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CN119506241A - 改造的Klenow片段及应用 - Google Patents

改造的Klenow片段及应用 Download PDF

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CN119506241A
CN119506241A CN202411443347.3A CN202411443347A CN119506241A CN 119506241 A CN119506241 A CN 119506241A CN 202411443347 A CN202411443347 A CN 202411443347A CN 119506241 A CN119506241 A CN 119506241A
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CN
China
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klenow fragment
sequencing
modified
amino acid
modified klenow
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Application number
CN202411443347.3A
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陈清斌
陈巍月
李红丹
林霞
王文
骆玮玮
孙雷
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Genemind Biosciences Co Ltd
Original Assignee
Genemind Biosciences Co Ltd
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Abstract

本发明涉及改造的Klenow片段及应用，具体地，涉及一种改造的Klenow片段，该改造的Klenow片段氨基酸序列上的F762、A842、I709和P603中的至少一个位置或者功能等效的位置包含至少一个氨基酸置换突变。本发明提供的改造的Klenow片段的DNA聚合酶活性较野生型Klenow片段高，并且，将该改造的Klenow片段应用在测序中，能够提高测序能力和测序数据质量如提高读长和/或降低连续重复碱基比例等。

Description

改造的Klenow片段及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种改造的Klenow片段及应用。
背景介绍
Klenow酶，也叫Klenow片段或者Klenow大片段，是大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理后得到的两个片段中的分子量较大的那个片段。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性、缺少5ˊ-3ˊ外切酶活性，常用于补平DNA单链末端。另外，试验也常使用的exo-Klenow片段，是Klenow片段的突变体，为不具有外切酶活性的Klenow片段，该酶也常表示为Klenow片段(3'→5'exo-)。
Klenow片段或exo-Klenow片段可在37摄氏度进行聚合反应/扩增，因而利用Klenow片段或exo-Klenow片段进行扩增反应对实验设备等的温控要求相对较低；并且，Klenow片段或者exo-Klenow片段相对于DNA聚合酶I来说，分子量较小，合成相应的核酸序列来构建表达载体相对较容易，便于制备，利于工业应用。
Klenow片段或exo-Klenow片段的扩增效果与该聚合酶本身的特性包括合成能力、保真度/校正能力、特异性/酶活性以及稳定性有关，也与反应环境包括反应条件有关，如测序缓冲液、核苷酸种类、固体介质表面结构(与酶的吸附作用)等。可能由于Klenow片段不耐高温、聚合能力偏低或者说该酶整体表现出的性能相对弱，目前市场上的扩增平台包括测序平台等较少使用该酶，也较少对该酶进行改造。
提升或者调整Klenow片段的某一方面性能，利于增加其工业实用性。
发明内容
发明人利用野生型Klenow片段和市售的Klenow片段试剂盒进行测试发现：野生型Klenow片段或其常见突变体exo-Klenow片段，在核酸序列扩增中尤其在测序反应中，不能获得较好的结果，如利用该些酶进行核苷酸延伸反应例如测序，获得的测序平均读长和有效数据量等测序指标均较不理想；而且，相较于市售的Klenow片段，野生型Klenow片段和exo-Klenow片段在测序中表现出的性能相对更弱。
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题至少之一。
为此，本发明的第一方面提供了一种改造的Klenow片段，该改造的Klenow片段氨基酸序列上的F762、A842、I709和P603中的至少一个位置或者功能等效的位置包含至少一个氨基酸置换突变。这里，改造的Klenow片段氨基酸序列上的氨基酸位置编号，以DNA聚合酶I(UniPRotKB登录号：P00582，https://www.uniPRot.org/uniPRot/P00582)为基准，如F762，表示该改造的Klenow片段氨基酸序列上对应于DNA聚合酶I的氨基酸序列的第762位的F(苯丙氨酸)存在突变。
在一些示例中，所称的氨基酸置换突变选自功能相当于F762Y、A842K、A842H、A842R、I709K、I709H、I709R和P603K置换突变中的至少一种。在一些示例中，例如，该改造的Klenow片段的错义突变为下列1)-14)中的任意一种：1)F762Y；2)A842K；3)I709K；4)F762Y和A842K；5)F762Y、A842K和P603K；6)A842K和I709K；7)F762Y和I709K；8)F762Y、A842K和I709K；9)A842H和I709K；10)A842K和I709H；11)A842H和I709H；12)A842R和I709K；13)A842K和I709R；14)A842R和I709R。在另一些示例中，该改造的Klenow片段为混合酶，例如为上述具有1)-14)中的两种或者两种以上的改造的Klenow片段的混合物。
本发明这一方面提供的改造的Klenow片段均具有较高的合成能力包括较快的合成速度和/或与底物较高的亲和力，应用于测序时，表现出与修饰的核苷酸和/或生长的DNA链有较强的兼容性，利于获得更长的读长和/或提高高质量数据的占比。
关于突变的命名规则，本文采用本领域公认的人类基因组变异协会制定的规则(HGVS突变命名规则)，如p.Trp26Cys，表示以蛋白质为参考序列、第26位的Trp被Cys取代；如无特别说明，本文提及的突变均为氨基酸突变，参考序列为蛋白质，书面表示该些突变时，均省略“p.”。
可以理解地，相同功能的突变可以有多种不同的表示方式，例如，以不同类型的参考序列为基准，如以基因组DNA和以蛋白质为参考序列，相同的突变具有不同的表示方式，再例如，以相同蛋白的一部分或者全部作为参考序列，突变的位置编号可能不同；依据具体参考序列信息，本领域人员能够知晓和识别出不同表示方式包括以不同位置编号表示的相同功能位置的相同突变，该些以不同表示方式表示与本发明该方面提供的相同突变的改造的Klenow片段，均属于本发明该方面所称的改造的Klenow片段。
为了直观显示发明人经过突变、测试、来回筛选验证后而提供的改造的Klenow片段的性能，在一些示例中，将该(些)改造的Klenow片段和商业化的Klenow片段分别应用于测序，进行结果对比，所称的商业化的Klenow酶包括NEB公司的Klenow片段(NEB公司，货号M0407B)和Vazyme公司的Klenow片段(诺唯赞公司，货号N105-C1)；另外，通过试验测试该(些)改造的Klenow片段的特性，并与野生型Klenow片段的进行对比。
所称的野生型Klenow片段同一般所说的野生型，相对于突变型，指自然群体中最常见的类型；在一些示例中，为利于制备在野生型氨基酸序列的末端引入一段不影响酶反应性能的已知序列的Klenow片段，该带有一段已知序列的Klenow片段，也称为野生型或带标签的野生型Klenow片段；在一些示例中，为利于制备在改造的Klenow片段氨基酸序列的末端引入一段不影响酶反应性能的已知序列的改造的Klenow片段，该带有一段已知序列的改造的Klenow片段，也称为改造的Klenow片段或带标签的改造的Klenow片段或带标签的突变型Klenow片段。
所称的测序，指的是利用Klenow片段的反应性能将带有可检测信号的核苷酸连接至核苷酸片段末端，并根据检测到的可检测信号种类确认连接的核苷酸或碱基的种类，所称的可检测信号包括荧光信号，如Cy5，Cy3等。
在下文涉及的酶的性能包括应用于测序获得的效果的描述中，如无例外说明，所称的BRR(base repeat ratio)为重复碱基比例，表示被检测到连续发出信号或者连续发出一种信号的某个待检测位置对应的碱基数目占碱基总数的比例。出于正常序列包含多个连续重复碱基是少见的来定义该术语，例如，正常序列包含一段或多段包含5个或5个以上连续重复碱基，是很少见的，确定该定义的术语的数值大小能一定程度上反映测得的数据为客观/真实的可能性大小。测序一般包括多轮反应(cycle)以能测定出一段具有特定长度的序列(读段)，定义完成一次四种核苷酸的碱基延伸反应为一轮反应，在一些示例中，将四种核苷酸分为两次或两次以上加入到反应体系来实现一轮反应，即一轮反应包含多次碱基延伸反应(repeat)，对于正常的序列，在连续的N次碱基延伸反应中，N为大于2的自然数，例如为8，某个位置都发出反应信号或者说都能被读取得碱基/核苷酸的可能性很低，如果该位置连续8次都读取得碱基/核苷酸了，更大可能性说明了该位置上存在核苷酸吸附或者核苷酸-聚合酶复合物吸附，因而在连续的8次碱基延伸反应中该位置均被测到反应信号，通常地，该被连续检测到的反应信号均指向同一种碱基；在另一些示例中，四种核苷酸同时加入到反应体系来实现一轮反应，即一轮反应包含一次碱基延伸反应，对于正常的序列，在连续的N次碱基延伸反应中，N为大于2的自然数，例如为6，某个位置被连续6次测到发出相同的信号或者说被识别为一段6bp的重复碱基，相较于待测序列上真实存在该段6bp重复碱基，更大可能地，该位置上存在核苷酸吸附或者核苷酸-聚合酶复合物吸附，因而连续发出相同信号。关于BRR的计算，在一些示例中，例如，设置N为8，在某次测序中，识别出的碱基/核苷酸总数为1000，识别出了三段不小于8的连续重复序列，如分别包括8、10和9个碱基，那么，相应的BRR为(8+10+9)/1000。一般地，BRR越低，说明吸附性越低。
在一个示例中，所称的改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于F762Y的置换突变。含有F762Y突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR1的Klenow片段)DNA聚合酶的活性显著高于野生型Klenow片段(如实施例中编号为PR0的Klenow片段)，在多次测试中，PR1的聚合酶活性为PR0的1.62倍或以上。PR1在含有Mn2+的溶液中测序结果与不知具体突变位点的NEB公司、Vazyme公司(诺唯赞公司)的Klenow片段的测序结果相当或者较优，利用PR1进行测序获得的平均读长分别为后两种酶的1.17倍和1.36倍。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于F762Y和A842K的置换突变。含有F762Y和A842K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR5的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性提高，在多次测试中，PR5的DNA聚合酶活性为PR0的1.29倍。PR5的测序结果分别与PR1、Vazyme公司的Klenow片段进行对比，利用PR5进行测序获得的平均读长分别为利用后两种酶的0.96倍和1倍，测序结果中的BRR(重复碱基比例)相较于两种酶降低。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于F762Y、I709K的置换突变。含有F762Y和I709K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR8的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性提高，在多次测试中，PR8的DNA聚合酶活性为PR0的1.33倍。PR8在含有Mg2+的缓冲液中的测序结果与Vazyme公司的Klenow片段进行对比，两者测序获得的平均读长相当，但PR8在含有Mn2+的溶液中进行测序时测序读长在短片段处有停滞。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于F762Y、A842K和P603K的置换突变。含有F762Y、A842K和P603K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR6的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0的DNA聚合酶活性提高，在多次测试中，PR6的DNA聚合酶活性为PR0的1.33倍。PR6的测序结果和Vazyme的Klenow片段进行对比：PR6在含有Mg2+缓冲液中进行测序时测序读长在短片段有停滞，在含有Mn2+的缓冲液中利用PR6进行测序获得的平均读长和的Vazyme的Klenow片段相当、且PR6测序结果的BRR为Vazyme的Klenow片段的0.82倍。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于F762Y、A842K和I709K的置换突变。含有F762Y、A842K和I709K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR9的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性显著提高，在多次测试中，PR9的DNA聚合酶活性为PR0的1.67倍。PR9的测序结果和Vazyme的Klenow片段进行对比：PR9在含有Mn2+缓冲液中进行测序时测序读长在短片段处有停滞，在含有Mg2+的缓冲液中可有效进行测序，但测序获得的平均读长比Vazyme的Klenow片段短。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于A842K或A842H或A842R的置换突变，置换后的氨基酸为碱性氨基酸。含有A842K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR2的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性提高，在多次测试中，PR2的DNA聚合酶活性为PR0的1.05倍。在含有Mn2+的缓冲液中的测序效果优于NEB公司的Klenow片段、Vazyme公司的Klenow片段，测序平均读长分别为后两种酶的1.03倍和1.04倍，且含有Mn2+的缓冲液中的测序效果优于含有Mg2+的缓冲液。。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于A842K和I709的置换突变，其中I709的置换突变类型可为I709K或I709H或I709R。含有A842K和I709K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR7的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性明显提高，在多次测试中，PR7的DNA聚合酶活性为PR0的1.43倍。利用PR7测序获得的平均读长是Vazyme的Klenow片段的1.15倍；PR7测序结果中的BRR比Vazyme的Klenow片段、PR3的低。不同的缓冲液条件下，PR7扩增能力不同，在含有Mg2+的条件下，扩增能力最强，在含有Mn2+无Mg2+的条件下，扩增能力降低，测序读长在短片段处有停留；同时，在Mn2+、Mg2+同时存在的条件下，PR7可进行有效扩增，测序获得的均读长长于Vazyme的Klenow片段。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于I709K的置换突变。含有I709K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR3的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性显著提高，在多次测试中，PR3 DNA聚合酶活性为PR0的1.67倍。利用PR3测序获得的平均读长为NEB的Klenow片段的1.01倍，两者平均读长相当。PR3可有效降低BRR，PR3测序结果中的BRR是NEB的Klenow片段的0.65倍。PR3在含有Mn2+测序缓冲液中测序读长在短片段处停留严重。
在一个示例中，改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于P603K的置换突变。含有I709K突变的Klenow片段(如实施例中的编号为PR4的Klenow片段)相较于野生型的Klenow片段PR0 DNA聚合酶活性显著提高，在多次测试中，PR4的DNA聚合酶活性为PR0的1.24倍。PR4在含有Mn2+的缓冲液中的测序效果优于在含有Mg2+的缓冲液的测序效果。PR4在缓冲液I中进行测序时获得的平均读长在短长度片段处停留，PR4在含有Mn2+的缓冲液中进行测序时测序的平均读长和Vazyme的Klenow片段的相当，两种酶测序结果中的BRR相当。PR4在含有Mn2+的缓冲液中的测序获得的平均读长是Vazyme的Klenow片段的1.07倍。
在一个示例中，改造的上述Klenow片段的氨基酸序列还包含功能相当于C907A的置换突变和/或功能相当于D355A和E357A的置换突变。
在一个示例中，上述改造的Klenow片段的氨基酸序列的至少一个末端带有一段长度小于12个氨基酸(12aa)的已知序列，该已知序列可以位于Klenow片段氨基酸序列的C端或N端，在本发明中该已知序列位于Klenow片段氨基酸序列的N端。已知序列不影响Klenow片段的活性，添加的已知序列包含6-10个组氨酸残基，如GSSHHHHHHSSG(SEQ ID NO:1)和HHHHHHHHHH(SEQ ID NO:7)。利用此已知序列中组氨酸(H)与含Ni的纯化柱中的Ni结合反应，用于纯化含此标签的蛋白。在本发明中，已知序列N端和C端添加了具有柔性结构的N的小分子甘氨酸和丝氨酸，可有效降低已知序列对于Klenow片段活性的影响。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，该核酸分子编码本发明第一方面提供的改造的Klenow片段。氨基酸突变位点的核苷酸密码子可能存在多种情况，如络氨酸密码子可以选择TAT和/或TAC，赖氨酸密码子可选择AAA和/或AAG。未突变的Klenow片段位点，对应的核苷酸序列与DNA聚合酶I(UniPRotKB：P00582)的324-928aa的核苷酸序列一致。
本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体包含本发明第二方面提供的核酸分子，使用的载体可用于保存目的核苷酸片段，如pET-28a及相关系列载体。
本发明第四方面提供了一种一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明第三方面提供的表达载体。宿主细胞可以用于表达载体蛋白，如大肠杆菌细胞BL21。
本发明第五方面提供了本发明第一方面提供的改造的Klenow片段在核酸序列延伸反应中的应用，核酸序列延伸反应包括常规PCR、核酸测序和DNA末端补平等实验，其中DNA指的是脱氧核糖核酸链，包括cDNA。改造的Klenow片段和野生型的Klenow相比，聚合酶活性提高，且能和测序体系很好兼容，从而可进行有效测序，测序质量提高，如测序获得的平均读长增加等。
本发明第六方面提供了一种使核苷酸结合到DNA中的方法，包括(a)发明第一方面提供的改造的Klenow片段任一一种或其混合物、(b)DNA和(c)核苷酸溶液发生相互作用。其中核苷酸溶液中的核苷酸为荧光分子修饰的核苷酸或核苷酸类似物，如PCT/CN2018/118259公开的核苷酸或Illumina公司公开的适用于二台测序平台的核苷酸等，优选的核苷酸种类为PCT/CN2018/118259公开的核苷酸或其类似结构的核苷酸。本发明中的结合指的是利用改造的Klenow片段的聚合酶活性将核苷酸连接在核苷酸序列末端。
常规的Klenow扩增反应溶液在测序过程中改造的Klenow片段不能进行有效扩增。改造的Klenow片段的有各自适宜的核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含Mg2+和/或Mn2+，在一示例中，当核苷酸结合到DNA中的方法中使用的改造的Klenow片段为实施例中的编号为PR2、PR3、PR7、PR8或PR9的Klenow片段时，核苷酸溶液包含Mg2+但不含Mn2+，且Mg2+的浓度为5mM～10mM。当核苷酸结合到DNA中的方法中使用的改造的Klenow片段为实施例中的编号为PR1、PR2、PR4、PR5或PR6的Klenow片段时，核苷酸溶液包含Mn2+但不含Mg2+，且Mn2+的浓度为0.1mM～5mM。当核苷酸结合到DNA中的方法中使用的改造的Klenow片段为实施例中的编号为PR7时，核苷酸溶液包含Mg2+和Mn2+，其中Mg2+的浓度为5mM～10mM，Mn2+的浓度为0.1mM～5mM。
本发明第六方面提供了一种用于使核苷酸结合到DNA中的试剂盒，试剂盒包含本发明第一方面提供的改造的Klenow片段至少一种。
在一个示例中试剂盒包含含有功能相当于F762Y的置换突变的改造的Klenow片段(如PR1)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和0.1mM～5mMMn2+，且不含Mg2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于F762Y和A842K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR5)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mM Mg2+，且不含Mn2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于I709K和F762Y的置换突变的改造的Klenow片段(如PR8)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mM Mg2+，且不含Mn2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于F762Y、A842K和P603K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR6)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和0.1mM～5mM Mn2+，且不含Mg2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于F762Y、A842K和I709K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR9)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mM Mg2+，且不含Mn2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于A842K或A842H或A842R的置换突变的改造的Klenow片段(如PR2)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mM Mg2+，且不含Mn2+，或者所述的核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和0.1mM～5mM Mn2+，且不含Mg2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于A842K和I709K，或者，A842H和I709K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR7)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mM Mg2+和0.1mM～5mM Mn2+；或者，核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸5mM～10mM Mg2+，且不含Mn2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于I709K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR3)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和5mM～10mMMg2+且不含Mn2+。
在一个示例中，试剂盒包含含有功能相当于P603K的置换突变的改造的Klenow片段(如PR4)和核苷酸溶液，其中核苷酸溶液包含带有荧光分子标记的核苷酸和0.1mM～5mMMn2+，且不含Mg2+。
本发明第七方面提供了上述试剂盒在核酸序列延伸反应中的应用，核酸序列延伸反应包括常规PCR、核酸测序和DNA末端补平等实验，其中DNA指的是脱氧核糖核酸链，包括cDNA。
上述本发明任一方面或者任一实施例提供的改造的Klenow片段的DNA聚合酶活性比野生型Klenow片段的高，能够显著提高聚合反应的效率；
上述本发明任一方面或者任一实施例提供的改造的Klenow片段相对于商业试剂盒的Klenow片段的测序效果在不同方面有不同程度的提高，如平均读长变长、BRR降低等；
另外，需要说明的，在一些示例中，上述本发明任一方面或者任一实施例提供的改造的Klenow片段表现出对不同反应条件的偏好，例如，有的改造的Klenow片段更适合在只有催化离子Mn2+存在的缓冲液中进行扩增反应，如含有突变为P603K的Klenow片段；又例如，有的改造的Klenow片段既适合在含有Mg2+催化离子又适合在同时含有Mg2+和Mn2+催化离子的缓冲液中进行扩增反应，如含有A842K和I709K突变的Klenow片段。
附图说明
图1野生型Klenow片段PR0 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR0、经步骤2纯化后PR0稀释20倍；
图2改造的Klenow片段PR1 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR1、经步骤2纯化后PR1稀释20倍；
图3改造的Klenow片段PR2 SDS-PAGE电泳图：泳道M、1、2分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR2、经步骤2纯化后PR2稀释20倍；
图4改造的Klenow片段PR3 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR3、经步骤2纯化后PR3稀释20倍；
图5改造的Klenow片段PR4 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR4、经步骤2纯化后PR4稀释20倍；
图6改造的Klenow片段PR5 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR5、经步骤2纯化后PR5稀释20倍；
图7改造的Klenow片段PR6 SDS-PAGE电泳图：泳道M、1、2分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR6、经步骤2纯化后PR6稀释20倍；
图8改造的Klenow片段PR7 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR7、经步骤2纯化后PR7稀释20倍；
图9改造的Klenow片段PR8 SDS-PAGE电泳图：23道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR8、经步骤2纯化后PR8稀释20倍；
图10改造的Klenow片段PR9 SDS-PAGE电泳图：泳道1、2、3分别为蛋白分子marker、经步骤2纯化后PR9、经步骤2纯化后PR9稀释20倍；
图11PR0内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道M、1、2分别为DNA分子marker、阴性对照、PR0；
图12改造的Klenow片段PR1内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道M、1、2分别为DNA分子marker、阴性对照、PR1；
图13改造的Klenow片段PR2内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道M、1、2分别为DNA分子marker、阴性对照、PR2；
图14改造的Klenow片段PR3内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道M、1、2分别为DNA分子marker、阴性对照、PR3；
图15改造的Klenow片段PR4内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道1、2、3分别为DNA分子marker、阴性对照、PR4；
图16改造的Klenow片段PR5内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道1、2、3分别为DNA分子marker、阴性对照、PR5；
图17改造的Klenow片段PR6内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道M、1、2分别为DNA分子marker、阴性对照、PR6；
图18改造的Klenow片段PR7内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道1、2、3分别为DNA分子marker、阴性对照、PR7；
图19改造的Klenow片段PR8内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道1、2、3分别为DNA分子marker、阴性对照、PR8；
图20改造的Klenow片段PR9内切酶活性检测凝胶电泳图：泳道1、2、3分别为DNA分子marker、阴性对照、PR9；
图21PR1-Mn2+(PR1测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、NEB酶、Vazyme酶测序结果对比图；
图22PR2、PR2-Mn2+(PR2测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、NEB酶、Vazyme酶测序结果对比图；
图23PR3、NEB酶、Vazyme酶测序结果对比图；
图24-1PR4-Mn2+(PR4测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、Vazyme酶测序结果对比图；图24-2PR4、Vazyme酶测序结果对比图；
图25PR5-Mn2+(PR5测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、PR1-Mn2+(PR1测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、Vazyme酶测序结果对比图；
图26PR6、PR6-Mn2+(PR6测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、Vazyme酶测序结果对比图；
图27-1PR7不同反应条件下的测序结果与Vazyme酶测序结果对比图；图27-2PR7、PR3测序结果对比图；
图28PR8、PR8-Mn2+(PR8测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、Vazyme酶测序结果对比图；
图29PR9、PR9-Mn2+(PR8测序缓冲液中Mg2+替换为Mn2+)、Vazyme酶测序结果对比图。
实施例
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
1、重组菌的制备
DNA聚合酶I(UniPRotKB：P00582)的324-928aa为Klenow酶对应的氨基酸片段，本实施例中的改造的Klenow片段是在Klenow酶的氨基酸片段的N端有1个标签序列及一个甲硫氨酸，改造的Klenow片段即为：甲硫氨酸-标签序列-DNA聚合酶I的324-928位的氨基酸。标签序列由12个氨基酸组成：甘氨酸-2个丝氨酸-6个组氨酸-2个丝氨酸-甘氨酸(GSSHHHHHHSSG)(SEQ ID NO.1)，标签序列对应的核苷酸序列为：GGCAGCAGCCACCACCACCACCACCACAGCAGCGGT(SEQ ID NO.2)，甲硫氨酸对应的核苷酸为ATG，本实施例中的野生型的Klenow片段核苷酸序列与DNA聚合酶I(UniPRotKB：P00582)324-928氨基酸对应的核苷酸序列一致。
合成改造的Klenow片段的编码基因，将pET-28a(Novagen)的NcoI和XhoI识别序列间的DNA片段替换为改造的Klenow片段的编码基因，得到重组载体，将该重组载体命名为V-PR。将V-PR导入大肠杆菌BL21(DE3)(天根生化科技(北京)有限公司)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-V-PR。BL21-V-PR表达改造的Klenow片段PR。
Klenow编码基因无突变时，BL21-V-PR表达的Klenow片段为PR0。
合成含有在Klenow编码基因区域有突变的核苷酸序列，编码表达的改造的Klenow片段分别为PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9。改造的Klenow片段突变位点及突变类型见下表1：
表1
2、Klenow片段PR的制备
2.1诱导表达
将步骤1得到的重组菌BL21-V-PR接种于5ml Kan-LB培养基(Kan-LB培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50μg/ml的液体培养基)中进行培养，37℃，220rpm，过夜；将所得菌液，按1:50接种于30ml Kan-LB培养基中培养，37℃，220rpm，4h；将所得菌液，按1:50接种于250ml Kan-LB培养基中，37℃，220rpm培养约4h；待OD600值达0.6左右，按向培养所得菌液中添加IPTG至其在菌液中的终浓度为0.5mM，然后30℃220rpm下培养过夜(约16h)；8000rpm，10min收集BL21-V-PR菌体。同时设不加IPTG作为空白对照，收集未诱导BL21-V-PR菌体。
2.2菌体破碎与纯化
取步骤2.1的BL21-V-PR菌体，按1g菌体:20ml亲和液(50mM Tris，200mMNaCl，5％Glycerol，PH 7.5)的比例用亲和A液重悬菌体，得到菌体重悬液1；向菌体重悬液1中加入苯甲基磺酰氟、Triton X-100与溶菌酶，得到菌体重悬液2，菌体重悬液2中苯甲基磺酰氟、TritonX-100与溶菌酶的终浓度分别为0.25mM、0.5％(体积百分比浓度)和2.5mg/100mL；将菌体重悬液2室温孵育30min，40％功率(约400W)超声2s停2s共30min，12000rpm4℃离心超声产物30min后收集上清液。
将上清液用0.45μm的注射式滤器(Life Sciences)过滤后，将上清液上样进行Ni柱亲和层析(亲和层析预装柱HisTrap HP，5ml，17-5248-02，GE healthcare)，上样后利用亲和buffer 1(50mMTris，200mM NaCl，10mM imidazole，5％Glycerol，PH 7.4)平衡10CV；3％亲和buffer2(50mMTris，1MNaCl，500mM imidazole，5％Glycerol，PH 7.4)洗脱5CV；50％亲和buffer2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的Ni柱亲和层析洗脱液。
将大于等于100mAU峰值对应的洗脱液使用离子buffer1(25mM Tris，50mMNaCl，5％Glycerol，PH 7.4)过夜透析，而后取透析后的溶液按一定的流速上样进行阳离子交换层析(离子交换预装柱HiTrap SP HP，5ml，17-1152-01，GE healthcare)，上样后用离子buffer1平衡10CV；3％离子buffer2(50mM Tris，1MNaCl，5％Glycerol，PH 7.40)洗脱5CV；50％离子buffer2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的SP柱阳离子交换层析洗脱液收集洗脱液使用透析袋(spectrumlabs，131267)于透析液(20mM Tris，200mM KCl，0.2mMEDTA，5％Glycerol)中透析24小时后，定量至0.5mg/ml并含50％的甘油，即得到纯化后的Klenow片段PR溶液，得到的Klenow片段PR分别为PR0、PR1、PR2、PR3、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9。
3、PR蛋白检测
(1)SDS-PAGE电泳
将20μl浓度为1mg/ml的步骤2得到的改造的Klenow片段PR与20μl上样缓冲液(生工，C508321-0205)混匀后得到液体1，将10μl浓度为0.05mg/ml的步骤2得到的改造的Klenow片段PR与10μl上样缓冲液混匀后得到液体2，分别取10μl液体1与液体2进行SDS-PAGE电泳，结果如图1，纯化后的改造的Klenow片段PR纯度大于95％。改造的Klenow片段PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9的纯度均大于95％，结果分别如图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10。
(2)内切酶活性检测
利用表2的反应体系检测步骤2得到的改造的Klenow片段PR的内切酶活性：
表2
反应缓冲液1：10mM Tris，10mM kcl，1mM MgSO4，PH 7.4。
将表2的反应体系37℃温浴4h后，加入1μl 0.5M EDTA终止反应。使用GelExtraction Kit(omegabio-tek)纯化反应产物。用水替换PR改造的Klenow片段作为阴性对照(NC)。而后进行1％琼脂糖凝胶电泳，pUC19质粒主带未被降解，和阴性对照的凝胶电泳图的条带一致，证明PR改造的Klenow片段无内切酶污染，PR0、PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9均无内切酶污染，结果分别如图11、图12、图13、图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20。
(3)DNase活性检测
本实验采用Thermo Fisher Scientific的货号为AM1970M的试剂盒进行DNase活性检测。
实验流程：1ml TE缓冲液(Thermo Fisher Scientific，货号：AM1970M)重悬DNaseAlert Substrate(Thermo Fisher Scientific)，确保底物完全溶解。取重悬后的DNaseAlert Substrate，每孔5μl加入到384孔板内，向样品孔内加入40μl步骤2得到的改造的Klenow片段PR酶，混匀。并设置阴性对照与阳性对照，阴性对照为利用等体积的无核酸酶水替换PR1改造的Klenow片段酶液，阳性对照为用无核酸酶水将10×Nuclease Alert Buffer(invitrogen)稀释10倍至1×溶液，再用1×溶液将标准品DNase I(Thermo FisherScientific，货号：AM1970M)五倍稀释后，取2.5μl加入阳性对照孔内，同时加37.5μl无核酸酶水补足体系、震荡混匀。
37℃孵育10min后，Gen5酶标仪检测。根据检测的荧光值，计算得到改造的Klenow片段PR的Dnase活性为0.002U/μl，无DNASE活性。PR1、PR2、PR3、PR4、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9的Dnase活性分别为0.001U/μl、0.001U/μl、0.001U/μ、0.001U/μl、0.002U/μl、0.002U/μl、0.001U/μl、0.001U/μl、0.002U/μl。
4、以dNTP为底物检测改造的Klenow片段PR的DNA聚合酶活性
采用酶稀释缓冲液(20mMpH 7.4Tris和100mM KCl，溶剂为水)，将20μl步骤2得到的改造的Klenow片段PR(0.5mg/ml)于圆底96孔板内按照8、16、30、64、128倍梯度稀释，最后得到稀释128倍的改造的Klenow片段PR，然后按表3的反应体系进行反应。
表3
组分 体积
annealedmixture 2.5μl
10mMdNTP 1.25μl
稀释128倍的改造的Klenow片段PR 3μl
反应缓冲液2 12.5μl
H2O 5.75μl
反应缓冲液2：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2和100μg/ml BSA，pH 7.9，置于25℃。表3中的annealedmixture的组分及配比如表4所示：
表4
组分 体积
30μMtemplate(模板) 2.5μl
30μMprimer(引物) 2.5μl
2*reactionbuffer(反应缓冲液) 12.5μl
H2O 7.5μl
以H2O作为阴性对照，设三个平行，将反应体系放置在PCR仪内37℃孵育30min，迅速置于冰上，1μl 50mM EDTA终止反应。其中，2*reactionbuffer：10mM Tris，50mMNaCl，pH为7.4；模板(template)：ATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAGAGCATTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGT(SEQ ID NO.3)；primer(引物)：TAGACTCCTGT(SEQ ID NO.4)。
反应结束后取终反应液2μl至预先加入38μl TE缓冲液的96孔板内，枪头吹打混匀后取10μl至预先加入40μl TE缓冲液的黑色平底96孔板内；在此96孔板其他孔内将500ng/mlλDNA按2倍法进行梯度稀释，取各稀释梯度的稀释液50μl作为标准品至新孔内。使用TE缓冲液将Picogreen(Thermo Fisher Scientific)染料稀释200倍后取50μl加入上述样品孔中混匀，室温避光静置2min。在激发光480nm发射光520nm下检测荧光。检测得到PR0的128倍稀释酶液聚合dNTP量为0.21nmol；PR1、PR2、PR3、BG8、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9聚合dNTP量分别为0.34nmol、0.22nmol、0.35nmol、0.26nmol、0.27nmol、0.28nmol、0.3nmol、0.28nmol、0.35nmol。DNA聚合酶活性比＝检测到的聚合dNTP量之比，具体计算结果见表5：
表5
计算结果表明，与PR0相比，其它PR突变体的聚合酶活性均有提高。
5、测序效果检测
将PR1、PR2、PR3、BG8、PR5、PR6、PR7、PR8、PR9在GenoCare测序平台对合成的已知序列作为模板进行测序。对照酶为NEB的Klenow片段(货号M0407B)和Vazyme的Klenow片段(N105-C1)。Genocare平台的搭建可参考CN201610209150.2，CN201710607295.2公开的内容，测序流程可参见https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188181(Single moleculesequencing of the M13 virus genome without amplification)文章中的测序流程。合成的已知序列为5’-TATTGATTCTCAAACTTACTCAAAATTAATTTTTAAATAACATTCTAACAAAATACCTCACTGGGTGC GGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTA-3’(SEQ ID NO.5)。本实施例中测序所用的芯片探针为5’-TACTTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAG-3’(SEQ IDNO.6)，探针5’固定在芯片上，且探针5’连接FAM荧光。
测序流程为：
1)将模板与芯片探针进行杂交；
2)然后将荧光标记的dNTP、Klenow酶加入芯片中，其中dNTP储存在缓冲液I中，形成核苷酸溶液，其中缓冲液I的组成为20mM Tris-HCI，pH 8.8，10mM MgSO 4，10mM(NH4)2SO4，10mM HCI，and0.1％Triton X-100；Klenow片段取100U加入芯片中；
3)在37摄氏度反应条件下进行测序反应。
为了排除测序芯片对实验结果的影响，在同一测序芯片上对本实施例的Klenow酶和对照酶进行测序检测。
实验结果：
将改造的Klenow片段的测序结果与NEB公司的Klenow片段、Vazyme公司的进行对比，分析改造的Klenow片段的测序能力。
PR1：
PR1在含有Mn2+的溶液中测序效果比在含有Mg2+的溶液中测序效果好，PR1在含有Mn2+的溶液中测序效果比NEB公司的Klenow片段、Vazyme公司的Klenow片段的更好，平均读长分别为后两种酶的1.17倍、1.36倍。具体测序结果如图21所示，横坐标为测序读长，纵坐标表示每种测序读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR1-Mn2+：PR1在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为2mM MnSO4或MnCl2后的溶液；NEB：NEB的Klenow片段的测序结果；Vazyme：Vazyme的Klenow片段的测序结果；PR1在含有Mn2+的溶液中平行做了2次测序。
PR2：
PR2在含有Mn2+的缓冲液中的测序效果优于NEB公司的Klenow片段、Vazyme公司的Klenow片段，测序平均读长分别为后两种酶的1.03倍、1.04倍，PR2在含有Mn2+的缓冲液中的测序效果优于含有Mg2+的缓冲液,具体测序结果如图22所示，横坐标为测序读长，纵坐标表示每种测序读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR2：在缓冲液I中PR2的测序结果；PR2-Mn2+：PR2在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为0.5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mM MnSO4或MnCl2后的溶液；NEB：NEB的Klenow片段的测序结果；Vazyme：Vazyme的Klenow片段的测序结果。
PR3：
PR3的测序结果：PR3在含有Mn2+的测序缓冲液中测序，测序读长在短片段处停留严重；PR3在缓冲液I中测序，测序平均读长为NEB公司的Klenow片段的1.01倍，两者平均读长相当。同时，PR3可有效降低测序结果中的BRR，BRR是NEB公司的Klenow片段测序结果的0.65倍。具体测序结果见图23，图23的横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR3：在缓冲液I中PR3的测序结果；NEB：NEB公司的Klenow片段的测序结果；PR3-Mn2+：PR3在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mM MnSO4或MnCl2后的溶液。
PR4：
PR4的测序结果和Vazyme公司的Klenow片段的进行对比，PR4在缓冲液I中测序时获得的平均读长在短片段处有停滞；PR4在含有Mn2+的缓冲液测序，测序平均读长和Vazyme公司的Klenow片段的相当、两种酶测序结果中的BRR相当。PR4在含有Mn2+的缓冲液中测序时，测序平均读长是Vazyme公司的Klenow片段的的1.07倍。具体测序结果见图24-1，24-2，横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR4-Mn2+：PR4在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mM MnSO4或MnCl2后的溶液；PR4：在缓冲液I中PR4的测序结果；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
PR5：
PR5在含有Mn2+的缓冲液中测序时测序结果和PR1、Vazyme公司的Klenow片段的进行对比，PR5的测序结果中的BRR比PR1、Vazyme公司的Klenow片段的低，测序平均读长和Vazyme公司的Klenow片段的相当。具体测序结果见表6及图25，图25中横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR1：在缓冲液I中PR1的测序结果；PR5-Mn2+：在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为1mM MnSO4或MnCl2后的溶液；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
表6
PR5-Mn2+/PR1 PR5-Mn2+/Vazyme
BRR 0.78 0.96
平均长度 0.96 1
PR6：
PR6的测序结果和Vazyme公司的Klenow片段的进行对比，PR6在缓冲液I中测序时测序读长在短片段有停滞，PR6在含有Mn2+的缓冲液中测序时获得的平均读长和Vazyme公司的Klenow片段的相当、PR6测序结果中的BRR为Vazyme公司的Klenow片段的0.82倍。具体测序结果见表7及图26，图26中横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR6：在缓冲液I中PR1的测序结果；PR6-Mn2+：PR6在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mMMnSO4或MnCl2后的溶液；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
表7
PR6/Vazyme PR6-Mn2+/Vazyme
BRR 0.99 0.82
平均长度 0.67 1.04
PR7：
分别对PR7和PR3多批次的实验结果进行对比分析，同时比较了PR7和Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。在测序缓冲液为缓冲液I时，PR7测序结果中的测序平均读长是Vazyme公司的Klenow片段的1.15倍，比PR3测序结果中的测序平均读长短；PR7测序结果中的BRR比Vazyme公司的Klenow片段、PR3的BRR低。不同的缓冲液条件下PR7扩增能力不同，在含有Mg2+的条件下，测序效果最好；在有Mn2+无Mg2+的条件下，测序结果中测序读长在短片段处有停滞；同时存在Mn2+、Mg2+的条件下，PR7可进行有效测序，测序平均读长是Vazyme公司的Klenow片段的1.12倍。具体的测序结果见表8和图27-1，27-2，图27-1和27-2中横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；图中PR7、PR7-Mn2+和PR7-Mn-Mg表示PR7在不同测序缓冲液中的测序结果，PR7：PR7在缓冲液I中测序结果；PR7-Mn2+：PR7在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中测序缓冲液是将缓冲液I中的10mMMgSO4替换为MnSO4或MnCl2后的溶液，且Mn2+的浓度为5mM；PR7-Mn-Mg：PR7在同时含有Mn2+和Mg2+的测序缓冲液中的测序结果，测序缓冲液为将缓冲液I中10mM MgSO4的浓度降低至5mM，且MnSO4或MnCl2的浓度为2mM，其它成分与缓冲液I相同；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
表8
PR7/Vazyme PR7/PR3 PR7-Mn/Vazyme PR7-Mn-Mg/Vazyme
BRR 0.44 0.97 0.78 1.18
平均长度 1.15 0.73 0.89 1.12
PR8：
在缓冲液I中测序时，PR8可以进行有效测序，PR8测序结果中测序平均读长为9.43，比Vazyme公司的Klenow片段的平均读长短。同时，PR8在含有Mn2+的溶液中测序时，测序读长在短片段处有停滞。
具体测序结果见图28，图28横坐标为测序读长，纵坐标表示每种读长的数量占所有测序读长总数的百分比；PR8：在缓冲液I中PR8的测序结果；PR8-Mn2+：PR8在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为1mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mM MnSO4或MnCl2后的溶液；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
PR9：
PR9在含有Mn2+的溶液测序时，测序读长在短片段处有停滞，PR9测序结果中的测序平均读长为10.59，比Vazyme公司的Klenow片段的测序平均读长短。PR9在缓冲液I中可以进行有效测序。具体测序结果见图29，PR9-Mn2+：G33在含有Mn2+的测序缓冲液中的测序结果，其中Mn2+的浓度为5mM，测序缓冲液为将缓冲液I中的10mM MgSO4替换为5mM MnSO4或MnCl2后的溶液；PR9：测PR9在缓冲液I中的测序结果；Vazyme：Vazyme公司的Klenow片段的测序结果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段用于核酸测序，以DNA聚合酶I为基准，所述改造的Klenow片段氨基酸序列存在氨基酸置换突变，且所述氨基酸突变为A842K和I709K的置换突变。
2.根据权利要求1所述的改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段氨基酸序列的至少一个末端带有一段长度小于12aa的已知序列；
任选地，所述已知序列位于所述改造的Klenow片段氨基酸序列的N端；
任选地，所述已知序列包含6-10个组氨酸残基；
任选地，所述已知序列选自GSSHHHHHHSSG和HHHHHHHHHH中的至少一种。
3.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1或2所述的改造的Klenow片段。
4.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的载体。
6.一种使核苷酸结合到DNA中的方法，其特征在于，包括(a)如权利要求1-2任一所述的改造的Klenow片段或者改造的Klenow片段的混合物、(b)DNA和(c)核苷酸溶液发生相互作用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述(c)核苷酸溶液包含的核苷酸为带有荧光分子标记的核苷酸；
任选地，所述(c)核苷酸溶液包含Mg2+和/或Mn2+；
任选地，(a)包含改造的Klenow片段，所述改造的Klenow片段包含功能相当于A842K置换突变的改造的Klenow片段，(c)核苷酸溶液包含Mn2+但不含Mg2+，所述Mn2+的浓度为0.1mM～5mM；
任选地，(a)包含改造的Klenow片段，所述的改造的Klenow片段的氨基酸序列包含功能相当于A842K和I709K的置换突变(c)核苷酸溶液包含Mg2+和Mn2+，所述Mg2+的浓度为5mM～10mM，所述Mn2+的浓度为0.1mM～5mM。
8.一种用于使核苷酸结合到DNA中的试剂盒，包括权利要求1或2所述的改造的Klenow片段。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括核苷酸溶液；
任选地，所述核苷酸溶液包含的核苷酸为带有荧光分子标记的核苷酸；
任选地，所述试剂盒包含改造的Klenow片段和核苷酸溶液，所述核苷酸溶液包含Mg2+但不含Mn2+，所述Mg2+的浓度为5mM～10mM；所述改造的Klenow片段的氨基酸序列存在如下氨基酸置换突变组合：A842K和I709K的置换突变；
任选地，所述试剂盒包含改造的Klenow片段和核苷酸溶液，所述核苷酸溶液包含Mg2+和Mn2+，所述Mg2+的浓度为5mM～10mM，所述Mn2+的浓度为0.1mM～5mM；所述改造的Klenow片段的氨基酸序列存在如下两个氨基酸置换突变：A842K和I709K的置换突变。
10.权利要求8或9所述的任一试剂盒在核酸序列延伸反应的应用。
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