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KR102286025B1 - 유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소를 이용한 질량분석법 - Google Patents

유전자 변이 특이성이 증가된 dna 중합효소를 이용한 질량분석법 Download PDF

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KR102286025B1
KR102286025B1 KR1020200003943A KR20200003943A KR102286025B1 KR 102286025 B1 KR102286025 B1 KR 102286025B1 KR 1020200003943 A KR1020200003943 A KR 1020200003943A KR 20200003943 A KR20200003943 A KR 20200003943A KR 102286025 B1 KR102286025 B1 KR 102286025B1
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Abstract

본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용한 질량분석법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 Taq 중합효소를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 DNA 중합효소, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용한 질량분석법 {MASS SPECTROMETRY USING DNA POLYMERASES WITH INCREASED MUTATION SPECIFICITY}
본 발명은 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용한 질량분석법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정 아미노산 위치에서 돌연변이가 유발되어 유전자 변이 특이성이 증가된 Taq 중합효소를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 DNA 중합효소, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
1900년대 초에 질량분석법이 처음으로 사용되기 시작한 이래로 다양한 이온화법이 발달되어 왔으며, 일반적으로 EI(Electron Impact)가 표준 이온화 방법으로 널리 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 휘발성 시료에만 사용할 수 있으며, 열에 불안정한 시료에는 사용할 수 없는 단점을 가지고 있어, 주로 유기 저분자에 한정적으로 응용되고 있다.
이러한 이유로, SIMS, FD, FAB, MALDI 등과 같이 휘발성이 없거나 열 안정성이 없는 물질의 질량분석을 위한 여러 가지 이온화 방법들이 개발되었다. 그 중에서도 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)는 고분자 물질에 대해 시료의 분해 없이 기화/이온화가 가능한 방법으로 일반적으로 질량이 크고 열에 불안정한 생체 고분자나 합성고분자에 매우 이상적으로 적용될 수 있는 방법이다. 또한, TOF(Time of Flight) 분석기와 결합하여 고분자 연구에 있어 가장 각광 받고 있는 질량분석법이다.
기존의 PCR을 통한 유전자 증폭방법은 ddNTP(Dideoxynucleotide)를 첨가하면 유전자 증폭이 ddNTP가 첨가된 자리에서 멈춘다. 따라서, 기존 방법은 변이가 있는 뉴클레오타이드 직전까지(-1) 상보결합하는 프라이머를 디자인하여 이용하고, ddNTP를 첨가하여 PCR을 실행한다. 이러한 PCR의 산물을 MALDI-TOF를 이용하여 질량분석하면 마지막 첨가된 ddNTP의 질량 차이를 확인할 수 있고 이를 통해 유전자 변이를 검출할 수 있었다. 그러나 ddNTP들 사이의 질량 차이가 크지 않고, 또한 검체 (조직, 혈액, 소변 등) 안에 존재하는 정상 유전자의 수에 비해 돌연변이체 유전자 숫자가 매우 적어 돌연변이 검출의 정확도나 민감도가 현저하게 낮았다.
이에, 본 발명자들은 변이 특이적 DNA 중합효소를 이용하여 미스매치에 의한 프라이머 말단의 연장 억제로 정상 유전자와 변이 유전자의 PCR 산물 사이의 질량 차를 증가시킴으로써, MALDI-TOF를 이용한 질량분석 시 돌연변이 검출의 정확도와 민감도를 개선시키는 방법을 개발하였다.
한편, 대한민국 공개특허 제10-2011-0008158호는 질량 분광분석법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 질량 분광분석법으로 분석하고자 하는 분석물을 포함하는 샘플에서 부가물의 형성을 감소시킴으로써 분석되는 샘플에 대하여 정확성, 민감성 및 처리량을 증가시킬 수 있는 방법이 개시되어 있으나, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용하여 정확도와 민감도를 개선시킨 질량분석방법에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명의 목적은 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한, 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 DNA 중합효소 및/또는 키트를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 DNA 중합효소를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 질량분석법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법, 레이저 탈착 질량분석법(LDMS), 전기분무(ES) 질량분석법, 이온 시클로트론 공명(ICR) 질량분석법, 매스 어레이(MassARRAY) 및 푸리에 변환 질량분석법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소; 및/또는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다;를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 40 내지 90 mM의 KCl; 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4; 및 10 내지 40 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법은: (a) 분리된 생물학적시료로부터 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 핵산에 본 발명 DNA 중합효소를 처리하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 요(urine), 분변(stool), 객담(sputum), 타액(saliva), 조직, 세포, 세포 추출물 및 체외 세포 배양물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, (b) 단계에서 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다가 처리될 수 있고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계는 질량분석법으로 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 질량분석법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법, 레이저 탈착 질량분석법(LDMS), 전기분무(ES) 질량분석법, 이온 시클로트론 공명(ICR) 질량분석법, 매스 어레이(MassARRAY) 및 푸리에 변환 질량분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것은 매치된 프라이머의 증폭 산물과 미스매치되어 프라이머 증폭이 일어나지 않은 산물 사이의 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트만큼의 분자량 차이를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 질환의 진단, 질환의 예후 예측 또는 약물 반응성 예측에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 방법은 1회의 PCR로 적어도 3개 이상의 상이한 표적의 돌연변이를 동시 다발적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용한 질량분석법은 미스매치에 의한 프라이머 말단의 연장 억제로 정상 유전자와 변이 유전자의 PCR 산물 사이의 질량 차를 증가시킴으로써, MALDI-TOF를 이용한 질량분석 시 돌연변이 검출의 정확도와 민감도를 현저하게 개선시킬 수 있다. 또한, 기존 형광 프로브를 이용한 정량 PCR 방법은 여러 개의 돌연변이 표적을 동시에 관찰하는 멀티플렉스에 기술적인 한계가 존재하였으나, 본 발명의 질량분석법을 적용하는 경우 디자인한 프라이머마다 질량 차이가 나타나므로 한번의 PCR로 최대 30-40개 정도의 서로 다른 표적의 변이를 동시 다발적으로 검출할 수 있는 멀티플렉스 기술이 가능하다.
도 1은 R536K, R660V 및 R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정을 나타낸 것으로, (a)는 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이고, (b)는 단편 PCR에서 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며, (c)는 오버랩 PCR로 전장을 증폭하여 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 1(c)의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 E507K, E507K/R536K, E507K/R660V 및 E507K/R536K/R660V 변이를 각각 포함하는 Taq DNA 중합효소의 제조과정 중 단편 PCR 및 오버랩 PCR을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 겔 추출을 위해, 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 SAP를 처리한 pUC19 벡터와 정제한 도 3의 오버랩 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 유전자 변이 특이성이 증가된 DNA 중합효소를 이용한 MALDI-TOF 질량분석법의 원리를 종래의 MALDI-TOF 질량분석법과 비교하여 나타낸 것으로, (A)는 종래의 방법을, (B)는 본 발명의 방법을 나타낸다.
도 6은 BRAF p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이 주형을 포함하는 시료에서 단일염기연장반응 (Single Base Extension) 후 전기영동으로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7e는 시료 내 BRAF p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이 주형의 농도 (각각 0, 0.1, 0.5, 5.0 및 10%)에 따른 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 돌연변이 검출 결과를 나타낸 것으로, 첫 번째 박스는 실험 별 로딩 컨트롤에 해당하고, 두 번째 박스는 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내며, 세 번째 박스는 연장된 프라이머의 양을 나타낸다.
도 8은 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이 주형을 포함하는 시료에서 단일염기연장반응 (Single Base Extension) 후 전기영동으로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 어닐링 온도 변화 (59, 61.9, 65.1 및 68℃)가 돌연변이 검출 결과에 미치는 영향을 보여준다.
도 9a 내지 9e는 시료 내 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이 주형의 농도 (각각 0, 0.1, 0.5, 5.0 및 10%)에 따른 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 돌연변이 검출 결과를 나타낸 것으로, 첫 번째 박스는 실험 별 로딩 컨트롤에 해당하고, 두 번째 박스는 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내며, 세 번째 박스는 연장된 프라이머의 양을 나타낸다.
도 10은 EGFR p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이 주형을 포함하는 시료에서 단일염기연장반응 (Single Base Extension) 후 전기영동으로 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것으로, 어닐링 온도 변화 (59, 61.9, 65.1 및 68℃)가 돌연변이 검출 결과에 미치는 영향을 보여준다.
도 11a 내지 11e는 시료 내 EGFR p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이 주형의 농도 (각각 0, 0.1, 0.5, 5.0 및 10%)에 따른 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 돌연변이 검출 결과를 나타낸 것으로, 첫 번째 박스는 실험 별 로딩 컨트롤에 해당하고, 두 번째 박스는 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내며, 세 번째 박스는 연장된 프라이머의 양을 나타낸다.
도 12a 내지 12e는 BRAF p.V600E(c.1799T>A), EGFR p.T790M (c.2369C>T) 및 EGFR p.L858R(c.2573T>G)에 대해 멀티플렉스 (Multiplex)를 수행한 결과로, 첫 번째 박스는 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이에 대해 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내고, 두 번째 박스는 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이에 대해 연장된 프라이머의 양을 나타내며, 세 번째 박스는 실험 별 로딩 컨트롤에 해당하고, 네 번째 박스는 EGFR p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이에 대해 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내며, 다섯 번째 박스는 EGFR p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이에 대해 연장된 프라이머의 양을 나타내고, 여섯 번째 박스는 BRAF p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이에 대해 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내며, 일곱 번째 박스는 BRAF p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이에 대해 연장된 프라이머의 양을 나타낸다.
상술한 바와 같이, MALDI-TOF를 이용한 질량분석은 ddNTP들 사이의 질량 차이가 크지 않고, 또한 검체 (조직, 혈액, 소변 등) 안에 존재하는 정상 유전자의 수에 비해 돌연변이체 유전자 숫자가 매우 적어 돌연변이 검출의 정확도나 민감도가 현저하게 낮았다. 이에 본 발명자들은 변이 특이적 DNA 중합효소를 이용하여 미스매치에 의한 프라이머 말단의 연장 억제로 정상 유전자와 변이 유전자의 PCR 산물 사이의 질량 차를 증가시킴으로써, MALDI-TOF를 이용한 질량분석 시 돌연변이 검출의 정확도와 민감도를 개선시키는 방법을 개발함으로써, 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
이하, 본원에 사용되는 용어를 설명한다.
"아미노산" 은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질에 혼입될 수 있는 임의의 단량체 단위를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산" 은 하기 20 개의 천연 또는 유전적으로 인코딩된 알파-아미노산을 포함한다: 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V).
아미노산은 전형적으로 유기산이며, 이는 치환되거나 치환되지 않은 아미노기, 치환되거나 치환되지 않은 카르복시기, 및 하나 이상의 측사슬(side chain) 또는 기(group), 또는 이들 기의 임의의 유사체를 포함한다. 예시적인 측사슬은, 예를 들어, 티올, 셀레노, 술포닐, 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 히드록실, 히드라진, 시아노, 할로, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포시핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 또는 이들 기의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 DNA 중합효소에서, 용어 "돌연변이체"는 상응하는 자연 발생 또는 변형되지 않은 DNA 중합효소에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "열안정성 중합효소" (열에 안정한 효소를 지칭함)는 열 저항성이 있으며, 후속 폴리뉴클레오타이드 신장 반응을 달성하기에 충분한 활성을 보유하고 이중가닥 핵산의 변성을 달성하기 위해 요구되는 시간 동안 승온으로 처리될 때 비가역적으로 변성 (불활성화) 되지 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이, PCR 과 같은 반응을 사이클링하는 온도에 사용되기에 적합하다. 본원에서 비가역성 변성은 영구하고 효소 활성의 완전한 손실을 지칭한다. 열안정성 중합효소에 대해, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적인 폴리뉴클레오타이드 신장 생성물을 형성하기 위한 적절한 방식으로 뉴클레오타이드의 조합을 촉매작용하는 것을 지칭한다. 호열성 박테리아 유래 열안정성 DNA 중합효소는 예를 들어 하기를 포함한다: 써모토가 마리티마, 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스써모필루스, 써무스 플라부스, 써모드 필리포르미스, 써무스 종 Sps17, 써무스 종 Z05, 써무스 칼도필루스, 바실러스 칼도테낙스, 써모토가 네오폴리타나, 및 써모시포 아프리카누스 유래 DNA 중합효소.
용어 "열활성" 은 RT-PCR 및/또는 PCR 반응에서 역전사 또는 어닐링/신장 단계에 통상적으로 사용되는 온도 (즉, 45-80℃)에서 촉매 특성을 유지하는 효소를 지칭한다. 열안정성 효소는 핵산 변성에 요구되는 상승된 온도로 처리될 때 비가역적으로 불활성화되거나 변성되지 않는 것이다. 열활성 효소는 열안정성일 수 있거나 열안정성일 수 없다. 열활성 DNA 중합효소는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는 호열성 종 또는 중온성 종으로부터 의존적인 DNA 또는 RNA 일 수 있다.
용어 “뉴클레오타이드(nucleotide)”는 단일가닥(single strand) 또는 이중가닥(double strand) 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(ribonucleic acid; RNA)이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "핵산"은 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA 중합체, 또는 이의 유사체에 상응할 수 있는 중합체를 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, 염색체 또는 염색체 분절, 벡터 (예를 들어, 발현 벡터), 발현 카세트, 네이키드 DNA 또는 RNA 중합체, 중합효소 사슬 반응 (PCR) 의 생성물, 올리고뉴클레오타이드, 탐침, 및 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 핵산은 예를 들어, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있으나 임의의 특정 길이에 한정되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시되는 임의의 서열 외에도 상보 서열을 포함하거나 이를 코딩한다.
용어 "프라이머" 는 폴리뉴클레오타이드 신장이 개시되는 조건 하에 놓일 때 주형-방향으로 핵산 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 또한 de novo RNA 합성 및 시험관내 전사-관련 공정의 개시제로서 포함되는, 다양한 기타 올리고뉴클레오타이드-중재 합성 공정에서 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로는, 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드)이다. 프라이머의 적절한 길이는 전형적으로는 6 내지 40 개의 뉴클레오타이드 범위, 보다 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오타이드 범위에서 의도되는 사용에 따라 달라진다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정적인 혼성화 착물을 형성하기 위해 보다 저온의 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하는데 요구되지 않으나, 프라이머가 신장되기 위한 주형과 혼성화되기 위해 충분히 상보적이어야만 한다. 특정 구현예에서, 용어 "프라이머 쌍"은 증폭되는 핵산 서열의 5'-말단에 상보적으로 혼성화되는 5'-센스 프라이머를 포함하고, 증폭되는 서열의 3' 말단에 혼성화되는 3'-안티센스 프라이머를 포함하는 프라이머의 세트를 의미한다. 프라이머는, 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를 들어, 유용한 표지는 하기를 포함한다: 32P, 형광 염료, 전자-덴스 시약, 효소 (ELISA 분석에서 통상적으로 사용됨), 비오틴, 또는 합텐 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 이용될 수 있는 단백질.
용어 "5'-핵산가수분해효소(nuclease) 프로브"는 핵산 검출을 표적화하기 위해 5'-핵산가수분해효소 반응에서 사용되는 하나 이상의 발광 표지 부분을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 몇몇 구현예에서, 예를 들어, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 오직 단일 발광 부분 (예를 들어, 형광 염료, 등)을 포함한다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 프로브가 선택 조건 하에서 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가-상보적 영역을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는, 2개 이상의 표지 부분을 포함하고, 2개 중 하나의 표지가 올리고뉴클레오타이드로부터 분리되거나 분해된 후 방사 강도가 증가하여 방출된다. 특정 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브는 2개의 상이한 형광 염료, 예를 들어 5'-말단 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지된다. 몇몇 구현예에서, 5'-뉴클레아제 탐침은, 말단 위에 더하여, 또는 말단 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 표지된다. 프로브가 원래대로인 경우, 전형적으로, 리포터 염료로부터 형광 방출이 부분 이상 소광되도록 2 개의 형광물질 사이에서 에너지 이동이 발생한다. 중합효소 사슬 반응의 신장 단계동안, 예를 들어 주형 핵산에 결합되는 5'-핵산가수분해효소 프로브가 리포터 염료의 형광 발광이 더 이상 소광되지 않도록 하는 활성을 갖는 예를 들어, Taq 중합효소 또는 다른 중합효소의 5' 내지 3'-핵산가수분해효소 활성에 의해 분해된다. 몇몇 구현예에서, 5'-핵산가수분해효소 프로브가 둘 이상의 상이한 리포터 염료 및 3'-말단 소광제 염료 또는 부분과 표지될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적인" 또는 "천연"은, 기술되는 폴리뉴클레오타이드에서 천연 발생하는 것을 지칭한다 (즉, DNA 에 대해 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP임). 또한, dITP, 및 7-데아자-dGTP 는 dGTP 대신 빈번히 이용되며 서열화와 같은 시험관내 DNA 합성 반응에서 dATP 대신 이용될 수 있다.
핵산 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드를 지칭할 때 용어 "통상적이지 않은" 또는 "변형된" 은, 특정 폴리뉴클레오타이드에서 천연적으로 발생하는 통상적인 염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오타이드의 변형, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 특정한 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 통상적인 dNTP 와 비교하여 리보오스 당의 2' 위치에서 변형된다. 따라서, RNA 에 대해 자연 발생 뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 (즉, ATP, GTP, CTP, UTP, 집합적 rNTP)이더라도, 뉴클레오타이드가 당의 2' 위치에서 히드록실기를 갖기 때문에, 이는 비교하여 dNTP가 부재하고, 본원에 사용되는 바와 같이, 리보뉴클레오타이드는 DNA 중합효소에 대한 기질로서 통상적이지 않은 뉴클레오타이드다. 본원에 사용되는 바와 같이, 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 핵산 서열화에 대한 종결자로서 사용되는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예시적인 종결자 화합물은 2',3'-디데옥시 구조를 갖는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트로서 지칭된다. 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 ddATP, ddTTP, ddCTP 및 ddGTP 는 ddNTP 로서 집합적으로 지칭된다. 종결자 화합물의 추가의 예는 리보뉴클레오타이드의 2'-PO4 유사체를 포함한다. 다른 통상적이지 않은 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 dNTP ([[α]-S]dNTP), 5'-[α]-보라노-dNTP, [α]-메틸-포스포네이트 dNTP, 및 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (rNTP) 를 포함한다. 통상적이지 않은 염기는 방사성 동위원소, 예컨대 32P, 33P, 또는 35S; 형광 표지; 화학발광의 표지; 생물발광의 표지; 합텐 표지 예컨대 비오틴; 또는 효소 표지 예컨대 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 표지될 수 있다. 형광 표지는, 음성으로 하전된 염료, 예컨대 플루오세인 패밀리의 염료, 또는 중성으로 하전된 염료, 예컨대 로다민 패밀리의 염료, 또는 양성으로 하전된 염료, 예컨대 시아닌 패밀리의 염료를 포함할 수 있다. 플루오세인 패밀리의 염료는, 예를 들어, FAM, HEX, TET, JOE, NAN 및 ZOE를 포함한다. 로다민 패밀리의 염료는 Texas Red, ROX, R110, R6G, 및 TAMRA를 포함한다. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Texas Red 및 TAMRA로 라벨링된 다양한 염료 또는 뉴클레오타이드는 Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), 또는 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) 에 의해 시판된다. 시아닌 패밀리의 염료는 Cy2, Cy3, Cy5, 및 Cy7 을 포함하고, GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)에 의해 시판된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 DNA 중합효소를 제공한다.
상기 "Taq 중합효소"는 고온성 세균인 써모스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 따서 명명된 내열성 DNA 중합효소로 상기 세균으로부터 최초로 분리되었다. 써모스 아쿠아티쿠스는 온천 및 열수 분출공에 서식하는 세균으로, Taq 중합효소는 PCR 과정에서 요구되는 단백질 변성 조건 (고온)을 견딜 수 있는 효소로 확인되었다. Taq 중합효소의 최적 활성온도는 75-80 ℃이고, 92.5 ℃에서 2시간 이상, 95 ℃에서 40분, 97.5 ℃에서 9분의 반감기를 가지며, 72 ℃에서 10초 이내에 1000개의 염기쌍 DNA를 복제할 수 있다. 이는 3'→5' 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정 활성이 결여되어 있으며, 9,000개의 뉴클레오타이드 중 약 1개에서 오류율이 측정된다. 예를 들어 내열성 Taq를 사용하면 고온(60 ℃ 이상)에서 PCR을 실행할 수 있다. Taq 중합효소에 대하여 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열이 기준 서열로 사용된다.
본 발명에서, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기가 글루탐산(E)에서 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기가 아르기닌(R)에서 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소는 "E507K/R536K/R660V"로 명명하였고, 이의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호 2와 서열번호 20에 나타내었다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 DNA 중합효소는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법, 레이저 탈착 질량분석법(LDMS), 전기분무(ES) 질량분석법, 이온 시클로트론 공명(ICR) 질량분석법, 매스 어레이(MassARRAY) 및 푸리에 변환 질량분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질량분석법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소 및/또는 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 있어서, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화될 수 있으며, 상기 미스매치된 프라이머는 혼성화되는 표적서열에 대하여 이의 3' 말단에 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되도록 충분히 상보적이어야 하지만 표적서열의 정확한 서열을 반영하지 않은 혼성 올리고뉴클레오타이드이다.
상기 "표준 뉴클레오타이드 (canonical nucleotide)" 또는 "상보적 뉴클레오타이드"는 표준 왓슨-크릭 염기쌍, A-U, A-T 및 G-C를 의미한다.
상기 "비표준 뉴클레오타이드(non-canonical nucleotide)" 또는 "비상보적 뉴클레오타이드"는 왓슨-크릭 염기쌍 외에 A-C, A-G, G-U, G-T, T-C, T-U, A-A, G-G, T-T, U-U, C-C, C-U를 의미한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 질량분석법을 위한 키트는 ddATP, ddTTP, ddCTP 또는 ddGTP와 같은 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(ddNTP)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 DNA 중합효소를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법은: (a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 핵산에 본 발명의 중합효소를 처리하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 요(urine), 분변(stool), 객담(sputum), 타액(saliva), 조직, 세포, 세포 추출물 및 체외 세포 배양물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다가 처리될 수 있고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 DNA 중합효소의 활성을 증가시키기 위한 PCR 버퍼 조성물이 처리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR 버퍼 조성물은 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 40 내지 90 mM의 KCl; 및 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 25 내지 100 mM의 KCl; 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4; 및 5 내지 50 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 키트는 40 내지 90 mM의 KCl; 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4; 및 10 내지 40 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 KCl, (NH4)2SO4, 및 TMAC 이외에도 Tris·Cl (pH 8.0 내지 9.5), MaCl2, Tween 20, 및 BSA (Bovine serum albumin)을 더 포함할 수 있으며, 이들 구성의 농도는 통상의 기술자가 적절한 범위로 조절하여 사용할 수 있다.
상기와 같은 PCR 버퍼 조성물은 본 발명의 DNA 중합효소의 활성을 현저하게 향상시킴으로써 신뢰성 있는 유전자 변이-특이적 증폭을 가능하게 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 단일염기연장반응(Single Base Extension, SBE)으로 수행될 수 있다. 상기 단일염기연장반응은 분석하고자 하는 변이 위치에 근접한 프라이머를 표적 유전자에 붙이고 DNA 중합효소와 ddNTP를 이용하여 삽입된 염기를 동정하는 기술로서 단일염기변이 분석에 효율적이다.
따라서, 본 발명의 방법은 단일염기다형성 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 검출에 유용하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 질량분석법으로 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 질량분석법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법, 레이저 탈착 질량분석법(LDMS), 전기분무(ES) 질량분석법, 이온 시클로트론 공명(ICR) 질량분석법, 매스 어레이(MassARRAY) 및 푸리에 변환 질량분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
이외에도 본 발명의 방법은 PCR 증폭 산물을 이용하여 염기서열을 분석하는 다양한 기술, 예를 들어 마이크로어레이 칩 또는 질량을 측정할 수 있는 다양한 분석기기 예를 들어 LC-MS와 같은 염기서열 분석기술에 적용될 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 MALDI-TOF 질량분석법(MALDI-TOF mass spectrometer)으로 PCR 증폭 산물의 질량을 분석할 수 있다. 이는 유전형질분석(genotyping) 등 다양한 유전체 연구에 적용가능한 멀티플렉싱 분석방법으로, 적은 비용으로 다수의 샘플과 타겟을 빠르게 분석하고자 하는 경우 또는 특정 표적에 대해서만 맞춤형(customized) 분석을 하고자 하는 경우 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것은 매치된 프라이머의 증폭 산물과 미스매치되어 프라이머 증폭이 일어나지 않은 산물 사이의 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트만큼의 분자량 차이를 확인하는 것일 수 있다.
도 5에 나타난 바와 같이, 기존의 MALDI-TOF 분자량 정량방법(A)에서 PCR을 통한 유전자 증폭방법은 ddNTP(Dideoxynecleotide)를 첨가하면 유전자 증폭이 ddNTP가 첨가된 자리에서 멈춘다. 따라서, 기존 방법은 변이가 있는 뉴클레오타이드 직전까지(-1) 상보결합하는 프라이머를 디자인하여 이용하고, ddNTP를 첨가하여 PCR를 실행한다. 이러한 PCR의 산물을 MALDI-TOF를 이용하여 질량분석하면 마지막 첨가된 ddNTP의 질량차이를 확인할 수 있고 이를 통해 유전자 변이를 검출할 수 있었다. 그러나 ddNTP들 사이의 질량 차이가 크지 않고, 또한 검체 (조직, 혈액, 소변 등) 안에 존재하는 정상 유전자의 수에 비해 돌연변이체 유전자 숫자가 매우 적어 돌연변이 검출의 정확도나 민감도가 현저하게 낮았다.
이에 반해, 본 발명의 기존의 MALDI-TOF 분자량 정량방법(도 1(B))은 변이 유전자의 경우에는 정상적으로 증폭되어 ddNTP가 다음의 위치에 결합할 수 있으나, 정상 유전자의 경우에는 변이 뉴클레오타이드 위치에서의 미스매치에 의해 증폭이 억제되므로 다음 위치에 ddNTP 만큼의 질량 차이가 발생하므로 기존 MALDI-TOF 분자량 정량방법에 비해 정확도와 민감도를 현저하게 개선시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 유전형질분석(genotyping) 등 다양한 유전체 연구뿐만 아니라, 생체 외 진단(In-Vitro Diagnostic, IVD)에 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 방법은 질환의 진단, 질환의 예후 예측 또는 약물 반응성 예측에 사용될 수 있다. 상기 질환은 암일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 특정 질환과 관련된 유전자 변이 검출을 통해 진단할 수 있는 질환이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
상기 예후 예측은 특정 질환의 치료 후, 해당 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 질환의 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 질환이 재발하거나 또는 해당 질환으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "무병생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 용어 "생존율"이란, 특정 질환의 치료 후, 환자가 해당 질환의 재발여부에 관계 없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 방법은 각각의 상이한 표적 돌연변이에 대한 프라이머의 길이를 조절함으로써 단 1회의 PCR만으로 적어도 3개 이상의 상이한 표적 돌연변이를 동시 다발적으로 검출할 수 있으며, 예를 들어, 3개 내지 40개의 상이한 표적 돌연변이를 동시 다발적으로 검출할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
Taq 중합효소의 돌연변이유발
1-1. 단편 PCR
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K"라 함), 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R660V"라 함) 및 536번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 리신으로 치환되고 660번째 아미노산 잔기를 아르기닌에서 발린으로 치환된 Taq DNA 중합효소 (이하 "R536K/R660V"라 함)를 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 표 1에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 1의 (a)에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F1 내지 F5)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 2와 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 3
R536K-R CTT GGT GAG CTC CTT GTA CTG CAG GAT 4
R536K-F ATC CTG CAG TAC AAG GAG CTC ACC AAG 5
R660V-R GAT GGT CTT GGC CGC CAC GCG CAT CAG GGG 6
R660V-F CCC CTG ATG CGC GTG GCG GCC AAG ACC ATC 7
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 8
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 1 μl
R 프라이머 1 μl
증류수 18 μl
pUC19-Taq (10 ng/ μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
PCR 산물을 전기영동 상에서 확인해본 결과, 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이 각 단편에 대한 밴드가 확인되어 목적하는 단편이 증폭되었음을 확인하였다.
1-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 1-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 3 및 4와 같다.
R660V 또는 R536K
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 1 (또는 단편 3) 1 μl
단편 2 (또는 단편 4) 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
R536K/R660V
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5x인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 26 μl
단편 2 1 μl
단편 3 1 μl
단편 5 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
그 결과, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소가 증폭되었음을 확인하였다.
1-3. 라이게이션
pUC19을 하기 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2.5 μl
pUC19 (500 ng/μl) 21.5 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 25 μl
10xSAP 버퍼 (로슈) 2 μl
정제된 DNA 17 μl
SAP (로슈) 1 μl
　 20 μl
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 1-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 2).
10xCutSmart 버퍼 (NEB) 2 μl
정제된 PCR 산물 17 μl
EcoRI-HF (NEB) 0.5 μl
XbaI (NEB) 0.5 μl
　 20 μl
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 원하는 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V")를 수득하였다.
　 벡터 단독 벡터+인서트
10ⅹ연결효소 버퍼 (솔젠트) 1 μl 1 μl
벡터 1 μl 1 μl
인서트 - 3 μl
증류수 7 μl 4 μl
T4 DNA 연결효소 (솔젠트) 1 μl 1 μl
　 10 μl 10 μl
E507K 변이의 도입
2-1. 단편 PCR
상기 실시예 1에서 제조된 "R536K", "R660V" 및 "R536K/R660V"의 Taq 중합효소 활성을 테스트해 본 결과 활성이 떨어지는 것을 확인하고(데이터 미도시), R536K, R660V, R536K/R660V 각각에 추가로 E507K 변이(서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기를 글루탐산에서 리신으로 치환)를 도입하였으며, 대조군으로 사용하기 위해 야생형 Taq DNA 중합효소(WT)에도 E507K 변이를 도입하였다. E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소의 제조방법은 실시예 1과 동일하다.
표 9에 기재된 돌연변이 특이적 프라이머를 이용하여 도 3에 나타난 바와 같이 Taq DNA 중합효소 단편들(F6 내지 F7)을 PCR로 증폭하였다. 반응조건은 표 10과 같다.
프라이머 서열 (5'→3') 서열번호
Eco-F GG GGTACC TCA TCA CCC CGG 3
E507K-R CTT GCC GGT CTT TTT CGT CTT GCC GAT 9
E507K-F ATC GGC AAG ACG AAA AAG ACC GGC AAG 10
Xba-R GC TCTAGA CTA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA 8
10xpfu 버퍼 (솔젠트) 2.5 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
F 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
R 프라이머 (10 pmol/μl) 1 μl
증류수 18 μl
주형 플라스미드 (10 ng/μl) 1 μl
Pfu 중합효소 0.5 μl
30 사이클 (Ta=60℃) 25 μl
*주형 플라스미드: pUC19-Taq (WT)
pUC19-Taq (R536K)
pUC19-Taq (R660V)
pUC19-Taq (R536K/R660V)
2-2. 오버랩 (overlap) PCR
상기 2-1에서 증폭한 각 단편을 주형으로 하여 양 말단의 프라이머(Eco-F 및 Xba-R 프라이머)를 이용하여 전장을 증폭하였다. 반응조건은 표 11과 같다.
10ⅹpfu 버퍼 (솔젠트) 5 μl
5ⅹ인핸서 (솔젠트) 10 μl
dNTP (각 10 mM) 1 μl
Eco-F 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
Xba-R 프라이머 (10 pmol/μl) 2 μl
증류수 27 μl
단편 6 1 μl
단편 7 1 μl
Pfu 중합효소 1 μl
40 사이클 (Ta=62℃) 50 μl
2-3. 라이게이션
pUC19을 표 5의 조건으로 37℃에서 4시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 DNA를 정제하고, 정제된 DNA를 표 6의 조건으로 37℃에서 1시간 동안 SAP를 처리하여 벡터를 준비하였다.
인서트(insert)의 경우, 상기 실시예 2-2의 오버랩 PCR 산물을 정제하여 표 7의 조건으로 37℃에서 3시간 동안 제한효소 EcoRI/XbaI로 분해한 다음 준비된 벡터와 함께 겔 추출하였다 (도 4).
표 8의 조건으로 실온(RT)에서 2시간 동안 라이게이션한 후, E. coli DH5α 또는 DH10β에 형질전환하여 암피실린이 포함된 배지에서 선별하였다. 수득된 콜로니들로부터 준비된 플라스미드를 시퀀싱하여 E507K 변이가 도입된 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 ("E507K/R536K", "E507K/R660V" 및 "E507K/R536K/R660V")를 수득하였다.
BRAF p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이 검출
3-1. 프라이머 세트의 제작
BRAF 유전자의 p.V600E(c.1799T>A) 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 BRAF 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm 값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 프라이머를 디자인하였다.
본 실시예에 사용된 프라이머 정보는 표 12에 나타내었다.
돌연변이 그룹 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호 길이 Tm 분자량
p.V600E (c.1799T>A) V600E Fmt24 AGG TGA TTT TGG TCT AGC TAC AG A 11 24nt 64.5℃ 7423 KDa
3-2. BRAF p.V600E (c.1799T>A) 검출 테스트
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V"변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 2) 및 실시예 3-1의 프라이머 세트를 사용하여 표 13의 각 그룹으로부터 BRAF p.V600E (c.1799T>A) 돌연변이를 검출하였다.
표 14의 조건으로 단일염기연장반응(Single Base Extension)을 진행하였으며, 표 14의 1X D-Taq 버퍼의 조성은 표 15에 나타내었고, WT 및 돌연변이 주형의 서열 정보는 표 16에 나타내었으며, PCR 사이클은 표 17의 조건으로 200 사이클 수행하였다.
그룹 시료
WT WT 주형 단독 (4pmol/)
WT+ mt 0.1% WT 주형 단독 (4pmol/) + 돌연변이 주형 0.1% (4fmol)
WT+ mt 0.25% WT 주형 단독 (4pmol/) + 돌연변이 주형 0.25% (10fmol)
WT+ mt 0.5% WT 주형 단독 (4pmol/) + 돌연변이 주형 0.5% (20fmol)
1 rxn 　 최종 농도
4.55 ul NFW -
2 ul 5X D-Taq 버퍼 1X
2 ul 정방향 프라이머 (10 pmol/ul): V600E Fmt24 2 uM
0.25 ul ddGTP (4nmol/ul) 100 uM
0.2 ul 변이 특이적 중합효소, 2.5U/ul 0.5 U / rxn
1 ul WT 주형 DNA (4 pmol/ul) 400 nM
1 ul 돌연변이 주형 DNA (4f, 10f, 20fmol/ul) 0.5, 1, 2 nM
10 ul 총 반응 부피 　
최종농도
MMX ADPS 버퍼 Tris·Cl (pH 8.8) 50 mM
MgCl2 2.5 mM
KCl 60 mM
(NH4)2SO4 2.5 mM
TMAC 25 mM
Tween 20 0.1%
BSA 0.01%
주형 서열 서열번호
V600E_wt_PE_tmp_+5R_55 ATTTC A CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAG 12
V600E_mt_PE_tmp_+5R_55 ATTTC T CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAG 13
단계 온도 시간
1 94℃ 10초
　
2
　 		94℃ 5초
58.4℃ 30초
68℃ 5초
2X 포름아미드 로딩 버퍼 10 ul를 결과물 10 ul에 첨가한 다음 95 ℃로 5분 가열하였다. 그런 다음 20% Aa, 8.3M 우레아 겔에 로딩한 뒤, 250V로 1시간 동안 전기영동을 하였다. 이후 젤을 분리하고 젤 레드 염색 다이로 30분간 염색을 시킨 뒤 UV 빛 아래에 촬영한 젤 사진을 도 6에 나타내었다.도 6에서 확인되는 바와 같이, 5개의 모든 레인에 WT 주형이 4pmol 있었지만, 돌연변이가 없는 WT 그룹에서는 25nt로 연장된 부분이 없었다. 돌연변이 주형이 0.1% (4 fmol) 첨가된 그룹에서는 희미하게 연장된 것이 보이기 시작하였으나, 구분이 명확하게 확인되는 그룹은 돌연변이 주형이 0.5% (20 fmol) 첨가된 그룹이었다.
3-3. MassARRAY (agena사)를 이용한 질량분석
실시예 3-2에서 단일염기연장반응 후 수득된 시료에 대해 agena사 MassARRAY 기기로 질량분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7a 내지 7e에서 확인되는 바와 같이 돌연변이 주형이 0.1% 첨가된 그룹부터 연장이 일어나지 않는 WT 그룹과 명확한 구분이 가능하여, 높은 민감도로 돌연변이가 정확하게 검출됨을 알 수 있었다.
EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이 검출
4-1. 프라이머 세트의 제작
EGFR 유전자의 p.T790M(c.2369C>T) 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 EGFR 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm 값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 프라이머를 디자인하였다.
본 실시예에 사용된 프라이머 정보는 표 18에 나타내었다.
돌연변이 그룹 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호 길이 Tm 분자량
p.T790M
(c.2369C>T)		 T790M Fmt20 TC CAC CGT GCA GCT CAT CA T 14 20nt 69.5℃ 6013 KDa
4-2. 어닐링 온도에 따른 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 검출 테스트
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V"변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 2) 및 실시예 4-1의 프라이머 세트를 사용하여 EGFR p.T790M (c.2369C>T) 돌연변이를 검출하였다.
WT 주형 2pmol을 포함하는 시료와 WT 주형 2pmol에 0.2pmol의 돌연변이 주형을 첨가한 시료에 대해 단일염기연장반응(Single Base Extension)을 진행하였다. 단일염기연장반응의 조건은 실시예 3-2와 동일하며, 이때 어닐링 온도를 각각 59℃, 61.9℃, 65.1℃ 및 68℃로 달리하였다. WT 및 돌연변이 주형의 서열 정보는 표 19에 나타내었다.
주형 서열 서열번호
T790M_wt_PE_tmpl_+5R_55 GCTGC G TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACAC 15
T790M_mt_PE_tmpl_+5R_55 GCTGC A TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACAC 16
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 WT 그룹의 경우 각 어닐링 온도에서 육안으로 확인가능한 수준 이내로 오류가 일어나는 것을 확인하였고, 돌연변이 주형이 첨가된 그룹에서는 단일염기연장반응이 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 실시예 결과를 통해 여러 종류의 각 표적에 대한 최적화 어닐링 온도 범위가 넓어지더라도, 본 발명의 DNA 중합효소를 사용하는 경우 여러 표적을 동시 다발적으로 확인하는 키트를 구성하는 것에 문제가 없음을 확인할 수 있다.
4-3. MassARRAY (agena사)를 이용한 질량분석
실시예 4-2에서 단일염기연장반응 후 수득된 시료에 대해 agena사 MassARRAY기기로 질량분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9a 내지 9e에서 확인되는 바와 같이 돌연변이 주형이 0.1% 첨가된 그룹부터 연장이 일어나지 않는 WT 그룹과 명확한 구분이 가능하여, 높은 민감도로 돌연변이가 정확하게 검출됨을 알 수 있었다.
EGFR p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이 검출
5-1. 프라이머 세트의 제작
EGFR 유전자의 p.L858R(c.2573T>G) 돌연변이에 대해서는 PCR 산물을 생성하지만 야생형 EGFR 유전자에 대해서는 생성하지 않는 프라이머를 디자인하기 위해 OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) 프로그램을 이용하여 프라이머 크기, Tm 값, 프라이머 GC 함량, 프라이머 내에 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)이 있는지의 여부 등을 확인하여 2차 구조(secondary structure)의 형성 가능성을 배제한 후 프라이머를 디자인하였다.
본 실시예에 사용된 프라이머 정보는 표 20에 나타내었다.
돌연변이 그룹 프라이머 서열 (5'-3') 서열번호 길이 Tm 분자량
p.L858R
(c.2573T>G)		 L858R Fmt23 GT CAA GAT CAC AGA TTT TGG GC G 17 23nt 65.1℃ 7104 KDa
5-2. 어닐링 온도에 따른 EGFR p.L858R(c.2573T>G) 검출 테스트
상기 실시예 2에서 수득한 "E507K/R536K/R660V"변이를 각각 포함하는 Taq 중합효소 (서열번호 2) 및 실시예 5-1의 프라이머 세트를 사용하여 EGFR p.L858R (c.2573T>G) 돌연변이를 검출하였다.
WT 주형 2pmol을 포함하는 시료와 WT 주형 2pmol에 0.2pmol의 돌연변이 주형을 첨가한 시료에 대해 단일염기연장반응(Single Base Extension)을 진행하였다. 단일염기연장반응의 조건은 실시예 3-2와 동일하며, 이때 어닐링 온도를 각각 59℃, 61.9℃, 65.1℃ 및 68℃로 달리하였다. WT 및 돌연변이 주형의 서열 정보는 표 21에 나타내었다.
주형 서열 서열번호
T790M_wt_PE_tmpl_+5R_55 GCTGC G TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACAC 18
T790M_mt_PE_tmpl_+5R_55 GCTGC A TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACAC 19
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 WT 그룹의 경우 각 어닐링 온도에서 육안으로 겨우 확인 가능한 오류가 미약하게 발생하는 것을 확인하였고, 돌연변이 주형이 첨가된 그룹에서는 단일염기연장반응이 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 실시예 결과를 통해 여러 종류의 각 표적에 대한 최적화 어닐링 온도 범위가 넓어지더라도, 본 발명의 DNA 중합효소를 사용하는 경우 여러 표적을 동시 다발적으로 확인하는 키트를 구성하는 것에 문제가 없음을 확인할 수 있다.
5-3. MassARRAY (agena사)를 이용한 질량분석
상기 실시예 5-2의 결과는 돌연변이 주형이 첨가된 그룹에서 단일염기연장반응이 일어난다는 것을 확인할 수 있었으나, 육안으로 최대 민감도를 판별하는 것은 어려웠다. 따라서, 본 실시예에서는 MALDI-TOF를 이용한 질량분석으로 돌연변이를 검출하여 민감도를 확인하기 위해, 실시예 5-2에서 단일염기연장반응 후 수득된 시료에 대해 agena사 MassARRAY 기기로 질량분석을 수행하였다.
그 결과, 도 11a 내지 11e에서 확인되는 바와 같이 돌연변이 주형이 0.1% 첨가된 그룹부터 연장이 일어나지 않는 WT 그룹과 명확한 구분이 가능하여, 높은 민감도로 돌연변이가 정확하게 검출됨을 알 수 있었다.
상이한 3개의 표적에 대한 멀티플렉스 (Multiplex)
본 실시예에서는 상기 실시예 3 내지 5에서 실시한 3개의 표적 돌연변이에 대해 멀티플렉스를 수행하였다. 실험 과정은 실시예 내지 5와 동일하나, BRAF.V600E의 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내는 구간과 EGFR.L868R의 연장된 프라이머의 양을 나타내는 구간이 7400-7500 사이로 겹치기 때문에 BRAF p.V600E 돌연변이를 표적하는 프라이머에 T를 연장하여 BRAF.V600E의 연장되지 않은 프라이머의 양을 나타내는 구간과 BRAF.V600E의 연장된 프라이머의 양을 나타내는 구간을 305 분자량만큼 오른쪽으로 이동시켜 3개의 타겟을 모두 함께 확인할 수 있도록 하였다.
그 결과, 도 12a 내지 12e에 나타난 바와 같이 돌연변이 주형이 0.1% 첨가된 그룹부터 연장이 일어나지 않는 WT 그룹과 명확한 구분이 가능하여, 3개의 상이한 표적 돌연변이가 동시 다발적으로 정확하게 검출됨을 알 수 있었다. 또한, 본 실시예를 통해 프라이머의 길이를 조절함으로써, 한번에 최대 30 내지 40개의 상이한 표적 돌연변이를 동시 다발적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GeneCast Co., Ltd. <120> MASS SPECTROMETRY USING DNA POLYMERASES WITH INCREASED MUTATION SPECIFICITY <130> 1066885 <150> KR 10-2019-0004225 <151> 2019-01-11 <160> 20 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) <400> 1 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 2 <211> 832 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Taq E507K/R536K/R660V <400> 2 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Lys Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Val Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Eco-F <400> 3 ggggtacctc atcaccccgg 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-R <400> 4 cttggtgagc tccttgtact gcaggat 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R536K-F <400> 5 atcctgcagt acaaggagct caccaag 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-R <400> 6 gatggtcttg gccgccacgc gcatcagggg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> R660V-F <400> 7 cccctgatgc gcgtggcggc caagaccatc 30 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Xba-R <400> 8 gctctagact atcactcctt ggcggagagc ca 32 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E507K-R <400> 9 cttgccggtc tttttcgtct tgccgat 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> E507K-F <400> 10 atcggcaaga cgaaaaagac cggcaag 27 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> V600E Fmt24 <400> 11 aggtgatttt ggtctagcta caga 24 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> V600E_wt_PE_tmp_+5R_55 <400> 12 atttcactgt agctagacca aaatcaccta tttttactgt gaggtcttca tgaag 55 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> V600E_mt_PE_tmp_+5R_55 <400> 13 atttctctgt agctagacca aaatcaccta tttttactgt gaggtcttca tgaag 55 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T790M Fmt20 <400> 14 tccaccgtgc agctcatcat 20 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T790M_wt_PE_tmpl_+5R_55 <400> 15 gctgcgtgat gagctgcacg gtggaggtga ggcagatgcc cagcaggcgg cacac 55 <210> 16 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T790M_mt_PE_tmpl_+5R_55 <400> 16 gctgcatgat gagctgcacg gtggaggtga 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acgaggtccg catcctcacc 420 gccgacaaag acctttacca gctcctttcc gaccgcatcc acgtcctcca ccccgagggg 480 tacctcatca ccccggcctg gctttgggaa aagtacggcc tgaggcccga ccagtgggcc 540 gactaccggg ccctgaccgg ggacgagtcc gacaaccttc ccggggtcaa gggcatcggg 600 gagaagacgg cgaggaagct tctggaggag tgggggagcc tggaagccct cctcaagaac 660 ctggaccggc tgaagcccgc catccgggag aagatcctgg cccacatgga cgatctgaag 720 ctctcctggg acctggccaa ggtgcgcacc gacctgcccc tggaggtgga cttcgccaaa 780 aggcgggagc ccgaccggga gaggcttagg gcctttctgg agaggcttga gtttggcagc 840 ctcctccacg agttcggcct tctggaaagc cccaaggccc tggaggaggc cccctggccc 900 ccgccggaag gggccttcgt gggctttgtg ctttcccgca aggagcccat gtgggccgat 960 cttctggccc tggccgccgc cagggggggc cgggtccacc gggcccccga gccttataaa 1020 gccctcaggg acctgaagga ggcgcggggg cttctcgcca aagacctgag cgttctggcc 1080 ctgagggaag gccttggcct cccgcccggc gacgacccca tgctcctcgc ctacctcctg 1140 gacccttcca acaccacccc cgagggggtg gcccggcgct acggcgggga gtggacggag 1200 gaggcggggg agcgggccgc cctttccgag aggctcttcg ccaacctgtg ggggaggctt 1260 gagggggagg agaggctcct ttggctttac cgggaggtgg agaggcccct ttccgctgtc 1320 ctggcccaca tggaggccac gggggtgcgc ctggacgtgg cctatctcag ggccttgtcc 1380 ctggaggtgg ccgaggagat cgcccgcctc gaggccgagg tcttccgcct ggccggccac 1440 cccttcaacc tcaactcccg ggaccagctg gaaagggtcc tctttgacga gctagggctt 1500 cccgccatcg gcaagacgaa aaagaccggc aagcgctcca ccagcgccgc cgtcctggag 1560 gccctccgcg aggcccaccc catcgtggag aagatcctgc agtacaagga gctcaccaag 1620 ctgaagagca cctacattga ccccttgccg gacctcatcc accccaggac gggccgcctc 1680 cacacccgct tcaaccagac ggccacggcc acgggcaggc taagtagctc cgatcccaac 1740 ctccagaaca tccccgtccg caccccgctt gggcagagga tccgccgggc cttcatcgcc 1800 gaggaggggt ggctattggt ggccctggac tatagccaga tagagctcag ggtgctggcc 1860 cacctctccg gcgacgagaa cctgatccgg gtcttccagg aggggcggga catccacacg 1920 gagaccgcca gctggatgtt cggcgtcccc cgggaggccg tggaccccct gatgcgcgtg 1980 gcggccaaga ccatcaactt cggggtcctc tacggcatgt cggcccaccg cctctcccag 2040 gagctagcca tcccttacga ggaggcccag gccttcattg agcgctactt tcagagcttc 2100 cccaaggtgc gggcctggat tgagaagacc ctggaggagg gcaggaggcg ggggtacgtg 2160 gagaccctct tcggccgccg ccgctacgtg ccagacctag aggcccgggt gaagagcgtg 2220 cgggaggcgg ccgagcgcat ggccttcaac atgcccgtcc agggcaccgc cgccgacctc 2280 atgaagctgg ctatggtgaa gctcttcccc aggctggagg aaatgggggc caggatgctc 2340 cttcaggtcc acgacgagct ggtcctcgag gccccaaaag agagggcgga ggccgtggcc 2400 cggctggcca aggaggtcat ggagggggtg tatcccctgg ccgtgcccct ggaggtggag 2460 gtggggatag gggaggactg gctctccgcc aaggagtga 2499

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소; 및/또는
    하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다;
    를 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트.
  5. 제3항에 있어서, 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가로 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트.
  6. 제3항에 있어서, 25 내지 100 mM의 KCl; 및 1 내지 7 mM의 (NH4)2SO4;를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.5인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트.
  7. 제3항에 있어서, 40 내지 90 mM의 KCl; 1 내지 5 mM의 (NH4)2SO4; 및 10 내지 40 mM의 TMAC(Tetra methyl ammonium chloride)를 포함하고, 최종 pH가 8.0 내지 9.0인 PCR 버퍼 조성물을 추가로 포함하는, 질량분석법을 이용한 유전자 돌연변이 검출에 사용하기 위한 키트.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 이용하여 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 핵산에 서열번호 1의 아미노산 서열에서 507번째 아미노산 잔기인 글루탐산(E)이 리신(K)으로 치환되고, 536번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 리신(K)으로 치환되며, 660번째 아미노산 잔기인 아르기닌(R)이 발린(V)으로 치환된 Taq 중합효소를 처리하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 결과 증폭 산물의 크기 또는 염기서열을 분석하는 단계를 포함하는, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈청(serum), 혈장(plasma), 요(urine), 분변(stool), 객담(sputum), 타액(saliva), 조직, 세포, 세포 추출물 및 체외 세포 배양물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 하나 이상의 매치된 프라이머, 하나 이상의 미스매치된 프라이머 또는 하나 이상의 매치된 프라이머와 하나 이상의 미스매치된 프라이머 둘 다가 처리되고, 상기 하나 이상의 매치된 프라이머 및 하나 이상의 미스매치된 프라이머는 표적서열과 혼성화되는, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계는 질량분석법으로 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것인, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질량분석법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석법, 레이저 탈착 질량분석법(LDMS), 전기분무(ES) 질량분석법, 이온 시클로트론 공명(ICR) 질량분석법, 매스 어레이(MassARRAY) 및 푸리에 변환 질량분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 PCR 증폭 산물의 질량을 분석하는 것은 매치된 프라이머의 증폭 산물과 미스매치되어 프라이머 증폭이 일어나지 않은 산물 사이의 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트만큼의 분자량 차이를 확인하는 것인, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 방법은 질환의 진단, 질환의 예후 예측 또는 약물 반응성 예측에 사용되는, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 방법은 1회의 PCR로 적어도 3개 이상의 상이한 표적 돌연변이를 동시 다발적으로 검출하는, 질량분석법으로 유전자 돌연변이를 검출하는 방법.
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