaktiiivisuutta, ja lisätään pyro-fosfataasia nauhojen hajoamisen pyrofosforolyysin vaiku-20 tuksesta: estämiseksi.

Niinikään edullisesti DNA-sekvensointireaktiot pystytään suorittamaan käyttäen magnesiumia ainoana kak-sivalenssisena kationina (eli mangaani puuttuu}. Ensiksi polymeraaseilla on taipumus olla vähemmän aktiivisia man-25 gaanin kanssa magnesiumiin verrattuna [katso esimerkiksi

Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 4076 ~ 4080]. Toiseksi vaikka polymeraaseilla on taipumus olla aktiivisia laajalla magnesiumpitoisuusalueella, on olemassa hyvin terävä, matala optimaalinen mangaanipitoi-30 suus, joka tarvitaan useimmissa tapauksissa optimaaliseen aktiivisuuteen (id.). Lisäksi optimaalisessa mangaanipi-toisuudessa on paljon vähemmän vaikutusta ädNTP-vastaisen diskriminaation vähennykseen kuin paljon korkeammissa pitoisuuksissa, joissa polymeraasi on paljon vähemmän ak-35 tiivinen. Kolmanneksi mangaani ei ole yhtä kätevä metalli- 43 ioni pakkaukseen sisällytettäväksi; se muodostaa helposti sakkoja, erityisesti korkeilla pH-arvoilla. Neljänneksi ei ole selvää, onko mangaani tehokas metalli-ionina ddNTP-vastai-sen diskriminaation laskemiseksi millään termofiili-5 sellä polymera&silla (eli korkeammissa lämpötiloissa).

Ennen esillä olevaa keksintöä mainitsimme [Tabor ja Richardson, Proe . Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 4076 - 4080], että diskriminaation ja prosessiivisuuden välillä oli korrelaatio: 10 "DNA-polymeraasi-I:llä on alhainen prosessiivisuus sen irrotessa alle 10 nukleotidin inkorporaation jälkeen.

On olemassa voimakas korrelaatio taajuuden, jolla entsyymi irtoaa kohdasta DNA-synteesin aikana ddNTP:eiden puuttuessa, ja ddNMP:n inkorporaation vastaisen diskriminaation 15 tuossa kohdassa laajuuden välillä (ei-julkistettuja tuloksia) . Tämä viittaa siihen, että DNA-polymeraasi-I inkorpo-roi dNMP:eitä ja ddNMP:eitä samankaltaisilla nopeuksilla prosessiivisen synteesin aikana; kuitenkin kun synteesi ei ole prosessiivinen, dNMP:eitä tulee inkorporoiduksi ensx-20 sijaisesti ddNMP:eihin nähden. Tämä malli voisi selittää suuremman vaihtelevuuden ddNMP-inkorporaatiossa DNA--poly-meraasi-I:llä verrattuna T7-DNA-polymeraasiin, sillä viimemainitun prosesiivisuus on kaksi suuruusluokkaa korkeampi kuin ensin mainitun" (viitteet jätetty pois).

25 Täten tämän keksinnön mukaiset tulokset Ek call DNA-polymeraasi-I:llä ja Taq-DNA-polymeraasilla ovat yllättäviä, koska emme löydä todisteita siitä, että tässä kuvatut mutantit todella lisäävät mutanttientsyymien pro-sessivisuutta.

30 Termofiilisiä polymeraaseja

Termofiiliset polymeraasit, jotka diskriminoivat vastaan ddNTP:tä alle tekijällä 100, ovat erityisen käyttökelpoisia tässä keksinnössä. Lisäksi käyttökelpoisia ovat ne, jotka diskriminoivat vastaan ddNTP:tä alle teki- j 35 jällä 100 magnesiumin läsnä ollessa ainoana kaksivalens- j 44 sisena kationina, ja jotka edullisesti kiertävät yhdestä aluke-templaatista toiseen enemmän kuin kerran sekunnissa,

Termofiiliset polymeraasit määritellään polymeraaseiksi, joilla on optimaalinen DNA-polymeraasiaktlivisuus 15 mi-5 nuutin reaktiossa yli SO °C:n lämpötilassa,.

Yhtenäiset nauha intensiteetit

Vaikka mangaani vähentää Klenow-fragmentin ddATP-vastaista diskriminaatiota 550-kertaisesta 3,9-kertaisaen,

Tabor ja Richardson IProc. Natl. Acad, Sei. USA 86 (1989) 10 4076 - 4080] osoittavat, että yksittäisten nauhojen inten siteetit vaihtelevat edelleen laajalti (katso kuvio 2 id.) . Täten T7-DNA-polymeraasi paitsi T7-DNA-polymeraasia tämä keksintö on ensimmäinen, joka antaa käyttöön polyme-raaseja, jotka kiertävät nopeasti kuten Klenow-fragraentti, 15 ja ne, jotka saadaan termofiilisistä organismeista, nauhojen tuottamiseksi, jotka ovat intensiteetiltään yhtenäiset, jopa magnesiumin läsnä ollessa ainoana kaksivalenssi-sena kationina, olosuhteissa, jotka ovat edulliset useimpien polymeraasien aktiivisuudelle (katso edellä) , Nopeas-20 ti kiertävät entsyymit voidaan määrittää alalla tunnetuilla menetelmillä kuten alla kuvataan.

Spesifisiä polymeraaseja

Edeltävän informaation perusteella on mahdollista helposti valmistaa: seuraavia polymeraaseja, joilla on 25 edellä esitetyt toivotut ominaisuudet. Kutakin näistä polymer aaseista,: voidaan, käyttää sekvensointimenettelyihin, jos eksonukleaasitaso on riittävän matala ja polymeraasin aktiivisuus· on riittävä (jotka molemmat ovat alalla hyvin tunnettuja) . Katso Hraithwaife ja ito, suora, viitteen 3 0 osalta kuhunkin aminohappokohtaan..

1, Pol I -ryhmä E, coli DNA-polymeraasi-X, jossa Phe762 on muutettu ("muutettu" tarkoittaa korvattu esim. Tyrillä, tai ekvi- j valenttisella aminohapolla ei-diskriminätorisen ominaisuu- | 35 den saamiseksi).

45

Streptococcus pneumoniae DNA-polymeraasi-I, jossa Phe711 on muutettu.

Thermus aeruaticus DNA-polymeraas i-1, jossa Phe667 on muutettu.

5 Thermus flavus DNA-polymeraasi-I, jossa Phe666 on muutettu.

Bakteriofagi-T5-DNA-polymeraasi, jossa Phe570 on muutettu.

Bakteriofagi Spo 1 -DNA-polymeraasi, jossa Leu52€ 10 on muutettu.

Bakteriofagi Spo 2 -DNA-polymeraasi, jossa Phe690 on muutettu.

Mitokondrio-DNA-polyineraasi, jossa on luonnollinen Tyr753, tai tätä kohtaa on muutettu ei-diskriminatorista 15 aktiivisuutta vähentämättä. Tällaista polymeraasia ei ole aiemmin käytetty DNA-sekvensointiin. Hakija uskoo, että se on käyttökelpoinen tällaisessa menettelyssä, koska sen odotusten mukainen ddNTP-diskriminaatiotaso on alhainen:. Tarvittaessa sitä voidaan modifioida polymersasiaktiivi-20 suuteen liittyvän eksonukleaasiaktiivisuuden vähentämi seksi ,

Esimerkkejä

Seuraavat ovat esimerkkejä menetelmistä prosessii-visuuden ja syklisiköjen määrittämiseksi eri polymeraa- 25 seille. Samoin annetaan; esimerkkejä polymeraasin diskri-minaatiotason määrittämiseksi, ja muita tässä keksinnössä käyttökeipoisia menetelmiä.

Esimerkki 1 DNA-polymeraasigeenien mutagenisointi ja mutantti-30 DNA-polymeraasien hyvin runsas tuotanto

Tavamomaisia tekniikoita käytetään· mutantti-DNA-polymeraasigeenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi. Geenit Ek. coli DMA-polymeraasi-I*n suurelle fragmentille (Kl enow-fragment ti'} ja Tag-DNA-polymeraasin suuri frag-35 mentti [KlenTaq- tai _Taq-DNA-polymeraasi, katso Barnes 46 gene 112 (1992) 29, tai Stoffel-fragmentti, katso Lawyer- et ai. . PCR Methods Appi 2 (1993) 275], lähtömateriaalit E. col i DNA-polymeraas i-1- ja Taq-DNA-polymeraas imutant-tien muodostamiseksi, ilmennetään T7-RNA-pQlymeraasipro-5 moottorin kontrollissa. Geeni _28 aminohapon deleetiolle T7-DNA-polytneraasissa [katso Tahor ja Richardson, J. Biol.

Chem. 264 81989) 6447] , lähtömateriaali T7-DNA-polymeraa- simutanttien muodostamiseksi, ilmennetään lac-promoottorin kontrollissa kannassa, joka tuottaa E. coli 10 tioredoksiinia, joka on välttämätön tekijä T7-DNA-polyme-raasin prosessiiviselle DNA-synteesiIle (Tabor ja Richardson, suora). Geeni taq-DNA-polymeraasimutantille F667Y siirretään _Taq-DNA-polymeraasia tuottavasta geenistä geeniin, joka tuottaa täysimittaista Taq-DNA-polymeraasia, 15 tavanomaisilla tekniikoilla käyttäen PCR:ää ja restriktio-pilkkomista ja sitten ligatoimalla.

Mutagenisointi mutantti-DNA-polymeraasien rakentamiseksi suoritetaan käyttäen tavanomaisia mutagenisointi-tekniikoita PCRrllä samoin kuin menetelmässä, jota kuvaa-20 vat Sarkar ja Sommer, BioTeohnlques 8. {1990) 404. Hybri dien rakentamiseksi, joissa enemmän kuin 4 aminohappotähdettä on vaihdettu, rakennetaan kaksi hybridialuketta, jolloin ensiksi suoritetaan PCR luqviattaja-DNA: 11a, minkä jälkeen saatua tuotetta käytetään: PCR:ään vastaanottaja-25 DNA:11a, jolloin muodostuu: hybridimolekyyli. Hybridien rakentamiseksi, joissa domeenivaihto on neljä aminohappotähdettä tai vähemmän, syntetisoidaan yksittäisiä: PCR- alukkeita, jotka sisältävät kokonaisuudessaan siirrettävän alueen sekä vastaanottajan oikeaoppiset sivuavat sekvens-30 sit, ja tuota aluketta käytetään hybridimolekyylin synte- j tisoimiseksi suoraan. :j

Mutantti-DNA-polymeraasien hyvin runsas tuotanto suoritetaan käyttäen tavanomaisia tekniikoita (katso esimerkiksi "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel 35 et al. . tcsim,., luku 16, 1994 ) . Mutanttiproteiineja puhdis- 47 tetaan tavanomaisilla menettelyillä mukaan lukien ionin-yaihtokramatografia. HL. coli DNA-polymeraasi-I-mutanttien puhdistamiseksi katso esimerkiksi Joyce ja Grindley, proc. Natl. Acad. Soi,. USA 80 (1983) 1830. Taq-DNA-polymeraasi- 5 mutanttien puhdistamiseksi katso esimerkiksi Engelke et ai. , Anal. Biochem. 191 {1990) 396. T7-DNA-poiymeraasimu:- tanttien puhdistamiseksi katso esimerkiksi Tahor ja Richardson,, J. Blol. Chem. 264 (1989) 644 7. Kurikin puhdistetun mutanttiproteiinin polymeraasispesifiset aktiivisuu-· 10 det määritetään tavanomaisilla näiss viitteissä kuvatuilla menettelyillä,

Esimerkki 2 DNA-polymeraas i en nopsa seulonta mutanttien suhteen, joiden tehokkuus inkorporoida dideoksinufcleotidi 15 verrattuna deoksinukleotidiin on parantunut

Seulotaan mutantti-DNA-polymeraaseja kyvyn suhteen inkorporoida dideoks inukleotidej ä SDS-akti ivisuusgeeli-analyysillä. Menettely on modifikaatio Spanosin ja Hub sohierin, Meth. Enzvm. 91 (1983) 263, ja Karawyan et 20 ai., Anal. Bloohem. 135 (1983) 318, kuvaamasta. Lyhyesti, 10 ml soluja indusoidaan 4-6 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pelletoidaan. Solupelletti uudelleensuspendoidaan 0,3 ml:aan 25 mM Tris-HCl:ää, pH 7,0, 5 mM EDTA. 2 0 μΐ uudel-leensuspendoituja soluja sekoitetaan 40 μΐ:aan liuosta, 25 jossa on 1 % SDS:ää (natriumdodesyylisulfaatti) , 2 % mer-kaptoetanolia, 30 % glyserolia, 0,04 % bromifenolisinistä

ja pitoisuus 100 mM Tris-HCl, pH 6,8. Seoksia inkuboidaan 37 °C:.ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen 20 μ!:η eriä panostetaan kaksikertaisin näyttein kahdelle SDS-polyakryy-30 liamidigeelille. SDS-pölyakryyliamidigeelit koostuvat erottavasta geelistä, joka sisältää 8 % polyakryyliamidia, 0,27 % bisakryyllamidia, pitoisuuden 190 mM Tris-HCl :ää, pH

8,8, 0,05 % SDS:ää ja 25 pg/ml denaturoitua lohensperma- DNA:ta, ja pakkausgeelistä, joka koostuu 5 %:sca poly-35 akryyliamidia, 0,17 %:sta bisakryyliamidia, pitoisuudesta 48 150 mM Tris-HCl, pH 6,8 ja 0,1 %:sta SDS:ää. Elektroforee-siajot näissä kahdessa geelissä suoritetaan 100 V:n jännitteellä 13 tunnin ajan 13 °C:: n vakioi ämpöt i 1 as s a elek-t ro f or e e s ipus kuri s s a, joka koostuu pitoisuudesta 190 mM 5 Tris-HCl, pH 8,8, 0, OS % SDS:ää.

Elektroforeesin j älkeen geelejä pestään 8 tunnin ajan käytten 4 vaihtoa kulloinkin 500 ml renaturoimispus-kuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM magnesdumasetaatti, 1 mM ditiotreitoli, 40 mM KC1, 400 pg/ml nautaseerumialfou- 10 miinia, 16 % glyserolia ja pitoisuus 0,95 mM EDTA) 4 °C:ssa.

Renaturoitujen proteiinien DNA-polymeraasiaktiivi-suus määritetään inkuboimalla kumpaakin kahta geeliä 6 ml:ssa renaturoimispuskuria, 1,5 pM neljää dNTPltä, 4 pl 15 [a~i2P] dATP; ta (800 Ci/mmol, 10 mCi/ml) ja 80 pg puhdis tettua tioredoksiinia. Yksi seoksista sisältää myös pitoisuuden 30 pM ddTTP (20-kertainen mooliy 1 itnäärä dTTP: hen nähden}.. Seoksia inkuboidaan 4 tunnin ajan 37 pC:ssa (70 °C:ssa 2 tunnin ajan termofiilisille DNA-polymeraa-20 seilie).

Inkuboinnin jälkeen geelejä pestään 8 tunnin, ajan vastaan neljää vaihtoa liuosta, jossa on 5 % trikioori-etikkahappoa ja 1 % natriumpyrofosfaattia. Sitten geelit kuivataan ja niistä otetaan autoradiokuvat.

25 Sen määrittämiseksi, diskriminoiko mutantti~DNA~ polymeraasi enemmän vai vähemmän ddTTP:tä vastaan, radioaktiivisten nauhojen kahdella geelillä, joita inkuboitiin ddTTP:n läsnä ollessa ja puuttuessa, intensiteettejä verrataan, ja signaalisuhdetta kahdessa nauhassa ei-modi-30 fioidulle DNA-polYmeraasille verrataan signaalisuhteeseen kahdessa nauhassa kullekin mutanti11e. Jos mutaatio johtaa siihen, että DNA-polymeraasi diskriminoi vähemmän ddTTP:tä vastaan, radioaktiivisuus laskee prosentuaalisesti enemmän nauhassa, jossa ddTTP oli läsnä, mutantti-pMA-polymeraa- \ 3 5 sille ei-modifipituun DNÄ-polymeraasi.in verrattuna. Esi- Ϊ 4 4 4 i i 49 merkiksi näissä olosuhteissa radioaktiivisten nauhojen, jotka havaitaan soluille, jotka sisältävät indusoitua Έ... coli DNA-polymeraasi-X:tä tai TT-DNA-pölymeraasimutanttiä Y526F, intensiteetit ovat suunnilleen samat (tekijän 2 5 puitteissa) reaktioissa, jotka suoritetaan ddTTP:n läsnä ollessa/puuttuessa. Sitä vastoin soluille, jotka sisältävät indusoitua Ek. coli DNA-polymeraasi-I-mutanttla F762Y tai T7-DNA-polymeraasia, nauhat geelissä, jossa reaktiot suoritetaan ddTTPm läsnä ollessa, ovat alle s: % nauhojen 10 intensiteetistä, jotka vastaavat reaktioita, jotka suoritettiin ddTTP:n puuttuessa.

Tämä määritys edustaa nopeaa menetelmää suuren lukumäärän DNA-polymeraasimutanttej a seulomiseksi niiden kyvyn suhteen diskriminoida vastaan dideoksinukleotidejä.

15 Sillä voidaan todeta vähintään 5-kertaiset muutokset suhteellisessa diskriminaationopeudessa. Kuitenkin tätä määritystä voisi seurata mahdollisesti kiinnostavien mutant-ti-DNA-polymeraasien puhdistus;, ja puhdistettujen proteiinien tarkemmat, alan kuvattujen kaltaiset määritykset 20 kunkin mutaation vaikutuksen dideoksinukleotidien vastai seen diskriminaatioon täsmälliseksi määrittämiseksi.

Seuraavat esimerkit ovat menetelmiä eri polymeraa-sien prosessiivisuuden ja sykliaikojen määrittämiseksi, polymeraasin ddNTP-vastaisen diskriminaatiotason määrit-25 tämiseksi, dideoksipäätteisten fragmenttien muodostamien nauhojen DMA-sekvensointigeelisää yhtenäisyyden määrittämiseksi ja tämän keksinnön mukaisten DNA-polymeraasien käyttämiseksi DMA-sekvenssianalyysiin.

Esimerkki 3 3 0 Yksisäikeisen M13 DNA - 5' 3iP-leimatun 40-meeri- alukekompeksin valmistus ja puhdistus - j

Templaatti on M13 mGPl-l yksisäikeinen DNA, 9 950 nukleotidin pituinen, kuten kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 795 699 (kuvio 9) . Fagi Ml3 mGPl-2 on talletettu 35 talletuslaitokseen ATCC hakunumerolla 40303. Ml3 mGPl-2 50 yksisäikeinen DNA puhdistetaan kuten kuvataan julkaisussa Tabor et ai. , J, Biol. Chem. 262 (1587} 16212. Lyhyesti, faagia puiidistetaan kahdella CsCl -gradienttisentrifugoin-nilla, CsCl poistetaan dialysoitnalla, DNA poistetaan f a-5 gista uuttamalla fenolilla ja kloroformilla 0,1 % :n nat-riumdodesyylisulfaattia läsnä ollessa, ja uutettua DNA:ta dialysoidaan perusteellisesti vastaan 20 mM Tris-HCl-liuosta, pH 7,5, 2 mM EDTA, ja se varastoidaan 4 °G: seen.

Ml 3 mGPl-2 yksisäikeisen DNA:n pitoisuus määritetään 10 spektrofotometrisesti käyttäen ekstinktiokerrointa 8,1 yksikköä = 1 mg/ml, tai 0,3 pmol M13 mGPl-2 templaattimo-lekyyliä/μΐ.

Aluke on synteettinen 40-meeri, jonka sekvenssi on 5' d(TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCA) 3' ja joka 15 syntetisoidaan tavanomaisin menettelyin. Se on komplementaarinen Ml3 mGPl-2 DNA:hän nähden nukleotideissä 9031 -8992 (katso 4 795 699 patenttijulkaisu edellä sekvenssin osalta). Äluketta puhdistetaan ioninvaihtokromatografises-ti tai denaturoivalla polyakryyliamidigeelielektroforee-20 silla ennen pääleimausta.

Aluke leimataan ja juotetaan templaattiin oleelli sesti kuten kuvataan julkaisussa Tabor et ai., supra.

Aluke 5'-pääleimataan reaktioseoksessa (15 μ!) , joka sisältää pitoisuudet 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl,f 5 25 mM ditiotreitoli, 100 mM NaCl, 50 pg/ml BSA:ta, 50 mCi [g”p]ATP:tä, 6 000 Ci/mmol, 5 pmol aluketta ja 10 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia, joka on valmistettu PseTl-mutant ista, jolta puuttuu fosfataasiaktiivisuus. Seosta in-kuboidaan 37 °C:ssa 15 minuutin ajan, ja sitten 70 °C:ssa 30: 15 minuutin ajan kinaasin inaktivöimisekai. 60 μΐ yksisäi- keistä Mi,3 mGPl-2 DNA:ta (0,25 mg/ml) , 6. ui 1 M NaCl- liuosta ja 3 μΐ 0,2 M MgCl,-liuos ta lisätään ja: seos jäähdytetään hitaasti 70 0C-sta huoneenlämpötilaan (noin 20 -25 °C) 30 minuutissa. Sitten seosta uutetaan kerran feno- 35 Iin ja kloroformin 1:1 seoksella ja 30 sekunnin sentrifu- | 51 goinnin jälkeen mikrofugissa vesifaasi (70 μΐ) sijoitetaan 1 ml:n Sepharose CL-6B -kolonniin, jota on tasapainoitettu 20 ΐτιΜ Tris-HCl: ssä, pH 7,5, 2 TOM EDTA, ja 100 raM NaCl.

Leimattu aluke-templaattikqmpleksi eluoidaan kolonnista 5 samalla puskurila kuin käytettiin tasapainoitukseen; leimattu kompleksi eluoituu tyhjössä tilavuudessa, Eluoinnin jälkeen kompleksi on pitoisuutena noin 50 pg/ml (0,015 pmol molekyylejä/plj spesifisen aktiivisuuden ollessa noin 200 000 cpm/μΐ.

10 Esimerkki 4 DNA-pölymeraasin prosessi ivisuuden määritys laimennos testillä

Prosessiivisuus määritetään entsyymilaimennoksella oleellisesti kuten kuvataan julkaisuissa Tabör et ai.

15 (supra) ja Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4767:,: Reaktiot suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin laajennus/päätös-reaktioissa, joita käytettiin DNA-sekvensointiin (Tabqr ja Richardson, suora) lukuun ottamatta, että ddNTP-t jätetään pois ja polymeraasin pitoi-2 0 suutta lasketaan aluke-1emp1 aa 11imolekyyliy1imäärän saami seksi polymeraasimolekyyleihin nähden joissakin reaktioissa, Aluke-templaatta koostuu yhdestä 5'-pääleimatusta alukkeesta juotettuna yksisäikeiseen Ml3 DNA-molekyyliin kuten kuvataan esimerkissä 3, 25 Laajennusreaktioseokset: valmistetaan oleellisesti j kuten kuvataan julkaisussa Tähor et al:. , supra., Kukin reaktioseos (18 μΐ) sisältää 1,0 μΐ juotettua '"'P-leimattua aluke-M13 DNA: ta kuten kuvataan esimerkissä 3 (noin 0,015 pmol, noin 200 000 emp) , pitoisuudet 40 mM Tris-HCl, pH 3D 8,0, 5 mM MgCl,, 5 mM ditiotreitoli ja 300 μΜ neljää dNTPitä. Seoksia inkuboidaan 37 °C:ssa 1 'minuutin ajan (70 °C:ssa termofiilisille DNA-polymeraaseille). Reaktiot käynnistetään lisäämällä 2 μ1:η eriä analysoitavan DNA-polymeraasin laimennoksia laimennettuina 20 mM 35 Tris-HCl:ään, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 0,05 % 52 nautaseerumialbumiinia. Reaktioseoksia inkuboidaan edelleen 37 °C:ssa {70 °C:ssa termof Hiisille DNA-polymeraa-seille) joko 30 sekunnin tai 3 minuutin ajan. Ilmoitettuina ajankohtina 8 pl:n eriä poistetaan ja lisätään joko 5 8 μΐ:aan 90-%:ista formamidia, 20 mM EDTA, 0,05 % bromi- fenolisinistä denaturoivaa polyakryyliamidigeellelektro-foreesia varten tai 2 μΐ:aan 100 mM SDTA-liuösta, 2 % natriumdodesyylisulfaattia alkalista agaroasigeelielek-troforeesia varten.

10 Näytteet analysoidaan joko denaturoivalla polyak- ryyliamidigeelielektroforeesilla tai alkälisella agaroo-sigeelielektroforeesilla. Denaturoiva poiyakryyliamidi-geelielektroforeesi sopii parhaiten polymeraas ien analysointiin, joiden keskimääräinen prosessiivisuus on alle 15 500 nukleotidiä, kun taas alkalinen agaroösigeelielektro- föreesi tuottaa herkemmän arvion DNA-polymeraasien pro-sessiivisuudesta, joiden keskimääräinen prosesiivisuus on yli 500 nukleotidiä; kuitenkin kumpaakin menetelmää voidaan käyttää menestyksekkäästi minkä tahansa DNA-poiyme-20 taasin keskimääräisen prosessivisuuden määrittämiseksi.

Prosessiivisuuden määrittämiseksi denaturoivalla pölyakryyliamidigeel1elektröforeesilla näyt teitä fofmami-dissa kuumennetaan 90 0C:sSa 2 minuutin ajan välittömästi ennen 6 μ1:η kutakin näytettä panostamista geeliin, joka 25 koostuu 8 %:sta polyakryyliamidia, 0,4 %:sta Ν,Ν'-mety-

leenibisakryyliamidia, 7 μΜ urea 100 mM Trisboraatissa, pH

8,3, 1 mM EDTA. Elektroforeesi suoritetaan jännitteellä 2 000 volttia 90 minuuttia kestävänä {kunnes bromi f enoli-sininen on juuri kulkenut ulos geelin pohjasta}. Geeliin 30 panostetaan myös sopivia 5' ”P-pääleimattuja moiekyylip- ainomerkkejä, jotka mahdollistavat fragmenttikokojen 100 -500 nukleotidiä määrittämisen. Esimerkkejä tällaisista sopivista merkeistä ovat T7 Hpal -fragmentit, jotka on defosforyloitu alkalisella fösfataasilla ja sitten 5' "P-35 pääleimataan käyttäen [g-"PjÄTP:tä T4-polynukleotidikinaa- 53 siä käyttäen, tavanomaisia menettelyjä (Sambrook et ai. , ''Molecular Cloning: A laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, ss. 6.20 - 6.21, ja Ausubel et al. , " Current Protocols in Molecular Biology" , Greene 5 Publishing Associates ja Wiley Interscience, N.N., 1989).

Elektroforeesin jälkeen geeli kuivataan tyhjössä ja otetaan autoradiokuva. Autoradiokuvanoton jälkeen radioaktii-visesti leimattujen fragmenttien jakauma määritetään Phosphorimager-analyysillä (Molecular Dynamics).

1Q Tuotteet analysoidaan alkalisella- agaroosigeeli- elektroforeesilla kuten kuvataan julkaisuissa (1) Villani et ai. , J. Biol.. Chem. 256 (1981) 8202, (2) Sabatino et ai. , Biochemistry 2? (1988) 2998, ja (3) Sambrook et ai. . suora. Agaroosigeelin valmistamiseksi 250 ml 1,5-%:ista 15 agaroosiliuosta 2 mM SDTA:ssa, pH 8,0, kuumennetaan mikroaaltouunissa agaroosin liuottamiseksi, minkä jälkeen sen annetaan jäähtyä 60 °C:seen. Lisätään 8,75 ml 1 N NaOI-I-1 itiöstä (loppupitoisims 35 mM NaOI-1) ja geeli kaadetaan agaroosigeelielektroforeesimuottiin. Geelin annetaan aset-20 tua 2 tunnin ajan ennen käyttöä. Elektroforeesipuskuri on 35 mM NaOH, 2 mM EDTA. Näytteet valmistetaan ottamalla edellä kuvattuja 10 μ1:η näytteitä (20 mM EDTA:saa, 0,4 % natriumdodesyylisulfaattia) , jotka denaturoidaan lisäämällä 1 ]il 1 N NaOH: ta ja kuumentamalla 60 °C:ssa 10 minuutin 25 aj an. Kuhunkin näytteeseen lisätään 7 μΐ 75-%:ista glyserolia, 0,2 % bromikresolivihreää, minkä jälkeen näytteet panostetaan alkaliseen agaroosigeeliin. Elektroforeesi suoritetaan 4 °C:ssa 150 mA:n vakiovirralla 15 tunnin ajan (kunnes bromikresolivihreä on kulkenut noin 14 cm) .

3 0 Elektroforeesikammion mitat ovat 26 cm (pituus) x 20 cm (leveys) ja 2 cm (korkeus). Elektroforeesin·jälkeen geeliä liotetaan 2 tunnin ajan 10-%: isessa tri-kloorietikkahapossa, se kuivataan tyhjössä ja otetaan au- f toradiokuva:. Autoradiokuvanoton jälkeen radioaktiivisesti i | 54 leimattujen fragmenttien jakauma määritetään Phosphor-imager-analyysillä (Molecular Dynamics).

Jonkin tietyn DNA-polymeraasin prosessivisuuden testaamiseksi tuon polymera as in pitoisuutta reaktioseok-5 sessa laimennetaan aina 2-kertaisesti kunnes vain osa (esim. 25 %) alukkeista laajenee, kun valtaosa (esim.

75 %) säilyy ennallaan, 40 nukleotidin pituisina. Näissä olosuhteissa 2-kertaisen nousun tai laskun DNA-polytneraa-sipitoisuudessa tulisi johtaa noin 2-kertaiseen nousuun 10 tai vastaavasti laajennettujen alukkeiden osuudessa. Laajennettujen leimattujen fragmen11ien keskimääräinen pituus määritetään joko visuaalisesti tarkastelemalla autoradio-kuvaa tai kvantitoimalla Phosphorimager-laitetta käyttäen.

Esimerkiksi tätä testiä käyttäen eksonukleaasivajaan T7 15 DNA -polymeraasin, joka on kompleksoitu sen prosessiivi-suustekijään tioredoksiiniin (esim. Sequenase® versio 2.0,

United States Biochemical Corporation), keskimääräinen prosessiivisuus on yli 500 nukleotidiä, kun taas EL. coli DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmentin prosessiivisuus on 20 alle 50 nukleotidiä.

Esimerkki 5 DNA-polymeraasin kiertonopeuden määritys

Kiertonopeus määritetään oleellisesti kuten kuvaavat Tabor et ai., supra. Reaktiot suoritetaan samoissa 25 olosuhteissa kuin DNA-sekvensointiin käytetyt iaajennus/-päätös-reaktiot (Tabor ja Richardson, supra) lukuun ottamatta, että ddNTP:t jätetään pois ja polymeraasin pitoisuutta lasketaan aluke-templaattimolekyyliylimäärän saamiseksi polymeraasimolekyyleihin nähden. Aluke-tempiaa11i 3 0 koostuu 5 ' [a"P]-pääleimatusta alukkeesta juotettuna yksi- säikeiseen M13 DNA-molekyyliin kuten kuvataan esimerkissä 3 .

Ensin suoritetaan testi aluke-templaattimolekyylien funktionaalisen suhteen polymeraasimolekyyleihin nähden i 35 määrittämiseksi esimerkiksi käyttäen .Εχ coli DNA-polyme- j | t | 55 raasi-I:n suurta fragmenttia (Klenow-fragmentti} . taimen-noskoe suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 4 polymeraa-simolekyylien sen pitoisuuden määrittämiseksi, joka tarvitaan 20 %:n leimattuja aluke-templaattimolekyyleja laajen-5 tamiseksi 10 sekunnissa. Polymeraasin tämä suhde aluke- templaattiin määritellään pienemmäksi tai yhtä suureksi kuin 1:5, ja sitä käytetään polymeraasin maksimaalisen kiertonopeuden määrittämiseksi kuten alla kuvataan.

Laajentamisreaktiot suoritetaan kuten kuvataan 10 esimerkissä 4 käyttäen DNA-polymeraasin suhdetta aluke- templaattiin, joka on pienempi tai yhtä suuri kuin 1:5 kuten edellisessä kappaleessa määritellään. Reaktiot suoritetaan olosuhteissa (eli puskuri, pH, suolat, lämpötila) , jotka ovat optimaaliset testattavalle polymeraasille.

15 Näytteitä otetaan ajankohtina 10, 20, 40 ja 80 sekuntia, ja reaktiot päätetään ja tuotteet analysoidaan kuten kuvataan eismerkissä 4. DNA-pplymersasien kohdalla, joiden prosessiivisuus on alhainen (alle 10Q nukleotidiä), kuten E. coli DNA-poiymeraasi-l:n suuri fragmentti, näytteet 20 analysoidaan edullisesti denaturoivalla polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla. DRA-polymeraasien kohdalla, joiden prosessiivisuus on korkea (yli 100 nukleotidiä), kuten T7 DNA-pölymeraasi, näytteet analysoidaan edullisesti alkamiselle. agaroDSigeeiielektroforeesilla, Elektroforeesin jäl-25 keen geelit kuivataan tyhjössä ja analysoidaan joko ottamalla autoradiokuya tai Phosphorimager-laitetta käyttäen.

Suoritettaessa reaktioita polymeraasilla, joka i kiertää hyvin hitaasti, kuten T7 ΚΗΑ,-polymeraasi, ei ta- \ 30 pahdu merkittävää laskua (eli alle tekijällä 2) ei-laa- jenriettujen alukkeiden lukumäärässä 10 sekunnin ja 80 sekunnin välillä. Täten jos: ei-laajennettujen leimattujen alukkeiden lukumäärä ei laske enempää kuin 2-kertaisesti 10 sekunnin ja 80 sekunnin ajankohtien: välillä, DNA-poly-35 meraasi kiertää hitaammin kuin kerran 70 sekunnissa. Po- 56 lymeraaseille* jotka kiertävät nopeasti, ei~1aajennettnjen alukkeiden lukumäärä laskee merkittävällä osuudella {eli enemmän kuin: 2-kertaisesti) 10 sekunnin ja 80 sekunnin ajankohtien välillä. Kiertonopeuden määrittämiseksi näille 5 polymeraaseille käytetään seur.aavaa yhtälöä.; R = N1 x L (t,} / {L (tx) X (t.. - t,) } jossa 10 R = minimikiertonopeus, sykliä/s

Nj = on aluke-templaattimolekyylien suhde funktionaalisiin DNA-polymeraasimolekyyleiMn (Nt = 5 edeltävässä esimerkissä) L itj) = tutkittavan DNA-polymeraasin maksimipro-15 sessiivlsuus nukleotideinä,· tämä määritellään maksimilukumääräksi nukleotidejä, jotka tulevat laajennetuiksi leimatuista alukkeista olosuhteissa, joissa DNA-polyme-raasi on rajoittava tekijä (kun vain 20 % alukkeista on tullut laajennetuksi 10 sekunnin ajankohtana) kuten kuva-20 taan esimerkissä 3 L(t.) = leimattujen alukkeiden laajennuksen maksi mipituus (nukleotideinä) ajankohtana t.., joka on 80 sekuntia tässä esimerkissä tj = lyhyin aika, jonka jälkeen näyte otetaan, eli 25 10 sekuntia tässä esimerkissä t, = pisin aika, joka reaktion annetaan kestää ennen näytteen ottamista, eli 80 sekuntia tässä esimerkissä .

Suoritettaessa tämä testi IL coli DNA-polymeraasi-30 I:n suurelle fragmentille saadaan arvo yli 0,2 sykliä/sek.

Esimerkeissä 6 ja 7 esitetään testejä dideoksinuk-leotidien inkorporaation tehokkuuden: määrittämiseksi tuntemattomalle DNA-polymeraasi1le käyttäen 51 ^P-leimattua 40-meerialuketta juotettuna yksisäikeiseen Ml3 DNA-temp-35 laattiin ja geelielektroforeesipohjäistä analyysiä. Esi- 57 merkki 6 on paras DNA-polymeraaseille, jotka inkorporaivat tehokkaasti dideoksinukleotidejä {esim. villityypin T7-DNÄ-polymeraas i ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y), kun taas esimerkki 7 on paras DNA-polymeraaseille, jotka diskrimi-5 noivat voimakkaasti vastaan dideoksinukleotidien inkorpo-raatiota {esim. T7-DNA- polymer aasi Y526F ja villityypin Taq-DNA-polymeraasi).

Esimerkki 6

Dideoksinukleotidien inkorporaationopeuden suh-10 teessa deoksinukleotideihin geelielekfcroforeesipohjainen määritys käyttäen dNTP/ ddNTP-suhdetta 1*1 Tämän testin ensisijainen sovellutus on määrittää ddNMP;n inkorporaation dHMP:hen nähden absoluuttinen suhde DNA-pölymeraasille, joka inkorporoi tehokkaasti dideoksi-15; nukleotidejä, kuten T7-DNA-polymeraasi, Eh G oli DNA-poly-meraasi-i-mutantti F762Y tai Taq-DKA-polymeraasimutantti FS67Y. Sillä voidaan myös osoittaa jonkin DNA-polymeraasin ddNTP-vastaisen diskriminaation taso; kuitenkin DNA-poly-meraaseille, jotka diskriminoivat voimakkaasti ddNT-P:eifcä 2 0 vastaan, kuten T7-DNA-polymeraasimutantti Y526F, EL coli DNA-polymeraasi-T tai Taq-DHA-polymeraasi, korkeammat ddNTP/dNTP-*suhteet ovat tarpeen niiden diskriminaatiotason täsmälliseksi määrittämiseksi, mitä kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkissä 7.

25 DNA-synteesireaktiot suoritetaan 3:P-pääleimatulla 4Q-meeri-M13 mSPl~2 DNA-templaattikompleksilla, joka valmistetaan kuten kuvataan esimerkissä 3. Käytetään reaktio-olosuhteita, jotka ovat optimaaliset testattavalle DNA-polymeraasille mitä tulee reaktion puskuriin, pH ihon, suo-30 loihln ja lämpötilaan. Valitaan DNA-polymeraasipitoisuus, jossa valtaosa alukkeista tulee laajennetuiksi 10 minuutin reaktiossa ja päättyvät dideoksinukleotidin inkorporaa-tioon. Eeaktioseos sisältää pitoisuudet 100: μΜ kutakin neljää dNTP:tä ja 100 pM yhtä neljästä ddNTPrsta.

58 Käytimme tätä testiä kuuden. DNA-polymeraas in kyvyn inkorporoida kutakin neljää ddNMP:tä vertaamiseksi. Testatut DNA-polymeraasit olivat: (1) T7-DNA-polymeraasi, jossa on 28 aminohapon deleetio eksonukleaasidomeenissa ja 5 joka on kompleksoi 1:1 suhteessa tioredoksiiniin [Tabor ja Richardson, J. Blol. Chem. 264 81:989) 6447] (jota kutsutaan tässä 11T7-DNA-polymeraasiksllt), (2) coli. DNA-poiy- mex*aasi-I:n suuri fragmentti, jota yleisesti kutsutaan Klenow-fragmentiksi (kutsutaan tässä "E_u coli DNÄ-polyme-10 raasi-I :ksir') , (3) ei-modifioitu DNA-polymeraasi TheimiUs aqua tie uksesta (jota kutsutaan tässä ''Taq-DNA-pöiymeraa-siks.i"), (4) edellä kuvatun mukainen T7-DNA-polymeraasi, jossa tyrosiini tähteessä 526 on vaihdettu fe-nyylialaniiniksi (kutsutaan tässä ''T7-DNA-polymeraasiksi 15 Y525F") , (5) edellä kuvatun mukainen coli DNA-polyme- raasi-I, jossa fenyylialaniini tähteenä 762 on vaihdettu tyrosiiniksi (kutsutaan tässä Et_ col 1 DN/v-polymeraasi-1 F762Y:ksi11) , ja (6) edellä kuvatun mukainen Taq-DNA-polymer aasi , jossa fenyylialaniini tähteenä 667 on vaihdettu 20 tyrosiiniksi (kutsutaan tässä "Taq-DNA-polymeraasi F667Y: ksi11) ,

Kunkin neljän ddNTPrn verrattavaan dMTP:hen nähden suhteellisen käyttönopeuden testaamiseksi kullekin edellä mainitulle: pNÄ-p.qlymeraasille reaktioseakset (8 ui) si-25 saisivat 1,0 μΐ juotettua a'’P-leimattua aluke-M13 DNA: ta

kuten kuvataan esimerkissä 3 (noin 0,015 pmol, noin 200 000 crop) , pitoisuudet 4 0 rriM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM

MgCl,, 5 mM ditiotreitoli, 50 mM NaCl, 100 pM kutakin neljää dNTP:tä ja 100 μΜ ddCTPitä. Reaktioseokset sisäl-30 sivät myös 10 ng hiivan epäorgaanista pyrofosfataasia pyro f o s f o ro1yys in inhiboimiseksi, joka voisi -muutoin lisätä \ DNA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota [Tabor ja j

Richardson, J, Blol, Chem. 265 (1990) 8322|. Reaktiot käynnistettiin lisäämällä 2 μΐ kutakin dna-polymersasia 35 laimennettuna 20 mM Tris-HCl:ään. pH 7,5, 10 mM 2-merkap- 59 toetanoli ja 0,05 % nautaseerumialbumiinia pitoisuuteen noin 0,025 yksikköä/μ1. Kunkin DNA-polymeraasin pitoisuus oli riittävä laajentamaan valtaosan leimatuista alukkeista yli 500 nukleotidillä ddNTP:eiden puuttuessa 15 minuutin 5 reaktiossa. Reaktioseoksia inkuboitiin 15 minuutin ajan joko 37 °C:ssa (T7-DMA-polymeraasi, T7-DNA-polymeraasi Y526F, Ek coli DNA-polymeraasi-I ja Ek coli DNA-polymeraasi-! F762Y) tai 70 °C:ssa iTaq-DNA-polymeraasi ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y). Reaktiot päätettiin lisäämällä 10 μΐ 10 90-%:ista formamidia, 20 mM EDTA, 0,05 % bromifenolisinis- tä. Kutakin näytettä kuumennettiin 90 nG:ssa 2 minuutin ajan välittömästi ennen 6 μ1·η kutakin näytettä panostamista geeliin, joka koostui 8 %:sta polyakryyliamidia, 0,4 %:sta ΚΓ,Ν1 -metyleenibisakryyliamidia, 7 M urea 100 mM 15 Tris'boraatissa, pH 8,3, 1 mM EDTA. Elektroforeesi suori tettiin 2 000 voltin jännitteellä 90 minuutin ajan (kunnes bromifenolisininen oli juuri kulkenut ulos geelin pohjasta) . Elektroforeesin jälkeen geeli kuivattiin tyhjössä ja otettiin autoradiokuva. Äutoradiokuvanoton jälkeen radio-20 aktiivisestu leimattujen fragmenttien jakauma määritettiin Phosphor imager-analyysillä (Molecular Dynamics) , Vaihtoehtoisesti dideoksipäätteisten nauhojen suhteelliset intensiteetit voidaan määrittää pyyhkäisemällä autoradiökuva laitteella, kuten SciScan 5 000 -kuvantami sdens i tomet ri 25 (United States Biochemical: Carp.).

Kun neljän reaktion sarja (kukin sisältää yhtä ddNTP:tä dNTPlhen nähden ekvimolaarisan. pitoisuuden) suoritettiin kullakin, kuudesta edellä kuvatusta DNÄ-polyme-raasista, reaktiot kolmella DNÄ-polymeraaseista (T7-DNA- i 3 0. polymeraasi Y526F, Jk coli DMA-polymeraasi-l ja Taq-DKfA-polymeraasi) johtivat valtaosan {> 50 %) radioaktiivisuudesta alukkeissä,: jotka olivat tulleet laajennetuiksi, kulkemiseen geelin, huipulle, mikä vastaa pituudeltaan yli 300 emäksen fragmentteja^: Signaalin ennakoidun eksponen- 3 5 tiaalisen vaimenemisen nojalla fragmenttikoon kasvaessa 60 tämä vastaa näillä 'kolmella DNA-polymeraasilla diskriminaatiota, joka on yli 100-kertainen kaikkia neljää dcLNTPrtä vastaan. Tarkempi mitta ddNTP-vastaisesta diskriminaatiosta näillä kolmella PNA-palymeraasilla saadaan 5 käyttämällä seuraavan esimerkin 7 testiä.

Muille kolmelle DNÄ-polymeraasille (T7-DNA-polyme-raasi, E. coli DNA-polyraeraasi-I F762Y ja Taq-DNA-polyme-raasi F667Y} autoradiokuva osoitti sarjaa dideoksipäättei-siä fragmentteja kaikissa reaktioissa. Yleensä ottaen lei— 10 mattujen syntetisoitujen keskimääräiset pituudet olivat alhaisimmat Taq-DNA-polymeraasi F667Y:lie, kun vain noin kuusi radioaktiivisesti leimattua dideqksipääfcteistä fragmenttia Oli nähtävissä jopa usean päivän kehityksen filmille jälkeen. Leimattujen fragmenttien keskimääräiset 15 pituudet Ek coli DNA-polymeraasi-I F762Y:n kohdalla ovat hieman pitempiä kuin Tag-DNA-polymeraasi F667Y:llä, kun taas keskimääräiset pituudet ovat merkittävästi pitemmät T7"DNÄ-polymeraasilla. Fragmentit ovat intensiteetiltään yhtenäisempiä synteti soi tuina Ek. coli DNA-polymeraaäi-I 20 F762Y: llä ja Tag-DIM-pplymeraasi F6;67Y: llä kuin T7-DNA- polymeraas i11a.

Radioaktiivisuuden fragmenteissa jakauma kvanti* toisiin Pho spho image r-analyysi11ä (Molecular Dynamics) , Leimattujen alukkeiden kokonaismäärä kussakin vyöhykkeessä 25 määritettiin ajamalla kolme verrokkiteaktiota, joissa ei ollut mitään DNA-polymeraasia, ja määritettiin radioaktiivisuus kussakin vastaavassa radioaktiivisessa nauhassa geelillä ei-laajennetun alukkeen asemassa. Radioaktiivisesti leimattuj en alukkeideh joidenkin valmisteiden koh-30 dalla tietty prosenttiosuus (< 10 %) ei laajene millään DMÄ-polymeraaseista riippumatta käytetyn DNA-polymeraasin pitoisuudesta; tämä taustataso määritetään mittaamalla radioaktiivisuuden pro selitti osuus, joka on jäljellä ei-laäj:ennetun alukkeen asemassa neljän ddJJT.P;eitä sisältävän 35 reaktion sarjalle ja vähentämällä näiden neljän arvon kes- 61 kiarvo aiemmin määritetystä tuikkeiden kokonaislukumäärästä. Tämä arvo määritellään tuikkeiden kokonaislukumääräksi alukkeissa, jotka kykenevät tulee laajennetuiksi DNA-poly-meraasilla.

5 Tuikkeiden kokonaislukumäärä (eli radioaktiivisuus) ensimmäisessä kolmessa dideoksipäätteisessä fragmentissa määritettiin. TT-DNA-poiymeraasille, coli DNA-polymer aa-si-I F762Y:lle ja Taq-PNA-polymeraasi F667Y:ile kullekin neljälle ddNTP-reaktiolle. Arvot esitetään alla taulukossa 10 tuikkeiden prosenttiosuutena ensimmäisessä kolmessa äide-oksipäättoisessa fragmentissa verrattuna tuikkeiden kokonaislukumäärään DNA-polymeraasilla laajennetuiksi tulemaan kykenevissä alukke i s sa.

15 Polymeraasi Reaktio

ddGTP ddATP ddTTP ddCTP

T7-DNA- polymeraasi 67% 66% 76% 61% 20 S. coli DNA-polyrneraas i -1 F762Y 95 % 92 % 96 % 92 %

Taq-DNA- polymeraasi 25 F667Y 97 % 95 % 95 % 99 %

Kunkin DNÄ-polymeraasin tehokkuuden inkorporoida dideoksinukleotidejä: edelleen testaamiseksi määritettiin kullekin reaktiolle: tuikkeiden lukumäärä kussakin merkit-3 0 tavan signaalin antavassa fragmentissa, ja tulostiedot i piirrettiin fragmenttinumeroii funktiona käyttäen Macint-osh-ohjelmaa Kaleidograph versio 3.0 (Synergy Software).

Saadut kuvaajat sovitettiin eksponentiaaliseen vaimene-ffliskäyrään käyttäen Kaleidograph-kirjastorutiinia tälle 3:5 funktiolle. Vaimenemiskäyrää esittää yhtälö: 62 γ = eM'x jossa 5 Y = X - (leimattujen alukkeiden fraktio fragmen teissa 1 - X verrattuna alukkeiden kokonaislukumäärään, joka voi tulla laajennetuksi) X - fragmenttinumero (ensimmäinen dideoksipäättei-nen fragmentti on 1) 10 M = eksponentiaalinen vaimenemisfunktio tulostie doille Kaleidograph-kirjastorutiinilla laskettuna.

Seuraavassa taulukossa seuraavat tulostiedot annetaan kullekin neljälle ddNTP-reaktiolle käyttäen T7-DNA-polymeraasia, Ek. coll DNA-polymeraasi-I F762Y: tä, Taq-DNA-15 polymeraasi F667Y:tä: N, fragmenttien lukumäärä, joka käytettiin sovitukseen kuhunkin eksponentiaaliseen käyrään M, laskettu eksponentiaalinen vaimenemisfunktio edellä kuvatun mukaisesti 20 D, diskriminaatiotekijä, joka esitetään spesifisen dNTP:n käytön suhteena verrattavan ddNTP:n käyttöön, kun kumpaakin nukleotidiä on läsnä sama pitoisuus; D lasketaan edeltävästä yhtälöstä käyttäen M:n laskettua arvoa Y:n määrittämiseksi kun X ^ 1, ja määrittelemällä D, dJSITPin 25 suosituimmuus suhde ddNTP:hen nähden ¥,/ (1-Y) :ksi ; R2, korrelaatioindeksi tulostiedoille, laskettiin Kaleido:graph-kir j astorutiinilla; tämä on vaihtelevuuden nauhainfeensiteeteissä mitta, tai sekvenssispesifinen vaihtelevuus DNA-polymeraas in kyvyssä inkorporoida spesi-30 finen dideoksinukleotidi.

63

Polymeraasj ddNTP_N M D Rz T7-DNA- ddGTP B -0,3 7.5 2,2 0,813 polymer aasi ddATP 6 -0,356: 2,3 0,996 aaTTP s -0,450 i,s 0,997 ddCTP 8 -0,317 2,7 0,889 E, coli ddGTP 5 -1,03 0,56 0,999

DNA -poly-meraasi 1 F762Y

ddATP 5 -0,860 0,72 0,998 ddTTP 5 -1,06 0,54 1,000 ddCTP 6 -0,842 0,75 1,000

Taq-DNA- ddGTP 5 -1,18 0,45 0,995 p°iy- mejraasi

F667Y

ddATP 6 -0,997 0,59 0,997 ddTTP 6 -1,01 0,56 0,996 ddCTP 4 -1,44 0,22 0,996

Keskiarvot: T7-DNA-- 4 ddNTP 2,3 0,924 poly- meraasi E. coli 4 ddNTP 0,64 0,99.9

DNA-polymer aasi Ϊ F762Y

Tag-DNA- 4 ddNTP 0,,48 0,996 poly- meraasi F667Y__ yhteenvetona T7-DNA-polyrr,eraasi diskriminoi keskimäärin 2,3-kertaisesti ddNTP:eitä vastaan, kun taas fit_ j coli DNA-polymeraasi-I F762Y ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y j 5 tosiasiassa asettavat ddNTP:t etusijalle dNTPteihin ver- ] 64 rattoina l,6-kertaisesti (1/0,64) ja vastaavasti 2,1-kertaisesti {1/0,48). R':n vertaaminen osoittaa, että viereisten fragmenttien intensiteetti on yhtenäisempi £h_ coli DNA-polymeraasi-I F762Y:llä ja Tag-DNA-palymeraasi 5 F667Y:llä kuin T7-DNA-polymeraasilla. Yhtenäisyyden tar kemmaksi mitaksi suurempi lukumäärä fragmentteja voitaisiin sisällyttää analyysiin laskemalla ddNTP:eiden tasoa {esimerkiksi 5-kertaisesti) kussakin reaktiossa, mikä laskee intensiteetin vaimenemista kussakin asemassa (katso 1Ö esimerkki 13),

Uuden DNA-polymeraasin ddNTPreiden vastaisen diskriminaation määrittämiseksi suoritettaisiin edellä kuvattuihin nähden analogisia reaktioita ja identtisiä reaktioita suoritettaisiin rinnan käyttäen T7-DNA-polyme-15 raasia (Sequenase versio 2.0, United States Biochemical

Corporation) analysoiden kaikki reaktiot samassa geelissä. Alustava vertailu dideoksipäätteisten nauhojen jakaumasta, joka saataisiin uudella DNA-polymeraasilla, verrattuna T7-DNA-polymeraasilla saatuihin osoittaisi, diskriminoiko 20 uusi DNA-polymeraasi: enemmän tai vähemmän ddNTP:eitä vastaan kuin T7-DNA-polymeraasi. Esimerkiksi tällainen visuaalinen tarkastelu coli DNA-polymeraasi-I F762Y:tä käyttäen osoittaa:, että reaktioille, joissa on kutakin neljää ddNTP:ta, geelissä näkyvien fragmenttien lukumäärä 25 Eh_ coli DNA-polymeraasi-1 F762Y:tä käyttäen on pienempi (ja keskimääräinen koko on pienempi) kuin T7-DNA-polyme-raasia käytettäessä. Kvantitatiivisempi analyysi suoritettaisiin sitten analogisesti edellä kuvattuun nähden eksponentiaalisen vaimennustekijän (M), dNTP:eiden 30 keskimääräisen suhteellisen käyttönopeuden suhteessa ddNTPreihin (D) ja vaihtelevuuden intensiteetissä (Ra) uudelle DNA-polymeraasille edellä kuvatun mukaisesti laskemiseksi.

Yksi komplikaatio, joka voi esiintyä tässä testis -35 sä, on, jos DMA-polymeraasilla on liittyvää eksonukleaa- 65 siaktiivisuutta, kuten Taq-DNA-polymeraasiin liittyvä 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuus ja JL_ coli DNA-po1ymeraas i -I:een ja natiiviin T 7-DNA-polymeraas iin (ei edeltävissä kokeissa käytettyyn _28 T7-DNA-polymeraasideleetiomutant-5 tl in') liittyvä 3 ' -5 ‘ -eksonukleaasiaktiivisuus. 5 ' -3 ' -ek sonukleaasiaktiivisuus on tuhoisa, koska se voi poistaa leiman alukkeen 5'-päästä, mikä laskee todettavaa radioaktiivisuus signaali a . Tämä ongelma voidaan osittain välttää laskemalla DNA-polymeraasin määrää reaktioseoksessa. 10 Edeltävässä esimerkissä 0,025 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia johti siihen, että käytännöllisesti katsoen kaikki alukkeet laajenivat kunnes päättyivät dideoksinukleotidin inkorporaatioon ilman mainittavaa 5'-3'-eksonukleaasiak-tiivisuudesta johtuvaa radioaktiivisuuden menetystä, kun 15 taas 40-kertainen lisäys Taq-DMA-polymeraasiaktiivisuu^ dessa, eli 1 yksikkö/reaktio, johti käytännöllisesti katsoen kaiken MP:n menetykseen alukkeen 5'-päistä. Vaihtoehtoinen lähestymistapa 5'-31-eksonukleaasiaktiivisuutta omaavan DNA-polymeraasin diskriminaation laajuuden mittaa-20 miseksi on käyttää eri toisenlaista, esimerkeissä 8 - 10 kuvatun kaltaista määritystä.

3'-51-eksonukleaasiaktiivisuus voi mutkistaa edellä kuvattua määritystä luomalla vaikutelman, että DNA-poly-meraasi diskriminoi enemmän ddNTP:tä vastaan kuin se to-25 siasiassa tekee [katso esimerkiksi Tabor ja Richardson, Proc, Natl. Äcad. Sei. USA 86 (1987) 4076] . Tämä johtuu siitä, että sitten kun dideoksinukleotidi on tullut in-korporoiduksi, eksonukleaasiaktiivisuus voi ensisijaisesti poistaa dideoksinukleotidin siten, että DNA-synteesi voi 30 jatkua, mikä johtaa kasvuun fragmentin pituudessa. Edullisesti edellä kuvatussa testissä määritetyt -entsyymit ovat vailla tällaista 3 '-5 '-eksonukleaasiaktiivisuutta,· esimerkkejä ovat modifioitu T7-DNA-polymeraasi (Sequenase®, United States Biochemical Corporation), Taq-DNÄ-polyme-35 raasi, eksonukleaasia vailla oleva Vent (Thermococcus.

66

Iltoraiis) -DNA-polymeraasi (New England Biolabs, katalo-ginro 257}, eksonukleaasia vailla oleva Deep: Vent (Pvrococuus OB-1) -DNA-polynieraasi (New England Bio'labs, kataloginro 259), eksonukleaasia vailla oleva Pfu (Pvro-5 coccus furiosus) -DNA-polymeraasi (Strategene kataloginro 60 0163} ja eksonukleaasia vailla oleva K1enow-fragmen11i (E. coli DNA-polymeraasi-I, United States Biochemical Corporation, kataloginro 70057). Joissakin tapauksissa kuten Ek. coll DNA-polymeraasi-I m kohdalla (Klenow- frag-10 mäntti) 3'-51-eksanukleaasiaktiivisuus on heikkoa, eikä häiritse sanottavasti tätä määritystä [katso: esimerkiksi Tabör ja Richardson, J. Biol. Chem. 264 (1989) 6447]. Yksi menetelmä: sen määrittämiseksi, onko. uudella testattavalla DNA-pölymeraasilla 3'-5'-eksonuklaäasiaktiivisuutta, joka 15 häiritsee kykyä mitata tarkasti ddNTP:eiden vastainen diskriminaatio, on suorittaa edellä kuvattu koe poistaen näyte-eriä eri ajankohtina aina 60 minuuttiin asti. Jos dideoksipäätteisten fragmenttien kokojakauma kasvaa ajan funktiona, on todennäköistä, että tällainen 31-51-eksonuk-20 leaasiaktiivisuus häiritsee määritystä, kun taas jos frag menttien jakauma on vakio ajan funktiona, tällaisella aktiivisuudella ei ole merkittävää vaikutusta. Jos keskimääräinen f ragmentt ip i tuus kasvaa ajan funktiona, tulisi käyttää lyhyempää inkubointiaikaa ja/tai laskea DNA-poly-25 meraasipitoisuus alueelle, jolla fragmenttikoot pysyvät vakioina ajan funktiona.

Pyrofosforolyysillä, eli polymeraasireaktion käänteisellä ilmiöllä, voi olla samankaltainen vaikutus kuin 3i_5i-eksonukleaasiaktiivisuudella, jolloin DNA-polymeraä-30 si voi poistaa ketjun päättävän dldeoksinukleotidin ja fragmenttikoko edelleen kasvaa [katso Tabor,ja Richardson, J, Biol. Chem. 265 (1990) 8322]. Tämä aktiivisuus välte tään helposti sisällyttämällä pyfpfosfataasia reaktiösepk-seen pyrofosfaatin poistamiseksi, joka akkumuloituu DNA- ) 67 synteesin aikana ja on pyrofosforolyysin välttämätön substraatti.

Esimerkki 7

Dideoksinukleotidien inkorporaationopeuden suhtees-5 sa deoksinukleotideihin geelielektro foreesipoh j ainen mää ritys vaihtelemalla dNTP/ddNTP-suhdetta Tämä esimerkki on samankaltainen kuin esimerkki 6.

Vaikka se on edullinen testi DNA-polymeraaseille, jotka diskriminoivat voimakkaasti vastaan dideoksinukleotidien.

10 inkorporaatiota (esim. T7-DNA-polymeraasi Y526F, coli DNA-polymeraasi-I ja Tag DNA polymeraasi), se toimii myös hyvin DNA-polymeraaseilla, jotka inkorporoivat tehokkaasti ddMMPteitä (esim. T7-DNÄ-pölymeraasi, Ek_ coli DNA-polyme-raasi^I-mutantti F762Y ja Taq-DNÄ-polymeraasiimitantti 15 F667Y) . Tässä testissä ddNTP/dNTP-suhdetta vaihel laari kah delle erilaiselle DNA-polymeraasivalmisteelle pitäen kaikki muut reaktionäkökohdat identtisinä ja dideoksipäätteis-ten radioaktiivisesti leimattujen fragmenttien jakaumia verrataan suhteiden määrittämiseksi, jotka tarvitaan ky-20 seisiile kahdelle testattavalle DNA-polymeraasilie verrattavan keskimääräisen pituuden omaavien fragmenttien saamiseksi .

Sarjan fragmentteja keskimääräinen pituus määritetään jommallakummalla kahdesta menetelmästä. Ensimmäises-25 sä, joka on paras DNA-polymeraaseille, jotka inkorporoivat ddNMP:eitä tehokkaasti, tarkastellaan autoradiokuvaa ja ;

määritetään suurimpien fragmenttien asema, jotka voidaan I

nähdä tietyllä valotusajalla sarjalle reaktioita, jotka käsittävät ddNTP/dNTP-suhteita, jotka vaihtelevat kaksin-30 kertaisen välein käyttäen yhtä DNA-polyrneraasia, ja verrataan tätä analogiseen: sarjaan toista DNA-polymeraasia käyttäen, suhteiden määrittämiseksi, jotka tarvitaan rinnastettavan kokoisten fragmenttien muodostamiseksi näille kahdelle polymeraasille. Eturintaman asema, joka osoittaa 35 näkyvien radioaktiivisten nauhojen ilmaantumisen, on ta- 68 vallisesti suhteellisen terävä ja silmällä helposti havaittavissa. Kuitenkin on samoin mahdollista määrittää tällaiset asemat täsmällisemmin käyttäen Phosphoimager-laitetta aseman paikantamiseksi kussakin vyöhykkeessä, 5 jossa ilmenee tietty radioaktiivisuuskynnys/pinta-alayksikkö lähtien geelin yläosasta ja kulkien alaspäin geeliä pitkin.

Jotkut DNA-poiymeraasit diskriminoivat hyvin voimakkaasti vastaan dideöksinakleotidien inkorporaatiota, 10 jolloin tässä tapauksessa on vaikeata lisätä riittävästi ddNTPreikä reaktioon suurimpien dideoksipäätteisten fragmenttien selväksi toteamiseksi denaturoivassa poiyakryy-iiamidigeelissä. Tällaisille DNA-polyraeraaseille voidaan käyttää alkalista agaroosigeelielektroforeesia dideoksi-15 päätteisten fragmenttien pituuksien vertaamiseksi eri sarjoissa. Jos käytetään denaturoivaa polyakryyliamidigee-liä, vaihtoehtoinen menetelmä ddNTP/dNTP-suhteiden määrittämiseksi, joka tarvitaan kyseisille kahdelle DNA-polyme raasille rinnastettavien keskimääräisten pituuksien omaa-20 vien dideoksipäätteisten fragmenttien muodostamiseksi, on keskittyä yhteen tai useampaan nauhaan ja määrittää ddNTP/dNTP-suhde, joka tarvitaan spesifisen radioaktiivi-suustason saamiseksi noissa fragmenteissa Phosphoimager-laitteella analysoituna testattaville kahdelle DNA-polyme-25 raasille.

Nämä testit suoritettiin käyttäen esimerkissä 6 kuvattuja 6 DNÄ-polymeraasia, Reaktio-olosuhteet olivat identtiset esimerkissä 6 kuvattuihin nähden lukuun ottamatta dNTPreiden ja ddNTPreiden pitoisuuksia. Kaikki reak-30 tioseokset sisälsivät 10 μΜ kutakin neljää dNTPrtä. Kunkin neljän. ddNTP:n pitoisuuksia vaihdeltiin kaksinkertaisen välein seuraavilla alueilla kuudelle DNA-polymeraasille j seuraavasti: T7-DNA-polymeraasi, Ek. coli DNA-polymeraasi-I { F762Y ja Taq-DNÄ-polymeraasi F667Y, 0,02 μΜ - 1 μΜ, ja: T7-35: DNA-polymeraasi Y526F, EL, coli DNA-polymeraasi-I ja Tag- 69 DNA-poiymeraasi F667Y, 100 - 2 000 μΜ. Reaktiot suoritettiin ja näytteet analysoitiin denaturoivalla polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla kuten kuvattiin esimerkissä 6.

Geelin kuivaus, autoradiokuvanotto ja Phosphoimager-ana-5 lyysi suoritettiin kuten kuvattiin esimerkissä 6. Taulukossa alla esitetään yhteenveto tämän kokeen tuloksista; arvot, jotka esitetään T7-DNÄ-polymeraasille, Sk. coli DNA-poiymeraasi-1 F762Y:lie ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y:lle, ovat absoluuttisia suhteita, jotka saatiin esimerkissä 6 10 dideoksipäätteisten fragmenttien, jotka saatiin käyttäen dNTP/ddNTP-suhdetta 1:1, intensiteetin eksoponentiaalisen vaimenemisnopeuden tilastollisella analyysillä. Arvot, jotka saatiin T7-DNA-poiymeraasi Y526F:Ile, Ek. coli DNA-polymeraäsi-X:lie ja Taq-DNA-polymeraasille, saatiin mää-15 erittämällä ddNTP/cUTP-suhteet, jotka tarvittiin sarjan didedksipäätteisiä fragmentteja muodostamiseksi, joiden keskimääräinen pituus oli verrattavissa sarjaan, joka muodostettiin käyttäen T7-DKA-polymeraasia, E_^ coli DNA-poly meraasi-I F762Y:tä ja vastaavasti Taq-DNA-polymeraasi 20 F667Y:tä; eli kullekin villityyppi- ja mutantti-DNA-poly- meraasiparille määritettiin ddNTP/dNTP-suhteet, jotka antoivat rinnastettavan dideoksipäätteisten fragmenttien jakauman. ddNTP/dNTP-suhde, jota käytettiin reaktiossa voimakkaasti diskriminoivalla entsyymillä (eli entsyymi, 25 joka sisältää f enyy1ialaniinin kriittisessä asemassa), jaettuna ddNTP/dNTP-suhteella, jota käytettiin rinnastettavan dideoksipäätteisten fragmenttien jakauman saamiseksi suhteellisen ei-diskriminatorisella entsyymillä (eli entsyymillä, joka sisältää tyrosiinin kriittisessä asemassa), 30 antaa tekijän, joka vastaa eroa tehokkuudesssa näiden kahden DMA-poiymeraasin välillä niiden ddNTPreiden käytössä suhteessa vastaavaan dNTPrhen, Tämä tekijä kerrottiin absoluuttisilla suhteilla, jotka saatiin T7-DNA-polymeraa- j sille, Et, coli DNA-poiymeraasi-I F762Y:lie ja Taq-DNA-po-35 lymeraasi F667Y:lie esimerkissä 6, alla esitettyjen arvo- 70 jen saamiseksi T7-DNA-polymeraasi Y526F: He, Eh. coli DNA-polymeraasi-Itile ja vastaavasti Taq-DNA-polymeraasille.

Polymeraasi Inkorporaationopeussuhteet

5 dG/ddG dA/ddA dT/ddT dC/ddC

T7-DNA- polymeraasi 3,2 3,3 2,8 3,7 T7“DNA- 10 polymeraasi Y526F 6 400 7 300 8 400 11 000 E. GOli DISTA- polymeraasi-T 140 720 1 100 250 15 E. coli DNÄ-polymeraas i-1 F762Y 0,56 0,72 0,54 0,75 2 0 Taq-DNA- polymeraasi 1 40.0 4 7 00 4 500 2 60 0

Taq-DNA- polymeraasi 25 F667Y 0,45 0,59 0,56 0,32

Seuraavassa taulukossa esitetään yhteenveto vaikutuksesta, joka tyrosiinilla on ollessaan fenyylialaniinin tilalla T7-DNA-polymeraasin, Ek. coli DNA-polymeraasi-I:n 30 ja Taq-DNA-polymeraasin kriittisenä selektivisyystähteenä ddNTP;eiden suhteessa dNTP:eihin käyttöön.

71 Tähde Keskimääräinen Parannus ddNTP:eiden nopeus dN/ddSftssä käyttö

T7-DNA- tyrosiini (WT) 3,0 3 000 X

5 polymeraasi fenyylialaniini 8 000

E. coli DNA- fenyylialaniini {WT} 600 polymeraasi-I tyrosiini 0,6 1 000 X

Taq-DNA- fenyylialaniini (WT) 3 000

polymeraasi tyrosiini 0,5 6 (JOO X

10 Tämän testin käyttämiseksi uuden DNA-polymeraasin diskriminaation laajuuden määrittämiseksi suoritettaisiin edellä kuvatun kaltaisia reaktioita käyttäen alliksi laajaa valikoimaa ddNTP/dNTP-suhteita, ja verraten dideoksipäät-15 teisten fragmenttien jakaumaa denaturoivassa polyakryyli-amidigeelissä standardiin, esim. T7-DNA-polymeraasiin. Sovittaen vyöhykkeet, joissa DNA-fragmenttien keskimääräiset pituudet ovat verrattavat, uuden DNA-polymeraasin ddNTP/dNTP-suhde jaetaan T7-DNÄ-polymeraasilla käytetyllä 20 suhteella uuden DNA-polymeraasin ddNTP-vastaisen diskrimi-naatiotason suhteessa T7-DNA-polymeraasiin saamiseksi.

Tämän testin käyttämiseksi sen määrittämiseksi, johtaako DNA-polymeraasin modifiointi laskuun sen kyvyssä diskriminoida ddNTP:eitä vastaan (eli inkorporoida dide-25 oksinukleotidejä tehokkaammin) käytettäisiin identtistä lukumäärää modifioitu ja ei-modifioitu DNA-polymeraa s iyk-siköitä sarjassa reaktioita, jotka sisältävät vaihtelevia ddNTP/dNTP-suhteita edellä kuvatun mukaisesti. Dideoksi-päätteisten fragmenttien keskimääräistä pituutta verrataan 30 identtisillä ddNTP/dNTP-suhteilla näiden kahden entsyymin kohdalla. Jos modifikaatio on johtanut DNA-polymeraasiin, joka inkorporoi dideoksinukleotidejä tehokkaammin, dideok-sipäätteisten fragmenttien keksimääräinen pituus on lyhyempi reaktioille, joissa käytetään modifioitua DNA-poly-35 meraasia, verrattuna reaktioihin, joissa käytetään ei-ma- 72 difioitua DNA-polymeraasia samoissa ddNTP/dNTP-suhteissa, kun taas keskimääräinen pituus on pitempi reaktioille, joissa käytetään modifioitua DNA-polymeraasia, jos modifikaatio: on johtanut: DNA-polymeraasiin, joka on diskrlmina-5 tori s empi ddLMTP: eitä vastaan.

Tätä testiä voidaan käyttää myös sen määrittämiseksi, johtaako DNA-polymeraasin modifikaatio laskuun sen kyvyssä: diskriminoida ddKTP-analogeja vastaan, esimerkiksi fluoresoivasta leimattujen ddNTP:eiden suhteen. Tämä on 10 mahdollista myös, jos testattavien analogien pitoisuutta ei tunneta.. Esimerkkinä tästä vertasimme Taq-DNA-polyme-raasin ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y:n kykyä käyttää kutakin neljää DyeDeoxy Terminator -päättäjää, joita valmistaa Applied Biosystems (osanumero 401150). Näissä DyeDeoxy 15 Terminator -päättäjissä on neljä erilaista fluoresoivaa ryhmää kovalenttisesti kytketty kuhunkin neljään ddNTPrhen (yksityiskohtien osalta katso esimerkki 12} . Kullekin DyeDeoxy Terminator -päättäjälle dNTP:eiden suhdetta DyeDeoxy Terminator -'päättäjiin vaihdeltiin 16 000-kertai-20 sen alueella kulloinkin kaksinkertaisen välein, ja dide-aksipäätteisten fragmenttien kuviota verrattiin autoradio-kuvassa suhteiden määrittämiseksi, jotka tarvittiin kummallekin kahdelle entsyymille dideoksipäätteisten fragmenttien saman keskimääräisen pituuden saamiseksi, 25 Seuraavassa taulukossa esitetään yhteenveto näistä tuloksista . Kullekin Terminator“päättäjäile sarakkeessa, joka on merkitty "suhde" , esitetään ddNTP/dNTP-suhteiden suhde, joka tarvitaan fragmenttien saamiseksi, joiden keskimääräinen pituus on identtinen Taq-DNA-polymeraasille ja Taq-30 DNA-polymeraasi F667Y:lle. Kuten normaalien ddNTP:eiden kohdalla, Taq-DNA-polymeraasi F667Y inkorporoi fluoresoivia ddNTP-johdannaisia paljon tehokkaammin kuin ei-modi-fioitu Taq-DNA-polymeraasi, ainakin tekijällä 4Ö0.

73

DyeDeojcy Terminä tor Suhde G Terminator > 400 A Terminator > 2 000 5 T Terminator > 2 000 C Terminator > 2 000

Kuten edellä on mainittu, yksi komplikaatio, joka voi syntyä tätä testiä käytettäessä, on, kun testattavalla 10 DNA-po1ymeraa silla on liittyvää eksönukleaasiaktiivismit- ta. Ongelmia, joita S'-!'- ja 3 ' -5'-eksonukleaasit voivat aiheuttää, ja tapoja niiden vaikutuksien niiden esiintyessä minimoimiseksi käsitellään esimerkissä 6. Suoritettaessa testi sen määrittämiseksi, laskeeko polymeraasin modi-15 fikaatio sen kykyä inkorporoida dideoksinukleotidejä, yksi luokka mutantteja, joilla voi olla tämä vaikutus, ovat ne, jotka inaktivoivat normaalisti hyvin aktiivisen 3'-5'-ek-sönukleaäsiaktiivisuuden [katso esimerkiksi Tabor ja Richardson, Proc. Mäti. Acad. Sei. USA 84 (1987) 4767].

20 Tätä mutanttiluokkaa ei vaadita patentoitavaksi tässä patentissa:. Jos käsillä on modifioitu DNA-pöiymeraasi, joka tuottaa ilmeisen lisäyksen DNÄ-polymeraasin kykyyn inkorporoida dideöksinukleötidejä, ja halutaan määrittää, onko se polymeraasidameenissa vai eksonukleaasidomeenissa, on 25 tarpeen suorittaa eksonukleaasimääritys entsyymin modi fioiduilla ja ei-modifioiduilla muodoilla; mutaatiolla, joka vaikuttaa pääasiassa entsyymin eksoiiukleaasiaktiivi-suuteen, on suurempi vaikutus entsyymin eksönukleaasiak-tiivisuuteeh kuin polymeraasiaktiivisuuteen. Edullisesti 3 0 mitattaisiin eksonukleaasiaktiivisuiiB DNA-substraatilla, joka on leimattu 3 1 -päästään ”p-ddÄMP:llä (katsö: esimerkki 21)Kuten esimerkissä 6, on tärkeätä inhiboida pvrofos-forolyysi näissä reaktioissa, jotta vältettäisiin, että se lisää DNA-polymer aas in ddNTP-vastaista näennäista dfskri- f 74 minaatiota:, Tämä suoritetaan helposti sisällyttämällä reaktioon pyrofosfataasi.

Esimerkki 8

Dideoksinukleotidien inkorporaafcion tehokkuuden S määritys inhiboimalla DNA-synteesi yksisäikeisellä Ml 3 DNA - ei-leimattu 40-meerialukekompleksilla Tässä esimerkissä DNA-polymeraasin herkkyys ddNTP:lle määritetään mittaamalla vaihtelevien döNTP-pitoisuuksien kyky inhiboida tavanomainen DNA-synteesireäk-10 tio. DNÄ-synteesimääritys on modifikaatio menetelmästä, jota kuvaavat tabor ja Richardson, J, Biol. Ghern. 254 (1989) 6447:, 40-meerialuke ja M13 mGPl-2-templaatti ovat esimerkissä 3 kuvatun mukaiset. Aluke juotetaan M13 mGPl-2 yksisäikeiseen DNA-templaattiin reaktioseoksessa (IX = 15 25 pl}, joka sisältää 2 pg Ml3 mGPl-2 DNA:ta, 6 pmol alu-

ketta (10-kertainen mooliylimäärä templaattiin nähden), pitoisuudet 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl. ja 100 mM NaCl. Seosta inkuboidaan 65 °C:ssa 2 minuutin aj an, minkä jälkeen se jäähdytetään huoneenlämpötilaan 30 minuutissa. 20 Tavanomainen reaktioseos (45 pl) sisälsi pitoisuudet 22 mM

Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCla, 55 t«M NaCl, 300 pM dGTP, dATP, dGTP ja [3H]TTP (30 epm/pmol), ja vaihtelevia pitoisuuksia yhtä neljästä ddNTP:stä tai kaikkia neljää ddNTPrtä, Reaktioseokset sisälsivät myös 10 ng hiivan epä-25 orgaanista pyrofosfataasia pyrofosforolyysin inhiboimisek-si, joka voisi muutoin nostaa DNA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota [Tabor ja Richardson, J. Biol, Chem. 265 (1990) 8322] . Seoksia inkuboidaan 37 °C:ssa 1 minuutin ajan (70 °C:ssa termofiilisille DNA-polymeraaseille): ja 30 reaktiot käynnistetään lisäämällä 5 pl:n eriä analysoitavan DNA-polymeraasin laimennoksia (0,01 - 1 yksikkö) laimennettuina 20 mM Tris-HCl:ään, pH 7,5, 10 mM 2-merkapto- etanoli ja 0,05 % nautaseerumialbumiinia. Reakcioseoksia inkuboidaan edelleen 37 °C:ssa 10 minuutin ajan (70 °C:ssa 35 termofiilisille DNA-polymeraaseille), Reaktiot päätetään 75 lisäämällä 5 μΐ 100 mM EDTA-liuosta, ja 45 μΐ seosta sijoitetaan täpläksi Whatman DESI -suodatinkiekoille. Kiekot pestään neljässä kulloinkin 150 ml :n vaihdossa 0,3 M am-moniumformaattia, pH 8,0, ja sitten kahdessa kummallakin: 5 kerralla 150 ml:n vaihdossa 90-%:isiä: etanolia kunkin pesun kestäessä 5 - 10 minuuttia. Sitten kiekot kuivataan lämpölampun alla ja lasketaan tuikelaskijalla, kun läsnä on 5 ml fluoria (Opti-Fluor O, Packard). Radioaktiivisuuden määrästä kullakin kiekolla lasketaan kokonais-DNA-syn-10 teesin määrä.

Testattavilla spesifisillä DNA-polymeraaseilla voi olla optimaalisia puskuri-, pH-, suola- tai lämpötilaolosuhteita, jotka poikkeavat edellä esitetyistä. Kukin DNA-polymeraasi tulisi testata olosuhteissa, jotka: antavat 15 tuolle entsyymille optimaalisen spesifisen polymeraasiäk-tiivisuuden.

Sen määrittämiseksi, johtaako jonkin tietyn DNA-polymeraasin modifiointi laskuun sen kyvyssä diskriminoida vastaan dideoksinukleotidej ä, suoritetaan ensin sarja 20 reaktioita ddNTP: e iden puuttuessa DNA- po 1 yme r aa s ip i t. o .1 -suutta vaihdellen alueen määrittämiseksi, jolla aktiivisuus vaihtelee likimäärin lineaarisesti entsyymipitoisuuden mukaan entsyymin sekä modifioidulle että ei-modifioi-dulle muodolle. Valitaan entsyymipitoisuus, joka on li-25 neaarisella alueella entsyymin molemmille muodoille; esim. entsyymipitoisuus, jolla noin 30 % templaatista replikoi-tuu 10 minuutin reaktiossa, on todennäköisesti tällaisella lineaarisella alueella.

Sitten kun oikea entsyymipitoisuus on valittu, suo-30 ritetaan sarja reaktioita vaihdellen joko yhden ddNTP:n määrää tai edullisesti kaikkien neljän ddNTP:n määrää seoksessa sen pitoisuuden määrittämiseksi, joka tarvitaan 50 %:n DNA-synteesistä inhlboimiseksi. Esimerkiksi edellä esitetyissä olosuhteissa (300 pM heijää dNTP:tä) taryifcasn 3 5 seuraavat neljän ddNTP:n seoksen pitoisuudet 50 %:n DNA- 76 synteesistä, inhiboimiseksi seuraaville kuudelle DMA-polymer aasi lie :

Polymeraasi [4ddNTP] 50 %:n inhibitioon 5 T7-DNÄ-poIyraeraasi 0,1 μΜ T7-DNA-polymefaasi. Y526F 300 μΜ

E. g oli DNA-pOlymeraasi-I 20 uM

E:, coli DNA-pOlyraeraasi-I F762Y 0,04 μΜ.

10

Taq-DNA-polymeräasi 150: μΜ

Tag-DNÄ-polymeraasi F667Y 0,4 μΜ Tätä testiä voidaan käyttää sen määrittämiseksi., 15 johtaako uuden DNA-polymeraasin modifikaatio laskuun sen kyvyssä diskriminoida vastaan ddNTP:eitä; jos mutaatiolla todella on tämä vaikutus, tarvitaan korkeampi neljän ddNTP: n pitoisuus inhiboimaan 50 % DNA-synteesistä edellä kuvatussa määrityksessä.

20 Esimerkki 9

Dideoksinukleotidien inkorporaation tehokkuuden määritys mittaamalla [a-3:!P] dAMP :n inkorporaatio synteettisiin aluke-templaafctikomplekseihin Tässä esimerkissä määritetään dNTP: n ja dd.NTP: n 25 välinen kilpailu käyttöön yhdessä kohdassa synteettisessä aluke-templaatissa. Tämä määritys poikkeaa muista sikäli, että se rajoittaa näiden kahden substraatin käytön vertailun yhteen yksittäiseen kohtaan, jolloin vältetään sek-venssispesifisen vaihtelevuuden aiheuttama komplikaatio 30 diskriminaatiossa. Vaikka tämä suhteellisen yksinkertainen määritys sopii DNA-polymeraasien kyvyn diskriminoida vastaan ddNTP:eitä alustavaan seulontaa, sitä ei tulisi käyttää esimerkeissä 6 - 8' esitettyjen määritysten kustannuksella, koska monasti ddNTP:eiden vastaiseen diskriminaa- i 35 tioon vaikuttavat voimakkaasti naapurisekvenssit, mikä on \ 77 merkittävä ongelma DNA-sekvenssianalyysilie [katso esimerkiksi Tabor ja .Richardson, J. Bio!.. Ghent 265 (.1990) 8322].

Tässä esimerkissä käytetään alla esitettyä kahta 5 aluke-templaattia, Ensimmäistä käytetään, &ATP:n ja ddÄTP:n välisen diskriminaation määrittämiseksi, kun taas toista käytetään dCTP:n ja ädCTP:n, dTTP:n ja ddTTP:n ja dGTP:n ja ddGTP:n välisen diskriminaation määrittämiseksi, 10 Aluke-templaatti A: 5' GGCGäCGTTGTÄAÄÄCGÄCGGCCäGTGCCA 3’ 31 GCTGCÄäCATTTTGGTGCCGGTCAGGGTTGCCC 5'

Aluke-templaatti B: 15 5' GGCGACGTTGTAAÄÄCGÄCGGCCAGTGCCA 3' 3' GCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCäCGGTGAGITTT 5'

Kukin reäktioseos sisältää 25 pmol sekä aluketta että templaattia. Aluke ja templaatti sekoitetaan keske-20 nään, ja juotetaan reaktioseoksessa (IX ~ ±0 μΐ) , joka

sisältää pitoisuudet 40 mM Tris-I-ICl, pH 8,0, 10 mM MgCl, ja 100 mM NaCl. Seosta inkuboidaan 65 °C:ssa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen se jäähdytetään huoneenlämpötilaan 30 minuutissa. Standardireaktioseos (45 μΐ) aluke-templaatti A:11a 25 suoritetuille reaktioille sisältää pitoisuudet 22 mM

Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl,, 55 mM NaCl, 25 pmol aluke-templaatti A-kompleksia, 5 μΜ [a-5SP] dGTP: tä (4 000 cpm/pmol) ja vaihtelevia pitoisuuksia idATP:tä ja ddATP:tä. Reaktioseokset sisälsivät myös 10 ng hiivan epäorgaanista 30 pyrofosfataasia pyrofosforolyysin inhiboimiseksi, joka

voisi muutoin nostaa DMA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota [Tabor ja Richardson, J. Biol. Chem. 265 (1990) I

8322]. Seoksia inkuboidaan 37 °C:ssa 1 minuutin ajan (70 0C:ssa hermotiilisille DNA-po1ymeraa se i11e) ja reak-35 hiot käynnistetään lisäämällä S μΐ-η eriä (0,01 - 1 yksik- 78 fcö) analysoitavaa DNA-polymeraasia laimennettuna 20 mM TrlsUGl:ään, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanoii ja 0,05 % nautaseerumialbumiinia. Reaktioseoksia inkuboidaan edelleen 37 cC:ssa 10 minuutin ajan (70 °C:ssa termofHiisille 5 DKA.-poiynierä:aseille) . Reaktiot päätetään lisäämällä 5 pl 100 mM EDTÄrliuosta, ja 45 μΐ sijoitetaan täpläksi Whatman DE81 -suodatinkiekoille. Kiekot pestään neljässä: kulloinkin 150 ml:n vaihdossa 0,3 M ammoniumformaat tia, pH 8,0, ja sitten kahdessa kummallakin kerralla 150 ml;n vaihdossa 10 90-%;ista etanolia kunkin pesun kestäessä 5 - 10 minuut tia, Sitten kiekot kuivataan lämpölampun alla ja lasketaan tuikelaskijalla, kun läsnä on S ml fluoria (Opti-Fluor O, Packard), Radioaktiivisuuden, määrästä kullakin kiekolla määritettiin inkorporoidun [22P]dGMP:n määrä. Olettamus 15 tehdään sitten/ kun yksi dAMP-tähde: on tullut inkorporoi-duksi döMP-tähteiden inkorporaation salpauksen poistamiseksi, neljä [32P] dGMP: tä inkorporoidaan kuhunkin alukkee-seen, jolloin inkorporoiduiksi tulleiden dAMP:eiden lukumäärä on 1/4 inkorporoituj en dGMP:eiden lukumäärästä.

20 Kaikki, reaktiot suoritetaan käyttäen vakiomäärää analysoitavaa DNA-polymeraasia; DNA-polymeraasin määrän tulisi olla riittävä replikoimaan 50 % dCMP-tähteiden ko-konaismäärästä templaatin yksisäikeiselle alueelle 10 minuutin inkuboinnissa pitoisuuden 10 μΜ dATP läsnä ollessa 25 ja ddATP:n puuttuessa. Testattavilla spesifisillä DNA-po-lymeraaseilTa saattaa olla optimimaaliset puskuri-, pH-, suola- tai lämpötilaolosuhteet.,, jotka poikkeavat edellä esitetyistä. Kukin DNA-polymeraasi tulisi testata olosuhteissa, jotka antavat tuolle entsyymille optimaalisen spe~ 30 sifisen polymeraasiaktiivisuuden. Tulisi myös suorittaa verrokkireaktioita, joissa ei ole läsnä - sen paremmin dATP:ta kuin ddATP:täkään; tämä määrittelee tausta-DNA-synteesin, joka tulisi vähentää kustakin näytteestä. Yleensä ottaen tämä on alle 10 % dATP:n läsnä ollessa saa-35 dusta DNA-synteesistä.

79

Reaktiot suoritetaan sitten, käyttäen pitoisuus 10 μΜ dÄTB ja vaihtelevia pitoisuuksia döATP:ta ddATP-määrän määrittämiseksi, joka tarvitaan inhiboimaan DNA-synteesi 50 %;lla. Esimerkkejä esitetään seuraavassa tau-5 lukossa ddATP-pitoisuudesta, joka tarvitaan inhiboimaan 50 % DNA-synteesistä pitoisuuden 10 μΜ dATP läsnä ollessa. Polymeraasit määritellään kuten esimerkissä 6.

Polymeraasi EddATP] 50 %:n inhibitioon 10 T7-DNÄ-poIymeraasi 30 μΜ T7-DNÄ~polymeraasi Y526F > 500 μΜ E. coli DNÄ-polymeraasi-I > 500 μΜ E. coli DNÄ-polymeraasi-I F762Y 6 μΜ 15

Tag-DMA-polymeraasi > 500 μΜ

Tag-DNA-polymeraasi F667Y 5 μΜ

Analogisen testin suorittamiseksi, joka mittaa 20 ddGTP-, cLdTTP- tai ddCTP-vastaista diskriminaatiota, suoritetaan edellä kuvattuun nähden identtisiä reaktioita lukuun ottamatta, että käytetään aluke-templaatti B:ta aluke-templaatti A;n asemesta j s. että reaktiot: sisältävät pitoisuudet 10 μΜ dGTP, dTTP j a dCTP j a 5 μΜ [3-3¾ dATP 25 (4 000 cpm/pmol) ja vaihtelevia pitoisuuksia joko ddGTP:fciä, ddTTP;tä tai ddCTP:tä.

Kuten, muidenkin esimerkkien .kohdalla DNA-polymeraa-sit, joilla on 31-5'-eksonukleaasiaktlivisuutta, voivat häiritä tätä määritystä tehden entsyymistä diskriminatori-30 semman ddNIPteitä vastaan kuin mikä johtuu diskriminaatiosta analogin inkorporaation tasolla. Lisäksi entsyymit, jonka eksonukleaasiaktiivisuustasot. ovat korkeat, voi käyttää kaikki dNTP:t reaktioseoksesta (etenkin kun dNTP;eitä on näissä reaktioissa läsnä suhteellisen mata-35 Iina tasoina), mikä johtaa nolla-netto-DNA-synteesiin 8Ö [esim. natiivi T7-DNA-pQlymeraasi, katso Tabor ja Richardson, J. Bio!. Chem. 264 (1989) 6447]. Näissä tapauksissa DNA-polymeraasin pitoisuutta ja reaktion inkubointi-aikaa tulisi säätää DNA-synteesin maksimitason saamiseksi 5 ddNTP:eiden puuttuessa.

Esimerkki 10 [a-a2P] ddNMP: eiden inkorporaation synteettiseen aluke-templaatfcikoinpleks iin tehokkuuden määrittäminen Tässä esimerkissä määritetään dNMP-n ja ddNMP:n 10 välinen kilpailu inkorporaatiolle yhteen kohtaan synteettisessä aluke-templaatissa. Tämä määritys poikkeaa esimerkin 9 määrityksestä sikäli, että leima on [a-'2P]ddATP ja siten mitataan ddAMP:N inkorporaatiota. Tätä määritystä voidaan käyttää sen testaamiseksi, inhiboiko ddNTP DNA-15 polymeraasia toimimalla ketjupäättäjänä, tulemalla inkor- poroidtiksi alukkeen 3' -päähän vai yksinkertaisesti sitomalla DNA-polymeraasin ja estämällä DNA:n jatkosynteesi tulematta tosiasiassa inkorporoiduksi alukkeeseen.

Seuraavassa esimerkissä mitataan ddÄMP:n inkorpo-20 raatio käyttäen [a-32P] ddATP:tä ja aluke-templaat ti A: ta (esimerkki 9):

Aluke-templaatti A: 5' GGCGACGTTGTäAAÄCGACGGCCäGTGCCA 3' 25 3’ GCTGCAACATTTTGCTGGCGGTCACGGTTCCCC 5' [a-3*P] ddGMP:n, [a~j2PjddCMP-n ja [a-‘2P] ddTMP:n in-korporaatio voitaisiin testata samalla tavalla sopivalla templaatilla (esimerkiksi aluke—templaatti esimerkissä 9).

30 Kukin reaktioseos sisältää 25 pmol sekä aluketta että templaattia (aluke-templaatti A, katso.edellä). Aluke ja templaatti sekoitetaan keskenään, ja juotetaan reaktio-seoksessa (IX - 10 μΐ) , joka sisältää pitoisuudet 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM .MgCl2 ja 100 mM NaCl. Seosta inku- j 35 boidaan 65 °G:ssa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen se jääh- j | 81

täytetään huoneenlämpötilaan 3 0: minuutissa. Standardireak-tioseos (45 μΐ) sisältää pitoisuudet 22 mM Tris-HCl, pH

3,0, 5,5 mM MgCl,, 55 mM NaCl, 25 pmol aiuke-templaatti A-kompleksia, 2,5 μΜ [a-3‘P] ddATP: tä (Amersham P310235, > 5 5 000 Ci/mmol laimennettuna leimaamattomalla ddATP:llä spesifiseen aktiivisuuteen 4 QÖQ cpm/pmol) ja vaihtelevia pitoisuuksia eLATP.-tä. Reaktioseokset sisälsivät myös 10 ng hiivan epäorgaanista pyrofosfataasia pyrofosforolyysin inhibaimiseksi, joka voisi muutoin nostaa DNA-polymeraasin 10 näennäistä diskriminaatiota [Tabor ja Richardson, J. Hioi. Chem. 265 (1990) 8322]* Seoksia inkuboidaan 37 °C:ssa 1 minuutin ajan (70 3C:ssa termofiilisille DNA-polymeraa-seille) ja reaktiot käynnistetään lisäämällä S μΐ :n eris (0,01 - 1 yksikkö) analysoitavaa DNA-polymeraasia laimen-15 nettuna 20 mM;' Tris-HCl;ään, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanoli ja 0,05 % nautaseerumiälbumiinia. Reaktioseoksia in-kuboidaan edelleen 37 °C;ssa 10 minuutin ajan (70 °C:ssa termofHiisille DNA-po1ymevaaseille). Reaktiot päätetään lisäämällä 5 μΐ 100 mM EDTÄ-liuosta, ja 45 μΐ sijoitetaan 20 täpläksi Whatman DESI -suodatinkiekoille. Kiekot pestään neljässä kulloinkin 150 ml:n vaihdossa 0,3 M ammoniumför-maattia, pH 8,0, ja sitten kahdessa kummallakin kerralla ISO ml:n vaihdossa 90-%:ista etanolia kunkin pesun kestäessä 5 - 10 minuuttia. Sitten kiekot kuivataan lämpö- 25 lampun alla ja lasketaan tuikelaski j alla, kun läsnä on 5 ml fluoria (Opti-Fluor O, Packard). Radioaktiivisuuden määrästä kullakin kiekolla määritettiin inkorporo i d un [32P] ddAMP:n määrä.

Kaikki reaktiot suoritetaan vakiomäärällä testat-30 tavaa DNA-polymeraasia; DNA-polymeraasin määrän tulisi vastata sitä pitoisuutta, joka antaa korkeimman [“P]ddAMP-inkorporaatiotason aluke-templaatti A:han 10 minuutin in-kuboinnissa dATP:n puuttuessa. Testattavilla spesifisillä DNA-polymeraaseilla saattaa olla optimaalisia puskuri-, 35 pH-, suola- tai lämpötilaolosuhteita, jotka poikkeavat 82 edellä esitetyistä. Kukin DNÄ-polymeraasi tulisi testata olosuhteissa, jotka antavat tuolle entsyymille optimaalisen spesifisen polymeraasiaktiivisuuden.

Tämän määrityksen käyttämiseksi ddNTP-vastaisen 5 diskriminaatiotason määrittämiseksi suoritetaan reaktioita vakiomäärällä DNA-polymeraasia ja [32P] ddATP: ta pitoisuuden 2,5 pM dÄTP: tä ( [“'P] ddATP:hen nähden ekvirtiolaarinen pitoisuus) läsnä ollessa tai puuttuessa, ja määritetään vaikutus, joka dATF: n läsnäololla on [32P]ddAMP:n inkorporaa-1Ö tioon. Jos DMA-polymer aasi ei diskriminoi ddAMPm ja dAMP:n inkorporaation välillä ja sillä ei ole 3'-5'-ekso-nukleaasiaktiivisuutta, dATPm lisääminen inhiboi Γ'Ρ] ddAMPm inkorporaatiota 50 % : 11a.

Tämä testi on paras DMA-polymeraasille, joak inkor-15 poroi tehokkaasti ddNMP:eitä, kuten Tag-DNA-polymeraasi F667Y. DNA-polymeraaseille, jotka diskriminoivat voimakkaasti vastaan ddNMP:eitä, edullinen on aiempi määritys, jossa leima on, muussa dMTP;ssä, kuin se, jota käytetään kilpailussa ddNTP-.n kanssa, koska tuossa tapauksessa pal-20 jon korkeampia ddMTP-pitoisuuksia voidaan käyttää.,

Kuitenkin DNA-polymeraaseilla, jotka diskriminoivat voimakkaasti ddNMP:eitä vastaan, oltaessa kiinnostuneita testaamaan, laskeeko jokin tietty mutaatio ddNMP-vastaisen diskriminaation tasoa, tätä määritystä voitaisiin 'käyttää 25 määrittämällä ei-modifioitu, DMA-polymeraasi tällä substraatilla dATPm puuttuessa (mitaten [32P] ddAMPm in-korporaatio DNA-polymeraasipitoisuuden funktiona) ja vertaamalla inkorporaationopeutta mutanttientsyymin inkorpo- j raationopeuteen. Jos mutaatio laskee ddATP-vastaista 30 diskriminaatiota, mutanttientsyymillä tulisi olla korkeam pi spesifinen aktiivisuus [3'P]ddAMPm inkorporaatiolle.

Kuten muiden esimerkkein kohdalla, DNA-polymeraa-sit, joilla on 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuutta, voivat häiritä tätä määritystä tekemällä entsyymistä diskrimina-35 torisempi ddNTPreitä vastaan kuin mitä johtuu diskriminaa- 83 tlosta analogin inkorporaation tasolla. Kuten, esimerkissä .9, entsyymit, joiden eksonukleaasiaktiivisuustasot. ovat korkeat, voivat kuluttaa kaikki dNTP:tf mikä johtaa [J~P]:dcLAMP:n nolla-netto-inkorporaatioon. Näissä tapauksis-.5 sa DNA-polymeraasin pitoisuus ja reaktion ihkubointiaika tulisi säätää [MP]ddAMP:n maksimaalisen inkorporaatiotason saamiseksi testattavalla DNA-polymeraasilla.

Kaikki edeltävät menetelmät perustuvat radioaktiivisuuteen joko laajennetun alukkeen pituuden tai DNA-syn-10 teesin alukkeella määrän toteamiseksi. Dideoksinukleoti-dien inkorporaation jonkin DNÄ-poiymeraasin toimesta tehokkuus voidaan mitata myös ei-radioaktiivisesti. Alla esitetään kaksi esimerkkiä, joissa käytetään, joko fluori-soivia alukke.it a tai fluoresoivia DyeDeoxy Terminator 15 -päättäjiä, jotka todetaan Applied Biosystems malli 373A DNA Sequencing System -systeemillä..

Esimerkki 11

Dideoksinukleotidien inkorporaation tehokkuuden määritys käyttäen yksisäikeiseen DNA:hän jaotettua fluore-20 soivaa aluketta ja geelielektroforeesia Tässä esimerkissä fluoresoivasti leimattu aluke juotetaan yksisäikeiseen DNAthan ja DNÄ-synteesireaktioita suoritetaan käyttäen vaihtelevia dNTP/ddNTP-suhteita. Näytteet panostetaan sitten Applied Biosystems malli 373A 25 DNA Sequencing System -systeemiin, ja fluoresoivan fragmentin pituus määritetään suoralla fluoresenssin toteamisella geelielektroforeesin aikana. Reaktio suoritetaan kuten kuvataan julkaisussa Tabor ja Richardson, J. Biol. Chem. 265 (1990) 8322. Käytetty fluoresoiva aluke on 30 "Pam"-aluke {Applied Biosystems) . Käytetty DNA on yksisäi- keinen M13 mGPl-2 DNA kuten kuvataan esimerkissä 3. Aluke juotetaan Ml 3 mGPl-2 yksisäie-DNA- ternplaattiin reaktio-seoksessa {IX - 10 μΐ) , joka sisältää 2 pg Ml-3- mGPl-2 DNA:ta, 5 ng aluketta, pitoisuudet 40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 35 10 mM- MgCl. ja 100 mM NaGl. Seosta inkuboidaan 65 °C:ssa 2 84 minuutin ajan, minkä jälkeen se jäähdytetään huoneenlämpö-tilaan 30 minuutissa. StandardireaktiQseos (1-8 μΐ) sisältää pitoisuudet 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl,, 55 mM NaCl ja vaihtelevia pitoisuuksia neljää dNTPrtä ja yhtä 5 neljästä ddKTP;stä. Reaktioseokset sisälsivät myös 10 ng hiivan epäorgaanista pyrofosfataasia pyrofosforolyysin inhiboimiseksi, joka voisi muutoin nostaa DNÄ-polymeraasin näennäistä: diskriminaatiota [Tabor ja Richardson, J. Blol.

Chem. 265 (1990) 8322], Seoksia inkuboidaan 37 °C;ssa 1 10 minuutin ajan (70 °C:ssa termofiilisille DNA-polymeraa-seille) ja reaktiot käynnistetään, lisäämällä 2 μΐ m eriä (0,01 - 1 yksikkö} analysoitavaa DNA-polymeraasia laimennettuna 20 titM. Tris-HCl: ään, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanoii ja 0,05 % nautaseerumialbumiinia. Reaktioseoksia in- 15 kuboidaan edelleen 37 °C;ssa 10 minuutin ajan (70 °C;ssa termofiilisille DNA-polymeraaseille). Reaktiot päätetään lisäämällä 8 μΐ 20 mM DTPÄ-liuosta, 1 M kaliuxnasetaatti, pH 5,0, ja 60 μΐ etanolia. Sentrifugoinnin jälkeen DNA uudelleensuspendöidaan 6 μΐ:aan 80-%rista formamidia, 20 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, ja 1 mM EDTA, ja kuumennetaan 80 °C:ssa 2 minuutin ajan välittömästi ennen panostamista polyakryyliamidigeelille Applied Biosystems 373A DNA Sequencing System -systeemiin noudatten valmistajan ohjeita .

25 Testattavilla spesifisillä DNA-polymeraaseilla saattaa olla optimaalisia puskuri-, pH-, suola- tai lämpötilaolosuhteita, jotka poikkeavat edellä esitetyistä. Kukin DNA-polymeraasi tulisi testata olosuhteissa, jotka antavat tuolle entsyymille optimaalisen spesifisen polyme-30 raasiaktiivisuuden. DNÄ-polymeraasin pitoisuuden tulisi olla riittävä laajentamaan valtaosa alukkeista ainakin usea sata nukleotidiä tai kunnes diöeoksinukleotidi on inkorporoitu 10 minuutin reaktiossa.

dNTPieiden suhde ddNTP-eihin säädetään optimaalis-35 ten piikki-intensiteettien saamiseksi noin 300 emäkselle.

j 85

Esimerkiksi Taq-DNA-polymeraasille noin 10 μΜ neljää dNTP:tä ja 200 - 600 μΜ ddNTP:tä on optimaalinen, kun taas Taq-DNA-polymeraasi F667Y:lle noin 300 μΜ neljää dNTPrtä ja 0,5 - 5 μΜ ddNTP:tä on optimaalinen.

5 Sen määrittämiseksi, johtaako jonkin tietyn DNA- polytneraasin modifikaatio laskuun sen kyvyssä diskriminoida vastaan dideoksinukleotidejä, tulisi suorittaa reaktioita vaihtelevin dNTP/ddNTP-suhtein sekä ei-modifioiduille että modifioiduille DNA-polymeraaseille, ja eri pituisten 10 dideoksipäätteisten fragmenttien-, intensiteettejä verrataan sen määrittämiseksi, käyttääkö modifioitu DNA-polymeraasi ddNTP:eitä tehokkaammin kuin ei-modifioitu entsyymi.

Esimerkki 12

Fluoresoivien dideoksinukleotidien inkorporaation 15 tehokkuuden määritys geelielektroforeesilla Tässä esimerkissä ei-fluoresoiva aluke juotetaan yksisäikeiseen DNA:hän ja suoritetaan DNA-synteesireaktioita käyttäen vaihtelevia dNTPreiden suhteita yhteen fluoresoivasti leimattuun ddNTP:hen. Näytteet panostetaan 20 sitten Applied Biosystems malli 373A DNA Sequencing System -systeemiin ja kunkin fluoresoivan fragmentin pituus määritetään suoralla fluoresenssin toteamisella geeli-elektroforeesin aikana. Tässä esimerkissä käytetty aluke on esimerkissä 3 kuvattu 40-meeri, ja templaatti on esi-25 merkissä 3 kuvattu yksisäikeinen Ml3 mGPl-2. Aluke juotetaan Ml3 mGPl-2 yksisäie-DNA-templaattiin reaktioseoksessa (IX = 10 μΐ), joka sisältää 2 pg M13 mGPl-2 DNA:ta, 6 pmol aluketta (10-kertainen mooliylitnäärä templaattiin nähden), pitoisuudet 4 0 tnM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl, ja 100 mM 30 NaCl. Seosta inkuboidaan 65 °C:ssa 2 minuutin ajan, minkä ; jälkeen se jäähdytetään huoneenlämpötilaan -30 minuutissa. Standardireaktioseos (18 μΐ) sisältää pitoisuudet 22 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5,5 mM MgCl,, 55 mM NaCl, ja vaihtelevia pitoisuuksia neljää dNTP:tä sekä yhtä neljästä fluoresoi-.3 5 vasti leimatusta ddNTP: s ta. Neljä f luoresoivasti leimattua 86 ddNTP:tä ovat Applied Biosystemsiltä (Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, osanumero 401150) , ja niitä kutsutaan nimillä G, A, T tai C "DyeDeoxy

Tertrdnator" [manuaali Taq Dye Deoxy Terminator Cycle 5 Sequencing Kit -pakkaukselle, osanumero 901497, Rev. E) . Reaktiöseökset sisälsivät myös 10 ng hiivan epäorgaanista pyrofosfataasia pyröfösforolyysin inhiboimiseksi, joka voisi muutoin nostaa DNÄ-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota [Tabor ja Richardson, J. Biol. Chem. .265 (1990) 10 8322]. Seoksia inkuboidaan 37 °C:ssa 1 minuutin ajan (70 °C: ssa termof iilisille: DNA-polymeraaseille) ja reaktiot käynnistetään lisäämällä 2 μ1:η eriä (0,01 - 1 yksikkö) analysoitavaa DNA-pölymeraasia laimennettuna 20 mM Tris-HCl ;ään, pH 7,5, 10 ItiM 2 -merkaptoetanoli ja 0,05 % 15 nautaseerumialbumiinia. Reaktioseoksia inkuboidaan edel leen 37 °C:ssa 10 minuutin ajan (70 °C:ssa termofiilisille DNÄ~pölymeraaseille). Reaktiot päätetään lisäämällä 8 pl 2 0 mM EDTA liuosta, 1 M kaliumasetaatti;, pH 5,0, ja 60 pl etanolia, Sentrifugöinnin jälkeen DNA uudeHeensuspendoi-20 da an 6 pl-.aan 80"%:ista formamidia, 10 rt TrisUCl, pH 8,0, ja 1 mM. DTEA,. ja kuumennetaan 80 °C: ssa 2 minuutin ajan välittömästi ennen panostamista pölyakryyliamidigeelille Applied Biosystems 373A DNA Sequencing System -systeemiin noudatten valmistajan ohjeita.

25 Testattavilla spesifisillä DNA-polymeraäseiila saattaa olla optimaalisia puskuri-, pH-k-, suola- tai lämpö t il aolosuiit ei tä, jotka poikkeavat edellä esitetyistä.

Kukin DNA-polymeraasi tulisi testata olosuhteissa, jotka antavat tuolle entsyymille optimaalisen spesifisen polyme-30 raasiaktiivisuuden. Näissä reaktioissa käytetyn DNA-poly- meraasin pitoisuuden tulisi olla riittävä laajentamaan valtaosa alukkeista ainakin usea sata nukleotidiä tai kunnes dideoksinukleötidi on inkdrporoitu 10 minuutin reak- | tiossa. DNÄ~pölymeraaseille, joilla on 5'-3’-eksönukleaa- | 35 siaktiivisuutta, kuten Taq-DFA-polymeraäsi, DNA-polymeraa- | j j 87 sipitoisuus on pidettävä riittävän alhaisena, jotta vältettäisiin, että tämä aktiivisuus hajottaa merkittävän prosenttiosuuden fragmenttien 5'-päistä.

Sen määrittämiseksi, diskriminoiko DNA-polymeraasi 5 voimakkaasti vai heikosti fluoresoivaa ddNTP:tä vastaan, suoritetaan reaktioita käyttäen pitoisuutta 20 μΜ neljää dNTP:tä ja 0,01 μΐ kutakin DyeDeoxy Terminator -päättäjää, jotka saadaan Applied Biosystemsiltä (osanumero 401150) . Käytettäessä Tag-DNA-polymeraasia näissä olosuhteissa valio taosa fluoresenssista on joko ei-inkorporoiduissa väri-ddNTPteissä geelin eturintamassa, tai fragmenteissa, joiden pituus on yli usea sata emästä. Sitä vastoin Tag-DNA-polymeraasimutantilla F667Y:llä näissä olosiihteissä valtaosa fluoresnessista on fragmenteissa, jotka ovat ainakin 15 usean sadan emäksen pituisia, ja merkittävästi matalampi prosenttiosuus kokonaisfluoresenssista on ei-inkorporoiduissa väri“ddNTPteissä geelin eturintamassa.

Sen määrittämiseksi, johtaako jonkin tietyn DNA-polymeraasin modifikaatio laskuun sen kyvyssä diskriminoi-20 da dideoksinukleotidejä vastaan, suoritetaan reaktioita

käyttäen vaihtelevia dNTP t eiden suhteita DyeDeoxy Terminator -päättäjiin, sekä ei-modifioiduille: että modifioiduille DNA-polymeraaseille, ja saatujen fluoresoivien fragmenttien. keskimääräistä pituutta verrataan sen määrittämisek- I

25 si, käyttääkö modifioitu DNA-polymeraasi DyeDeoxy Termina tor -päättäjiä tehokkaammin kuin ei-modifioitu entsyymi.

Seuraavat esimerkit tarjoavat testejä eri DNA-po-lymeraasien syntetisoimien dideoksipäättelsten fragmenttien tuottamien nauhaintensiteettien yhtenäisyyden määrit-30 tämiseksi.

88

Esimerkki 13

Dideoksinukleofeidien inkorporaatidn yhtenäisyyden määritys käyttäen yksi säikeisen M13 DNA: n ja 5! '2P-leima-tun 40-meerialukkeen kompleksia ja geelieiekfcroföreesia s Tässä esimerkissä dideoksinukleQtidi-inkQrpQraation yhtenäisyys mitataan 5' a2P-pääleirriatulla alukkeella, joka on laajennettu yksisäikeisellä 'Ml3 DNA -templaatilla. Kolme aktiivisuutta voi aiheuttaa vaihtelua dideoksipäätteis-ten fragmenttien nauhaintensiteetissä. Yksi ön eksonukle-10 aasiaktiivisuus, joka voi ensisijaisesti katkoa tiettyjä sekvenssejä; tämä vältetään poistamalla aktiivisuus selektiivisesti joko kemiallisin tai geneettisin keinoin [katso esimerkiksi Tabor ja Richardson, J. Biol. Chem. 264 (1989) 6447]. Toinen on pyrofosforolyysi; tämä vältetään helposti 15 sisällyttämällä reaktioseokseen pyrofosfataäsia, joka hajottaa DNA-synteesin aikana akkumuloituvan pyrofosfaatin ja on pyrofosforolyysille välttämätön substraatti. Kolmas on sekvenssispesifinen vaihtelu dideoksinukleotidien in-korporaatiossa. vaihtelu nauhaintensiteetissä on tuhoisa 20 DNA-sekvenssianalyysille laskiessaan määritetyn DNA-sek

venssin tarkkuutta. Tämä testi on suunniteltu vaihtelevuuden nauhaintensiteeteissä asteen vertaamiseksi eri DNÄ-polymeraasien syntetisoimissa fragmenteissa, mukaan lukien I

mutantti-DNA-polymeraasit, jotka saattavat inkorporoida 25 dideoksinukleotidej ä tehokkaammin

Aluke, tmeplaatti ja reaktioölosuhteet tässä esimerkissä ovat identtiset esimerkeissä 6 ja 7 kuvattuihin nähden. Templaatti on esimerkissä 3 kuvattu Ml 3 m(3Pl-2 yksisäie-DNA, ja aluke on niinikään esimerkissä 3 kuvattu 3 0 40-tneeri. Käytetään reaktio-olosuhteita, jotka ovat testattavalle DNA-pölymeraasille: optimaaliset mitä tulee reaktion puskuriin, pHlhon, suoloihin ja lämpötilaan.

Edullisesti magnesium on ainoa reaktioseoksessa läsnä oleva metalli-ioni {eli reaktiot Suoritetaan lisäämättä man-35 gaani-ioneja). Valitaan DNA-polymeraasipitoisuus, jossa valtaosa alukkeista. laajenee 10 minuutin reaktiossa ja 89 päättyy dideaksinukleotidin inkorporaatioon. dNTPteiden suhteet ddNTPteihin säädetään testattavalle spesifiselle DNA-polymeraasille siten, että keskimääräinen fragmentti -koko on noin 100 - 30 0 nukleotidiä. ddCTP on edullinen 5 ddBTP käytettäväksi yhtenäisyyden testissä, koska tähän di deoks inukleot i di in päättyvillä fragmenteilla on taipumus olla vaihtelevimpia intensiteetiltään [katso esimerkiksi Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 4076] .: Geelielektrof oreesi, autoradiokuvanotto ja nauha -10 intensiteettien analyysi joko geeli pyyhkäisemällä tai

Phosphoimager-analyysillä suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 6. Elektrof oreesia jatketaan kunnes pituudeltaan noin 55 nukleotidin fragmentteja on geelin pohjalla (väri b romi f eno1ί s i uinen on kulkenut ulos geelin pohjasta ja 15 väri ksyleenisyanoli on noin 8 cm geelin pohjasta).

Jollekin tietylle sarjalle ddNMP-päätteisiä fragmentteja, esimerkiksi sarjalle ddCMP-päätteisiä fragmentteja, määritetään edullisesti Phosphoimager-analyysillä geelin pohjasta lukien ensimmäisten 20 fragmentin inten-20 siteetit. Vaihtoehtoisesti autoradiokuva voidaan pyyhkäis tä kuvannusdensitometrillä ensimmäisten 20 fragmentin suhteellistan intensiteettien määrittämiseksi, Nämä intensi- j

teetit analysoidaan sitten tilastollisesti kuten kuvataan I

esimerkissä 6 niiden vaihtelevuuden määrittämiseksi. Esi-25 merkiksi arvot voidaan piirtää kuvaajana käyttäen

Macintosh-ohjelmaa Käleidograph versio 3.0 (Synergy Software) . Saadut kuvaajat sovitetaan eksponentiaaliseen vaimennus käy r ään käyttäen Kaleidograph-kirjastorutiinia tälle funktiolle* R‘,: tulostietojen korrelaatioindeksi, lasketaan 30 Kaleidograph-kirjastorutiinilla. Tämä on vaihtelevuuden nauhaintensiteeteissä mitta. Arvoja, jotka - saadaan R::lie käytettäessä uutta DNA-polymeraasia, verrataan arvoihin, jotka saadaan käyttäen tunnettuja HNA-polymeraaseja, esimerkiksi _2 8 T7-DNA-polymeraas ia (Sequenase versio 2.0, 35 United States Biochemical Corporation} magnesiumin tai 90 mangaanin läsnä ollessa [katso TaJoor ja Richardson, J.

Biol. Chem. 265 (1990) 8322], Jk. coli DNA-polymeraäsi-I:ta (joko Klenow-fragmentti tai IQenow-fragmentti mutaatioin F762Y) tai Taq-DNA-polymeraasia (joko villityyppiä tai 5 mutanttia F667Y). Näillä tunnetuilla DNA-polymeraaseille saatuja R2-arvoja käytetään standardeina, joiden avulla verrata uutta DNA-polymeraasia sen yhtenäisyyden osalta.

Esimerkki 14 [a-53P] ddNMP reiden inkorporaation yhtenäisyyden mää-10 ritys käyttäen yksisäie-MI3 DNA-ex-leimattu aluke-kompleksia ja geelielektroforeesia Tässä esimerkissä dideoksinukleotidi-inkorporaation yhtenäisyys mitataan käyttäen ei-leimattua aluketta juotettuna yksisäie-'Mi3 DA-tempiaattiin ja suorittamalla DNA-15 synteesi [a-^P]ddATP:n läsnä ollessa. Esimerkissä 13 kuvattu testi on edullinen tähän nähden dideoksinukleotidi-päätteisten fragmenttien yhtenäisyyden mittaamiseksi, sillä on kätevämpää käyttää korkeita ddNTP:eiden pitoisuuksia, joita tarvitaan käytettäviksi entsyymeillä, jot-20 ka diskriminoivat voimakkaasti ddNTP:eitä vastaan, kuten E. coli DNA-polymeraasi-1, Taq-DNA-polymeraasi ja T7-DNA-polymeraasi Y526F. Tämän esimerkin testi sopii parhaiten käytettäväksi entsyymien kanssa, jotka inkorporoivat di-deoksinukleot idejä tehokkaasti, kuten T7-DNA-polymeraas i, 25 E_„_ coli DNA-polymeraas i -1 F762Y ja Taq-DNA-polymeraasi F667Y.

Aluke, templaatti ja yleiset reaktio-olosuhteet tässä esimerkissä ovat samankaltaiset kuin kuvattiin esimerkissä 8 seuraavin poikkeuksin. Templaatti on esimerkis-3Q sä 3 kuvattu M13 mGPl-2 yksisäie-DNA ja aluke on niinikään esimerkissä 3 kuvattu 40-meeri. Käytetään reaktio-olosuhteita, jotka ovat optimaaliset testattavalle DNA-polyme- I

raasille mitä tulee reaktion puskuriin, pH:hon, suoloihin ja lämpötilaan. Edullisesti magnesium on ainoa reaktio-35 seoksessa läsnä oleva metalli-ioni (eli reaktiot suorite- 91 taan lisäämättä mangaani-ioneja) . Reaktiot suoritetaan käyttäen pitoisuus 50 μΜ dGTP:tä, dCTP:tä ja dTTP:tä ja vaihteleyia pitoisuuksia dATP: tä ja [a-32P] ddATP: tä. dATP :n ja [a~^P] ddATP:n pitoisuudet valitaan rädioaktiivisuusmää-5 rän maksimoiseksi noin 100 nukleotidin mittaisissa fragmenteissa. Kaikki muut näkökohdat mitä tulee radioaktii-vistenfragmenttien geelielektroforeesiin ja analyysiin ovat kuten kuvattiin esimerkissä 13..

Esimerkki 15 10 Dideoksinukleotidien inkorpo raat ion yhtenäisyyden määritys käyttäen yksisaikeisen M13 DNA:n ja fluoresoivaa-ti leimatun alukkeen kompleksia ja geelielektroforeesia Tässä esimerkissä suoritetaan esimerkissä 11 kuvatun kaltaisia reaktioita. Tempiaatti on Ml3 mGPl-2 yksi-15 säie-DNA esimerkissä 3 kuvatun mukaisesti ja aluke on niinikään esimerkissä 3 kuvattu 40-meeri. Käytetään reaktio-olosuhteita, jotka ovat optimaaliset testattavalle DNA-polymeraasille mitä tulee reaktion puskuriin, pH:hon, suoloihin ja lämpötilaan. Edullisesti magnesium on ainoa 20 reaktioseoksessa läsnä oleva metalli-ioni {eli reaktiot suoritetaan lisäämättä mangaani-ioneja). Valitaan DNA-po-lymeraasipitoisuus, jossa valtaosa alukkeista laajenee 10 minuutin reaktiossa ja päättyy dideoksinukleot.idin inkor-poraatiöon. dNTP:eiden suhteet ddNTP:eihin säädetään tes-25 tattavalle spesifiselle DNA-polymeraasille siten, että keskimääräinen fragmenttikoko on noin 100 - 200 nukleotidiä . ddCTP on edullinen ddNTP käytettäväksi, koska tähän dideoksinukleotidiin päättyvillä fragmenteilla on taipumus olla vaihtelevampia intensiteetiltään [katso esimerkiksi 30 Tabor ja Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 4076] . Aina ensimmäisten 50 dideöksipäätteisen fragmentin alukkeesta (noin 200 nukleotidiä) intensiteetit määritetään, ja ne analysoidaan tilastollisesti kuten kuvataan esimerkissä 13. Korrelaatioindeksi R! määritetään testatfca-35 valle DNA-polymeraasille, ja sitä verrataan tunnetuilla 92 DNA-polymeraaseilla saatuun kuten kuvataan esimerkissä 13. Vaihtoehtoisesti: määritetään ensimmäisten 50 nauhan korkeudet, ja lasketaan viereisten nauhojenkorkeuksien suhde, jota käytetään vaihtelevuuden mittanai näiden, testat-5 tavalla DNA.-polymeraasilla suoritetuista reaktioista saatujen suliteiden maksimia ja keskiarvoa verrataan arvoihin, jotka, on saatu reaktioille, jotka on suoritettu käyttäen tunnettuja DNA-polymeraaseja, kuten esimerkissä 13 kuvatun kaltaisia.

10 Esimerkki 16

Fluoresoivien dideoksinukleotldien inkorporaation yhtenäisyyden määritys geelielektroforeesilla Tässä esimerkissä suoritetaan esimerkissä 12: kuvatun kaltaisia, reaktioita:. DyeDeoxy Terminator -päättäjien 15 inkorporaation yhtenäisyyden määrittämiseksi spesifiselle DNÄ-polymeraasille dNTPreiden ja spesifisen DyeDeoxy Terminator- -päättäjän pitoisuudet valitaan .siten., että saadaan 'keskimääräiseltä pituudeltaan 100 - 200 nukleotidin fluoresoivasti leimattuja fragmentteja. Fluoresenssin 20 intensiteetti määritetään fragmenteille 10 - 40 alukkeesta (ensimmäiset 1.0 fragmenttia lähellä fluoresoivasti leimattua aluketta jätetään huomiotta). Fragmentit analysoidaan tilastollisesti kuten kuvataan esimerkissä 13, ja keskimääräinen vaihtelevuus määritellään Roksi, joka on korre-25 laatioindeksi eksponentiaaliseen vaimennuskäyrään sovite tuille tulostiedoille. Ra:lle saatuja arvoja verrataan esimerkissä 13 kuvatun mukaisesti tunnettuja DNA-po1ymeraase- i ja käyttäen saatuihin. Sen määrittämiseksi, johtaako spesifinen mutaatio DNA-polymeraasissa siihen, että tuo DNA-30 polyrae::aasi tuottaa nauhoja, joiden vaihtelevuus on vähäisempi, mutantti-DNA-polymeraasille saatua R"-arvoa verrataan ei-modifioidulle: DNA-polymeraasille saatuun.

93

Esimerkki 17 DNA-sekvens s i analyysi käyttäen dideoksinukleotidej ä tehokkaasti inkorporoivaa DNA-polymeraasia DNA-sekvenssianalyysi tämän keksinnön mukaisella 5 DNA-polymeraasilla suoritetaan käyttäen tavanomaisia menettelyjä siten, että dNTPreiden suhde ddNTP:eihin säädetään dideoksipaatteisten fragmenttien saamiseksi, joiden keskimääräinen pituus sopii erotukseen elektroforeesilla.

E. coli DNA - polynie raasi-I:n suuren fragmentin mutant il le, 10 "Klenow-fragmentti F762Y", reaktiotta suoritetaan oleellisesti kuten modifioidulla T7~DNA-polymeraasilla ja kuten kuvataan Taborin ja Richardsonin US-patenttijulkaisussa numero 4 795 6:99, julkaisussa Tabor ja Richardson, Proc.

Natl. Acad. Soi. USA 84 (1987) 4767, ja Sequenase-manuaa- 15 Iisaa, "Step-By-Step Protocols For DNA Sequencing With Sequenase", 3, painos, United States Biochemical Corpor ation, Koska: Klenow-fragmentti F762Y inkorporoi dideoksinukleotide ja noin 5 kertaa tehokkaammin kuin modifioitu T7-DNA-polymeraasi, ddNTPreiden pitoisuutta laajennus-pää-20 tösseoksissa tulisi laskea tekijällä 5 verrattuna standar-doseoksiin, joita suositellaan modifioidulle T7-DNA-poly-meraasille (Sequenase-manuaali, supra).

DNA-sekvenssianalyysi lämpöstabi ililla DNÄ-polyme-raasilla, kuten Tag-DNA-polymeraasi F667Y, suoritetaan ku-25 ten kuvaavat Innis et ai. . Proc. Natl:. Acad. Sei. USA 85 (1988) 9436, seuraavin modifikaatioin. Kun Innis et ai.

suosittelevat dNTP/ddNTP-· suhteita 1:6: dGTP/ddGTP, 1:32 dÄTP/ddATP, 1:48 dTTP/ddTTP ja 1:16 dCTPrddCTP, näitä j suhteita on säädettävä Taq-DNA-polymeraasi F667Y:n villi-30 tyyppi-Taq-DNA-polymeraasiin verrattuna 3 000 - 8 000 kertaa tehokkaamman neljän ddNTP:n käytön huomioon ottamiseksi. Täten laaj ennus-piäätösreaktioiden Taq-DNA-polymeraasi F667Y:11a tulisi sisältää pitoisuus 100 pM neljää dNTPrtä ja 0,1 - 5 pM kutakin neljää ddNTP :tä; kunkin ddNTP: n 35 tarkka määrä tulisi säätää halutun keskimääräisen fragmen- 94 tlkoon nojalla DNA-sekvenssi optimaaliseksi määrittämisek-si. DNA-sekvensointireaktioiden ja denaturoivan geeli-ele k t r o f o r e e s i n kaikki muut: näkökohdat ovat kuten kuvaavat Iimis ,et ai.. (supra) .

5 Esimerkki 18

Sykli-DNA-sekvenssianalyysi käyttäen lämpöätabiilia DHA-polymeraasia, joka inkorporoi tehokkaasti dideoksinuk-leotidejä

Sykli - DNA - sekvens oint 1 1 ämpös .tab ii lilla DNA -poly- 10 meraasilla, kuten Tag-DMA-polymeraasi F667Y, suoritetaan kuten kuvataan julkaisussa Carothers :et ai., BioTechnioues V {1989:) 494, lukuun ottamatta, että: (1) neljä deoksi/di- deoksi-NTP-seosta sisältävät pitoisuudet 250 μΜ kaikkia neljää dNTP:tä ja 0,1 - 10 pM joko ddGTP:tä, ddATP:tä, 15 ddTTPitä tai ddCTPitä, jolioin kunkin: ddNTEui tarkka määrä säädetään kokeellisesti halutun keskimääräisen fragmenttiko on nojalla DMA-sekvenssin optimaaliseksi määrittämiseksi. (2) Tag-DNA-pölymeraasi F667Y:tä käytetään Taq-DNA-polymeraasin tilalla käyttäen samaa DNA-polymeraasiyksik-20 kölukumäärää kuin .suosit te levät Carothers et ai, (suora) , (3) Reaktiöseokset sisältävät 10 ng epäorgaanista pyrofos-fätaasia pyrofosforolyysin inhiboimiseksi, joka voisi muutoin nostaa DNA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota Spesifisissä sekvensseissä laskien nauhaintensiteettien 25 yhtenäisyyttä [Tabor ja Richardson, J. Biol. Chem. 265 {1990) 8322] . Edullisesti tämä pyrofosfataasi puhdistetaan termofiilisästä organismista, esimerkiksi Thermus thermo-philuksesta [Hohne et ai., Biomed. Biochim. Acta 47 (1988) 941] .

3 0 Esimerkki 19

Automatisoitu sykli-DNA-sekvensointi käyttäen modifioitua Taq-DNA-polymeraasia ja fluoresoivia alukkeita

Sykli-DNA-sekvensointi lämpöstabiililla DNA-polymer a a.si 11 a, kuten Taq-DNA-polymeraasi F667Y, ja Applied 35 Biosystems Dye Primer -alukkeilla on modifikaatio menet- | 95 telystä, jota kuvataan Applied Biosystems -manuaalissa (ösanumero 901482, Rev. B) . Menettely on identtinen manuaalissa kuvattuun nähden sauraavin modifikaatioin: (1) dNTF/döNTP-seoksia on modifioitava Taq-DNA. polymeraasi 5 F667Y:n Taq-DNA-polymeraasiin nähden tehokkaamman ddNTP:eiden käytön huomioon ottamiseksi. Uudet seokset, joita tulisi käyttää Applied Biosystems “manuaalissa mainittujen tilalla, ovat seuraavat:

10 dG/ddG-seos - ioo M CdGTP, dATP, dTTP ja dCTP, ja 0,05 M ddGTP

dA/ddT-seos = 100 M CdGTP, dATP, dTTP ja dCTP, ja 0,3 M ddATP

dT/ddT-seos - 100 M C'dGTP, dATP, dTTP ja dCTP, ja 0,25 M

15 ddTTP

dC/ddC-seos = 100 M C’dGTP, dATP, dTTP ja dCTP, ja 0,15 M

ddCTP

ddNTP:eiden pitoisuuksia tulisi vaihdella fluore-20 senssi-intensiteetin optimoimiseksi spesifisillä koko- alueilla. olevissa fragmenteissa käyttösovellutuksesta riippuen. Esimerkiksi ddNTP:eiden pitoisuuden nostaminen kasvattaa pituudeltaan lyhyempien fragmenttien fluoresens- | siä. (2) Taq-DNÄ-palymeraasi F667Y:tä käytetään Taq-DNA-25 polymeraasin tilalla. Kummassakin tapauksessa käytetään samaa entsyymiyksikkölukumäärää suoritettaessa määritys t avanoma isissä DNA-polymeraasimääritysolosuhte i s s a.. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää samaa lukumäärää DNA-pölynne -raasimolekyylejä. (3) Reaktioseokset sisältävät 10 ng epä- 30 orgaanista pyrofosfataasia pyröfösforplyysin inhiboimisek- si, joka voisi muutoin nostaa DNA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota spesifisissä sekvensseissä laskien nau-haintensiteettien yhtenäisyyttä [Tabor ja Richardson, J.

Bio!. Chem. 265 (1990) 8322] . Edullisesti tämä pyrofosfa- 35 taasi puhdistetaan termofiilisestä organismista, esimer- 96 kijcsl Thermus thermophiluksesta [Hohne et ai. . Biomed.

Blochimn Acta 47 (1988) 941] . Menettelyjen kaikki muut näkökohdat ovat identtiset Applied Biosystems -manuaalissa (suora) kuvattuihin nähden.

5 Esiaierkki 20

Automatisoitu sykli-DNA-sekvensointi käyttäen modifioitua Taq-PNA-poiymeraasia ja fluoresoivia väripäättä-jiä

Sykli-DNA-sekvensointi lämpöstabiililla DNA-poly-10 meraspilla, kuten Taq-DNA-polyraeraasi F667Y, ja Applied

Biosystems DyeDeoxy Terminator -päättäjillä on modifikaatio menettelystä Applied Biosystems -manuaalissa (osanu-mero 901497, Rev. E) . Menettely on identtinen manuaalissa kuvattuun nähden, seuraavin modifikaatioin:; (1) manuaalissa 15 kehotetaan käyttämään 1 μ'1 kutakin neljää DyeDeoxy Terminator -päättäjää laimentamattornina kussakin sekvensoin-tireaktiossa (2 0 pl:n reaktio) . Tässä esimerkissä. Ter-minator-pätttäjäfc tulisi laimentaa ennen iisäämistö sekvensointireaktioseokseen, koska ne tulevat inkorporoi-20 duiksi yli usea satakertaisesti tehokkaammin Taq-DNA-po-lymeraasi F667Y:llä kuin Taq-DNA-polytneraasilla. 1 μΐ kutakin seuraayaa laimennosta lisätään sekvensointireaktioon 1 pl:n laimentamattomien Terminator-päättäjäliuosten asemesta : 2 5

DyeDeoxy G Terminator, 1:500 Η,Ο: ssa

DyeDeoxy A Terminator-, 1:1 500 Η,Ο: ssa

DyeDeoxy T Terminator, 1:1 500 H,Q: ssa

DyeDeoxy C Terminator, 1:1 000 Η,Ο:ssa.

3 0 I

Nämä laimennokset ovat vain likimääräistyksiä; kunkin DyeDeoxy Terminator -päättäjän täsmällinen laimennos tulisi määrittää kokeellisesti riippuen aiukkeesta määritettävän DNA-sekvenssin emästen lukumäärästä. (2) Taq-DNA- 35 polymeraasi F667Y:tä käytetään Taq-DNA-polymeraasin tilal- 97 la, Samaa entsyymiyksikkölukumäärää käytetään kummassakin tapauksessa suorittaan määritys tavanomaisissa DNA-pöly-meraasimäärityBQlöSUhteissa - Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää samaa lukumäärää DNA-polymeraasimolekyylejä. (3) 5 Reaktioseokset sisältävät 10 ng epäorgaanista pyrofosfa-taasia pyrofosforolyysin inhiboimiseksi, joka voisi muutoin nostaa DNA-polymeraasin näennäistä diskriminaatiota spesifisissä sekvensseissä laskien nauhaintensiteettien yhtenäisyyttä [Tabor ja Richardson, J. Biol, Chem. 265 10 (1090) 8322] . Edullisesti tämä pyrofosfatäasi puhdistetaan, termofiilisestä organismista, esimerkiksi Thermus thermo-philuksesta [Hohne et ai. . Biomed. Blochinv. Acta 47 (1988) 941] .

Koska tässä menettelyssä käytetään yli 500 kertaa 15 vähemmän DyeDeoxy Terminator -päättäjiä kuin edeltävissä menettelyissä/ ei-inkorporoidut DyeDeoxy Terminator -päättäjät ovat paljon vähäisempi ongelma reaktioon päätyttyä.

Täten ei ole tarpeen poistaa e i-i nkorporoi tuj a DyeDeöxy Terminator -päättäjiä käyttämällä näyte spin-kolonnissa 20 kuten Applied Biosystems -manuaalissa (suora) suositel laan. Paremminkin näyte voidaan seostaa etanolilla, liettä ä 5 plraan deionisoitua formamidia ja 1 pl:aan 50 rnM EDTÄ-liuosta, pH 8,0, kuumentaa 90 °C:ssa 2 minuutin ajan ja panostaa Applied Biosystems 373A DNA Sequencing System 25 -systeemiin 373Ä-käyttäjämanuaalin ohjeiden mukaan. On mahdollista, että DNA-polymeraasilla, joka inkorporoi j

DyeDeoxy Terminator -päättäjiä tehokkaasti (kuten Taq-DNA-polymeraasi F667Y), että DNÄ-sekvensointireaktiqn kon-sentrointi etanolilla seostamalla ei ole tarpeen; DNA-syk-3 0 lisekvensointireaktiot, jotka suoritetaan käyttäen edulli

sesti alukkeen ja dNTPteiden korkeaa pitoisuutta (katso alla} , voidaan päättää lisäämällä sama tilavuus deionisoitua formamidia, kuumentaa 90 ®:C:ssa 2 minuutin ajan ja panostaa välittömästi Applied BiosystemS: 3.73 A DNA

35 Sequencing System -systeemiin. Tämä edustaa huomattavaa 90 ajansäästöä tutkijalle, joka valmistelee näytteitä DNA-sekvenssimääritykseen.

Edellä kuvatussa menettelyssä käytetään suhteella -sen matalaa dNTP:eiden pitoisuutta aluksi (7,5 μM dATP, 5 dTTP ja dCTP ja 37,5 μΜ dlTP) . dNTPeiden pitoisuus laskee sykli-DNA-sekvensointireaktion aikana kun dNTP:eitä käytetään. Tämä dNTP: eiden pitoisuus {alle 7,5 μΜ): on vähemmän kuin optimaalista maksimaaliselle DNA-polymeraasiaktiivi-suudelle useimmille DNA-polymeraaseille. Tämä matala pi-10 toisuus oli välttämätön aiemmin protokollien kanssa, koska käytetty DNÄ-poTymeraasi diskriminoi voimakkaasti vastaan ddNTP;eitä edellyttäen korkeaa ddNTPreiden suhdetta dNTP:eihin. Käyttämällä tämän keksinnön mukaista DNA-po-lymeraasia, joka diskriminoi paljon vähemmän vastaan 15 DyeDeoxy Terminator -päättäjiä:/ on myt: mahdollista käyttää korkeampia dNTP-pifeoisuuksia, Esimerkiksi edellä kuvatussa protokollassa 10-kertaisesti korkeampaa dNTP:eiden ja DyeDeoxy Terminator -päättäjien pitoisuutta voitaisiin käyttääeli 75 μΜ dATP, dTTP ja dCTP, 375 μΜ dlTP, ja 20 kunkin neljästä DyeDeoxy Terminator -päättäjästä seuraavia laimennoksia : DyeDeoxy G Terminator, 1:50 11,0: ssa; DyeDeoxy A Terminator, 1:150 H,0:ssa; DyeDeoxy T Terminator, 1:150 H,0: ssa; DyeDeoxy G Terminator, 1:100 H,0: ssa. Täten tässä esimerkissä DyeDeoxy Terminator -päättäjäpitoisuudet ovat 25 yhä ainakin matalampia kuin edeltävissä protokollissa ainakin tekijän 50 verran.

Esimerkki 21

Eksonukleaasiniääritys käyttäen [3:P)ddAMP-päätteistä DNA-substraattia | 30 3' r3PjddAMP-päätteinen DNA-substraatti valmiste taan pilkkomalla natiivia vasikan kateenkorvan DNA:ta 'HinduI; 11a reaktioseoksessa (50 μΐ) , joka sisältää 10 pg kaksi säikeistä vas ikankat eenkorva - DNA :t a, pitoisuudet 40 mM TrisUCl, pH 7,5, 10 mM MgCl,, 5, mM ditiotreitoli, 35 50 mM MaCB, 50 pg/ml nautaaeerumialbumiinia ja 10 yksikköä 93

Hindin: a. 60 minuutin inkuboinnin 37 °C:ssa j älkeen lisätään 5 yksikköä Seguenase versio 2.0 -valmistetta (United States Biochemical Corporation, kataloginumero 70775) , ja seosta inkuboidaan 20 °C:ssa .15 minuutin ajan.

5 Reaktioseosta uutetaan kerran samalla tilavuudella fenoli-kloarbformi-iso.amyyli.aikoholia (24:24:1) ja se fraktioidaan 1 ml:n kolonnissa, joka: sisältää 'Sephadex G10 0 -valmistetta (Pharmacia) 20 mM Tris-HCl: ssä, pH 7,5, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl. 3 15iP-leimatun DNA: n, joka el noituu tyhjässä tila-10 vuudessä:,: spesifinen aktiivisuus on noin 500 cpm/ng kokonais -DNA: ta.

Reaktioseokset eksonukleaasimäärityksiin (90 pl) sisältävät pitoisuudet 40 rnM TrislICl, pH 7,5, 10 mM MgCls, 10 mM ditiotreitoli, 50 mM KCl ja 1 nmol 3 ,3*P-leimattua 15 DNA;ta. Reaktioseokset sisältävät myös 10 ng hiivan epäorgaanista pyrofosfataasia pyrofosfaatiri hivenmäärien poistamiseksi ja siten pyrofosforölyysin estämiseksi [Tabor ja Richardson, J. B loi. Chem. 265 (1990) 8322] . Tätä seosta esi-inkuboidaan 20 °C;ssa 1 minuutin ajan, minkä jälkeen 2 0 lisätään 10 μΐ sopivaa entsyymi laimennosta. Kun on inku-fooitu 37 °C:Ssa ilmoitettu aika, reaktiot pysäytetään lisäämällä 3.0 pl nautaseerumialbumiinia (10 mg/ml) ja 30 pl triklöorietikkahapppa (100 % w/v). Seostettua DNA:ta inkuboidaan 0 °C:S:Sa 15' minuutin ajan, minkä jälkeen se pelle-25 toidaan s.entrifugoimalla 12 000 x g:ssä 30 minuutin ajan.

Happoliukoinen radioaktiivisuus mitataan 100 pirsta super- | natarittia. Yksi yksikkö 3 1 [”p] ddAMP-DNA-eksonukleaasiakti-ivisuut ta katalysoi yhden pikomoolin (pmol) ['“P]ddAMP:tä liukenemisen happoon 15 minuutissa.

30 Muut suoritusmuodot ovat seuraavien patenttivaati musten suojapiirissä.

100

Sekvenssilletaus (1) YLEISET TIEDOT: (i.) HAKIJA: (A) NAME: President & Fellows of Harvard College (E) KATU: 17 Quincy Street (C) KAUPUNKI: Cambridge (D) OSAVALTIO: Massachusetts

(E) MAA: USA

(F) POSTINUMERO: 02138 (ii) KIRJEENVAIHTO-OSOITE:; (A) OSOITE: Richard J. Warburg

Lyon & Lyon (B) KATU: 633 West Fifth Street Suite 4700 (c) kaupunki: Los Angeles, CA 90071

(D) MAA: USA

(Έ) POSTINUMERO: 90071 (A) PUHELIN: (213) 955-0440 (B) TELEXFAX: ¢213) 489-1600 (C) TELEX: 67-3510 (ii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 24 {iv) KEKSINNÖN NIMITYS: DNA-polymeraaseja, joilla on modifioitu nukleotidisitoutumiskohfa, DNA-sekvensointia varten (V) KONE KOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke, 3,35", 1,44 Mb

(B) TIETOKONE: IBM PS/2, malli 50Z tai 55SX

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: IBM PC-DOS {versio 3.30) (D) OHJELMISTO: Wordperfect (versio 5.0) (vi) NYKYISEN HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: ei vielä annettu (B) JÄTTOPÄIVÄMÄÄRÄ: (vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT:

Kaikki aikaisemmat hakemukset mukaan lukien jäljempänä kuvattu hakemus: KAKSI

(A) HAKEMUSNUMERO: 08/324 437 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 14.10.1994 (A) HAKEMUSNUMERO: ei vielä annettu US-hakemus- numeroa <B) JÄTTÖPÄIVÄ: 10.11.1994 i (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: 101 <i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen, (il) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (X) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ! {A} PITUUS: 14 |

(B) TYYPPI: aminohappo I

(C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen j (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {li) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS; yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: 102 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (E) TYYPPI: aminohappo (C) JUQSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: .SEKVENSSI NRO 5: (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 {B) TYYPPI: aminohappo {C} JUQSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (1). SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen.

(ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen | (li) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: j 103 {2} SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (il) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: | 104 (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: (i} SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (il) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo fc) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {il) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (I) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A} PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (li) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen | (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: j (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: 105 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen {D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: {2} SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i ) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: (2} SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo | (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen : (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20; <2} SEKVENSSIN NRO 21 TIEDOT; 106 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo {0} JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen {ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 21: (2) SEKVENSSIN NRO 22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (G) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 22: (2) SEKVENSSIN NRO 23 TIEDOT: (I) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (Ä) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (il) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2.3.: (2) SEKVENSSIN NRO 24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 14 (B) TYYPPI: aminohappo CC) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen i (ii) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 24: j

Claims (17)

1. Lämpöstabiili DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että deoksinukleotidia sitova kohta käsittää 5 sekvenssin K Ni IL· N3 N4 Ns Ne N7 Y G/Q, jossa kukin N on muista riippumatta mikä tahansa aminohappo lukuun ottamatta N.i:ää, joka on polaarinen aminohappotähde,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen lämpöstabiili. DNA-pölymeraasi,· tunnettu siitä, että polaarinen 10: aminohappotähde on hydroksyylipitoinen aminohappotähde,

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen lämpöstabiili DNA-polymeraasi, tunnettu siltä, että .hydroksyylipitoinen aminohappotähde on tyrösiinitähde,

4 Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen 15: lämpöstabiili DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että polymeräasi ei ole villityypin pölymeraasi, jolla on missä tahansa patenttivaatimuksessa: 1-3 määritelty aminohappotähde asemassa N4*

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen lämpöstabiili DNA-20 pölymeraasi, tunnettu siitä, että lämpöstabiili entsyymi on modifioitu DNA-polymeraasista, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu Thermus thermophiluksen, Thermus flävuksen ja Bacillus sterothermophiluksen DNA-polymeraaseista.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että se on modifioitu Thermus aquaticuksen DNA-polymeraäsista aikaansaamalla tyu'osiinitahde asemaan, joka vastaa villityypin polymeraäsin tähdettä 667.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että magnesiumin ollessa läsnä ainoana kaksivalenssisenä kationina polymeraasin keskimääräinen prosessiivisuus on alle 50 ja se diskriminoi ddNMP:n inkorporaatiota alle 50 kertaisesti 35 dNMP:hen verrattuna.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen lämpöstabiili DMA-polymeraasi, tunnettu siitä, että sen keskimääräinen prosessiivisuus on alle 100.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen 5 lämpöstabiili DNA-polyraeraasi, tunnettu siitä, että se kiertää yhdestä a1u ke-1emp i aa t i s ta toiseen enemmän kuin kerran viidessä sekunnissa.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että sitä on 10 modifioitu vastaavaan vi.U 1tyypin DNA-polymeraasiin liittyvän eksonukleaasiaktiivisuuden poistamiseksi tai muuttamiseksi.

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-polymeraasi, tunnettu siitä, että sitä on lisäksi modifioitu 5' —31 — 15 eksonukleaasiaktiivisuuden poistamiseksi tai muuttamiseksi,

12. Nukleiinihappo, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksen: 1 - 11 mukaista DNA-polymeraasia.

13. Pakkaus DNA-sekvensointiin, joka pakkaus käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen: 1-11 mukaista

20 DNA-polymeraasia ja reagenssia, jota tarvitaan mainittuun sekvensointiin ja joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat dlTP, ketjun päättävä aine ja deatsa-GTP.

14. Pakkaus DNÄ-sekvensointiin, joka pakkaus käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 11 mukaista

25 DNÄ-polymeraasia ja pyrofosfataasia.

15. Liuos, joka käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 11 mukaista DNA-polymeraasia ja pyrofosfataasia.

16. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen: 30 4-6 tai 11 mukaisen DNA-polymeraasin tuottamiseksi, joka j menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: ' | tarjotaan käyttöön nukleiinihappomoiekyyli, joka | koodaa lämpöstabiilia DNA-polymeraasia, joka sisältää sekvenssin K Ni N2 Ns 1¾ Ng N7 ¥ G./Q, jossa kukin N on 35 muista riippumatta jokin aminohappo, ja 10:9 mutagen i soidaan mainittu nukleiinihappomolekyyii yhden tai useamman emäsmuutoksen inkorporoimiseksi nukleotidin emässekvenssiin polaarisen aminohapon koodaamiseksi asemassa N4. 5

17» Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-11 mukaisen lämpöstabiilin DNÄ-polymeraasin käyttö DNÄ-molekyylin nu k 1 e 1 i n i happo s e kv.en s s i n mä ä r i 11 ämi s e e n tarkoitetussa menetelmässä. ! Patentfcrav