CN109652499B - 快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒 - Google Patents
快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
快速检测DNA聚合酶3'‑5'外切活性或错配的方法和试剂盒。本方法包括：提供一段已知序列的核酸，以及检测引物，其与已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；使已知序列的核酸和检测引物杂交，加入待测DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行第一次信号收集；加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；综合分析第一次信号和第二次信号，判断待测DNA聚合酶是否发生外切或错配。可检测在四种核苷酸单独存在于反应体系时DNA聚合酶3'‑5'外切活性或错配。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法和试剂盒。
背景技术
3'端有自由羟基的dNTP用于测序中可以使测序速度大大提升。新的测序技术如单分子测序等更倾向于使用这种3'-OH的dNTP以实现快速和长读长的目标。但是使用这种dNTP时，很多情况下，需要将四种脱氧核苷酸按照一定的顺序单独加入，每次只加入一种，这就要求所使用的DNA聚合酶在反应体系中只有一种dNTP存在时能够忠实地依次加入正确配对的dNTP，不能有3'-5'外切活性或错配。在实际应用中发现，当四种dNTP同时存在时，无3'-5'外切活性且高保真的DNA聚合酶不表现出3'-5'外切活性或错配；当只有一种dNTP时，若待聚合的脱氧核苷酸位置与加入的dNTP种类相同，则可以正确聚合；若待聚合的脱氧核苷酸位置与加入的dNTP种类不同，有些DNA聚合酶会表现出3'-5'外切活性或错配，即按3'-5'方向切除一个或几个脱氧核苷酸，直至将dNTP加上，或直接加上错配的dNTP。这种DNA聚合酶的特性就会导致测序错误，影响测序的数据质量。因此，急需开发一种快速检测DNA聚合酶在只有一种dNTP存在时，是否能忠实聚合dNTP的方法。
现有的对DNA聚合酶3'-5'外切活性的检测技术是放射性同位素法，即合成一条3'末端带3H标记dATP的单链寡核苷酸，3'-5'外切酶活性可将[3H]-dATP切除。通过测定放射性的含量计算3'-5'外切酶活性。放射性同位素法易产生放射性污染，且步骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。
有的研究人员(CN104293930A，一种3'-5'外切酶活性测定方法)将3'端有错配脱氧核苷酸的引物与单链模板混合并退火，加入酶进行3'脱氧核苷酸外切反应，然后加入足量没有3'-5'外切酶活性的聚合酶延长引物直至获得双链DNA，通过检测反应体系中双链DNA的相对量，由该检测结果推导出外切酶活性程度。然而这些方法不能检测DNA聚合酶在单个dNTP存在且与待测位置脱氧核苷酸不匹配时外切活性。
其它的3'-5'外切活性检测方法也只限于检测3'端错配时的DNA聚合酶的3'-5'外切活性，都不能检测当3'端配对正确时DNA聚合酶的3'-5'外切活性。因此，不能适用于某些测序酶的外切活性检测和筛选。对DNA聚合酶错配率的传统检测方法(例如蓝白斑实验、质粒内切法实验)操作繁琐，也不能适用于某些特殊需求的测序酶的检测和筛选。
发明内容
本发明提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法和试剂盒，可以通过两步反应，检测在dATP、dCTP、dGTP、dTTP等四种核苷酸单独存在于反应体系时的DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的情况。
根据第一方面，一种实施例中提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，包括：
提供一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与上述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；
提供两个反应体系，使上述已知序列的核酸和上述检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集；
向上述两个反应体系中加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；
综合分析上述第一次信号和上述第二次信号，判断上述待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配。
进一步地，上述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。
进一步地，上述带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、上述第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及上述第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同。
进一步地，上述方法还包括：
提供第三个反应体系，使上述已知序列的核酸和上述检测引物在其内杂交，加入上述待测的DNA聚合酶和带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，作为对照组。
进一步地，上述已知序列的核酸装载在芯片上，或使用链霉亲和素和生物素固定在磁珠或芯片上，或使用其它方式将上述已知序列的核酸固定在芯片或磁珠上。
根据第二方面，一种实施例中提供一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的试剂盒，包括：
一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与上述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；
与待聚合的脱氧核苷酸不同的带荧光标记的脱氧核苷酸，用于在反应池内与待测的DNA聚合酶、上述已知序列的核酸和上述检测引物一起进行反应以进行第一次信号收集；
无外切活性的Taq DNA聚合酶、带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸，用于在反应池内进行反应以进行第二次信号收集。
进一步地，上述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。
进一步地，上述带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、上述第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及上述第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同。
进一步地，上述试剂盒还包括：反应池，用于在其内进行反应。
进一步地，上述已知序列的核酸装载在芯片上，或使用链霉亲和素和生物素固定在磁珠或芯片上，或使用其它方式将上述已知序列的核酸固定在芯片或磁珠上。
本发明首次提出了可以检测DNA聚合酶在只有一种dNTP存在的情况时的3'-5'外切活性或错配，为快速测序所需的DNA聚合酶提供筛选方法；该方法使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染；对模板底物结构或序列没有特殊要求，可直接用于筛选，易于实现；并且可以直接利用微量96孔或384孔板进行筛选测试实验，并可根据筛选量同时进行多块板实验，且实验结果可直接使用，无需对数据进行额外的处理。
附图说明
图1为本发明实施例中快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法的原理示意图；
图2为本发明实施例中快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法的流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
如图1所示，本发明一个实施例中，快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，包括：
(1)提供一段固定在固相上的已知序列的核酸(图中②所示)，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物(图中①所示)，该检测引物与已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸(图中①所示的检测引物的3'端A)和待聚合的前两位脱氧核苷酸(图中④和⑤所示)互不相同。在一些具体实施方式中，已知序列的核酸装载在芯片上，或使用链霉亲和素和生物素固定在磁珠或芯片上，或者通过其他方式固定在固相上。在一些具体实施方式中，检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。
(2)提供两个反应池(即反应体系)，使已知序列的核酸和检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记且与待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)不同的脱氧核苷酸，在图1所示的实施例中，该脱氧核苷酸是A(图中③所示)，其刚好与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸相同，在其它实施例中，该脱氧核苷酸还可以与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸不同，只要同时满足与待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)不同即可，例如，在图1中，③所指示位置的脱氧核苷酸还可以是G或C；然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集。在一些具体实施方式中，还提供第三个反应池，使已知序列的核酸和检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶和带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，作为对照组。
(3)向两个反应池中加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸(图中⑤所示)进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集。在一些具体实施方式中，“与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸相同的脱氧核苷酸”(图中③所示)的荧光标记、“第一位待聚合的脱氧核苷酸”(图中④所示)的荧光标记以及“第二位待聚合的脱氧核苷酸”(图中⑤所示)的荧光标记互不相同。在一些具体实施方式中，“与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸相同的脱氧核苷酸”或“与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸”、“第一位待聚合的脱氧核苷酸”和“第二位待聚合的脱氧核苷酸”分别是dATP、dCTP、dTTP和dGTP四种脱氧核苷酸中的任意一种，并且互不相同。在一些具体实施方式中，dATP、dTTP、dCTP和dGTP四种脱氧核苷酸分别是dATP-Cy3、dTTP-TexRd、dCTP-FITC和dGTP-Cy5，即分别带有荧光标记Cy3、TexRd、FITC和Cy5，这些荧光标记都是本领域中常用的荧光标记。然而，本领域的技术人员能够理解，本发明并不限于上述四种荧光标记，只要四种脱氧核苷酸的荧光标记互不相同即可。在一些具体实施方式中，使用dNTP-Dye表示带荧光标记的脱氧核苷酸。
(4)综合分析第一次信号和第二次信号，只要信号超过对照信号的10％就算发生了外切或错配，来判断待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配。具体而言，若第一次信号收集时检测不到信号或信号很低(接近背景)，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶没有外切和错配发生；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了外切；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时检测到与第二位待聚合的脱氧核苷酸(图中⑤所示)相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了错配。
需要说明的是，图1仅示出了一个示例性的例子，并不代表本发明的全部情况。本发明的各种情况，可以依据图1示出的例子，按照本发明的精神进行变换。
图2示出了本发明一个实施例中，快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法的流程示意图。在图2中，“待检测的DNA聚合酶”即“待测的DNA聚合酶”；“与引物最后一位碱基相同的dNTP-Dye”相当于图1中“带荧光标记且与检测引物的3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸相同的脱氧核苷酸(图中③所示)”；“Taq DNA聚合酶”即“无外切活性的Taq DNA聚合酶”；“与引物后第一位碱基相同的dNTP-Dye”相当于图1中“带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸(图中④所示)”；“与引物后第二位碱基相同的dNTP-Dye”相当于图1中“带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸(图中⑤所示)”。
在图2中，从左到右按照流程依次包括：引物杂交、第一步反应、第一次信号收集、第二步反应和第二次信号收集。
具体而言，设计特异的模板(即已知序列的核酸)，模板固定在固相上，针对dATP、dCTP、dTTP和dGTP四种脱氧核苷酸设计四种不同的引物序列，每种引物平行三个反应池。其中，每种引物的一个反应池加入待检测的DNA聚合酶和与引物后第一位待聚合的脱氧核苷酸相同的带荧光的脱氧核苷酸，分别作为各自的对照。对于检测组，第一步反应：使用待检测的DNA聚合酶聚合与引物的最后一个脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye，清洗没有结合上的dNTP-Dye后进行第一次信号收集；然后进行第二步反应：针对每个引物的两个反应池，分别加入与引物后的第一个脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye和与引物后的第二个脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye(此时使用无外切活性的Taq DNA聚合酶进行聚合)，清洗没有结合上的dNTP-Dye后进行第二次信号收集。如果第一次信号收集时检测不到信号或信号很低(接近背景)，且第二次信号收集时能够检测到与引物后第一位脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶没有外切和错配发生。如果第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时能够检测到与引物后的第一位脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了外切。如果第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时检测到与引物后的第二位脱氧核苷酸相同的dNTP-Dye的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了错配。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果，应当理解，实施例并不是限制性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
固定在固相上的DNA序列(模板)可以是固定在芯片上或磁珠上的，本实施例是在固定在芯片上的核酸序列(DNB，DNA nanoball)上进行。
1.器材：
Bgiseq1000测序仪(BGI)，测序芯片(BGI)，VWR加热板，PCR仪，PCR八连管。
2.试剂：
本实施例使用的试剂如下表1所示。
表1试剂
本实施例所使用的DNB上的固定序列为：
AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGCAT(SEQ ID NO：1)。
检测引物序列如下表2所示：
表2引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| 153_ACgA | ATGCAACTCCTTGGCTCACAGAAC(SEQ ID NO：2) |
| 153_CAtG | CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACA(SEQ ID NO：3) |
| 153_TAcG | CTTGGCTCACAGAACGACATGGCTA(SEQ ID NO：4) |
| 153_CTaC | CTTGGCTCACAGAACGACATGGCT(SEQ ID NO：5) |
3.试剂准备：
3.1制备DNB并将DNB固定在芯片上，此DNB上包含一段已知序列，能与设计的引物互补。
3.2将表2中的四种引物用1xTE buffer充分溶解至100uM，并用5XSSC稀释至4uM，放于冰上待用；
3.3用分子级水将NEBuffer 2和1Standard Taq Reaction Buffer稀释至1X，分别作为1X buffer 1和1X buffer2，放于冰上待用；
3.4按表3配置12个DNA聚合酶混合液I(待测的DNA聚合酶，此处以KlenowFragment(3'→5'exo-)为例)：
表3 DNA聚合酶混合液I
3.5按表4配置8个DNA聚合酶混合液II：
表4 DNA聚合酶混合液II
4.步骤：
共12个反应池，设置如下表5所示：
表5
| 反应池 | 杂交的引物 |
| 对照_T | 153_CAtG |
| 测试_1 | 153_CAtG |
| 测试_2 | 153_CAtG |
| 对照_G | 153_ACgA |
| 测试_3 | 153_ACgA |
| 测试_4 | 153_ACgA |
| 对照_A | 153_CTaC |
| 测试_5 | 153_CTaC |
| 测试_6 | 153_CTaC |
| 对照_C | 153_TAcG |
| 测试_7 | 153_TAcG |
| 测试_8 | 153_TAcG |
按照下表6的顺序，依次向12个反应池中加入各个反应试剂：
表6
5.实施例数据(Klenow Fragment(3'→5'exo-)的外切或错配测试结果如下表7所示：
表7
结果分析：
测试_1和测试_2的结果显示，第一次收集信号时，在应该聚合dTTP的位置，加入dATP-Cy3信号远远超过了正确聚合dATP-Cy3(对照_A)的信号的10％，说明此处发生了错配或外切；结合第二次收集信号的数据，测试_1的第二步加入dUTP-TexRd时信号小于正确聚合dUTP-TexRd(对照_T)时的信号的10％，而测试_2的第二步加入dGTP-Cy5时信号约为正确聚合dGTP-Cy5(对照_G)的信号的39％，说明此处聚合上了dGTP-Cy5而非dUTP-TexRd，从而得出结论，第一步时发生了AA错配而非外切；依次类推分析测试_3至测试_8的结果，KlenowFragment(3'→5'exo-)没有发生错配或外切；综合测试1至测试8的结果，可以得出结论：Klenow Fragment(3'→5'exo-)在只有一种dNTP存在于反应池时，没有外切活性，但是发生了AA错配(正确聚合时应为AT配对)。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法和试剂盒
<130> 17I24621
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tgcat 45
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcaactcc ttggctcaca gaac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caactccttg gctcacagaa cgaca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttggctcac agaacgacat ggcta 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cttggctcac agaacgacat ggct 24
Claims (9)
1.一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的方法，其特征在于，包括：
提供一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与所述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；
提供两个反应体系，使所述已知序列的核酸和所述检测引物在其内杂交，加入待测的DNA聚合酶以及带荧光标记的、与待聚合的脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第一次信号收集；
向所述两个反应体系中加入无外切活性的Taq DNA聚合酶，并且分别加入带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，然后清洗未被聚合的脱氧核苷酸，进行第二次信号收集；带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同；
提供第三个反应体系，使所述已知序列的核酸和所述检测引物在其内杂交，加入所述待测的DNA聚合酶和带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸进行反应，作为对照组；
综合分析所述第一次信号和所述第二次信号，判断所述待测的DNA聚合酶是否发生外切或错配；
若第一次信号收集时检测不到信号或信号很低、接近背景，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶没有外切和错配发生；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了外切；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时检测到与第二位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了错配；
所述一段已知序列的核酸为SEQ ID NO：1所示序列，所述检测引物为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5所示序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知序列的核酸固定在磁珠或芯片上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用链霉亲和素和生物素将核酸固定在磁珠或芯片上。
5.一种快速检测DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配的试剂盒，其特征在于，包括：
一段已知序列的核酸，以及针对一种待测脱氧核苷酸的检测引物，该检测引物与所述已知序列的核酸互补配对且3'羟基端的最后一个脱氧核苷酸和待聚合的前两位脱氧核苷酸互不相同；
与待聚合的脱氧核苷酸不同的带荧光标记的脱氧核苷酸，用于在反应池内与待测的DNA聚合酶、所述已知序列的核酸和所述检测引物一起进行反应以进行第一次信号收集；
无外切活性的Taq DNA聚合酶、带荧光标记的第一位待聚合的脱氧核苷酸和带荧光标记的第二位待聚合的脱氧核苷酸，用于在反应池内进行反应以进行第二次信号收集；
带荧光标记的脱氧核苷酸的荧光标记、第一位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记以及第二位待聚合的脱氧核苷酸的荧光标记互不相同；
所述一段已知序列的核酸为SEQ ID NO：1所示序列，所述检测引物为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5所示序列；
使用试剂盒进行DNA聚合酶3'-5'外切活性或错配检测时，若第一次信号收集时检测不到信号或信号很低、接近背景，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶没有外切和错配发生；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时能够检测到与第一位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了外切；若第一次信号收集时检测到信号，且第二次信号收集时检测到与第二位待聚合的脱氧核苷酸相同的荧光信号，则说明待测的DNA聚合酶发生了错配。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测引物包括四种，分别针对A、C、G、T四种待测脱氧核苷酸。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：反应池，用于在其内进行反应。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述已知序列的核酸固定在磁珠或芯片上。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，使用链霉亲和素和生物素将核酸固定在磁珠或芯片上。
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