ES2227640T3 - Polimerasa de adn termoestable modificada. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA ENZIMAS DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES QUE COMPRENDEN LA SECUENCIA AMINOACIDICA SER GLN ILE XAA LEU ARG XAA (SEQ ID NUM: 1), EN LA QUE XAA EN LA POSICION 4 DE ESTA SECUENCIA ES CUALQUIER RESIDUO AMINOACIDICO, EXCEPTO UN RESIDUO DE ACIDO GLUTAMICO (GLU), PREFERENTEMENTE UN RESIDUO DE GLICINA, Y XAA EN LA POSICION 7 DE ESTA SECUENCIA ES UN RESIDUO DE VALINA (VAL) O UN RESIDUO DE ISOLEUCINA (ILE). LAS DNA POLIMERASAS TERMOESTABLES DE LA INVENCION POSEEN UNA EFICIENCIA AUMENTADA EN LA INCORPORACION DE NUCLEOTIDOS NO CONVENCIONALES, TALES COMO RIBONUCLEOTIDOS, EN PRODUCTOS DE DNA, Y PRESENTAN VENTAJAS EN NUMEROSAS APLICACIONES DE SINTESIS IN VITRO. TALES ENZIMAS SON PARTICULARMENTE UTILES PARA SU USO EN PROTOCOLOS DE SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS, Y PARA PROPORCIONAR NUEVOS MEDIOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIA DE DNA CON VENTAJAS RELATIVAS AL COSTE Y A LA EFICIENCIA. SE REIVINDICAN ASIMISMO ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHAS POLIMERASAS, VECTORES Y CELULAS HUESPEDQUE COMPRENDEN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, ASI COMO COMPOSICIONES PARA SER UTILIZADAS EN LAS REACCIONES DE SECUENCIACION DE DNA, KITS Y METODOS PARA SECUENCIACION QUE INCLUYEN DICHAS POLIMERASAS.

Description

Polimerasa de ADN termoestable modificada.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a polimerasas de ADN termoestables que tienen una mayor eficacia en incorporar trifosfatos de ribonucleósidos. La invención proporciona métodos y medios para aislar estas polimerasas. Las enzimas de la invención son útiles en muchas aplicaciones y en particular en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. La invención proporciona además métodos mejorados de análisis de las secuencias de los ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

La secuenciación del ADN implica normalmente la generación de cuatro poblaciones de fragmentos de ADN de hebra simple que tiene un extremo definido y un extremo variable. El extremo variable termina por lo general en bases específicas de nucleótido (del tipo guanina (G), adenina (A), timidina (T) o citosina (C)). Los cuatro conjuntos diferentes de fragmentos se separan en base a su longitud. En uno de los procedimientos se emplea un gel de poliacrilamida de alta resolución. Cada banda de un gel de este tipo corresponde a un nucleótido específico de la secuencia del ADN, con lo cual identifica las posiciones dentro de la secuencia.

Un método de secuenciación de ADN que se utiliza con frecuencia es el método de secuenciación didesoxi o de terminación de cadena, que consiste en la síntesis enzimática de una hebra de ADN (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463, 1977). Se llevan a cabo por lo general cuatro síntesis separadas, cada reacción provoca la terminación en una base específica (G, A, T o C) mediante la incorporación de un nucleótido apropiado para la terminación de la cadena, por ejemplo un didesoxinucleótido. Los productos de la reacción son fáciles de interpretar, ya que cada carril corresponde únicamente a una de las cuatro G, A, T o C.

En el método didesoxi de terminación de cadena se fusiona un cebador (primer) corto de hebra simple con un molde (template) de hebra simple. Se prolonga el cebador en su extremo 3' con la incorporación de desoxinucleótidos (dNTP) hasta que se incorpora un didesoxinucleótido (ddNTP). Cuando se incorpora un ddNTP, entonces cesa la prolongación en dicha base. Sin embargo, para asegurar la fidelidad de la replicación del ADN, las polimerasas de ADN tienen una tendencia muy fuerte a incorporar sus sustratos normales, es decir, los dNTP y contra la incorporación de análogos de nucleótidos, también llamados nucleótidos no convencionales. En el caso de la síntesis del ADN, los ribonucleótidos (rNTP) se consideran nucleótidos no convencionales porque, al igual que los ddNTP, los rNTP no son el sustrato normal "in vivo" de una polimerasa de ADN. En las células, esta propiedad atenúa la incorporación de bases no normales, por ejemplo el trifosfato de desoxiinosina (dITP) o los rNTP, a una hebra de ADN en crecimiento.

Dos metodologías de secuenciación automatizada que se utilizan frecuentemente consisten en la secuenciación con cebador-colorante (dye-primer) y con terminador-colorante (dye-terminator). Estos métodos son idóneos para restos marcados con compuestos fluorescentes. Aunque la secuenciación puede realizarse también empleando restos marcados radiactivamente, se está prefiriendo cada vez más la secuenciación basada en la fluorescencia. Resumiendo, en la secuenciación con cebador-colorante se utiliza un cebador marcado con compuestos fluorescentes, combinados con los ddNTP sin marcar. El procedimiento requiere cuatro reacciones de síntesis y hasta cuatro carriles en un gel para cada molde que quiera secuenciarse (un carril para cada uno de los productos de terminación específicos de cada base). Después de la extensión del cebador, se analizan de forma habitual las mezclas de las reacciones de secuenciación, que contienen los productos de terminación que incorporan didesoxinucleótidos, por electroforesis a través de un gel de secuenciación de ADN. Después de la separación por electroforesis se excitan los productos marcados con compuestos fluorescentes con un láser en el fondo del gel y se detecta la fluorescencia con un monitor apropiado. En los sistemas automatizados, un detector escanea el fondo del gel durante la electroforesis para detectar cualquier tipo de resto marcador que se haya empleado, a medida que las mezclas reaccionantes atraviesan la estructura (matrix) del gel (Smith y col., Nature 321, 674-679, 1986). En una modificación de este método se marcan cuatro cebadores con diferentes marcadores fluorescentes. Una vez finalizadas las cuatro reacciones separadas de secuenciación, se reúnen las mezclas reaccionantes y se someten las mezclas reaccionantes combinadas a un análisis a través de gel en un solo carril, de este modo se detectan individualmente los diferentes marcadores fluorescentes (cada una de ellas correspondiente a uno de los cuatro productos de terminación diferentes específicos de una base).

Como alternativa se emplean métodos de secuenciación de terminador-colorante. En este método se utiliza una polimerasa de ADN para incorporar los dNTP y los ddNTP marcados con compuestos fluorescentes al extremo creciente del cebador de ADN (Lee y col., Nucleic Acid Research 20, 2471, 1992). Este proceso tiene la ventaja de no tener que sintetizar cebadores marcados con colorante. Además, las reacciones de terminador-colorante son más convenientes por cuanto las cuatro reacciones pueden llevarse a cabo en el mismo tubo. Se han descrito polimerasas de ADN termoestable modificado que presentan una discriminación reducida con respecto a los ddNTP (ver publicación de solicitud de patente europea EP-A-655 506). Un ejemplo de polimerasa de ADN termoestable modificada es la forma mutada de la polimerasa de ADN del T. aquaticus que tiene un resto tirosina en la posición 667 (en lugar de un resto fenilalanina), es decir, la forma llamada mutada F667Y de la polimerasa del Taq ADN. El AmpliTaq® FS, fabricado por Hoffmann-La Roche y comercializado a través de Perkin Elmer, reduce la cantidad de ddNTP requerida para la secuenciación eficaz de ácido nucleico de una diana entre cien y mil veces. El AmpliTaq® FS es una forma mutada de la polimerasa de ADN del T. aquaticus que tiene la mutación F667Y y además un resto ácido aspártico en la posición 46 (en lugar del resto glicina; mutación G46D).

Existe demanda de polimerasas de ADN termoestables que se permitan realizar métodos alternativos de síntesis de ácidos nucleicos, destinados a análisis precisos y económicos de secuencias de ADN de ácidos nucleicos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona enzimas polimerasa de ADN termoestables, dependientes del molde, que consisten en el motivo de secuencia de aminoácidos SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO: 1), en la que el "Xaa" de la posición 4 de esta secuencia es cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile). Si se recurre al método de una sola letra para representar los aminoácidos, este motivo de secuencia podría representarse del modo siguiente: S Q I X L R V/I, en el que la X de la posición 4 de esta secuencia es cualquier resto de aminoácido, excepto el resto ácido glutámico. Las enzimas polimerasa de ADN termoestables que tienen una secuencia de aminoácidos que llevan dicho motivo de secuencia, en el que la X de la posición 4 de este motivo de secuencia no es un resto de ácido glutámico, tienen una discriminación reducida frente a la incorporación de ribonucleótidos, si se compara con la de las polimerasas termoestables conocidas previamente. En una hebra de ADN en crecimiento, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales. Por lo tanto, en un primer aspecto, las nuevas enzimas de la invención incorporan a la hebra de ADN en crecimiento análogos de base no convencionales, por ejemplo ribonucleótidos, que son más eficientes en varios órdenes de magnitud que las enzimas sintetizadoras de ADN termoestables ya identificadas con anterioridad. Se proporcionan también en la presente invención los genes que codifican estas enzimas, así como los vectores de expresión recombinantes y las células hospedantes que contienen dichos vectores. Con estas células hospedantes transformadas se pueden proporcionar grandes cantidades de enzimas polimerasas termoestables purificadas.

Con la presente invención se identifica una región o motivo de secuencia dentro de la secuencia de aminoácidos de las polimerasas de ADN termoestables, que aumenta la eficacia de la idoneidad de la polimerasa por incorporar ribonucleótidos, al tiempo que conserva la aptitud para incorporar fielmente los desoxirribonucleótidos. Las alteraciones de esta región, es decir, uno o varios cambios de aminoácidos (introducidos p.ej. por mutagénesis específica de sitio) proporciona una enzima polimerasa termoestable que es capaz de sintetizar una hebra de ARN o quimérica o híbrida de ARN/ADN sobre un molde de ADN.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones mejorados para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana, en los que se elimina la necesidad de los ddNTP terminadores de cadena. Con los métodos mejorados de la presente se incorporan los ribonucleótidos (rNTP) a los productos de extensión del cebador. Dado que las enzimas en cuestión incorporan de modo preciso y eficaz ya sea los rNTP, ya sea los dNTP, las reacciones de secuenciación pueden utilizar los dos tipos de nucleótidos. Después de la extensión del cebador pueden separarse (eliminarse) los productos oligonucleótidos recién sintetizados de los rNTP incorporados por métodos ya conocidos de la técnica, p.ej. por hidrólisis, proporcionando de este modo una población de fragmentos idónea para el fraccionamiento y el análisis de secuencias por medios convencionales, por ejemplo la electroforesis a través de gel. Estos métodos utilizan las nuevas enzimas polimerasas termoestables proporcionadas por la presente. En este aspecto, la invención proporciona por tanto enzimas polimerasas de ADN termoestables que se caracterizan porque la polimerasa contiene el motivo crítico SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ: ID NO: 1), en el que el "Xaa" de la posición 4 puede ser cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile).

En otro aspecto de la invención, las polimerasas modificadas descritas en la presente proporcionan medios para la incorporación de ribonucleótidos o análogos que contienen un grupo hidroxilo, u otra sustitución, en la posición 2' que, en comparación, está ausente de los desoxirribonucleótidos convencionales. Esto nucleótidos pueden marcarse de forma diferencial, proporcionando alternativas al uso convencional de los didesoxinucleótidos para las aplicaciones de secuenciación del ADN.

Las enzimas polimerasas termoestables mutantes de la invención se caracterizan por la capacidad de incorporar con mayor eficacia los nucleótidos no convencionales, en especial ribonucleótidos, que las enzimas equivalentes de tipo salvaje. En una forma preferida de ejecución de la invención, el nucleótido no convencional puede incorporarse a un análogo de base terminadora de cadena, por ejemplo el 2-hidroxi-3'-desoxi-ATP (trifosfato de cordicepina), un análogo riboterminador de ATP o un nucleótido no terminador de cadena, por ejemplo el rNTP.

En otro aspecto de la invención se proporcionan enzimas polimerasas termoestables mutantes que se caracterizan por su idoneidad para incorporar con mayor eficacia los nucleótidos no convencionales, en especial ribonucleótidos, que las enzimas correspondientes de tipo salvaje. En este aspecto, la invención proporciona enzimas polimerasas de ADN termoestables recombinantes que se caracterizan porque (a) en su forma nativa, la polimerasa contiene la secuencia de aminoácidos SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en la que el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile); (b) la secuencia de aminoácidos está mutada en la enzima recombinante, con preferencia en la posición 4 de esta secuencia, de modo que el resto ácido glutámico de la posición 4 es otro resto de aminoácido, con preferencia un resto glicina; y (c) la enzima recombinante tiene una discriminación reducida en cuanto a la incorporación de ribonucleótidos y análogos de ribonucleótido si se compara con la forma nativa de dicha enzima.

En otro aspecto de la invención, las polimerasas de la invención proporcionan un medio conveniente para fragmentar productos de amplificación y productos de extensión de cebadores, dichos productos fragmentados pueden ser útiles en las metodologías basadas en la hibridación y en un gran número de estrategias de detección de secuencias.

Las enzimas de la presente invención y los genes que las codifican pueden utilizarse para obtener composiciones destinadas a reacciones de secuenciación de ADN, que consisten en una mezcla de nucleótidos convencionales y por lo menos un ribonucleótido o un análogo de ribonucleótido. En una forma preferida de ejecución de la invención, el nucleótido no convencional es un ribonucleótido y la concentración de ribonucleótido es menor que la concentración del correspondiente desoxirribonucleótido, es decir, la proporción rNTP:dNTP se sitúa en 1:1 o menos. Las enzimas de la invención son idóneas además para la comercialización en formatos de tipo kit, dicho kit puede contener además cualquiera de los elementos adicionales siguientes, necesarios para la reacción de secuenciación de ácidos nucleicos, p.ej. los dNTP, los rNTP, tampones y/o cebadores.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevas y mejoradas enzimas polimerasas de ADN termoestables modificadas, composiciones y kits que se definen en el grupo de reivindicaciones anexas. Las enzimas de la invención incorporan los trifosfatos de nucleósidos no convencionales con mayor eficacia que las polimerasas conocidas con anterioridad o que las correspondientes enzimas polimerasas de tipo salvaje de las que derivan estas nuevas polimerasas. Se proporcionan también las secuencias de ADN que codifican estas enzimas modificadas, los vectores de expresión de las enzimas modificadas y las células transferidas con tales vectores. Las enzimas modificadas de la invención permiten la práctica de nuevos métodos de secuenciación de ADN que son ventajosos con respecto a los procedimientos de secuenciación de ADN ya conocidos de la técnica anterior.

Para facilitar la comprensión de la invención se definen a continuación muchos de los términos empleados.

El término "convencional" referido a bases de ácidos nucleicos, trifosfatos de nucleósidos o nucleótidos indica que aquellas aparecen de forma natural en el polinucleótido descrito (es decir, en el caso del ADN, estas bases son el dATP, el dGTP, el dCTP y el dTTP). Además, el c7dGTP y la dITP se utilizan con frecuencia en lugar de el dGTP (aunque se incorporen con una eficacia menor) en las reacciones de síntesis de ADN "in vitro", por ejemplo la secuenciación. El término colectivo que se puede emplear para designarlas es el de trifosfatos de desoxirribonucleósido (dNTP).

El término "sistema de expresión" se refiere a secuencias de DNA que contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias de control en engarces operables, de modo que los hospedantes transformados con estas secuencias son capaces de producir proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión debe incluirse en un vector, pero es posible también integrar el ADN relevante en el cromosoma hospedante.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que contiene las secuencias de control y de codificación, necesarias para la producción de un polipéptido o precursor bioactivo recuperable. El polipéptido puede codificarse con una secuencia de gen de longitud completa o con cualquier porción de una secuencia codificante, en el supuesto de que se conserve la actividad enzimática.

El término "célula(s) hospedante(s)" indica organismos celulares simples, tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo bacterias, levadura y actinomicetos y células simples de plantas o animales de orden superior que se están cultivando en un cultivo celular.

En esta descripción, el término "mezcla reaccionante de secuenciación de ADN" indica una mezcla reaccionante que contiene los elementos necesarios para una reacción de secuenciación de ADN. Por consiguiente, una mezcla reaccionante de secuenciación de ADN es idónea para el uso en un método de secuenciación de ADN para determinar la secuencia de ácidos nucleicos de una diana, aunque la mezcla reaccionante puede estar inicialmente incompleta, de modo que sea el usuario quien controle el inicio de la reacción de secuenciación. De esta manera, la reacción puede iniciarse en el momento en el que se añade un elemento final, por ejemplo la enzima, que completa la mezcla reaccionante de secuenciación del ADN. La reacción de secuenciación del ADN contendrá por ejemplo un tampón, idóneo para la actividad de polimerización, trifosfatos de nucleósidos y por lo menos un nucleótido no convencional. La mezcla reaccionante puede contener además un cebador idóneo para la extensión sobre una diana por acción de una enzima polimerasa, una polimerasa y un ácido nucleico diana. Ya sea el cebador, ya sea uno de los nucleótidos estará por lo general marcado con un resto detectable, por ejemplo un marcador fluorescente. Por lo general, la mezcla reaccionante es una mezcla que contiene cuatro nucleótidos convencionales y por lo menos un nucleótido no convencional. En una forma preferida de ejecución de la invención, la polimerasa es una polimerasa de ADN termoestable y el nucleótido no convencional es un ribonucleótido.

El término "oligonucleótido" empleado en la presente se define como una molécula que consta de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, con preferencia más de tres, y usualmente más de diez. El tamaño exacto de un oligonucleótido dependerá de muchos factores, incluida la función o el uso últimos de los oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos pueden obtenerse por cualquier método idóneo, incluida por ejemplo la clonación y la restricción de secuencias adecuadas y la síntesis química directa por un método tal como el método del fosfotriéster de Narang y col., Meth. Enzymol. 68, 90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown y col., Meth. Enzymol. 68,
109-151, 1979; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage y col., Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862, 1981; el método del triéster de Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191, 1981; los métodos de síntesis automatizada; o el método del soporte sólido de la patente US-4 458 066.

El término "cebador" empleado en la presente significa un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se pone en condiciones en las que se inicia la extensión del cebador. Un cebador es con preferencia un oligodesoxirribonucleótido de hebra simple. La longitud apropiada de un cebador dependerá del uso pretendido de dicho cebador, pero se sitúa por ejemplo entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas cortas de cebador requieren por lo general temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, pero tiene que ser lo suficientemente complementario para hibridarse con un molde para que pueda tener lugar el alargamiento del cebador.

Un cebador, si se desea, puede marcarse con la incorporación de un marcador detectable por métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, entre los marcadores útiles se incluyen el P^{32}, los colorantes fluorescentes, los reactivos densos en electrones, las enzimas (empleadas habitualmente en los ensayos ELISA), la biotina o los haptenos y proteínas, de las que se dispone de antisueros o de anticuerpos monoclonales.

El término "polimerasa termoestable" indica una enzima que es estable al calor, es resistente al calor o conserva una actividad suficiente para efectuar las reacciones posteriores de extensión del cebador cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para realizar la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble hebra. Tal como se utiliza en la presente descripción, una polimerasa termoestable es idónea para utilizarse en una reacción de ciclación por temperatura, como es la reacción en cadena de polimerasa (PCR). En el caso de una polimerasa termoestable, la actividad enzimática significa la catálisis de la combinación de los nucleótidos de una manera adecuada para obtener productos de extensión del cebador que sean complementarios de una hebra de ácido nucleico del molde.

Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización del ácido nucleico dependerán p.ej. de la concentración de la sal tampón y de la composición y de la longitud de los ácidos nucleicos que se van a desnaturalizar, pero se sitúa por lo general entre 90ºC y 105ºC, con preferencia entre 90ºC y 100ºC, durante un período de tiempo que dependerá principalmente de la temperatura y de la longitud del ácido nucleico y está comprendido en general entre unos pocos segundos y cuatro minutos.

El término "no convencional" o "modificado" aplicado a una base de ácido nucleico, a un trifosfato de nucleósido o a un nucleótido indica la modificación, las derivaciones o los análogos de bases convencionales o de nucleótidos que están presentes de forma natural en el ADN. Más en concreto, cuando se utilizan en la presente, los nucleótidos no convencionales están modificados en la posición 2' del azúcar ribosa a diferencia de los dNTP convencionales. Por lo tanto, aunque para el RNA los nucleótidos naturalmente presentes son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, denominados en general rNTP), dado que estos nucleótidos tienen un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar, que en cambio está ausente de los dNTP, tal como se utiliza en la presente, los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales. Los análogos de ribonucleótidos que llevan sustituyentes en la posición 2', por ejemplo los análogos sustituidos por flúor o por amino en la posición 2', están contemplados dentro del alcance de la presente invención. Además, los análogos de ribonucleótidos pueden modificarse en la posición 3', por ejemplo sustituyendo el grupo hidroxilo normal por un grupo hidrógeno (3'-desoxi), proporcionando un terminador análogo de ribonucleótido. Estos nucleótidos están también incluidos dentro del alcance del término "nucleótidos no convencionales".

Dado que el ADN está compuesto convencionalmente por los dNTP, la incorporación de un rNTP puede ser no convencional y por ello un rNTP puede ser una base no convencional. Por consiguiente, en una forma preferida de ejecución de la invención, para los métodos de extensión de cebador de ADN incluidos los métodos de secuenciación de ADN, los productos de ácidos nucleicos contendrán nucleótidos tanto convencionales como no convencionales, y contendrán de forma predominante nucleótidos convencionales que son dNTP.

Las bases no convencionales pueden estar marcadas con marcadores fluorescentes, por ejemplo la fluoresceína o la rodamina; con marcadores no fluorescentes, por ejemplo la biotina; con isótopos, por ejemplo con P^{32}, P^{33} o S^{35}; o estar sin marcar.

Con el fin de facilitar todavía más la comprensión de la invención, las enzimas polimerasas de ADN termoestables específicas se mencionan a lo largo de toda la descripción para ilustrar (ejemplificar) la invención; sin embargo, estas referencias no pretenden limitar en modo alguno el alcance de la invención. En una forma preferida de ejecución, las enzimas termoestables de la invención se utilizan en un gran número de métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, pero las nuevas polimerasas termoestables descritas en la presente pueden utilizarse para cualquier finalidad en la que sea necesaria o deseable una actividad enzimática de este tipo. La enzima puede utilizarse también en reacciones de amplificación, por ejemplo en la PCR.

Las polimerasas termoestables de la invención se caracterizan porque cada una de ellas contiene el motivo crítico SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO: 1), en el que el "Xaa" de la posición 4 de esta secuencia es cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile). Los genes que codifican a las polimerasas termoestables, que tengan un resto ácido glutámico en la posición 4 de dicho motivo, pueden modificarse del modo descrito en la presente para obtener enzimas polimerasas modificadas oportunamente. Dichas enzimas polimerasas termoestables modificadas se caracterizan, con respecto a las enzimas nativas o de tipo salvaje, porque tienen una modificación en el motivo de la secuencia de aminoácidos SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en el que el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile), es decir, dicho motivo se ha modificado reemplazando el resto ácido glutámico de la posición 4 por otro resto aminoácido. El motivo crítico de una polimerasa de ADN termoestable proporcionado por la presente invención se indica a continuación empleando el código de aminoácidos de tres letras convencional (Lehninger, Biochemistry, Nueva York, Nueva York, editorial Worth Publishers Inc., 1970, página 67).

SEQ ID NO: 1

\hskip2.5cm

SerGlnIleXaaLeuArgXaa,

en el que el "Xaa" de la posición 4 es cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile).

Tanto los genes que codifican las secuencias como las proteínas que contienen esta secuencia crítica de aminoácidos, en la que el Xaa de la posición 4 no es un resto ácido glutámico (Glu), proporcionan una polimerasa que tiene una discriminación disminuida con respecto a los rNTP, y están comprendidos dentro del alcance de la invención. Dentro del motivo crítico se puede realizar modificaciones adicionales en lo tocante a otros restos aminoácidos de este motivo crítico, con preferencia en lo tocante a un resto aminoácido elegido entre el conjunto formado por la glutamina (Gln o Q), la leucina (Leu o L) y la arginina (Arg o R).

La presente invención es idónea para la obtención de enzimas polimerasas de ADN termoestables con propiedades ventajosas mediante la modificación especial de la secuencia del gen que codifica a una polimerasa termoestable de ADN. En una forma preferida de ejecución de la invención, la secuencia del gen y la enzima codificada se derivan de una especie del género Thermus, aunque se incluyen también dentro del alcance de la invención otras eubacterias no Thermus, como se describe a continuación con mayor detalle. De manera similar, en vista de la naturaleza altamente conservada del motivo crítico que ahora se ha identificado, las nuevas polimerasas termoestables de ADN pueden identificarse basándose en su homología con la Taq polimerasa, por ejemplo. Tales polimerasas termoestables están dentro del alcance de la presente invención, en el supuesto de que su secuencia de aminoácidos contenga el motivo S Q I X L R V/I, en el que X es un resto aminoácido, pero no el resto ácido glutámico, y dicha secuencia de aminoácidos posee una homología global (identidad de secuencia) por lo menos del 39%, con preferencia por lo menos del 60% y con preferencia especial por lo menos del 80%, cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la Taq polimerasa nativa. La secuencia de longitud completa de dicha Taq polimerasa se describe en el documento WO 89/06691 y puede accederse a ella con el número de adquisición P90556 del banco de datos de secuencias patentadas GENESEQ o con el número de adquisición M26480 del banco de datos de secuencias EMBL y con el número de adquisición A33530 del banco de datos de secuencias PIR.

Son ejemplos de polimerasas termoestables de ADN de la presente invención los derivados recombinantes de las polimerasas nativas de los organismos que figuran en la lista de la siguiente tabla 1. En la tabla 1 se recogen las secuencias particulares del motivo crítico y la posición del resto X en cada una de estas polimerasas nativas. Dado que cada una de las polimerasas de ADN termoestables es única, la posición de los aminoácidos del motivo crítico es distinta en cada una de las enzimas. En las polimerasas que figuran en la siguiente lista, el resto aminoácido de la posición X del motivo crítico S Q I X L R V/I es el ácido glutámico. Las polimerasas preferidas de la presente invención tienen un peso molecular comprendido entre 85.000 y 105.000, con mayor preferencia entre 90.000 y 95.000. La secuencia de aminoácidos de estas polimerasas consta de 750 a 950 restos de aminoácidos, con preferencia entre 800 y 850 restos de aminoácidos. Las polimerasas de la presente invención pueden constar además de 540 aminoácidos o más y consta por lo menos del dominio polimerasa y una porción que corresponde al dominio exonucleasa de 3' a 5' (la polimerasa resultante puede tener la actividad de exonucleasa de 3' a 5' o no) y posiblemente partes del dominio de exonucleasa de 5' a 3', que está contenido dentro del primer tercio de la secuencia de aminoácidos de muchas enzimas polimerasas termoestables de longitud completa.

Para las polimerasas termoestables de ADN que no figuran en la tabla 1, la identificación del ácido glutámico apropiado para la modificación es simple después de que se haya identificado el motivo crítico o el motivo de consenso de la secuencia de aminoácidos.

Con independencia de la posición exacta dentro de la polimerasa de ADN termoestable, la sustitución del resto ácido glutámico (Glu) por otro resto aminoácido dentro del motivo de secuencia SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en la que el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile), del dominio de polimerasa, sirve para obtener polimerasas termoestables que tienen la capacidad de incorporar eficazmente nucleótidos no convencionales. En una forma preferida de ejecución, el ácido glutámico se sustituye por un aminoácido que tenga un grupo polar R no cargado, por ejemplo la glicina, la serina, la cisteína, la treonina o un aminoácido que tenga un grupo R no polar pequeño, p.ej. la alanina. En la forma de ejecución más preferida se sustituye el ácido glutámico por un resto glicina (G). Los programas de alineamiento de aminoácidos y de secuencias de aminoácidos se pueden obtener fácilmente del Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Dado el motivo particular identificado en la presente, estos programas, incluidos por ejemplo el "GAP", el "BESTFIT" y el "PILEUP", sirven para asistir la identificación de la región exacta de la secuencia que se tiene que modificar.

Tal como se desprende de la siguiente tabla 1, existen esencialmente dos formas de motivo de secuencia conservada SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2) dentro del dominio de polimerasa de las enzimas polimerasas de ADN termoestables de organismos termófilos. El motivo de secuencia SerGlnIleGluLeuArgVal (SEQ ID NO: 3) está presente en las polimerasas termoestables nativas de la especie Thermus, p.ej. del Thermus aquaticus, del Thermus caldophilus, del Thermus thermophilus, del Thermus flavus y del Thermus filiformis así como en las especies Thermus sps17 y Z05. El motivo de secuencia SerGlnIleGluLeuArgVal (SEQ ID NO: 3) está presente también en el dominio polimerasa de otras enzimas polimerasas de ADN termoestables, p.ej. del Thermosipho africanus y de varias cepas de Bacillus, por ejemplo el Bacillus caldotenax y el Bacillus stearothermophilus. El motivo de secuencia SerGlnIleGlu
LeuArgIle (SEQ ID NO: 4) está presente p.ej. en las polimerasas termoestables nativas de la Thermotoga maritima, de la Thermotoga neapolitana y del Anaerocellum thermophilum.

TABLA 1

1

La secuencia completa de ácido nucleico y de aminoácidos de cada una de las polimerasas Taq, Tth, Z05, sps17, Tma y Taf se ha publicado en la patente US-5 466 591 que se incorpora a la presente como referencia. Las secuencias de las polimerasas de ADN de la Tca, Tfl, Tne, Ath, Bca y Bst se han publicado en las fuentes siguientes: la Tca en el banco de datos de secuencias EMBL con el número de adquisición U62584 (ver también Kwon, Mol. Cells 7(2), 264-271, 1997); la Tfl en Akhmetzjanov y Vakhitov, Nucleic Acids Research 20(21), 5839, 1992; la Tne en WO 97/09451 y WO 96/41014; la Ath en el banco de datos de secuencias EMBL con el número de adquisición X98575 (para más detalles de la cepa Ath, ver Rainey y col., J. Bacteriol. 175(15), 2772-2779, 1993; la Bst en Uemori y col, J. Biochem. 113, 401-410, 1993, y en el banco de datos de secuencias EMBL con el número de adquisición U23149 (ver también Phang y col., Gene 163, 65-68, 1995). Las secuencias de aminoácidos de la polimerasa Bst que contienen una E en la posición 658 del motivo crítico se facilitan también en la publicación de patente japonesa JP 05/304 964A, en la publicación de patente europea nº EP-A 699 760 y en Alliota y col., Genet. Anal. 12, 185-195, 1996; la secuencia está disponible también en el banco de datos de secuencias EMBL con el número de adquisición U33536. La secuencia publicada en Gene 163, 65-68, 1995, contiene la "E" en número de resto 661 del motivo crítico. La Bca en Uemori y col., J. Biochem. 113, 401-410, 1993 y en el banco de datos de secuencias EMBL con el número de adquisición D12982. La polimerasa de ADN termoestable del Thermus filiformis (ver FEMS Microbiol. Lett. 22, 149-153, 1994; también disponible del depósito nº 43280 de la ATCC) puede recuperarse aplicando los métodos descritos en la patente US-4 889 818 así como en base a la información de secuencia presentada en la tabla 1. Cada una de las secuencias y publicaciones anteriores se incorporan a la presente como referencias. La homología de secuencias (identidad de secuencias) entre la secuencia de aminoácidos de la forma nativa de polimerasa del Taq facilitada por el documento WO 89/06691 y la polimerasa del Tfl recién mencionada es del 87,4%. La homología correspondiente con respecto a la polimerasa del Tth es del 87,4%, con respecto a la polimerasa Tca es del 86,6%, con respecto a la polimerasa del Bst (número de adquisición U23149) es del 42,0%, con respecto a la polimerasa del Bca es del 42,6% y con respecto a la polimerasa del Ath es del 39,7%.

Tal como se observa en la tabla 1, el motivo crítico se conserva sustancialmente entre las polimerasas de ADN termoestables. Cuando X es un resto de ácido glutámico, la alteración del gen codificador de la polimerasa proporciona la enzima de la invención que incorpora rápidamente los rNTP si se compara, por ejemplo, con la polimerasa de Taq, cuyo motivo crítico no se haya modificado. La invención se refiere, pues, a un grupo de enzimas que incluye por ejemplo la polimerasa de ADN termoestable y los genes y vectores de expresión correspondientes del Thermus oshimai (Williams y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 46(2), 403-408, 1996); Thermus silvanus y Thermus chliarophilus (Tenreiro y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 45(4), 633-639, 1995); Thermus scotoductus (Tenreiro y col., Res. Microbiol. 146(4), 315-324, 1995); Thermus brockianus (Munster, Gen. Microbiol. 132, 1677, 1986) y Thermus ruber (Loginov y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 34, 498-499, 1984; también disponible del depósito nº 35948 de la ATCC). La invención incluye además por ejemplo las formas modificadas de las polimerasas de ADN termoestables y los genes y vectores de expresión correspondientes de la Thermotoga elfii (Ravot y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 312, 1995; también disponible del depósito nº 9442 de DSM) y de la Thermotoga thermarum (Windberger y col., Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 327, 1992; también disponible del depósito nº 5069 de DSM). Cada una de las secuencias y publicaciones anteriores se incorporan a la presente como referencias.

En una forma de ejecución preferida de la invención, el motivo crítico a modificar está dentro de la secuencia de aminoácidos LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 5). Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a la generación de mutantes de polimerasas de ADN termoestables que desplieguen una eficacia muy mejorada para la incorporación de nucleótidos no convencionales de un modo dependiente del molde. En una forma de ejecución especialmente preferida, la secuencia de la polimerasa contiene LeuAspTyrSerGlnIleGlyLeuArgValLeu
AlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 6). Tales polimerasas termoestables de ADN son especialmente indicadas para procesos como la secuenciación de ADN, la síntesis de RNA dirigida por ADN y la síntesis "in vitro" de ADN sustituido por rNTP.

La producción de polimerasas de ADN termoestables con mayor eficacia de incorporación de bases no convencionales puede llevarse a cabo mediante procesos como son la mutagénesis dirigida a un sitio. Véase por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, editorial Cold Spring Harbor, 1989, segunda edición, capítulo 15.51, "Oligonucleotide Mediated Mutagenesis", que se incorpora a la presente como referencia. Por ejemplo, la mutación de A en G en la segunda posición del ácido glutámico de la posición 615 que codifica al codón de la secuencia del gen de polimerasa de ADN del Thermus aquaticus (Taq) (ver SEQ ID NO: 7) se traduce en aumentar 500 veces mayor la eficacia de incorporación de nucleótidos no convencionales, ya definida, al tiempo que se conserva la capacidad de la enzima para medir la PCR en presencia de nucleótidos convencionales, es decir, los dNTP. En la polimerasa de ADN de Taq, esta mutación concreta se traduce en un cambio de aminoácidos, el E (ácido glutámico) se sustituye por la G (glicina). Aunque este cambio de aminoácido concreto altera de modo significativo la capacidad de la enzima por incorporar nucleótidos no convencionales, se espera que la sustitución del resto ácido glutámico por cualquier otro resto aminoácido, p.ej. un resto serina, cisteína, treonina, alanina, valina o leucina, tenga el mismo efecto. Otras sustituciones de aminoácido que consisten en reemplazar el E615 están comprendidas por tanto dentro del alcance de la invención, siendo una forma preferida de ejecución la E615G. Un aspecto crítico de la invención consiste, pues, en que el cuatro resto aminoácido del motivo de la SEQ ID NO: 1 no sea un resto de ácido glutámico.

La mutagénesis dirigida a un sitio puede llevarse a cabo mediante mutagénesis dirigidas a un sitio mediante un cebador específico. Esta técnica ya es estándar en la técnica y se realiza empleando un cebador oligonucleótido sintético, complementario de un fago de ADN de hebra simple que quiere mutagenizarse excepto en un desapareamiento limitado que representa la mutación deseada. Resumiendo, el oligonucleótido sintético se utiliza en forma de cebador para la síntesis directa de una hebra complementaria del plásmido o fago y el ADN de doble hebra resultante se transforma en una bacteria hospedante que soporta un fago. Las bacterias resultantes pueden ensayarse, por ejemplo, mediante análisis de secuencia de ADN o hibridación de sonda para identificar aquellas calvas que llevan la secuencia deseada de gen mutado. Como alternativa pueden emplearse los métodos de "PCR recombinante" descritos en el manual PCR Protocols, San Diego, editorial Academic Press, Innis y col. (coord.), 1990, capítulo 22, que lleva el título "Recombinant PCR", páginas 177-183, cuyo autor es Higuchi.

Tal como se indica en la tabla 1, el ácido glutámico del motivo crítico de la polimerasa del Taq se conserva en otras polimerasas termoestables de ADN, pero puede ubicarse en una posición diferente aunque cercana de la secuencia de aminoácidos. La mutación del ácido glutámico conservado en la SEQ ID NO: 2 de las polimerasas de ADN termoestables de la especie Thermus y de las polimerasas de ADN de las especies afines Thermotoga, Thermosipho y Anaerocellum tendrá un efecto mejorador similar en la capacidad de la polimerasa por incorporar con eficacia los nucleótidos no convencionales si se compara con la polimerasa de Taq que contiene la SEQ ID NO: 2. Las mutaciones del resto ácido glutámico del motivo crítico en otras polimerasas de ADN termoestables puede llevarse a cabo aplicando los principios y técnicos utilizados para la mutagénesis dirigida a un sitio. Existen diversas variantes de secuencia de la polimerasa del ADN del Bacillus stearothermophilus registradas en las bases de datos del GeneBank o Swiss Prot/PIR. Estas secuencias son muy afines, pero algo diferentes entre sí, aunque cada una de ellas contiene la secuencia idéntica del motivo crítico SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en la que el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile), aunque en posiciones diferentes de la secuencia.

En base a la información de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos disponibles al público, referente a polimerasas de ADN termoestables descritas en la presente, es posible además con metodologías recombinantes convencionales construir polimerasas quiméricas que están compuestas por dominios derivados de diferentes polimerasas de ADN termoestables. En las patentes US-5 466 591 y US-5 374 553 se describen métodos para el intercambio de varios segmentos funcionales de polimerasas termoestables, por ejemplo el dominio de exonucleasa de 5' a 3', el dominio de exonucleasa de 3' a 5' y el dominio de polimerasa, para obtener las nuevas enzimas. Las enzimas polimerasas termoestables quiméricas preferidas contienen un dominio de exonucleasa de 5' a 3', un dominio de exonucleasa de 3' a 5' y un dominio de polimerasa, en los que un dominio se deriva de una polimerasa diferente y en las que el dominio de polimerasa contiene la secuencia del motivo crítico SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO: 1), en la que el "Xaa" de la posición 4 de esta secuencia es cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile). Son ejemplos de tales moléculas quiméricas las enzimas quiméricas de Taq/Tma que están compuestas del modo especificado en la tabla 2. Tal como se indica en esta tabla, el dominio polimerasa de estas enzimas quiméricas de Taq/Tam contiene la mutación del motivo crítico especificado anteriormente.

TABLA 2

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(aa. = aminoácidos)

2

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El plásmido pC1 se ha depositado con arreglo al Tratado de Budapest en la ATCC con fecha de 17 de julio de 1996 y se le ha dado en número de adquisición 98107. El plásmido pC1 contiene un gen que codifica una polimerasa de ADN termoestable que está mutado en el codón que codifica al resto ácido glutámico de la posición 615 de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa del Taq nativo, resultando de ello una forma mutada de la polimerasa del Taq que tiene un resto glicina en la posición 615 (polimerasa del Taq mutada E615G que tiene la secuencia SEQ ID NO: 8). Este depósito proporciona medios alternativos de obtener una polimerasa de ADN termoestable que tengan una mejor eficacia para incorporar análogos de nucleótido no convencionales. El ejemplo I ilustra el uso de sitios de restricción flanqueadores, idóneos para subclonar la mutación E615G para crear otras enzimas polimerasas de ADN termoestables. Debido a que ya se conocen las secuencias completas de genes de numerosas polimerasas termoestables de ADN, los expertos en la materia disponen fácilmente de otros medios para introducir una mutación en el codón que codifica al E615, por ejemplo mediante una digestión de restricción o una sustitución de fragmento o bien por mutagénesis "in vitro" específica de un sitio, basándose en la información de secuencia del motivo crítico que se facilita en la presente.

El gen o fragmento de gen modificado preparado por mutagénesis específica de un sitio puede recuperarse del plásmido o fago por métodos convencionales y ligarse a un vector de expresión para el posterior cultivo y purificación de la enzima resultante. Para la práctica de la invención son idóneos numerosos vectores de clonación y de expresión, incluidos los sistemas bacterianos y de mamíferos, que se describen por ejemplo en el manual de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, 1989. Por conveniencia, la presente invención se ejemplifica empleando el promotor PL derivado de lambda (Shimatake y col., Nature 292, 128, 1981). El uso de este promotor se describe específicamente en las patentes US-4 711 845 y US-5 079 352.

Las polimerasas termoestables de ADN de la presente invención se purifica por lo general a partir de microorganismos del tipo E. coli, que se han transformado con un vector de expresión unido operativamente a un gen que codifica la polimerasa de ADN termoestable de tipo salvaje o modificada. Un ejemplo de microorganismo hospedante idóneo es la cepa de E. coli DG116, descrita por Lawyer y col., PCR Methods and Applications 2, 275-287, 1993, dicha cepa está disponible además en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de adquisición ATCC 53601. Los métodos de purificación de polimerasas termoestables se describen por ejemplo en Lawyer y col., PCR Methods and Applications 2, 275-287, 1993.

Los expertos en la materia habrán observado que las polimerasas termoestables de ADN anteriores, provistas de una mayor eficacia para incorporar nucleótidos no convencionales, pueden obtenerse muy fácilmente empleando métodos de la tecnología del ADN recombinante. Si uno desea obtener una de las enzimas de la presente invención o un derivado o un homólogo de dichas enzimas, la obtención de una forma recombinante de la enzima implica por lo general la construcción de un vector de expresión, la transformación de la célula hospedante en vector y el cultivo de la célula hospedante transformada en condiciones favorables para que pueda efectuarse la expresión. Los métodos para la obtención de vectores de expresión, la transformación y el cultivo de las células hospedantes cultivadas ya son conocidas en la técnica y se describen con detalle por ejemplo en Sambrook y col., 1989, lugar ya citado.

La presente invención proporciona polimerasas de ADN termoestables, idóneas para utilizar con trifosfatos de ribonucleósidos para muchas aplicaciones, incluidos los métodos de amplificación y detección de ácidos nucleicos, la secuenciación de ADN. El uso de ribonucleótidos en la secuenciación permite evitar el coste elevado de los análogos terminadores de cadena, por ejemplo los ddNTP y, hecho muy importante, facilita la obtención de nuevos productos de amplificación, idóneos no solo para los análisis de secuencia de ADN, sino también para otros tipos de análisis, por ejemplo la electroforesis y la hibridación, sin necesidad de llevar a cabo las posteriores reacciones de secuenciación del ADN.

Se ha observado que la pirofosfatasa amplía los resultados de secuenciación, empleando tanto polimerasas mesofílicas como polimerasas de ADN termoestables, para ello se disminuye el grado de pirofosforolisis a medida que se acumulan los productos de extensión. Está claro que los métodos de secuenciación cíclicos de la técnica anterior requieren la inclusión de enzimas adicionales en la reacción de secuenciación. Sin embargo, un aspecto muy útil y ventajoso de la presente invención consiste en que la pirofosfatasa no se requiere para la secuenciación del ADN. Por ello, el uso de las nuevas enzimas facilitadas en la presente elimina la necesidad de gastos adicionales ocasionados por la adición de una segunda enzima a la mezcla reaccionante de secuenciación.

Empleando las enzimas de la presente invención se combinan las reacciones de amplificación y secuenciación, lo cual se traduce en un ahorro de tiempo y materiales, aparte de que simplifica el análisis en su conjunto. Estas ventajas y otras se derivan primariamente del hecho de que la incorporación tanto de nucleótidos convencionales como de ribonucleótidos y análogos de ribonucleótidos al producto de extensión de cebador proporciona una hebra quimérica de ARN/ADN que es susceptible de hidrolizar el ARN. El tratamiento no afecta el esqueleto del ADN y proporciona una población de fragmentos de ácido nucleico, cada uno de los cuales termina en la posición en la que se ha insertado un ribonucleótido en lugar del dNTP correspondiente. La hidrólisis se lleva a cabo fácilmente por diversos métodos, incluido el tratamiento con álcali (es decir, el tratamiento con NaOH, p.ej. en una concentración final de 0,2 M, como se indica en el siguiente ejemplo VI), con calor o con enzimas del tipo RNasa (Vogel y col., coordinadores, Informational Macromolecular, Academic Press, Nueva York, 1963, capítulo escrito por Berg y col., titulado "The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonucleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E. coli", páginas 467-483).

En una forma preferida de ejecución, la presente invención proporciona composiciones nuevas y mejoradas, especialmente útiles para los métodos de secuenciación del ADN. Las nuevas enzimas descritas en la presente son ventajosas para los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos, empleando ya sea terminadores-colorantes, ya sea cebadores-colorantes, así como otros métodos de secuenciación. Tal como se ha dicho anteriormente, los métodos de terminación de cadena requieren por lo general la extensión del cebador dependiente del molde en presencia de nucleótidos terminadores de cadena, obteniéndose una distribución de fragmentos parciales que posteriormente se separan por tamaños. La secuenciación didesoxi estándar utiliza trifosfatos de didesoxinucleósidos para la terminación de la cadena y una polimerasa de ADN, por ejemplo el fragmento Klenow de la E. coli Pol I (ver Sanger y col., lugar citado).

El procedimiento básico de secuenciación didesoxi básico consiste, pues, de (i) fusionar un cebador oligonucleótido a un molde; (ii) extender el cebador con una polimerasa de ADN en cuatro reacciones separadas, cada una de ellas contiene un nucleótido marcado, o un cebador marcado, una mezcla de dNTP no marcados y un ddNTP terminador de cadena; (iii) resolver los cuatro conjuntos de productos de las reacciones mediante por ejemplo electroforesis desnaturalizante de alta resolución a través de gel de poliacrilamida/urea, separación capilar u otros métodos de resolución; (iv) producir una imagen autorradiográfica del gel que pueda examinarse para inferir la secuencia. Como alternativa, para derivar la información de la secuencia del ADN pueden utilizarse métodos de espectrometría de masas o métodos basados en la hibridación, empleando cebadores o nucleótidos marcados con compuestos fluorescentes.

La disponibilidad de las polimerasas termorresistentes, por ejemplo la polimerasa del Taq, permite trabajar con métodos mejorados de secuenciación (ver la patente US-5 075 216) y modificaciones de los mismos que se llaman "secuenciación cíclica". En la secuenciación cíclica se repiten ciclos de calentamiento y enfriamiento que permiten la generación de numerosos productos de extensión a partir de cada molécula diana (Murray, Nucleic Acid Research 17, 8889, 1989). Esta amplificación asimétrica de secuencias diana complementarias de la secuencia del molde en presencia de terminadores de cadena didesoxi permite obtener una familia de grupos de extensión de todas las longitudes posibles.

Después de la desnaturalización del producto de la reacción de extensión del molde de ADN se producen ciclos múltiples de fusión del cebador y extensión del cebador en presencia de los terminadores didesoxi. Las polimerasas de ADN termoestables tienen diversas ventajas en la secuenciación cíclica: toleran las temperaturas de fusión astringente que se requieren para la hibridación específica del cebador con los ácidos nucleicos diana y toleran además los múltiples ciclos de desnaturalización a temperatura elevada, que se realiza en cada ciclo, es decir: 90-95ºC. Por esta razón se han incluido varias formas de la polimerasa de ADN AmpliTaq® en los kits de secuenciación cíclica del Taq, comercializados por la empresa Perkin Elmer, de Norwalk, CT.

Con todo, la propiedad de la polimerasa de ADN del Taq de discriminar contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, por ejemplo los ddNTP, plantea un problema cuando se utiliza en la secuenciación cíclica, en la que los ddNTP o los ddNTP marcados con compuestos fluorescentes tienen que incorporarse en calidad de terminadores de cadena. Por lo general, antes de la presente invención, la secuenciación del ADN con polimerasas de ADN termoestables requería una mezcla de nucleótidos terminadores de cadena, por lo general didesoxinucleótidos, en concentraciones elevadas para asegurar que se generaría una población de productos de extensión, en la que estarían representadas todas las longitudes posibles de fragmentos a lo largo de un tramo de varios centenares de bases. A menudo ocurría que para cubrir el capítulo de los costes se recurría a métodos con concentraciones muy bajas de los dNTP convencionales, por ello las reacciones resultaban ineficaces. Estas mezclas reaccionantes que tienen un baja concentración de dNTP y una alta concentración de ddNTP crean un entorno en el que la polimerasa termoestable está esencialmente desprovista de sustratos nucleótidos.

Incluso con la llegada de las enzimas modificadas, por ejemplo la polimerasa FS de ADN llamada AmpliTaq® que permite aumentar la concentración de los dNTP hasta niveles más óptimos, las enzimas anteriores siguen basándose en la presencia de los caros ddNTP para la secuenciación del ADN. En cambio, la presente invención proporciona enzimas que no solo permiten aumentar la concentración de los dNTP, sino que evitan el uso de los caros ddNTP, empleando en su lugar los rNTP para la incorporación a la hebra en crecimiento. La capacidad de las nuevas enzimas para realizar con eficacia una sustitución parcial de ribonucleótidos facilita la generación de escaleras de secuenciación de ADN omitiendo una reacción separada de incorporación de un nucleótido terminador.

La elección de análogos de nucleótido no convencionales, idóneos para el uso en métodos de secuenciación de ADN venía dictada previamente por la capacidad de la polimerasa de ADN termoestable de incorporar dichos análogos. Es una pena que dichos análogos de nucleótido sean bastante caros. Por ejemplo, los costes de los ddNTP son aproximadamente 25 veces mayores que el coste de los rNTP o de los dNTP. Dado que las polimerasas de ADN termoestables anteriores eran incapaces de incorporar con eficacia los rNTP de un modo dirigido por un molde a un hebra de ADN en crecimiento, dichos ribonucleótidos que son fácilmente asequibles y baratos no constituyen una opción válida para la secuenciación del ADN con una polimerasa de ADN termoestable. La presente invención elimina la necesidad de los ddNTP en las reacciones de secuenciación de ADN. La presente invención proporciona, pues, en un primer aspecto métodos para los análisis de secuenciación de ADN que son significativamente menos costosos que los métodos de terminación de cadena de la técnica anterior.

La presencia de manganeso en la reacción de extensión del cebador puede influir en la capacidad de una polimerasa para insertar con precisión el nucleótido de bases apareadas correctamente. El manganeso puede utilizarse para forzar el apareamiento incorrecto de las bases o para facilitar la discriminación contra la inserción de un análogo de nucleótido. Los investigadores han utilizado el manganeso para inducir la mutagénesis en procedimientos de replicación o de amplificación del ADN. Por lo tanto, el manganeso puede afectar la fidelidad de una reacción de polimerización así como el rendimiento de una reacción. La secuencia resultante puede ser incorrecta o bien, en un método de secuenciación de ADN, la información resultante puede ser ambigua. Los métodos presentes no requieren la inclusión del manganeso en calidad de catión divalente en la mezcla de la reacción de secuenciación para forzar a la polimerasa a que inserte un nucleótido no convencional. A diferencia de las polimerasas de ADN anteriores, la presente invención identifica el motivo crítico dentro del dominio de la polimerasa para controlar la capacidad de las enzimas de discriminar entre nucleótidos sustituidos en 2' y no sustituidos, sin necesidad de manganeso.

Para la secuenciación, las enzimas de la presente invención no necesitan concentraciones altas de análogos de bases no convencionales. Antes de la presente invención, los análogos de bases no convencionales y las correspondientes bases convencionales estaban presentes en una proporción (p.ej. ddATP:dATP) comprendida aproximadamente entre 1,3:1 y 24:1 para los métodos de secuenciación de ADN con terminación de cadena (véase además la patente
US-5 075 216 de Innis y col.). En cambio, las polimerasas termoestables proporcionadas por la presente invención permiten una reducción de la proporción entre análogos de bases no convencionales y las bases convencionales de cien a varios millares de veces. Para el análisis de secuencia de ADN es suficiente una proporción rNTP:dNTP de 1:1 o menos, en combinación con las nuevas enzimas proporcionadas en la presente. En una forma preferida de ejecución de la invención, la proporción rNTP:dNTP se reduce a menos de 1:8. La proporción entre el nucleótido sustituidos en 2' y el dNTP natural correspondiente puede ser muy baja, del orden de 1:80 ó 1:200, en función del diseño experimental concreto y de la longitud deseada de los fragmentos.

Por lo tanto, dado que las enzimas presentes incorporan fácilmente los nucleótidos no convencionales, por ejemplo los nucleótidos sustituidos en 2', no es necesario forzar la incorporación del rNTP empleando una concentración elevada de rNTP y una concentración limitante del dNTP correspondiente. Por consiguiente, los métodos presentes permite el uso de concentraciones óptimas de los dNTP en combinación con cantidades bajas de los rNTP.

Cuando en un método adecuado de secuenciación, como pueda ser la secuenciación de cebador-colorante, se emplean las enzimas polimerasas modificadas según la presente invención, se obtienen buenos resultados de secuenciación de ADN con una concentración de dNTP comprendida entre 50 y 500 \muM de cada dNTP. La concentración de dNTP se sitúa con preferencia entre 100 y 300 \muM. En estos intervalos, el rNTP correspondiente puede estar presente en la misma concentración que el dNTP o menos. El rNTP está presente con preferencia en una concentración de 0,1 \muM a 100 \muM y está presente con mayor preferencia en una concentración de 2,5 a 25 \muM.

Los expertos en la materia podrán determinar fácilmente la concentración de los rNTP idóneos para el uso con las enzimas modificadas presentes por valoración y con pruebas de optimización. La cantidad de rNTP o análogo requerida dependerá del tipo de ensayo y del tamaño y pureza de la diana, así como del tampón elegido y de la especie concreta de enzima.

La proporción de rNTP:dNTP determinará la frecuencia con que los rNTP se insertarán en el oligonucleótido en crecimiento. Dado que la hidrólisis se producirá en cada rNTP incorporado, la proporción de rNTP:dNTP puede ajustarse para que el usuario actúe con flexibilidad para aumentar o reducir el tamaño de los fragmentos resultantes.

Como se sabe, el ADN es un polímero sintetizado a partir de los dNTP. Cada trifosfato de desoxinucleósido consta de un azúcar ribosa que contiene un grupo hidroxilo en la posición 3' y un hidrógeno en la posición 2'. Los ribonucleósidos contienen además un grupo hidroxilo en la posición 3' del azúcar. Sin embargo, los rNTP se distinguen de los dNTP en la posición 2' del azúcar, en la que un segundo grupo hidroxilo reemplaza al átomo de hidrógeno. En el contexto presente, los rNTP ilustran la capacidad de las enzimas de la presente invención para incorporar con precisión nucleótidos sustituidos en 2'. Sin embargo, los compuestos de la invención no se limitan al uso de nucleótidos no convencionales que sean ribonucleótidos. La modificación de la secuencia de polimerasa termoestable en el dominio crítico identificado en la presente permite la incorporación, dirigida por el molde, de nucleótidos alternativos sustituidos en 2', por ejemplo los 2'-hidroxi-3-desoxi-nucleótidos y los fluor- o amino-nucleótidos sustituidos en la posición 2'.

Tal como se describe en los ejemplos de la presente, la incorporación de 3-desoxi-2-hidroxi-ATP, que aquí se denominan trifosfato de cordicepina, se facilita con la presencia de una segunda mutación en la polimerasa termoestable, la cual reduce la discriminación contra la incorporación de un nucleótido que contenga un desoxi en la posición 3' de la ribosa. Tales enzimas se han descrito previamente, por ejemplo en el documento EP-A-655 506. El depósito nº 69820 de la ATCC, registrado con fecha 10 de mayo de 1995 con arreglo al Tratado de Budapest, proporciona un gen que codifica una polimerasa de ADN termoestable modificada del Thermus aquaticus que tiene una discriminación reducida contra la incorporación de análogos, por ejemplo los ddNTP. Los didesoxinucleótidos tienen una posición 3' sustituida si se comparan con los dNTP convencionales. Por ello, en combinación con la presente invención, la doble mutación, ejemplificada con un mutante de polimerasa de Taq E615G, F667Y, proporciona medios para utilizar los análogos de nucleótidos que están sustituidos en las posiciones 3' y 2' de la ribosa, si se comparan con los dNTP (ver ejemplos III y V).

Una aplicación particular de la invención es un método de secuenciación de rNTP, en el que el cebador de secuenciación está marcado de modo detectable con un marcador (tag) fluorescente o radiactivo distinguible. A diferencia de los ddNTP, la incorporación de un rNTP sin modificar no produce un hecho de terminación de cadena. La reacción de secuenciación de ADN, que contiene tanto los rNTP como los dNTP en combinación con una enzima de la invención, genera una mezcla de productos de extensión sustituidos al azar, susceptible de rotura del enlace 3'-5'-fosfodiéster entre el ribonucleótido y el desoxiribonucleótido adyacente. Después de la extensión del cebador, por ejemplo en la amplificación por PCR o la secuenciación cíclica y antes de resolver los productos de extensión del cebador, por ejemplo mediante electroforesis a través de gel, se trata la mezcla reaccionante ya sea con álcali, calor, una ribonucleasa, ya sea con otros medios, para hidrolizar los productos de extensión en cada aparición de un ribonucleótido. Para cada producto marcado de extensión de cebador, en un gel de secuenciación solamente es detectable el fragmento 5' que es el producto intermedio de extensión del cebador marcado. Para una diana determinada, el análisis del gel de secuenciación resultante proporciona una escalera de secuenciación, es decir, series de señales identificables en los carriles G, A, T y C, correspondientes a la secuencia de ácido nucleico de la diana. La escalera de secuenciación resultante proporciona la misma información tanto si el método utiliza los ddNTP con métodos convencionales, como si utiliza los rNTP y las nuevas polimerasas termoestables descritas en la presente. Por lo tanto, utilizando la presente invención ya no hace falta recurrir a los ddNTP, que son caros, para la secuenciación del ADN (ver ejemplo VI).

En un método alternativo de secuenciación se emplean ribonucleótidos terminadores de cadena. En esta forma de ejecución de la invención se emplean como terminadores los 2-hidroxi-3-desoxi-nucleótidos, por ejemplo el trifosfato de cordicepina. Estos análogos de rNTP pueden marcarse con compuestos fluorescentes y utilizarse en la secuenciación del ADN. Lee y col. (lugar citado) han descrito el uso de los ddNTP de terminador-colorante. En el documento
EP-A-655 506 y en la patente US que lleva el número de serie 08/448 223, presentada con fecha 23 de mayo de 1995, se describen enzimas modificadas destinadas a usarse junto con los ddNTP. Una polimerasa de ADN termoestable que contenga tanto la modificación presente en el AmpliTaq®, polimerasa FS de ADN ver antes), y las especificadas en la SEQ ID NO: 1, en la que X no es ácido glutámico (E), ya descritas en la presente, puede utilizarse con eficacia para la incorporación eficaz de los análogos de rNTP marcados en la reacción de secuenciación con terminación de cadena. Este proceso puede automatizarse y no requiere la síntesis de cebadores marcados con colorante. Además, dado que las reacciones de terminador-colorante permiten la realización de cuatro reacciones en un mismo tubo, son más convenientes que los métodos de cebador-colorante. Los nucleótidos 2-hidroxi-3-desoxi pueden sintetizarse a partir de nucleótidos 3' que sean productos comerciales (por ejemplo los 3' dA, 3' dC, 3' dG y 3' dT, suministrados por la empresa Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) por adición de los trifosfatos 5' del modo descrito por Ludwig, Biophosphates and Their Synthesis, Structure, Metabolism and Activity, coordinadores: Bruzik y Stec, editorial Elsevier Science Publishers, Amsterdam 1987, páginas 201-204.

Además de la utilidad de las enzimas de la presente invención para los nuevos métodos de secuenciación, las enzimas modificadas descritas en la presente son útiles en un gran número de aplicaciones de biología molecular. En una forma de ejecución, la enzima modificada se utiliza en una mezcla de reacción de amplificación que contiene nucleótidos convencionales y no convencionales, por ejemplo los dNTP y por lo menos un rNTP marcado de modo detectable, los marcadores pueden ser por ejemplo marcadores fluorescentes o radioisótopos. La síntesis, dirigida por un molde, de una hebra complementaria proporciona un producto de ADN que contiene monofosfatos de ribonucleósidos en varias posiciones a lo largo de su longitud. El tratamiento con calor y/o con álcali hidroliza el producto de extensión del ácido nucleico en cada ribonucleótido. Por ello se proporciona una familia de segmentos de ADN en la que cada fragmento contiene un resto marcado en su extremo 3'. El tamaño de los fragmentos de ácido nucleico resultantes puede modificarse ajustando la proporción y la cantidad de rNTP incluido en la reacción.

La amplificación de una diana empleando los rNTP y las enzimas presentes aporta numerosas ventajas en función de cada aplicación concreta. En el método descrito antes en el que se emplea un rNTP marcado, la familia resultante contiene fragmentos que están todos marcados con igual intensidad: un marcador por cada fragmento de oligonucleótido. Los procedimientos, tales como la detección de ácido nucleico empleando un conjunto de sondas de oligonucleótido fijadas en un chip de silicona, requieren en su forma óptima que la diana amplificada se fragmente al azar dentro de un intervalo de tamaños fijo y reproducible para limitar la formación de estructuras secundarias para controlar la cinética de la hibridación. Además, para detectar la hibridación con un conjunto de miles de sondas sobre un chip, puede ser preferible que los fragmentos de ácido nucleico se marquen con igual intensidad. La presente invención proporciona un método de producción de familias de fragmentos que cumple esta norma y, de este modo, facilita el uso de formatos alternativos de detección, por ejemplo los métodos basados en chip descritos por ejemplo por Cronin y col., Human Mutation 7, 244-255, 1996.

En otra forma de ejecución, el uso de un cebador marcado y un cebador no marcado en una reacción de amplificación, que contenga una polimerasa termoestable de la invención y tanto los rNTP como los dNTP, proporciona un método para efectuar simultáneamente las reacciones de amplificación y de secuenciación. Este método requiere que se realicen cuatro reacciones separadas de amplificación, una para cada rNTP. Entonces, por ejemplo, dado que la enzima de la invención es idónea para la amplificación de la diana mediante, por ejemplo, una reacción PCR o por otros métodos de amplificación, el producto resultante, si está presente, puede detectarse por métodos convencionales, tales como la electroforesis a través de gel o la hibridación con sonda empleando una porción del producto de reacción. Estos métodos de detección no provocarán la hidrólisis de los ribonucleótidos incorporados y las hebras quiméricas de ARN/ADN se comportarán del modo esperado en un producto de amplificación de ácido nucleico convencional. Si se detecta un producto deseado, la porción restante de la misma mezcla de reacción puede tratarse con álcali y analizarse por electroforesis a través de gel con el fin de determinar la secuencia del ácido nucleico. Por ello, después de la detección del producto no hace falta efectuar una reacción posterior de secuenciación. Este procedimiento simplificado permite ahorrar tiempo y materiales y proporciona una mayor precisión al tiempo que suprime etapas: el producto detectado es el producto secuenciado.

Podría aplicarse también un procedimiento similar con cuatro rNTP marcados y un cebador biotinilado. Después de la amplificación se disgrega el producto con álcali y se separan los productos asociados al cebador por reacción con esferillas recubiertas de estreptavidina. Los productos capturados se analizan seguidamente a través de un gel de secuenciación. Esta modificación permite efectuar la reacción de secuenciación en un solo tubo, eliminando así la necesidad de cuatro amplificaciones separadas.

En otro aspecto de la invención, las enzimas descritas aquí son útiles para obtener ARN a partir de un molde de ADN o para obtener ADN sustituido para esterilización mediada por álcali, sin emplear los agentes esterilizantes convencionales, como son la uracil-N-glicosilasa (UNG), tal como se describe en la publicación de patente internacional WO 92/01814.

En otro aspecto de la invención, la polimerasa termoestable contiene además una mutación en el dominio de exonucleasa 5'-3' que sirve para atenuar en gran manera la actividad de esta exonucleasa. Las formas modificadas de la polimerasa de Taq se describen en la patente US-5 466 591. En una forma de ejecución de esta invención, el codón que codifica al resto glicina (G) de la posición 46 de aminoácido se ha reemplazado por un codón que codifica al ácido aspártico (D). La enzima resultante tiene una utilidad mejorada en las reacciones de secuenciación cíclica debido a una menor actividad de la exonucleasa 5'-3' y es un antecedente preferido para el uso con la presente invención. La secuencia de aminoácidos del dominio polimerasa y la actividad de la polimerasa no resultan afectados por la presencia del mutante (G46D) si se compara con la enzima de tipo salvaje.

En una forma comercial de ejecución de la invención, los kits para la secuenciación de ácido nucleico que contienen una polimerasa termoestable según la presente invención constituyen una forma de ejecución comercial de la invención. Dichos kits contienen de forma típica reactivos adicionales para la secuenciación del ADN, por ejemplo los rNTP, los dNTP y tampones adecuados. Si los rNTP no están marcados, entonces puede incluirse también un cebador marcado.

Los siguientes ejemplos se presentan a título meramente ilustrativo y en modo alguno se pretende limitar con ellos el alcance de la invención reivindicada.

Ejemplo I Expresión de un gen de polimerasa de Taq modificada que tiene una discriminación reducida con respecto a nucleótidos no convencionales

La porción de aminoácidos terminada en C de una polimerasa de ADN de Taq codifica el dominio del sitio activo de polimerasa (Lawyer y col., PCR Methods and Applications 2, 275-287, 1993, que se incorpora a la presente como referencia). Se aísla un fragmento de ADN que contiene esta región a partir de un gen de Taq de longitud completa y se mutageniza mediante una amplificación de PCR en presencia de manganeso (Leung y col., Technique 1(1), 11-15, 1989). Para este ejemplo, todas las enzimas de restricción se adquieren de New England Biolabs, Beverly, MA. Se digieren los fragmentos mutagenizados con PstI y BgIII y se clonan en un plásmido de expresión del Taq, en este caso el plásmido pLK102 que se ha digerido con PstI y BgIII. El plásmido pLK102 es una forma modificada del plásmido de expresión del Taq, el plásmido pSYC1578 (Lawyer y col., lugar citado). Se somete a deleción el fragmento HincII/EcoRV localizado en posición 3' de la región codificadora de polimerasa para crear el plásmido pLK101. A continuación se somete a deleción un fragmento PstI-BgIII de 898 pares de bases del pLK101 y se reemplaza por un dúplex corto de oligonucleótidos PstI-EcoRV-BgIII para crear el plásmido pLK102. De este modo, esta deleción elimina 900 pares de bases del extremo 3' del gen de la polimerasa de ADN de Taq y lo reemplaza por una pieza corta de ADN.

Se transforman los plásmidos de expresión resultantes a la cepa N1624 de E. coli (descrita por Gottesman, J. Mol. Biol. 77, 531, 1973; también disponible de la E. coli del Genetic Stock Center de la Universidad de Yale con el nº CGSC de cepa #5066) y se escanea la capacidad de los transformantes resultantes para incorporar con eficacia los rNTP, comparándolos con enzimas de tipo salvaje. Utilizando este procedimiento se identifica que el mutante C1 tiene capacidad para incorporar con mayor eficacia los rNTP.

Para determinar a qué porción del gen de la polimerasa de Taq puede atribuirse el fenotipo alterado se digiere el plásmido de expresión de Taq mutagenizado, llamado pC1, aislado a partir del mutante C1, con varias enzimas de restricción y se subclonan los fragmentos de restricción resultantes en el gen de polimerasa de ADN de Taq de tipo salvaje del pLK101, reemplazando los fragmentos de restricción no mutagenizados. El análisis de los subclones indica que la mutación que genera el fenotipo está contenido dentro de un fragmento de restricción de NheI a BamHI de 265 pares de bases.

Se realiza un análisis de secuencia de ADN en esta región del pC1 utilizando un kit llamado ABI PRISM^{a} Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit junto con AmpliTaq®, polimerasa FS de ADN, suministrada por Applied Biosystems, Foster City, CA, y un sistema de secuenciación de ADN modelo 373A de la empresa Applied Biosystems. El análisis de secuencia identifica dos mutaciones erróneas (missense) en el gen de la polimerasa del Taq entre los sitios NheI y BamHI. Una mutación de la posición de aminoácido 615 provoca la sustitución del resto ácido glutámico (E) por un resto glicina (G) y otra mutación en la posición 653 provoca la sustitución de un resto alanina (A) por un resto treonina (T). La numeración se empieza en el codón que codifica el primer resto de metionina de la proteína madura, igual que en la patente US-5 079 352. La mutación E615G se debe a un cambio de GAG por GGG en el codón 615. La mutación A635T se debe a un cambio de GCC por ACC en el codón 653. El plásmido C1 de la cepa N1624 hospedante de E. coli se ha depositado en la ATCC con fecha 17 de julio de 1996 con arreglo al Tratado de Budapest y ha recibido el número de adquisición 98107.

Se analizan por separado las dos mutaciones puntuales subclonando cada una de ellas por separado en un gen de polimerasa de Taq de tipo salvaje utilizando una reacción PCR recombinante (Innis y col., coordinadores, PCR Protocols, editorial Academic Press, San Diego 1990, capítulo 22, titulado "Recombinant PCR", cuyo autor es Higuchi, páginas 177-183). Se analizan los productos de expresión resultantes para determinar si la mutación E615G o A635T o ambas son las que causan el fenotipo de incorporación de ribonucleótido. Los resultados del ensayo indican que la mutación E615G es la única responsable del fenotipo mutante.

Para el ulterior análisis y cuantificación de la eficacia de incorporación de análogos de nucleótido se clona el fragmento BamHI-NheI de PCR que contiene 265 pares de bases y contiene además la mutación E615G en un vector de expresión de Taq, el pRDA3-2. El vector de expresión pRDA3-2 contiene un gen de Taq de longitud completa unido operativamente al promotor PL lambda de fago. El dominio de exonucleasa del gen Taq de este vector contiene una mutación puntual en el codón que codifica a la glicina, el resto aminoácido 46, que reduce la actividad de la exonucleasa 5'-3'. Sin embargo, la secuencia del gen dentro del dominio de polimerasa del vector de expresión pRDA3-2 es idéntica a la secuencia del gen Taq de tipo salvaje. El plásmido pRDA3-2 se describe por completo en la patente US-5 466 591 que se incorpora a la presente como referencia, en esta patente el plásmido se denomina "clon 3-2". Se digiere el plásmido pRDA3-2 con BamHI y NheI y se liga el fragmento PCR de 265 pares de bases al vector por métodos convencionales.

El plásmido resultante, el pLK108, se transforma en la cepa DG116 de E. coli (Lawyer y col., lugar citado, 1993, también disponible de la American Type Culture Collection con el número ATCC 53606). El plásmido pLK108 codifica una polimerasa de ADN termoestable que en la presente se llama G46D, E615G Taq. Se crea un mutante G46D, E615G, F667Y Taq combinando las mutaciones E615G y F667Y por reacción PCR recombinante en un fragmento BamHI-NheI. Se clona este fragmento en un plásmido pRDA3-2 para crear el plásmido pLK109. Se purifican las proteínas de polimerasa de ADN termoestable expresada de los plásmidos pLK108 y pLK109 con arreglo a los métodos descritos por Lawyer y col., lugar citado, 1993, aunque se omiten las etapas de la cromatografía. Se confirma la secuencia de los insertos mediante un análisis de secuencia de ADN. Se detecta una mutación adicional en la secuencia del inserto pLK108; sin embargo, esta mutación no cambia la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Después de una purificación parcial se determina la actividad de la enzima modificada mediante ensayos de actividad descritos por Lawyer y col., J. Biol. Chem. 264, 6427-6437, 1989, que se incorporan a la presente como referencia. Se calcula la actividad de las enzimas modificadas del modo siguiente: una unidad de enzima corresponde a 10 nmoles de producto sintetizado en 30 minutos. La actividad de polimerasa de ADN de la enzima de tipo salvaje es linealmente proporcional a la concentración de la enzima hasta 80-100 pmoles de dCMP incoporado (enzima diluida a 0,12-0,15 unidades por reacción). La actividad de los mutantes E615G, G46D y E615G, F667Y, G46D es linealmente proporcional la concentración de enzima hasta 0,25-3 pmoles de dCMP incorporado (enzima diluida hasta 6 x 10^{-4} a 5 x 10^{-3} unidades por reacción). Esta preparación de enzima se utiliza para las reacciones de incorporación y secuenciación, descritas en los ejemplos III-V. En los ejemplos II y VI, la enzima se purifica del modo descrito por Lawyer y col. (lugar citado).

Ejemplo II Ensayo para comparar la eficacia de incorporación

Se determina la actividad relativa del G46D y G46D, E615G Taq para incorporar los rNTP midiendo la cantidad de rNTP[\alpha-P^{32}] que cada enzima podría incorporar en una concentración límite de enzima a un molde de ADN activado de esperma de salmón. Para medir la incorporación de rATP se prepara una mezcla de reacción de modo que las concentraciones finales en 50 \mul de mezcla reaccionante sean: 12,5 \mug de ADN activado de esperma de salmón, obtenido del modo descrito a continuación, 200 \muM de cada uno de los siguientes dCTP, dGTP y dTTP (Perkin Elmer, Norwalk, CT), 100 \muM de rATP[\alpha-P^{32}], 1 mM de \beta-mercaptoetanol, 25 mM de ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-amino-propanosulfónico (TAPS), pH 9,5, 20ºC, 50 mM de KCl y 2,25 mM de MgCl_{2}.

Se preparan mezclas similares para medir la incorporación de rCTP, rGTP y rUTP. En cada caso el rNTP se marca radiactivamente y está presente en una concentración de 100 \muM y los tres dNTP restantes (dATP, dGTP y DTTP para el rCTP, dATP, dCTP y DTTP para el rGTP y dATP, dCTP y DGTP para el rUTP) están presentes en una concentración de 200 \muM en cada caso. Como norma se mide también la incorporación del dNTP[\alpha-P^{32}] correspondiente por acción de cada enzima. La mezcla empleada para estos ensayos es similar a la empleada en el ensayo de incorporación de rNTP anterior, salvo que cada rNTP[\alpha-P^{32}] se reemplaza por 100 \muM del correspondiente dNTP[\alpha-P^{32}]. El ADN en bruto de esperma de salmón, 1 g/l, suministrado por Worthington Biochemical, Freehold, NJ, se activa por incubación en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,2, 5 mM de MgCl_{2}, entre 2 y 8ºC durante 96 horas. A continuación se añaden el EDTA y el NaCl en concentraciones de 12,5 mM y 0,1 M, respectivamente. Después se extrae el DNA con fenol/cloroformo y a continuación se precipita con etanol y se resuspende en 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 7,5. Seguidamente se dializa la preparación de ADN activado frente al mismo tampón.

Se dividen en cinco partes alícuotas cuarenta y cinco microlitros de cada mezcla de reacción que se introducen en tubos de 0,5 ml (p.ej. Eppendorf) para cada uno de los precursores de nucleótido marcado en 5'. De este modo se ensaya por duplicado cada uno del Taq G46D y Taq G46D, E 615G guardando un tubo para el control negativo. Se inicia la reacción de polimerización en dos tubos para cada mezcla de ensayo con 5 \mul de polimerasa de Taq G46D (0,02 unidades) o con Taq G46D, E615G (0,002 unidades). Como control del nivel de fondo se añaden 5 \mul de tampón de dilución de la enzima y no de la enzima a la reacción de control negativo.

Se trata cada mezcla reaccionante en vórtex por poco tiempo y se incuba a 75ºC durante 10 minutos. Se interrumpen las reacciones por adición de 10 \mul de EDTA 60 mM y se almacenan sobre hielo. De cada muestra se diluyen 50 \mul de alícuota de 60 \mul de mezcla reaccionante con 1 ml de EDTA 2 mM, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón recortado. Se precipita el ADN con TCA empleando métodos estándar y se recoge en discos de filtro GF/C (Whatman, Kent, Inglaterra). Se cuantifica la cantidad de nucleótido o ribonucleótido marcado [\alpha-P^{32}] incorporado por espectrometría de centelleo líquido y se calcula el número de pmoles incorporados. Se normaliza el número de pmoles de cada rNTP incorporado por cada enzima en el número de pmoles del dNTP[\alpha-P^{32}] correspondiente incorporado por cada enzima. Los datos obtenidos se indican a continuación.

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Los resultados indican que el G46D, E615G incorpora ribonucleótidos con una eficacia 500 veces mayor que el G46D (p.ej. en el caso del rGTP: 181:0,36 = 502 veces; en el caso del rCTP: 189:0,22 = 859 veces; y en el caso del rATP: 210:0,18 = 1166 veces más eficaz). Por lo tanto, una mutación errónea (missense) en el codón 615 del gen de polimerasa da lugar a un nuevo fenotipo: una polimerasa de ADN termoestable capaz de incorporar con eficacia ribonucleótidos además de desoxirribonucleótidos.

Ejemplo III Ensayo comparativo de la eficacia de incorporación de 3'-desoxi-ATP (cordicepina)

Se determina la capacidad relativa del Taq G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y y G46D, F667Y para incorporar el 5-trifosfato de 3-desoxi-adenosina (trifosfato de cordicepina) midiendo la cantidad de trifosfato de cordicepina[\alpha-P^{32}] que cada enzima podría incorporar en una concentración límite de enzima a un molde de ADN activado de esperma de salmón. Para medir la incorporación del trifosfato de cordicepina[\alpha-P^{32}] se compone el ensayo de modo que las concentraciones finales dentro de una mezcla reaccionante de 50 \mul sean de: 12,5 \mug de ADN activado de esperma de salmón, 200 \muM de cada una de las siguientes: dCTP, dGTP y dTTP, 50 \muM de dATP (Perkin Elmer), 50 \muM de 3dATP[\alpha-P^{32}]/3dATP (New England Nuclear, Sigma), 1 \muM de \beta-mercaptoetanol, 25 mM de ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-amino-propanosulfónico (TAPS), pH 9,5, 20ºC, 55 mM de KCl y 2,25 mM de MgCl_{2}.

Se dividen en partes alícuotas cuarenta y cinco microlitros de cada mezcla de reacción que se introducen en nueve tubos de 0,5 ml, de este modo cada reacción se realiza con Taq G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y o G46D, F667Y por duplicado, guardando un tubo para el control sin enzima. Se inicia la reacción de polimerización en dos tubos para cada mezcla de ensayo con 5 \mul de polimerasa de Taq G46D (0,058 unidades). Lo mismo se repite con Taq G46D, E615G (0,0025 unidades), con Taq G46D, E615G, F667Y (0,0034 unidades) y con Taq G46D, F667Y (0,083 unidades). Como control del nivel de fondo, el tubo restante se inicia con tampón de dilución de la enzima y no con la enzima.

Se trata cada mezcla reaccionante en vórtex por poco tiempo y se incuba a 75ºC durante 10 minutos. Se interrumpen las reacciones por adición de 10 \mul de EDTA 60 mM y se almacenan sobre hielo. De cada muestra se diluyen 50 \mul de alícuota de 60 \mul de mezcla reaccionante con 1 ml de EDTA 2 mM, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón recortado. Se precipita el ADN con TCA empleando métodos estándar y se recoge en discos de filtro GF/C (Whatman, Kent, Inglaterra). Se cuantifica la cantidad de nucleótido marcado [\alpha-P^{32}] incorporado por espectrometría de centelleo líquido y se calcula el número de pmoles incorporados. Se divide el número de pmoles de trifosfato de cordicepina
[\alpha-P^{32}] incorporado por cada enzima en el número de unidades de cada enzima empleada en el ensayo, obteniéndose los pmoles incorporados por unidad de enzima. En la tabla siguiente se recogen los resultados.

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Estos resultados indican que se requieren las dos mutaciones, la E615G y la F667Y, para lograr una incorporación eficaz de la molécula de cordicepina al ADN.

Ejemplo IV Secuenciación de ADN por disgregación alcalina empleando una polimerasa de ADN de Taq G46D, E615G

Este ejemplo ilustra la aplicación de la polimerasa modificada de la invención en la secuenciación por disgregación alcalina, empleando un ADN parcialmente sustituido por rNTP. La proporción entre el rNTP y el dNTP dentro de las mezclas de reacción se sitúa entre 1:80 y 1:8. Se realizan las reacciones de extensión de cebador en un tampón que consta de 50 mM de bicina (N-N-bi(2-hidroxietil)glicina; pH 8,3), 25 mM de KOAc y 2,5 mM de MgCl_{2}. Se llevan a cabo cuatro reacciones individuales, una para cada uno de los cuatro rNTP. Cada mezcla de reacción (50 \mul) contiene: 200 \muM de cada uno de los siguientes dATP, dCTP, dGTP y DTTP (Perkin-Elmer) y 0,09 pmoles de molde M13mp18 de ADN de hebra simple (Perkin-Elmer) fusionado con DG48 marcado en 5 con [P^{32}] (Lawyer y col., PCR Methods and Applications, 2, 275-287, 1993). Las mezclas reaccionantes contienen además 2,5, 2,5, 2,5 y 25 \muM de rATP, rCTP, rGTP y rUTP, respectivamente.

Se inicia cada una de las cuatro reacciones con la adición de 7 unidades de polimerasa de ADN de Taq G46D E615G y se incuba a 75ºC durante 10 minutos. Se interrumpen las reacciones por adición de 10 \mul de EDTA 50 mM y se guardan sobre hielo. Veinte \mul de cada mezcla reacción se añaden a 80 \mul de bicina 50 mM (pH 8,3), 25 mM de KOAc y 2,5 mM de MgCl_{2}. Los productos de disgregación se obtienen por adición de 7 \mul de NaOH 1 N e incubación a 98ºC durante 15 minutos. Se neutralizan las mezclas de reacción con la adición de 7 \mul de HCl 1N. Se precipita cada mezcla reaccionante por adición de 312 \mul de etanol del 95% y 10 \mul de acetato sódico 3 M (pH 4,8). Se microcentrifugan las mezclas reaccionantes durante 15 minutos para recoger el precipitado, se retira el líquido sobrenadante, se lavan los perdigones con 500 \mul de etanol del 70% y se secan. Se vuelve a suspender cada perdigón en 5 \mul de tampón 0.5X Stop (suministrado por Perkin Elmer, Norwalk, CT; contiene un 95% de formamida, EDTA 20 mM y azul de bromofenol al 0,05%), se calienta a 98ºC durante 3 minutos y se carga directamente en un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida al 6%/urea 8 M preelectroforesado y se somete a la electroforesis. Se seca el gel y se expone a rayos X de película. La película resultante pone de manifiesto una escalera de secuenciación clara que proporciona un exceso de 100 bases de secuencia correcta.

Ejemplo V Secuenciación de ADN empleando polimerasa de ADN de Taq G46D, E615G, F667Y y trifosfatos de 3'-desoxi-nucleótidos

Este ejemplo ilustra la aplicación de la polimerasa modificada, el Taq G46D, E615G, F667Y para secuenciar el ADN empleando trifosfatos de 3-desoxi-nucleótidos. Este ensayo se realiza empleando 3-desoxi-ATP; sin embargo, podría ampliarse también al uso de 3-deoxi-nucleótidos. Las reacciones de extensión del cebador se realizan en un tampón que consta de 50 mM de bicina (pH 8,3), 25 mM de KOAc y 2,5 mM de MgCl_{2}. Cada mezcla reaccionante (50 \mul) contiene una concentración 200 \muM de cada uno de los siguientes dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Perkin-Elmer) y 0,09 pmoles del molde M13mp18 de ADN de hebra simple (Perkin-Elmer) fusionado a DG48 marcado en posición 5' con [P^{32}] (Lawyer y col, PCR Methods and Applications 2, 275-287, 1993). Las mezclas de reacción contienen además 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 ó 5 \muM de 3-desoxi-ATP.

Se inicia cada una de las reacciones por adición de 7 unidades de polimerasa de ADN de Taq G46D, E615G, F667Y y se incuban a 75ºC durante 10 minutos. Se interrumpen las reacciones por adición de 10 \mul de EDTA 60 mM y se colocan sobre hielo. Treinta \mul de cada mezcla reaccionante se precipitan en etanol y se vuelven a suspender en el tampón Stop, se calienta a 98ºC durante 3 minutos y se cargan directamente en un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida al 6% /urea 8 M preelectroforesado, y se realiza la electroforesis. Se seca el gel y se expone a rayos X de película. Los carriles que contienen mezclas de reacción realizada en presencia de cordicepina contienen escaleras de terminación claramente discernibles. Los carriles que contienen la mayor parte de cordicepina, es decir 5 \muM, muestran una escalera de terminación en la que, en premio, las bandas son de longitud más corta que los carriles en los que existen niveles menores de cordicepina. Estos resultados indican que la enzima mutante es capaz de incorporar la cordicepina y que la incorporación de esta molécula a un producto de extensión de cebador provoca la terminación. Este método podría utilizarse también para crear una escalera de secuenciación de ADN, también con el 3'-desoxi-CTP, el 3'-desoxi-GTP y 3-desoxi-UTP.

Ejemplo VI Secuenciación por PCR de cebador-colorante con polimerasa de ADN de Taq G46D E615G

Este ejemplo ilustra la aplicación de la polimerasa modificada de la invención a la secuenciación de cebador-colorante empleando trifosfato de ribonucleósido (rNTP) en una reacción PCR y con una proporción de rNTP:cNTP no superior a 1:30. Se llevan a cabo cuatro reacciones individuales, una para cada uno de los rNTP. Las reacciones de secuenciación por PCR se realizan en un tampón que contiene 25 mM de Tris-HCl (pH 9), 5,0 mM de MgCl_{2} y un 10% de glicerina (v/v). Cada mezcla reaccionante contiene además 500 \muM de cada uno de los siguientes dATP, dCTP, dGTP, DTTP (Perkin-Elmer), 5 x 10^{6} copias/\mul de molde de plásmido pBSM13+ (Stratagene) linealizado con endonucleasa de restricción XmnI y 0,05 unidades/\mul de polimerasa de ADN de Taq G46D E615G. Las mezclas de reacción de ribo-ATP (10 \mul) contienen 2,5 \muM de ATP (Pharmacia Biotech), 0,1 \muM del cebador JOE M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) y 0,1 \muM del cebador ASC46 (5'-CGCCATTCGCCATTCAG). Las mezclas de reacción de ribo-CTP (10 \mul) contienen 2,5 \muM de CTP (Pharmacia Biotech), 0,1 \muM del cebador FAM M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) y 0,1 \muM del cebador ASC46. Las mezclas de reacción de ribo-GTP (20 \mul) contienen 2,5 \muM de GTP (Pharmacia Biotech), 0,1 \muM del cebador TAMRA M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) y 0,1 \muM del cebador ASC46. Las mezclas de reacción de ribo-UTP (20 \mul) contienen 16 \muM de UTP (Pharmacia Biotech), 0,1 \muM del cebador ROX M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) y 0,1 \muM del cebador ASC46.

Cada una de las cuatro mezclas de reacción se coloca en un aparato ciclador térmico del tipo Perkin Elmer GeneAmp® PCR System 9600 precalentado (75ºC) y se somete a 30 ciclos de 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 10 segundos, una rampa hasta 65ºC que dura 1 minuto y 65ºC durante 5 minutos. Las mezclas de reacción de rATP y rCTP generan, cada una, 6 x 10^{11} copias de producto amplificado de 300 pares de bases, marcado con colorante y las mezclas de reacción de rGTP y UTP generan, cada una, 1,2 x 10^{12} copias de producto amplificado de 300 pares de bases, marcado con colorante.

Para determinar la secuencia de ADN de los productos amplificados por PCR sin necesidad de una reacción separada de secuenciación enzimática del ADN se reúnen las mezclas de reacción, se tratan con base y con calor, se neutralizan y se precipitan del modo siguiente. Se reúnen cuatro \mul de cada mezcla de reacción de ATP y CTP y 8 \mul de cada mezcla de reacción de GTP y UTP. A la mezcla de reacción reunida se le añaden dos microlitros de EDTA 0,25 M (pH 8,0) (concentración final: 10 mM), 10 \mul de NaOH 1 M (conc. final: 200 mM) y 14 \mul de H_{2}O que se incuba a continuación a 95ºC durante 5 minutos en un aparato ciclador térmico del tipo Perkin Elmer GeneAmp® PCR System 9600 y se neutraliza con 10 \mu de HCl 1 M. Después se precipita la mezcla de reacción reunida por adición de 150 \mul de etanol del 95% y a continuación se incuba a 4ºC durante 15 minutos. Seguidamente se centrifuga a 4ºC durante 15 minutos para recoger el precipitado y se retira el líquido sobrenadante por aspiración. Se lava el perdigón con 300 \mul de etanol del 70%, se microcentrifuga durante 5 minutos, se retira el líquido sobrenadante por aspiración y se seca el perdigón. Se vuelve a suspender el perdigón en 6 \mul de formamida 50 mg/ml de azul dextrano (en EDTA 25 mM) 5:1 (v/v) y se calienta a 90ºC durante 3 minutos. Un \mul y medio del perdigón resuspendido se carga directamente en un gel de secuenciación preelectroforesado de Long Ranger (FMC BioProducts) al 5%/urea 6 M. A continuación se somete a electroforesis y se analiza en un aparato del tipo Perkin Elmer ABI Prism™ 377 DNA Sequencer siguiendo las instrucciones del fabricante. La clasificación automática de las bases que permite el programa informático Perkin Elmer ABI Prism™ Sequencing Analysis permite obtener una precisión superior al 99% en la determinación de las secuencias de ADN del producto amplificado por PCR que contiene 300 pares de bases.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Grenzacherstrasse 124

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Basilea

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CANTÓN: BS

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NACIÓN: Suiza

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (0)61 688 24 03

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (0) 61 688 13 95

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TELEX: 962292/965512 hlr ch

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: polimerasa de ADN termoestable modificada

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA COMPUTERIZADA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete (floppy disk)

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS PREVIOS DE SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/023,376

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-AUG-1996

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN DIVERSA: /marcador= Xaa /nota = "en la que Xaa es cualquier aminoácido, excepto Glu"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN DIVERSA: /marcador= Xaa /nota = "en la que Xaa es Ile o Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO DISTINTIVO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

INFORMACIÓN DIVERSA: /marcador= Xaa /nota = "en la que Xaa es Ile o Val"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2626 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Thermus aquaticus

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO CARACTERÍSTICO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 121...2616

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7

5

6

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 832 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8

10

11

12

Claims (21)

1. Una enzima polimerasa de ADN termoestable que contiene una secuencia de aminoácidos SerGlnIleXaaLeuArg
Xaa (SEQ ID NO: 1), en la que el "Xaa" de la posición 4 de esta secuencia es cualquier resto aminoácido, excepto el resto ácido glutámico (Glu) y el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile), caracterizada porque produce una discriminación reducida contra la incorporación de un nucleótido no convencional en comparación con una polimerasa de ADN termoestable de origen natural, dicha discriminación reducida está caracterizada porque la capacidad de dicha polimerasa para incorporar dicho nucleótido no convencional se aumenta por lo menos 20 veces.

2. Una enzima polimerasa de ADN termoestable, caracterizada porque es un derivado recombinante de una polimerasa de ADN termoestable de origen natural, dicha polimerasa de ADN termoestable de origen natural contiene un motivo de secuencia de aminoácidos SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), en la que el "Xaa" de la posición 7 de esta secuencia es un resto valina (Val) o un resto isoleucina (Ile); dicho derivado recombinante se ha modificado para obtener un aminoácido que no es ácido glutámico (Glu) en la posición 4 de dicho motivo de secuencia; dicho derivado recombinante despliega una discriminación reducida contra la incorporación de un nucleótido no convencional en comparación con dicha polimerasa de ADN termoestable de origen natural, dicha discriminación reducida está caracterizada porque la capacidad de dicha polimerasa para incorporar un nucleótido no convencional se aumenta por lo menos 20 veces con respecto a la capacidad de dicha forma nativa correspondiente de la polimerasa para incorporar dicho nucleótido no convencional.

3. La enzima polimerasa de ADN termoestable de la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el aminoácido de la posición 4 es la glicina (Gly).

4. La polimerasa de ADN termoestable, reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque tiene una actividad para utilizarse en una mezcla de reacción de secuenciación de ADN evitando el uso de didesoxinucleótidos, dicha mezcla de reacción contiene un nucleótido no convencional que es con preferencia un trifosfato de ribonucleósido y un nucleótido convencional correspondiente en una proporción de 1:1 o menos.

5. La polimerasa de ADN termoestable, reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque tiene una actividad para utilizarse en una mezcla de reacción de secuenciación de ADN evitando el uso de didesoxinucleótidos, dicha mezcla de reacción contiene un nucleótido no convencional que es un trifosfato de ribonucleósido que está presente en una concentración inferior a 100 \muM y un nucleótido convencional correspondiente que está presente en una concentración de más de 100 \muM.

6. Una enzima polimerasa de ADN termoestable según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que es un derivado recombinante de una enzima polimerasa de ADN termoestable de origen natural obtenida a partir de un organismo elegido entre el grupo formado por el Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformi, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus especie Z05, Thermus especie sps17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax y Bacillus stearothermophilus.

7. La enzima polimerasa de ADN termoestable según una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 5, que es un derivado recombinante de una polimerasa de ADN de una especie de Thermus termoestable de origen natural, con preferencia una polimerasa de ADN de Taq o una polimerasa homóloga de esta, con mayor preferencia una polimerasa de ADN termoestable que contiene una secuencia de aminoácidos LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 5), con preferencia especial la polimerasa de ADN termoestable que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y las formas modificadas de esta, por ejemplo las formas mutantes G46D y/o F667Y.

8. La enzima polimerasa de ADN termoestable según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que tiene por lo menos un 39%, con preferencia por lo menos un 60%, con mayor preferencia por lo menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de ADN de Taq (SEQ ID NO: 7).

9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica a una enzima polimerasa de ADN termoestable reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8.

10. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica a una enzima polimerasa de ADN termoestable reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8.

11. Una célula hospedante que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica a una enzima polimerasa de ADN termoestable reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8.

12. Un método para la obtención de una enzima polimerasa termoestable de ADN que consiste en:

(a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 11 en condiciones que permitan la expresión de la enzima polimerasa de ADN termoestable y

(b) aislar la enzima polimerasa de ADN termoestable de la célula hospedante o del medio de cultivo.

13. Una enzima polimerasa de ADN termoestable obtenida por el método reivindicado en la reivindicación 12.

14. Uso de una enzima polimerasa de ADN termoestable reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 en la reacción de amplificación o de secuenciación de ácidos nucleicos.

15. Una composición para utilizar en una reacción de secuenciación de ADN que contiene:

un molde de ácido nucleico, un cebador oligonucleótido complementario de dicho molde, una polimerasa de ADN termoestable reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, una mezcla de dNTP convencionales y por lo menos un nucleótido no convencional, en la que la proporción entre el nucleótido no convencional y dichos nucleótidos convencionales correspondientes se sitúa en 1:1 o menos.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho nucleótido no convencional es un ribonucleótido, dicho ribonucleótido está presente con preferencia en una concentración inferior a 100 \muM y el nucleótido convencional correspondiente está presente en una concentración de más de 100 \muM.

17. La composición según la reivindicación 16, caracterizada además porque dicho nucleótido no convencional no está marcado.

18. Un método para la secuenciación de un ácido nucleico diana, dicho método consiste en las etapas siguientes:

(a) aportar un nucleótido no convencional y un nucleótido convencional correspondiente a una reacción de secuenciación de ADN, dichos nucleótidos no convencional y convencional correspondiente están presentes en una proporción inferior a 1:1;

(b) tratar la mezcla de reacción de la etapa (a) en presencia de una polimerasa de ADN termoestable, reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en condiciones idóneas para la extensión del cebador para obtener productos de extensión de cebador que contengan dicho nucleótido no convencional;

(c) tratar los productos de extensión de cebador de la etapa (b) en condiciones que permitan hidrolizar dichos productos de extensión de cebador;

(d) resolver los productos de extensión de la etapa (c); y

(e) determinar la secuencia del ácido nucleico diana.

19. Un método de secuenciación según la reivindicación 18, en el que dicho nucleótido no convencional es un ribonucleótido que está presente con preferencia en una concentración de 0,1 \muM a 100 \muM.

20. El método de secuenciación según la reivindicación 18, en el que dicho nucleótido convencional correspondiente está presente en una concentración de 50 \muM a 500 \muM.

21. Un kit para secuenciar un ácido nucleico que contiene una polimerasa de ADN termoestable, reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, y opcionalmente otros reactivos útiles para tal procedimiento de secuenciación, p.ej. uno o varios cebadores oligonucleótidos, una mezcla de dNTP convencionales y por lo menos un nucleótido no convencional, situándose la proporción entre dicho nucleótido no convencional y dicho nucleótido convencional correspondiente con preferencia en menos de uno.