CN111826366B

CN111826366B - 一种直扩型热启动dna聚合酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111826366B
Application number: CN202010503288.XA
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 黄丽芳; 苑歆; 刘光毅; 何贤蓉; 侯轶; 樊壬水
Original assignee: Guangzhou Yingzan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yingzan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111826366A

Abstract

本发明公开了一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明公开的直扩型热启动DNA聚合酶是野生型Taq DNA聚合酶经缺失、定点突变、融合非特异性双链DNA结合蛋白结构域生物突变，并用化学修饰改造而成。本发明直扩型热启动DNA聚合酶可大幅提高DNA聚合酶稳定性，可耐受高浓度的荧光染料和各种抑制剂，可应用于各种来源、组成复杂样本的直接PCR或qPCR检测，使得PCR相关反应和检测更加便利。本发明还公开了一种qPCR反应试剂盒，检测特异性高、荧光信号强，适用于低含量粗提取核酸的快速定量检测，可应用于食品掺杂、微生物检测、转基因植物筛查。

Description

一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术是在聚合酶链式反应(PCR)的基础上发展起来的，弥补了普通PCR不可以实时监测及定量的缺陷，成为了当今基因研究的重要工具。SYBR GreenΙ染料法qPCR技术以其成本低、重复性好、适用性强等优点广泛应用于医学研究、病原微生物检测和食品安全检测等诸多领域。

灵敏、精准一直是检测领域发展的需求及目标，SYBR GreenΙ染料法qPCR技术在应用于核酸检测的过程中，Taq DNA聚合酶的活性会受到样品或者样品提取过程中残留的qPCR抑制剂的干扰。如植物核酸样本中的多糖、血液核酸样本中的免疫球蛋白、土壤核酸样本中的腐殖酸等都会抑制Taq DNA聚合酶活性，从而影响qPCR检测的特异性、荧光信号及灵敏度，造成结果的不可靠和不准确。

Taq DNA聚合酶作为qPCR反应的核心组分，具有超强的耐热性和聚合酶活性，其性能直接决定了qPCR检测的速度、特异性及结果的可靠性。热启动DNA聚合酶可在PCR反应前封闭DNA聚合酶的活性，使得PCR反应开始时才释放其活性，可大幅度减少非特异性扩增及引物二聚的形成，是目前qPCR试剂的主要成分。近年来，涌现了多种耐抑制剂的、可以直接对粗样样品进行PCR扩增的Taq DNA聚合酶。但当前的直扩Taq DNA聚合酶可耐受的粗样样品量少，当样本中检测目标含量低时，容易导致假阴性结果(如病毒或细菌感染初期时的样本检测)，且仅适用于普通PCR。用于粗样直接qPCR检测的Taq DNA聚合酶需要更强的耐抑制剂能力，以便在高浓度抑制剂和高浓度染料存在下，保证qPCR检测的特异性及结果的可靠性。因此，亟需研究开发一种用于qPCR的高性能热启动DNA聚合酶。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种直扩型热启动DNA聚合酶。

本发明的另一目的在于提供上述直扩型热启动DNA聚合酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述直扩型热启动DNA聚合酶的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种直扩型热启动DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的直扩型热启动DNA聚合酶与NCBI登录号为P19821.1的野生型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列相比，具有以下特点：1～289位氨基酸缺失，626位谷氨酸突变为精氨酸，707位异亮氨酸突变为亮氨酸，708位谷氨酸突变为精氨酸，且N末端融合了双链DNA结合蛋白。

所述的双链结合蛋白优选为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的Sso7d。双链结合蛋白可以显著提高DNA聚合酶对模板DNA的亲和力。

编码上述直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子。

所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该序列是根据大肠杆菌表达系统特点进行密码子优化而得，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

一种重组表达载体，是将编码上述直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子克隆入表达载体得到。

所述的表达载体优选为原核表达载体；更优选为pET系列载体；最优选为pET-28a。

一种重组工程细胞株，是将上述重组表达载体转化入工程细胞得到。

所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为BL21(DE3)细胞。该重组工程细胞株可快速、可溶表达上述重组表达载体。

上述直扩型热启动DNA聚合酶可通过化学合成方法得到，或是通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到。从成本考虑，优选为通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到；具体包括如下步骤：

取上述重组工程细胞株，接种于含抗生素的LB培养基中，在35～38℃条件下，培养至菌液OD₆₀₀达到0.7～0.9，再用IPTG诱导细胞表达蛋白，经分离纯化后得到所述的直扩型热启动DNA聚合酶。

所述的抗生素优选为卡那霉素。

所述的卡那霉素的用量优选为按50μg/mL LB培养基计算。

所述的IPTG的用量优选为按终浓度为0.1～0.5mmol/L计算。

所述的诱导的条件优选为温度35～38℃、时间2～4h；更优先为温度37℃、时间3h。

所述的分离纯化的方法优选为先经镍离子亲和层析(Ni-NTA层析)，再经阴离子交换柱层析。

优选的，所述的镍离子亲和层析所用的结合缓冲液(Buffer A)的配方为：50mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；所用的洗脱缓冲液(Buffer B)的配方为：500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl，pH＝8.0。

优选的，所述的阴离子交换层析所用的结合缓冲液(Buffer C)的配方为：50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl，pH＝8.0；所用的洗脱缓冲液(Buffer D)的配方为：50mmol/LTris-HCl、1mol/L NaCl，pH＝8.0。

优选的，所述的直扩型热启动DNA聚合酶的聚合酶活性位点赖氨酸侧链氨基上特异性结合有酸酐类化合物，以可逆的封闭其聚合酶活性。

所述的酸酐类化合物优选为顺式乌头酸酐或柠槺酸酐；更优选为柠槺酸酐。经酸酐修饰的聚合酶，大大降低了PCR反应过程中非特异性产物扩增和引物二聚体形成的可能性。

上述直扩型热启动DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将上述直扩型热启动DNA聚合酶透析到Tris-HCl缓冲液中；

(2)加入酸酐类化合物，混合均匀，孵育；

(3)将孵育后的酶液透析到储存缓冲液中，即获得稳定的直扩型热启动DNA聚合酶。经该方法制得的热启动DNA聚合酶具有优异的热启动性能，在50℃，孵育10min仍无聚合酶活性释放；在95℃热激，5～10min才可释放活性。

所述的Tris-HCl缓冲液优选浓度为10～30mmol/L、pH＝9～10的Tris-HCl缓冲液。

所述的直扩型热启动DNA聚合酶与所述的酸酐类化合物的配比优选为摩尔比1:50～1:100。

所述的孵育的条件优选为温度40℃～50℃、时间2～5h。

所述的储存缓冲液的配方优选为：20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，0.1mmol/L EDTA，50％甘油(Glycerol)，1mmol/LDTT，0.5％Tween-20，0.5％

CA-630，pH8.0。

一种PCR反应缓冲液，包含如下组分：20～100mmol/L Tris-HCl、1～3mmol/LMgCl₂、5～20mmol/L(NH₄)₂SO₄、20～80mmol/L KCl、0.1～0.4mg/L BSA、0.05％～0.1％Tween-20、1％～6％DMSO，pH值为8～10；所述的PCR反应缓冲液与上述直扩型热启动DNA聚合酶配套使用。

所述的PCR反应缓冲液还包含海藻糖、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)和L-肉毒碱中的至少一种。

所述的海藻糖在体系中的浓度优选为0.1～0.4mol/L；更优选为0.3mol/L。

所述的乙基苯基聚乙二醇在体系中的浓度优选为0～0.4％；更优选为0.4％。

所述的L-肉毒碱在体系中的浓度优选为0.1～0.3mol/L；更优选为0.2mol/L。

上述PCR反应缓冲液在DNA样本扩增中的应用。

一种qPCR反应试剂盒，包含上述PCR反应缓冲液、SYBR Green I、PCR用水和dNTPs中的至少一种，以及上述直扩型热启动DNA聚合酶。

所述的SYBR Green I在体系中的浓度为0.2～10ng/μL。

所述的直扩型热启动DNA聚合酶在体系中的浓度优选为0.02～0.05U/μL。

所述的dNTPs在体系中的浓度优选为100～300μmol/L。

上述qPCR反应试剂盒在DNA样本扩增中的应用。

所述的DNA样本来源不受限制，可能含有腐殖酸、多糖、免疫球蛋白、酪蛋白等抑制剂中的至少一种。比如，含有多糖的植物核酸样本、含有免疫球蛋白的血液核酸样本、含有酪蛋白的牛奶核酸样本、含有腐殖酸的土壤核酸样本等。

本发明相较于现有技术具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明的直扩型热启动DNA聚合酶稳定性良好，在qPCR检验中可耐受高浓度的荧光染料和各种高浓度的抑制剂，如10ng/μL SYBR GreenΙ、1.6μg/mL腐殖酸、0.32mg/mL黄芪多糖或600μg/mL IgG。

(2)本发明所述的热启动DNA聚合酶使用便利，配套所述的PCR反应缓冲液后，可以直接用于各种来源、组成复杂的样本中目的基因的多重PCR扩增，至少可以在含50％的全血或20％的牛奶的反应体系中正常扩增目的基因。

(3)本发明所述qPCR反应试剂盒具有特异性强、灵敏度高的特点，可以准确检出浓度低至0.2copies/μL的目的基因。

附图说明

图1为Taq DNA聚合酶的纯化结果图；其中，泳道1为(11.4-116.0kDa)宽范围蛋白上样Marker，泳道2为细胞破碎后离心处理所得的上清液，泳道3为破碎液上清75℃加热30min离心处理后上清，泳道4～9分别为Ni-NTA亲和层析纯化时10％～60％Buffer B线性洗脱峰中的Taq DNA聚合酶，泳道10为阴离子交换层析纯化后所得到的Taq DNA聚合酶。

图2为本发明HS Sso-Taq与市售热启动DNA聚合酶TaqHS(Takara，R007Q)用于全血直接扩增的对比结果图；其中，A为两种DNA聚合酶用于扩增不同浓度的全血中的人类固醇21-羟化酶基因(CYP21)得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；B为本发明HS Sso-Taq用于在40％(v/v)全血中扩增3种不同长度的DNA片段，得到的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明HS Sso-Taq与市售热启动DNA聚合酶TaqHS(Takara，R007Q)用于直接扩增不同浓度鲜牛奶中的牛线粒体色素细胞b(Cytochrome,cob)基因，得到的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳对比结果图。

图4为含本发明HS Sso-Taq的SYBR GreenΙ染料法荧光定量PCR试剂与市售同类试剂的扩增灵敏度对比结果图；其中，A为市售品牌Promega(A600A)结果曲线图、B为市售品牌Takara(RR820)结果曲线图、C为本发明HS Sso-Taq结果曲线图、D为不同试剂的扩增灵敏度和扩增效率结果。

图5为本发明HS Sso-Taq与热启动野生型Taq DNA聚合酶(HS wt-Taq)的耐受SYBRGreenΙ荧光染料性能对比结果图；其中，A为HS Sso-Taq扩增曲线，B为HS Sso-Taq熔解曲线，C为HS wt-Taq扩增曲线，D为HS wt-Taq熔解曲线。

图6为本发明HS Sso-Taq与热启动野生型Taq DNA聚合酶(HS wt-Taq)在荧光定量PCR检测中耐受腐殖酸的性能对比结果图；其中，A为HS Sso-Taq扩增曲线，B为HS Sso-Taq熔解曲线，C为HS wt-Taq扩增曲线，D为HS wt-Taq熔解曲线。

图7为本发明HS Sso-Taq与热启动野生型Taq DNA聚合酶(HS wt-Taq)在荧光定量PCR检测中耐受多糖的性能对比结果图；其中，A为HS Sso-Taq扩增曲线，B为HS Sso-Taq熔解曲线，C为HS wt-Taq扩增曲线，D为HS wt-Taq熔解曲线。

图8为本发明HS Sso-Taq与热启动野生型Taq DNA聚合酶(HS wt-Taq)在荧光定量PCR检测中耐受IgG性能对比结果图。其中，A为HS Sso-Taq扩增曲线，B为HS Sso-Taq熔解曲线，C为HS wt-Taq扩增曲线，D为HS wt-Taq熔解曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1构建含编码Taq DNA聚合酶的核苷酸序列的重组载体

(1)根据Taq DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，进行大肠杆菌表达系统的密码子优化后，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的DNA分子，利用重叠延伸PCR的方法，人工合成编码所述Taq DNA聚合酶的DNA分子，具体如SEQ ID NO.3所示。

(2)将编码Taq DNA聚合酶的DNA分子与表达载体pET-28a进行同源重组。Taq DNA聚合酶扩增引物序列如下：

Taq-FP：5’-GGCATATGGCGACCGTTAAGTTTAAGTAC-3’(SEQ ID NO.4)；

Taq-RP：5’-CCATGAATTCTTATTCCTTCGCAGAT-3’(SEQ ID NO.5)。

pET-28a线性化引物序列如下：

pET-28a-FP：5’-GGAATAAGAATTCATGGTTGCGGCCGCA-3’(SEQ ID NO.6)；

pET-28a-RP：5’-ACGGTCGCCATATGCCGCGCGGCACCA-3’(SEQ ID NO.7)。

应用PCR对Taq DNA聚合酶DNA分子及pET-28a载体进行扩增，分别以人工合成编码所述Taq DNA聚合酶的DNA分子及pET-28a空载为模板，加入25μL 2×Pfu Max HiFi PCRProMix(广州英赞生物科技有限公司，货号P217A)、各1μL(10μmol/L)上下游引物以及适量的灭菌水，进行PCR扩增。Taq DNA聚合酶DNA分子的扩增条件为：98℃30s；98℃10s、55℃30s、68℃1min，共30个循环；68℃5min。质粒线性化PCR扩增程序为：98℃30s；98℃10s、55℃30s、68℃2.5min，共30个循环；68℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收全长约1.8kb的Taq DNA聚合酶DNA基因片段，以及约5kb线性化的pET-28a载体。将回收产物进行同源重组，体系为5μL 2×Hipro DNA Assembly Cloning Mix(广州英赞生物科技，K001A)、回收产物各加50ng，补水至10μL，50℃孵育15min。孵育完后将重组产物转化至DH5a感受态细胞中。

(3)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码Taq DNA聚合酶的DNA分子的重组载体。

实施例2表达Taq DNA聚合酶的转化体的制备

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞E.coliBL21(DE3)中，挑取单菌落，接种至液体LB(含50μg/mL的卡那霉素)培养基培养至OD₆₀₀为0.9，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，37℃诱导3h，收集菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达Taq DNA聚合酶。

实施例3 Taq DNA聚合酶在重组大肠杆菌中的表达

将实施例2获得的能够表达Taq DNA聚合酶的阳性转化体菌种，接种至含50μg/mL卡那霉素的60mL LB培养基中，放置于37℃摇床中震荡培养过夜；取过夜培养的种子液，按体积比1:100接种至1L含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中震荡培养至OD₆₀₀为0.7；向摇瓶中加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，37℃继续震荡诱导3h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于-20℃。

实施例4 Taq DNA聚合酶的纯化

1、重组菌体超声破碎

取-20℃冻存的诱导表达菌体，根据实施例3记录的菌体湿重，按每克菌体加入5mL裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl，pH 8.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：功率250W，超声5.5s，停5.5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下20000r/min离心15min，取上清液至250mL灭菌玻璃瓶中。上清液于75℃恒温水浴锅孵育30min，4℃下20000r/min离心15min，0.22μm微孔滤膜过滤，取上清液至250mL灭菌玻璃瓶。

2、镍离子亲和层析纯化

选用的层析柱是HisTrap^TM HP 5mL(购自GE Healthcare)，结合缓冲液为bufferA：50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl，pH＝8.0；洗脱缓冲液为buffer B：500mmol/L咪唑、50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl，pH＝8，0.22μm滤膜过滤备用。

将HisTrap^TM HP 5mL接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，后用超纯水清洗系统和柱子，再用buffer A平衡柱子，然后用样品泵将步骤1所述上清液进行上样，上样完毕，先用buffer A清洗柱子，再用buffer B进行线性洗脱(10％～60％)，并收集线性洗脱峰样品。对buffer B洗脱峰中收集的1～6管(3mL/管)样品进行取样，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图1(泳道4-9)所示，将纯度较高的5、6管样品合并作为强阴离子交换柱层析样品。

3、强阴离子交换柱层析

所用层析柱为HisTrap^TMCapto^TM Q 5mL(购自GE Healthcare)，所用的结合缓冲液为Buffer C：50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl，pH＝8.0；洗脱缓冲液为BufferD：50mmol/L Tris-HCl、1mol/L NaCl，pH＝8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

将HisTrap^TMCapto^TM Q 5mL接入AKTA纯化仪柱位阀中，再用超纯水清洗系统和柱子，用buffer C平衡柱子，然后用样品泵将上述含有目的蛋白的亲和层析样品进行上样，上样完毕，先用buffer C清洗柱子，再用洗脱缓冲液buffer D进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。洗脱峰取样20μL，SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图1所示。

实施例5 Taq DNA聚合酶活性测试

取实施例4制备的Taq DNA聚合酶，按照以下方法测定酶活。74℃下，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在200μmol/L dNTPs、50mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、0.1～0.4mg/L BSA、0.1％Tween-20、4％DMSO组成的pH8.0的反应体系中进行酶催化反应，30min内，催化10nmoldNTPs掺入到DNA的酶量定义为1U。结果表明，本发明的TaqDNA聚合酶的酶活浓度为62U/μL。

实施例6 HS Sso-Taq的制备及测活

将高纯度的Taq DNA聚合酶过夜透析到10～30mmol/L Tris-HCl(pH9.0～10.0)缓冲溶液中。并用BCA的方法测定蛋白浓度，后与柠槺酸酐按摩尔比为1:100混匀均匀，并于42℃孵育4h，得到经柠槺酸酐修饰可逆封闭酶活性的热启动DNA聚合酶，命名为HS Sso-Taq。

将得到的热启动DNA聚合酶透析到储存缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，100mmol/LKCl，0.1mmol/L EDTA，50％Glycerol，1mmol/L DTT，0.5％Tween-20，0.5％

CA-630，pH8.0)中，95℃，热激10min后按实施例5的测活方法测定热启动DNA聚合酶的活性。结果表明，HS Sso-Taq的酶活浓度为5U/μL。

实施例7 HS Sso-Taq的全血直扩能力研究

(1)对不同浓度的全血进行直扩

分别以100ng的从EDTA-2Na抗凝血中提纯的人基因组DNA及10％、20％、40％、50％(v/v)的EDTA-2Na抗凝血(全血由健康人提供，于广东省内取样)为模板，用本发明中的直扩型热启动DNA聚合酶以及购买市售品牌Takara的热启动DNA聚合酶TaqHS(Takara，R007Q)同时扩增人类固醇21-羟化酶基因(CYP21)基因，结果如图2所示。扩增引物和具体操作如下：

CYP21-FP：5’-GCTCAGCATGGTGGTGGCATAA-3’(SEQ ID NO.8)；

CYP21-RP：5’-CCTCATACCTTCCCCCCCATTT-3’(SEQ ID NO.9)。

基于本发明中的PCR反应缓冲液包含50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、3mmol/LMgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、0.1mg/L BSA、0.05％Tween-20、1％DMSO、250nmol/L CYP21-FP、250nmol/L CYP21-RP，200μmol/L dNTPs，0.05U/μL HS Sso-Taq，适量的灭菌ddH₂O。反应程序为95℃10min；95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35个循环。

市售品牌Takara热启动DNA聚合酶Taq HS的反应体系包含2.5μL 10×PCRBuffer，200nmol/L CYP21-FP、200nmol/L CYP21-RP，200μmol/L dNTPs，0.05U/μL Taq HS，适量的灭菌ddH₂O。反应程序为98℃10s、60℃30s、72℃30s，共35个循环。

结果如图2A所示。分析结果可得，本发明的直扩型热启动DNA聚合酶至少可耐受50％的全血，并从中扩增得到目的基因。而商品的热启动DNA聚合酶TaqHS不能耐受全血抑制。

(2)在40％全血中同时扩增3个不同长度的基因片段

以40％EDTA-2Na抗凝血为模板，用本发明中的直扩型热启动DNA聚合酶同时扩增不同长度的基因片段，扩增基因、引物和具体操作如下：

人类固醇21-羟化酶基因(steroid 21-hydroxylase，CYP21)基因，基因长度为320bp，引物如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

二酰基甘油激酶基因(diacylglycerol kinase，DGK)，基因长度为243bp，

DGK-FP：5’-GGAACAAGACACGGCTGGGTT-3’(SEQ ID NO.10)；

DGK-RP：5’-AGCAAGGCAGGGCAGGCAAGT-3’(SEQ ID NO.11)。

bHLH转录因子基因(bHLH transcription factor，bHLH TF)，基因长度为100bp，

bHLH TF-FP：5’-GTCCTTCCCCCGCTGGAAAC-3’(SEQ ID NO.12)；

bHLH TF-RP：5’-GCAGCAGAGATCATCGCGCC-3’(SEQ ID NO.13)。

基于本发明中的PCR反应缓冲液包含50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、3mmol/LMgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、0.1mg/L BSA、0.05％Tween-20、1％DMSO、200nmol/L CYP21-FP/CYP21-RP、DGK-FP/DGK-RP、bHLH TF-FP/bHLH TF-RP，200μmol/LdNTPs，0.05U/μL HS Sso-Taq，适量模板，适量的灭菌ddH₂O。反应程序为95℃10min；95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35个循环。

结果如图2B所示。分析结果可得，本发明的直扩型热启动DNA聚合酶可在40％(v/v)的全血含量的PCR体系中，同时扩增得到三个不同长度的基因片段(320bp、243bp、100bp)。这是Taq DNA聚合酶首次于40％(v/v)的全血中，同时完成三个基因的扩增。

实施例8 HS Sso-Taq的牛奶直扩能力测试

分别以2ng的从鲜牛奶中提纯的基因组DNA及5％、10％、15％、20％(v/v)的鲜牛奶(光明优倍)为模板，用本发明中的直扩型热启动DNA聚合酶以及购买市售品牌Takara的热启动DNA聚合酶HS-Taq同时扩增牛线粒体色素细胞b(Cytochrome,cob)基因，扩增引物，扩增长度为424bp和具体操作如下：

cob-FP：5’-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTA-3’(SEQ ID NO.14)；

cob-RP：5’-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3’(SEQ ID NO.15)。

基于本发明中的PCR反应缓冲液包含50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、3mmol/LMgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、0.1mg/L BSA、0.05％Tween-20、1％DMSO、200nmol/Lcob-FP、200nmol/Lcob-RP，200μmol/L dNTPs，0.05U/μL HS Sso-Taq，适量的灭菌ddH₂O。反应程序为95℃10min；95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35个循环。

市售品牌Takara热启动DNA聚合酶TaqHS的反应体系包含2.5μL10×PCR Buffer，200nmol/Lcob-FP、200nmol/Lcob-RP，200μmol/L dNTPs，0.05U/μL TaqHS，适量的灭菌ddH₂O。反应程序为98℃10s、60℃30s、72℃30s，共35个循环。

结果如图3所示。分析结果可得，本发明的直扩型热启动DNA聚合酶至少可耐受20％的鲜牛奶，并从中扩增得到目的基因。而商品的热启动DNA聚合酶TaqHS只能耐受10％的鲜牛奶。与商品的热启动DNA聚合酶相比，本发明的热启动DNA聚合酶具有更强的直扩能力。

实施例9基于HS Sso-Taq的本发明qPCR反应试剂灵敏度测试

以梯度稀释的重组内参基因U6质粒(U6-pMD 18-T，B2M插入的位置为限制性酶切位点EcorⅤ)为模板，最后一个梯度中重组质粒的拷贝数浓度约为0.2copies/μL，用本发明中的qPCR反应液以及购买市售品牌Takara、Promega同类产品同时扩增U6基因，扩增引物和具体操作如下：

U6-FP：5’-GCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3’(SEQ ID NO.16)；

U6-RP：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.17)。

基于本发明中的qPCR反应液的反应体系包含0.05U/μL HS Sso-Taq、200μmol/LdNTPs、50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、3mmol/L MgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、50mmol/L KCl、0.1mg/L BSA、0.05％Tween-20、4％DMSO、0.4×SYBR Green I、250nmol/L U6-FP、250nmol/L U6-RP，1μL模板，适量的灭菌ddH₂O，反应总体积为20μL。反应程序为95℃，10min；95℃5s、60℃20s、read plate，共40个循环；读取熔解曲线。

市售品牌Takara同类试剂TB

Premix Ex Taq^TMII(TliRNaseH Plus)的反应体系包含10μL 2×

Premix Ex Taq^TMII，400nmol/L U6-FP、400nmol/L U6-RP，1μL模板，适量的灭菌ddH₂O，总体系为20μL。反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃20s、read plate，共40个循环；读取熔解曲线。

市售品牌Promega同类试剂

qPCR Master Mix的反应体系包含10μL2×

qPCR Master Mix，400nmol/L U6-FP、400nmol/L U6-RP，1μL模板，适量的灭菌ddH₂O，总反应体积为20μL。反应程序为95℃2min；95℃3s、60℃30s、read plate，共40个循环，读取熔解曲线。

结果如图4所示。分析结果可得，本发明的qPCR反应试剂可准确检测出浓度为0.2copies/μL的靶基因，具有优良的灵敏度，且扩增效率接近100％，梯度间的线性关系为0.999可进行准确的定量及微量核酸检测。和市售的Promega(A600A)、Takara(RR820)相比具有更高的灵敏度及扩增效率。

实施例10 HS Sso-Taq在qPCR检测中耐受抑制剂性能研究

以1ng重组内参基因B2M质粒(购买得到，B2M-pMD 18-T，B2M插入的位置为限制性酶切位点EcorⅤ)为模板，用等量的HS wt-Taq(热启动野生型Taq DNA聚合酶)及HS Sso-Taq，在不同抑制剂存在的情况下去扩增B2M基因，扩增引物为：

B2M-FP：5’-CTATCCAGCGTACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO.18)，

B2M-RP：5’-GAAAGACCAGTCCTTGCTGA-3’(SEQ ID NO.19)。

各种抑制剂测试qPCR反应体系均包含以下通用成分：0.05U/μL HS wt-Taq/HSSso-Taq、200nmol/L B2M-FP、200nmol/L B2M-RP、200μmol/L dNTPs、50mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl₂、5mmol/L(NH₄)₂SO₄、30～80mmol/L KCl、0.1mg/L BSA、0.05％Tween-20、3％DMSO、0.3mol/L海藻糖、0.2mol/L L-肉毒碱、0.4％NP40，反应体系的pH为8.0。

(1)耐受SYBR GreenΙ性能测试

在上述的通用组分中再分别加入反应终浓度为0ng/μL、0.5ng/μL、1.0ng/μL、2.0ng/μL、4.0ng/μL、8.0ng/μL、10.0ng/μL的SYBR GreenΙ，反应程序均为95℃10min；95℃5s、60℃20s、read plate，共40个循环；读取熔解曲线。结果如图5所示，从结果可以看出HSwt-Taq可耐受最高SYBR GreenΙ浓度为1.0ng/μL，HS Sso-Taq至少可耐受反应浓度为10.0ng/μL的高浓度染料，相对于HS wt-Taq，HS Sso-Taq具有更强的SYBR GreenΙ耐受能力。

(2)耐受腐殖酸性能测试

在上述的通用组分中分别加入反应终浓度为0.4×SYBR GreenΙ(HS wt-Taq)、0.8×SYBR GreenΙ(HS Sso-Taq)，再分别添加终浓度为0μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL的腐殖酸，反应程序均为95℃10min；95℃5s、60℃20s、read plate，共45个循环；读取熔解曲线。结果如图6所示，从结果可以看出，HS Sso-Taq可耐受反应终浓度为1.6μg/mL的腐殖酸，大大提升了野生型Taq DNA聚合酶抗腐殖酸抑制能力。

(3)耐受多糖性能测试

在上述的通用组分中分别加入反应终浓度为0.4×SYBR GreenΙ(HS wt-Taq)、0.8×SYBR GreenΙ(HS Sso-Taq)，再分别添加终浓度为0mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL的黄芪多糖，反应程序均为95℃10min；95℃5s、60℃20s、read plate，共45个循环；读取熔解曲线。结果如图7所示，从结果可以看出HS Sso-Taq可耐受高至反应浓度为0.32mg/mL的黄芪多糖，野生型Taq DNA聚合酶只能耐受反应浓度为0.08mg/mL的黄芪多糖。

(4)耐受免疫球蛋白IgG性能测试

在上述的通用组分中分别加入反应终浓度为0.4×SYBR GreenΙ(HS wt-Taq)、0.8×SYBR GreenΙ(HS Sso-Taq)，再分别添加终浓度为0μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、300μg/mL、600μg/mL的免疫球蛋白IgG，反应程序均为95℃，10min；95℃5s，60℃20s，read plate；共45个循环；读取熔解曲线。结果如图8所示，从结果可以看出HS Sso-Taq可耐受高至反应浓度为600μg/mL的免疫球蛋白IgG，野生型Taq DNA聚合酶几乎不具备抗IgG抑制的性能。

综上所述，本发明的热启动DNA聚合酶具有优异的直扩能力，更强的耐qPCR抑制剂能力，适用于粗样的直接荧光定量PCR。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种直扩型热启动DNA聚合酶及其制备方法与应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 631

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 直扩型热启动DNA聚合酶氨基酸序列

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu

20 25 30

Lys Glu Val Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys

35 40 45

Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly

50 55 60

Ala Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu

65 70 75 80

Lys Gln Lys Lys Gly Gly Val Thr Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala

85 90 95

Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg

100 105 110

Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly

115 120 125

Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu

130 135 140

Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu

145 150 155 160

Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala

165 170 175

Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg

180 185 190

Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser

195 200 205

Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg

210 215 220

Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu

225 230 235 240

Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg

245 250 255

Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu

260 265 270

Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln

275 280 285

Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys

290 295 300

Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala

305 310 315 320

Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu

325 330 335

Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile

340 345 350

His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr

355 360 365

Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro

370 375 380

Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu

385 390 395 400

Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg

405 410 415

Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Arg Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln

420 425 430

Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val

435 440 445

Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile

450 455 460

Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu

465 470 475 480

Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe

485 490 495

Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Leu Arg Lys Thr Leu Glu Glu

500 505 510

Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr

515 520 525

Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu

530 535 540

Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met

545 550 555 560

Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala

565 570 575

Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys

580 585 590

Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly

595 600 605

Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu

610 615 620

Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

625 630

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Sso7d氨基酸序列

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His

20

<210> 3

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 直扩型热启动DNA聚合酶核苷酸序列

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggcgacgg ttaaattcaa gtataagggc gaggagaaag aagtagatat tagcaagatt 120

aagaaagtgt ggcgcgtagg caaaatgatt tctttcacct atgatgaagg aggtggcaaa 180

accggtcgtg gggcggtgtc agaaaaggat gcgccgaagg aacttcttca aatgctggag 240

aaacagaaga agggcggagt gaccagcccg aaagcccttg aggaggcacc atggccaccg 300

cctgaaggtg cgtttgtggg gtttgtgctg agccgtaagg aaccgatgtg ggccgatctg 360

ttggcattgg cagccgcacg tggtggccgc gtgcatcgcg ctccagaacc gtacaaagcg 420

ctgcgggatc tgaaagaggc tcgtggatta ctggcgaagg atcttagcgt gcttgctctt 480

cgcgagggcc tgggtcttcc acctggtgac gatccgatgc ttcttgcata tctgctggat 540

ccgagcaaca ccaccccgga gggcgtggct cgtcggtatg gaggtgaatg gaccgaagaa 600

gccggagaac gtgccgcgtt aagcgagcgg ctgtttgcga atctttgggg tcgtcttgag 660

ggggaagagc gtctgctgtg gctttatcgt gaagtcgagc gtccgcttag tgcagtgtta 720

gcgcacatgg aggccacggg tgttcgttta gacgtggcgt acctgcgtgc gttgagcctg 780

gaagtggcgg aggaaatagc gcggttggag gcggaagttt ttcgcttggc gggtcaccct 840

tttaatctga atagccgtga tcagctggaa cgtgtcctgt tcgatgaact gggcctgccg 900

gccattggga agacagagaa aacaggcaaa cgttcaacca gcgcggcagt gcttgaagct 960

ttacgtgagg cccacccaat tgtggaaaaa atcctgcagt atcgcgaact gaccaaactg 1020

aaaagcacct acattgatcc gctgccggac ctgattcacc cgcgtaccgg acgcctgcat 1080

acccgtttca atcagaccgc gaccgccaca ggccggttga gtagcagcga tcccaactta 1140

cagaacattc cggtgcgtac cccgttaggc cagcgcattc gccgtgcctt tattgcggaa 1200

gagggctggc tgcttgtggc acttgattat agccaaattg aactgcgtgt gttggctcac 1260

ctgtctggcg atcggaacct tatccgggta tttcaggagg gacgtgatat tcatacagaa 1320

accgcgagct ggatgttcgg tgtaccgcgc gaagcagtag atcctctgat gcggcgtgct 1380

gctaagacaa tcaattttgg cgtgttatat ggcatgtccg cccatcgtct gagtcaagaa 1440

ttggcaatac cgtacgaaga ggcgcaggca tttatcgagc ggtattttca gagttttccg 1500

aaagttcggg catggctgcg taaaaccctg gaggaaggtc gccgtcgggg ctacgttgag 1560

actctgtttg ggcgtcggcg ttatgttccg gatctggaag cgcgtgtgaa atccgtgcgg 1620

gaagcagctg aacgcatggc ctttaacatg cctgtgcagg ggaccgccgc tgatctgatg 1680

aaactggcta tggtgaaact tttcccacgc ttggaggaga tgggggctcg tatgttgctg 1740

caggtccatg acgaactggt tttagaagct ccaaaggaac gcgcagaggc agttgcgcgc 1800

ctggctaagg aagttatgga aggtgtgtat ccgttagcgg tgccgctgga ggttgaagtg 1860

ggcataggag aggattggct gagtgcaaaa gaa 1893

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Taq -FP

<400> 4

ggcatatggc gaccgttaag tttaagtac 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Taq -RP

<400> 5

ccatgaattc ttattccttc gcagat 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pET-28a-FP

<400> 6

ggaataagaa ttcatggttg cggccgca 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pET-28a-RP

<400> 7

acggtcgcca tatgccgcgc ggcacca 27

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYP21-FP

<400> 8

gctcagcatg gtggtggcat aa 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CYP21-RP

<400> 9

cctcatacct tcccccccat tt 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DGK -FP

<400> 10

ggaacaagac acggctgggt t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DGK -RP

<400> 11

agcaaggcag ggcaggcaag t 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bHLH TF -FP

<400> 12

gtccttcccc cgctggaaac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bHLH TF -RP

<400> 13

gcagcagaga tcatcgcgcc 20

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cob-FP

<400> 14

aagacgagaa gaccctatgg agcttta 27

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cob-RP

<400> 15

gattgcgctg ttatccctag ggta 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6-FP

<400> 16

gctcgcttcg gcagcacata t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6-RP

<400> 17

cgcttcacga atttgcgtgt c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2M-FP

<400> 18

ctatccagcg tactccaaag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2M-RP

<400> 19

gaaagaccag tccttgctga 20

Claims

1.一种直扩型热启动DNA聚合酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1中所述的直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：是将编码权利要求1中所述的直扩型热启动DNA聚合酶的DNA分子克隆入表达载体得到。

4.一种重组工程细胞株，其特征在于：是将权利要求3中所述的重组表达载体转化入工程细胞得到。

5.根据权利要求1中所述的直扩型热启动DNA聚合酶，其特征在于：

所述的直扩型热启动DNA聚合酶的聚合酶活性位点赖氨酸侧链氨基上特异性结合有酸酐类化合物；所述的酸酐类化合物进一步为柠槺酸酐。

6.权利要求1或5中所述的直扩型热启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

取权利要求4中所述的重组工程细胞株，接种于含抗生素的LB培养基中，在35～38℃条件下，培养至菌液OD₆₀₀达到0.7～0.9，再用IPTG诱导细胞表达蛋白，经分离纯化后得到所述的直扩型热启动DNA聚合酶；

当所述的直扩型热启动DNA聚合酶的聚合酶活性位点赖氨酸侧链氨基上特异性结合有酸酐类化合物时，所述的制备方法还包括如下步骤：

（1）将所述的直扩型热启动DNA聚合酶透析到Tris-HCl缓冲液中；

（2）加入酸酐类化合物，混合均匀，孵育；

（3）将孵育后的酶液透析到储存缓冲液中，即获得稳定的直扩型热启动DNA聚合酶。

7.根据权利要求6中所述的直扩型热启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：

所述的IPTG的用量按终浓度为0.1～0.5 mmol/L计算；

所述的诱导的条件为温度35～38℃、时间2～4h；

所述的分离纯化的方法为先经镍离子亲和层析，再经阴离子交换柱层析；

所述的Tris-HCl缓冲液是浓度为10～30 mmol/L、pH=9～10的Tris-HCl缓冲液；

所述的直扩型热启动DNA聚合酶与所述的酸酐类化合物的配比为摩尔比1:50～1:100；

所述的孵育的条件为温度40℃～50℃、时间2～5 h；

所述的储存缓冲液的配方为：20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl， 0.1 mmol/LEDTA，50%甘油，1 mmol/L DTT，0.5% Tween-20，0.5% IGEPAL®CA-630，pH8.0。

8.一种qPCR反应试剂盒，其特征在于：包含PCR反应缓冲液、SYBR Green I、PCR用水和dNTPs中的至少一种，以及权利要求1或5中所述的直扩型热启动DNA聚合酶；

所述的SYBR Green I在体系中的浓度为0.2~10 ng/μL；

所述的直扩型热启动DNA聚合酶在体系中的浓度为0.02～0.05 U/μL；

所述的dNTPs在体系中的浓度为100～300μmol/L。

9.根据权利要求8所述的qPCR反应试剂盒，其特征在于：

所述的PCR反应缓冲液包含如下组分：20～100 mmol/L Tris-HCl、1～3 mmol/L MgCl₂、5～20 mmol/L (NH₄)₂SO₄、20～80 mmol/L KCl、0.1～0.4 mg/L BSA、0.05%～0.1% Tween-20、1%～6% DMSO，pH值为8～10；

所述的PCR反应缓冲液还包含海藻糖、乙基苯基聚乙二醇和L-肉毒碱中的至少一种；

所述的海藻糖在体系中的浓度为0.1～0.4 mol/L；

所述的乙基苯基聚乙二醇在体系中的浓度为0～0.4%；

所述的L-肉毒碱在体系中的浓度为0.1～0.3 mol/L。

10.权利要求8或9中所述的qPCR反应试剂盒在DNA样本扩增中的应用。