CZ293215B6 - Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje - Google Patents

Abstract

Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, která je mutantní formou přírodně se vyskytující tepelně stálé DNA polymerázy, přičemž přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymeráza má aminokyselinovou sekvenci obsahující aminokyselinový sekvenční motiv SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID No: 2), kde Xaa v poloze 7 tohoto sekvenčního motivu je Val nebo Ile a tato mutantní forma je modifikována tak, že obsahuje jinou aminokyselinu než Glu v poloze 4 sekvenčního motivu a mutantní forma má sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou. Polymeráza má zlepšenou účinnost v začleňování neobvyklých nukleotidů, jako jsou ribonukleotidy do produktů DNA a je výhodná v mnoha aplikacích syntézy in vitro. Obzvlášť se hodí pro protokoly sekvenční analýzy nukleových kyselin a poskytuje nové prostředky pro sekvenční analýzy DNA s cenovými a účinnostními přednostmi . Nukleové kyseliny, kódující takové polymerázy, vektory a hostitelské buňky obsahující takové nukleové kyseliny i prostředky k použití v sekvenčních reakcích DNA, kity a způsoby sekvencování za použití takové polymerázy.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká tepelně stálých polymeráz DNA, které mají zlepšenou schopnost začleňovat ribonukleosidové trifosfáty. Vynález se týká způsobu izolování takových polymeráz a zařízení k provádění tohoto způsobu. Enzymy podle vynálezu se hodí pro černá použití a zejména pro sekvencování nukleových kyselin. Vynález se také týká způsobu analyzování sekvencí nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Sekvencování DNA obecně zahrnuje vytváření čtyř populací jednořetězcových fragmentů DNA, majících jedno vymezené zakončení a jedno proměnlivé zakončení. Proměnlivé zakončení končí obvykle u specifických nukleotidových bází (buď guaninu (G), adeninu (A), thymidinu (T), nebo cytosinu (C)). Každý ze čtyř rozdílných souborů fragmentů je oddělen na základě své délky. V jednom takovém postupu se používá polyakrylamidového gelu. Každý pruh takového gelu odpovídá specifickému nukleotidu v sekvencí DNA a tím identifikuje polohu v sekvenci.

Často používaným způsobem sekvencování DNA je dideoxy, nebo řetězec ukončující způsob sekvencování, který zahrnuje enzymatickou syntézu řetězce DNA (Sanger a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977). Obvykle probíhající čtyř oddělené syntézy, přičemž každá reakce končí na specifické bází (G, A, T nebo C) cestou začlenění jednoho nukleotidu zakončujícího řetězec, jako je dideoxynukleotid. Produkty reakce lze snadno interpretovat, jelikož každá linie odpovídá pouze jedné z G, A, T nebo C.

Při způsobu sekvencování dideoxy ukončováním řetězce je teplotně připojen kjednoprovazcové matici krátký jednoprovazcový primer. Příměr je prodloužen na svém 3'-konci začleněním deoxynukleotidů (dNTP), dokud se nezačlení dideoxynukleotid (ddNTP). Jakmile se začlení ddNTP, prodlužování v této bázi ustane. K zaručení věrnosti replikace DNA, mají polymerázy velmi silný sklon začleňovat své normální substráty, tedy dNTP, a oproti začleňování nukleotidových analogů se označují jako neobvyklé nukleotidy. V případě syntéz DNA se považují ribonukleotidy (rNTP) za neobvyklé nukleotidy, jelikož podobně jako ddNTP nejsou rNTP normálním substrátem polymerázy DNA in vivo. V buňce tlumí tato vlastnost začleňování abnormálních bází jako jsou deoxyinosintrifosfát (dITP) nebo rNTP v rostoucím řetězci DNA.

Dvěma často používanými automatizovanými způsoby sekvencování jsou sekvencování „dyeprimer“ a „dye-terminator“. Tyto způsoby se hodí k použití s fluorescenčně značenými podíly. Ačkoliv lze sekvencování provádět také s radioaktivně značenými podíly, dává se zvýšenou měrou přednost sekvencování založenému na fluorescenci. Stručně řečené, při sekvencování způsobem „dye-primer“ se používá fluorescenčně značeného primeru v kombinaci s neznačeným ddNTP. Postup vyžaduje čtyři syntézní reakce a sekvencování až 4 linií gelu pro každou matrici (z nichž jedna odpovídá každému koncovému produktu pro specifickou bázi). Po rozšíření primeru se rutinním způsobem analyzují sekvencující reakční směsi obsahující dideoxynukleotidy začleněné koncové produkty elektroforézou na gelu sekvencujícím DNA. Po separaci elektroforézou, se laserem vybudí fluorescenčně značené produkty na dně gelu a fluorescence se detekuje vhodným monitorem. V automatizovaných systémech detektor snímá dno gelu v průběhu elektroforézy ke zjištění, jak velkého množství značeného podílu bylo použito, když reakční směs prochází gelovou matricí (Smith a kol. Nátuře 321 str. 674 až 679, 1986). V modifikaci tohoto způsobu se každý ze čtyř primerů značí odlišným fluorescenčním značením. Když se ukončí čtyři oddělené sekvenční reakce, reakční směs se spojí a spojené reakční směsi se podrobí

-1 CZ 293215 B6 analýze gelu v jediné linii, přičemž se individuelně detekují rozdílné fluorescenční značky (z nichž jedna přísluší každému ze čtyř různých, pro bázi specifických koncových produktů).

Alternativně se používá způsobu „dye-terminator“. Při tomto způsobu se používá polymerázy DNA k začlenění do dNTP a fluorescenčně značených ddNTP do rostoucího konce primerů DNA (Lee skol. Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992). Tento způsob má tu výhodu, že se nemusejí syntetizovat barevně značené primeiy. Kromě toho jsou dye-terminátové reakce výhodnější v tom, že všechny čtyři reakce lze provádět v téže zkumavce. Modifikované tepelně stálé polymerázy DNA se sníženou diskriminací vůči ddNTP byly popsány (zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo EP-A-655 506). Příkladně modifikovaná tepelně stálá polymeráza DNA je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající tyrosinový zbytek v poloze 667 (místo fenylalaninového zbytku), je to tak zvaná F667Y mutovaný forma polymerázy Taq DNA. Ampli Taq^RFS (vyráběná firmou Hoffmann-La Roche, obchodní produkt společností Perkin Elmer) redukuje množství ddNTP potřebné k účinnému sekvencování nukleové kyseliny se stonásobně až tisícinásobně. Ampli Taq^RFS je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající mutaci F667Y a přídavně zbytek asparagové kyseliny v poloze 46 (místo glycinového zbytku; mutace G46D).

Existuje tedy potřeba tepelně stálých polymeráz DNA, které umožní alternativní způsoby syntézy nukleových kyselin a levnou analysu sekvence nukleových kyselin DNA. Žádoucí by byly fluorescenční způsoby, které nevyžadují použití dideoxynulkeotidů. Vynález je zaměřen na tyto potřeby.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, která je mutantní formou přírodně se vyskytující tepelně stálé DNA polymerázy, přičemž přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymeráza má aminokyselinovou sekvenci obsahující aminokyselinový sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID No: 2), kde Xaa znamená Val nebo Ile a tato mutantní forma je modifikována tak, že obsahuje jinou aminokyselinu než glutamovou kyselinu Glu v poloze 4 sekvenčního motivu a mutantní forma má sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou.

Vynález se týká na matrici závislých tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které zahrnují motiv aminokyselinové sekvence SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No: 1), kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je (Val) nebo (Ile). Při použití jednopísmenového kódu může být tento sekvenční motiv zapsán jako SQIXLRV/I, kde „X“ v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však Glu. Tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, mající aminokyselinovou sekvenci zahrnující tento sekvenční motiv, kde „X“ v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny, mají sníženou diskriminaci oproti začlenění ribonukleotidů v porovnání s dříve známými tepelně stálými polymerázami. V rostoucím řetězci DNA jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Tudíž, z prvního pohledu, začleňují nové enzymy podle vynálezu neobvyklé základní analogy, jako ribonukleotidy, do rostoucího řetězce DNA o několik řádů účinněji než dříve identifikované tepelně stálé DNA syntetizující enzymy. Vynález se také týká genů kódujících tyto enzymy, stejně jako rekombinantních expresních vektorů a hostitelských buněk obsahujících tyto vektory. U takových transformovaných hostitelských buněk mohou být zajištěna velká množství vyčištěných tepelně stálých polymerázových enzymů.

Vynálezem je definována oblast nebo sekvenční motiv v aminokyselinové sekvenci tepelně stálých DNA polymeráz, která zlepšuje účinnost schopnosti polymerázy začleňovat ribonukleotidy při zachování schopnosti spolehlivě začleňovat deoxyribonukleotidy. Změny v této oblasti, například výměny jedné nebo několika kyselin (například zavedených mutagenesou specifickou

-2CZ 293215 B6 pro místa), poskytují tepelně stálý polymerázový enzym, který je schopen syntetizovat chimérický nebo hybridní řetězec RNA nebo RNA/DNA na matrici DNA.

Vynález se dále týká zlepšených způsobů a prostředků k určování sekvence cílené nukleové kyseliny, přičemž je vyloučena potřeba ddNTP k ukončení řetězce. Zde poskytovaným způsobem jsou ribonukleotidy (rNTP) začleňovány do produktů primemí extense. Jelikož subjektové enzymy začleňují přesně a účinně rNTP nebo dNTP, mohou sekvenční reakce využít směsi obou nukleotidů. Pro primemí extensi se mohou vklínit nově syntetizované oligonukleotidové produkty u začleněných rNTP způsoby známými ze stavu techniky, například hydrolýzou, čímž vytvoří populaci fragment, vhodných pro frakcionaci a sekvenční analysu konvenčními prostředky, jako je gelová elektroforéza. Tyto způsoby využívají zde poskytovaných nových enzymů tepelně stálé polymerázy. Z toho hlediska se vynález týká tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které se vyznačují tím, že polymeráza obsahuje rozhodující motiv SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:l), kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence může být jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile).

Podle vynálezu poskytuje zde popsaná modifikovaná polymeráza prostředky k začleňování ribonukleotidů nebo analogů obsahujících hydroxylovou skupinu nebo jinou substituci v poloze 2', která chybí v běžných deoxyribonukleotidech. Tyto nukleotidy mohou být odlišně značeny, což zajistí alternativy vůči běžnému použití dideoxynukleotidů pro aplikaci sekvencování DNA.

Mutantní tepelně stálé polymerázové enzymy podle vynálezu se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Ve výhodném provedení vynálezu, může být nekonvenčním začleňovaným nukleotidem analog báze zakončující řetězec, jako je 2'-hydroxy-3'-deoxy ATP (kordycepin trifosfát) „riboterminátorový“ analog ATP, nebo řetězec nezakončující nukleotid jako je rNTP.

Vynález se dále týká mutantních tepelně stálých polymerázových enzymů, které se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Z tohoto hlediska poskytuje vynález rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, z nichž každý se vyznačuje tím že (a) ve své nativní formě obsahuje polymeráza aminokyselinovou sekvenci SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile); (b) aminokyselinová sekvence je mutována na rekombinantní enzym, s výhodou v poloze 4 této sekvence, takže zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 je jiným aminokyselinovým zbytkem, s výhodou glycinovým zbytkem; (c) rekombinantní enzym má sníženou diskriminaci vůči začleňování ribonukleotidů a ribonukleotidových analogů v porovnání s nativní formou uvedeného enzymu.

Vynález se dále týká tepelně stálé polymerázy jako vhodného prostředku k fragmentování produktů zesílení a příměrových extensních produktů; takové fragmentované produkty mohou být užitečné při metodologiích založených na hybridizaci a při řadě strategií detekce sekvencí.

Enzymy podle vynálezu a geny, které je kódují, mohou sloužit k zajištění prostředků pro použití v reakcích sekvencujících DNA, které představují směs běžných nukleotidů a nejméně jednoho ribonukleotidů nebo ribonukleotidového analogu. Ve výhodném provedení vynálezu je nekonvenčním nukleotidem ribonukleotid a koncentrace ribonukleotidů je nižší než odpovídající koncentrace deoxyribonukleotidu, tedy poměr rNTP:dNTP =1:1 nebo menší. Enzymy podle vynálezu se hodí také ke komercializaci v podobě kitů, přičemž kity mohou také obsahovat kterýkoli z následujících prvků potřebných pro sekvenční reakce nukleové kyseliny, jako jsou například dNTP, rNTP, pufry a/nebo primery.

Vynález se týká nových a zlepšených tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, prostředků a kitů dále definovaných. Enzymy podle vynálezu daleko účinněji začleňují nekonvenční nukleotidové trifosfáty než dosud známé polymerázy nebo odpovídající polymerázové enzymy divoké

-3 CZ 293215 B6 ho typu odvozené z těchto nových polymeráz. Poskytovány jsou také sekvence DNA kódující tyto modifikované enzymy, vektory kexpresování modifikovaných enzymů a buňky transferované takovými vektory. Enzymy podle vynálezu umožňují provádění způsobů sekvencování nových DNA, což je pokrok proti sekvenčním postupům DNA známým ze stavu techniky.

Pro usnadnění pochopení vynálezu, jsou jednotlivé pojmy definovány.

Pojem „konvenční“ (obvyklý), použitý ve vztahu k bázím nukleových kyselin, nukleosidovým trifosfátům, nebo nukleosidům se vztahuje k přírodně se vyskytujícím v popsaných polynukleotidech (například pro DNA to jsou dATP, dGTP, dCTP a dTTP). Přídavně se používají často v 7dGTP a dITP místo dGTP (ačkoli začleňování s nižší účinností) u in vitro DNA syntézních reakcí, jako je sekvencování. Souborně je lze nazývat jako deoxyribonukleotidové trifosfáty (d(NTP)).

Pojem „expresní systém“ se týká DNA sekvencí, obsahujících požadované kódovací sekvence v operativní vazbě, takže hostitelské buňky, transformované těmito sekvencemi, jsou schopné produkovat zakódované proteiny. K provádění transformace může být expresní systém zahrnut ve vektoru, avšak relevantní DNA může být též integrována v chromosomu hostitelské buňky.

Pojem „gen“ se vztahuje k sekvenci DNA, která obsahuje řídicí a kódující sekvence, potřebné pro produkci získatelného bioaktivního polypeptidů nebo prekurzorů. Polypeptid může být zakódován genovou sekvencí plné délky nebo částí kódovací sekvence, tak dlouhé jak je zachována enzymatická aktivita.

Pojem „hostitelská buňka (nebo buňky)“ se týká jak jednobuněčného prokaryotového tak eukaryotového organismu, jako jsou bakterie, kvasinky, a aktinomycetes, tak jednotlivých buněk rostlin nebo živočichů vyššího řádu, pěstovaných v buněčné kultuře.

Zde používané označení „DNA sekvencující reakční směs“ se týká reakční směsi, jež obsahuje prvky potřebné pro sekvenční reakci DNA. DNA sekvencující reakční směs je tedy vhodná k použití v sekvenční metodě DNA k určení sekvence nukleových kyselin cíle, ačkoli reakční směs může být zpočátku neúplná, takže iniciaci sekvenční reakce ovládá uživatel. Při tomto způsobu může být reakce iniciována, jakmile se přidá koncový element, například enzym, k zajištění úplnosti DNA sekvencující reakční směsi. DNA sekvencující reakce obsahuje zpravidla pufr, vhodný pro polymerizační aktivitu, nukleosidové trifosfáty a alespoň jeden neobvyklý nukleosid. Reakční směs může také obsahovat primer vhodný k extensi cíle polymerázovým enzymem, polymerázu a cílovou nukleovou kyselinu. Buď primer, nebo jeden z nukleotidů je obvykle značen detekovatelným podílem jako je fluorescenční značení. Obecně je reakční směs směsí obsahující čtyři obvyklé nukleotidy a alespoň jeden neobvyklý nukleotid. Ve vhodném provedení vynálezu je polymeráza tepelně stálá polymeráza DNA a neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid.

Zde používaný pojem „oligonukleotid“ je definován jako molekula sestavená ze dvou nebo z několika deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů, s výhodou z více než tří a obvykle z méně než 10. Přesná velikost oligonukleotidu závisí na mnoha činitelích, včetně koncové funkce nebo použití oligonukleotidu.

Oligonukleotidy se mohou připravovat vhodným způsobem, včetně například klonováním, nebo restrikcí příslušných sekvencí a přímou chemickou syntézou způsobem, jako je fosfotriesterový způsob (Narang a kol. Meth. Enzymol. 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodiesterový způsob (Brown a kol. Meth. Enzymol. 68, str. 109 až 151,1979), způsob diethylfosforamiditový (Beaucage a kol. Tetrahedron Lett. 22, str. 1859 až 1862,1981), triesterový způsob (Mateucci a kol., J. Am. Chem. Soc. 103, str. 3185 až 3191, 1981), způsob automatizované syntézy nebo způsob pevné podložky (americký patentový spis 4 458 066).

-4CZ 2932IS B6

Zde používané označení „primer se vztahuje k oligonukleotidu, ať přírodnímu nebo syntetickému, který je schopen působit jako místo iniciace syntézy, je-li umístěn za podmínek, ve kterých se extense primerů iniciuje. Primerem je s výhodou oligodeoxyribonukleotid sjedním řetězcem. Přiměřená délka primerů závisí na záměru použití primerů, avšak obvykle je 15 až 35 nukleotidů. Krátké primerové molekuly vyžadují obvykle nižší teploty k vytvoření dostatečně stabilního komplexu hybridů s matricí. Primer nemusí reflektovat přesnou sekvenci matrice, avšak musí být dostatečně komplementární k vytváření hybridů s matricí, aby mohlo nastat prodloužení primerů.

Primer může být popřípadě značen vnesením značkovacího činidla detekovatelného spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, imunochemicky, nebo chemicky. Vhodným značkovacím činidlem jsou například ³²P, fluorescenční barviva, reakční činidla s hustými elektrony, enzymy (jako běžně používané v ELISA), biotin nebo hepteny a proteiny, pro něž jsou k dispozici antiséra nebo monoklonální protilátky.

Označení „tepelně stálá polymeráza“ se vztahuje k enzymu, který je stálý za tepla, je odolný vůči teplu a zachovává si postačující aktivitu k ovlivnění reakcí extense primerů pokud je podroben zvýšeným teplotám po dobu potřebnou k ovlivnění denaturace nukleových kyselin se dvěma řetězci. Jak je zde použita, je tepelně stálá polymeráza vhodná k použití v reakcích cyklicky měnících teplotu, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR = polymerase chain reaction). U tepelně stálé polymerázy enzymatická aktivita znamená katalysu kombinace nukleotidů správným způsobem k vytvoření produktů extense příměru, které jsou komplementární s řetězcem matricové nukleové ky seliny.

Tepelné podmínky nutné k denaturaci nukleové kyseliny závisejí například na koncentraci soli v pufru a na složení a délce nukleových kyselin, jež jsou denaturovány, avšak typickým rozmezím teplot je přibližně 90 až přibližně 105 °C, s výhodou 90 až 100 °C po dobu závisející hlavně na teplotě a na délce nukleové kyseliny, obvykle několik sekund až čtyři minuty.

Výrazy jako „neobvyklý“ nebo „modifikovaný“, jsou-li použity k definování báze nukleové kyseliny, nukleosidového trifosfátu, nebo nukleotidu, zahrnují modifikaci, derivaci nebo analogy obvyklých bází, nebo nukleotidů, které se přirozeně vyskytují v DNA. Blíže, jak je zde použito, jsou neobvyklé nukleotidy modifikovány v poloze 2' ribosového cukru v porovnání s obvyklými dNTP. Tudíž, ačkoli pro RNA jsou přírodně se vyskytujícími nukleotidy ribonukleotidy (například ATP, GTP, CTP, UTP kolektivně rNTP), jelikož tyto nukleotidy mají hydroxylovou skupinu v poloze 2' cukru, která pro porovnání v dNTP chybí, jak zde použito, jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Do rozsahu vynálezu spadají ribonukleotidové analogy mající substituce v poloze 2', jako jsou 2'-fluoro- nebo 2'-aminosubstituované analogy. Přídavně mohou být ribonukleotidové analogy modifikovány v poloze 3', například nahražením normální hydroxylové skupiny vodíkovou skupinou (3'-deoxy), poskytující terminátor ribonukleového analogu. Takové nukleotidy jsou do rozsahu vynálezu také zahrnuty pod pojmem „neobvyklé nukleotidy“.

Jelikož DNA se obvykle skládá z dNTP, začlenění rNTP by bylo neobvyklé a tudíž rNTP by byla neobvyklá báze. V důsledku toho, ve vhodném provedení vynálezu, pro metody extense primerů DNA včetně metod sekvencování DNA, obsahují produkty nukleových kyselin jak obvyklé, tak neobvyklé nukleotidy, kterými jsou rNTP.

Neobvyklé báze mohou být fluorescenčně značeny, například fluoresceinem nebo rhodaminem; nefluorescenčně značené, například biotinem; izotopicky značené například ³²P, ³³P nebo ³⁵S; nebo neznačené.

K lepšímu pochopení vynálezu je dále pojednáno o specifických tepelně stálých DNA polymerázových enzymech, kterých se vynález týká; avšak toho pojednání rozsah vynálezu nijak neovlivňuje. Podle výhodného provedení vynálezu je tepelně stálých enzymů použito v různých způsobech sekvencování nukleových kyselin, ačkoli je možno zde popsaných nových tepelně

-5CZ 293215 B6 stálých polymeráz použít k jakémukoli účelu, kdy je aktivita takového enzymu nutná nebo žádoucí. Enzymů lze také použít v zesilovacích reakcích, jako je PCR.

Tepelně stálé polymerázy podle vynálezu se vyznačují tím, že každá obsahuje rozhodující motiv SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:l), kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile). Geny kódující tepelně stálé polymerázy, které mají zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 uvedeného motivu, mohou být modifikovány, jak je zde popsáno k zajištění vhodně modifikovaných polymerázových enzymů. Uvedené tepelně stálé polymerázové enzymy se vyznačují tím, že ve srovnání s odpovídajícími nativními enzymy nebo s enzymy divokého typu, mají modifikaci v motivu aminokyselin SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID No: 2), kde „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile), tedy motiv byl modifikován nahražením zbytku glutamové kyseliny v poloze 4 jiným aminokyselinovým zbytkem. Rozhodující motiv tepelně stálé DNA polymerázy podle vynález je vyznačen dále pomocí konvenčního jednopísmenkového kódu (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers, lne. str. 67, 1970).

SEQ ID No: 1 SerGlnlleXaaLeuArgXaa kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a „Xaa“ v poloze Ί této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile).

Jak kódující genové sekvence, tak proteiny obsahující tuto rozhodující aminokyselinovou sekvenci, kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny (Glu), poskytující polymerázu mající klesající diskriminaci vůči rNTP a jsou v rozsahu vynálezu. Uvnitř rozhodujícího motivu mohou být provedeny další modifikace, pokud jde o jiné aminokyselinové zbytky v tomto rozhodujícím motivu, s výhodou vzhledem k aminokyselinovým zbytkům ze skupiny glutaminu (Glu neboli Q), leucinu (Leu neboli L), nebo argininu (Arg neboli R).

Vynález se hodí k přípravě tepelně stálých DNA polymerázových enzymů s vynikajícími vlastnostmi příslušnou modifikací genové sekvence kódující tepelně stálou DNA polymerázu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou genová sekvence a zakódovaný enzym odvozeny od druhů Thermus, ačkoli vynález zahrnuje eubakterie non-Thermus, jak bude dále popsáno. Obchodně s ohledem na vysoce konzervovanou povahu nyní identifikovaného rozhodujícího motivu, se mohou identifikovat nové tepelně stálé DNA polymerázy na základě své homologie, například polymeráza Taq. Takové tepelně stálé polymerázy jsou v rozsahu vynálezu, pokud jejich sekvence obsahuje motiv S QIX L R V/I, kde X je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek kyseliny glutamové a jejichž aminokyselinové sekvence činí nejméně přibližně 39 %, s výhodou nejméně přibližně 60 %, výhodněji alespoň přibližně 80 % celkové homologie (sekvencové identity) ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí nativní polymerázy Taq. Úplná délka sekvence uvedené polymerázy Taq je uvedena ve WO 89/06691 aje dostupná pod číslem P90556 v databance patentových sekvenci GENESCO nebo pod číslem M26480 v databance patentovaných sekvencí EMBL a pod číslem 133530 a databance patentových sekvencí PIR.

Příkladně jsou tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu rekombinantními deriváty nativních polymeráz organismů, jejichž seznam je v tabulce I. Tabulka I vyznačuje jednotlivé sekvence rozhodujícího motivu a polohu zbytku „X“ pro každou z těchto nativních polymeráz. Jelikož každá tepelně stálá polymeráza DNA je jedinečná, je poloha aminokyseliny v rozhodujícím motivu odlišná pro každý enzym. U polymeráz, jejichž seznam je dále uveden, je aminokyselinovým zbytkem v poloze „X“ rozhodujícího motivu S WIX L R V/I glutamová kyselina. Výhodné polymerázy podle vynálezu mají molekulovou hmotnost 85 000 až 105 000, s výhodou 90 000 až 95 000. Aminokyselinová sekvence těchto polymeráz sestává přibližně ze 750 až 950 aminokyselinových zbytků, s výhodou z 800 až 850 aminokyselinových zbytků. Polymerázy podle vynálezu mohou také sestávat z 540 nebo z více aminokyselin a zahrnovat nejméně polymerá

-6CZ 293215 B6 zovou doménu a část odpovídající 3' až 5' exonukleázové domény (výsledná polymeráza může mít popřípadě exonukleázovou aktivitu 3' až 5') a případně části 5' až 3' exonukleázové domény, která je obsažena v první třetině aminokyselinové sekvence mnoha tepelně stálých polymerázových enzymů s plnou délkou.

U tepelně stálých DNA polymeráz, jež nejsou uvedeny v tabulce I, je identifikace příslušné glutamové kyseliny pro modifikaci snadná, jakmile je identifikován rozhodující motiv nebo dohodnutý motiv aminokyselinové sekvence.

ío Bez ohledu na přesné umístění uvnitř tepelně stálé polymerázy DNA, slouží nahražování zbytku glutamové kyseliny (Glu) zbytkem jiné kyseliny v sekvenčním motivu SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile) polymerázové domény, k zajištění tepelně stálých polymeráz majících schopnost účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy. Ve výhodném provedení je glutamová kyselina 15 nahražena aminokyselinou mající nenabitou polární skupinu R, jako je serin, glycin, cystein, threonin nebo aminokyselinou mající malou nepolární skupinu R, jako například alanin. V nejvýhodnějším provedení je zbytek glutamové kyseliny nahražen glycinovým zbytkem (G). Programy seřazení aminokyselin a nukleových kyselin jsou k dostání od Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Při daném zvláštním, zde identifikovaném 20 motivu, slouží tyto programy, včetně například „GAP“, „BESTFIT“ a „PILEUP“ k nápomocí při identifikaci přesného úseku sekvence, který má být modifikován.

Jak vyplývá z tabulky I, jsou v podstatě dvě formy konzervovaného sekvenčního motivu SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO:2) v polymerázové doméně enzymů tepelně stálých 25 polymeráz DNA z termofilních organismů. Sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID NO:3) je přítomen v nativních tepelně stálých pomylerázách z druhu Thermus, jako například Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus thermophilus, Thermus flavus a Thermus filiformis stejně jako z druhů Thermus sps 17 a ZO5.

Sekvenční motiv SerGlnlle GluLeuArgVal (SEQ ID NO:3) je obsažen v doméně polymeráz jiných tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, například z Thermosipho africanus a z různých kmenů Bacillus, jako je Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophilus. Sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArglle (SEQ ID NO:4) je obsažen v nativních tepelně stálých polymerázách z Thermotoga maritima, z Thermotoga neopolitana a z Anaerocellum thermophilum.

Tabulka I

Organismus	Aminokyselinový dohodnutý motiv	Poloha glutamové kyseliny
Thermus aquaticus (Taq)	SQIXLRV/I SQIELRV	615
Thermus caldophilus (Tea)	SQIELRV	617
Thermus thermophilus (Tth)	SQIELRV	617
Thermus flavus (Tfl)	SQIELRV	616
Thermus filiformis (Tfi)	SQIELRV	613
Thermus specie sps 17	SQIELRV	613
Thermus specie Z05	SQIELRV	617
Thermotoga maritima (Tma)	SQIELRI	678
Thermotoga neopolitana (Tne)	SQIELRI	678
Thermosipho africanus (Taf)	SQIELRV	677
Anaerocellum thermophilum (Ath)	SQIELRI	632
Bacillus caldotenax (Bca)	SQIELRV	659
Bacillus stearothermophilus (Bst)	SQIELRV	658, 661, or736*

v závislosti na zvolené aminokyselinové sekvenci (viz dále)

Úplné sekvence nukleových a aminokyselin pro každou polymerázu Taq, Tth, ZO5, spsl7, Tma aTaf byly publikovány v americkém patentovém spise 5 466 591. Sekvence DNA polymerázy z Tca, Tfl, Tne, Ath, Bca a Bst byly publikovány takto: Tca v bance sekvencí EMBL pod číslem U62584 (viz též Kxvin, Mol. Cells, 7(2), str. 264 až 271, 1971), Tfl v článku Akmetzjanov aVakhinov (Nuclaic Acids Research 20 (21), str. 5839, 1992), The ve WO 97/09451 a WO 96/41014, Arth v bance sekvencí pod číslem X98575 (podrobnosti o řetězci Ath Viz Rainey a kol. J. Bacterio. 175 (15), str. 4772 až 2779, 1993), Bst (Uemori a kol. J. Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a pod číslem U23149 v bance sekvencí EMBL (viz též Phang a kol. Gene 163, str. 65 až 68, 1995). Aminokyselinové sekvence polymerázy Bst, obsahující E v rozhodujícím motivu v poloze 658 jsou též popsány (japonský patentový spis číslo JP 05/3P4 964A, evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP-A-699 760 a Aliott a kol. Genet. Anal. 12, str. 185 až 195, 1996); sekvenci lze také získat v bance sekvencí EMBL pod číslem U 533536. Sekvence publikovaná v gene 163, str. 65 až 68 (1995) obsahuje „E“ rozhodujícího motivu ve zbytku čísel 661. Bca v článku Uemori a kol. (J. Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a v bance sekvencí EMBL pod číslem D 12982. Tepelně stálé DNA polymerázy od Thermus fílifosmis (FEMS Microbiol. Lett. 22, str. 149 až 153, 1994, také k dostání od ATCC depositní číslo 43280) lze získat způsobem podle amerického patentového spisu 4 889 818 i na základě informace o sekvencích v tabulce I. Homologie sekvencí (identita sekvencí) mezi aminokyselinovou sekvencí nativní formy polymerázy Taq, jak je popisována ve WO 89/06691 u shora zmíněné polymerázy Tfl je na 87,4 %. Odpovídající homologie vzhledem k polymeráze Tht je 87,4 %, vzhledem k polymeráze Tca je 86,6%, vzhledem k polymeráze Bst (číslo U 23149) je 42% vzhledem k polymeráze Bca je 42,6 % a vzhledem k polymeráze Ath je 39,7 %.

Jak tabulka I ukazuje, je rozhodující motiv pozoruhodně konzervován mezi tepelně stálými polymerázami. V případě, kdy znamená „X“ zbytek glutamové kyseliny, poskytuje záměna genu kódujícího polymerázový enzym podle vynálezu, který právě kodon kódující glutamové kyseliny u zbytku 615 v genové sekvenci polymerázy DNA Thermus aquaticus (Taq) (voz SEQ ID NO: 7) vede k více než 500-násobnému zvýšení účinnosti při začleňování neobvyklých nukleotidů, jak jsou zde definovány, při zachování schopnosti enzymu zprostředkovat PCR v přítomnosti obvyklých nukleotidů, například dNTP. Polymeráza DNA Taq této příslušné mutace vede ke změně aminokyseliny E (glutamové kyseliny) na G (glycin). Ačkoli tato příslušná změna aminokyseliny mění významně schopnost enzymu začleňovat neobvyklé nukleotidy, má se zato, že nahrazení zbytku glutamové kyseliny jinými zbytky aminokyselin jako například šeřinu, cysteinu, theroninu, alaninu, valinu nebo leucinu, má stejný účinek. Jiné substituce aminokyselin, které nahražují E615 jsou proto v rozsahu vynálezu, ačkoli E615G přestavuje výhodné provedení. Rozhodujícím význakem vynálezu tedy je, že ve čtyřech aminokyselinových zbytcích v motivu SEQ ID No: 1 není zbytek glutamové kyseliny.

Místně cílená mutageneze se může provádět také mutagenezí cílenou na primer specifický pro místo. Tato technika je nyní v oboru standardní a provádí se použitím syntetického oligonukleotidového primerů komplementárního s jednořetězcovým fágem DNA podrobeným mutagenezi s výjimkou omezeného chybného uspořádání představujícího požadovanou mutaci. Stručně řečeno, syntetického oligonukleotidu se použije jako promeru k zecílení syntésy řetězce komplementárně na plazmid nebo fág a výsledná dvouřetězcová DNA je transformována na bakteriofág podporující hostitelské bakterie. Výsledné bakterie lze pak zkoumat například analýzou sekvencí DNA nebo sondovou hybridizací k identifikování destiček nesoucích požadované sekvence mutovaného genu. Alternativně lze použít metod genového inženýrství, které jsou popsány v PCR Protocols, San Diego, Academie Press, vydavatelé Innis a kol., 1990 v kapitole 22 s názvem „Recombinant PCR“, Higuchi, str. 166 až 183, kodon kódující glutamové kyseliny kódující glutamové kyseliny u zbytku 615 v genové sekvenci polymerázy DNA Thermus aquaticus (Taq) (viz SEQ ID NO:7) vede k více než 500-násobnému zvýšení účinnosti při začleňování neobvyklých nukleotidů, jak jsou zde definovány, při zachování schopnosti enzymu zprostředkovat PCR v přítomnosti obvyklých nukleotidů, například dNTP. Polymeráza DNA Taq této příslušné mutace vede ke změně aminokyseliny E (glutamové kyseliny) na G (glycin). Ačkoli tato příslušná změna aminokyseliny mění významně schopnost enzymu

-8CZ 293215 B6 začleňovat neobvyklé nukleotidy, má se zato, že nahrazení zbytku glutamové kyseliny jinými zbytky aminokyselin jako například šeřinu, cysteinu, threoninu, alaninu, valinu nebo leucinu, má stejný účinek. Jiné substituce aminokyselin, které nahražují E615 jsou proto v rozsahu vynálezu, ačkoli E615G představuje výhodné provedení. Rozhodujícím význakem vynálezu tedy je, že ve čtyřech aminokyselinových zbytcích v motivu SEQ ID No: 1 není zbytek glutamové kyseliny.

Místně cílená mutageneze se může provádět také mutagenezí cílenou na primer specifický pro místo. Tato technika je nyní v oboru standardní a provádí se použitím syntetického oligonukleotidového primeru komplementárního s jednořetězcovým fágem DNA podrobeným mutagenezi s výjimkou omezeného chybného uspořádání přestavující požadovanou mutaci. Stručně řečeno syntetického oligonukleotidu se použije jako primeru k zacílení syntézy řetězce komplementárně na plazmid nebo fág a výsledná dvouřetězcová DNA je transformována na bakteriofág podporující hostující bakterie. Výsledné bakterie lze pak zkoumat například analýzou sekvencí DNA nebo sondovou hybridizací k identifikování destiček nesoucích požadované sekvence mutovaného genu. Alternativně lze použít metod genového inženýrství, které jsou popsány vPCR protocols, San Diego, Academie Press, vydavatelé Innis a kol. 1990 v kapitole 22 s názvem „Recombinant PCR“, Higuchi, str. 166 až 183.

Jak je v tabulce I ukázáno, je glutamová kyselina v rozhodujícím motivu polymerázy Taq konzervována v jiných tepelně stálých DNA polymerázách, může však být umístěna v jiné, avšak sousední aminokyselinové sekvenci. Mutace konzervované glutamové kyseliny uvnitř SEQ ID NO:2 druhů Thermus tepelně stálých polymeráz DNA a příbuzných druhů Theromotoga, Thermospigho a Anaerocellum polymeráz DNA, bude mít stejný zlepšující účinek na schopnost polymerázy účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy ve srovnání spolymerázou Taq obsahující SEQ IDNO:2.

Mutace zbytku glutamové kyseliny s rozhodujícím motivem, aby mohlo být dosaženo tepelně stálých polymeráz DNA, využívají principů a technik používaných v místně cílené mutagenese. Pro polymerázu DNA Bacillus stearothermophilus je několik sekvencí v databázích GeneBank a SwissProg/PIR. Tyto sekvence jsou vysoce příbuzné, avšak poněkud se od sebe odlišují, avšak každá obsahuje identický rozhodující motiv sekvence SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile), ačkoli v jiné místě sekvence.

Na základě veřejně dostupné informace o sekvencích aminokyselin a nukleových kyselin pro tepelně stálé DNA polymerázy, je možno běžnými rekombinantními metodami konstruovat chimérické polymerázy, které sestávají z domén odvozených od odlišných tepelně stálých polymeráz DNA: V amerických patentových spisech 5 466 591 a 5 374 553 jsou popsány metody k zaměňování různých funkčních segmentů tepelně stálých polymeráz, jako 5' až 3' exonukleázovou doménu a 3' až 5' exonukleázovou doménu a polymerázovou doménu k vytváření nových enzymů. Výhodné enzymy chimérických tepelně stálých polymeráz obsahují 5' až 3' exonukleázovou doménu a 3' až 5' exonukleázovou doménu, přičemž jedna doména je odvozena od odlišné polymerázy a polymerázová doména obsahuje rozhodující motiv sekvence SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:l), kde „Xaa“ v poloze 4 této sekvence není glutamový zbytek (Glu) a „Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo izoleucinový zbytek (Ile). Příklady takových chimérických molekul jsou chimérické enzymy Taq/Tma, které jsou složeny jak uvedeno v tabulce II. Jak z této tabulky vyplývá, obsahuje polymerázová doména těchto chimérických enzymů Taq/Tam mutaci v rozhodujícím shora uvedeném motivu.

-9CZ 293215 B6

Tabulka II

	5' až 3' exonukleázová doména	3' až 5' exonukleázová doména	polymerázová doména
Taq	aa. 1-289	aa. 290-422	aa. 423-832
Tma	aa. 1-291	aa. 292-484	aa. 485-893
Taq/Tma	aa. 1-289 (Taq)	aa. 292-484 (Tma)	aa. 423-632 (Taq) s mutací E615G
Taq/Tma	aa. 1-289 (Taq)	aa. 292-484 (Tma)	aa. 485-893 (Tma) s mutací E678G

Plazmid pCl byl uložen podle Budapešťské dohody sATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno depositní číslo 98107. Plazmid pCl obsahuje tepelně stálou DNA polymerázu kódující gen, která je mutována u kodonu kódujícím zbytek glutamové kyseliny v poloze 615 aminokyselinové sekvence nativní polymerázy Taq, vedoucí k mutované formě polymerázy Taq mající glycinový zbytek v poloze 615 (E615G mutovaná polymeráza Taq). Tento deposit poskytuje alternativní prostředky k zajištění tepelně stálých DNA polymeráz majících zlepšenou účinnost k začleňování analogů obvyklých nukleotidů. Příklad 1 objasňuje použití lemovacích restrikčních míst, vhodných k subklonování mutace E615G k vytváření jiných enzymů tepelně stálých DNA polymeráz. Jelikož úplné genové sekvence četných tepelně stálých DNA polymeráz jsou známy, jsou pro pracovníky v oboru, na základě zde poskytnuté sekvenční informace o rozhodujícím motivu, snadno dostupné jiné prostředky k zavádění mutací kodonu kódujícího E615, jako je restrikční digesce a přemisťování fragmentů nebo specificky místně cílená mutagenese in vitro.

Modifikovaný gen nebo genový fragment, připravený specificky místně cílenou mutagenesí, může být získán z plazmidu nebo bakteriofágu konvenčními prostředky a ligací zaveden do expresního vektoru k další kultivaci a čištění výsledného enzymu. K provádění vynálezu se hodí četné klonovací a expresní vektoiy, včetně savčích a bakteriálních systémů a jsou popsány například v knize Sambrook a kol. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor 1989. Pro pohodlí je vynález doložen příkladem používajícím lambda-derivovaného promotoru PL (Shimatake a kol. Nátuře 292, str. 128, 1981). Použití tohoto promotoru je specificky popsáno v amerických patentových spisech 4 71 845 a 5 079 352.

Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu se obvykle čistí od mikroorganismů, jako jsou například E.coli, které byly transformovány expresním vektorem DNA divokého typu nebo modifikovanou tepelně stálou polymerázu DNA. Příkladem vhodného hostitelského mikroorganismu je kmen E. coli DG116, který popsal Lawyer a kol. (PCR Methods and Apllication 2, str. 275 až 287, 1993), a který lze získat od Američan Type Culture Collection pod číslem ATCC 53601. Způsoby čištění tepelně stálé polymerázy jsou také popsal Lawyer a kol. (PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287,1993.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že uvedené tepelně stálé DNA polymerázy se zlepšenou účinností začleňování neobvyklých nukleotidů se nejsnáze připraví způsoby rekombinantní technologie DNA. Pokud je snahou připravit některý enzym podle vynálezu, derivát podle homolog těchto enzymů, zahrnuje produkce rekombinantní formy zpravidla konstrukci expresního vektoru, transformaci hostitelské buňky tímto vektorem a kultivaci transformované hostitelská buňky za podmínek, při kterých se exprese uskuteční. Prostředky k přípravě expresních vektorů, transformování a kultivaci transformovaných hostitelských buněk jsou v oboru dobře známy a podrobně je opsal například Sambrook a kol. (Molecular cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, druhé vydání, kapitola 15.51, „Oligonucleotide-Mediatel Mutagenesis“ 1989, jak shora uvedeno).

Vynález poskytuje tepelně stálé polymerázy DNA vhodné k použití s ribonukleosidovými trifosfáty pro četné aplikace, včetně zesilování nukleových kyselin, způsobů detekce a

-10CZ 293215 B6 sekvencování DNA. Použití ribonukleotidů při sekvencování vylučuje velmi nákladné koncové analogy v řetězcích, jako jsou ddNTP a především usnadňuje přípravu nových zesilovacích produktů, vhodných nejenom pro analýzu sekvencí DNA, ale také pro analýzy jiného typu, jako je elektroforéza nebo hybridizace bez nutnosti zavádění následných reakcí sekvencujících DNA.

Ukázalo se, že pyrofosfatáza zlepšuje výsledky sekvencování za použití jak mezofilických polymeráz, tak tepelně stálých DNA polymeráz snižováním množství pyrofosforolýzy při akumulaci produktů extense. Dosavadní cyklus sekvencující metody vyžadují, aby byl do sekvenční reakce zahrnut přídavný enzym. Avšak velmi užitečná a pokroková je možnost sekvencování DNA bez použití pyrofosfatázy. Použití nových enzymů podle vynálezu tudíž eliminuje nutnost přídavných nákladů, souvisejících s přidáváním druhého enzymu do sekvenční reakční směsi.

Při použití enzymů podle vynálezu se zesilovací a sekvencující reakce kombinují, což spoří čas i materiál a zjednodušuje celou analýzu. Tyto a další přednosti se uplatňují, jelikož začleňování jak obvyklých nukleotidů, tak ribonukleotidů a analogů ribonukleotidů do primemího extensního produktu zajišťuje chimérický řetězec RNA/DNA, který je schopen hydrolýzy RNA. Postup neovlivňuje kostru DNA a poskytuje populaci fragmentů nukleových kyselin, z nichž každý končí v poloze, kde je místo odpovídající dNTP vsazen ribonukleotid. Hydrolýza se snadno uskuteční různými prostředky včetně alkalií (například zpracováním hydroxidem sodným například s konečnou koncentrací 0,2M, jak uvedeno dále v příkladu 6), tepelným nebo enzymatickým zpracováním RNase (Vogel a kol. Informational macromolecular, New York, Academie Press, kapitola, kterou zpracovali Berg a kol. s názvem „The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonukleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E. coli“, str. 467 až 483).

Ve výhodném provedení poskytuje vynález nové a zlepšené sloučeniny obzvlášť užitečné pro způsoby sekvencování DNA. Nové, zde popisované enzymy jsou pokrokové ve způsobech sekvencování nukleových kyselin používajících buď barevných terminátorů, nebo barevných primerů stejně jako jiných metod sekvencování. Jak bylo výše popsáno, vyžadují způsoby zakončování řetězců obecně extensi příměru závislou na matrici v přítomnosti nukleotidů zakončujících řetězec, což vede k rozdělení parciálních fragmentů, které se pak oddělí velikostí. Standardní dideoxy sekvencování používá dideoxynukleosidových trifosfátů k ukončení řetězců DNA polymerázy, jako je Klenowůr fragment E. coli Pol I (Sanger a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977).

Základní dideoxy sekvenční postup tedy zahrnuje (i) tepelné připojení ribonukleotidového primeru k matrici; (ii) rozšíření primeru polymerázou DNA ve čtyřech oddělených reakcích, z nichž každá obsahuje jeden značený nukleotid, nebo značený primer, směs neznačených dNTP, jeden řetězec zakončující ddNTP; (iii) rozlišení čtyř souborů reakčních produktů například elektroforézou denaturačního gelu polyakrylamid/močovina s vysokým rozlišením, kapilární separací nebo jinými rozlišujícími prostředky; a (iv) vytvoření autoradiografického obrazce gelu, který může být zkoumán k posouzení sekvence. Alternativně lze k odvození informace o sekvenci DNA použít metod hmotové spektroskopie nebo metod založených na hybridizaci, za použití značených primerů nebo nukleotidů.

Dostupnost tepelně stálých polymeráz, jako jsou Taq polymerázy vedla ke zlepšeným metodám sekvencování (americký patentový spis 5 075 216) a kjejich modifikaci nazývanou „eyele sequencing“ (cyklové sekvecování). Při cyklonovém sekvencování se opakuje ohřev a ochlazení, což umožňuje vytvoření četných extensních produktů z každé cílové molekuly (Murray Nucleic Acids Research 17, str. 8889, 1989). Toto asymetrické zesilování cílových sekvencí komplementárních s matricovou sekvencí v přítomnosti dideoxy řetězcových terminátorů produkuje populaci produktů extense všech možných délek.

-11 CZ 293215 B6

Po denaturaci produktů extensní reakce od matrice DNA nastane několik cyklů teplotní hybridizace a extense primerů v přítomnosti dideoxy terminátorů. Tepelně stálé DNA polymerázy mají četné přednosti v cyklovém sekvencování; vymezují přísné teploty teplotní hybridizace, jež jsou požadovány pro specifickou hybridizaci primerů na cíle nukleové kyseliny stejně jako vymezují několikeré cykly vysokoteplotní denaturace, ke které dochází v každém cyklu, například 90 až 95 °C. Z toho důvodu byly do kitů sekvencujících cyklus Taq prodávaných společností Perkin Elmer, Norwalk, CT, zařazeny různé formy ApliTaq^R DNA polymerázy.

Nicméně vlastnosti Taq polymerázy DNA, k odlišení od začleňování neobvyklých nukleotidů, jako jsou ddNTP, představují problém, použije-li se jí k cyklovému sekvencování, kde ddNTP nebo fluorescenčně značené ppNTP musejí být začleněny jako terminátory řetězců. Před vynálezem vyžadovalo obecně dříve sekvencování DNA tepelně stálými DNA polymerázami směs řetězec ukončujících nukleotidů ve velké koncentraci k zajištění vytvoří populace extensních produktů představující všechny možné délky fragmentů v délce několika set bází. Často, k provedení tohoto nákladného postupu, činily protokoly používající velmi nízkým koncentrací obvyklých dNTP, reakce neúčinnými. Tyto reakční směsi mající nízko koncentraci dNTP a vysokou koncentraci ddNTP, vytvářejí prostředí, ve kterém je tepelně stálá polymeráza v podstatě spotřebována na nukleotidové substráty.

I s příchodem modifikovaných enzymů, jako je AmpliTaq^RDNA polymeráza ES, které umožňují zvyšování koncentrace dNRP na optimálnější úrovně, spoléhají dřívější enzymy stále na přítomnost nákladných ddNTP pro sekvencování DNA. Na rozdíl od toho poskytuje vynález enzymy, které umožňují nejenom zvyšování koncentrace dNRP, ale zabraňují používání nákladných ddNTP používáním místo toho rNTP k začleňování do rostoucího řetězce. Schopnost nových enzymů účinně ovlivňovat částečnou ribonukleotidovou substituci usnadňuje generaci sekvencujících žebříků DNA při vyloučení separátní reakce k začlenění koncového nukleotidu.

Volba analogů neobvyklých nukleotidů vhodných pro použití v sekvenčních metodách DNA byla dříve diktována schopností tepelně stálé DNA polymerázy začleňovat takové analogy. Naneštěstí jsou takové nukleotidové analogy dosti drahé. Například cena ddNTP je přibližně 25x vyšší než cena rNTP nebo dNTP. Jelikož dřívější tepelně stálé polymerázy DNA nebyly schopny účinně začleňovat rNTP do rostoucí DNA způsobem řízeným matricí, nebyly takové ribonukleotidy, které jsou snadno dostupné a jsou levné, možností pro použití v sekvencování DNA tepelně stálou polymerázou. Vynález vylučuje potřebu ddNTP v sekvenčních reakcích DNA. Vynález tedy také poskytuje metodu pro analysu sekvencí DNA, která je podstatně levnější než dřívější metody ukončování řetězců.

Přítomnost manganu v extensní reakci primerů může ovlivnit schopnost polymerázy vložit přesně správně založený pár nukleotidů. Manganu lze použít k vynucení nesprávného párování bází nebo k usnadnění diskriminace proti začlenění nukleotidového analogu. Manganu bylo použito při výzkumech k zavedení mutageneze v procesech replikace nebo zesilování DNA. Mangan může tudíž ovlivnit věrnost polymerační reakce i výtěžek reakce. Výsledná sekvence může být nesprávná, nebo může být v sekvenční metodě DNA výsledná informace dvojznačná. Způsoby podle vynálezu nepotřebují zavádění manganu jako dvojmocného kationtu v sekvenční reakční směsi k přinucení polymerázy, aby začlenila neobvyklý nukleotid. Na rozdíl od dosavadních DNA polymeráz, identifikuje vynález rozhodující motiv v polymerázové doméně k ovládání schopnosti enzymu rozlišit mezi 2'-substituovanými a nesubstituovanými nukleotidy bez potřeby manganu.

Enzymy podle vynálezu nevyžadují k senvencování vysoké koncentrace nekonvenční báze analogů a odpovídající neobvyklé báze v poměru (například ddATP:dATP) od 1,3:1 do 24:1 pro sekvenční metody terminálů řetězců DNA (viz též americký patentový spis 5 175 216, Innis a kol.). V porovnání umožňují tepelně stálé polymerázy podle vynálezu snížení poměru nekonvenční báze analogů k obvyklým bázím z několika stonásobků na několik tisícinásobků. Poměr

-12CZ 293215 B6 rNTP:dNTP 1:1 nebo menší, v kombinaci snovými enzymy podle vynálezu je postačující pro analýzu sekvence DNA. Ve výhodném provedení vynálezu je poměr rNTP:dNTP snížen na méně než 1:8. Poměr 2'-substituovaného nukleotidu k odpovídajícímu přírodnímu dNTP může být

1:80 až 1:200 v závislosti na příslušně experimentální konstrukci a na požadované délce fragmentů.

Jelikož tedy enzymy podle vynálezu pohotově začleňují neobvyklé nukleotidy, jako je 2'-substituované nukleotidy, není nutné vynucovat začlenění rNTP pomocí vysoké koncentrace rNTP a omezováním koncentrace odpovídajících dNTP. Proto způsob podle vynálezu umožňuje použití optimálních koncentrací dNTP v kombinaci s nízkým množstvím rNTP.

Jestliže se modifikovaných polymerázových enzymů podle vynálezu použije ve vhodné sekvencovací metodě, jako je například dye-primer sequvencing, dosahuje se dobrých sekvenčních výsledků s koncentrací dNTP v rozsahu 50 až 500 μΜ každého dNTP. S výhodou je koncentrace dNTP 10 až 300 μΜ. Při tomto rozsahu mohou být příslušné rNTP obsaženy v koncentraci přibližně stejné jako dNTP nebo menší. S výhodou je rNTP obsažen v koncentraci 0,1 μ až 10 μΜ, nejvýhodněji přibližně 2,5 až 25 μΜ.

Koncentraci rNTP, vhodnou pro použití s enzymy podle vynálezu, lze snadno zjistit titrací a optimalizací experimentů pracovníky v oboru. Potřebné množství rNTP nebo analogu se určí při typu experimentu a může být ovlivněno cílovou velikostí a čistotou i volbou pufru a jednotlivými druhy enzymů.

Poměr rNTP:dNTP určuje frekvenci, se kterou se rNTP začleňuje do rostoucího oligonukleotidu. Jelikož při každém začlenění rNTP nastane hydrolýza, může se poměr rNTP:dNTP nastavit tak, aby uživatele vybavila flexibilitou ke zvyšování nebo snižování velikosti výsledných fragmentů.

Jak známo, je DNA polymeráz syntetizovaný z dNTP. Každý deoxynukleosidový trifosfát představuje ribosový cukr, který obsahuje hydroxylovou skupinu v poloze 3' a atom vodíku v poloze 2'. Ribonukleotidy obsahují také hydroxylovou skupinu v podílu 3' cukru. Avšak rNTP se odlišují od dNTP v poloze 2' cukru, kde druhá hydroxylová skupina nahražuje atom vodíku. V této souvislosti je rNTP příkladem schopnosti enzymů podle vynálezu přesně začleňovat nukleotidy substituované v poloze 2'. Sloučeniny podle vynálezu nejsou však omezeny na použití neobvyklých nukleotidů, kterými jsou ribonukleotidy. Modifikace sekvence tepelně stálé polymerázy v rozhodující doméně, zde identifikované, umožňuje matricí cílené začlenění alternativy v poloze 2' substituovaných nukleotidů, jako jsou 2'-hydroxylová skupina a 3'-deoxynukleotidy a v poloze 2' substituované fluoronukleotidy nebo aminonukleotidy.

Jak je popsáno v příkladech, začlenění 3'-deoxy, 2'-hydroxy ATP, zde označované jako cordycepintrifosfát, je usnadněno obsahem druhé mutace v tepelně stálé polymeráze, která redukuje diskriminaci proti začlenění nukleotidu obsahující deoxyskupinu v poloze 3' ribosy. Takové enzymy byly už popsány deoxyskupinu v poloze 3' ribosy. Takové enzymy byly už popsány například v evropském patentovém spise číslo EP-A-655506 a americké přihlášce vynálezu číslo 08/448 223 z 23. května 1995. ATCC deposit No. 69820, uložený podle Budapešťské koncepce 10. května 1995, poskytuje gen kódující modifikovanou tepelně stálou DNA polymerázu Thermus aquaticus, která má sníženou diskriminaci vůči začleňování analogů, jako jsou ddNTP. Dideoxynukleotidy mají substituovanou polohu 3' na rozdíl od obvyklých dNTP. Tudíž v kombinaci s vynálezem, poskytuje dvojitá mutace, jejímž příkladem je zde polymerázový mutant E615G, F667YTaq, prostředek k využití analogů nukleotidů, jež jsou substituovány v poloze 3' a 2' ribosy, ve srovnání s dNTP (viz příklad 3 a 5).

Zvláštní aplikací vynálezu je způsob sekvencování rTNP, kde sekvencující primer je detekovatelně označen rozlišitelnou fluorescenční nebo radioaktivní značkou. Na rozdíl od ddNTP, začleňování nemodifikované rNTP nevede k ukončení řetězce. Sekvenční reakce DNA zahrnují

- 13CZ 293215 B6 jak rNTP, tak dNTP v kombinaci s enzymem podle vynálezu, vytváří směs statisticky substituovaných primer rozšiřujících produktů schopných rozštěpit v poloze 3'-5'-fosfodiesterovou vazbu mezi ribo- a sousedním deoxynukleotidem. Po extensi primeru, například PCR zesílením nebo cyklickým sekvencováním a před rozlišením produktů extense primeru, například gelovou elektroforézou, se reakční směs zpracuje buď alkalií, teplem, ribonukleázou nebo jinými prostředky k hydrolyzování produktů extense primeru u každého výskytu ribonukleotidu. Pro každý značený produkt extense primeru, je detekovatelný pouze nejvýše 5' fragment, který je bezprostředním produktem extenze značeného primeru, na sekvenčním gelu. Pro daný cíl, představuje analýza výsledných sekvenčních gelů sekvenční žebří, tedy sérii neidentifikovatelných signálů v drahách G, A, T a C odpovídajících sekvenci nukleové kyseliny cíle. Výsledný sekvenční žebřík poskytuje stejnou informaci, ať metoda použije ddNTP konvenčními prostředky, nebo rNTP a nových zde popsaných tepelně stálých polymeráz. Použitím vynálezu tedy už se k sekvencování DNA nemusí používat drahých ddNTP (viz například 6).

V alternativní sekvenční analýze se používá ribonuleotidů zakončujících řetězec. Při tomto provedení vynálezu se jako terminátorů používá 2-hydroxy, 3'-deoxynukleotidů, jako je kordicepintrifosfát. Tyto analogy rNTP mohou být fluorescenčně označeny a použití k sekvenční analýze DNA: Lee a kol. (Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992) popsal použití dyeterminátoru ddMTP. V evropském patentovém spisu EP-A-655506 a v americké přihlášce vynálezu 08/448 223 z 23. května 1995 jsou popsány modifikované enzymy pro použití s ddNTP. K účinnému začleňování značených analogů rNTP v sekvenční reakci zakončující řetězec je možno použít tepelně stálé polymerázy DNA obsahující jak modifikace obsaženou v AmpliTaq^R DNA polymeráze FS (viz shora) a specifikovaných v SEQ ID No:l, kde X není glutamová kyselina (E), jak zde popsáno. Tento proces může být automatizován a nevyžaduje syntézu barevně značených primerů. Kromě toho, jelikož reakce s barveným terminátorem umožňují provádění všech čtyř reakcí v téže zkumavce, jsou výhodnější než způsoby s barveným primerem. 2'-Hydroxy, 3'-deoxynukleotidy mohou být syntetizovány z obchodně dostupných 3'-nukleotidů (3'dA, 3'dC, 3'dG a 3'dT například od Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) a přidáním 5'-trifosfátu (Ludwig, Biophosphates and Their Synthesis Structure, Metabolism and Activity, vydavatelé Bruzik a Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, str. 201 až 204, 1987).

Kromě využití enzymů podle vynálezu v nových metodách sekvenční analýzy, hodí se zde popsané modifikované enzymy v řadě aplikací molekulární biologie. V jednom provedení je modifikovaných enzymů použito v zesilovací reakci směsi obsahující obvyklé i neobvyklé nukleotidy, například dNTP a alespoň jeden detekovatelně značený rNTP, přičemž značky mohou být například fluorescenční značky nebo radiosiotopy. Syntéza řízená matricí komplementárního řetězce poskytuje produkt DNA obsahující ribonukleosidmonofosfáty v různých polohách po své délce. Tepelné a nebo alkalické zpracování hydrolyzuje produkt extense nukleové kyseliny na každém ribonukleotidu. Získá se tak populace segmentů DNA, kde každý fragment obsahuje jeden značený podíl na konci 3'. Velikost výsledných fragmentů nukleové kyseliny může být modifikována nastavením poměru a množství rNTP zahrnutých v reakci.

Zesilování štítu pomocí rNTP a enzymů podle vynálezu poskytuje četné přednosti v závislosti na jejich příslušné aplikaci. Ve shora popsaném způsobu se značenými rNTP, je výsledná populace fragmentů celá značená se stejnou intenzitou: jedna značka pro oligonukleotidový fragment. Postupy, jako detekce nukleových kyselin pomocí řady oligonukleotidové sondy fixované na křemíkový čip, optimálně vyžaduje, aby zesílený štít byl statisticky fragmentován v pevně reprodukovatelném rozmezí velikosti k omezení vytváření sekundárních struktur pro ovládání hybridizační kinetiky. Dále k detekci hybridizace na řadě tisíců sond na čipu, může být výhodné, jsou-li fragmenty nukleová kyseliny značeny se stejnou intenzitou. Vynález poskytuje prostředky k produkování populací fragmentů, které tomuto standardu vyhovují a tím usnadňuje použití alternativních detekčních forem, jako jsou metody založené na čipu, které popsal například Corin a kol. (Human Mutation 7, str. 244 až 255,1996).

-14CZ 293215 B6

V jiném provedení poskytuje použití značených a neznačených primerů v zesilovací reakci, která obsahuje tepelně stálou polymerázu podle vynálezu a jak rNTP, tak dNTP, prostředky k současnému provádění zesilovacích a sekvenčních reakcí. Tento způsob vyžaduje provádění 4 oddělených zesilovacích reakcí, jedné pro každý rNTP. Tedy, jelikož například enzym podle vynálezu je vhodný k cílenému zesílení například pomocí PCR, nebo jinými zesilovacími prostředky, může být výsledný produkt, pokud je obsažen, detekován konvenčními metodami jako je gelová elektroforéza nebo sondová hybridizace pomocí části produktu reakce. Tyto detekční metody se neprojeví v hydrolýze začleněných ribonukleotidů a chimérické řetězce RNA/DNA se budou chovat podle očekávání u běžných produktů zesílených nukleových kyselin. Je-li žádaný produkt detekován, může se zbývající část téže reakční směsi zpracovat alkalií a analyzovat elektroforézou gelu ke stanovení sekvence nukleové kyseliny. Po detekci produktu je tudíž následná sekvenční reakce zbytečná. Tento zjednodušený postup šetří čas a materiály a přináší zvýšenou přesnost odstraněním kroku; detekovaný produkt je sekvencovaný produkt.

Podobnému způsobu s čtyřmi značenými rNTP a jedním biotinylovaným primerem lze také použít. Po zesílení se produkt rozštěpí alkalií a s primerem spojené produkty se odstraní reakcí s kuličkami povlečenými strepavidinem. Zachycené produkty se pak analyzují na sekvenčním gelu. Tato modifikace umožňuje provádět sekvenční reakci v jedné zkumavce, čímž se vylučuje nutnost čtyř samostatných zesílení.

Podle jiného význaku vynálezu se hodí zde popsané enzymy k přípravě RNA z matrice DNA nebo k vytváření substituovaných DNA pro alkalií zprostředkovanou sterilizaci bez použití konvenčních sterilizačních činidel jako je uracil-N-glykolsyláza (UNG) popsaná ve světovém patentovém spise číslo WO 92/01814.

V příkladném provedení obsahuje tepelně stálá polymeráza také mutaci v 5'-3'-exonukleázové doméně, která slouží k silnému utlumení exonukleázové aktivity. Modifikované formy Taq polymerázy jsou popsány v americkém patentovém spise 5 466 591. V jednom provedení vynálezu byl nahražen kodon kódující glycinový (G) zbytek v poloze 46 aminokyseliny kodonem kódujícím asparagovou kyselinu (D). Získaný enzym má podpořenou účinnost v cyklických sekvenčních reakcích v důsledku snížené 5'-3'-exonulkeázové aktivity a je výhodným základem pro účely vynálezu. Polymerázová doména aminokyselinové sekvence a polymerázovou aktivita jsou nedotčeny přítomností (G46D) mutantu ve srovnání s divokým typem enzymu.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese modifikované Taq polymerázového genu se sníženou diskriminací vůči neobvyklým nukleotidům

C-Koncová aminokyselinová část Taq DNA polymerázy DNA polymerázové aktivní místo domény (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Fragment DNA, který obsahuje tento úsek, byl izolován z genu Taq plné délky a mutagenizován zesílením PCR v přítomnosti manganu (Leung a kol. Technique 1 (1), str. 11 až 15,1989). Pro tento příklad byly opatřeny všechny restrikční enzymy od New England Biolabs, Beverly, Ma. Mutagenizované fragmenty byl digestovány Pstl a BglII a klonovány do expresního plazmidu Taq, zde plazmidu pLK102, který byl digestován Pstl a BglII. Plazmid pLK102 je modifikovanou formou Taq expresního plazmidu pSYC1578 (Lawyer a kol.). Fragment HincII/EcoRV umístěný v poloze 3' k úseku kódujícím polymerázu se vyjme k vytvoření plazmidu pLK.101. Pak se od pLK.101 oddělí fragment 898 páru báze Pstl—BglII a nahradí se krátkým oligonukleidovým

-15CZ 293215 B6 duplexem Pstl-EcoRV-BglII k vytvoření plazmidu pLK102. Toto vymizení odstraní základový pár 900 z konce 3' genu TaqDNA pol a nahradí ho krátkým kusem DNA.

Výsledné expresní plazmidy se transformují do kmene E. coli NI624, který popsal Gottesman (J. Mol. Biol. 77, str. 531, 1973; též k dostání od E. coli Genetic Stock Center at Yale University pod číslem kmene CGSC#5066) a produkt výsledné transformace sskrínují se zřetelem na schopnost účinně začleňovat rNTP v porovnání s enzymem divokého typu. Tímto způsobem se identifikuje mutant Cl jako mající schopnost účinněji začleňovat rNTP.

Ke zjištění, která část genu Taq polymerázy byla zodpovědná za změněný fenotyp, byl digestován mutagenizovaný Taq expresní plazmid, pojmenovaný pCl, izolovaný zmutantu Cl s různými restrikčními enzymy a výsledné restrikční fragmenty byly subklonovány do genu pLKlOl TaqDNA polymerázy divokého typu, knahražení nemutagenizovaných restrikčních fragmentů. Analýza výsledných subklonů ukázala, že mutace, zodpovědná za fenotyp, je obsažena uvnitř restrikčního fragmentu páru báze 265 Nhel až BamHI.

Sekvenční analýza DNA byla provedena v tomto úseku pCl pomocí ABI PRISM^a Dye Terminátor Cycle Sequencing Coe kit s ApliTaq^R polymerázy DNA FS od Applied Biosystems, Foster City, CA a pomocí DNA sekvenčního systému Applied Biosystems model 373A. Sekvenční analýza identifikovala dvě mutace v genu polymerázy Taq mezi místy Nhel a Bam HI. Mutace na aminokyselinové mutaci 615 způsobila, že zbytek glutamové (E) kyseliny byl nahražen glycinovým (G) zbytkem a druhá mutace v poloze 653 nahradila alaninový (A) zbytek threoninem (T). Číslování začíná v kodonu kódujícího první methioninový zbytek přírodního proteinu jako v americkém patentovém spise 5 079 352. Mutace E615G byla způsobena změnou GAG až GGG v kodonu 615. Mutace A653T byla způsobena změnou GCC na ACC u kodonu 653. Plazmid Cl v hostitelském kmenu E. coli NI624 byl uložen podle Budapešťské konvence s ATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno číslo dostupnosti 98107.

Dvoubodové mutace byly odděleně analyzovány subklonováním každé zvlášť do genu Taq polymerázy divokého typu, pomocí rekombinantní PCR (Innis a kol., PCE Protocols San Diego, Academie Press kapitola 22 s názvem „Recombinant PCR“, Higuchi, str. 177 až 183, 1990). Výsledné expresní produkty byl analyzovány ke zjištění, zda mutace E615G nebo A653T nebo obě mutace jsou zodpovědné za začleněný ribonukleotidový fenotyp. Výsledky těchto pokusů ukázaly, že za mutantový fenotyp zodpovídá pouze mutace E615G.

K další analýze a ke kvantifikování začleňování účinnosti nukleotidových analogů, byl základní párový fragment PCR265 BamHI-Nhel obsahující E615G klonován do Taq expresního vektoru pRDA3-2. Expresní vektor pRDA3-2 obsahuje v plné délce gen Taq operativně ligovaný na fág lambda PL promotor. Exonukleázová doména Taq genu v tomto vektoru obsahuje bodovou mutaci na kodonu kódujícím glycin, aminokyselinový zbytek 46, který snižuje aktivitu 5-3' exonukleázy. Avšak genová sekvence uvnitř polymerázové domény expresního vektoru pRDA32 je totožná s Taq genovou sekvencí divokého typu. Plazmid pRDA3-2 je úplně popsán v americkém patentovém spise 5 466 591, kde je plazmid nazýván „klon 3-2“. Plazmid pRDA3-2 byl digestován s BamHI a Nhel a základní párový fragment PCR 265 byl ligován do vektoru obvyklými prostředky.

Výsledný plazmid pLK108 byl transformován do kmene E. coli DG116 (Lawyer a kol., 1993, též z dostání od Američan Type Culture Collection pod číslem ATCC 53606). Plazmid pLK108 kóduje tepelně stálou DNA polymerázu, kde nazývanou G46D, E615G Taq. Mutant G46D, E615G, F667Y Taq se vytvoří kombinováním mutací E615G a F667Y rekombinantní PCR do fragmentu BamHI-Nhel. Tento fragment byl klonován do plazmidu pRNA32 k vytvoření plazmidu pLK109. Expresovaný protein tepelně stálé polymerázy DNA z plazmidu pLK108 apLK109 se čistí způsobem, který popsal Lawyer 1993, ačkoli chromatografie byla vynechána. Sekvence insertů byla potvrzena sekvenční analýzou DNA. Další mutace v sekvenci byla detekována v insertu pLK108; tato mutace nemění aminokyselinovou sekvenci proteinu.

-16CZ 293215 B6

Po částečném vyčištění se zjistí aktivita modifikovaného enzymu zkouškou aktivity, kterou popsal Lawyer a kol. (J. Bio.. Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989). Aktivita modifikovaného enzymu se vypočte takto: jedna jednotka enzymu odpovídá lOnmol produktu syntetizovaného během 30 minut. Aktivita enzymu polymerázy DNA divokého typuje přímo úměrná koncentraci enzymu do 80 až lOOpmol začleněného dCMP (zředěný enzym s 0,12 až 0,15 jednotek na reakci). Aktivita mutantů E615G, G46D a E615G, F667Y, G46D je přímo úměrná koncentraci enzymu do 0,25 až 3 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym při 6x10‘⁴ až 5xl0'³ jednotek na reakci). Tento enzymový prostředek byl využit k začlenění a k sekvenčním reakcím popsaným v příkladech 3 až 5. Pro příklady 2 až 6 byl enzym čištěn jak popsáno v literatuře Lawyer a kol., (J. Biol. Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989).

Příklad 2

Test k porovnání účinnosti i začleňování

Relativní schopnost G46D a G46D, E615G Taq začleňovat rNTP se zjistí měřením množství [alfa-³²P]rNTP, které je schopen každý enzym začlenit při omezené koncentraci enzymu do aktivované matrice DNA lososového sperma. K měření začlenění rATP μΐ reakční směsi je: 12,5 pg aktivované DNA lososího sperma, připravené jak dále uvedeno, 200 μΜ každé dCTP, dGTP a dTTP (Perkin Elmer Norwalk, CT), 100 μΜ [alfa-³²P]rATP, 1 mM beta-merkaptoethanolu, 25 mM N-tris[hydroxymethyl]methyl-3-aminopropansulfonové kyseliny (TAPS) pH

9.5, 20 °C, 50 mM JC1 a 2,25 mM chloridu hořečnatého.

Podobné testovací směsi se připraví k měření začlenění rCTP, rGTP a rUTP. V každém případě se rNTP označí radioizotopem a je obsažen ve 100 μΜ a tři zbývající rNTP (dATP, dGTP a dTTP pro rCTP, dATP, dCTP a dTTP pro rGTP a dATP, dCTP a dGTP pro rUTP) jsou obsaženy každý pří 200 μΜ. Jako standard se také změří začlenění odpovídajícího [alfa³²P]dNTP každým enzymem. Testovací směs pro tyto testy je podobná se shora uvedeným testem začleňování rNTP, stou výjimkou, že každý [alfa-³²P]rNTP, je nahražen odpovídajícím [alfa³²P]dNTP. Surová DNA lososového mlíčí 1 g/1 od Worthington Biochemical, (Freehold, NJ) se aktivuje inkubací v 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 5 mM MgCL při teplotě 2 až 8 °C po dobu 96 hodin. Přidá se pak EDTA 12,5 mM a NaCl 0,lM. DNA se pak extrahuje systémem fenol/chloroform a pak se vy sráží ethanolem a resuspenduje se v 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH

7.5. Aktivovaný prostředek DNA se dialyzuje proti stejnému pufru.

Do pěti 0,5 ml zkumavek (například Eppendorf) se vnese podíl 45 μΐ každé reakční směsi pro každý 5'-značený nukleotidový prekurzor. Testuje se tak každý G46D Taq a G46D, E615G Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro negativní kontrolu. Polymerizační reakce ve dvou zkumavkách každé testované směsi se iniciuje 5 μΐ každé polymerázy G46D Taq (0,02 jednotek) nebo G46D, E615G Taq (0,002 jednotek). Do negativní kontrolní reakce se přidá jako kontrola na úroveň základu, 5 μΐ enzym řadicího pufru spíše než enzymu.

Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přísadou 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 μΐ alikvot ze 60 μΐ reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 pg/ml DNA míchaného losového mlíčí. DNA se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračník kotoučcích GF/C (Whatman, Kent, Anglie). Množství začleněného nukleotidu nebo ribonukleotidu, značeného [alfa-³²P] se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometrií a pak se vypočte množství začleněných pmol. Počet pmol každého rNTP začleněného každým enzymem se normalizuje k počtu pmol odpovídajícího [alfa-³²P]dNTP začleněného každým enzymem. Výsledky obsahuje následující tabulka.

-17CZ 293215 B6

Poměr začlenění rNTP do dNTP pro G46D a G46D, E615G Tag

Enzym	Počet začleněných pmol (procento)
	dATP	rATP	dCTP	rCTp	dGTP	rGTP	dTTp	rUTP
G46D	27,74	0,052	34,6	0,76	36,94	0,113	28,79	0
	(100%)	(0,18%)	(100%)	(0,22 %)	(100%)	(0,36 %)	(100%)	(0)
G46D, E615G	0,67	1,41	2,82	5,33	3,27	5,96	0,688	0,545
	(100%)	(210%)	(100%)	(189%)	(100%)	(181 %)	(100%)	(79 %)

Tyto výsledky ukazují, že G46D, E615G začleňují ribonukleotidy více než 500x účinněji než G46D (například u rDTP 181:0,36 = 502x, u rCTP 189:0,22 = 859x a u rATP 210:0,18 = 1166x účinněji). Tudíž chybějící mutace v genu polymerázy u kodonů 615 poskytuje nový fenotyp: tepelně stálou polymerázu DNA schopnou účinně začleňovat ribonukleotidy přídavně k deoxyribonukleotidům.

Příklad 3

Test porovnání účinnosti začleňování 3'-deoxyATP (kordycepin)

Relativní schopnost G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y a G46D, F667Y Taq začleňovat 3'-deoxyadenosin-5'-trifosfát (kordycepintrifosfát), se zajišťovala měřením [alfa-³²P]kordycepintrifosfátu, který každý enzym mohl začlenit v omezené koncentraci enzymu do aktivované matrici DNA lososového mlíčí. K měření začlenění [alfa-³²P]kordycepintrifosfátu probíhal test tak, že konečné koncentrace v 50 μΐ byly: 12,5 pg aktivovaného DNA lososového mlíčí, po 200 μΜ dCTP, dGTP a dTTP, 50 μΜ dATP (Perkin Elmer), 50 μΜ [alfa-³²P]-3'-dATP/3'dATP (New England Nuclaer, Sigma), 1 mM beta-merkaptoethanolu, 25 mM N-tris[hydroxymethyl]methyl-3-aminopropansulfonové kyseliny (TAPS) pH 9,5, 20 °C, 55 mM KC1 a 2,25 mM MgCl₂.

Do devíti 0,5 ml zkumavek se vnese podíl 45 μΙ každé reakční směsi, takže do každé reakce se vnese G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y a G46D, F667Y Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro kontrolu bez enzymu. Polymerizační reakce ve dvou zkumavkách testované směsi se iniciuje 5 μΐ (0,05 jednotek) polymerázy G46D Taq. Totéž se provede sG46D-E615G Taq (0,0025 jednotek), G46D, E615G, F667Y Taq (0,0034 jednotek) nebo G46D, F66.Y Taq (0,083 jednotek). Jako kontrola na základní úroveň začala jedna zkumavka s enzym ředícím pufrem a místo s enzymem.

Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přísadou 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 μΐ podíl ze 60 μΐ reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 pg/ml DNA míchaného losového mlíčí. Dna se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračních kotoučcích GF/C (Whatman, Kent, Anglie). Množství začleněného značeného [alfa-³²P] se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometrií a pak se vypočte množství začleněných pmol. Počet pmolů [alfa-³²P] kordycepintrifosfátu, začleněného každým enzymem, se podělí počtem jednotek každého v testu použitého enzymu k získání pmol začleněných na jednotku enzymu. Výsledky obsahují následující tabulka.

-18CZ 293215 B6

Začlenění [alfa-²P]kordycepinu G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y a G46D, F667Y

Taq

Enzym	Počet pmol začleněných na jednotek enzymu
G46D G46D, E615G G46D, E615G, F667Y G46D, F667Y	0,221 1,560 893,6 0,740

Výsledky ukazují, že k účinnému začleňování molekuly kordycepinu do DNA jsou zapotřebí mutace E615 G a F667Y.

Příklad 4

Sekvencování DNA alkalickým štěpením pomocí G46D, E615G Taq DNA polymerázy

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu k sekvencování alkalic15 kým štěpením pomocí DNA částečně substituované rNTP. Poměr rNTP k dNTP v reakčních směsích byl 1:80 až 1:8. Reakce extense příměru se provádějí v pufru sestávajícím z50mM

Bicinu (N,N-bis)-2-hydroxyethyl)glycin, pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCk provedou se čtyři reakce, jedna pro každý ze čtyř rNTP. Každá reakční směs (50 μΐ) obsahuje po 200 μΜ dATP, dCTP, dGTP, a dTTP (Perkin-Elmer) a 0,09 pmol M13mpl8 jednořetězcové matrice 20 DNA (Perkin-Elmer) teplotně hybridizované na 5'—[³²P] značenou dG48 (Layxer a kol. PCR

Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Reakční směsi také obsahují 2,5 μΜ rATM, 2,5 μΜ rCTp, 2,5M rGTP a 2,5 μΜ rUTP.

Každá ze čtyř reakcí se iniciuje přidáním 7 jednotek polymerázy DNA G46D E615 Taq a 25 inkubuje se 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přísadou 10 μΐ 60 mM EDTA a směs se dá k ledu. Přidá se 20 μ reakční směsi do 80 μΐ 50 mM bicinu (pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM

MgCl₂. Produkty štěpení se vytvoří přidáním 7 μΐ 1 N HC1. Každá reakční směs se vysráží přísadou 312 μΐ 95% ethanolu a 10 μΐ 3M acetátu sodného (pH 4,8). Reakční směs se mikroodstřeďuje 15 minut ke shromáždění precipitátu, supematantu se odstraní, pelety se promyjí 500 30 μΐ 70% ethanolu a vysuší se. Každá peleta se resuspenduje v 5 μΐ 0,5X stop-pufru (k dostání od

Perkin-Elmer, Norwalk CT, který obsahuje 95 % formamidu, 20 mM EDTA a 0,5 % bromfenolové modře), zahřeje se na 98 °C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně elektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakrylamid/8M močovina a podrobí se elektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenovém film. Výsledný film ukazuje zřetelný 35 sekvenční žebřík, který poskytuje v nadbytku 100 bází správné sekvence.

Příklad 5

Sekvencování DNA pomocí G46D, E615G, F667Y Taq DNA polymerázy a 3'-deoxy nukleotidtrifosfátů

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy G46D, E615G, F667Y Taq k sekvencování DNA pomocí 3'-deoxynuleotidtrifosfátů. Tento pokus byl proveden s 3'-deoxyATP; bylo 45 by však možno rozšířit jeho použití stejně dobře na jiné 3'-deoxynukleotidy. Reakce extense primem byly provedeny v pufru obsahujícím 50 mM bicinu (pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCl₂. Každá reakční směs (50 μΐ) obsahovala po 200 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (PerkinElmer) teplotně hybridizovaných na 5'-[³²P] značené DG48 (Lawyer a kol., PCR Methods and

-19CZ 293215 B6

Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Reakční směsi obsahovaly také 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 nebo 5 μΜ 3'-deoxyATP.

Každá reakce se iniciuje přidáním 7 jednotek G46D, E615G, F667Y Taq DNA polymerázy a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přísadou 10 μΐ 60 mM EDTA a dá se k ledu. Třicet μΐ každé reakční směsi se vysráží ethanolem a resuspenduje se ve stop pufru, zahřeje se na teplotu 98 °C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně elektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakrylamid/8M močovina a podrobí se elektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenový film. Dráhy, obsahující reakce provedené v přítomnosti kordycepinu, obsahují zřetelně rozeznatelné terminační žebříky. Dráhy obsahující nejvíce kordycepinu, například 5 μΜ vykázaly terminační žebříky, ve kterých, v průměru, byly pásy kratší než dráhy, ve kterých byly úrovně kordycepinu nižší. Dráha, obsahující reakci provedenou v nepřítomnosti kordycepinu, vykazovaly většinou produkt v plné dolce a žádný terminační žebřík. Tyto výsledky naznačují, že mutantní enzym je schopen začleňovat kordycepin a začlenění této molekuly do produktu extense primerů způsobuje terminaci. Tohoto způsobu by mohlo být použito také k vytváření sekvenčního žebříku Na s 3'-deoxyCTO, 3'-deóxyGTP a 3'-deoxy UTP.

Příklad 6

Sekvencování barvou značeného primerů PCR G46D E615G Taq DNA polymerázou

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu na sekvencování značeného primerů, použitím ribonukleosidových trifosfátů (rNTP) v PCR při poměru rNTP-dNTP nepřesahujícím 1:30. Provedou se čtyři individuální reakce, jedna pro každý rNTP. Sekvenční reakce PCR se provedou v pufru sestávajícím z 25 mM Tris-HCl (pH 9), 5,0 mM MgCh a objemově 10% glycerolu. Každá reakční směs obsahuje po 500 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer), matrici 5xl0⁶ copy/μΙ pBSM13+plazmid (Stratagene) linearizovanou restrikční endonukleázou XmnI a 0,05 jednotek/μΐ DNA polymerázy G46D E6I5 G Taq. Reakce ribo-ATP (10 μΐ) obsahovaly 2,5 pm ATP (Pharmacia Biotech), 0,1 μΜ JOE M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 μΜ primerů ASC46 (5'-CGCCATTCGCCATTCAG). Reakce ribo-CTP (10 μΙ) obsahovaly 2,5 μΜ CTP (Pharmacia Biotech), 0,1 μΜ FAM M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 μΜ primerů ASC46. Reakce ribo-GTP (20 μΐ) obsahovaly 2,5 μΜ GTP (Pharmacia Biotech), 0,1 μΜ TAMRA M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 μΜ primerů ASC46. Reakce ribo-UTP (20 μΐ) obsahovaly 16 μΜ UTP (Pharmacia Biotech), 0,1 μΜ ROX M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 μΜ primerů ASC46.

Každá ze čtyř reakčních směsí byla umístěna do předehřátého (75 °C) tepelného cyklovače Perkin Elmer GenaAmp^RPCR systém 9600 a podrobena 30 cyklům po 95 °C 10 sekund, 55 °C, 10 sekund, 1 minutu na 65 °C a 65 °C 5 minut. Každá reakce rATP a rCTP vytvořila 6x10” kopií značeného zesíleného produktu 300 párů bází a každá reakce rGTP a UTP l,2xl0¹² kopií značeného zesíleného produktu 300 párů bází.

K určení sekvence DNA zesílených produktů PCR bez požadování separátní enzymatické reakce sekvencující DNA, se reakční směsi shromáždí, zpracují se bází a teplem, neutralizují se a vysrážejí se. Shromáždí se 4 μΐ z každé reakční směsi ATP a CTP a 8 μΐ z každé reakční směsi GTP a UTP. Do spojené reakční směsi se přidají 2 μ 0,25 M EDTA (pH 8,0) (10 mM konečné), 10 μΐ 1M NaOH (200 mM konečné) a 14 μΐ vody a inkubují se 5 minut při teplotě 95 °C v tepelném cyklovači Gena Amp^RPCR systém 9600 a neutralizují se 10 μΐ 1M HCI. Spojené reakční směsi se pak vysrážejí přísadou 150 μΐ 95% ethanolu s následnou inkubací 15 minut při teplotě 4 °C. Pak se provede 15-minutové mikroodstředění při teplotě 4 °C ke shromáždění

-20CZ 293215 B6 sraženiny a supematant se odsaje. Pelety se promyjí 300 μΐ 70% ethanolu, mikroodstředí se 5 minut, supematant se odsaje a pelety se vysuší. Pelety se resuspendují v 6 μΐ formamidu, 50 mg/ml dextranové modři (ve 25 mM EDTA) 5:1 (objemově) a 3 minuty se udržují na teplotě 90 °C. 10 μΐ resuspendovaných pelet se přímo naloží na předem elektroforezovaný 5% Long 5 Ranger M6 močovinový sekvenční gel (FMC BioProducts). Pak se provede elektroforéza a analýza na sekvenceru DNA Perkin Elmer ABI Prism™ podle výrobcových pokynů. Výsledkem softwaru automatizovaného vyvolávání bází je větší než 99% přesnost k určení sekvence DNA PCR zesíleného 300 páru bází.

Průmyslová využitelnost

Enzym tepelně stálé DNA polymerázy vykazují sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou 15 do řetězců DNA různé sekvence se zvýšenou účinností a výhodný v mnoha aplikacích syntézy in vitro.

(1) Obecná informace (i) Přihlašovatel:

(A) F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) město: Basel (D) stát: BS (E) země: BS (F) poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) telefon: (0)61 688 24 03 (H) telefax: (0)61 688 13 95 (I) telex: 962292/965512 hlr ch (ii) Název vynálezu: Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje (iii) Počet sekvencí: 13 (iv) Počítačem čitelná forma:

(A) typ prostředí: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: PatentlnRelease # 1,0, verse # 1,30 (EPO) (vi) Současné údaje o přihlášce vynálezu:

(A) číslo přihlášky vynálezu: US 60/023,376 (B) datum podání: 06-AUG-1996 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid

-21 CZ 293215 B6 (ix) Charakteristiky (A) jméno/khc: peptid (B) lokace: 4 (D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka = „kde Xaa je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Glu“ (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid (B) lokace: 7 (D) jiná informace:/označeni = Xaa /poznámka = „kde Xaa je Ile nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa

5 (2) Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid (B) lokace: 7 (D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka = „kde Xaa je Ile nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

Ser Gin Ile Glu Leu Arg Xaa

5 (2) Informace pro SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val

5 (2) Informace pro SEQ ID NO:4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární

-22CZ 293215 B6 (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

Ser Gin Ile Glu Leu Arg Ile

5 (2) Informace pro SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO:5:

Lue Asp Tyr Ser Gin Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 15 10 15 (2) Informace pro SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2626 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (iii) Hypotetická: ne (iv) Antisens: ne (vi) Originální zdroj:

(A) organismus: Thermus aquaticus

-23CZ 293215 B6 (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 121..2616 (xi) Popis sekvence: SEQ IDN0:7:

AAGCTCAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA

GGGAGGCGTT TCTAAAAGCC CTTCAC-GACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG GAAGGGTAAC

120

ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC

TTT Phe

GAG Glu

CCC AAG

GGC Gly

CGG GTC CTC

CTG Leu

168

Met 1

Arg

Gly Met

Leu 5

Pro Leu

Pro 10

Lys

Arg Val

Leu 15

GTG

GAC

GGC

CAC

CAC

CTG

GCC

TAC

CGC

ACC

TTC

CAC

GCC

CTG

AAG

GGC

216

Val

Asp

Gly

His

His

Leu

Ala

Tyr

Arg

Thr

Phe

His

Ala

Leu

Lys

Gly

20

25

30

CTC

ACC

ACC

AGC

CGG

GGG

GAG

CCG

GTG

CAG

GCG

GTC

TAC

GGC

TTC

GCC

264

Leu

Thr

Thr

Ser

Arg

Gly

Glu

Pro

Val

Gin

Ala

Val

Tyr

Gly

Phe

Ala

35

40

45

AAG

AGC

CTC

CTC

AAG

GCC

CTC

AAG

GAG

GAC

GGG

GAC

GCG

GTG

ATC

GTG

312

Lys

Ser

Leu

Leu

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Asp

Gly

Asp

Ala

Val

Ile

Val

50

55

60

GTG

TTT

C-AC

GCC

AAG

GCC

CCC

TTC

CGC

CAC

GAG

TAC

GGG

GGG

360

Val

Phe

A.sp

Ala

Lys

Ala

Prc

Ser

Phe

Arg

His

Glu

Ala

Tyr

Gly

Gly

65

7C

75

80

TAC

AAG

GCG

GGC

CGG

GCC

CCC

ACG

CCG

GAC-

GAC

TTT

CCC

CGG

CAA

CTC

408

Tyr

Lys

Ala

Gly

Arg

Ala

Pro

Thr

Pro

Glu

Asp

Phe

Pro

Arg

Gin

Leu

85

50

95

GCC

CTC

ATC

AAG

GAG

CTG

GTG

GAC

CTC

CTG

GGG

CTG

GCG

CGC

CTC

GAG

456

Ala

Leu

Ile

Lys

Glu

Leu

Val

Asp

Leu

Leu

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu

Glu

100

105

110

GTC

CCG

GGC

TAC

GAG

GCG

GAC

GAC

GTC

CTG

GCC

AGC

CTG

GCC

AAG

AAG

504

Val

Pro

Gly

Tyr

Glu

Ala

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Ser

Leu

Ala

Lys

Lys

115

120

125

GCG

GAA

AAG

GAG

GGC

TAC

GAG

GTC

CGC

ATC

CTC

ACC

GCC

GAC

AAA

GAC

552

Ala

Glu

Lys

Glu

Gly

Tyr

Glu

Val

Arg

Ile

Leu

Thr

Ala

Asp

Lys

Asp

130 135 140

-24CZ 293215 B6

CTT Leu 145

TAC Tyr

CAG CTC CTT

TCC GAC

CGC Are

ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG

GGG Gly 160

600

Gin

Leu Leu

Ser 150

Asp

Ile

His

Val 155

Leu

HiS

Pro

Glu

TAC

CTC

ATC

ACC

CCG

GCC

TGG

CTT

TGG

GAA

AAG

TAC

GGC

CTG

AGG

CCC

648

Tyr

Leu

Ile

Thr

Pro

Ala

Trp

Leu

Trp

Glu

Lys

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

165

170

175

GAC

CAG

TGG

GCC

GAC

TAC

CGG

GCC

CTG

ACC

GGG

GAC

GAG

TCC

GAC

AAC

696

Asp

Gin

Trp

Ala

Asp

Tyr

Arg

Ala

Leu

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser ·Αερ

Asn

180

185

190

CTT

CCC

GGG

GTC

AAG

GGC

ATC

Icco

GAG

AAG

ACG

GCG

AGG

AAG

CTT

CTG

744

Leu

Pro

Gly

Val

Lys

Gly

Ile

Gly

Glu

Lys

Thr

Ala

Arg

Lys

Leu

Leu

195

21-0

205

GAG

GAG

TGG

GGG

AGC

CTG

GAA

GCC

CTC

CTC

AAG

AAC

CTG

GAC

CGG

CTG

792

Glu

Glu

Trp

Gly

Ser

Leu

Glu

A_ 3

Leu

Leu

Lys

Asn

Leu

Asp

Arg

Leu

210

21 =

220

AAG

CCC

GCC

ATC

CGG

GAG

AAC-

ATC

CTG

GCC

CAC

ATG

GAC

GAT

CTC-

AAG

84C

Lys

Pro

Ala

Ile

Arg

Glu

Lys

1A

Leu

Ala

riiS

Met

Asp

Asp

Leu

Lys

225

23C

235

240

CTC Leu

TCC TGG

GAC Asp

CTG Leu 245

GCC AAG GTG

CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG

888

Ser

Trp

Ala

Lys

Val

Arg Thr 250

Asp

Leu Pro

Leu

Glu Val 255

GAC

TTC

GCC

AAA

AGG

CGG

GAG

CCC

GAC

CGG

GAG

AGG

CTT

AGG

GCC

TTT

936

Asp

Phe

Ala

Lys

Arg

Arg

Glu

Pro

Asp

Arg

Glu

Arg

Leu

Arg

Ala

Phe

260

265

270

CTG

GAG

AGG

CTT

GAG

TTT

GGC

AGC

CTC

CTC

CAC

GAG

TTC

GGC

CTT

CTG

984

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

C-ly

Ser

Leu

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Leu

Leu

275

280

285

GAA

AGC

CCC

AAG

GCC

CTG

GAG

GAG

GCC

CCC

TGG

CCC

CCG

CCG

GAA

GGG

1032

Glu

Ser

Pro

Lvs

Ala

Leu

Glu

Giu

Ala

Pro

Trp

Pro

Pro

Pro

Glu

Gly

290

295

300

GCC

TTC

GTG

GGC

TTT

GTG

CTT

TCC

CGC

AAG

GAG

CČC

ATG

TGG

GCC

GAT

108G

Ala

Phe

Val

Gly

Phe

Val

Leu

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Met

Trp

Ala

Asp

305

310

315

320

CTT

CTG

GCC

CTG

GCC

GCC

GCC

AGG

GGG

GGC

CGG

GTC

CAC

CGG

GCC

CCC

1123

Leu

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Gly

Gly

Arg

Val

His

Arg

Ala

Pro

325

330

335

GAG

CCT

TAT

AAA

GCC

CTC

AGG

GAC

CTG

AAG

GAG

GCG

CGG

GGG

CTT

CTC

1176

Glu

Pro

Tyr

Lys

Ala

Leu

Arg

Asp

Leu

Lys

Glu

Ala

Arg

Gly

Leu

Leu

340

345

350

-25CZ 293215 B6

GCC Ala

AAA Lys

GAC Asp 355

CTG Leu

AGC GTT Ser Val

CTG Leu

GCC CTG AGG GAA GGC CTT GGC

CTC CCG Leu Pro

1224

Ala Leu 360

Arg

Glu

Gly Leu 365

Gly

CCC

GGC

GAC

GAC

CCC

ATG

CTC

CTC

GCC

TAC

CTC

CTG

GAC

CCT

TCC

AAC

1272

Pro

Gly

Asp

Asp

Pro

Met

Leu

Leu

Ala

Tyr

Leu

Leu

Asp

Pro

Ser

Asn

370

375

380

ACC

ACC

CCC

GAG

GGG

GTG

GCC

CGG

CGC

TAC

GGC

GGG

GAG

TGG

ACG

GAG

1320

Thr

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Ala

Arg

Arg

Tyr

Gly

Gly

Glu

Trp

Thr

Glu

385

390

395

400

GAG

GCG

GGG

GAG

CGG

GCC

C-CC

CTT

TCC

GAG

AGG

CTC

TTC

GCC

AAC

CTG

1368

Glu

Ala

Gly

Glu

Arg

Ala

Ala

Leu

Ser

Glu

Arg

Leu

Phe

Ala

Asn

Leu

405

410

415

TGG

GGG

AGG

CTT

GAG

GGG

GAG

GAG

AGG

CTC

CTT

TGG

CTT

TAC

CGG

GAG

1416

Trp

Gly

Arg

Leu

Glu

Gly

Glu

Glu

Arg

Leu

Leu

Trp

Leu

Tyr. Arg

Glu

420

425

430

GTG

GAG

AGG

CCC

CTT

TCC

C-CT

GTC

CTG

GCC

CAC

ATG

GAG

GCC

ACG

GGG

1464

Val

Glu

Arg

Pro

Leu

Ser

Ala

val

Leu

Ala

His

Met

Glu

Ala

Thr

Gly

435

• · A •s-sU

445

GTG

CC-C

CTG

GAC

GTG

TAT

CTC

AGG

GCC

TTG

TCC

CTG

GAG

GTG

GCC

1512

Val

Arg

Leu

Asp

Val

Ala

Tyr

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Ala

450

455

460

GAG GAG ATC

GCC Ala

CGC Arg

CTC GAG c-:c

GAG GGC Glu Val

TTC CGC CTC-

GCC GGC

CAC His 480

i ? o C

Glu Glu 465

Ile

Leu Glu 470

Ala

Phe Arg 475

Leu

Ala

Gly

CCC

TTC

AAC

CTC

AAC

TCC

CGG

GAC

» /-·

CTG

GAA

AGG

GTC

CTC

TTT

GAC

1608

Pro

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Arg

Asp

Gin

Leu

Glu

Arg

Val

Leu

Phe

Asp

485

490

495

GAG

CTA

GGG

CTT

CCC

GCC

ATC

GGC

AAG

ACG

GAG

AAG

ACC

GGC

AAG

CGC

1656

Glu

Leu

Gly

Leu

Pro

Ala

Ile

Gly

Lys

Thr

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

500

505

510

TCC

ACC

AGC

GCC

GCC

GTC

CTG

GAG

awa Líc.

CGC

GAG

GCC

CAC

CCC

ATC

-704

Ser

Thr

Ser

Ala

Ala

Val

Leu

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Ala

His

Pro

Ile

515 520 525

GTG Val

GAG AAG Glu Lys 530

ATC CTG CAG

TAC CGij

GAG CTC

ACC AAG CTG AAG AGC ACC

1752

Ile

Leu Gin

Tyr 535

Arg

Glu

Leu

Thr

Lys Leu 540

Lys

Ser Thr

TAC

ATT

GAC

CCC

TTG

CCG

GAC

CTC

ATC

CAC

CCC

AGG

ACG

GGC

CGC

CTC

1800

Tyr

Ile

Asp

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ile

His

Pro

Arg

Thr

Gly

Arg

Leu

545

550

555

560

-26CZ 293215 B6

CAC His

ACC CGC Thr Arg

TTC AAC CAG ACG GCC ACG

GCC ACG GGC AGG

CTA AGT

AGC Ser

1848

Phe Asn Gin 565

Thr

Ala Thr

Ala 570

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser 575

TCC

GAT

CCC

AAC

CTC

CAG

AAC

ATC

CCC

GTC

CGC

ACC

CCG

CTT

GGG

CAG

1896

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Gin

Asn

Ile

Pro

Val

Arg

Thr

Pro

Leu

Gly

Gin

580

585

590

AGG

ATC

CGC

CGG

GCC

TTC

ATC

GCC

GAG

GAG

GGG

TGG

CTA

TTG

GTG

GCC

1944

Arg

Ile

Arg

Arg

Ala

Phe

Ile

Ala

Glu

Glu

Gly

Trp

Leu

Leu

Val

Ala

595

600

605

CTG

GAC

TAT

AGC

CAG

ATA

GGG

CTC

AGG

GTG

CTG

GCC

CAC

CTC

TCC

GGC

1992

Leu

ASD

Tyr

Ser

Gin

Ile

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Ala

His

Leu

Ser

Gly

610

615

620

GAC

GAG

AAC

CTG

ATC

CGG

GTC

T~r'

CAG

GAG

GC-G

CGG

GAC

ATC

CAC

ACG

2040

Asp

Glu

Asn

Leu

Ile

Arg

Val

Phe

Gin

Glu

Glv

Arg

Asp

Ile

His

Thr

625

630

635

640

GAG

ACC

GCC

AGC

TGG

ATG

TTC

GGC

GTC

CCC

CGG

GAG

GCC

GTG

GAC

CCC

2088

Glu

Thr

Ala

Ser

Trp

Met

Phe

Gly

Val

Pro

A.rg

Glu

Ala

Val

Asp

Pro

645

650

655

CTG

ATG

CGC

CGG

GCG

GCC

AAG

ACC

* »»*/· Λ 1 'w

AAC

TTC

GGG

GTC

CTC

TAC

GGC

2136

Leu

Met

Arg

Arg

Ala

Ala

Lys

Thr

Tis

Asn

Phe

Gly

Val

Leu

Tyr

Gly

650

ec5

670

ATG

TCG

GCC

CAC

' CGC

CTC

TCC

C.-.G

GAG

GCC

ATC

CCT

TAC

GAG

GAG

2184

Met

Ser

Ala

His

Arg

Leu

Ser

Glu

Leu

Ala

Ile

Pro

Tyr

Glu

Glu

675

< “ Λ

585

GCC

/» w /*»

GCC

TTC

ATT

GAG

CGC

7 —

TTT

CAG

AGC

TTC

CCC

AAG

GTG

CGG

2232

Ala

C' ' .-s

Ala

Phe

Ile

Glu

Arg

Tvr

?.~.e

Glr.

Ser

Phe

Pro

Lys

Val

Arg

w * J

535

700

/'-z—·—’ Ala 705

TGG Tro

ATT Zle

GAG Glu

AAG ACC CTG

GAG Glu

GAG GGC

AGG a.rr

AGG Arg

CGG Arg

GGG Gly

TAC Tyr

GTG Val 720

2280

Lys

Thr 710

Leu

Glu

~ _ y

GAG

ACC

CTC

TTC

GGC

CGC

CGC

CGC

TAC

GTG

CCA

GAC

CTA

GAG

GCC

CGG

2328

Glu

Thr

Leu

Phe

Gly

Arg

Arg

Arg

Tyr

Val

Pra

Asp

Leu

Glu

Ala

Arg

725

730

735

GTG

AAG

AGC

GTG

CGG

GAG

GCG

GCC

GAG

CGC

ATG

GCC

TTC

AAC

ATG

CCC

2376

Val

Lys

Ser

Val

Arg

Glu

Ala

Ala

Glu

Arg

Met

Ala

Phe

Asn

Het

Pro

740

745

750

GTC

CAG

GGC

ACC

GCC

GCC

GAC

CTC

ATG

AAG

CTG

GCT

ATG

GTG

AAG

CTC

2424

Val

Gin

Gly

Thr

Ala

Ala

Asp

Leu

Met

Lys

Leu

Ala

Met

Val

Lys

Leu.

755

760

765

TTC

CCC

AGG

CTG

GAG

GAA

ATG

GGG

GCC

AGG

ATG

CTC

CTT

CAG

GTC

CAC

2472

Phe

Pro

Arg

Leu

Glu

Glu

Met

Gly

Ala

Arg

Met

Leu

Leu

Gin

Val

His

77C

775

780

-27CZ 293215 B6

GAC Asp 785

GAG Glu

CTG GTC CTC

GAG Glu 790

GCC CCA

AAA GAG AcjG

GCG GAG GCC GTG GCC

2520

Leu

val

Leu

Ala

Pro

Lys

Glu

Arg 795

Ala

Glu

Ala Val

Ala 800

CGG

CTG

GCC

AAG

GAG

GTC

ATG

GAG

GGG

GTG

TAT

CCC

CTG

GCC

GTG

CCC

2568

Arg

Leu

Ala

Lys

Glu

Val

Met

Glu

Gly

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Val

Pro

805

810

815

CTG

GAG

GTG

GAG

GTG

GGG

ATA

GGG

GAG

GAC

TGG

CTC

TCC

GCC

AAG

GAG

2616

Leu

Glu

Val

Glu

Val

Gly

Ile

Gly

Glu

Asp

Trp

Leu

Ser

Ala

Lys

Glu

820

825

830

TGATACCACC

2626

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 832 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ IDN0:8:

Met. 1

Arg Gly Met

Leu Pro 5

Leu

Phe Glu

Pro 10

Lys

Gly Arg

Val

Leu 15

Leu

Va 1

Asp

Gly

His

His

Leu

Ala

Arg

Thr

Pha

His

Ala

Leu

Lys

Gly

20

25

30

Leu

Thr

Thr

Ser

Arg

Gly

Glu

Pro

Val

Gin

Ala

Val

Tyr

Gly

Phe

Ala

35

40

45

Lys

Ser

Leu

Leu

Lys

Ala

Leu

Lys

Glu

Asp

Gly

Asp

Ala

Val

Ile

Val

C * J

55

60

Val

Phe

Asp

Ala

Lys

Ala

Pro

Ser

Phe

Arg

His

Glu

Ala

Tyr

Gly

Gly

65

70

75

80

Tyr

juV s

Ala

Gly

Arg

Ala

Pro

Thr

Pro

Glu

A.so

Phe

Pro

Arg

Gin

Leu

85

90

95

Ala

Leu

Ile

Lys

Glu

Leu

Val

Asp

Leu

Leu

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu

Glu

100

105

110

Val

Pro

Gly

Tyr

Glu

Ala

Asp

Asp

Val

Leu

Ala

Ser

Leu

Ala

Lys

Lys

115

120

125

Ala

Glu

Lys

Glu

Gly

Tyr

Glu

Val

Arg

Ile

Leu

Thr

Ala

Asp

Lys

Asp

130

135

140

-28CZ 293215 B6

Leu 145

Tyr

Gin Leu

Leu

Ser Asp 150

Arg Ile

His Val Leu His Pro Glu Gly

155

160

Tyr

Leu

Ile

Thr

Pro

Ala

Trp

Leu

Trp

Glu

Lys

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

.165

170

175

Asp

Gin

Trp

Ala

Asp

Tyr

Arg

Ala

Leu

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Asp

Asn

180

185

190

Leu

Pro

Gly

Val

Lys

Gly

Ile

Gly

Glu

Lys

Thr

Ala

Arg

Lys

Leu

Leu

195

200

205

Glu

Glu

Trp

Gly

Ser

Leu

Glu

Ala

Leu

Leu

Lys

Asn

Leu

Asp

Arg

Leu

210

215

220

Lys

Pro

Ala

Ile

Arg

Glu

Lys

Ile

Leu

Ala

His

Met

Asp

Asp

Leu

Lys

225

230

235

240

Leu

Ser

Trp

Asp

Leu

Ala

Lys

Val

Arg

Thr

Asp

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

245

250

255

Asp

Phe

Ala

Lys

Arg

Arg

Glu

Pro

Asp

Arg

Glu

Arg

Leu

Arg

Ala

Phe

260

265

270

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Phe

Gly

Ser

Leu

Leu

His

Glu

Phe

Gly

Leu

Leu

275

280

285

Glu

Ser

Pro

Lys

Ala

Leu

Glu

Glu

Ala

Pro

Trp

Pro

Pro

Pro

Glu

Gly

250

295

300

Ala

Phe

Val

Gly

Phe

val

Leu

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Met

Trp

Ala

Asp

305

310

315

320

Leu

Les

Ala

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Gly

Gly

Arg

Val

His

Arg

Ala

Pro

325

330

335

Glu

Tvr

Lys

Ala

Leu

Arg

Asp

Leu

Lys

Glu

Ala

Arg

Gly

Leu

Leu

340

345

350

Λ-d

-ys

Asp

Leu

Ser

Val

Leu

Ala

Leu

Arg

Glu

Gly

Leu

Gly

Leu

Pro

35’5

360

365

Pro

Q ...

Asp

Asp

Pro

Met.

Leu

Leu

Ala

Tyr

Leu

Leu

Asp

Pro

Ser

Asn

370

375

380

Thr

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

Ala Arg

Arg

Tyr

Gly

Gly

Glu

Trp

Thr

Glu

335

390

395

400

Glu

Ala

Gly

Glu

Arg

Ala

Ala Leu

Ser

Glu

Arg

Leu

Phe

Ala

Asn

Leu

405

410

415

Trp

Gly

Arg

Leu

Glu

Gly

Glu Glu

Arg

Leu

Leu

Trp

Leu

Tyr

Arg

Glu

420

425

430

-29CL 293215 B6

Val

Glu Arg 435

Pro Leu Ser Ala Val 440

Leu

Ala His Met Glu 445

Ala Thr

Gly

val

Arg

Leu

Asp

Val

Ala

Tyr

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

Leu

Glu

Val

Ala

450

455

460

Glu

Glu

Ile

Ala

Arg

Leu

Glu

Ala

Glu

Val

Phe

Arg

Leu

Ala

Gly

His

4 65

470

475

480

Pro

Phe

Asn

Leu

Asn

Ser

Arg

Asp

Gin

Leu

Glu

Arg

Val

Leu

Phe

Asp

485

490

495

Glu

Leu

Gly

Leu

Pro

Ala

Ile

Gly

Lys

Thr

Glu

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg

500

505

510

Ser

Thr

Ser

Ala

Ala

Val

Leu

Glu

Ala

Leu

Arg

Glu

Ala

His

Pro

Ile

515

520

525

Val

Glu

Lys

Ile

Leu

Gin

Tyr

Arg

Glu

Leu

Thr

Lys

Leu

Lys

Ser

Thr

530

535

540

Tyr

Ile

Asp

Pro

Leu

Pro

Asp

Leu

Ile

His

Pro

Arg

Thr

Gly

Arg

Leu

545

550

555

560

His

Thr

Arg

Phe

Asn

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Ser

565

570

575

Ser

Asp

Pro

Asn

Leu

Gin

Asn

Ile

Pro

Val

Arg

Thr

Pro

Leu

Gly

Gin

580

585

590

Arg

Ile

Arg

Arg

Ala

Phe

Ile

Ala

Glu

Glu

Gly

Trp

Leu

Leu

Val

Ala

595

600

605

Leu

Asp

Tyr

Ser

Gin

Ile

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Ala

His

Leu

Ser

Gly

610

615

620

Asp

Glu

Asn

Leu

Ile

Arg

Val

Phe

Gin

Glu

Gly

Arg

Asp

Ile

His

Thr

625

630

635

640

Glu

Thr

Ala

Ser

Trp

Met

Phe

Gly

Val

Pro

Arg

Glu

Ala

Val

Asp

Pro

645

650

655

Leu

Met

Arg

Are

Ala

Ala

Lys

Thr

Ile

Asn

Phe

Gly

Val

Leu

Tyr

Gly

660

665

670

Met

Ser

Ala

His

Arg

Leu

Ser

Gin

Glu

Leu

Ala

Ile

Pro

Tyr

Glu

Glu

675

680

685

Ala

Gin

Ala

Phe

Ile

Glu

Arg

Tyr

Phe

Gin

Ser

Phe

Pro

Lys

Val

Arg

690

695

700

-30CZ 293215 B6

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705

710

715

720

Glu

Thr

Leu

Phe

Gly

Arg

Arg

Arg

Tyr

Val

Pro

Asp

Leu

Glu

Ala

Arg

725

730

735

Val

Lys

Ser

Val

Arg

Glu

Ala

Ala

Glu

Arg

Met

Ala

Phe

Asn

Met

Pro

740

745

750

Val

Gin

Gly

Thr

Ala

Ala

Asp

Leu

Met

Lys

Leu

Ala

Met

Val

Lys

Leu

755

760

765

Phe

Pro

Arg

Leu

Glu

Glu

Met

Gly

Ala

Arg

Met

Leu

Leu

Gin

Val

His

770

775

780

Asp

Glu

Leu

Val

Leu

Glu

Ala

Pro

Lys

Glu

Arg

Ala

Glu

Ala

Val

Ala

785

790

795

800

Arg

Leu

Ala

Lys

Glu

Val

Met

Glu

Gly

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Val

Pro

805

810

815

Leu

Glu

Val

Glu

Val

Gly

Ile

Gly

Glu

Asp

Trp

Leu

Ser

Ala

Lys

Glu

820

825

830

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, která je mutantní formou přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymerázy, přičemž přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymeráza má aminokyselinovou sekvenci obsahující aminokyselinový sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde Xaa v poloze 7 tohoto sekvenčního motivuje Val nebo Ile a tato mutantní forma je modifikována tak, že obsahuje jinou aminokyselinu než glutamovou kyselinu Glu v poloze 4 sekvenčního motivu a mutantní forma má sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou.
2. 2. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 s alespoň dvacetinásobnou schopností začleňovat neobvyklé nukleotidy ve srovnání s odpovídající nativní polymerázou.
3. 3. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 a 2, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA, která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je s výhodou ribonukleosidtrifosfát a odpovídající obvyklý nukleotid v poměru 1:1 nebo menším.
4. 4. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 a 2, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA, která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je svýhodou ribonukleosidtrifosfát obsažený v koncentraci méně než 100 μΜ a odpovídající obvyklý nukleotid, který je obsažen v koncentraci vyšší než 100 μΜ.
5. 5. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 a 2, která je rekombinantním derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé DNA polymerázy z organismu voleného ze souboru zahrnujícího Thermus aquaticus, Thermus caldophlilus, Thermus chliarophilus, Thermus fíliformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species 205, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga

   -31 CZ 293215 B6 maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum,

   Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophilus.
6. 6. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 až 5, která je rekombinantním derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé Thermus species DNA polymerázy, s výhodou Taq DNA polymerázy DNA nebo její homologické polymerázy, nejvýhodněji tepelně stálé DNA polymerázy obsahující aminokyselinovou sekvenci LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ IDNO:5).
7. 7. Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 až 4 mající alespoň 39 %, výhodně alespoň 60 %, výhodněji alespoň 80 % sekvenční homologie s aminokyselinovou sekvencí Taq DNA polymerázy (SEQ ID NO:7).
8. 8. Sekvence nukleové kyseliny kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 7.
9. 9. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázou podle nároků 1 až 7.
10. 10. Hostitelská buňka obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 7.
11. 11. Způsob přípravy rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy nároků laž7, vyznačující se tím, že (a) se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 10 za podmínek, které podporují expresi rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy a (b) izoluje se rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza z hostitelské buňky nebo z kultivačního prostředí.
12. 12. Použití rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy podle nároků 1 až 7 k zesilování nukleových kyselin nebo v sekvenčních reakcích.
13. 13. Prostředek pro použití v DNA sekvenční reakci, vyznačující se tím, že ho tvoří matrice nukleové kyseliny, oligonukleotidový primer komplementární k uvedené matrici, rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza podle nároků 1 až 7, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je 1:1 nebo menší.
14. 14. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid, přičemž je tento ribonukleotid s výhodou obsažen v koncentraci nižší než 100 μΜ a odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci vyšší než 100 μΜ.
15. 15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že neobvyklý nukleotid je neznačený.
16. 16. Způsob sekvenční analýzy cílové nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že se (a) zajišťuje neobvyklý nukleotid a příslušný obvyklý nukleotid v sekvenční reakci DNA, kde neobvyklý nukleotid a odpovídající obvyklý nukleotid jsou v poměru nižším než 1:1, (b) zpracovává se reakční směs ze stupně (a) v přítomnosti rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy podle nároků 1 až 7 za podmínek extense primem k zajištění produktů extense primeru obsahujících neobvyklý nukleotid,

    -32CZ 293215 B6 (c) zpracovávají se produkty extense příměru ze stupně (b) za podmínek pro hydrolýzu produktů extense příměru, (d) štěpí se produkty reakce ze stupně (c) a (e) stanoví se sekvence cílové nukleové kyseliny.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid, obsažený s výhodou v koncentraci 0,1 μΜ až 100 μΜ.
18. 18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci 50 μΜ až 500 μΜ.
19. 19. Kit pro sekvenční analýzu nukleové kyseliny obsahující reakční činidla užitečná při takové sekvenční analýze, jako je například několik oligonukleotidových primerů, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je s výhodou nižší než 1:1, v y z n a č u j i c í se t í m , že obsahuje rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároků 1 až 7.