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JP2022549048A - インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物 - Google Patents

インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物 Download PDF

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JP2022549048A
JP2022549048A JP2021575358A JP2021575358A JP2022549048A JP 2022549048 A JP2022549048 A JP 2022549048A JP 2021575358 A JP2021575358 A JP 2021575358A JP 2021575358 A JP2021575358 A JP 2021575358A JP 2022549048 A JP2022549048 A JP 2022549048A
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フィオナ イー． ブラック，
ジェフリー デニス ブローディン，
ロレンツォ ベルティ，
シュー ホン リョン，
ジェフリー エス． フィッシャー，
アレン エックハルト，
ルイ ジャン，
イン ナー テオ，
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イルミナ インコーポレイテッド
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Abstract

本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、アレイ上の標的リガンドの検出のための方法及び組成物を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブがサンプルからの標的リガンドに特異的に結合し、この捕捉プローブを含むビーズの位置がアレイ内で決定され、捕捉プローブ及びサンプルを識別するために、このビーズがデコードされる。いくつかの実施形態では、バーコードが、ビーズに取り付けられた捕捉プローブを示しており、インデックスが、ビーズのサブ集団を示している。いくつかの実施形態は、ビーズアレイ上のいくつかの異なる核酸サンプルから標的ポリヌクレオチドを配列決定することに関する。

Description

（関連出願）
本出願は、米国特許仮出願第６２／９０９，０１４号、２０１９年１０月１日出願、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＯＮ ＡＲＲＡＹ」、及び米国特許仮出願第６２／９０３，１０８号、２０１９年９月２０日出願、発明の名称「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＨＩＧＨ－ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ ＧＥＮＯＴＹＰＩＮＧ ＯＮ ＡＲＲＡＹＳ ＵＳＩＮＧ ＩＮＤＥＸＥＳ ＡＮＤ ＢＡＲＣＯＤＥＳ」の優先権を主張するものであり、これらの出願はそれぞれその全体が参照により組み込まれる。
（発明の分野）
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、アレイ上の標的リガンドの検出のための方法及び組成物を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブがサンプルからの標的リガンドに特異的に結合し、この捕捉プローブを含むビーズの位置がアレイ内で決定され、捕捉プローブ及びサンプルを識別するために、このビーズがデコードされる。いくつかの実施形態では、バーコードが、ビーズに取り付けられた捕捉プローブを示しており、インデックスが、ビーズのサブ集団を示している。いくつかの実施形態は、ビーズアレイ上のいくつかの異なる核酸サンプルからの標的ポリヌクレオチドの配列決定に関する。
生物学的サンプル中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物を識別及び分類する、感染症を診断する、遺伝子異常を検出及び特徴付ける、癌に関連する遺伝的変化を識別する、疾患に対する遺伝的感受性を調べる、並びに様々な種類の治療に対する応答を測定するための方法として使用されてきた。生物学的サンプル中の特定の核酸配列を検出するための一般的な技術は、核酸配列決定である。
核酸配列決定方法は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔによって使用された化学的分解法並びにＳａｎｇｅｒによって使用されたストランド伸長法から著しく進化している。現在では、単一チップ上での数千個の核酸の並行処理を可能にするいくつかの配列決定方法が使用されている。いくつかのプラットフォームは、ビーズベース及びマイクロアレイのフォーマットを含み、シリカビーズが、配列決定、遺伝子型決定、遺伝子発現プロファイリングを含む用途でのこのようなフォーマットの適用に応じたプローブで官能化される。
現在のビーズベースのアレイ上で異なるサンプルを遺伝子型決定する方法は、ビーズチップの異なる領域を複数のセクタに物理的に細分割するのにガスケットを必要とする。次いで、個々のサンプルを、ガスケットによって作成された各別個のセクションにロードする。しかしながら、そのような方法は、比較的少ないサンプル数の投入で使用されるが、ビーズチップ当たりのサンプルの密度が、ビーズチップ当たり２４～９６、３８４、１５３６、又はそれ以上のサンプルに増加すると、困難であり管理不能であることが立証されている。
いくつかの実施形態は、アレイ上の標的核酸を配列決定する方法であって、（ａ）ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）第１及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、（ｃ）第１の標的核酸を第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、第２の標的核酸を第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、（ｄ）ハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、（ｅ）第１及び第２のバーコードを配列決定することによって、アレイ上の第１及び第２のビーズの位置をデコードすることと、（ｆ）第１及び第２の捕捉プローブを伸長して、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、第１の複数のポリヌクレオチドは、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、第２の複数のポリヌクレオチドは、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、第１又は第２の複数のポリヌクレオチドは、複数のトランスポソームで核酸サンプルをタグ付けすることによって得られる。いくつかの実施形態では、複数のトランスポソームは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、タグ付けされた核酸サンプルにアダプターを付加することも含み、アダプターは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、第１又は第２のインデックスを含むプライマーで、タグ付けされた核酸サンプルを増幅することも含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、第１及び第２のインデックス、並びに第１及び第２のインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を、伸長された捕捉プローブに組み込む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団は、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、ビーズの第２の集団は、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のオリゴヌクレオチドは、第１のインデックスを含み、ビーズの第２の集団のオリゴヌクレオチドは、第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態では、第１のインデックスは、第１の標的核酸のソースを示し、第２のインデックスは、第２の標的核酸のソースを示す。いくつかの実施形態では、第１のインデックスは互いに同じであり、第２のインデックスは互いに同じである。
いくつかの実施形態はまた、第１及び第２のインデックスを配列決定することも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のインデックスを配列決定することは、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、インデックス結合プライマー部位（インデックスプライマー結合部位）は同じである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、異なる核酸サンプルから得られる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、ゲノムＤＮＡから得られる。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードは、第１又は第２の捕捉プローブの核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のバーコードは互いに異なり、第２のバーコードは互いに異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードを配列決定することは、バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は同じである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、ポリメラーゼ伸長を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、捕捉プローブへの単一のヌクレオチドの付加を含む。いくつかの実施形態はまた、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを伸長された捕捉プローブにライゲーションすることも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを捕捉プローブにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、溶液中で実施される。
いくつかの実施形態では、アレイは、フローセルの表面上に位置する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、アレイに取り付けられるように適合されている。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、磁性である。
いくつかの実施形態は、アレイ上の標的核酸を配列決定する方法であって、（ａ）ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）第１及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接する第２のプライマー結合部位を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、（ｃ）第１の標的核酸を第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、第２の標的核酸を第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、（ｄ）ハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、（ｅ）第１及び第２のバーコードを配列決定することによって、アレイ上の第１及び第２のビーズの位置をデコードすることと、（ｆ）第１及び第２の捕捉プローブを伸長して、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、（ｇ）第１及び第２のインデックスを配列決定することによって、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データのソースを決定することと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、第１の複数のポリヌクレオチドは、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、第２の複数のポリヌクレオチドは、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、第１又は第２の複数のポリヌクレオチドは、複数のトランスポソームで核酸サンプルをタグ付けすることによって得られる。いくつかの実施形態では、複数のトランスポソームは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、タグ付けされた核酸サンプルにアダプターを付加することも含み、アダプターは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、第１又は第２のインデックスを含むプライマーで、タグ付けされた核酸サンプルを増幅することも含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、第１及び第２のインデックス、並びに第１及び第２のインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を、伸長された捕捉プローブに組み込む。
いくつかの実施形態はまた、アレイ上の標的核酸を配列決定する方法であって、（ａ）ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）第１及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、（ｃ）第１の標的核酸を第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、第２の標的核酸を第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、（ｄ）ハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、（ｅ）第１及び第２のバーコードを配列決定することによって、アレイ上の第１及び第２のビーズの位置をデコードすることと、（ｆ）第１及び第２の捕捉プローブを伸長して、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のオリゴヌクレオチドは、第１のインデックスを含み、ビーズの第２の集団のオリゴヌクレオチドは、第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態では、第１のインデックスは、第１の標的核酸のソースを示し、第２のインデックスは、第２の標的核酸のソースを示す。いくつかの実施形態では、第１のインデックスは互いに同じであり、第２のインデックスは互いに同じである。
いくつかの実施形態はまた、第１及び第２のインデックスを配列決定することも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のインデックスを配列決定することは、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、インデックス結合プライマー部位は同じである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、異なる核酸サンプルから得られる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、ゲノムＤＮＡから得られる。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードは、第１又は第２の捕捉プローブの核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のバーコードは互いに異なり、第２のバーコードは互いに異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードを配列決定することは、バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は同じである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、ポリメラーゼ伸長を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブは、捕捉プローブへの単一のヌクレオチドの付加を含む。いくつかの実施形態はまた、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを伸長された捕捉プローブにライゲーションすることも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを捕捉プローブにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、溶液中で実施される。
いくつかの実施形態では、フローセルはアレイを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、アレイに取り付けられるように適合されている。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、磁性である。
いくつかの実施形態は、キットであって、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドを含むビーズの複数の集団であって、オリゴヌクレオチドが、インデックス、インデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位、捕捉プローブ、バーコード、及びバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含み、インデックスがビーズの集団間で異なる、複数の集団を含む、キットを含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位は、複数の集団において同じである。いくつかの実施形態では、バーコードは、捕捉プローブの核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、バーコードは、ビーズの集団において異なる。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、複数の集団において同じである。いくつかの実施形態はまた、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、核酸サンプルをタグ付けするためのトランスポソーム、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むトランスポソーム、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むアダプター、インデックスプライマー結合部位又はその相補体にハイブリダイズすることができるプライマー、並びにバーコードプライマー結合部位又はその相補体にハイブリダイズすることができるプライマー、から選択された試薬も含む。いくつかの実施形態はまた、フローセルも含む。
いくつかの実施形態は、インデックス化されたビーズの集団を調整する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、アダプター、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）複数のインデックスポリヌクレオチドを得ることであって、各インデックスポリヌクレオチドがインデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む、ことと、（ｃ）複数のインデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介してビーズの集団に取り付けることによって、インデックス化されたビーズの集団を得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ポリメラーゼ伸長によってアダプターを伸長することを含む。
いくつかの実施形態では、各インデックスポリヌクレオチドは、アダプター結合部位を含み、取り付けることは、アダプター結合部位をアダプターにハイブリダイズすることを含む。
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、インデックスポリヌクレオチドをアダプターにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、取り付けることは、スプリントポリヌクレオチドをアダプター及びインデックスポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを含む。
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、化学反応性部分を介して、複数のインデックスポリヌクレオチドをビーズの集団のアダプターに取り付けることを含む。いくつかの実施形態では、取り付けることは、クリックケミストリー反応を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの集団の第１のポリヌクレオチドは、互いに異なる捕捉プローブを含む。
いくつかの実施形態では、各インデックスポリヌクレオチドのインデックスは同じである。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。
いくつかの実施形態はまた、インデックス化されたビーズの集団を、標的核酸を含む複数の核酸と接触させることを含む。
いくつかの実施形態はまた、標的核酸を含む複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団を、追加のインデックス化されたビーズの集団と混合することを含み、追加のインデックス化されたビーズの集団は、複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団のインデックスとは異なるインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実行される。
いくつかの実施形態は、標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びバーコードプライマー結合部位に結合することができるアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、（ｃ）標的リガンドを捕捉プローブに特異的に結合することと、（ｄ）インデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることと、（ｅ）アレイ上の標的リガンドを検出することと、（ｆ）第１のポリヌクレオチドのインデックス及びバーコードを決定することと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ビーズの集団をアレイ上に分配することを含む。
いくつかの実施形態では、（ｆ）はインデックスプライマーをインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドからインデックスポリヌクレオチドをデハイブリダイズすることと、バーコードプライマーをバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、バーコードプライマーを伸長して、バーコードの配列を決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、アダプターとインデックスとの間に位置する切断可能なリンカーを更に含み、（ｆ）は、（ｉ）切断可能なリンカーを切断することと、（ｉｉ）アダプターを伸長して、バーコードの配列を決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、標的核酸にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実行される。
いくつかの実施形態は、標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、バーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第２のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、（ｃ）標的リガンドを捕捉プローブに特異的に結合することと、（ｄ）インデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介して第２のポリヌクレオチドに取り付けることと、（ｅ）アレイ上の標的リガンドを検出することと、（ｆ）第１のポリヌクレオチドのインデックス及びバーコードを決定することと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、バーコード、及びバーコードプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、（ｄ）は、反応性部分を第２のポリヌクレオチドに付加することを含み、アダプターは、反応性部分に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、反応性部分を付加することは、クリックケミストリー反応を含む。
いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ビーズの集団をアレイ上に分配することを含む。
いくつかの実施形態では、（ｆ）はインデックスプライマーをインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。
いくつかの実施形態では、（ｆ）はバーコードプライマーをバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、標的核酸にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実行される。
いくつかの実施形態は、アレイ上の標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、各ビーズが、標的リガンドに特異的に結合することができる捕捉プローブと、バーコード及びバーコードプライマー結合部位をコードする核酸であって、バーコードが捕捉プローブを示す、核酸と、インデックス及びインデックスプライマー結合部位をコードする核酸であって、インデックスが第１の集団又は第２の集団からのビーズのソースを示す、核酸と、を含む、ことと、（ｂ）ビーズの第１の集団を第１の標的リガンドを含む第１のサンプルと接触させることであって、第１の標的リガンドが、ビーズの第１の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第１の集団を得ることと、（ｃ）ビーズの第２の集団を第２の標的リガンドを含む第２のサンプルと接触させることであって、第２の標的リガンドが、ビーズの第２の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第２の集団を得る、ことと、（ｄ）標的結合されたビーズの第１の集団及び標的結合されたビーズの第２の集団を、アレイ上にランダムに分配することと、（ｅ）アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズの位置を検出することと、（ｆ）アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズのインデックス及びバーコードの配列を決定することと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、核酸を含む。いくつかの実施形態では、アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズの位置を検出することは、ポリメラーゼ伸長又はライゲーションによって捕捉プローブを伸長することを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｆ）の後に実施される。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のバーコードは、互いに異なるバーコードを含み、第２のビーズの集団のバーコードは、互いに異なるバーコードを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のインデックスは互いに同じであり、ビーズの第２の集団のインデックスは互いに同じである。
いくつかの実施形態では、アレイは、フローセルの表面上に位置する。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、アレイに取り付けられるように適合されている。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、磁性である。
５’リンカーを介してビーズに取り付けられた、バーコード、プライマー結合部位、及び捕捉プローブを含むポリヌクレオチドの例示的な実施形態を示す。
５’リンカーを介してビーズに取り付けられ、捕捉プローブとバーコードとの間に切断可能なリンカーを有する、捕捉プローブ、バーコード、及びプライマー結合部位を含むポリヌクレオチドの例示的な実施形態を示す。
３’リンカーを介してビーズに取り付けられた、バーコード、プライマー結合部位、及び捕捉プローブを含むポリヌクレオチドの例示的な実施形態を示す。
５’リンカーを介してビーズに取り付けられた、スペーサー、バーコード、プライマー結合部位、及び捕捉プローブを含むポリヌクレオチドの例示的な実施形態を示す。
ビーズの例示的な実施形態を示しており、取り付けられた第１のポリヌクレオチドは、バーコード、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含み、取り付けられた第２のポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む。
ビーズに取り付けられた捕捉プローブにハイブリダイズされた一塩基多型（ＳＮＰ）を含有する標的核酸の例示的な実施形態を示す。
検出可能なマーカーで伸長された捕捉プローブの例示的な実施形態を示す。
バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたバーコードプライマー、及びバーコードプライマーの伸長の例示的な実施形態を示す。
インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたインデックスプライマー、及びインデックスプライマーの伸長の例示的な実施形態を示す。
捕捉プローブを含む単一ポリヌクレオチドを含むビーズ（左パネル）、核酸捕捉プローブ、捕捉プローブを示すバーコードを含むポリヌクレオチド、及びビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別するためのインデックスを含むポリヌクレオチドを含むビーズ（中央パネル）、並びに抗体の抗体又は抗原結合断片を含む捕捉プローブ、捕捉プローブを示すバーコードを含むポリヌクレオチド、及びビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団から区別するためのインデックスを含むポリヌクレオチドを含むビーズ（右パネル）の例示的な実施形態を示す。
以下の例示的な実施形態：標的核酸にハイブリダイズされた第１及び第２の捕捉プローブを含むビーズであって、第１の捕捉プローブが切断可能なリンカーを含むビーズ（左パネル）、並びに基材に一時的に結合して検出可能な標識を含むシグナルを生成するタンパク質捕捉プローブを含むビーズ（右パネル）、を示す。
標的核酸がビーズ上の第１及び第２の捕捉プローブにハイブリダイズされ、第１の捕捉プローブが第２の捕捉プローブにライゲーションされ、切断可能なリンカーが切断されて、検出可能な標識を含む伸長された第１の捕捉プローブを含むビーズを生成する、二重プローブアッセイの例示的な実施形態を示す。
フローセル上に固定化されたビーズプールの写真である。
特定のビン内の特定のビーズタイプについての複製数の棒グラフである。
平均Ｃ強度対平均Ｔ強度のグラフである。平均Ｃ強度は、一対のヌクレオチド内の標識されたシトシンに由来する蛍光の強度であり、平均Ｔ強度は、一対のヌクレオチド内の標識されたチミジンに由来する蛍光の強度である。
代表的なサンプルについての特定のビン内の特定のビーズタイプの数のヒストグラムである。
標的核酸を含むポリヌクレオチドがインデックスも含む、アレイ上の標的核酸を配列決定するためのワークフローの実施形態を示す。 標的核酸を含むポリヌクレオチドがインデックスも含む、アレイ上の標的核酸を配列決定するためのワークフローの実施形態を示す。
ビーズがインデックスを含むアレイ上の標的核酸を配列決定するためのワークフローの実施形態を示す。
インデックス化されたビーズの集団を調製するためのワークフロー、及びマルチウェルプレート中のインデックス化されたビーズの使用の実施形態を示し、各ウェルは異なるサンプルを含有する。
ビーズに取り付けられた第１及び第２のポリヌクレオチドを有するビーズの概略図である。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマーＡ、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックスを含む。第２のポリヌクレオチドは、スペーサー及びリンカーＸ－Ｙを介してビーズに取り付けられている。
ビーズに取り付けられた第１及び第２のポリヌクレオチドを有するビーズの概略図である。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマーＡ、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位などのプライマーＢを含む。第２のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチド及びアダプターにハイブリダイズされたスプリントを介してビーズに取り付けられている。第２のポリヌクレオチドは、アダプターにライゲートすることができる。
ビーズに取り付けられた第１及び第２のポリヌクレオチドを有するビーズの概略図である。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマーＡ、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス、インデックスプライマー結合部位などのプライマーＢ、及びアダプター結合部位を含む。第２のポリヌクレオチドは、ビーズに取り付けられたアダプターへのハイブリダイゼーションを介してビーズに取り付けられている。アダプターを伸長して、インデックスの相補体、及びプライマーＢを組み込むことができる。
ビーズに取り付けられた第１のポリヌクレオチドを有するビーズの概略図である。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマー、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス、インデックスプライマー結合部位などのプライマー２、ウリジン切断部位などの任意選択的な切断可能な部位を含むことができるスペーサー、及びバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたアダプターを含んで示されている。
インデックスポリヌクレオチドがビーズに取り付けられた第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、アレイ上の標的核酸を検出するためのワークフローの実施形態を示す。
ビーズに取り付けられた第１及び第２のポリヌクレオチドを有するビーズの概略図である。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマーＡ、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位の繰り返しを含む。
インデックスポリヌクレオチドが反応性基を介してビーズに取り付けられているアレイ上の標的核酸を検出するためのワークフローの実施形態を示す。
アレイ上の標的核酸を検出するためのワークフローの実施形態を示し、図１５Ａのワークフローの続きである。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、アレイ上の標的リガンドの検出のための方法及び組成物を含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、核酸、タンパク質、又は他の抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブがサンプルからの標的リガンドに特異的に結合し、この捕捉プローブを含むビーズの位置がアレイ内で決定され、捕捉プローブ及びサンプルを識別するために、このビーズがデコードされる。いくつかの実施形態では、バーコードが、ビーズに取り付けられた捕捉プローブを示しており、インデックスが、ビーズのサブ集団を示している。いくつかの実施形態では、バーコード及びインデックスは、配列決定によって決定される。いくつかの実施形態はまた、ビーズに取り付けられた第１及び第２の捕捉プローブが標的核酸の存在下で一緒にライゲーションされ、ライゲーション生成物の末端がビーズから切断され、ビーズが、アレイ上で検出及びデコードされた伸長された捕捉プローブを含む、二重プローブアッセイも含む。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、アレイ上でのハイスループット遺伝子型決定に関する。いくつかの実施形態は、アレイ内の微小特徴部（マイクロフィーチャ）の位置をデコードすることに関する。いくつかの実施形態では、微小特徴部は、バーコード及びインデックスを有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態は、バーコード及びインデックスを配列決定して、アレイ内のポリヌクレオチドの位置を識別することを含む。本明細書に開示される方法及び組成物に有用であり得る特定の態様は、その全体が参照により組み込まれる国際公開第２０２０／０８６７４６号に開示されている。
ハイブリダイゼーションによるデコードは、捕捉プローブのランダムに分配されたアレイ内の捕捉プローブの位置を識別することを含む。この方法は、典型的には、標識されたハイブリダイゼーションプローブを捕捉プローブの１つ又はそれ以上の部分にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションイベントを撮像し、ハイブリダイゼーションプローブを除去する、数回の連続的なサイクルを伴う。ハイブリダイゼーションによるデコードは、特殊な試薬、特殊な流体デバイス、及び特殊な検出器を必要とする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションによるデコードは、７～８回の連続的なサイクルと共に最大８時間かかり得る。
本明細書で提供される実施形態は、プライマー結合部位及びバーコードを含むポリヌクレオチドのランダムに分配されたアレイを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、ハイスループット配列決定システムを使用してアレイをデコードするために、容易に配列決定することができる。いくつかの実施形態は、追加の試薬、ハイブリダイゼーションプローブ、又は特殊なデコーディング機器なしで、アレイをデコードするためにかかる時間を大幅に短縮することができる。
いくつかの実施形態は、次世代配列決定（ＮＧＳ）技術及びビーズベースのマイクロアレイの使用を含む。いくつかのこのような実施形態は、基材及び試薬に対するわずかな改変と共に一般的なＮＧＳ配列決定プラットフォーム上で実行することができる、高性能、低コスト、かつハイスループットの遺伝子型決定アッセイをもたらす。
いくつかの多重化方法では、各サンプルを物理的に分離した状態に維持することによって、異なるソースからの複数の核サンプルを並行して処理することができる。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、各サンプルを、関連するビーズ上のインデックスを介してインデックス化することによって、全ての工程において個々のサンプルを分離する物理的バリアの必要性をなくす、核酸インデックス化方法を含む。いくつかの実施形態では、インデックス逆多重化（多重分離）は、配列決定によって実施されるものであり、標準的な合成による配列決定（ＳＢＳ）ケミストリーを使用してユーザの現場で実行することができる。加えて、標準的なプラットフォーム及びＳＢＳケミストリーを使用して顧客の現場で実装することができる、配列決定によるデコード（ＤＢＳ）アプローチを採用することによって、ビーズアレイの内部デコードに起因するコスト、スペース、及び時間の制限が低減される。
いくつかの実施形態は、図５Ａに示されるビーズを含むインデックス化された濃縮ビーズプールを含む。いくつかのそのような実施形態では、ビーズは、遺伝子座特異の捕捉プローブ、アレイ上での関連するプローブの位置識別のためのバーコード、及びバーコードのＳＢＳ読み取りのためのバーコードプライマー結合部位を含む、第１のポリヌクレオチドと、サンプル多重化のためのインデックス、及びインデックスのＳＢＳ読み取りのためのインデックスプライマー結合部位を含む、第２のポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズプール複雑性は、捕捉プローブの数、すなわちプレキシティ（plexity）（Ｎ）によって、及び支持されるサンプルの数（Ｓ）によって定義される。したがって、プレキシティＮ及びＳ個のサンプルを支持するビーズプールは、Ｓ×Ｎ個の固有のビーズタイプからなる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブ及び／又はインデックスプライマーは、２つのオリゴヌクレオチドのうちの１つでのＳＢＳ中の干渉を回避するために、追加の３’直交ブロッカーを含む。
いくつかの実施形態は、Ｓ個のウェルを含むマルチウェルプレートにＳ個のビーズプールがロードされる遺伝子型決定アッセイを行うことを含み、各ビーズプールは固有のサンプルインデックスを有し、各ウェルはＮ個の固有のビーズタイプを含む。ランダムプライマー増幅、その後の酵素的断片化、及びクリーンアップを含む工程で核酸サンプルを処理するなど、サンプルからの核酸ライブラリ生成後、各サンプルライブラリが、インデックス化されたウェルに添加され、捕捉プローブにハイブリダイズさせられる。ハイブリダイゼーションが完了した後、蛍光ヌクレオチド及び適切なポリメラーゼを含むインコーポレーションミックスを添加することにより、対象となるＳＮＰをプローブするための一塩基伸長アッセイが実行される。この取り込みの最後に、プレート内の全てのビーズ捕捉サンプルがプールされ、フローセルにロードされる。フローセルは、そのままにすることも、パターン化することもでき、表面は、ビーズの固定化を所望の密度で支持するように適切に修正することができる。いくつかの実施形態では、ビーズ固定化時に、ＳＮＰ部位での蛍光インコーポレーション由来のシグナルを読み取るための１回のスキャンサイクルを含むＳＮＰリードアウトが実施される。このサイクルは、器具上でのＳＢＳサイクルを含んでもよい。また、フローセル内の特定のビーズの捕捉プローブ及び位置を識別するために、ビーズプールプレキシティに応じて、１２～２０回のＳＢＳサイクルを含むバーコードリードアウトも実施される。いくつかの実施形態では、この工程は、識別されたＳＮＰを通り越して配列決定する追加のサイクルによって置き換えることができる。また、サンプルインデックスを読み取るための６～１２回のＳＢＳサイクルを含むサンプルインデックスリードアウトも実施される。いくつかの実施形態では、フローセル上のアッセイ全体は、約３０回未満のＳＢＳサイクルを含むことができ、４時間未満で実行することができる。
いくつかの実施形態は、アレイ上の標的ポリヌクレオチドの配列決定方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態は、ビーズアレイ上のいくつかの異なる核酸サンプルからの標的ポリヌクレオチドの配列決定に関する。いくつかのそのような実施形態では、インデックス配列は、核酸サンプルからの標的核酸に関連付けられる。
本発明の一実施形態では、ガスケットは、遺伝子アレイの様々な領域を細分割するためには使用されない。代わりに、インデックス配列をサンプルに付加して、ビーズにハイブリダイズされたサンプルを区別し、高プレキシティサンプルプールを支持する。いくつかの実施形態では、インデックスをビーズプール又はサンプルのいずれかに付加することができる。
実施形態は、多くの異なる核酸サンプルからのポリヌクレオチドライブラリの調製、及び各核酸サンプルの標的核酸における一塩基多型、挿入、欠失などの特定の特徴の存在を決定することに関する。ポリヌクレオチドライブラリは、標的核酸の特定の特徴の存在についてアレイ上で並列に調査される。
いくつかの実施形態では、各核酸サンプルは、核酸サンプルに由来するポリヌクレオチドのライブラリが同じインデックスを含むように、異なるインデックス配列に関連付けられる。標的核酸は、標的核酸をビーズに取り付けられた捕捉プローブに選択的にハイブリダイズし、捕捉プローブを伸長し、アレイ上の捕捉プローブの伸長を検出することによって、ポリヌクレオチドのライブラリにおいて識別される。各捕捉プローブは、バーコードを含むことができ、したがって、捕捉プローブは、アレイ上の捕捉プローブに関連付けられたバーコードを配列決定することによって識別することができる。いくつかのそのような実施形態では、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブ及びバーコードを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに関連付けられたインデックスを、アレイ上で配列決定することができる。捕捉プローブの伸長のためのアレイ上のシグナルの位置、バーコードの配列、及びインデックスの配列は、特定の核酸サンプルからの標的核酸中の一塩基多型、挿入、欠失などの特定の特徴の存在を識別することができる。いくつかの実施形態では、多くの異なる核酸サンプルを単一のアレイ上で試験することができる。
本明細書で使用される場合、「アレイ」は、異なるマイクロフィーチャが相対位置に従って互いに区別され得るように表面に結合又は取り付けられているポリヌクレオチドを含むマイクロフィーチャなどの、異なるマイクロフィーチャの集団を指すことができる。アレイの個々の特徴部（フィーチャ）は、マイクロフィーチャの単一のコピーを含むことができ、又はマイクロフィーチャの複数のコピーは、アレイの個々のフィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団として存在することができる。各フィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団は、典型的には均質であり、単一種のマイクロフィーチャを有する。したがって、単一の核酸配列の複数のコピーが１つのフィーチャに、例えば、同じ配列を有する複数の核酸分子上に存在し得る。
いくつかの実施形態では、マイクロフィーチャの不均質な集団が１つのフィーチャに存在し得る。したがって、特徴部は、単一の微小特徴種のみを含んでもよいが、必ずしも必須ではなく、代わりに、異なる配列を有する核酸の混合物など、複数の異なる微小特徴種を含有することができる。アレイの隣接する特徴部は、それらが重なり合わないという点において、互いに別個とすることができる。したがって、特徴部は、互いに隣接していても、ギャップによって分離されていてもよい。特徴部が離間されている実施形態では、隣接する部位は、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ、１００ｐｍ、５０ｐｍ、１ｐｍ未満の距離、又は前述の距離のうちのいずれか２つの範囲内の任意の距離で分離させることができる。アレイ上のフィーチャのレイアウトは、隣接するフィーチャ間の中心間距離の観点から理解することもできる。本発明において有用なアレイは、約１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ、１００ｐｍ、５０ｐｍ、１ｐｍ未満、又は前述の距離のうちのいずれか２つの範囲内の任意の距離の中心間間隔の隣接する特徴部を有することができる。
いくつかの実施形態では、上記及び本明細書の他の場所に記載の距離値は、アレイの隣接する特徴部の間の平均距離を表すことができる。したがって、例えば、距離がアレイの全ての隣接するフィーチャ間の閾値距離を構成するという特定の記述によって特に別段に指示されない限り、全ての隣接するフィーチャが指定された範囲にある必要はない。実施形態は、様々な密度のいずれかで特徴部を有するアレイと共に使用することができる。特定の実施形態の密度の例示的な範囲は、約１０，０００，０００の特徴部／ｃｍ２～約２，０００、０００，０００の特徴部／ｃｍ２；約１００，０００，０００の特徴部／ｃｍ２～約１，０００，０００，０００の特徴部／ｃｍ２；約１００，０００の特徴部／ｃｍ２～約１０，０００、０００特徴部／ｃｍ２；約１，０００，０００特徴部／ｃｍ２～約５，０００，０００の特徴部／ｃｍ２；約１０，０００の特徴部／ｃｍ２～約１００，０００の特徴部／ｃｍ２；約２０，０００の特徴部／ｃｍ２～約５０，０００特徴部／ｃｍ２；約１，０００特徴部／ｃｍ２～約５，０００特徴部／ｃｍ２、又は前述の密度のうちのいずれか２つの範囲内の任意の密度、を含む。
本明細書で使用される場合、「表面」は、試薬、ビーズ又は分析物と接触するためにアクセス可能な基材又は支持構造体の一部を指すことができる。表面は、実質的に平坦又は平面であり得る。あるいは、表面は丸みを帯びているか、又は輪郭付けられ得る。表面上に含まれ得る例示的な輪郭は、ウェル、くぼみ、柱、隆起部、チャネルなどである。基材又は支持構造として使用することができる例示的な材料としては、改質又は官能化ガラスなどのガラス；プラスチック、例えば、アクリル、ポリスチレン、又はスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、又はＴＥＦＬＯＮ（登録商標）；多糖類又は架橋多糖類、例えば、アガロース又はセファロース；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；ケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ又はシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバーバンドル、又は様々な他のポリマーが挙げられる。単一の材料又はいくつかの異なる材料の混合物は、本発明において有用な表面を形成することができる。いくつかの実施形態では、表面はウェルを含む。いくつかの実施形態では、支持構造体は、１つ又はそれ以上の層を含むことができる。例示的な支持構造体としては、チップ、フィルム、マルチウェルプレート、及びフローセルを挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「ビーズ」は、剛性又は半剛性材料で作られた小さな物体を指すことができる。物体は、例えば、球体、楕円形、微小球、又は規則的若しくは不規則な寸法を有するかどうかに関わらず他の認識された粒子形状として特徴付けられる形状を有することができる。ビーズに有用な例示的な材料の例としては、改質又は官能化ガラスなどのガラス；プラスチック、例えば、アクリル、ポリスチレン、又はスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、又はＴＥＦＬＯＮ（登録商標）；多糖類又は架橋多糖類、例えば、アガロース又はセファロース；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；ケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ又はシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；又は他の様々なポリマーが挙げられる。例示的なビーズとしては、制御された細孔ガラスビーズ、常磁性ビーズ、トリアゾル（thoria sol）、セファロースビーズ、ナノ結晶、及び当該技術分野で公知の他のものが挙げられる。ビーズは、生物学的又は非生物学的材料で作製され得る。磁性ビーズは、本明細書に記載される方法の様々な工程における磁石を使用した磁性ビーズの操作の容易さにより、特に有用である。特定の実施形態で使用されるビーズは、約０．１μｍ～約１００μｍ、約０．１ｎｍ～約５００ｎｍの直径、幅、又は長さを有することができる。いくつかの実施形態では、特定の実施形態で使用されるビーズは、約１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ、１００ｐｍ、５０ｐｍ、１ｐｍ未満の直径、幅、若しくは長さ、又は前述の直径、幅、若しくは長さのうちのいずれか２つの範囲内の任意の直径、幅、若しくは長さを有することができる。ビーズサイズは、特徴部を分析するために十分なシグナル（１特徴部当たりのテンプレートコピー数）を維持しながら、縮小されたサイズを有するように選択することができ、したがって、単位面積当たりにより多くの特徴部を得ることができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドをビーズに取り付けることができる。いくつかの実施形態では、ビーズは、基材の表面上のウェル内に分配することができる。特定の実施形態で使用することができる例示的なビーズアレイとしては、ランダムに順序付けられたビーズアレイの技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）が挙げられる。そのようなビーズアレイは、Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７０、１２４２－８（１９９８）、Ｗａｌｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７、４５１－２（２０００）；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ６８：６９－７８（２００３）；Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ３７：５４９－５４（２００５）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１６５：１７９９－８０７（２００４）；Ｆａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ１４：８７８－８５（２００４）；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １４：２３４７－５６（２００４）；Ｙｅａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０：３５３－８（２００２）；及びＢｉｂｉｋｏｖａｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ１６：３８３－９３（２００６）に開示されており、それらはそれぞれその全体が参照により組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、互換的に使用され得、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すことができる。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、又は多本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。用語「ポリヌクレオチド」はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。ポリヌクレオチドの例としては、遺伝子若しくは遺伝子断片、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）（Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）など）、低分子ヘアピン型（ｓｈＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及びウイルスＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、又は上記のいずれかの増幅コピーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、及び非天然塩基を有するヌクレオチド、アザプリン又はデアザプリンなどの修飾天然塩基を有するヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の特定の配列で構成することができる。ウラシル（Ｕ）はまた、例えば、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、チミンの天然代替物として存在することができる。ウラシルは、ＤＮＡにも使用することができる。したがって、用語「配列」は、天然及び非天然塩基を含む、ポリヌクレオチド又は任意の核酸分子のアルファベット表現を指す。
本明細書で使用するとき、「標的核酸」又はその文法的等価物は、配列決定、分析、及び／又は更なる操作が望まれる核酸分子又は配列を指すことができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、アレイに取り付けることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブをアレイに取り付けることができ、続いてこのアレイを使用して、プローブと相互作用するサンプル中の標的核酸を検出することができる。この点に関して、いくつかの実施形態では、用語「標的」及び「プローブ」が核酸検出方法に関して互換的に使用され得ることは理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、「捕捉プローブ」は、標的核酸に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドを指すことができる。捕捉プローブは、混合物中の他の核酸及び／又は構成成分から標的核酸を単離するための親和性結合分子として機能することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、介在分子を介して捕捉プローブによって特異的に結合されることができる。介在分子の例としては、標的配列及び捕捉プローブの両方に特異的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するリンカー、アダプター、及び他の架橋核酸が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、又はその文法的等価物は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、少なくとも部分的にはヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって形成される複合体を形成する反応を指すことができる。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合、又は他の任意の配列特異的方法で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせを有することができる。鎖はまた、水素結合に加えて、力によって架橋又は結合され得る。
本明細書で使用される場合、「伸長する」、「伸長」、又はそれらの任意の文法的等価物は、ポリメラーゼなどの伸長酵素によるプライマー、ポリヌクレオチド又は他の核酸分子へのｄＮＴＰの付加を指すことができる。例えば、本明細書に開示されるいくつかの方法では、得られる伸長されたプライマーは、ＲＮＡの配列情報を含む。いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、又は逆転写酵素を使用して伸長を実施するものとして論じられているが、伸長は、当該技術分野において周知の任意の他の方法で実施することができる。例えば、伸長は、対象となるストランドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドなど、ランダムなオリゴヌクレオチドの短い断片を共にライゲーションすることによって実施することができる。
本明細書で使用される場合、「ライゲーション」又は「ライゲートする」又はそれらの他の文法的等価物は、ホスホジエステル結合による２つのヌクレオチド鎖の結合を指すことができる。そのような反応は、リガーゼによって触媒され得る。リガーゼは、ＡＴＰ又は同様の三リン酸の加水分解でこの反応を触媒する酵素のクラスを指す。
配列決定によるデコード
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ハイスループット配列決定を使用してアレイの微小特徴部の位置をデコードすることを含む。いくつかの実施形態では、アレイの微小特徴部は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基材の表面上にランダムに分配することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位及びバーコードを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、捕捉プローブ、プライマー結合部位、及びバーコードを含むことができる。
アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードするいくつかの実施形態は、（ａ）基材の表面上に分配されたポリヌクレオチドのアレイを有する基材を得ることであって、各ポリヌクレオチドが、バーコード及びプライマー結合部位を含む、ことと、（ｂ）複数のプライマーをプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、（ｃ）ハイブリダイズされたプライマーを伸長することによってバーコードの配列を決定することと、を含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、各バーコードの配列は、アレイ内のポリヌクレオチドの位置を示すことができる。例えば、いくつかの実施形態では、アレイは、バーコードが特定の捕捉プローブと関連付けられることが既知のポリヌクレオチドで調製することができ、その結果、アレイ上のバーコードの位置を識別することにより、関連する捕捉プローブの位置を示すことができる。そのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、共通の要素を介して捕捉プローブと関連付けられることができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブはそれぞれ、ビーズなどの同じ微小特徴部に結合されることができる。より多くのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含むことができる。
いくつかの実施形態では、バーコードは、アレイ内のポリヌクレオチドを識別するために使用することができる核酸配列を含むことができる。バーコードは、他のバーコードと区別できる固有のヌクレオチド配列を含むことができる。また、バーコードの配列によって、及びまたポリヌクレオチド内のバーコードの位置によって、例えばプライマー結合部位の５’位置によって、ポリヌクレオチド内及び標的核酸内の他のヌクレオチド配列と区別することができる。例えば、いくつかの実施形態では、バーコードの配列が、複数の核酸中に２回以上存在し得るが、プライマー結合部位の５’に位置するバーコードを検出することができる。バーコードは、集団内の複数のバーコード内、並びに／又は分析若しくは検討される複数のポリヌクレオチド及び標的核酸内の固有のヌクレオチド配列であるのに十分な任意の所望配列長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、約６～３０ヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチド内の核酸又は領域である。バーコードは、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド、又はそれより長くすることができる。例えば、バーコードは、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチド、又はそれより長くすることができる。いくつかの実施形態のための好適なバーコードは、米国特許第８，０５３，１９２号に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、バーコードは、各バーコードが別のバーコードとは異なるように、あるポリヌクレオチドをアレイ内の別のポリヌクレオチドから区別することができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、バーコードのセットがバーコードの別のセットとは異なるように、ポリヌクレオチドの集団をアレイ内のポリヌクレオチドの別の集団と区別することができる。本明細書で提供される方法及び組成物に有用ないくつかの態様は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０３３４７１１（Ａ１）号及び米国特許出願公開第２０１９００８５３８４（Ａ１）号に開示されている。いくつかの実施形態では、バーコードは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、プライマー結合部位は、プライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーが伸長させられて、バーコードの相補体を提供することができるように、バーコードの３’とすることができる。例えば、プライマーは、バーコードの配列を得るために伸長させることができる。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位は、ポリヌクレオチド内のバーコードに直接隣接することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの集団内の各プライマー結合部位は、同じ配列を有することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのサブ集団は、第１の配列を有するプライマー結合部位を含むことができ、ポリヌクレオチドの別のサブ集団は、第２の配列を有するプライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、異なるプライマーを複数の異なるプライマー結合部位にハイブリダイズすることは、同時に、連続的に、又は反復的に行われることができる。
いくつかの実施形態は、捕捉プローブを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、標的核酸とハイブリダイズすることができる配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの集団は、互いに異なる捕捉プローブを含むことができる。いくつかの実施形態では、各捕捉プローブは、互いに異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは互いに類似していてもよく、例えば、それらは、類似の配列、及び／又は類似の長さを有する類似の配列を有することができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２未満の数のヌクレオチドで互いに異なることができ、この数のヌクレオチドは、捕捉プローブ内の連続するヌクレオチド、連続していないヌクレオチド、挿入したヌクレオチド、又は欠失したヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、単一のヌクレオチドで別の捕捉プローブと異なることができる。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位及びバーコードは、捕捉プローブの５’とすることができる。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位及びバーコードは、捕捉プローブの３’とすることができる。
いくつかの実施形態は、切断可能なリンカーを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、切断可能なリンカーは、リンカーを切断すると、捕捉プローブをプライマー結合部位及びバーコードから分離させることができるように、配置することができる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、捕捉プローブと、プライマー結合部位及びバーコードとの間のポリヌクレオチド内に配置することができる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、捕捉プローブに連結されたプライマー結合部位及びバーコードを含むポリヌクレオチドを除去することができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブは両方とも、ビーズに結合されることができる。切断可能なリンカーの切断は、プライマー結合部位及びバーコードを含むポリヌクレオチドをビーズから除去することができる。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００個のヌクレオチドに対応する長さ、又は前述の長さのうちのいずれか２つの範囲内の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、光、塩基、酸などの作用因子、及び／又は配列特異的な制限酵素又はプロテアーゼなどの酵素による切断を受けやすい。切断可能なリンカーは、酵素の認識部位など、ヌクレオチドの特定の配列を含むことができ、及び／又は作用因子による切断を受けやすい特定の修飾ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはウラシルを含むことができ、ウラシルは、ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）などの外因性塩基切断作用因子によって切断可能である。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、８－ヒドロキシグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＦＰＧタンパク質）によって切断することができる８－ヒドロキシグアニンを含むことができる。切断可能なリンカーの多くの例は、米国特許出願公開第２００５／０１８１３９４号に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基材に取り付けられている。いくつかの実施形態では、基材はビーズを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ビーズ又は他の表面などの基材に、ポリヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又はその付近における基材表面への単点共有結合によって固定化することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基材に取り付けられているスペーサーを含むことができる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、５００個のヌクレオチドに対応する長さ、又は前述の長さのうちのいずれか２つの範囲内の長さを有することができる。当該技術分野において既知の任意の好適な共有結合手段をこの目的のために使用することができる。選択された付着化学的物質は、固体支持体の性質、及びそれに適用される任意の誘導体化又は官能化に依存する。ポリヌクレオチドは、結合を促進する部分を含んでもよく、この部分は、非ヌクレオチド化学修飾であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、５’末端に位置する、ホスホロチオエート又はチオホスフェートなど、硫黄含有求核剤を含み得る。固体に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルの場合、この求核剤はヒドロゲルに存在するブロモアセトアミド基に結合する。ポリヌクレオチドを固体支持体に取り付ける例示的な手段は、重合アクリルアミド及びＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）からなるヒドロゲルへの５’ホスホロチオエート結合を介するものであり、これは、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，１６８，３８８号に開示されている。
いくつかの実施形態では、アレイ中のポリヌクレオチドの位置は、ポリヌクレオチドのバーコードを配列決定することによってデコードすることができる。例えば、バーコードの配列は、アレイ上の部位と関連付けることができ、部位は、特定の捕捉プローブと関連付けることができる。いくつかの実施形態は、クローン増幅された分子の及び単一の核酸分子の大規模平行配列決定を可能にする配列決定法を指し得る次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む。ＮＧＳの例としては、可逆的ダイターミネーターを使用した合成による配列決定（ＳＢＳ）、及びライゲーションによる配列決定が挙げられる。ＳＢＳにおいて、核酸テンプレートに沿った核酸プライマーの伸長を監視して、テンプレート中のヌクレオチド配列を決定する。基礎をなす化学プロセスは、重合であり得る。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳ実施形態では、プライマーに付加されたヌクレオチドの順序及び型の検出を使用してテンプレートの配列を決定することができるように、蛍光標識されたヌクレオチドが付加されて、プライマーをテンプレート依存様式で伸長する。
１つ以上の増幅された核酸は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むＳＢＳ又は他の検出技術に供することができる。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ又はそれ以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ又はそれ以上の増幅された核酸分子を収容するヒドロゲルビーズに流入／通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加して、デブロッキング作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆終端を使用する実施形態では、検出が行われる前又はその後に、デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次いで、このサイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎヌクレオチドだけ伸長させ、これにより、長さｎの配列を検出することができる。
いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、市販されている電気検出器及び関連する技術を使用することができる。そのような配列決定システムの例は、Ｒｏｃｈｅの子会社の４５４Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製の市販プラットフォームなどのパイロシーケンシング、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の市販プラットフォームなどのγ－ホスファイト標識ヌクレオチドを使用する配列決定、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社のＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ製の市販プラットフォームなどのプロトン検出を使用する配列決定である。いくつかの実施形態は、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号及び同第２００６／０１３４６３３号、並びに米国特許第４，９７１，９０３号、同第６，２５８，５６８号、及び同第６，２１０，８９１号に記載されているパイロシーケンシングを含み、それぞれその全体が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態は、米国特許第５，５９９，６７５号、及び米国特許第５，７５０，３４１号に開示されるライゲーションによる配列決定を含み、これらはそれぞれその全体が参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を通して、又はゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。別の有用な配列決定技術は、ナノ細孔配列決定である。いくつかのナノポアの実施形態では、標的核酸又は標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノ細孔を通過するとき、各ヌクレオチド型は、細孔の電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別することができる。
図１に示されるように、いくつかの実施形態では、アレイの微小特徴部は、５’リンカー２０を介してビーズ１０に取り付けられたポリヌクレオチドを含むことができる。ポリヌクレオチドは、バーコード３０、プライマー結合部位４０、及び捕捉プローブ５０を含むことができる。プライマー６０は、プライマー結合部位にハイブリダイズし、伸長させられて、アレイ内の微小特徴部の位置をデコードするためのバーコードの配列を得ることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、標的核酸にハイブリダイズすることができ、捕捉プローブは、例えば、ポリメラーゼによって、又はリガーゼによって、伸長させられることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ブリッジ増幅に参加することができる。ブリッジ増幅の方法は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に開示されており、これらはそれぞれその全体が参照により組み込まれる。
図２に示されるように、いくつかの実施形態では、アレイの微小特徴部は、捕捉プローブ５０、バーコード３０、及びプライマー結合部位４０を含むポリヌクレオチドを含むことができ、ポリヌクレオチドは、５’リンカー２０を介してビーズ１０に取り付けられている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、捕捉プローブとバーコードとの間に切断可能なリンカー７０を含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマー６０は、プライマー結合部位にハイブリダイズされることができ、バーコードの配列が決定され、これにより、アレイ内の微小特徴部の位置をデコードすることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは切断することができ、バーコード及びプライマー結合部位が、ビーズ及び捕捉プローブを含む微小特徴から除去される。いくつかのこのような実施形態は、標的核酸を捕捉プローブとハイブリダイズする前に、デコードされたアレイを提供する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、アレイ内のデコードされた位置で捕捉プローブにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブは、例えば、ポリメラーゼによって、又はリガーゼによって、伸長させられることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ブリッジ増幅に参加することができる。
図３に示されるように、いくつかの実施形態では、アレイの微小特徴部は、３’リンカー２５を介してビーズ１０に取り付けられた、バーコード３０、プライマー結合部位４０、及び捕捉プローブ５０を含むポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位は、ビーズに結合されたリンカーに当接することができる。いくつかの実施形態は、特定のポリメラーゼをスクリーニング及び開発するためのアッセイにおけるこのような微小特徴部の使用を含むことができる。例えば、ポリメラーゼの活性は、スペーサーを有するビーズに取り付けられたプライマー部位と比較して、スペーサーを有しないビーズに取り付けられたプライマー部位についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、捕捉プローブにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた標的核酸は、例えば、ポリメラーゼによって、又はリガーゼによって、伸長させられる。
図４に示されるように、アレイの微小特徴部の実施形態は、５’リンカー２０を介してビーズ１０に取り付けられた、スペーサー８０、バーコード３０、プライマー結合部位４０、及び捕捉プローブ５０を含むポリヌクレオチドを含むことができる。
複数の標的核酸の配列決定
いくつかの実施形態は、複数の標的核酸を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、異なる被験者など、異なるソース、例えば、異なる被験者からのゲノムＤＮＡに、由来することができる。いくつかの実施形態では、異なる標的核酸は、異なるインデックスと関連付けることができ、その結果、インデックスは、単一のソースに由来する集団など、標的核酸の特定の集団を識別することができる。
いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも第１及び第２のサブ集団を得ることを含み、各ビーズは、捕捉プローブ、同じビーズの捕捉プローブを示すバーコード、及びバーコードのバーコードプライマー結合部位３’を含む第１のポリヌクレオチドと、インデックス及びインデックスのインデックスプライマー結合部位３’を含む第２のポリヌクレオチドと、を含み、第１のサブ集団のインデックスは、第２のサブ集団のインデックスとは異なる。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含み、ビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び／又は第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なるヌクレオチド配列を含む。例えば、第１のサブ集団の捕捉プローブは互いに異なっていてもよく、及び／又は第１のサブ集団の捕捉プローブは、互いに異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、ビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブと同じヌクレオチド配列を有する捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、一塩基多型（ＳＮＰ）又はその相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態はまた、第１の標的核酸をビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブにハイブリダイズし、第２の標的核酸をビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブにハイブリダイズすることも含む。いくつかのそのような実施形態では、第１の標的核酸をビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブにハイブリダイズすること、及び第２の標的核酸をビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブにハイブリダイズすることは、異なる位置で実施される。例えば、異なる位置は、多層プレート内の異なるウェルなど、異なるウェルなどの異なる反応体積を含む。例えば、９６ウェルプレートでは、ビーズの９６の異なるサブ集団が９６個の異なる標的核酸とハイブリダイズされることができ、ビーズの各異なるサブ集団は、異なるウェル内の異なる標的核酸にハイブリダイズされる。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの異なるサブ集団は、平面の基材など、基材上に分配される。いくつかの実施形態では、ビーズの分配されたサブ集団はアレイを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数の別個の部位を含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの異なるサブ集団は、基材上に分配される前に組み合わせられる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの異なるサブ集団は、連続的に基材上に分配される。例えば、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの第１のサブ集団は、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの第２のサブ集団が基材上に分配される前に、基材上に分配される。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブは伸長される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブは、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズの異なるサブ集団が基材上に分配される前に伸長される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブは、ハイブリダイズされた捕捉プローブ及び標的核酸を含むビーズが基材上に分配された後に伸長される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブを伸長させることは、ポリメラーゼ伸長を含むことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブを伸長させることは、リガーゼの存在下での捕捉プローブへの伸長プローブのライゲーションなど、リガーゼベースの伸長を含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長工程は、伸長された捕捉プローブに検出可能なマーカーを付加することができる。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光マーカーを含むことができる。
いくつかの実施形態は、基材上のビーズをデコードすることを含む。いくつかの実施形態は、基材上での伸長された捕捉プローブ、バーコード、及びインデックスの位置を識別することによってビーズをデコードすることを含む。いくつかの実施形態では、基材上の位置での特定のバーコードの存在は、その位置での特定の捕捉プローブを示す。いくつかの実施形態では、基材上の位置での特定のインデックスの存在は、標的核酸の特定のサブ集団のうちの標的核酸が基材上のその位置に関連付けられていることを示す。いくつかの実施形態では、基材上の位置での伸長された捕捉プローブの存在は、標的核酸のサブ集団内の特定の標的核酸の存在を示す。いくつかの実施形態では、表面上の単一位置でのバーコードの同一性、インデックスの同一性、及び伸長された捕捉プローブの存在は、標的核酸の特定のサブ集団内の特定の標的核酸の存在を示す。
いくつかの実施形態では、基材上のビーズをデコードすることは、ハイブリダイズされた捕捉プローブ又は伸長された捕捉プローブの位置を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブ又は伸長された捕捉プローブの位置を検出することは、ハイブリダイズされた捕捉プローブを検出可能なマーカーで伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされた捕捉プローブ又は伸長された捕捉プローブの位置を検出することは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む。
いくつかの実施形態では、基材上のビーズをデコードすることは、伸長された捕捉プローブを含むビーズのインデックスの位置をデコードすることを含む。いくつかの実施形態は、複数のインデックスプライマーをインデックスプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ビーズのインデックスの位置をデコードすることは、基材上のインデックスを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、基材上のビーズをデコードすることは、伸長された捕捉プローブを含むビーズのバーコードの位置をデコードすることを含む。いくつかの実施形態は、複数のバーコードプライマーをバーコードプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、基材上のビーズをデコードすることは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、基材上のビーズをデコードすることは、基材上のバーコードを配列決定することを含む、ビーズのバーコードの位置をデコードすることを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５０個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも１００、２００、３００、４００、若しくは５００個又はそれ以上の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５０００個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５０，０００個の捕捉プローブを含む。
いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１０個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１０００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１０，０００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。
いくつかの実施形態の態様を図５Ａ～図５Ｅに示す。図５Ａに示されるように、ビーズのサブ集団は、バーコード、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含む取り付けられた第１のポリヌクレオチドと、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む取り付けられた第２のポリヌクレオチドとを有するビーズを含む。ビーズの異なるサブ集団は、異なるインデックスを含むことができる。各サブ集団が特定のインデックスを有する、ビーズの異なるサブ集団は、各ウェルがビーズの単一のサブ集団を含むように、９６ウェルプレートのウェル内に分配することができる。
図５Ｂに示されるように、標的核酸の集団からの標的核酸が、捕捉プローブにハイブリダイズされ、この標的核酸はＳＮＰを含有する。いくつかの実施形態では、標的核酸のサブ集団が、ビーズのサブ集団を含有する各ウェルに添加される。標的核酸の各サブ集団は、異なる被験者など、異なるソースに由来することができる。例えば、標的核酸のサブ集団は、被験者からの単一の核酸サンプルなど、単一の核酸ソースから核酸のライブラリを調製することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列決定されるのにアダプターを必要としない。
図５Ｃに示されるように、ＳＮＰを含有する標的核酸にハイブリダイズされている捕捉プローブは、伸長させることができる。いくつかの実施形態では、伸長は、蛍光ヌクレオチド及び適切なポリメラーゼを含むインコーポレーションミックスを添加することによって実行されることによって実施することができる。いくつかの実施形態では、伸長は一塩基伸長である。
いくつかの実施形態では、全てのビーズが組み合わされ、フローセルの表面上に分配される。フローセルは、パターン化された表面を有することができ、表面は、ビーズの固定化を所望の密度で支持するように修正することができる。
いくつかの実施形態では、ＳＮＰリードアウトが実施される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブのＳＮＰ部位での取り込みからのシグナルを読み取るために、スキャンサイクルが実施される。いくつかの実施形態では、このサイクルは、合成による配列の少なくとも１回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長された捕捉プローブの３’末端は、切断され、ブロックされる。
図５Ｄに示されるように、バーコードプライマーがバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされ、バーコードプライマーは伸長させられる。いくつかの実施形態では、バーコードプライマーの伸長は、バーコードリードアウトを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、合成による配列の少なくとも１回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、合成による配列のサイクル数は、ビーズのサブ集団内の異なるバーコードの数に依存することができる。いくつかの実施形態では、伸長は、１２～２０回の合成による配列サイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長は、フローセル内の特定のビーズの捕捉プローブ及び位置を識別する。
図５Ｅに示されるように、インデックスプライマーがインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされ、インデックスプライマーは伸長させられる。いくつかの実施形態では、インデックスプライマーの伸長は、インデックスリードアウトを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、合成による配列の少なくとも１回のサイクルを含むことができる。いくつかの実施形態では、合成による配列のサイクル数は、ビーズの複数のサブ集団内の異なるインデックスの数に依存することができる。いくつかの実施形態では、伸長は、６～１２回の合成による配列サイクルを含むことができる。
標的リガンドを検出する特定の方法
いくつかの実施形態は、標的リガンドを検出する方法を含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、核酸、タンパク質、又は他の抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、異なるソースから、例えば、異なるサンプル、異なる個々の被験者、又は被験者の異なる集団から得られる。
いくつかの実施形態では、標的リガンドを検出する方法は、ビーズの集団を得ることを含むことができ、各ビーズは、標的リガンドに特異的に結合する捕捉プローブを含む。例えば、捕捉プローブは、核酸、抗体、又は抗体の抗原結合断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズは、同じビーズの捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードのバーコードプライマー結合部位３’とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、各ビーズはまた、インデックスと、インデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、ビーズの集団は、ビーズの第１及び第２のサブ集団を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスは、ビーズの第２のサブ集団のインデックスとは異なる。例えば、ビーズの第１のサブ集団のインデックスは、ビーズの第２のサブ集団のインデックスからビーズの第１のサブ集団を識別するために使用することができる。
いくつかの実施形態は、第１の標的リガンドをビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブに接触させ、第２の標的リガンドをビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブに接触させることを含む。例えば、第１の標的リガンドは、リガンドの第１のサンプルから得ることができ、第２の標的リガンドは、リガンドの第２のサンプルから得ることができる。いくつかの実施形態はまた、特異的に結合された第１及び第２の標的リガンドを含むビーズの第１及び第２のサブ集団を基材上に分配することも含む。いくつかの実施形態はまた、基材上に分配された、第１及び第２の標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブを検出することも含む。いくつかの実施形態はまた、基材上での検出された捕捉プローブを含むビーズの位置をデコードすることも含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは核酸を含み、標的リガンドは核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。他の実施形態では、捕捉プローブは、第１のポリヌクレオチドとは別個である。いくつかの実施形態では、ビーズのサブ集団の捕捉プローブは、互いに異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの異なるサブ集団は、同じ異なる捕捉プローブを含むことができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、一塩基多型（ＳＮＰ）又はその相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
いくつかのそのような実施形態では、標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブを検出することは、標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、伸長させることは、ポリメラーゼ伸長、及び／又はリガーゼ伸長を含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長は、蛍光標識されたヌクレオチドなど、検出可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、捕捉プローブの単一ヌクレオチド伸長を含む。いくつかの実施形態では、伸長は、複数のヌクレオチドによる捕捉プローブの伸長を含む。
いくつかのそのような実施形態では、捕捉プローブは、抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ビーズのサブ集団の捕捉プローブは、互いに異なる標的リガンドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ビーズの異なるサブ集団は、同じ異なる捕捉プローブを含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、ビーズのサブ集団の異なる捕捉プローブは、同じ標的リガンドに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブを検出することは、イムノアッセイを含む。例えば、捕捉プローブに特異的に結合された標的リガンドは、二次抗体又はその抗原結合断片と接触させられ、二次抗体又はその抗原結合断片は、蛍光標識など、検出可能な標識を含む。
いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズのサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含んでおり、ビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別することができる。例えば、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列、及びビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的リガンドをビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブに接触させること、及び第２の標的リガンドをビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブに接触させることは、異なる位置で実施される。例えば、異なる位置は、マイクロタイタープレートの異なるウェル内の異なる体積など、異なる反応体積を含み得る。
いくつかの実施形態はまた、ビーズの第１及び第２のサブ集団を基材上に分配することの前にビーズの第１及び第２のサブ集団を組み合わせることを含む。他の実施形態では、ビーズの第２のサブ集団が基材上に分配される前に、ビーズの第１のサブ集団が基材上に分配される。いくつかの実施形態では、ビーズのサブ集団は、リガンドに特異的に結合した捕捉プローブが検出される前に、基材上に分散される。
いくつかの実施形態では、標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブを検出することはまた、基材上での標的リガンドに特異的に結合した捕捉プローブの位置を決定することを含むこともできる。
いくつかの実施形態では、検出された捕捉プローブの位置をデコードすることは、検出された捕捉プローブを含むビーズのインデックスの位置をデコードすることを含む。いくつかの実施形態はまた、複数のインデックスプライマーをインデックスプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることも含む。いくつかの実施形態では、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることも含む。いくつかの実施形態では、ビーズのインデックスの位置をデコードすることは、基材上のインデックスを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、検出された捕捉プローブの位置をデコードすることは、検出された捕捉プローブを含むビーズのバーコードの位置をデコードすることを含む。いくつかのそのような実施形態は、複数のバーコードプライマーをバーコードプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ビーズのバーコードの位置をデコードすることは、基材上のバーコードを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、基材は、複数の別個の部位を含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの分配された第１及び第２のサブ集団はアレイを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、互いに異なる少なくとも５０、１００、５００、１０００、若しくは５０００個の捕捉プローブ、又は前述の数のうちのいずれか２つの間の任意の数の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００個の、ビーズの異なるサブ集団であって、各サブ集団が別のサブ集団とは異なるインデックスを含む、サブ集団、又は前述の数のうちのいずれか２つの間の任意の数の、ビーズの異なるサブ集団も含む。
ポリヌクレオチド２１０が取り付けられているビーズ２００を含む実施形態が、図６Ａの左パネルに示される。ポリヌクレオチドは、標的核酸２２０にハイブリダイズされている捕捉プローブを含む。捕捉プローブは、検出可能な標識２３０を含むヌクレオチドで伸長されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードを配列決定及び識別するのに有用なバーコードプライマー結合部位とを含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、ビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別して示すインデックスと、インデックスを配列決定及び識別するのに有用なインデックスプライマー結合部位とを含むこともできる。いくつかの実施形態では、ビーズは、基材上のアレイ内に分配し、デコードすることができる。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。
捕捉プローブ２４０が取り付けられているビーズ２００を含む実施形態が、図６Ａの中央パネルに示される。捕捉プローブは、標的核酸２２０にハイブリダイズされている。捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードを配列決定及び識別するのに有用なバーコードプライマー結合部位とを含む第１のポリヌクレオチド２６０もまた、ビーズに取り付けられている。ビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別して示すインデックスを含む第２のポリヌクレオチド２５０もまた、ビーズに取り付けられている。捕捉プローブは、検出可能な標識２３０を含むヌクレオチドで伸長されている。いくつかの実施形態では、ビーズは、基材上のアレイ内に分配し、デコードすることができる。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。
捕捉プローブ２７０が取り付けられているビーズ２００を含み、捕捉プローブが抗体、又は抗体の抗原結合断片である、実施形態が、図６Ａの右パネルに示される。捕捉プローブは、リガンド２８０に特異的に結合されている。リガンドはまた、検出可能な標識２３０を含む二次抗体２９０とも結合されている。捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードを配列決定及び識別するのに有用なバーコードプライマー結合部位とを含む第１のポリヌクレオチド２６０もまた、ビーズに取り付けられている。ビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別して示すインデックスを含む第２のポリヌクレオチド２５０もまた、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、ビーズは、基材上のアレイ内に分配し、デコードすることができる。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。
タンパク質を含む捕捉プローブ３３０が取り付けられているビーズ２００を含む実施形態が、図６Ｂの右パネルに示される。いくつかの実施形態では、ビーズは、基材上のアレイ内に分配することができる。タンパク質の基材３４０は、タンパク質と接触して、検出可能な標識２３０を含むシグナルを生成する。アレイ上のシグナルの位置は、決定することができる。いくつかの実施形態では、ビーズは、捕捉プローブを示すバーコードを含む第１のポリヌクレオチドを含むことができ、バーコードを配列決定及び識別するのに有用なバーコードプライマー結合部位もまた、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、ビーズは、やはりビーズに取り付けられている、ビーズのサブ集団をビーズの別のサブ集団と区別して示すインデックスを含む第２のポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズはアレイ上でデコードされる。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。
いくつかの実施形態は、アレイ上の標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、各ビーズが、標的リガンドに特異的に結合することができる捕捉プローブと、バーコード及びバーコードプライマー結合部位をコードする核酸であって、バーコードが捕捉プローブを示す、核酸と、インデックス及びインデックスプライマー結合部位をコードする核酸であって、インデックスが、第１の集団又は第２の集団からのビーズのソースを示す、核酸と、を含む、ことと、（ｂ）ビーズの第１の集団を第１の標的リガンドを含む第１のサンプルと接触させることであって、第１の標的リガンドが、ビーズの第１の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第１の集団を得る、ことと、（ｃ）ビーズの第２の集団を第２の標的リガンドを含む第２のサンプルと接触させることであって、第２の標的リガンドが、ビーズの第２の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第２の集団を得る、ことと、（ｄ）標的結合されたビーズの第１の集団及び標的結合されたビーズの第２の集団を、アレイ上にランダムに分配することと、（ｅ）アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズの位置を検出することと、（ｆ）アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズのインデックス及びバーコードの配列を決定することと、を含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、核酸を含む。いくつかの実施形態では、アレイ上の第１の標的リガンド及び第２の標的リガンドを含むビーズの位置を検出することは、ポリメラーゼ伸長又はライゲーションによって捕捉プローブを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｆ）の後に実施される。いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のバーコードは、互いに異なるバーコードを含み、第２のビーズの集団のバーコードは、互いに異なるバーコードを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のインデックスは互いに同じであり、ビーズの第２の集団のインデックスは互いに同じである。いくつかの実施形態では、アレイは、フローセルの表面上に位置する。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、アレイに取り付けられるように適合されている。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団は、磁性である。
標的核酸の配列決定及び分析
いくつかの実施形態は、標的核酸の配列決定及び／又は分析を含む。いくつかの実施形態は、本明細書で提供される方法に従って、アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードすることと、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることと、捕捉プローブを伸長することと、アレイ上の位置で標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸をポリヌクレオチドにハイブリダイズする前にデコードすることができる。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出した後にデコードすることができる。いくつかのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、共通の要素を介して捕捉プローブと関連付けられることができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブはそれぞれ、ビーズなどの同じ微小特徴部に結合されることができる。より多くのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含むことができる。
いくつかの実施形態は、捕捉プローブの一塩基伸長（ＳＢＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＢＥは、標的核酸中の対立遺伝子、変異、又は他の特徴部の検出に使用することができる。簡潔に述べると、ＳＢＥは、検出位置に近位の又は隣接した位置で標的ゲノム断片にハイブリダイズする捕捉プローブを利用し、検出位置は特定の遺伝子座を示す。捕捉プローブの３’末端を、検出標識で標識されたヌクレオチド類似体で伸長させるために、ポリメラーゼを使用することができる。酵素の忠実度に基づいて、ヌクレオチドは、標的核酸中の検出位置に相補的である場合にのみ、捕捉プローブに取り込まれる。所望により、ヌクレオチドは、ブロッキング基（可逆的なブロッキング基を含む）を使用して、更なる伸長が起こることができないように誘導体化することができ、したがって、単一のヌクレオチドのみが付加される。伸長された捕捉プローブ中の標識されたヌクレオチドの存在は、例えば、アレイ内の特定の位置で、検出することができ、付加されたヌクレオチドは、遺伝子座又は対立遺伝子の同一性を決定するために識別することができる。ＳＢＥは、それぞれその全体が参照により組み込まれる米国特許第９，４４１，２６７号及び同第９，０４５，７９６号に記載されている条件など、既知の条件下で行うことができる。
いくつかの実施形態は、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＥは、３’末端でのヌクレオチド組成が異なる捕捉プローブの伸長を含むことができる。ＡＳＰＥ法は、切断可能なリンカーを含有するヌクレオシド又はヌクレオチドを使用して実施することができ、その結果、標識は、プローブが検出された後に除去することができる。これは、プローブの更なる使用、又は検出されたシグナルが、たった今除去された標識によるものであったことの検証を可能にする。簡潔に述べると、ＡＳＰＥは、検出位置に相補的である３’配列部分と、検出位置に隣接する配列に相補的である５’部分とを有する捕捉プローブに標的核酸をハイブリダイズすることによって実施することができる。例えば、ポリメラーゼによる標識されたヌクレオチドの付加による、捕捉プローブの３’部分のテンプレート指向修飾は、標識された伸長生成物を産生するが、これは、テンプレートが標的配列を含む場合のみである。次いで、このような標識されたプライマー伸長生成物の存在は、例えば、特定の対立遺伝子の存在を示すために、アレイ内でのその位置に基づいて検出することができる。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＥは、標的核酸中の同じ検出位置に隣接してアニーリングするように同様の５’末端を有するが、検出位置を補完する３’末端を有する捕捉プローブのみがポリメラーゼによって修飾されるように、異なる３’末端を有する、複数の捕捉プローブを用いて実施することができる。特定の検出位置に相補的である３’末端塩基を有する捕捉プローブは、位置に対する完全一致（ＰＭ）プローブと称され、一方、３’末端不一致塩基を有し、ＡＳＰＥ反応で伸長させることができない捕捉プローブは、位置に対する不一致（ＭＭ）プローブである。ＰＭプローブ中の標識されたヌクレオチドの存在は検出することができ、捕捉プローブの３’配列は、検出位置において特定の対立遺伝子を識別するために決定することができる。
いくつかの実施形態は、アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードするための方法を含む。このようないくつかの方法は、（ａ）ポリヌクレオチドのアレイが基材の表面上に分配されている基材を得ることであって、各ポリヌクレオチドがバーコードのプライマー結合部位３’を含み、各ポリヌクレオチドが捕捉プローブに連結されている、ことと、（ｂ）複数のプライマーをプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、（ｃ）ハイブリダイズされたプライマーを伸長させることによってバーコードの配列を決定することであって、各バーコードの配列が、アレイ内のポリヌクレオチドの位置を示している、ことと、を含む。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ビーズを介して捕捉プローブに連結される。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、プライマー結合部位の３’である。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、バーコードの５’である。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、別の捕捉プローブとは異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、５個未満の異なるヌクレオチドで別の捕捉プローブとは異なる。いくつかの実施形態では、各捕捉プローブは、異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、基材の表面上にランダムに分配される。いくつかの実施形態では、バーコードは、別のバーコードとは異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、各バーコードは、異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、各プライマー結合部位は、同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、ビーズはウェル内に分配される。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、捕捉プローブをプライマー結合部位及びバーコードから除去するように適合される。いくつかの実施形態では、基材はウェルを含む。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドはスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、基材に取り付けられている。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることも含む。いくつかの実施形態では、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることは、バーコードの配列を決定した後に実施される。いくつかの実施形態では、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることは、バーコードの配列を決定する前に実施される。いくつかの実施形態はまた、ハイブリダイズされた標的核酸、又はポリヌクレオチドを伸長させることも含む。いくつかの実施形態では、伸長させることはライゲーションを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を増幅することも含む。
いくつかの実施形態は、標的核酸を配列決定する方法を含む。いくつかのそのような方法は、（ａ）前述の方法のいずれか１つに従ってアレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードすることと、（ｂ）標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることと、（ｃ）標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブを伸長することと、（ｄ）伸長された捕捉プローブの位置を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、（ｄ）伸長された捕捉プローブの位置を検出することは、（ａ）アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードすることの前に実施される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブはリガーゼによって伸長される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブはポリメラーゼによって伸長される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは単一ヌクレオチドの付加によって伸長される。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズする前にプライマー結合部位及びバーコードを捕捉プローブから切断することも含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズした後にプライマー結合部位及びバーコードを捕捉プローブから切断することも含む。
いくつかの実施形態は、アレイ上の異なる生物学的ソースに由来する標的ポリヌクレオチドを配列決定することを含む。いくつかのそのような実施形態では、標的核酸を含むポリヌクレオチドは、核酸サンプルから調製することができる。ポリヌクレオチドサンプルの例としては、個体由来のゲノムＤＮＡサンプル、ｃＤＮＡサンプル、ＲＮＡサンプル、及びアンプリコンが挙げられる。ポリヌクレオチドは、標的核酸、インデックス、及びインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むことができる。インデックスは、特定の核酸サンプルとして標的核酸のソースを示すために使用することができる。例えば、異なる核酸サンプルから調製されたポリヌクレオチドは、異なるインデックスを含むことができる。各インデックスは、特定の増幅プライマーに結合するように設計された位置を有することができる。このインデックスプライマー結合部位を使用して、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによってインデックスを配列決定することができる。いくつかの実施形態では、インデックスは、約３～３０の連続するヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチド内の核酸又は領域である。インデックスは、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド、又はそれより長くすることができる。本明細書で提供される方法及び組成物に有用ないくつかの態様は、それぞれその全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０３３４７１１（Ａ１）号及び米国特許出願公開第２０１９００８５３８４（Ａ１）号に開示されている。いくつかの実施形態では、バーコード又はインデックスは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。
ポリヌクレオチドは、様々な方法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸を含む核酸サンプルは、トランスポソームでタグ付けされて、トランスポソームからの配列を含む末端を有する核酸断片を得ることができる。いくつかの実施形態では、トランスポソームは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むことができ、それにより、タグ付けが、核酸断片にインデックス及びインデックスプライマー結合部位を付加する。例えば、標的核酸を含む投入核酸は、複数のトランスポソームと接触させることができる。トランスポソームは、投入核酸を断片化し、アダプターを核酸断片の末端に取り付けることができる。タグ付け反応の例は、その全体が参照により組み込まれる米国特許第９，０４０，２５６号に開示されている。
いくつかの実施形態では、インデックスを含むポリヌクレオチドは、標的核酸を含む核酸断片の末端にアダプターを付加することによって調製することができ、アダプターは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、インデックスを含むポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むプライマーで標的核酸を含む核酸断片を増幅することによって調製することができ、それにより、増幅生成物は、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの標的核酸は、捕捉プローブにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。オリゴヌクレオチドは、捕捉プローブ、バーコード、及びバーコードプライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、プライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによって配列決定することができる。いくつかの実施形態では、バーコードは、アレイ内の捕捉プローブなどのポリヌクレオチドを識別するために使用することができる核酸配列を含むことができる。バーコードは、他のバーコードと区別できる固有のヌクレオチド配列を含むことができる。また、バーコードの配列によって、及びポリヌクレオチド内のバーコードの位置によって、例えばバーコードプライマー結合部位に隣接する位置によって、ポリヌクレオチド内及び標的核酸内の他のヌクレオチド配列と区別することができる。例えば、いくつかの実施形態では、バーコードの配列が、複数の核酸中に２回以上存在し得るが、バーコードプライマー結合部位に隣接するバーコードを検出することができる。バーコードは、集団内の複数のバーコード内、並びに／又は分析若しくは検討される複数のポリヌクレオチド及び標的核酸内の固有のヌクレオチド配列であるのに十分な任意の所望配列長であり得る。いくつかの実施形態では、バーコードは、約６～３０の連続するヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチド内の核酸又は領域である。バーコードは、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０ヌクレオチド、又はそれより長くすることができる。いくつかの実施形態のための好適なバーコードは、米国特許第８，０５３，１９２号に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。いくつかの実施形態では、バーコードは、各バーコードが別のバーコードとは異なるように、あるポリヌクレオチドをアレイ内の別のポリヌクレオチドから区別することができる。いくつかの実施形態では、バーコードを使用して、アレイ内のビーズの位置を識別することができる。いくつかの実施形態では、バーを使用して捕捉プローブを識別することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの標的核酸は、捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされたビーズを得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたビーズは、バーコード、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含有するオリゴヌクレオチドを含むことができ、捕捉プローブは、ポリヌクレオチドの標的核酸にハイブリダイズすることができ、ポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むことができる。ハイブリダイズされたビーズは、アレイ上にランダムに分配することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸の配列情報は、捕捉プローブを伸長することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、標的核酸に相補的な配列を含むように伸長することができる。いくつかのそのような実施形態では、伸長は、ポリメラーゼ伸長を含むことができる。いくつかの実施形態では、伸長は一塩基伸長（ＳＢＥ）である。いくつかの実施形態では、ＳＢＥは、標的核酸中の対立遺伝子、変異、又は他の特徴部の検出に使用することができる。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ライゲーションによって伸長させることができる。例えば、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドは、捕捉プローブが標的核酸にハイブリダイズする部位に隣接する位置で標的核酸にハイブリダイズすることができ、次いで、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを、捕捉プローブにライゲートすることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは伸長されて、伸長された捕捉プローブが、インデックス及びポリヌクレオチドのインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を組み込むようにすることができる。
いくつかの実施形態では、インデックスは、アレイ上のビーズに取り付けられた標的核酸のソースを決定するように配列決定される。いくつかの実施形態では、バーコードは、アレイ上のビーズの位置をデコードするように配列決定される。いくつかの実施形態では、バーコードは、アレイ上のビーズに取り付けられた捕捉プローブを識別するように配列決定される。
いくつかの実施形態では、アレイは、フローセルの表面上に位置する。いくつかの実施形態では、ビーズは、アレイに取り付けられるように適合されている。例えば、ビーズは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体などの作用因子を含むことができ、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ビーズ及びアレイは磁性である。
いくつかの実施形態は、異なる核酸サンプルから複数のポリヌクレオチドを調製することと、各複数のポリヌクレオチドを、捕捉プローブを含むビーズの集団とハイブリダイズして、ハイブリダイズされたビーズを得ることと、ハイブリダイズされたビーズをアレイ上にランダムに分配することと、を含む。例示的な実施形態は、ビーズの第１及び第２の集団を得ることであって、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことを含む。第１及び第２の複数のポリヌクレオチドが得られ、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある。第１の標的核酸が、第１の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第１のビーズを得て、第２の標的核酸が、第２の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第２のビーズを得る。アレイ上のハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズは、アレイ上にランダムに分配されている。アレイ上の第１及び第２のビーズの位置は、第１及び第２のバーコードを配列決定して、標的核酸の各セットによってどのビーズが結合されているかを決定することによってデコードされる。第１及び第２の捕捉プローブを伸長することによって、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データが得られる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のようにインデックス化される。例えば、ビーズの第１及び第２の集団が得られ、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む。第１及び第２の複数のポリヌクレオチドが得られ、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接する第２のプライマー結合部位を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある。第１の標的核酸が、第１の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第１のビーズを得て、第２の標的核酸が、第２の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第２のビーズを得る。ハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズは、アレイ上にランダムに分配されている。アレイ上の第１及び第２のビーズの位置は、第１及び第２のバーコードを配列決定することによってデコードされる。第１及び第２の捕捉プローブは、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データを得るために伸長される。第１及び第２の標的核酸の核酸配列データのソースは、第１及び第２のインデックスを配列決定することによって決定される。
いくつかの実施形態では、第１の複数のポリヌクレオチドは、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、第２の複数のポリヌクレオチドは、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、第１又は第２の複数のポリヌクレオチドは、複数のトランスポソームで核酸サンプルをタグ付けすることによって得られる。いくつかの実施形態では、複数のトランスポソームは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、タグ付けされた核酸サンプルにアダプターを付加することも含み、アダプターは、第１又は第２のインデックスを含む。いくつかの実施形態はまた、第１又は第２のインデックスを含むプライマーで、タグ付けされた核酸サンプルを増幅することも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、第１及び第２のインデックス、並びに第１及び第２のインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を、伸長された捕捉プローブに組み込む。
いくつかの実施形態では、ビーズは、インデックス化することができる。例えば、ビーズは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドは、バーコード、バーコードプライマー結合部位、インデックス、及びインデックスプライマー結合部位を含むことができる。例えば、ビーズの第１の集団は、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むことができ、ビーズの第２の集団は、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のオリゴヌクレオチドは、第１のインデックスを含み、ビーズの第２の集団のオリゴヌクレオチドは、第２のインデックスを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２の集団が得られ、ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、第１のインデックス、及び第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、第２のインデックス、及び第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む。第１及び第２の複数のポリヌクレオチドが得られ、第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある。第１の標的核酸が、第１の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第１のビーズを得て、第２の標的核酸が、第２の捕捉プローブにハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた第２のビーズを得る。ハイブリダイズされた第１のビーズ及びハイブリダイズされた第２のビーズは、アレイ上にランダムに分配されている。アレイ上の第１及び第２のビーズの位置は、第１及び第２のバーコードを配列決定することによってデコードされる。第１及び第２の捕捉プローブは、第１及び第２の標的核酸の核酸配列データを得るために伸長される。いくつかの実施形態では、ビーズの第１の集団のオリゴヌクレオチドは、第１のインデックスを含み、ビーズの第２の集団のオリゴヌクレオチドは、第２のインデックスを含む。
いくつかの実施形態では、第１のインデックスは、第１の標的核酸のソースを示し、第２のインデックスは、第２の標的核酸のソースを示す。いくつかの実施形態では、第１のインデックスは互いに同じであり、第２のインデックスは互いに同じである。いくつかの実施形態はまた、第１及び第２のインデックスを配列決定することも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のインデックスは、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、インデックス結合プライマー部位は同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、異なる核酸サンプルから得られる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の標的核酸は、ゲノムＤＮＡから得られる。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードは、第１又は第２の捕捉プローブの核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、第１のバーコードは互いに異なり、第２のバーコードは互いに異なる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバーコードを配列決定することは、バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は同じである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、ポリメラーゼ伸長を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、捕捉プローブへの単一のヌクレオチドの付加を含む。いくつかの実施形態はまた、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを伸長された捕捉プローブにライゲーションすることも含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の捕捉プローブを伸長することは、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを捕捉プローブにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、第１の標的核酸を第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、第２の標的核酸を第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、第２のビーズを得ることとは、溶液中で実施される。
いくつかの実施形態では、フローセルはアレイを含む。いくつかの実施形態では、アレイは複数のウェルを含み、各ウェルは１つ以上のビーズを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、アレイに取り付けられるように適合されている。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビーズは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、アレイは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ビーズ及びアレイは磁性である。
標的核酸を含むポリヌクレオチドがインデックスも含む、アレイ上の標的核酸の配列決定の例示的な実施形態を図９に示す。一塩基多型（星型）を含有する標的核酸を含むＤＮＡサンプルは、ＤＮＡサンプルが断片化され、増幅プライマー結合部位が断片の各末端に付加されるタグ付けを受ける。断片は、増幅プライマー結合部位に結合するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅され、サンプルインデックス及びインデックスリードプライマー結合部位を含む。サンプルインデックス及びインデックスリードプライマー配列は、増幅生成物に組み込まれる。ビーズは、オリゴヌクレオチドをビーズに取り付けることによって調製される。オリゴヌクレオチドは、リンカー、デコード配列（バーコード配列としても知られる）、デコードリードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含む。増幅生成物とビーズが組み合わされる。標的核酸は、捕捉プローブにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、溶液中又はアレイ上で起こることができる。ハイブリダイズされたビーズは、アレイ上にランダムに分配される。捕捉プローブは、完全に官能化されたヌクレオチド（ＦＦＮ）で伸長され、伸長は検出される。伸長された捕捉プローブは更に、サンプルインデックス及びインデックスリードプライマー結合部位に相補的な配列を組み込むように伸長される。標的核酸を含む鎖は、伸長された捕捉から解離される。伸長された捕捉プローブのサンプルインデックスは、インデックスリードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによって配列決定される。伸長された捕捉プローブのデコード配列は、デコードリードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによって配列決定される。標的核酸のソースは、サンプルインデックスの配列から識別される。ビーズはデコードされ、捕捉プローブはデコード配列から識別される。
ビーズがインデックスを含むアレイ上の標的核酸を配列決定する別の例示的な実施形態を図１０に示す。ビーズは、捕捉プローブオリゴヌクレオチド及びサンプルインデックスプローブオリゴヌクレオチドを取り付けることによって調製される。捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、リンカー、デコード配列、デコードリードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含む。サンプルインデックスプローブオリゴヌクレオチドは、リンカー、サンプルインデックス、及びインデックスリードプライマー結合部位を含む。ビーズは、対象となる一塩基多型（星型）を含有する核酸などの標的核酸を含む断片化された核酸と組み合わされる。標的核酸は、溶液中又はアレイ上のいずれかで捕捉プローブにハイブリダイズする。捕捉プローブはＦＦＮで伸長される。伸長が検出される。標的核酸は、伸長された捕捉プローブから解離される。サンプルインデックスは、インデックスリードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによる配列である。伸長された捕捉プローブのデコード配列は、デコードリードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することによって配列決定される。標的核酸のソースは、サンプルインデックスの配列から識別される。ビーズはデコードされ、捕捉プローブはデコード配列から識別される。
特定の二重プローブ方法
いくつかの実施形態は、標的核酸を第１及び第２の捕捉プローブで検出することを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、第１の捕捉プローブにハイブリダイズすることができる第１の部分と、第２の捕捉プローブにハイブリダイズすることができる第２の部分と、を含む。いくつかの実施形態では、各ビーズが第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉を含む、ビーズの集団が得られる。いくつかの実施形態では、２つの捕捉プローブのうちの１つは、切断可能なリンカーを介してビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、捕捉プローブのうちの１つは、蛍光標識などの検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、捕捉プローブにハイブリダイズして、一本鎖ギャップを含む二本鎖核酸を生成する。ギャップは埋められ、切断可能なリンカーは切断される。伸長された捕捉プローブが検出される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブのうちの１つは、蛍光標識などの検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ギャップを埋めている間に、伸長された捕捉プローブに取り込まれる。
いくつかの実施形態では、第２の捕捉プローブは、切断可能なリンカーを介してビーズに取り付けられており、第２の捕捉プローブは、蛍光標識などの検出可能な標識を含む。切断可能なリンカーの例としては、化学的手段によって、エンドヌクレアーゼなどの酵素によって、及び特定の周波数の光によって切断することができるリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、各ビーズはまた、第１又は第２の捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードのバーコードプライマー結合部位３’とを含む第１のポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、第１の捕捉プローブは、第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の捕捉プローブは、第１のポリヌクレオチドとは別個である。
いくつかの実施形態では、第１の捕捉プローブの末端は、第２の捕捉プローブの末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、第１の捕捉プローブは、標的核酸をビーズの集団のうちのビーズの第１及び第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、第１の捕捉プローブと第２の捕捉プローブとの間の一本鎖ギャップを含む二本鎖核酸を生成し、第１の捕捉プローブと第２の捕捉プローブとの間のギャップを埋めることによって、第２の捕捉プローブにライゲーションされる。いくつかの実施形態では、ギャップを埋めることは、ポリメラーゼ及び／又はリガーゼを用いて実施することができる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、検出可能な標識を含む第１の捕捉プローブを含むビーズを生成するために切断される。いくつかの実施形態では、ビーズの集団は、基材上に分配される。いくつかの実施形態では、ビーズの集団は、切断可能なリンカーが切断された後に基材上に分配される。いくつかの実施形態では、ビーズの集団は、切断可能なリンカーが切断される前に、又は第１の捕捉プローブを第２の捕捉プローブにライゲーションする前に、基材上に分配される。いくつかの実施形態では、基材上での検出可能な標識を含む第１の捕捉プローブを含むビーズの位置が決定される。
いくつかの実施形態では、基材上での検出可能な標識を含む第１の捕捉プローブを含むビーズの位置をデコードすることは、基材上での検出可能な標識を含む第１の捕捉プローブを含むビーズのバーコードの位置をデコードすることを含む。いくつかのそのような実施形態は、バーコードプライマーをバーコードプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたバーコードプライマーを伸長させることは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ビーズのバーコードの位置をデコードすることは、基材上のバーコードを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、各ビーズは、標的核酸のソースを示すインデックスとインデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの集団はビーズの第１及び第２のサブ集団を含み、各ビーズは、インデックスとインデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドを含み、第１のサブ集団のインデックスは、第２のサブ集団のインデックスとは異なる。いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含み、ビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団とライゲーションする又はそれを切断する工程は、ビーズの第２のサブ集団とライゲーションする又はそれを切断する工程とは異なる位置で実施される。いくつかの実施形態では、異なる位置は、異なる反応体積を含む。いくつかの実施形態では、異なる位置は、異なるウェルを含む。
いくつかの実施形態はまた、ビーズの集団を基材上に分配することの前にビーズの第１及び第２のサブ集団を組み合わせることを含む。他の実施形態では、ビーズの第２のサブ集団が基材上に分配される前に、ビーズの第１のサブ集団が基材上に分配される。
いくつかの実施形態では、基材上での検出可能な標識を含む第１の捕捉プローブを含むビーズの位置をデコードすることは、検出された捕捉プローブを含むビーズのインデックスの位置を決定することを含む。いくつかのそのような実施形態は、複数のインデックスプライマーをインデックスプライマー部位にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズされたインデックスプライマーを伸長させることは、合成による配列決定の少なくとも１回のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ビーズのインデックスの位置をデコードすることは、基材上のインデックスを配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、基材は、複数の別個の部位を含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの分配された集団はアレイを含む。
ビーズ２００が、切断可能なリンカー３１０を介してビーズに取り付けられた第１の捕捉プローブ３００を含む実施形態が、図６Ｂの左パネルに示される。第２の捕捉プローブ３２０が、ビーズに取り付けられている。特定のサンプルからの標的核酸２２０が、第１及び第２の捕捉プローブにハイブリダイズされ、第１の捕捉プローブは、検出可能な標識２３０を含むヌクレオチドで第１の捕捉プローブと第２の捕捉プローブとの間のギャップを埋めるように伸長される。ギャップが埋められた後、標的核酸は除去され、切断可能なリンカーは、ビーズに取り付けられた検出可能な標識を含む伸長された第２の捕捉プローブを生成するために切断される。ビーズは、基材上のアレイ上に分配し、デコードすることができる。ビーズに取り付けられたサンプルを示すインデックスを含むポリヌクレオチド、及び第１又は第２の捕捉プローブを示すバーコードを含むポリヌクレオチドは、図示されていない。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。
第１の捕捉プローブが、その５’末端を介してビーズ２００に取り付けられている実施形態が、図６Ｃに示される。第２の捕捉プローブ３６０が、その３’末端及び切断可能なリンカー３１０を介してビーズに取り付けられている。第２の捕捉プローブは、検出可能な標識２３０を含む。標的核酸２２０が、第１及び第２の捕捉プローブにハイブリダイズされ、第１の捕捉プローブは伸長させられ、第２の捕捉プローブにライゲーションされる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、構造変異体（ＳＶ）を含むことができる。切断可能なリンカーは、検出可能な標識を含み、かつビーズに取り付けられた伸長された第１の捕捉プローブを生成するために切断される。ビーズは、基材上のアレイ上に分配し、デコードすることができる。ビーズに取り付けられたサンプルを示すインデックスを含むポリヌクレオチド、及び第１又は第２の捕捉プローブを示すバーコードを含むポリヌクレオチドは、図示されていない。デコードすることは、アレイ上の検出可能な標識の位置を決定すること、アレイ上のビーズに取り付けられたバーコードを決定すること、及び／又はアレイ上のビーズに取り付けられたインデックスを決定すること、を含むことができる。標的核酸の不在下では、第２の捕捉プローブ及び検出可能な標識は、ビーズから切断される。
インデックス化されたビーズの調製及び使用のための特定の方法
いくつかの実施形態は、インデックス化されたビーズを調製することを含む。いくつかのそのような実施形態は、インデックスポリヌクレオチドの集団を提供することを含むことができ、各インデックスポリヌクレオチドは、インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びアンカー／アダプターを含む。いくつかの実施形態では、アンカー／アダプターは、ビーズに取り付けられたアダプター結合部位に結合又はハイブリダイズすることができる。
いくつかの実施形態は、インデックス化されたビーズの集団を調整する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、アダプター、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）複数のインデックスポリヌクレオチドを得ることであって、各インデックスポリヌクレオチドがインデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む、ことと、（ｃ）複数のインデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介してビーズの集団に取り付けることによって、インデックス化されたビーズの集団を得ることと、を含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ポリメラーゼ伸長によってアダプターを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、各インデックスポリヌクレオチドは、アダプター結合部位を含み、取り付けることは、アダプター結合部位をアダプターにハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、インデックスポリヌクレオチドをアダプターにライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態では、取り付けることは、スプリントポリヌクレオチドをアダプター及びインデックスポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態では、（ｃ）は、化学反応性部分を介して、複数のインデックスポリヌクレオチドをビーズの集団のアダプターに取り付けることを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの集団の第１のポリヌクレオチドは、互いに異なる捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、各インデックスポリヌクレオチドのインデックスは同じである。化学的ライゲーションによってポリヌクレオチドを互いに接合するのに有用な方法及び組成物に有用な態様は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０１２７８１６号に開示されている。
いくつかの実施形態はまた、インデックス化されたビーズの集団を、標的核酸を含む複数の核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を含む複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団を、追加のインデックス化されたビーズの集団と混合することを含み、追加のインデックス化されたビーズの集団は、複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団のインデックスとは異なるインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、インデックス化されたビーズの集団を、標的核酸を含む複数の核酸と接触させることを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を含む複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団を、追加のインデックス化されたビーズの集団と混合することを含み、追加のインデックス化されたビーズの集団は、複数の核酸と接触させられたインデックス化されたビーズの集団のインデックスとは異なるインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実行される。
インデックス化されたビーズを調製するための例示的な実施形態を図１１に示す。インデックスポリヌクレオチドは、アンカー又はアダプター、インデックス、及びインデックスプライマー結合部位を含む。複数のインデックスポリヌクレオチド集団が調製され、マルチウェルプレートのウェルに分配される。各ウェルは、同じインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドの集団を含有することができる。例えば、第１のウェルは、第１のインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドの集団を含有することができ、第２のウェルは、第２のインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドの集団を含有することができる。複数のビーズをウェルに分配することができる。各ビーズは、捕捉プローブを含む第１のポリヌクレオチドと、インデックスポリヌクレオチドのアンカー又はアダプターに結合することができる結合部位などのインデックス化するアンカーを含む第２のポリヌクレオチドとを含むことができる。単一のビーズプールが各ウェルに付加される。単一のビーズプールは、捕捉プローブが互いに異なるビーズの集団を含むことができる。同じインデックスを含有する単一のビーズプールは、単一のサンプルで使用することができ、それにより、サンプルの操作された核酸の後続の生成物のソースが、関連するインデックスを識別することを介して単一のサンプルに由来しているものとして識別することができる。図１１に示すように、単一のインデックス化されたビーズプールをマルチウェルプレート内の単一ウェルに付加することができ、各ウェルは単一のサンプルを含む。
インデックスポリヌクレオチドのインデックスは、いくつかの異なる方法によってビーズに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、アンカー及び第２のポリヌクレオチドを介してビーズにハイブリダイズし、第２のポリヌクレオチドは、伸長されることによって、インデックスポリヌクレオチドのインデックスの相補体を、ビーズに取り付けられた伸長された第２のポリヌクレオチドに組み込む。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、一緒にライゲートされる。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、化学的又は酵素的方法を介してビーズに取り付けられたポリヌクレオチドに取り付けられる。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、ビーズに取り付けられたポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ハイブリダイズされたインデックスポリヌクレオチドのインデックスは、アレイ上で決定される。
いくつかの実施形態は、化学的又は酵素的方法によってビーズにインデックスを付加することを含む。化学的又は酵素的方法によってビーズにインデックスを付加するための例示的な実施形態は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含むビーズを示す図１２Ａに示されている。第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブなどのプローブ、バーコードなどのコード、及びバーコードの配列を決定するために使用され得るバーコードプライマー結合部位などのプライマーＡを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス、及びインデックスの配列を決定するために使用することができるインデックスプライマー結合部位などのプライマーＢを含む。第２のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドをスペーサーに連結するスペーサー及び部分Ｘ－Ｙを介してビーズに取り付けることができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、配列プライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ブロッキング基は、インデックスポリヌクレオチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位はまた、可逆的にブロックされた３’末端を有するヘアピンであり得る。
いくつかの実施形態は、ビーズに取り付けられたアダプターを伸長することによって、インデックスをビーズに付加することを含む。いくつかの実施形態では、ビーズに取り付けられたアダプターは、ライゲーションによって、又はポリメラーゼ伸長によって伸長することができる。ライゲーションによる伸長の例示的な実施形態は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含むビーズを示す図１２Ｂに示されている。第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブなどのプローブ、バーコードなどのコード、及びバーコードの配列を決定するために使用され得るバーコードプライマー結合部位などのプライマーＡを含む。第２のポリヌクレオチドは、第２及び第３のポリヌクレオチドの両方にハイブリダイズすることができるスプリントを含む第４のポリヌクレオチドを使用して、インデックス及びプライマーＢを含む第３のポリヌクレオチドへのライゲーションによって伸長され得るアダプターを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、配列プライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ブロッキング基は、インデックスポリヌクレオチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位はまた、可逆的にブロックされた３’末端を有するヘアピンであり得る。
ポリメラーゼ伸長による伸長の例示的な実施形態は、第１及び第２のポリヌクレオチドを含むビーズを示す図１２Ｃに示されている。第１のポリヌクレオチドは、プローブ、プライマーＡ、及びコードを含む。第２のポリヌクレオチドは、アダプターを含む。インデックスポリヌクレオチドなどの第３のポリヌクレオチドは、アダプターに結合することができるアダプター結合部位、インデックス、及びプライマーＢを含む。第３のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドがポリメラーゼ伸長によって伸長されて、インデックスを伸長アダプターに組み込むように、第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、配列プライマー結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ブロッキング基は、インデックスポリヌクレオチドに付加することができる。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位はまた、可逆的にブロックされた３’末端を有するヘアピンであり得る。
いくつかの実施形態は、ビーズに取り付けられた第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされたインデックスポリヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態は、標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びバーコードプライマー結合部位に結合することができるアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、（ｃ）標的リガンドを捕捉プローブに特異的に結合することと、（ｄ）インデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることと、（ｅ）アレイ上の標的リガンドを検出することと、（ｆ）第１のポリヌクレオチドのインデックス及びバーコードを決定することと、を含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ビーズの集団をアレイ上に分配することを含む。いくつかの実施形態では、（ｆ）はインデックスプライマーをインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドからインデックスポリヌクレオチドをデハイブリダイズすることと、バーコードプライマーをバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、バーコードプライマーを伸長して、バーコードの配列を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、アダプターとインデックスとの間に位置する切断可能なリンカーを更に含み、（ｆ）は、（ｉ）切断可能なリンカーを切断することと、（ｉｉ）アダプターを伸長して、バーコードの配列を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、標的核酸にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実施される。
ビーズに取り付けられた第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされたインデックスポリヌクレオチドを使用するための例示的な実施形態を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。図１３Ａは、第１のポリヌクレオチドを含むビーズを示す。第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブなどのプローブ、プライマー結合部位などのプライマー、及びバーコードなどのコードを含む。インデックスポリヌクレオチドは、インデックス、インデックスプライマー結合部位などのプライマー２、切断可能なスペーサーなどのスペーサー、及び第１のポリヌクレオチドのプライマー結合部位にハイブリダイズすることができるアダプターを含む。ビーズプールは、図１１に示されるように、インデックスポリヌクレオチドを用いて調製することができる。図１３Ｂの第１のパネルは、標的核酸が捕捉プローブを介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされる第１のポリヌクレオチドを含むビーズを示し、インデックスポリヌクレオチドは、プライマー結合部位を介して第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。図１３Ｂの第２のパネルは、ビーズのアレイ上で検出することができる単一の蛍光ジデオキシヌクレオチド（星型）を有する伸長された第１のポリヌクレオチドを示す。インデックス及びバーコードを決定することができる。図１３Ｂの第３のパネルは、蛍光ジデオキシヌクレオチドが伸長された第１のポリヌクレオチドから除去されていることを示す。インデックスプライマーをインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズし、伸長し、インデックスの配列を決定することができる。図１３Ｂの第４のパネルは、標的核酸が第１のポリヌクレオチドからデハイブリダイズされていることを示す。インデックスポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーで切断され、アダプターはここで、伸長され得るプライマー結合部位にハイブリダイズされたバーコードプライマーに対応し、バーコードの配列が決定される。
いくつかの実施形態は、複数のインデックス配列及びインデックスプライマー結合部位を含むインデックスポリヌクレオチドの使用を含む。いくつかのそのような実施形態では、複数のインデックス配列は、インデックスが配列決定されるときにアレイ上の位置でのシグナルの増加をもたらすことができる。例示的な実施形態を図１４に示す。図１４は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むビーズを示す。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマーＡ、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位の繰り返しを含む。いくつかの実施形態では、繰り返しは、少数の固定化インデックスを有するビーズ上のシグナル強度を改善する。いくつかの実施形態では、繰り返しは、シグナルを低減することなく、プライマーによって占有される表面積の量を制限することができる。
いくつかの実施形態は、ビーズへのインデックスポリヌクレオチドの酵素付加を含む。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、反応性基を介してビーズに取り付けられたポリヌクレオチドを伸長することによってビーズに取り付けることができる。いくつかの実施形態では、インデックスポリヌクレオチドは、ビーズプールを他のビーズプールと混合する前、例えば、混合物をアレイ上にロードする前に、ビーズに取り付けることができる。いくつかの実施形態は、標的リガンドを検出する方法であって、（ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、バーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第２のポリヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、（ｃ）標的リガンドを捕捉プローブに特異的に結合することと、（ｄ）インデックスポリヌクレオチドを、アダプターを介して第２のポリヌクレオチドに取り付けることと、（ｅ）アレイ上の標的リガンドを検出することと、（ｆ）第１のポリヌクレオチドのインデックス及びバーコードを決定することと、を含む、方法を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、バーコード、及びバーコードプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、（ｄ）は、反応性部分を第２のポリヌクレオチドに付加することを含み、アダプターは、反応性部分に取り付けることができる。ポリヌクレオチドに反応性部分を付加するのに有用な方法及び組成物に有用な態様は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０１２７８１６号に開示されている。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ビーズの集団をアレイ上に分配することを含む。いくつかの実施形態では、（ｆ）はインデックスプライマーをインデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、（ｆ）はバーコードプライマーをバーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、インデックスの配列を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、（ｅ）は、標的核酸にハイブリダイズされた第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、伸長は、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フローセル上で実行される。
ビーズへのインデックスポリヌクレオチドの酵素付加の例示的な実施形態を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。図１５Ａ及び図１５Ｂは、第１のポリヌクレオチドの捕捉プローブを介したビーズへの標的核酸のハイブリダイゼーション、第２のポリヌクレオチドを介したビーズへのインデックスポリヌクレオチドの付加、並びにビーズに取り付けられたバーコード及びインデックスの決定を示す。図１５Ａの第１のパネルは、第１及び第２のポリヌクレオチドを含むビーズを示す。第１のポリヌクレオチドは、バーコードなどのコード、バーコードプライマー結合部位などのプライマー、及び捕捉プローブなどのプローブを含む。図１５Ａの第２のパネルは、捕捉プローブへの標的核酸のハイブリダイゼーションを示す。図１５Ａの第３のパネルは、蛍光ジデオキシヌクレオチド（星型）を有する第１のポリヌクレオチドの一塩基伸長（ＳＢＥ）を示す。図１５Ａの第４のパネルは、反応性ジデオキシヌクレオチドなどの第２のポリヌクレオチドへの反応性基（三角形）の付加を示す。付加は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の使用を含むことができる。図１５Ｂの第１のパネルは、インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドの、反応性基及びアダプターを介した第２のポリヌクレオチドへの付加を示す。ビーズはアレイにロードすることができ、ビーズの位置は、蛍光ジデオキシヌクレオチドから決定することができ、蛍光ジデオキシヌクレオチドは除去することができる。図１５Ｂの第２のパネルは、インデックスの配列を決定するためのインデックスプライマー結合部位へのインデックスプライマーのハイブリダイゼーションを示す。インデックスプライマー及び標的核酸は、デハイブリダイズすることができる。図１５Ｂの第３のパネルは、バーコードの配列を決定するためのバーコードプライマー結合部位へのバーコードプライマーのハイブリダイゼーションを示す。
スペーサー
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、スペーサーの使用を含む。スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００個の連続するヌクレオチド、又は前述の数のうちのいずれか２つの範囲内の長さを有するポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、立体障害を減少させることによって特定のプロセスの効率を高めるために、２つのポリヌクレオチド要素の間に位置することができる。例えば、スペーサーは、ビーズに取り付けられたポリヌクレオチドなどの基材用のポリメラーゼ、リガーゼ、及び／又は末端トランスフェラーゼの使用などの酵素プロセスの効率を高めるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ビーズへのポリヌクレオチドの取り付けられた末端などのビーズ、インデックス、インデックスプライマー結合部位、バーコード、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含む任意の２つの要素間に位置することができる。
キット及びシステム
いくつかの実施形態は、アレイ上のポリヌクレオチドなどの微小特徴部をデコードするためのキット及びシステムを含む。いくつかのそのようなキット及びシステムは、チップなどの基材、又は基材の表面上にランダムに分配されたポリヌクレオチドのアレイを有する流体セルを含むことができる。ポリヌクレオチドは、バーコードのプライマー結合部位３’を含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含むことができる。より多くのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、共通の要素を介して捕捉プローブと関連付けられることができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブはそれぞれ、ビーズなどの同じ微小特徴部に結合されることができる。いくつかの実施形態は、アレイ内のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた試薬からのシグナルを検出するように適合された検出器を含み、そのような試薬は、検出可能な標識を含むヌクレオチドなどの配列決定試薬を含むことができる。いくつかの実施形態は、ピロリン酸など、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの取り込み、又は水素イオンの変化から生じることができるシグナルを検出するように適合された検出器を含む。
いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも第１及び第２のサブ集団を含むキット又はシステムを含む。いくつかの実施形態では、サブ集団の各ビーズは、捕捉プローブと、同じビーズの捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードのバーコードプライマー結合部位３’とを含む第１のポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、サブ集団の各ビーズはまた、インデックスと、インデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドも含むことができる。いくつかの実施形態では、ビーズのサブ集団のインデックスは、ビーズのその特定のサブ集団を示すことができる。いくつかの実施形態では、第１のサブ集団のインデックスは、第２のサブ集団のインデックスとは異なる。本明細書で提供されるキット及びシステムのいくつかの実施形態では、第１の体積がビーズの第１のサブ集団を含み、第２の体積がビーズの第２のサブ集団を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の異なる捕捉プローブは、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、一塩基多型（ＳＮＰ）又はその相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、バーコードプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のバーコードプライマーも含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含み、ビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、インデックスプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のインデックスプライマーも含む。
いくつかの実施形態では、基材は、複数の別個の部位を含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。いくつかの実施形態では、基材は、ビーズの第１のサブ集団と第２のサブ集団との組み合わせが基材の表面上にビーズのアレイを形成し、かつアレイが複数回の合成による配列決定サイクルで配列決定されることができるように、適合される。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５０個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５００個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５０００個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を含む少なくとも５００００個の捕捉プローブを含む。
いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１０個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１０００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。いくつかの実施形態は、ビーズの少なくとも１００００個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。
いくつかの実施形態は、基材の表面上にランダムに分配されたポリヌクレオチドのアレイを含むキットを含み、各ポリヌクレオチドは、バーコードのプライマー結合部位３’を含み、捕捉プローブに連結されており、各ポリヌクレオチドは、異なるバーコードを含み、異なる捕捉プローブに連結されている。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは、ビーズを介して捕捉プローブに連結されている。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドは捕捉プローブを含み、いくつかの実施形態では、基材は平面である。いくつかの実施形態では、基材はウェルを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ビーズに取り付けられている。いくつかの実施形態では、ビーズはウェル内に分配されている。いくつかの実施形態では、フローセルはアレイを含む。
いくつかの実施形態は、ビーズの第１及び第２のサブ集団を含むキット及びシステムを含む。いくつかの実施形態では、各ビーズは、標的リガンドに特異的に結合する捕捉プローブを含む。標的リガンドの例としては、核酸、タンパク質、又は他の抗原が挙げられる。捕捉プローブの例としては、核酸、抗体、及び抗体の抗原結合断片が挙げられる。いくつかの実施形態では、各ビーズは、同じビーズの捕捉プローブを示すバーコードと、バーコードのバーコードプライマー結合部位３’とを含む第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、各ビーズは、インデックスと、インデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のサブ集団のインデックスは、第２のサブ集団のインデックスとは異なる。例えば、ビーズの第１のサブ集団のインデックスは、ビーズの第１のサブ集団をビーズの第２のサブ集団と区別するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団は、ビーズの第２のサブ集団と別個である。例えば、第１の体積はビーズの第１のサブ集団を含み、第２の体積はビーズの第２のサブ集団を含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは核酸を含み、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかのそのような実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、一塩基多型（ＳＮＰ）又はその相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、抗体又は抗体の抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なる標的リガンドに特異的に結合する。例えば、ビーズの第１のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なる標的リガンドに特異的に結合し、ビーズの第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なる標的リガンドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の異なる捕捉プローブは、同じ標的リガンドに特異的に結合する。例えば、ビーズの第１のサブ集団の異なる捕捉プローブのセットは、ビーズの第１のサブ集団の異なる捕捉プローブのセットと同じ標的リガンドに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、バーコードプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のバーコードプライマーも含む。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含み、及び／又はビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、インデックスプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のインデックスプライマーも含む。
いくつかの実施形態では、基材は、複数の別個の部位を含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のウェルを含む。いくつかの実施形態では、基材は、複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。いくつかの実施形態では、基材は、ビーズの第１のサブ集団と第２のサブ集団との組み合わせが基材の表面上にビーズのアレイを形成し、かつアレイが複数回の合成による配列決定サイクルで配列決定されることができるように、適合される。
いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、互いに異なる少なくとも５０、１００、５００、１０００、若しくは５０００個の捕捉プローブ、又は前述の数のうちのいずれか２つの間の任意の数の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００個の、ビーズの異なるサブ集団であって、各サブ集団が別のサブ集団とは異なるインデックスを含む、サブ集団、又は前述の数のうちのいずれか２つの間の任意の数の、ビーズの異なるサブ集団も含む。
いくつかの実施形態は、キットを含み、このキットは、ビーズの第１及び第２のサブ集団であって、各ビーズが、標的リガンドに特異的に結合する捕捉プローブと、捕捉プローブを示すバーコードとバーコードのバーコードプライマー結合部位３’とを含む第１のポリヌクレオチドと、インデックスとインデックスのインデックスプライマー結合部位３’とを含む第２のポリヌクレオチドと、を含み、第１のサブ集団のインデックスが、第２のサブ集団のインデックスとは異なり、第１の体積がビーズの第１のサブ集団を含み、第２の体積がビーズの第２のサブ集団を含む、ビーズの第１及び第２のサブ集団を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは核酸を含み、標的リガンドは標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の異なる捕捉プローブは、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の捕捉プローブはそれぞれ、互いに異なる標的リガンドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団の異なる捕捉プローブは、同じ標的リガンドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、バーコードプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のバーコードプライマーも含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含み、ビーズの第２のサブ集団のインデックスのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位のヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態はまた、インデックスプライマー部位にハイブリダイズすることができる複数のインデックスプライマーも含む。いくつかの実施形態では、フローセルは基材を含む。いくつかの実施形態では、基材は、ビーズの第１のサブ集団と第２のサブ集団との組み合わせが基材の表面上にビーズのアレイを形成し、かつアレイが複数回の合成による配列決定サイクルで配列決定されることができるように、適合される。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、互いに異なる少なくとも５０個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ビーズの第１及び第２のサブ集団はそれぞれ、互いに異なる少なくとも５００個の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、ビーズの少なくとも１０個の異なるサブ集団を含み、各サブ集団は別のサブ集団とは異なるインデックスを含む。
本明細書に提供されるキット及びシステムのより多くの実施形態は、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドを含むビーズの複数の集団を含むことができ、オリゴヌクレオチドが、インデックス、インデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位、捕捉プローブ、バーコード、及びバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含み、インデックスがビーズの集団間で異なる。いくつかの実施形態では、インデックスプライマー結合部位は、複数の集団において同じである。いくつかの実施形態では、バーコードは、捕捉プローブの核酸配列を示す。いくつかの実施形態では、バーコードは、ビーズの集団において異なる。いくつかの実施形態では、バーコードプライマー結合部位は、複数の集団において同じである。いくつかの実施形態では、ビーズは、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは磁性である。
いくつかの実施形態はまた、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、核酸サンプルをタグ付けするためのトランスポソーム、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むトランスポソーム、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むアダプター、インデックスプライマー結合部位若しくはその相補体にハイブリダイズすることができるプライマー、及び／又はバーコードプライマー結合部位若しくはその相補体にハイブリダイズすることができるプライマーから選択される試薬も含む。いくつかの実施形態はまた、フローセルの表面上のアレイなどのアレイを含む。いくつかの実施形態は、アレイ内のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた試薬からのシグナルを検出するように適合された検出器を含み、そのような試薬は、検出可能な標識を含むヌクレオチドなどの配列決定試薬を含むことができる。いくつかの実施形態は、ピロリン酸など、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの取り込み、又は水素イオンの変化から生じることができるシグナルを検出するように適合された検出器を含む。
実施例１－配列決定によるアレイのデコード
複数のポリヌクレオチドを合成し、各ポリヌクレオチドは、５’から３’に、スペーサー、固有のバーコード、プライマー結合部位、及び固有の捕捉プローブを含む。バーコード及び捕捉プローブの配列は既知である。プライマー結合部位の配列は、各ポリヌクレオチドで同じである。各ポリヌクレオチドをビーズに取り付ける。ビーズを、チップのウェル内にランダムに分配する。プライマーをプライマー結合部位にハイブリダイズし、プライマーを伸長させ、バーコードの配列を検出することによって、ビーズアレイをデコードする。バーコードの位置により、関連する捕捉プローブの位置が識別される。
実施例２－配列決定によるアレイ上のバーコードのデコード
ヒトゲノムＤＮＡから調製される核酸ライブラリを調製した。ビーズのサブ集団を調製した。第１及び第２のポリヌクレオチドを各ビーズに取り付けた。第１のポリヌクレオチドは、捕捉プローブ、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを示すバーコードを含んでいた。第２のポリヌクレオチドは、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含んでいた。
１８８１６の異なるコード／プローブタイプを含むビーズプールを、ＨｉＳｅｑフローセル上にロードした（図７Ａ）。固定化後、ＳＢＳケミストリーを使用して２０ヌクレオチド長のコードを配列決定し、コード配列をビーズタイプのリストに位置合わせすることによって各ビーズの同一性を決定した。図７Ｂは、特定のビン内の特定のビーズタイプの複製数のヒストグラムであり、予想される内容物の９７．５％が、配列決定ベースのデコードプロセスを使用して識別されること、及びビーズタイプの大多数が、遺伝子型決定試験に十分な濃度で存在することを示した。
実施例３－ＦＦＮ検出を使用したＨｉＳｅｑ上での遺伝子型決定性能
ＦＦＮ検出を使用したＨｉＳｅｑ上での遺伝子型決定性能を実証するために、オリゴヌクレオチド標的ＤＮＡを、プローブオリゴにコンジュゲートされたビーズの懸濁液にハイブリダイズした。ビーズは、ＨｉＳｅｑフローセル上にロードした。標的ＤＮＡに結合したプローブを、蛍光ヌクレオチドを使用して一塩基伸長させた。ビーズをロードしたフローセルを撮像して、遺伝子型決定ビーズ強度を得た。蛍光ヌクレオチドを切断し、ＳＢＳケミストリーを使用してビーズをデコードした。デコード及び遺伝子型決定リードを位置合わせして、アッセイ性能を測定した。個々の点を、予想される遺伝子型に従って着色した。図７Ｃは、Ｃ強度対Ｔ強度のグラフであり、各点は、所与のビーズタイプの全ての複製の平均であり、予想される遺伝子型に従って着色されており、蛍光ヌクレオチドによる一塩基プローブ伸長が正確な遺伝子型決定を可能にすることを示した。
実施例４－１０，３６８プレックスのビーズプールによる１２個のサンプルの多重化
この実施例は、単一フローセル上の複数サンプルの多重分離、具体的には、１０、３６８プレックスのビーズプールで１２個のサンプルを多重化する能力を実証する。単一のビーズプールを１２個の異なるインデックス配列に別個にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、サンプルをプールし、ＨｉＳｅｑフローセル上にロードした。次いで、２つの別個の読み取り、すなわち、ハイブリダイズされたインデックスに基づいてサンプルを識別するための読み取り、及びデコード読み取りに基づいてビーズタイプを識別するための別個の読み取りを実施した。図８は、代表的なサンプルに対する特定のバインド内の特定のビーズタイプの数のヒストグラムであり、ビーズタイプの大半が、所与のサンプルに対する遺伝子型決定実験のために十分な濃度で存在することを示した。図７の表は、同時にプール及びロードされた１２個のインデックス化されたサンプルにわたるビーズの多重分離及びデコードの一貫性の要約であり、サンプル表現が均一であり、プローブの大半が全てのサンプルにわたって存在することを実証している。
実施例５－大規模な並列ＳＮＰ遺伝子型決定
これは、単一の配列決定実行における３８４サンプルの遺伝子型決定の例示的なワークフローである。対象となる一塩基多型（ＳＮＰ）を含む標的核酸を含むポリヌクレオチドは、３８４ウェルプレートで調製される。各ウェルは、異なる被験者からのＤＮＡを含有する。ＤＮＡは、ＤＮＡを断片化し、断片の各末端に増幅プライマー結合部位を付加するトランスポソームでタグ付けされる。断片は、インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むプライマーで増幅されて、各増幅された断片の少なくとも１つの末端がインデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む、増幅された断片を得る。特定のウェル由来のポリヌクレオチドを特定のインデックスで識別することができるように、インデックスはウェル毎に異なる。調製されたポリヌクレオチドは、インデックス、インデックスプライマー結合部位、及び標的核酸を含む。
ビーズの集団が各ウェルに付加される。ビーズの集団は、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、バーコード、バーコードプライマー結合部位、及び捕捉プローブを含む。捕捉プローブは、５０ヌクレオチド長であり、特定の標的核酸に特異的である。バーコードを使用して、捕捉プローブを識別することができる。ビーズの集団は、異なる捕捉プローブを含む。標的核酸は、各ウェルの溶液中の捕捉プローブとハイブリダイズして、ハイブリダイズされたビーズを得る。各ウェルからハイブリダイズされたビーズは一緒にプールされ、フローセル上のビーズアレイにロードされる。ハイブリダイズされたビーズは、アレイ上にランダムに分配される。
アレイ上で、捕捉プローブは、単一のヌクレオチドによって伸長されて、ＳＮＰを識別する。インデックスは、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長して、標的核酸のソースを識別することによって配列決定される。バーコードは、インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長して、アレイ上のビーズの位置をデコードすることによって配列決定される。特定のＳＮＰが識別され、特定の被験者からの特定のＤＮＡサンプルと関連付けられる。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するものである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。そのような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明のその開示又は実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び代替を網羅することを意図する。
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。

Claims (116)

  1. 標的核酸をアレイ上に配列決定する方法であって、
    （ａ）ビーズの第１の集団及び第２の集団を得ることであって、
    前記ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び前記第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、
    前記ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び前記第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）第１の複数のポリヌクレオチド及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、
    前記第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、前記複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、
    前記第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、前記複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、
    （ｃ）前記第１の標的核酸を前記第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、前記第２の標的核酸を前記第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、
    （ｄ）前記ハイブリダイズされた第１のビーズ及び前記ハイブリダイズされた前記第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、
    （ｅ）前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードを配列決定することによって、前記アレイ上の前記第１のビーズ及び前記第２のビーズの位置をデコードすることと、
    （ｆ）前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長して、前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、
    を含む、方法。
  2. 前記第１の複数のポリヌクレオチドが、第１のインデックス、及び前記第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、
    前記第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び前記第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の複数のポリヌクレオチド又は前記第２の複数のポリヌクレオチドが、複数のトランスポソームで核酸サンプルをタグ付けすることによって得られる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記複数のトランスポソームが、前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記タグ付けされた核酸サンプルにアダプターを付加することを更に含み、前記アダプターが、前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含むプライマーで前記タグ付けされた核酸サンプルを増幅することを更に含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、前記第１のインデックス及び前記第２のインデックス、並びに前記第１のインデックスプライマー結合部位及び前記第２のインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を、伸長された前記捕捉プローブに組み込む、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ビーズの第１の集団が、第１のインデックス、及び前記第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、
    前記ビーズの第２の集団が、第２のインデックス、及び前記第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ビーズの第１の集団の前記オリゴヌクレオチドが、前記第１のインデックスを含み、前記ビーズの第２の集団の前記オリゴヌクレオチドが、前記第２のインデックスを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記第１のインデックスが、前記第１の標的核酸のソースを示し、前記第２のインデックスが、前記第２の標的核酸のソースを示す、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１のインデックスが互いに同じであり、前記第２のインデックスが互いに同じである、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１のインデックス及び前記第２のインデックスを配列決定することを更に含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１のインデックス及び前記第２のインデックスを配列決定することが、前記インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記インデックスプライマー結合部位が同じである、請求項２～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、異なる核酸サンプルから得られる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、ゲノムＤＮＡから得られる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記第１の捕捉プローブ又は前記第２の捕捉プローブの核酸配列を示す、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第１のバーコードが互いに異なり、前記第２のバーコードが互いに異なる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードを配列決定することが、前記バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記バーコードプライマー結合部位が同じである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、ポリメラーゼ伸長を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、捕捉プローブへの単一のヌクレオチドの付加を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを前記伸長された捕捉プローブにライゲーションすることを更に含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを前記捕捉プローブにライゲーションすることを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 工程（ｃ）が、溶液中で実施される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記アレイが、フローセルの表面上に位置する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記第１のビーズ及び前記第２のビーズが、前記アレイに取り付けられるように適合されている、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第１のビーズ及び前記第２のビーズが、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む、又は前記アレイが、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが磁性である、請求項２７に記載の方法。
  30. 標的核酸をアレイ上に配列決定する方法であって、
    （ａ）ビーズの第１の集団及び第２の集団を得ることであって、
    前記ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、及び前記第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、
    前記ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び前記第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）第１の複数のポリヌクレオチド及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、
    前記第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸、第１のインデックス、及び前記第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、前記複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、
    前記第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び前記第２のインデックスに隣接する第２のプライマー結合部位を含み、前記複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、
    （ｃ）前記第１の標的核酸を前記第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、前記第２の標的核酸を前記第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、
    （ｄ）前記ハイブリダイズされた第１のビーズ及び前記ハイブリダイズされた第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、
    （ｅ）前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードを配列決定することによって、前記アレイ上の前記第１のビーズ及び前記第２のビーズの位置をデコードすることと、
    （ｆ）前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長して、前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、
    （ｇ）前記第１のインデックス及び前記第２のインデックスを配列決定することによって、前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸の前記核酸配列データのソースを決定することと、
    を含む、方法。
  31. 前記第１の複数のポリヌクレオチドが、第１のインデックス、及び前記第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含み、
    前記第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸、第２のインデックス、及び前記第２のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記第１の複数のポリヌクレオチド又は前記第２の複数のポリヌクレオチドが、複数のトランスポソームで核酸サンプルをタグ付けすることによって得られる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記複数のトランスポソームが、前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記タグ付けされた核酸サンプルにアダプターを付加することを更に含み、前記アダプターが、前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第１のインデックス又は前記第２のインデックスを含むプライマーで前記タグ付けされた核酸サンプルを増幅することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、前記第１のインデックス及び前記第２のインデックス、並びに前記第１のインデックスプライマー結合部位及び前記第２のインデックスプライマー結合部位に相補的な配列を、前記伸長された捕捉プローブに組み込む、請求項３５に記載の方法。
  37. 標的核酸をアレイ上に配列決定する方法であって、
    （ａ）ビーズの第１の集団及び第２の集団を得ることであって、
    前記ビーズの第１の集団が、第１の捕捉プローブ、第１のバーコード、前記第１のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、第１のインデックス、及び前記第１のインデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含み、
    前記ビーズの第２の集団が、第２の捕捉プローブ、第２のバーコード、及び前記第２のバーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位、及び前記第２のインデックスに隣接する第２のインデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）第１の複数のポリヌクレオチド及び第２の複数のポリヌクレオチドを得ることであって、
    前記第１の複数のポリヌクレオチドが、第１の標的核酸を含み、前記複数の第１のポリヌクレオチドが、溶液中にあり、
    前記第２の複数のポリヌクレオチドが、第２の標的核酸を含み、前記複数の第２のポリヌクレオチドが、溶液中にある、ことと、
    （ｃ）前記第１の標的核酸を前記第１の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第１のビーズを得ることと、前記第２の標的核酸を前記第２の捕捉プローブにハイブリダイズして、ハイブリダイズされた第２のビーズを得ることと、
    （ｄ）前記ハイブリダイズされた第１のビーズ及び前記ハイブリダイズされた第２のビーズをアレイ上にランダムに分配することと、
    （ｅ）前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードを配列決定することによって、前記アレイ上の前記第１のビーズ及び前記第２のビーズの位置をデコードすることと、
    （ｆ）前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長して、前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸の核酸配列データを得ることと、
    を含む、方法。
  38. ビーズの前記第１の集団の前記オリゴヌクレオチドが、前記第１のインデックスを含み、ビーズの前記第２の集団のオリゴヌクレオチドが、前記第２のインデックスを含む、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記第１のインデックスが、前記第１の標的核酸のソースを示し、前記第２のインデックスが、前記第２の標的核酸のソースを示す、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記第１のインデックスが互いに同じであり、前記第２のインデックスが互いに同じである、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記第１のインデックス及び前記第２のインデックスを配列決定することを更に含む、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記第１のインデックス及び前記第２のインデックスを配列決定することが、前記インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記インデックスプライマー結合部位が同じである、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、異なる核酸サンプルから得られる、請求項３０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第１の標的核酸及び前記第２の標的核酸が、ゲノムＤＮＡから得られる、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記第１の捕捉プローブ又は前記第２の捕捉プローブの核酸配列を示す、請求項３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記第１のバーコードが互いに異なり、前記第２のバーコードが互いに異なる、請求項３０～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードを配列決定することが、前記バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズされたプライマーを伸長することを含む、請求項３０～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記バーコードプライマー結合部位が同じである、請求項３０～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、ポリメラーゼ伸長を含む、請求項３０～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、捕捉プローブへの単一のヌクレオチドの付加を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを前記伸長された捕捉プローブにライゲーションすることを更に含む、請求項５０又は５１に記載の方法。
  53. 前記第１の捕捉プローブ及び前記第２の捕捉プローブを伸長することが、遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドを前記捕捉プローブにライゲーションすることを含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 工程（ｃ）が、溶液中で実施される、請求項３０～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. フローセルが前記アレイを含む、請求項３０～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記アレイが、複数のウェルを含む、請求項３０～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記第１のビーズ及び前記第２のビーズが、前記アレイに取り付けられるように適合されている、請求項３０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第１のビーズ及び前記第２のビーズが、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む、又は前記アレイが、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが磁性である、請求項５７に記載の方法。
  60. キットであって、ビーズに取り付けられたオリゴヌクレオチドを含む前記ビーズの複数の集団であって、前記オリゴヌクレオチドが、インデックス、前記インデックスに隣接するインデックスプライマー結合部位、捕捉プローブ、バーコード、及び前記バーコードに隣接するバーコードプライマー結合部位を含み、前記インデックスが前記ビーズの集団間で異なる、複数の集団を含む、キット。
  61. 前記インデックスプライマー結合部位が、前記複数の集団において同じである、請求項６０に記載のキット。
  62. 前記バーコードが、前記捕捉プローブの核酸配列を示す、請求項６０又は６１に記載のキット。
  63. 前記バーコードが、ビーズの集団において異なる、請求項６０～６２のいずれか一項に記載のキット。
  64. 前記バーコードプライマー結合部位が、前記複数の集団において同じである、請求項６０～６３のいずれか一項に記載のキット。
  65. 遺伝子座特異的オリゴヌクレオチド、
    核酸サンプルをタグ付けするためのトランスポソーム、
    インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むトランスポソーム、
    インデックス及びインデックスプライマー結合部位を含むアダプター、
    インデックスプライマー結合部位又はその相補体にハイブリダイズすることができるプライマー、並びに
    バーコードプライマー結合部位又はその相補体にハイブリダイズすることができるプライマー、
    から選択される試薬を更に含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載のキット。
  66. フローセルを更に含む、請求項６０～６５のいずれか一項に記載のキット。
  67. インデックス化されたビーズの集団を調製する方法であって、
    （ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、アダプター、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）複数のインデックスポリヌクレオチドを得ることであって、各インデックスポリヌクレオチドがインデックス及びインデックスプライマー結合部位を含む、ことと、
    （ｃ）前記複数のインデックスポリヌクレオチドを、前記アダプターを介して前記ビーズの集団に取り付けることによって、インデックス化されたビーズの集団を得ることと、を含む、方法。
  68. （ｃ）が、ポリメラーゼ伸長によって前記アダプターを伸長することを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 各インデックスポリヌクレオチドが、アダプター結合部位を含み、前記取り付けることが、前記アダプター結合部位を前記アダプターにハイブリダイズすることを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. （ｃ）が、前記インデックスポリヌクレオチドを前記アダプターにライゲーションすることを含む、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記取り付けることが、スプリントポリヌクレオチドを前記アダプター及び前記インデックスポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを含む、請求項７０に記載の方法。
  72. （ｃ）が、化学反応性部分を介して前記ビーズの集団の前記アダプターに前記複数のインデックスポリヌクレオチドを取り付けることを含む、請求項６７に記載の方法。
  73. 前記取り付けることが、クリックケミストリー反応を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ビーズの集団の前記第１のポリヌクレオチドが、互いに異なる捕捉プローブを含む、請求項６７～７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 各インデックスポリヌクレオチドの前記インデックスが同じである、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記第１のポリヌクレオチドが、前記捕捉プローブを含む、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記インデックス化されたビーズの集団を、標的核酸を含む複数の核酸と接触させることを更に含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 標的核酸を含む複数の核酸と接触させられたインデックス化された前記ビーズの集団を、追加のインデックス化されたビーズの集団と混合することを更に含み、前記追加のインデックス化されたビーズの集団が、複数の核酸と接触させられた前記インデックス化された前記ビーズの集団の前記インデックスとは異なるインデックスを含むインデックスポリヌクレオチドを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記捕捉プローブが、タンパク質を含む、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  80. フローセルで実施される、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. 標的リガンドを検出する方法であって、
    （ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、並びにバーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びバーコードプライマー結合部位に結合することができるアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、
    （ｃ）標的リガンドを前記捕捉プローブに特異的に結合することと、
    （ｄ）前記インデックスポリヌクレオチドを、前記アダプターを介して前記第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることと、
    （ｅ）アレイ上の前記標的リガンドを検出することと、
    （ｆ）前記第１のポリヌクレオチドの前記インデックス及び前記バーコードを決定することと、を含む、方法。
  82. （ｅ）が、アレイ上にビーズの前記集団を分配することを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. （ｆ）が、インデックスプライマーを前記インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、前記インデックスの配列を決定することとを含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
  84. 前記第１のポリヌクレオチドから前記インデックスポリヌクレオチドをデハイブリダイズすることと、バーコードプライマーを前記バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、前記バーコードプライマーを伸長して、前記バーコードの配列を決定することと、を更に含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記インデックスポリヌクレオチドが、前記アダプターと前記インデックスとの間に位置する切断可能なリンカーを更に含み、（ｆ）が、
    （ｉ）前記切断可能なリンカーを切断することと、
    （ｉｉ）前記アダプターを伸長して、前記バーコードの配列を決定することと、を含む、請求項８１又は８２に記載の方法。
  86. 前記捕捉プローブが、タンパク質を含む、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記標的リガンドが標的核酸を含む、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記第１のポリヌクレオチドが、前記捕捉プローブを含む、請求項８７に記載の方法。
  89. （ｅ）が、前記標的核酸にハイブリダイズされた前記第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む、請求項８７又は８８に記載の方法。
  90. 前記伸長が、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む、請求項８９に記載の方法。
  91. フローセル上で実施される、請求項８１～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 標的リガンドを検出する方法であって、
    （ａ）ビーズの集団を得ることであって、各ビーズが、捕捉プローブ、バーコード及びバーコードプライマー結合部位を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第２のポリヌクレオチドを含む、ことと、
    （ｂ）インデックス、インデックスプライマー結合部位、及びアダプターを含むインデックスポリヌクレオチドを得ることと、
    （ｃ）標的リガンドを捕捉プローブに特異的に結合することと、
    （ｄ）前記インデックスポリヌクレオチドを、前記アダプターを介して前記第２のポリヌクレオチドに取り付けることと、
    （ｅ）アレイ上の前記標的リガンドを検出することと、
    （ｆ）前記第１のポリヌクレオチドの前記インデックス及び前記バーコードを決定することと、を含む、方法。
  93. 前記第２のポリヌクレオチドが、バーコード、及びバーコードプライマー結合部位を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. （ｄ）が、反応性部分を第２のポリヌクレオチドに付加することを含み、前記アダプターが、前記反応性部分に取り付けることができる、請求項９２又は９３に記載の方法。
  95. 前記反応性部分を付加することが、クリックケミストリー反応を含む、請求項９４に記載の方法。
  96. （ｅ）が、アレイ上にビーズの集団を分配することを含む、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. （ｆ）が、インデックスプライマーを前記インデックスプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、前記インデックスの配列を決定することとを含む、請求項９２～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. （ｆ）が、バーコードプライマーを前記バーコードプライマー結合部位にハイブリダイズすることと、前記バーコードの配列を決定することとを含む、請求項９２～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記捕捉プローブが、タンパク質を含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記標的リガンドが標的核酸を含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記第１のポリヌクレオチドが、前記捕捉プローブを含む、請求項１００に記載の方法。
  102. （ｅ）が、前記標的核酸にハイブリダイズされた前記第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む、請求項１００又は１０１に記載の方法。
  103. 前記伸長が、検出可能なジデオキシヌクレオチドを付加することを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. フローセル上で実施される、請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. アレイ上の標的リガンドを検出する方法であって、
    （ａ）ビーズの第１の集団及び第２の集団を得ることであって、各ビーズが、
    標的リガンドに特異的に結合することができる捕捉プローブと、
    バーコード及びバーコードプライマー結合部位をコードする核酸であって、前記バーコードが前記捕捉プローブを示す、核酸と、
    インデックス及びインデックスプライマー結合部位をコードする核酸であって、前記インデックスが前記第１の集団又は前記第２の集団からの前記ビーズのソースを示す、核酸と、
    を含む、ことと、
    （ｂ）前記ビーズの第１の集団を、第１の標的リガンドを含む第１のサンプルと接触させることであって、前記第１の標的リガンドが、前記ビーズの第１の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第１の集団を得る、ことと、
    （ｃ）ビーズの第２の集団を、第２の標的リガンドを含む第２のサンプルと接触させることであって、前記第２の標的リガンドが、前記ビーズの第２の集団の捕捉プローブに特異的に結合し、それによって標的結合されたビーズの第２の集団を得る、ことと、
    （ｄ）前記標的結合されたビーズの第１の集団及び前記標的結合されたビーズの第２の集団を、アレイ上にランダムに分配することと、
    （ｅ）前記アレイ上の前記第１の標的リガンド及び前記第２の標的リガンドを含む前記ビーズの位置を検出することと、
    （ｆ）前記アレイ上の前記第１の標的リガンド及び前記第２の標的リガンドを含む前記ビーズの前記インデックス及び前記バーコードの配列を決定することと、を含む、方法。
  106. 前記捕捉プローブが、ポリヌクレオチドを含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記標的リガンドが核酸を含む、請求項１０５又は１０６に記載の方法。
  108. 前記アレイ上の前記第１の標的リガンド及び前記第２の標的リガンドを含む前記ビーズの位置を検出することが、ポリメラーゼ伸長又はライゲーションによって前記捕捉プローブを伸長することを含む、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記捕捉プローブが、タンパク質を含む、請求項１０５に記載の方法。
  110. 工程（ｅ）が、工程（ｆ）の後に実施される、請求項１０５～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記ビーズの第１の集団の前記バーコードが、互いに異なるバーコードを含み、前記第２のビーズの集団の前記バーコードが、互いに異なるバーコードを含む、請求項１０５～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記ビーズの第１の集団の前記インデックスが互いに同じであり、前記ビーズの第２の集団の前記インデックスが互いに同じである、請求項１０５～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記アレイが、フローセルの表面上に位置する、請求項１０５～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. ビーズの前記第１の集団及び前記第２の集団が、前記アレイに取り付けられるように適合されている、請求項１０５～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. ビーズの前記第１の集団及び前記第２の集団が、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含み、前記アレイが、ビオチン、ストレプトアビジン、又はそれらの誘導体を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. ビーズの前記第１の集団及び前記第２の集団が、磁性である、請求項１１４に記載の方法。
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