ES3000582T3

ES3000582T3 - Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3

Info

Publication number: ES3000582T3
Application number: ES18716573T
Authority: ES
Inventors: Deak Laura Codarri; Jens Fischer; Sabine Imhof-Jung; Christian Klein; Stefan Seeber; Patrick Alexander Aaron Weber; Mario Perro
Original assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: HOFFMANN LA ROCHE; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2025-02-28
Anticipated expiration: 2038-04-03
Also published as: WO2018185043A1; IL268527B1; EP3606955B1; TWI690538B; US11285207B2; PE20191463A1; CN116375876A; PL3606955T3; JP7304921B2; KR102346336B1; TW201841941A; KR20190126356A; MY199406A; SG11201909154SA; MX2019011910A; BR112019019821A2; JP2020516252A; CN110506059A; US20180326054A1; LT3606955T

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3. La invención se refiere además a métodos para producir estas moléculas y a métodos para utilizarlas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a PD1 y LAG3

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en los que el anticuerpo biespecífico es bivalente y comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende dicho primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio v L que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y un segundo fragmento Fab que comprende el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, en particular a anticuerpos biespecíficos que comprenden además un dominio Fc que comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. La invención se refiere además a procedimientos de producción de estas moléculas y a procedimientos de uso de las mismas.

Antecedentes

La importancia del sistema inmunitario en la protección contra el cáncer se basa en su capacidad para detectar y destruir células anómalas. Sin embargo, algunas células tumorales pueden escapar del sistema inmunitario generando un estado de inmunosupresión (Zitvogelet al.,Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715-727). Los linfocitos T tienen un papel importante en las respuestas inmunitarias antivíricas y antitumorales. La activación apropiada de linfocitos T específicos de antígeno da lugar a su expansión clonal y a su adquisición de función efectora y, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL), les permite lisar específicamente las células diana. Los linfocitos T han sido el foco principal de los esfuerzos para manipular terapéuticamente la inmunidad antitumoral endógena debido a su capacidad para el reconocimiento selectivo de péptidos derivados de proteínas en todos los compartimentos celulares; su capacidad para reconocer y destruir directamente las células que expresan antígenos (por linfocitos T efectores CD8+; también conocidos como linfocitos T citotóxicos (CTL)) y su capacidad para orquestar diversas respuestas inmunitarias (por linfocitos T cooperadores CD4+), lo que integra mecanismos efectores adaptativos e innatos. La disfunción de linfocitos T se produce como resultado de una exposición a antígeno prolongada: el linfocito T pierde la capacidad de proliferar en presencia del antígeno y progresivamente deja de producir citocinas y de lisar las células d iana l. Los linfocitos T disfuncionales se han denominado linfocitos T agotados y no proliferan ni ejercen funciones efectoras tales como citotoxicidad y secreción de citocinas en respuesta a la estimulación antigénica. Otros estudios identificaron que los linfocitos T agotados se caracterizan por la expresión mantenida de la molécula inhibidora PD-1 (proteína de muerte celular programada 1) y que el bloqueo de las interacciones de PD-1 y PD-L1 (ligando de PD-1) puede invertir el agotamiento de linfocitos T y restaurar las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno en ratones infectados con LCMV (Barberet al.,Nature 439 (2006), 682-687). Sin embargo, seleccionar la vía PD-1-PD-L1 sola no siempre da como resultado la inversión del agotamiento de linfocitos T (Gehringet al.,Gastroenterology 137 (2009), 682-690), lo que indica que es probable que otras moléculas estén implicadas en el agotamiento de linfocitos T (Sakuishi, J. Experimental Med.

207 (2010), 2187-2194).

El gen de activación de linfocitos 3 (LAG3 o CD223) se descubrió inicialmente en un experimento diseñado para aislar selectivamente moléculas expresadas en una línea de células NK dependiente de IL-2 (Triebel Fet al.,Cancer Lett. 235 (2006), 147-153). LAG3 es una proteína transmembranaria única con homología estructural con CD4 con cuatro dominios similares a la superfamilia de inmunoglobulinas extracelulares (D1-D4). El dominio de IgG distal a la membrana contiene una secuencia de aminoácidos corta, el denominado bucle adicional que no se encuentra en otras proteínas de la superfamilia de IgG. El dominio intracelular contiene una secuencia de aminoácidos única (KIEELE, SEQ ID NO: 75) que se requiere para que LAG3 ejerza un efecto negativo sobre la función de linfocitos T. LAG3 se puede escindir en el péptido conector (CP) por metaloproteasas para generar una forma soluble, que es detectable en el suero. Al igual que CD4, la proteína lAG3 se une a moléculas MHC de clase II, aunque con mayor afinidad y en un sitio distinto de CD4 (Huardet al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749). LAG3 se expresa por linfocitos T, linfocitos B, linfocitos NK y células dendríticas plasmocitoides (CDp) y se regula por incremento después de la activación de los linfocitos T. Modula la función de los linfocitos T, así como la homeostasis de los linfocitos T. Los subconjuntos de linfocitos T convencionales que son anérgicos o presentan funciones alteradas expresan LAG3. Los linfocitos T LAG3+ se enriquecen en los sitios tumorales y durante las infecciones víricas crónicas (Sierroet alExpert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101). Se ha demostrado que LAG3 desempeña un papel en el agotamiento de los linfocitos T CD8 (Blackburnet al.Nature Immunol. 10 (2009), 29-37). Por tanto, existe la necesidad de anticuerpos que antagonicen la actividad de LAG3 y se puedan usar para generar y restablecer la respuesta inmunitaria a los tumores.

Se han descrito anticuerpos monoclonales para LAG3, por ejemplo, en el documento WO 2004/078928, en el que se reivindica una composición que comprende anticuerpos que se unen específicamente a CD223 y una vacuna contra el cáncer. El documento WO 2010/019570 divulga anticuerpos humanos que se unen a LAG3, por ejemplo, los anticuerpos 25F7 y 26H10. El documento US 2011/070238 se refiere a un anticuerpo anti-LAG3 citotóxico útil en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes de órganos y enfermedades autoinmunitarias. El documento WO 2014/008218 describe anticuerpos para LAG3 con propiedades funcionales optimizadas (es decir, sitios de desamidación reducidos) en comparación con el anticuerpo 25F7. Además, los anticuerpos para LAG3 se divulgan en los documentos WO 2015/138920 (por ejemplo, BAP050), WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782 y WO 2017/015560.

La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1 o CD279) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 es un receptor de superficie celular y se expresa en células mieloides, linfocitos T y linfocitos B activados (Okazakiet al(2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennettet al.(2003) J Immunol 170:711-8). La estructura de PD-1 es una proteína transmembranaria de tipo 1 monomérica, que consiste en un dominio extracelular de tipo variable de inmunoglobulina y un dominio citoplásmico que contiene un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) y un motivo de intercambio basado en tirosina del inmunorreceptor (ITSM). Los linfocitos T activados expresan de forma transitoria PD1, pero la hiperexpresión mantenida de PD1 y su ligando PDL1 promueven el agotamiento inmunitario, dando lugar a persistencia de infecciones víricas, evasión tumoral, incremento de infecciones y mortalidad. La expresión de PD1 se induce por el reconocimiento de antígenos por medio del receptor de linfocitos T y su expresión se mantiene principalmente a través de la señalización del receptor de linfocitos T continua. Después de una exposición a antígenos prolongada, el locus de PD1 no se remetila, lo que promueve una hiperexpresión continua. El bloqueo de la vía PD1 puede restaurar la funcionalidad de linfocitos T agotada en cáncer e infecciones víricas crónicas (Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730). Se han descrito anticuerpos monoclonales frente a PD-1, por ejemplo, en los documentos WO 2003/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2004/087196, WO 2006/121168, WO 2006/133396, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2008/156712, WO 2009/024531, WO 2009/014708, WO 2009/101611, WO 2009/114335, WO 2009/154335, WO 2010/027828, WO 2010/027423, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/063011, WO 2010/089411, WO 2011/066342, WO 2011/110604, WO 2011/110621, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664 y WO 2015/112900.

Los diacuerpos de Fc biespecíficos que tienen inmunorreactividad con PD1 y LAG3 para su uso en el tratamiento del cáncer o una enfermedad asociada con un patógeno tal como una bacteria, un hongo o un virus se describen en el documento WO 2015/200119. Los anticuerpos biespecíficos que se unen a PD1 o PD-L1 y LAG3 se divulgan además por Rinse Kloosteret al.,"Generation of immuno-modulatory receptor binding bispecific antibodies to modulate tumor immunity (B088)" (http://www.merus.nl/wordpress/wp-content/uploads/2015/10/Poster-ICIC-New-York-26Sep16-final.pdf), Bernettet al.,"Multiple Bispecific Checkpoint Combinations Promote T cell activation (http://files.shareholder.com/ downloads/AMDA-2B2V8N/0x0x916283/67AE1A8B-40E8-4316-9F79-384D06B2C395/XNCR_SITC_2016_PD1x CTLA4_Poster126_12Nov2016.pdf) y Kramanet al,"A LAG-3/PD-L1 bispecific antibody inhibits tumor growth in two syngeneic colon carcinoma models" (http://www.f-star.com/media/73722/A-LAG-3-PD-L1-bispecific-antibody-inhibits-tumour-growth-in-two-syngeneiccolon-carcinoma-models.pdf).

Sin embargo, existe la necesidad de proporcionar nuevos anticuerpos biespecíficos que no solo se unan simultáneamente a PD1 y LAG3 y por tanto seleccionen selectivamente células que expresan tanto PD1 como LAG3, sino que también eviten el bloqueo de LAG3 en otras células dado el amplio patrón de expresión de LAG3. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención no solo bloquean eficazmente PD1 y LAG3 en linfocitos T que sobreexpresan tanto PD1 como LAG3, son muy selectivos para estas células y de este modo se pueden evitar los efectos secundarios administrando anticuerpos para LAG3 altamente activos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y al menos un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3). Estos anticuerpos biespecíficos son ventajosos ya que proporcionan mejor selectividad y, potencialmente, eficacia que las estrategias de combinación anti-PD1 y anti-LAG3. Se caracterizan además porque muestran un efecto de deterioro reducido (como se demuestra por la internalización reducida por linfocitos T), se unen preferentemente a linfocitos T convencionales como a Treg y pueden rescatar las funciones efectoras de linfocitos T de la supresión de Treg, muestran un incremento en funciones efectoras de linfocitos T específicos de tumor y un incremento en la erradicación tumoralin vivo.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), en el que el anticuerpo biespecífico es bivalente y comprende un dominio Fc,

un primer fragmento Fab que comprende dicho primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10,

y un segundo fragmento Fab que comprende el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

En particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4 y en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado o quimérico. En particular, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado.

En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235<a>y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Además, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe anteriormente en el presente documento, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc. En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende botones y la segunda subunidad del dominio Fc comprende ojales de acuerdo con el procedimiento de botones en ojales. En particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada. En particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento Fab en el que en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico, en el que en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).

Más en particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos w de SEQ ID NO: 101.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento anteriormente, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que se fusiona al extremo C del dominio Fc.

En particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento anteriormente. La invención proporciona además un vector, en particular un vector de expresión, que comprende un polinucleótido de la invención y una célula huésped procariota o eucariota que comprende el polinucleótido o el vector de la invención. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula eucariota, en particular una célula de mamífero.

En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden polinucleótidos que codifican dicho anticuerpo biespecífico, b) cultivar la célula huésped de acuerdo con condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo biespecífico y c) recuperar el anticuerpo biespecífico del cultivo. La invención también engloba un anticuerpo biespecífico producido por el procedimiento de la invención.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención también engloba el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso como medicamento.

En un aspecto, se proporciona el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un aspecto específico, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en el tratamiento del cáncer. En otro aspecto específico, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, o la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, para su uso en la modulación de respuestas inmunitarias. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en el tratamiento de una infección vírica crónica.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para uso en inmunoterapia contra el cáncer. En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para uso en inmunoterapia contra el cáncer.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1:ilustración esquemática de los diferentes formatos de los anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos descritos en el presente documento. Lafig. 1Amuestra el formato 1 1 biespecífico, en el que el dominio de unión a PD1 comprende un crossFab (con intercambio de dominio VH/VL) y el dominio de unión a LAG3 comprende dominios CH1 y CK con mutaciones aminoacídicas para soportar el emparejamiento correcto ("variantes cargadas"). La parte Fc comprende las mutaciones de botón en ojal (ilustradas por la flecha negra) y las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G que suprimen casi por completo la unión al receptor de Fcy del dominio Fc de IgG1 humana (ilustrado por el área blanca). Lafig. 1Bmuestra un formato 2+1 con dos dominios Fab de unión anti-LAG3 que comprenden mutaciones en CH1/CK y un dominio Fab de unión a PD1 fusionado en el extremo C de una cadena pesada. Lafig. 1Cmuestra un formato 2+1 similar con dos dominios FAB de unión anti-LAG3 que comprenden mutaciones en CH1/CK, pero un dominio scFab monocatenario de unión a PD1 fusionado en el extremo C de una cadena pesada. En lafig. 1Dse muestra un formato 2+1 con dos dominios Fab de unión anti-LAG3 y un VH y VL de unión a PD1 fusionados cada uno a uno de los extremos C de las cadenas pesadas. Lafig. 1Emuestra una construcción similar a la de la figura 1D, sin embargo con un enlace disulfuro genomanipulado entre VH y VL y enfig. 1Fse muestra una variante con un sitio de furina. Lafig. 1Gmuestra el formato 2+2 biespecífico con dos dominios Fab de unión anti-LAG3 que comprenden mutaciones en CH1/CK y dos dominios crossFab de unión a PD1 fusionados en el extremo C de cada cadena pesada. En lafig. 1Hse muestra un formato 1 1 biespecífico (llamado "trans"), en el que el dominio de unión a PD1 comprende un crossFab (con intercambio de dominio VH/VL) y el dominio de unión a LAG3 se fusiona con su dominio VH en el extremo C de la cadena de ojal de Fc. El dominio Lag3 comprende los dominios CH1 y CK con mutaciones aminoacídicas para soportar el emparejamiento correcto ("variantes cargadas"). Lafig. 1Imuestra un formato trans 2+1, en el que el dominio de unión a PD1 comprende un crossFab (con intercambio de dominio VH/VL) y un dominio de unión a LAG3 que comprende dominios CH1 y CK con mutaciones aminoacídicas para soportar el emparejamiento correcto ("variantes cargadas") y un segundo dominio de unión a LAG3 se fusiona con su dominio VH en el extremo C de la cadena de ojal de Fc.

Figura 2:efecto de anticuerpos aLAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IL-2 por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas. En lafig. 2Ase muestra el efecto de anticuerpos aLAG3 como se describe en el presente documento sobre la secreción de granzima B y enfig. 2Bse muestra el efecto de anticuerpos aLAG3 sobre la secreción de IL-2.

Figura 3:efecto de anticuerpos aLAG3 en combinación con el anticuerpo aPD1 (0376) sobre la liberación de granzima B citotóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblastoide-linfocitos B (ARH77). Se muestra una comparación de diferentes anticuerpos aLAG3 en combinación con anticuerpo aPD1 (0376) y con anticuerpo aPD1 (0376) solo.

Figura 4:efecto de anticuerpos aLAG3 en combinación con el anticuerpo aPD1 (0376) sobre la supresión de Treg de la liberación de granzima B e IFN-<y>por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con PBMC alogénicas irradiadas. Lafig. 4Amuestra la liberación de granzima B en comparación con aPD1 (0376) solo y lafig. 4Bmuestra la liberación de IFN-y en comparación con aPD1 (0376) solo.

Figura 5:unión simultánea y dimerización de receptor provocada por la unión de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos células PD1+Lag3+ recombinantes. Se representa la quimioluminiscencia (medida en UR) frente a la concentración de anticuerpo. Lafig. 5Ayfig. 5Bmuestran una comparación de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos y anticuerpos anti-LAG3 monoespecíficos. Solo los formatos biespecíficos pudieron inducir quimioluminiscencia. Se muestra un experimento de competencia en lafig. 5C. Si se proporcionó el mismo anticuerpo biespecífico en presencia de un anticuerpo aLAG3 (0156, MDX25F7) o un anticuerpo anti-PD1 (0376), la señal casi se inhibió (para la competencia de PD1) o bien se redujo al menos significativamente (Lag3). Se muestra otro experimento de competencia en lafig. 5D. La competencia del anticuerpo anti-PD1/anti-LAG3 biespecífico con el mismo anticuerpo anti-PD1 (0376) y también la proteína LAG3:Fc recombinante (0160) casi suprimió la señal, mientras que la presencia de la misma proteína fijadora aLAG3 (0156) solo dio lugar a una inhibición parcial y otros dos anticuerpos anti-LAG30414 y 0416 no modularon la señal significativamente.

Figura 6:comparación de la unión simultánea de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos en diferentes formatos (1 1 frente a 2+1) y con diferentes proteínas fijadoras aLAG3. Lafig. 6Amuestra la curva de unión para la construcción 0799 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0416) en formato 1 1). La curva de unión para la construcción 8311 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0416) en formato 1+2) se muestra en lafig. 6B.Lafig. 6Cmuestra la curva de unión para la construcción 0927 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 1 1). La curva de unión para la construcción 8310 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 1+2) se muestra en lafig. 6D.

Figura 7:comparación de la unión simultánea de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos en diferentes formatos (2+1 frente a 2+2) y con diferentes proteínas fijadoras aLAG3. Lafig. 7Amuestra la curva de unión para la construcción 8310 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 1+2). La curva de unión para la construcción 8970 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 2+2) se muestra en la fig. 7B. La fig. 7C muestra la curva de unión para la construcción 8311 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0416) en formato 1+2).

La curva de unión para la construcción 8984 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0416) en formato 2+2) se muestra en la fig. 7D. Las curvas de unión para las construcciones 0725 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato trans 1 1) y 0750 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato trans 1+2) se muestran en la fig. 7E en comparación con la curva de unión de la construcción 0927 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 1 1). Estas 3 construcciones también se compararon en el ensayo de indicador combinado PD1/LAG3 disponible comercialmente y las correspondientes curvas de unión se muestran en la fig. 7F.

Figura 8: internalización de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos en diferentes formatos y anticuerpo anti-LAG3 original después de 3 horas de la adición a la administración a linfocitos T activados como se mide con citometría de flujo. La fig. 8A muestra el histograma representativo del experimento, el porcentaje de internalización para los diferentes formatos se muestra en la fig. 8B.

Figura 9: el análisis con el tiempo muestra mayor localización de membrana del formato 1 1 del anticuerpo anti-PD1/anti-LAG3 biespecífico (0927) en comparación con los otros formatos que muestran un mayor grado de internalización. La fig. 9A muestra las imágenes fluorescentes como se detecta por microscopía confocal después de 15 minutos, 1 hora y 3 horas. Las células CD4 activadas se muestran como bolas negras. Las imágenes fluorescentes de un anticuerpo para TIM3 se muestran como ejemplo de una fuerte internalización. Un análisis cuantitativo de las imágenes se muestra en la fig. 9B.

Figura 10: unión a linfocitos T convencionales frente a Treg. Las figs. 10A a 10C muestran datos de un donante representativo que muestra la unión a linfocitos T convencionales (curva negra) y Treg (área gris). La unión de un anticuerpo anti-LAG30414 (hu IgG1 PGLALA) se muestra en la fig. 10A, las fig. 10B y 10C muestran la unión del anticuerpo anti-PD1 0376 y el anticuerpo anti-PD1/anti-LAG3 biespecífico (0927), respectivamente. En la fig. 10D se muestra el Delta de la intensidad media de fluorescencia geométrica de una molécula dada unida en los linfocitos T convencionales frente a la de Treg dentro de la misma muestra. Los resultados (mediana) son de 3 experimentos independientes con 3 donantes diferentes.

Figura 11: el cobloqueo de PD1 y Treg rescata las funciones efectoras de Tconv de la supresión de Treg. Se muestra el porcentaje de supresión por Treg de granzima B secretada por Tconv después de 5 días de cocultivo. Los resultados (mediana) son de 10 experimentos independientes con 10 donantes diferentes. P se calculó usando ANOVA bidireccional.

Figura 12: efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la secreción de granzima B e IFN-y por linfocitos T CD4 de PBMC de pacientes con melanoma después de la recuperación con grupos de péptidos de antígeno de melanoma inmunógeno. La fig. 12 muestra una comparación del efecto sobre la liberación de granzima B e IFN-y provocada por anti-PD1(0376) solo, la combinación de anti-PD1(0376) con aLAG3(0414) y el anticuerpo biespecífico 0927 (anti-PD1(0376)/anti-LAG3(0414) en formato 1+1). Se muestra el incremento en veces de la producción de granzima B e IFNy relativa a linfocitos T CD4 estimulados con grupos de péptidos de 12 PBMC de pacientes con melanoma.

Figura 13: efecto de anticuerpos biespecíficos aPD1/aLAG3 sobre la liberación de granzima B citotóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblatoide-linfocitos B (ARH77). Se comparan diferentes anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos como se describe en el presente documento con anticuerpos usados en el tratamiento de referencia o ensayos clínicos.

Figura 14: estudio de eficacia en ratones humanizados expuestos con adenocarcinoma pancreático, BxPC3. En combinación con CEACAM CD3 TCB, solo el anticuerpo biespecífico aPD1/aLAG3 proporcionó una protección tumoral estadísticamente significativa en comparación con anticuerpos para PD1 convencionales. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral en ratones humanizados expuestos por vía subcutánea con células BxPC3 y tratados con las moléculas indicadas en combinación con CEACAM5-TCB.

Figura 15: las mediciones de volúmenes tumorales (mm3 /- EEM), durante un período de 47 días, se muestran para cada animal individual mostrando la homogeneidad de la respuesta antitumoral de grupo. Las curvas de crecimiento tumoral se muestran para el grupo del vehículo en la fig. 15A, para CEACAM5 CD3 TCB solo (2,5 mg/kg) en la fig. 15B, para la combinación de CEACAM5 CD3 TCB con Nivolumab (1,5 mg/kg) en la fig. 15C, para la combinación de CEACAM5 CD3 TCB con Pembrolizumab (1,5 mg/kg) en la fig. 15D, para la combinación de CEACAM5 CD3 TCB con PD1/LAG3 0927 en la fig. 15E (1,5 mg/kg) y en la fig. 15F (3 mg/kg de anticuerpo biespecífico).

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se usa en general en la técnica a la que la presente invención pertenece. Para los propósitos de interpretación de la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa.

Como se usa en el presente documento, el término"molécula de unión a antígeno"se refiere en su sentido más amplio a una molécula que se une específicamente a un determinante antigénico. Los ejemplos de moléculas de unión a antígeno son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y proteínas de unión a antígeno de armazón.

El término"anticuerpo"en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

El término"anticuerpo monoclonal"como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades escasas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno.

El término anticuerpo"monoespecífico"como se usa en el presente documento indica un anticuerpo que tiene uno o más sitios de unión de los que cada uno se une al mismo epítopo del mismo antígeno. El término"biespecífico"quiere decir que el anticuerpo se puede unir específicamente a al menos dos determinantes antigénicos distintos, por ejemplo, dos sitios de unión formados cada uno por un par de un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo que se unen a diferentes antígenos o a diferentes epítopos en el mismo antígeno. Un anticuerpo biespecífico de este tipo tiene un formato 1 1. Otros formatos de anticuerpo biespecífico son los formatos 2+1 (que comprenden dos sitios de unión para un primer antígeno o epítopo y un sitio de unión para un segundo antígeno o epítopo) o formatos 2+2 (que comprenden dos sitios de unión para un primer antígeno o epítopo y dos sitios para un segundo antígeno o epítopo). Típicamente, un anticuerpo biespecífico comprende dos sitios de unión a antígeno, de los que cada uno es específico para un determinante antigénico diferente.

El término"valente"como se usa dentro de la actual solicitud, indica la presencia de un número específico de dominios de unión en una molécula de unión a antígeno. Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos dominios de unión, cuatro dominios de unión y seis dominios de unión, respectivamente, en una molécula de unión a antígeno. Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son al menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo, "tetravalentes" o "hexavalentes"). En un aspecto particular, los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión y son biespecíficos. Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecíficos incluso en casos donde existen más de dos sitios de unión (es decir, que el anticuerpo es trivalente o multivalente).

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural."Anticuerpos naturales"se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de clase IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio constante de la cadena ligera (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de un anticuerpo se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 5 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o |j (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, y1 (IgG1), y2 (IgG2), y3 (IgG3), y4 (IgG4), a1 (IgA 1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

Un"fragmento de anticuerpo"se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>; diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, fragmentos Fab cruzados; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv); anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudsonet al.,Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate y que tienen un incremento en la semividain vivo,véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos dominios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos, véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 1993/01161; Hudsonet al.,Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollingeret al.,Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al.,Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar de este modo la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa. Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), como se describe en el presente documento.

La digestión con papaína de anticuerpos intactos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab" que contienen cada uno los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, por tanto, el término"fragmento Fab"se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de la cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH son fragmentos Fab' en los que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno (dos fragmentos Fab) y una parte de la región Fc.

El término"fragmento cross-Fab"o "fragmento xFab" o "fragmento Fab de entrecruzamiento" se refiere a un fragmento Fab, en el que las regiones variables o bien las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se intercambian. Son posibles dos composiciones de cadena diferentes de una molécula Fab de entrecruzamiento y están comprendidas en los anticuerpos biespecíficos de la invención: por una parte, las regiones variables de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, es decir, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab(VLVH). Por otra parte, cuando las regiones constantes de la cadena pesada y ligera de Fab se intercambian, la molécula Fab de entrecruzamiento comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula Fab de entrecruzamiento también se denomina CrossFab(CLCH1).

Un "fragmento Fab monocatenario" o"scFab"es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CH1-conector-VL-CL, b) VL-CL-conector-VH-CH1, c) VH-CL-conector-VL-CH1 o d) VL-CH1 -conector-VH-CL; y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente de entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios se estabilizan por medio del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, estas moléculas Fab monocatenarias se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).

Un "fragmento Fab monocatenario de entrecruzamiento" o"x-scFab"es un polipéptido que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de la cadena ligera (CL) de anticuerpo y un conector, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho conector tienen uno de los siguientes órdenes en sentido de N terminal a C terminal: a) VH-CL-conector-VL-CH1 y b) VL-CH1-conector-VH-CL; en el que VH y VL forman juntos un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno y en el que dicho conector es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos. Además, estas moléculas x-scFab se podrían estabilizar además por generación de enlaces disulfuro intercatenarios por medio de la inserción de residuos de cisteína (por ejemplo, la posición 44 en la cadena pesada variable y la posición 100 en la cadena ligera variable de acuerdo con la numeración de Kabat).

Un"fragmento variable monocatenario (scFv)"es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesada (V<h>) y ligera (V<l>) de un anticuerpo, conectada con un péptido conector corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. No, el conector es rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para su solubilidad, y puede conectar el extremo N de V<h>con el extremo C de V<l>, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad del anticuerpo original, a pesar de la retirada de las regiones constantes y la introducción del conector. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston, J.S., Methods in Enzymol.

203 (1991) 46-96). Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, que se pueden ensamblar conjuntamente con un dominio VH a un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar de este modo la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa.

Las"proteínas de unión a antígeno de armazón"son conocidas en la técnica, por ejemplo, la fibronectina y proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPins) se han usado como armazones alternativos para los dominios de unión a antígeno, véase, por ejemplo, Gebauer y Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) y Stumppet al.,Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). En un aspecto de la invención, una proteína de unión a antígeno de armazón se selecciona del grupo que consiste en CTLA-4 (Evibody), lipocalinas (anticalina), una molécula derivada de proteína A tal como el dominio Z de la proteína A (Affibody), un dominio A (Avimer/Maxibody), una transferrina sérica (cuerpotrans);una proteína con repeticiones de anquirina diseñada (DARPin), un dominio variable de la cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único, sdAb), un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo (nanocuerpo, aVH), fragmentos V<nar>, una fibronectina (AdNectin), un dominio de lectina de tipo C (tetranectina); un dominio variable de un nuevo receptor de antígeno beta-lactamasa (fragmentos V<nar>), una gamma-cristalina o ubicuitina (moléculas de Affilin) humanas; un dominio de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, microcuerpos tales como las proteínas de la familia knottin, aptámeros peptídicos y fibronectina (adnectina). CTLA-4 (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4) es un receptor de la familia de<c>D28 expresado principalmente en linfocitos T CD4+. Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig como un dominio variable.

Los bucles correspondientes a CDR de anticuerpos se pueden sustituir con secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas CTLA-4 genomanipuladas para tener diferentes especificidades de unión también son conocidas como Evibodies (por ejemplo, documento US7166697B1). Los Evibodies tienen aproximadamente el mismo tamaño que la región variable aislada de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio). Para detalles adicionales, véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen un estructura secundaria de lámina beta rígida con un número de bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana. Las anticalinas tienen entre 160-180 aminoácidos de tamaño, y se derivan de lipocalinas. Para detalles adicionales, véanse Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), documentos US7250297B1 y US20070224633. Un Affibody es un armazón derivado de la proteína A deStaphylococcus aureusque se puede genomanipular para unirse al antígeno. El dominio consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado colecciones por aleatorización de residuos de superficie. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462 y documento EP 1641818A1. Las Avimer son proteínas multidominio derivadas de la familia del armazón de dominio A. Los dominios naturales de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida a disulfuro definida. La diversidad se genera reordenando la variación natural presentada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales, véanse Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) y Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junio 2007). Una transferrina es una glucoproteína de transporte sérico monomérica. Las transferrinas se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana por inserción de secuencias peptídicas en un bucle de superficie permisivo. Los ejemplos de armazones de transferrina genomanipulados incluyen el Trans-body. Para detalles adicionales, véase J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999). Las proteínas con repeticiones de anquirina diseñadas (DARPin) se derivan de anquirina, que es una familia de proteínas que median en la fijación de proteínas de membrana integrales al citoesqueleto. Una repetición de anquirina individual es un motivo de 33 residuos que consiste en dos hélices alfa y una vuelta beta. Se pueden genomanipular para unirse a diferentes antígenos diana aleatorizando residuos en la primera hélice alfa y una vuelta beta de cada repetición. Su interfase de unión se puede incrementar incrementando el número de modules (un procedimiento de maduración en afinidad). Para detalles adicionales, véanse J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.

Un anticuerpo de dominio único es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Los primeros dominios únicos se derivaron del dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo de camélidos (nanocuerpos o fragmentos V<h>H). Además, el término anticuerpo de dominio único incluye un dominio variable de la cadena pesada humana autónomo (aVH) o fragmentos V<nar>derivados de los tiburones. La fibronectina es un armazón que se puede genomanipular para unirse a un antígeno. La adnectina consiste en una cadena principal de la secuencia de aminoácidos natural del 10.° dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana tipo III (FN3). Se pueden genomanipular tres bucles en un extremo del sándwich beta para permitir que una adnectina reconozca específicamente una diana terapéutica de interés. Para detalles adicionales, véanse Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), documentos US20080139791, WO2005056764 y US6818418B1. Los aptámeros peptídicos son moléculas de reconocimiento combinatorias que consisten en una proteína de armazón constante, típicamente tiorredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable restringido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales, véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005). Los microcuerpos se derivan de microproteínas naturales de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína (los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knottin). Las microproteínas tienen un bucle que se puede genomanipular para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar al pliegue total de la microproteína. Para detalles adicionales de dominios knottin genomanipulados, véase el documento WO2008098796.

Una"molécula de unión a antígeno que se une al mismo epítopo"que una molécula de referencia se refiere a una molécula de unión a antígeno que bloquea la unión de la molécula de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más, y a la inversa, la molécula de referencia bloquea la unión de la molécula de unión a antígeno a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.

Como se usa en el presente documento, el término"dominio de unión a antígeno"o"sitio de unión a antígeno"se refiere a la parte de la molécula de unión a antígeno que se une específicamente a un determinante antigénico. Más en particular, el término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria de parte o la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, una molécula de unión a antígeno solo se puede unir a una parte particular del antígeno, parte que se denomina epítopo. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables (también llamados regiones variables). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno se puede unir a su antígeno y bloquear o bloquear parcialmente su función. Los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 o a LAG3 incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos como se define además en el presente documento. Además, los dominios de unión a antígeno pueden incluir proteínas de unión a antígeno de armazón, por ejemplo, dominios de unión que se basan en proteínas de repetición diseñadas o dominios de repetición diseñados (véase, por ejemplo, documento WO 2002/020565).

Como se usa en el presente documento, el término"determinante antigénico"es sinónimo de "antígeno" y "epítopo" y se refiere a un sitio (por ejemplo, un tramo contiguo de aminoácidos o una configuración conformacional constituida por diferentes regiones de aminoácidos no contiguos) en una macromolécula polipeptídica a la que se une un resto de unión a antígeno, formando un complejo resto de unión a antígeno-antígeno. Los determinantes antigénicos útiles se pueden encontrar, por ejemplo, en las superficies de células tumorales, en las superficies de células infectadas por virus, en las superficies de otras células patológicas, en la superficie de células inmunitarias, libres en suero sanguíneo y/o en la matriz extracelular (MEC). Las proteínas útiles como antígenos en el presente documento pueden ser cualquier forma natural de las proteínas de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. En un modo de realización particular, el antígeno es una proteína humana. Cuando se hace referencia a una proteína específica en el presente documento, el término engloba la proteína no procesada "de longitud completa", así como cualquier forma de la proteína que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de la proteína, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas.

Por"unión específica"se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o inespecíficas. La capacidad de una molécula de unión a antígeno para unirse a un antígeno específico se puede medir a través de un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o bien otras técnicas familiares para un experto en la técnica, por ejemplo, técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizado en un instrumento de BIAcore) (Liljebladet al.,Glyco J 17, 323-329 (2000)), y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de una molécula de unión a antígeno a una proteína no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión de la molécula de unión a antígeno al antígeno como se mide, por ejemplo, por RPS. En determinados modos de realización, una molécula que se une al antígeno tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |<j>M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'7 M o menos, por ejemplo, de 10'7 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M).

"Afinidad"o "afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).

Como se usa en el presente documento, el término"alta afinidad"de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10<-9>M o menos e incluso más en particular 10<-10>M o menos para un antígeno diana. El término"baja afinidad"de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10<-8>o mayor.

Un anticuerpo"madurado en afinidad"se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

El término"un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3""un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a PD1 y LAG3", "molécula de unión a antígeno biespecífica específica para PD1 y LAG3" o un "anticuerpo anti-PD1/anti-LAG3" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un anticuerpo biespecífico que se puede unir a PD1 y LAG3 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar PD1 y LAG3.

El término"PD1", también conocido como proteína de muerte celular programada 1, es una proteína de membrana de tipo I de 288 aminoácidos que se describió por primera vez en 1992 (Ishidaet al.,EMBO J., 11 (1992), 3887 3895). PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 extendida de reguladores de linfocitos T y tiene dos ligandos, PD-L1 (B7-H1, CD274) y PD-L2 (B7-DC, CD273). La estructura de la proteína incluye un dominio IgV extracelular seguido de una región transmembranaria y una cola intracelular. La cola intracelular contiene dos sitios de fosforilación localizados en un motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptor y un motivo de intercambio basado en tirosina inmunorreceptor, lo que sugiere que PD-1 regula negativamente las señales de TCR. Esto es consecuente con la unión de las fosfatasas SHP-1 y SHP-2 a la cola citoplásmica de PD-1 tras la unión del ligando. Aunque PD-1 no se expresa en linfocitos T indiferenciados, se regula por incremento después de la activación mediada por el receptor de linfocitos T (TCR) y se observa tanto en linfocitos T activados como agotados (Agataet al.,Int. Immunology 8 (1996), 765-772). Estos linfocitos T agotados tienen un fenotipo disfuncional y no pueden responder apropiadamente. Aunque PD-1 tiene un patrón de expresión relativamente amplio, es probable que su papel más importante sea como receptor coinhibidor en linfocitos T (Chinaiet al,Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595). Por tanto, los enfoques terapéuticos actuales se centran en bloquear la interacción de PD-1 con sus ligandos para potenciar la respuesta de linfocitos T. Los términos "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "proteína PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-1" se pueden usar de manera intercambiable, e incluyen variantes, isoformas, especies homólogas de PD-1 humana y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia de aminoácidos de PD1 humana se muestra en UniProt (www.uniprot.org), con número de acceso Q15116 (SEQ ID NO:128).

Los términos"anticuerpo anti-PD1"y "un anticuerpo que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a PD1" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a PD1, en especial un polipéptido de PD1 expresado en una superficie celular, con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar PD1. En un aspecto, el grado de unión de un anticuerpo anti-PD1 a una proteína distinta de PD1 no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a PD1 como se mide, por ejemplo, por radioinmunoanálisis (RIA) o citometría de flujo (FACS) o por un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. En determinados aspectos, una proteína de unión a antígeno que se une a PD1 humana tiene un valor de KD de la afinidad de unión por la unión a PD1 humana de < 1 |<j>M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ejemplo, 10<' 8>M o menos, por ejemplo, de 10<' 8>M a 10<' 13>M, por ejemplo, de 10<' 9>M a 10<' 13>M). En un modo de realización preferente, el respectivo valor de K<d>de las afinidades de unión se determina en un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando el dominio extracelular (ECD) de PD1 humana (PD1-ECD) para la afinidad de unión a PD1. El término "anticuerpo anti-PD1" también engloba anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a PD1 y un segundo antígeno.

Los términos"LAG3"o "Lag-3" o "gen de activación de linfocitos 3" o "CD223" como se usa en el presente documento se refieren a cualquier LAG3 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba LAG3 no procesado "de longitud completa" así como cualquier forma de LAG3 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de LAG3, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En un modo de realización preferente, el término "LAG3" se refiere a LAG3 humana. La secuencia de aminoácidos de una LAG3 procesada (sin secuencias señal) ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 73. La secuencia de aminoácidos de una LAG3 de dominio extracelular (ECD) ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 74.

Las expresiones "anticuerpo anti-LAG3" y "un anticuerpo que se une a LAG3" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a LAG3 con una afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a LAG3. En un aspecto, el grado de unión de un anticuerpo anti-LAG3 a una proteína distinta de LAG3 no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a LAG3 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA). En determinados modos de realización, un anticuerpo que se une a LAg 3 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 |<j>M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, de 10-8 M o menos, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por ejemplo, de 10-9 M a 10-13 M). En determinados aspectos, un anticuerpo anti-LAG3 se une a un epítopo de LAG3 que se conserva entre LAG3 de diferentes especies. En un modo de realización preferente, un "anticuerpo anti-LAG3", "un anticuerpo que se une específicamente a LAG3 humana" y "un anticuerpo que se une a LAG3 humana" se refieren a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de LAG3 humana o su dominio extracelular (ECD) con una afinidad de unión de un valor de K<d>de 1,0 x 10-8 mol/l o menor, en un modo de realización de un valor de K<d>de 1,0 x 10-9 mol/l o menor, en un modo de realización de un valor de K<d>de 1,0 x 10-9 mol/l a 1,0 x 10-13 mol/l. En este contexto, la afinidad de unión se determina con un ensayo de unión estándar, tal como la técnica de resonancia de plasmón superficial (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Suecia), por ejemplo, usando el dominio extracelular de LAG3. El término "anticuerpo anti-LAG3" también engloba anticuerpos biespecíficos que se pueden unir a LAG3 y un segundo antígeno.

Un anticuerpo"de bloqueo"o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une. En algunos modos de realización, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos de la invención bloquean la señalización a través de PD-1 y LAG3 para restaurar una respuesta funcional por los linfocitos T (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas, destrucción de células diana) de un estado disfuncional a la estimulación antigénica.

El término"región variable"o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión de la molécula de unión a antígeno al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen en general estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindtet al.,Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk,J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Las CDR ejemplares (c Dr -L1 , CDR-L2, Cd R-l3, CDR-H1, c Dr -H2 y CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se usan en el presente documento de manera intercambiable en referencia a porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabatet al.,U.S. Dept, of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothiaet al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo esté dentro del alcance del término como se define y se usa en el presente documento. Los residuos aminoacídicos apropiados que engloban las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la tabla A como comparación. Los números de residuos exactos que engloba una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA A. Definiciones de CDR1

1 La numeración de todas las definiciones de CDR en la tabla A está de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabatet al.(véase a continuación).

2 "AbM" con una "b" minúscula como se usa en la tabla A se refiere a las CDR como se define por el programa informático de modelado de anticuerpos "AbM" de Oxford Molecular.

Kabatet al.también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabatet al.,U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en una región variable de anticuerpo son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 31-34 de L1 ,50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro y Fransson,Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)). A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos del dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabatet al.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y<f>R4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Una "región estructural humana aceptadora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptadora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptadora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG<1>, IgG<2>, IgG3, IgG4, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y, y |j respectivamente.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, en especial con respecto a la unión a C1q y/o unión a receptor de Fc (FcR).

Un anticuerpo "humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes en general dichas variantes en cantidades escasas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, el procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de anticuerpo que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En particular, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede o no estar presente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas siempre se presentan con la lisina C terminal, sin embargo las variantes sin lisina C terminal se incluyen en la invención.

Una región Fc de IgG comprende un dominio CH2 de IgG y uno CH3 de IgG. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 231 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 340. En un modo de realización, una cadena glucídica se fija al dominio CH2. El dominio CH2 en el presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia natural o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 341 a un residuo aminoacídico aproximadamente en la posición 447 de una IgG). La región CH3 en el presente documento puede ser un dominio CH3 de secuencia natural o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" ("botón") introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" ("ojal") introducida correspondiente en la otra cadena del mismo; véase la patente de EE. UU. n.° 5.821.333). Dichos dominios CH3 variantes se pueden usar para promover la heterodimerización de dos cadenas pesadas de anticuerpo no idénticas como se describe en el presente documento. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD, 1991.

La tecnología de "botón en ojal" se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.731.168; US 7.695.936; Ridgwayet al.,Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un modo de realización específico, una modificación de botón comprende la sustitución aminoacídica T366W en una de las dos subunidades del dominio Fc, y la modificación de ojal comprende las sustituciones aminoacídicas T366S, L368A e Y407V en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. En otro modo de realización específico, la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de botón adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica S354C, y la subunidad del dominio Fc que comprende la modificación de ojal adicionalmente comprende la sustitución aminoacídica Y349C. La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades de la región Fc, estabilizando por tanto además el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

Una "región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir variantes alélicas naturales de la región Fc de una inmunoglobulina así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar en las funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, se pueden delecionar uno o más aminoácidos del extremo N o extremo C de la región Fc de una inmunoglobulina sin pérdida sustancial de la función biológica. Dichas variantes se pueden seleccionar de acuerdo con reglas generales conocidas en la técnica para tener un efecto mínimo sobre la actividad (véase, por ejemplo, Bowie, J. U.et al.,Science 247:1306-10 (1990)).

El término "funciones efectoras" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por el complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

Un"receptor de Fc activador"es un receptor de Fc que después del acoplamiento por una región Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula que porta el receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores incluyen FcyRMIa (CDl6a), F<cy>RI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89). Un receptor de Fc activador particular es FcyRMIa humano (véase n.° de acceso de UniProt P08637, versión 141).

El término "conectar peptídico" se refiere a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, típicamente de aproximadamente 2 a 20 aminoácidos. Los conectores peptídicos son conocidos en la técnica o se describen en el presente documento. De forma adecuada, los péptidos conectores no inmunógenos son, por ejemplo, conectores peptídicos (G4S)n, (SG4)n o G4(SG4)n, en los que "n" es en general un número entre 1 y 10, típicamente entre 1 y 4, en particular 2, es decir, los péptidos seleccionados del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO:129) GGGGSGGGGS<(SEQ ID NO: 130),>SGGGGSGGGG<(SEQ ID NO: 131) y>GGGGSGGGGSGGGG<(SEQ ID NO:132), pero también incluyen las secuencias>GSPGSSSSGS<(SEQ ID NO:133), (G4S)3 (SEQ ID NO:134), (G4S)4 (SEQ ID NO:135),>GSGSGSGS<(SEQ ID NO:136),>GSGSGNGS<(SEQ ID NO:137),>GGSGSGSG<(SEQ ID NO:138),>GGSGSG<(SEQ ID NO:139),>GGSG<(SEQ ID NO:140),>GGSGNGSG<(SEQ ID NO:141),>GGNGSGSG<(SEQ ID NO: 142) y>GGNGSG<(SEQ ID NO: 143). Los conectores peptídicos de particular interés son (G4S) (SEQ ID NO:129), (G4S)2 o>GGGGSGGGGS<(SEQ ID NO:130), (G4S)3 (SEQ ID NO:134) y (G4S)4 (SEQ ID NO:135), más en particular (G4S)2 o>GGGGSGGGGS<(SEQ ID NO:130).>

Por "fusionado a" o "conectado a" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno y un dominio FC) se enlazan por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.

El término "aminoácido" como se usa dentro de la presente solicitud indica el grupo de carboxi-a-aminoácidos naturales que comprende alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V).

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica (proteica) de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible tal como el programa informático BLAs T, BlAs T-2, ALIGN, sAw I o Megalign (DnAs TAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado%de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

En determinados aspectos, se contemplanvariantes de secuencia de aminoácidosde los anticuerpos biespecíficos de la invención proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los anticuerpos biespecíficos. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos biespecíficos introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica las moléculas o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y regiones estructurales (FR). Se proporcionan sustituciones conservadoras en la tabla B bajo el encabezado "sustituciones preferentes" y se describen además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos (1) a (6). Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en la molécula de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad, o mejora en ADCC o C<d>C.

TABLA B

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

El término "variantes de secuencia de aminoácidos" incluye variantes sustanciales en las que existen sustituciones aminoacídicas en uno o más residuos de la región hipervariable de una molécula de unión a antígeno original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento en afinidad, reducción en inmunogenicidad) con relación a la molécula de unión a antígeno original y/o tendrán determinadas propiedades biológicas sustancialmente conservadas de la molécula de unión a antígeno original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, uno o más residuos de HVR se mutan y las moléculas de unión a antígeno variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). En determinados modos de realización, se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad de la molécula de unión a antígeno para unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden preparar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en HVR. Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se pueden seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989)Science,244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-molécula de unión a antígeno para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpos biespecíficos con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula incluyen la fusión al extremo N o C a un polipéptido lo que incrementa la semivida en suero del anticuerpo biespecífico.

En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento se alteran para incrementar o disminuir el grado al que se glucosila el anticuerpo. Las variantes de glucosilación de las moléculas se pueden obtener convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación, por ejemplo, se pueden alterar los carbohidratos fijados al dominio Fc. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al. TIBTECH15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en los anticuerpos biespecíficos de la invención para crear variantes con una mejora en determinadas propiedades. En un aspecto, se proporcionan variantes de anticuerpos biespecíficos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función de ADCC, véase por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 (Presta, L.) o el documento US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Otras variantes de los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen aquellas con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc se biseca por GlcNAc. Dichas variantes pueden tener una recucción en la fucosilación o una mejora en la función ADCC, véase, por ejemplo, el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umanaet al.);y el documento US 2005/0123546 (Umanaet al.).También se proporcionan variantes con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.);WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En determinados aspectos, puede ser deseable crearvariantes genomanipuladas con cisteínade los anticuerpos biespecíficos de la invención, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de la molécula se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles de la molécula. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado. En determinados modos de realización, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar moléculas de unión a antígeno genomanipuladas con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

En determinados aspectos, los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento se pueden modificar además para contener restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones incluyendo, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, ya sea si el derivado de anticuerpo biespecífico se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro aspecto, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

El término "poMnucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a uno cualquiera o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterógenas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de a Rnin vivooin vitrode la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.

Por un ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, un 95 % "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos un 95 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede delecionar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta un 5 % de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como cuestión práctica, se puede determinar convencionalmente si cualquier secuencia polinucleotídica particular es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos de la presente invención usando programas informáticos conocidos, tales como los analizados anteriormente para polipéptidos (por ejemplo, ALIGN-2).

El término "casete de expresión" se refiere a un polinudeótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados modos de realización, el casete de expresión de la invención comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

El término "vector" o "vector de expresión" es sinónimo de "construcción de expresión" y se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula diana. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está en el interior de la célula diana, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención o fragmentos de las mismas.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pasos. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención. En particular, la célula huésped es una célula huésped procariota o eucariota. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombras solo unas pocas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta cultivada o tejido animal o vegetal cultivado.

Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.

El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "excipiente farmacéuticamente aceptable"se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un excipiente farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un estabilizante o un conservante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo al que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan las moléculas de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades proliferativas, tales como linfomas, leucemias linfocíticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón bronquioloalveolar, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de partes blandas, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores de la médula espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma hipofisario y sarcoma de Ewing, incluyendo las versiones resistentes al tratamiento de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Anticuerpos biespecíficos

En el presente documento se divulgan anticuerpos biespecíficos novedosos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), con propiedades en particular ventajosas tales como producibilidad, estabilidad, afinidad de unión, actividad biológica, selección específica de determinados linfocitos T, eficacia de selección y reducción en la toxicidad.

En determinados aspectos, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que muestra una reducción en la internalización tras la unión a la superficie del linfocito T. La internalización representa un deterioro importante para la molécula que se puede degradar en unas pocas horas mientras los receptores seleccionados se reexpresan rápidamente en la superficie celular listos para inhibir la señalización de TCR. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que se une preferentemente a linfocitos T convencionales en lugar de a T reg. Esto es ventajoso porque seleccionar LAG-3 en Treg con anticuerpos de bloqueo podría ser perjudicial al incrementar su función supresora y finalmente enmascarar el efecto de bloqueo positivo en otros linfocitos T. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 y que puede rescatar funciones efectoras de linfocitos T de la supresión de Treg. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, que puede inducir la secreción de granzima B por linfocitos T CD4, cuando se cocultiva con la línea celular tumoral ARH77 como se muestra en el ensayo proporcionado en el presente documento. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que muestra un incremento en las funciones efectoras de linfocitos T específicos de tumor y/o potencia el efecto citotóxico de linfocitos T. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que muestra un incremento en la erradicación tumoralin vivo.

A. Anticuerpos biespecíficos ejemplares que se unen a PD1 y LAG3

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que dicho primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4;

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4 y en el que el dominio Fc tiene una función efectora reducida o incluso suprimida. En particular, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4 y en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 comprende

(a) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; o

(b) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; o

(c) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35; o

(d) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43; o

(e) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende

(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o

(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o

(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o

(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o

(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

(a) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:80,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:83,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85; o

(b) un dominio VH que comprende

(i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88,

(ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:89, y

(iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91,

(ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92, y

(iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:93.

En un aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende

(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, o

(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o

(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, o

(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, o

(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, o

(e) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 comprende un dominio VH que comprende

(a) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, o

(b) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o

(c) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, o

(d) un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.

En un aspecto particular, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que

el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10,

y el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

Aún en otro aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

Aún en otro aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a<l>AG3 es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En particular, es un anticuerpo humanizado o quimérico.

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 es bivalente. Esto quiere decir que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 (formato 1 1).

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3. En un aspecto particular, en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada. En un aspecto particular, en el primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

En un aspecto particular, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 97, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:99, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 100, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:101, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 102, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 104, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 103, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:105, o

(d) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 106, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 107, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 103, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:105.

Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, o

(d) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.

Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que se fusiona al extremo C del dominio Fc. En particular, el fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 se fusiona al extremo C del dominio Fc por medio de su dominio VH (formato trans 1 1).

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 144, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 101. Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:101.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 y un tercer fragmento Fab que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3. En un aspecto particular, el fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 se fusiona a por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas.

En este aspecto, el anticuerpo biespecífico es trivalente con unión bivalente a LAG3 y unión monovalente a PD1. Esto quiere decir que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y dos dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a LAG3 (formato 2+1).

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 118, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 119, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:101, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 120, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115,

una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 121, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:99, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 122, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95%de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 103, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:105.

Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 y un tercer fragmento Fab que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que uno de los fragmentos Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 se fusiona por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas (formato trans 2+1).

En un aspecto particular, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 145, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 101. Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 145, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 101.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 y un Fab monocatenario (scFab) que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1. En particular, el scFab que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 se fusiona por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas.

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 123, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 119, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 101, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 124, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95%de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 121, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:99, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 125, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 103, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:105.

Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende

(a) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, o

(b) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 124, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, o

(c) una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 y un dominio VH y VL que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1. En particular, el dominio VH del dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 se fusiona por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas y el dominio VL del dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 se fusiona por medio de un conector peptídico al extremo C de la otra de las cadenas pesadas.

En un aspecto particular, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 126, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 127, y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 109. Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 y dos cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109.

En otro aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc, un primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, un tercer fragmento Fab que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, y un cuarto fragmento Fab que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1.

En este aspecto, el anticuerpo biespecífico es tetravalente con unión bivalente a LAG3 y unión bivalente a PD1. Esto quiere decir que el anticuerpo biespecífico comprende dos dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 y dos dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a LAG3 (formato 2+2).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende

(a) dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas de un anticuerpo que comprende dos fragmentos Fab que comprenden los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a LAG3, y

(b) dos fragmentos Fab adicionales que comprenden los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1, en el que dichos fragmentos Fab adicionales se conectan cada uno por medio de un conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de (a).

En un aspecto particular, el conector peptídico es (G4S)4. En otro aspecto, los dos fragmentos Fab adicionales que comprenden los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 son fragmentos Fab de entrecruzamiento en los que los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí y las cadenas VL-CH se conectan cada una por medio de un conector peptídico al extremo C de las cadenas pesadas de (a).

En un aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que los dos fragmentos Fab que comprenden cada uno un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 se fusionan cada uno por medio de un conector peptídico al extremo C de una de las cadenas pesadas, respectivamente.

(a) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 114, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 101, o

(b) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 116, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 99, o

(c) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 117, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 105.

Más en particular, el anticuerpo biespecífico comprende

(a) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, o

(b) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, o

(c) dos cadenas pesadas que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, dos primeras cadenas ligeras que comprenden cada una una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115, y dos segundas cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:105.

Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión a receptor de Fc y/o función efectora

En determinados aspectos, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que comprende una o más modificaciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy, y reducen o suprimen la función efectora.

En determinados aspectos, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

La siguiente sección describe aspectos preferentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden modificaciones de dominio Fc que reducen la unión a receptor de Fc y/o función efectora. En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. En particular, el dominio Fc es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

El dominio Fc confiere propiedades farmacocinéticas favorables a los anticuerpos biespecíficos de la invención, incluyendo una semivida en suero larga lo que contribuye a una acumulación buena en el tejido diana y una proporción de distribución en tejido-sangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a que los anticuerpos biespecíficos de la invención se dirijan a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células que portan antígenos preferentes. En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc de los anticuerpos biespecíficos presenta una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG natural, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4. Más en particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1.

En un aspecto de este tipo, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un aspecto, el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce la función efectora. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc inhibidor. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de F<cy>humano inhibidor, más específicamente FcyRi IB humano. En un aspecto, la función efectora es una o más de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un aspecto particular, la función efectora es ADCC. En un aspecto, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de Fc neonatal (FcRn), en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión por un dominio Fc de IgG1 natural (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc de IgG1 natural) por FcRn.

En un aspecto particular, el dominio Fc se genomanipula para tener una reducción en la afinidad de unión por un receptor de Fc y/o reducción en la función efectora, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o función efectora. Típicamente, las mismas una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En otro aspecto, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces. En un aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con los anticuerpos biespecíficos de la invención que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un aspecto particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En otros aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un aspecto, el receptor de Fc es un receptor de Fc inhibidor. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de F<cy>humano inhibidor, más específicamente F<cy>RIIB humano. En algunos aspectos, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un aspecto específico, el receptor de Fc es un receptor de F<cy>humano activador, más específicamente FcYRIIIa, F<cy>RI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos aspectos, también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un aspecto, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). La unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc para dicho receptor, se logra cuando el dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o la molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, el dominio Fc de la molécula de unión a antígeno biespecífica se genomanipula para tener una reducción en la función efectora en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, uno o más de los siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación reducida de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos, unión reducida a linfocitos NK, unión reducida a macrófagos, unión reducida a monocitos, unión reducida a células polimorfonucleares, señalización directa que induce apoptosis reducida, maduración de células dendríticas reducida o sensibilización de linfocitos T reducida.

Los anticuerpos con una función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. U<u>. n.° 7.332.581). Se describen determinadas variantes de anticuerpo con una mejora o disminución en la unión a FcR. (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312, y Shields, R.L.et al.,J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición de E233, L234, L235, N297, P331 y P329. En algunos aspectos, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A ("LALÁ'). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un aspecto, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un aspecto más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular, P329G. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G ("P329G LALA"). La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas suprime casi por completo la unión al receptor de Fcy de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la solicitud de patente PCT n.° WO 2012/130831 A1. Dicho documento también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como la unión al receptor de Fc o funciones efectoras. dicho anticuerpo es una IgG1 con las mutaciones L234A y L235A o con las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabatet al,Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende (todas las posiciones de acuerdo con el índice EU de Kabat) (i) una región Fc homodimérica de la subclase IgG1 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, L234A y L235A, o (ii) una región Fc homodimérica de la subclase IgG4 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, S228P y L235E, o (iii) una región Fc homodimérica de la subclase IgG1 humana opcionalmente con las mutaciones P329G, L234A, L235A, 1253A, H310A y H435A, u opcionalmente con la mutaciones P329G, L234A, L235A, H310A, H433A e Y436A, o (iv) una región Fc heterodimérica en la que un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido c de la región Fc incluye las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C, o (v) una región Fc heterodimérica de la subclase IgG1 humana en la que ambos polipéptidos de la región Fc comprenden las mutaciones P329G, L234A y L235A y un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C.

En un aspecto, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende las sustituciones aminoacídicas L235E y S228P y P329G. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fabin vivode los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauchet al.,Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). Por tanto, en un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico, que comprende (todas las posiciones de acuerdo con el índice EU de Kabat) una región Fc heterodimérica de la subclase IgG4 humana en la que ambos polipéptidos de la región Fc comprenden las mutaciones P329G, S228P y L235E y un polipéptido de la región Fc comprende la mutación T366W, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W e Y349C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V y S354C, o en la que un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366W y S354C, y el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C.

Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión a receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L.,et al.,J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K.,et al.,J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826). Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. Un ensayo de unión de este tipo adecuado se describe en el presente documento. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYlIIa. La función efectora de un dominio Fc, o anticuerpos biespecíficos de la invención que comprenden un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Un ensayo adecuado para medir la ADCC se describe en el presente documento. Otros ejemplos de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrometal.,Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrometal.,Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemannet al.,J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radiactivo a Ct I™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar la actividad de ADCC de la molécula de interésin vivo,por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clyneset al.,Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

La siguiente sección describe aspectos preferentes de los anticuerpos biespecíficos que comprenden modificaciones de dominio Fc que reducen la unión a receptor de Fc y/o función efectora. En un aspecto, se proporciona el biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del anticuerpo a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy. En otro aspecto, se proporciona el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la función efectora. En particular, el dominio Fc es de la subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Modificaciones en el dom inio Fc que promueven la heterodimerización

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento comprenden diferentes dominios de unión a antígeno, fusionados a una o a la otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto las dos subunidades del dominio Fc pueden estar comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza de los anticuerpos biespecíficos en la producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.

En consecuencia, en aspectos particulares se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de la interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana está en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un aspecto, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.

En un aspecto específico, dicha modificación es una modificación llamada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Por tanto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende botones y la segunda subunidad del dominio Fc comprende ojales de acuerdo con el procedimiento de botones en ojales. En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en el documento US 5.731.168; el documento US 7.695.936; Ridgwayet al.,Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una correspondiente cavidad ("ojal") en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).

En consecuencia, en un aspecto, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas, un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando, de este modo, una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede situar en una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando, de este modo, una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad en el que se puede situar la protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad. La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica. En un aspecto específico, en el dominio c H3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 407 por un residuo de valina (Y407V). En un aspecto, en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 por un residuo de serina (T366S) y se reemplaza el residuo de leucina en la posición 368 por un residuo de alanina (L368A).

Aún en otro aspecto, en la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C), y en la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza adicionalmente el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C). La introducción de estos dos residuos de cisteína da lugar a la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando además el dímero (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). En un aspecto particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración EU) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Pero también se pueden usar otras tecnologías de botón en ojal como se describe por el documento EP 1870459 A1 forma alternativa o adicionalmente. En un aspecto, el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" y adicionalmente las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3, de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones s 354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones Y349C y T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y adicionalmente las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena de botones" y las mutaciones D399K y E357K en el CH3 dominio de la "cadena de ojales" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados, de modo que la formación de un homodímero se vuelva electrostáticamente desfavorable, pero la heterodimerización electrostáticamente favorable.

Además de la "tecnología de botón en ojal", otras técnicas para modificar los dominios CH3 de las cadenas pesadas de un anticuerpo multiespecífico para forzar la heterodimerización son conocidas en la técnica. Estas tecnologías, en especial las descritas en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 and WO 2013/096291 se contemplan en el presente documento como alternativas a la "tecnología de botón en ojal" en combinación con un anticuerpo biespecífico.

En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico se usa el enfoque descrito en el documento EP 1870459 para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase entre los dominios CH3/CH3 entre tanto la primera como la segunda cadena pesada.

En consecuencia, en este aspecto en la estructura terciaria del anticuerpo multiespecífico el dominio CH3 de la primera cadena pesada y el dominio CH3 de la segunda cadena pesada forman una interfase que se localiza entre los respectivos dominios CH3 del anticuerpo, en los que las respectivas secuencias de aminoácidos del dominio CH3 de la primera cadena pesada y la secuencia de aminoácidos del dominio CH3 de la segunda cadena pesada comprenden cada uno un conjunto de aminoácidos que se localiza dentro de dicha interfase en la estructura terciaria del anticuerpo, en los que del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de una cadena pesada, un primer aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado positivamente y del conjunto de aminoácidos que se localiza en la interfase en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, un segundo aminoácido se sustituye por un aminoácido cargado negativamente. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con este aspecto también se denomina en el presente documento "anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-)" (en el que la abreviatura "+/-" representa los aminoácidos con carga opuesta que se introdujeron en los respectivos dominios CH3).

En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado CH3 (+/-) el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K, R y H, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado CH3 (+/-) el aminoácido cargado positivamente se selecciona de K y R, y el aminoácido cargado negativamente se selecciona de E o D.

En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) el aminoácido cargado positivamente es K, y el aminoácido cargado negativamente es E.

En un aspecto, en el anticuerpo biespecífico con CH3 genomanipulado (+/-) en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido R en la posición 409 se sustituye por D y el aminoácido K en la posición se sustituye por E, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por K y el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2013/157953 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat). En otro modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por K y el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por K, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Adicionalmente, al menos una de las siguientes sustituciones está comprendida en el dominio CH3 de la otra cadena pesada: el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por E, el aminoácido Y en la posición 349 se sustituye por D y el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el aminoácido L en la posición 368 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2012/058768 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada se sustituye al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 411 (originalmente T), 399 (originalmente D), 400 (originalmente S), 405 (originalmente F), 390 (originalmente N) y 392 (originalmente K) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Las sustituciones preferentes son:

- sustitución del aminoácido T en la posición 411 por un aminoácido seleccionado de N, R, Q, K, D, E y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),

- sustitución del aminoácido D en la posición 399 por un aminoácido seleccionado de R, W, Y y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),

- sustitución del aminoácido S en la posición 400 por un aminoácido seleccionado de E, D, R y K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat),

- sustitución del aminoácido F en la posición 405 por un aminoácido seleccionado de I, M, T, S, V y W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat);

- sustitución del aminoácido N en la posición 390 por un aminoácido seleccionado de R, K y D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y

- sustitución del aminoácido K en la posición 392 por un aminoácido seleccionado de V, M, R, L, F y E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico se genomanipula de acuerdo con el documento WO 2012/058768), es decir, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido L en la posición 351 se sustituye por Y y el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por V y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización del anticuerpo multiespecífico, en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por A y el aminoácido K en la posición 409 se sustituye por F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En el último modo de realización mencionado anteriormente, en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido K en la posición 392 se sustituye por E, el aminoácido T en la posición 411 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 399 se sustituye por R y el aminoácido S en la posición 400 se sustituye por R (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2011/143545 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un aspecto, las modificaciones aminoacídicas en los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas se introducen en las posiciones 368 y/o 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2011/090762 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo biespecífico. El documento WO 2011/090762 se refiere a modificaciones aminoacídicas de acuerdo con la tecnología "botón en ojal" (KiH). En un modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por W, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por A (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat). En otro modo de realización, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido T en la posición 366 se sustituye por Y, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido Y en la posición 407 se sustituye por T (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2009/089004 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo biespecífico. En un modo de realización en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K o N en la posición 392 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D), y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada el aminoácido D en la posición 399, el aminoácido E o D en la posición 356 o el aminoácido E en la posición 357 se sustituye por un aminoácido cargado positivamente (en un modo de realización K o R, en un modo de realización preferente por K, en un modo de realización preferente, los aminoácidos en las posiciones 399 o 356 se sustituyen por K) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, además de las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K o R en la posición 409 se sustituye por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Incluso en otro aspecto, además de o de forma alternativa a las sustituciones mencionadas anteriormente, en el dominio CH3 de una cadena pesada el aminoácido K en la posición 439 y/o el aminoácido K en la posición 370 se sustituye independientemente entre sí por un aminoácido cargado negativamente (en un modo de realización por E o D, en un modo de realización preferente por D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el enfoque descrito en el documento WO 2007/147901 se usa para apoyar la heterodimerización de la primera cadena pesada y la segunda cadena pesada del anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización en el dominio CH3 de una cadena pesada, el aminoácido K en la posición 253 se sustituye por E, el aminoácido D en la posición 282 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 322 se sustituye por D, y en el dominio CH3 de la otra cadena pesada, el aminoácido D en la posición 239 se sustituye por K, el aminoácido E en la posición 240 se sustituye por K y el aminoácido K en la posición 292 se sustituye por D (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

El extremo C de la cadena pesada del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento puede ser un extremo C completo que termine con los residuos de aminoácido PGK. El extremo C de la cadena pesada puede ser un extremo C acortado en el que se han retirado uno o dos de los residuos aminoacídicos C terminales. En un aspecto preferente, el extremo C de la cadena pesada es un extremo C acortado que termina en PG.

En un aspecto de todos los aspectos como se informa en el presente documento, un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 C terminal como se especifica en el presente documento, comprende el dipéptido glicina-lisina C terminal (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, un anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada que incluye un dominio CH3 C terminal, como se especifica en el presente documento, comprende un residuo de glicina C terminal (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

Modificaciones en los dom inios fab

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a LAG3, en el que en uno de los fragmentos Fab se intercambian los dominios variables VH y VL o bien los dominios constantes CH1 y CL. Los anticuerpos biespecíficos se preparan de acuerdo con la tecnología Crossmab.

Los anticuerpos multiespecíficos con un reemplazo/intercambio de dominio en un brazo de unión (CrossMabVH-VL o CrossMabCH-CL) se describen en detalle en los documentos WO2009/080252, WO2009/080253 y Schaefer, W.et al,PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Reducen claramente los subproductos provocados por el emparejamiento erróneo de una cadena ligera frente a un primer antígeno con la cadena pesada equivocada frente al segundo antígeno (en comparación con enfoques sin dicho intercambio de dominio).

En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a LAG3, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada. En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

En otro aspecto, y para mejorar además el emparejamiento correcto, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a LAG3, puede contener diferentes sustituciones aminoacídicas cargadas (llamadas "residuos cargados"). Estas modificaciones se introducen en los dominios CH1 y CL cruzados o no cruzados. Dichas modificaciones se describen, por ejemplo, en los documentos WO2015/150447, WO2016/020309 y PCT/EP2016/073408.

En un aspecto particular, se proporciona anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a LAG3, en el que en uno de los fragmentos Fab en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice Eu de Kabat). En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con índice EU de Kabat).

En un aspecto particular, se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer fragmento Fab que se une específicamente a PD1 y un segundo fragmento Fab que se une específicamente a LAG3, en el que en uno de los dominios CL el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido por lisina (K) y en el que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido por ácido glutámico (E). En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico es uno, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a<l>AG3 el aminoácido en la posición 123 (numeración EU) se ha reemplazado por arginina (R) y el aminoácido en la posición 124 (numeración EU) se ha sustituido por lisina (K) y en el que en uno de los dominios CH1 los aminoácidos en la posición 147 (numeración EU) y en la posición 213 (numeración EU) se han sustituido por ácido glutámico (E).

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente que comprende

a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno, y

b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.

El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas.

En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y dentro de la cadena pesada el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo.

En un aspecto, (i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente, o (ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 (numeración de acuerdo con Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) se sustituye por un aminoácido cargado negativamente.

En otro aspecto, (i) en el dominio constante CL de la primera cadena ligera en a) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada en a) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), o (ii) en el dominio constante CL de la segunda cadena ligera en b) el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con Kabat) (en un modo de realización preferente independientemente por lisina (K) o arginina (R)), y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena pesada en b) el aminoácido en la posición 147 o el aminoácido en la posición 213 se sustituye independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada, el aminoácido en la posición 123 se sustituye por R y el aminoácido de la posición 124 se sustituye por K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CL de la primera cadena ligera los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CL de la primera cadena ligera el aminoácido en la posición 123 se sustituye por R y el aminoácido en la posición 124 se sustituye por K, y en el dominio constante CH1 de la primera cadena pesada los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen ambos por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, en el dominio constante CL de la segunda cadena pesada los aminoácidos en la posición 124 y 123 se sustituyen por K, y en el que en el dominio constante CH1 de la segunda cadena ligera los aminoácidos en la posición 147 y 213 se sustituyen por E, y en el dominio variable VL de la primera cadena ligera el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, en el dominio variable VH de la primera cadena pesada el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E, en el dominio variable VL de la segunda cadena pesada el aminoácido en la posición 38 se sustituye por K, y en el dominio variable VH de la segunda cadena ligera el aminoácido en la posición 39 se sustituye por E (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo bivalente que comprende

b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí, y en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.

El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas. En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio variable de la cadena ligera VL se reemplaza por el dominio variable de la cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo; y dentro de la cadena pesada, el dominio variable de la cadena pesada VH se reemplaza por el dominio variable de la cadena ligera VL de dicho anticuerpo, y el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.

b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se unen específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se reemplazan entre sí.

El anticuerpo en a) no contiene una modificación como se informa en b) y la cadena pesada y la cadena ligera en a) son cadenas aisladas. En el anticuerpo en b) dentro de la cadena ligera el dominio constante de la cadena ligera CL se reemplaza por el dominio constante de la cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo; y dentro de la cadena pesada el dominio constante de la cadena pesada CH1 se reemplaza por el dominio constante de la cadena ligera CL de dicho anticuerpo.

Polinucleótidos

Se proporcionan además polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo.

El término "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprende un polímero de nucleótidos. Cada nucleótido se compone de una base, específicamente una base de purina o pirimidina (es decir, citosina (C), guanina (G), adenina (A), timina (T) o uracilo (U)), un glúcido (es decir, desoxirribosa o ribosa) y un grupo fosfato. A menudo, la molécula de ácido nucleico se describe por la secuencia de bases, con lo que dichas bases representan la estructura primaria (estructura lineal) de una molécula de ácido nucleico. La secuencia de bases se representa típicamente de 5' a 3'. En el presente documento, el término molécula de ácido nucleico engloba ácido desoxirribonucleico (ADN) que incluye, por ejemplo, ADN complementario (ADNc) y ADN genómico, ácido ribonucleico (ARN), en particular ARN mensajero (ARNm), formas sintéticas de ADN o ARN y polímeros mixtos que comprenden dos o más de estas moléculas. La molécula de ácido nucleico puede ser lineal o circular. Además, el término molécula de ácido nucleico incluye tanto hebras sentido como antisentido, así como formas monocatenarias y bicatenarias. Además, la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento puede contener nucleótidos naturales o no naturales. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen bases nucleotídicas modificadas con glúcidos derivatizados o enlaces de cadena principal de fosfato o residuos modificados químicamente. Las moléculas de ácido nucleico también engloban moléculas de ADN y ARN que son adecuadas como vector para la expresión directa de un anticuerpo de la invenciónin vitroy/oin vivo,por ejemplo, en un huésped o paciente. Dichos vectores de ADN (por ejemplo, ADNc) o ARN (por ejemplo, ARNm) pueden ser no modificados o modificados. Por ejemplo, el ARNm se puede modificar químicamente para potenciar la estabilidad del vector de ARN y/o la expresión de la molécula codificada de modo que el ARNm se pueda inyectar en un sujeto para generar el anticuerpoin vivo(véase, por ejemplo, Stadleret al.,Nature Medicine 2017, publicado en línea el 12 de junio de 2017, do: 10.1038/nm.4356 o el documento EP 2101 823 B1).

Un polinucleótido "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un polinucleótido aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

Los polinucleótidos aislados que codifican anticuerpos biespecíficos como se divulga en el presente documento se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica la molécula de unión a antígeno completa o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se coexpresan. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se coexpresan se pueden asociar a través de, por ejemplo, enlaces disulfuro u otros medios para formar una molécula de unión a antígeno funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de una inmunoglobulina se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Cuando se coexpresan, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar la inmunoglobulina.

En algunos aspectos, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido comprendido en el anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento.

En un aspecto, se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada<1>(PD1) y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), en el que dicho primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 comprende un dominio VH que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3; y un dominio VL que comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:<6>.

B. Procedimientos recombinantes

Los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. Para estos procedimientos se proporcionan uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo.

En el caso de un anticuerpo natural o fragmento de anticuerpo natural, se requieren dos ácidos nucleicos, uno para la cadena ligera o un fragmento de la misma y otro para la cadena pesada o un fragmento de la misma. Dicho(s) ácido(s) nucleico(s) codifica(n) una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, la(s) cadena(s) ligera(s) y/o pesada(s) del anticuerpo). Estos ácidos nucleicos pueden estar en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión. En el caso de determinados anticuerpos biespecíficos con cadenas pesadas heterodiméricas, se requieren cuatro ácidos nucleicos: uno para la primera cadena ligera, uno para la primera cadena pesada que comprende el primer polipéptido de la región Fc heteromonomérica, uno para la segunda cadena ligera y uno para la segunda cadena pesada que comprende el segundo polipéptido de la región Fc heteromonomérica. Los cuatro ácidos nucleicos pueden estar comprendidos en una o más moléculas de ácido nucleico o vectores de expresión. Dicho(s) ácido(s) nucleico(s) codifica(n) una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VH que incluye la primera región Fc heteromonomérica y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VL y/o una secuencia de aminoácidos secuencia que comprende el segundo VH que incluye la segunda región Fc heteromonomérica del anticuerpo (por ejemplo, la primera y/o la segunda cadenas ligeras y/o la primera y/o la segunda cadenas pesadas del anticuerpo). Estos ácidos nucleicos pueden estar en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión, normalmente estos ácidos nucleicos están localizados en dos o tres vectores de expresión, es decir, un vector puede comprender más de uno de estos ácidos nucleicos. Los ejemplos de estos anticuerpos biespecíficos son CrossMab y biespecíficos de linfocitos T (véase, por ejemplo, Schaefer, W.et al,PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Por ejemplo, una de las cadenas pesadas heteromonoméricas comprende las denominadas "mutaciones de botón" (T366w y opcionalmente una de S354C o Y349C) y la otra comprende las denominadas "mutaciones de ojal" (T366S, L368A e Y407V y opcionalmente Y349C o S354C) (véase, por ejemplo, Carter, P.et al.,Immunotechnol. 2 (1996) 73).

En un aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH de los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a PD1 y LAG3, respectivamente (por ejemplo, en las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). En otro aspecto, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico.

En otro aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En un aspecto de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (<1>) un primer vector que comprende un primer par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, comprendiendo uno de ellos el primer VL y comprendiendo el otro el primer VH del anticuerpo y un segundo vector que comprende un segundo par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos comprendiendo uno de ellos el segundo VL y comprendiendo el otro el segundo VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un primer ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende uno de los dominios variables (preferentemente un dominio variable de la cadena ligera), un segundo vector que comprende un par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, comprendiendo uno de ellos un dominio variable de la cadena ligera y comprendiendo el otro el primer dominio variable de la cadena pesada, y un tercer vector que comprende un par de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, comprendiendo uno de ellos el otro dominio variable de la cadena ligera respectivo como en el segundo vector y comprendiendo el otro el segundo dominio variable de la cadena pesada, o (3) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VL del anticuerpo, un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el primer VH del anticuerpo, un tercer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VL del anticuerpo, y un cuarto vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el segundo VH del anticuerpo. En un aspecto, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un aspecto, se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo biespecífico, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD<1>y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, el ácido nucleico que codifica los anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos, que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli.)Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gemgross, T.U., Nat. Biotech.

22 (2004) 1409-1414; y Li, H.et al.,Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (c OS-7); línea de riñón embrionario humano (células HEK 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L.et al.,J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en in Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P.et al.,Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR- (Urlaub, G.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0,<n>S0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, Nj (2004), pp. 255-268.

C. Ensayos

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a<l>AG3 proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de afinidad

La afinidad de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo proporcionados en el presente documento para los correspondientes antígenos se puede determinar de acuerdo con los procedimientos expuestos en los ejemplos por resonancia de plasmón superficial (SPR), usando instrumentación estándar tal como un instrumento Biacore® (GE Healthcare) y receptores o proteínas diana tales como las que se pueden obtener por expresión recombinante. Un modo de realización específico ilustrativo y ejemplar para medir la afinidad de unión se describe en los ejemplos 2,<8>u 11. De acuerdo con un aspecto, se mide Kd por resonancia de plasmón superficial usando una máquina BIACORE® T100 (GE Healthcare) a 25 °C.

2. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, se someten a prueba los anticuerpos biespecíficos para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc. Se puede evaluar la unión de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento al correspondiente antígeno recombinante o a células que expresan antígenos por ELISA como se describe en los ejemplos 8 u 11.

En otro aspecto, se usan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recién obtenidas en ensayos de unión para mostrar la unión a diferentes células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tales como monocitos, linfocitos NK y linfocitos T.

En otro aspecto, se usó un ensayo de dimerización celular para demostrar la dimerización o, por último, la unión/interacción de dos receptores diferentes PD1 y LAG3, que se fusionan citosólicamente con dos fragmentos de una enzima, tras la ligación o reticulación con un anticuerpo biespecífico contra ambas dianas. Por esto, únicamente un receptor solo no muestra actividad enzimática. Para esta interacción específica, los extremos C terminales citosólicos de ambos receptores se fusionaron individualmente a subunidades heterólogas de una enzima indicadora. Una única subunidad enzimática sola no mostró actividad indicadora. Sin embargo, se esperaba que la unión simultánea a ambos receptores diera lugar a la acumulación citocólica local de ambos receptores, la complementación de las dos subunidades enzimáticas heterólogas y, finalmente, diera como resultado la formación de una enzima específica y funcional que hidroliza un sustrato generando de este modo una señal quimioluminiscente (ejemplo<11>).

Ensayos de actividad

En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que tiene actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, la capacidad para potenciar la activación y/o proliferación de diferentes células inmunitarias, en especial linfocitos T, secreción de citocinas inmunomoduladoras tales como IFN<y>o TNF-alfa, bloquear la vía PD1, bloquear la vía LAG3, destrucción de células tumorales. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológicain vivoy/oin vitro.

En determinados aspectos, se somete a prueba un anticuerpo para determinar dicha actividad biológica. En un aspecto, se proporciona un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) a linfocitos de otro individuo (donante Y). La reacción de linfocitos mixtos (MLR) puede demostrar el efecto de bloquear la vía PD1 en células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y su secreción de IFN-gamma en presencia o ausencia de anticuerpos biespecíficos de la invención. El ensayo se describe con más detalle en el ejemplo 9.

Inmunoconjugados

Se divulgan inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo biespecífico conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas) o isótopos radiactivos.

Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

En determinados aspectos, cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 proporcionados en el presente documento puede ser útil para detectar la presencia de tanto PD1 como LAG3 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados aspectos, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como células madre cancerosas de LMA.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo biespecífico para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de tanto PD1 como LAG3 en una muestra biológica. En determinados aspectos, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo biespecífico como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo biespecífico a tanto PD1 como LAG3, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo biespecífico y ambos antígenos. Dicho procedimiento puede ser un procedimientoin vitrooin vivo.En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se usa para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al anticuerpo frente a LAG3, por ejemplo, cuando PD1 y LAG3 son biomarcadores para la selección de pacientes.

En determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-<6>-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos o radicales libres estables.

Composiciones farmacéuticas, formulaciones y vías de administración

En otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un aspecto, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos biespecíficos proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos biespecíficos disueltos o dispersos en un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable"' se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo biespecífico y opcionalmente un ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990. En particular, las composiciones son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, sales, estabilizantes y combinaciones de los mismos, como será conocido para un experto en la técnica.

Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para la inyección, los anticuerpos biespecíficos se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los anticuerpos biespecíficos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua sin pirógenos estéril, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando las proteínas de fusión de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsión inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado a vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente<10>residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (<p>E<g>). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales, tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

Se describen formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

Además de las composiciones descritas previamente, los anticuerpos biespecíficos también se pueden formular como preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como sal escasamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se puedan usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que retienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.

La composición en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

Las formulaciones que se van a usar para la administraciónin vivoson en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Composiciones y procedimientos terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 proporcionados en el presente documento se pueden usar en procedimientos terapéuticos.

Para su uso en procedimientos terapéuticos, los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se define en el presente documento anteriormente se pueden formular, dosificar y administrar de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los médicos.

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se define en el presente documento para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se define en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en particular para su uso en el tratamiento del cáncer. En determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En determinados aspectos, se proporcionan anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico. En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto, la enfermedad que se va a tratar es una enfermedad infecciosa, en particular una infección vírica crónica como VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), VHB (virus de la hepatitis B), VHC (hepatitis C), HSV1 (virus del herpes simple tipo 1), CMV (citomegalovirus), LCMV (virus de la cromomeningitis linfocitaria) o VEB (virus de Epstein-Barr). El sujeto, paciente o "individuo" que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.

En determinados aspectos, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo, en particular cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 incluyen, pero no se limitan a, neoplasias localizadas en el abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pélvico, piel, tejido blando, bazo, región torácica y sistema urogenital. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados aspectos, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello. En otros aspectos, el cáncer se elige de carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de hodgkiniano y no hodgkiniano), blastoma, sarcoma y leucemia. En otro aspecto, el cáncer que se va a tratar se selecciona entre cáncer de células escamosas, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma pulmonar no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar de células escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.

En otro aspecto, la enfermedad que se va a tratar es una enfermedad infecciosa, en particular una infección vírica crónica. El término "infección vírica crónica" se refiere a un sujeto afectado o infectado con un virus crónico. Los ejemplos de infecciones víricas crónicas son virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección vírica por hepatitis B (VHB), infección vírica por hepatitis C (VHC), virus del herpes simple 1 (VHS1), citomegalovirus (CMV), virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o virus de Epstein Barr (VEB).

Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos la molécula biespecífica puede no proporcionar una cura, sino que solo puede proporcionar un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad del anticuerpo biespecífico que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz".

Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de proteína de fusión, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo biespecífico se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o simultáneas, la anamnesis del paciente y la respuesta a la proteína de fusión, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

El anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se define en el presente documento se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo,<0 ,1>mg/kg -<10>mg/kg) del anticuerpo biespecífico puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo biespecífico estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente<1000>mg/kg de peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 jg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. El progreso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a lAG3 como se define en el presente documento se usarán en general en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir una enfermedad, los anticuerpos biespecíficos de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está bien dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.

Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayosin vitro,tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye la CI<50>como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.

También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datosin vivo,por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.

La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del anticuerpo biespecífico que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.

En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del anticuerpo biespecífico puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Una dosis terapéuticamente eficaz de los anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y eficacia terapéutica de una proteína de fusión se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivo celular o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios en animales para determinar la DL<50>(la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE<50>(la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL<50>/DE<50>. Los anticuerpos biespecíficos que presentan grandes índices terapéuticos son preferentes. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico como se divulga en el presente documento presenta un alto índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuado para su uso en seres humanos. La dosificación se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la afección del paciente (véase, por ejemplo, Finglet al.,1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, p. 1).

El médico especialista para pacientes tratados con anticuerpos biespecíficos como se divulga en el presente documento sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración, y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual.

Otros agentes y tratamientos

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento anteriormente se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en tratamiento. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente que se puede administrar para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de forma adversa entre sí. En determinados aspectos, un agente terapéutico adicional es otro agente antineoplásico.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo biespecífico es para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para uso en inmunoterapia contra el cáncer.

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo biespecífico es para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un anticuerpo biespecífico anti-CD3 activador de linfocitos T, en particular un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 activador de linfocitos T que comprende un segundo dominio de unión a antígeno que comprende (a) una región variable de la cadena pesada (V<h>CEA) que comprende la secuencia CDR-H1 de S<e>Q ID NO: 154, secuencia CDR-H2 de SEQ ID NO: 155 y secuencia CDR-H3 de SEQ ID NO: 156, y/o una región variable de la cadena ligera (V<l>CEA) que comprende la secuencia CDR-L1 de SEQ ID NO: 157, secuencia CDR-L2 de SEQ ID NO: 158 y secuencia CDR-L3 de SEQ ID NO: 159, o (b) una región variable de la cadena pesada (V<h>CEA) que comprende la secuencia CDR-H1 de SEQ ID NO: 162, secuencia CDR-H2 de SEQ ID NO: 163 y secuencia CDR-H3 de SEQ ID NO: 164, y/o una región variable de la cadena ligera (V<l>CEA) que comprende la secuencia CDR-L1 de SEQ ID NO: 165, secuencia CDR-L2 de SEQ ID NO: 166 y secuencia<c>D<r>-L3 de SEQ ID NO: 167. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 es un anticuerpo biespecífico anti-CD3 activador de linfocitos T que comprende una región variable de la cadena pesada (V<H>CEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y/o una región variable de la cadena ligera (V<l>CEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161 o un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una región variable de la cadena pesada (V<h>CEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y/o una región variable de la cadena ligera (V<l>CEA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:<1 69>.

En otro aspecto, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un dominio Fc que comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc y/o función efectora. En particular, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un dominio Fc de IgG1 que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G.

En un aspecto particular, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 146, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 147, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 148, y un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 149. En otro modo de realización particular, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 146, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 147, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 148 y una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 149 (CEA CD3 TCB).

En otro aspecto particular, el anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 comprende un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 150, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 151, un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 152, y un polipéptido que es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntico a la secuencia de SEQ ID NO: 153. En otro modo de realización particular, el anticuerpo biespecífico comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 150, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 151, una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 152 y una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 153 (CEACAM5 CD3 TCB).

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se describe en el presente documento, y un anticuerpo biespecífico anti-CD3 activador de linfocitos T, en particular un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3. En un aspecto particular, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento combinado, secuencial o simultáneo de una enfermedad, en particular para el tratamiento del cáncer. Más en particular, la composición es para su uso en el tratamiento de tumores sólidos.

Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito destinado. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Los anticuerpos biespecíficos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma o en composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo biespecífico se puede producir antes de, simultáneamente y/o después de, la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional.

Artículos de fabricación

En otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es, por sí misma o combinada con otra composición, eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que es perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 como se define en el presente documento anteriormente.

La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende el anticuerpo biespecífico de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro modo. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular.

De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Tabla C (secuencias):

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos generales

La información general con respecto a las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas se da en: Kabat, E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpos se numeran y denominan de acuerdo con los sistemas de numeración de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como se define anteriormente.

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular ADN como se describe en Sambrooket al.,Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica

Se prepararon segmentos génicos deseados a partir de oligonucleótidos preparados por síntesis química. Los segmentos génicos de 600 - 1800 pb de longitud, que se flanquearon por sitios de escisión de endonucleasas de restricción singulares, se ensamblaron por hibridación y unión de oligonucleótidos incluyendo amplificación por PCR y posteriormente se clonaron por medio de los sitios de restricción indicados, por ejemplo, KpnI/SacI o AscI/PacI en un vector de clonación pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Se confirmaron las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados por secuenciación de ADN. Se ordenaron fragmentos de síntesis génica de acuerdo con las especificaciones dadas en Geneart (Ratisbona, Alemania).

Determinación de la secuencia de ADN

Se determinaron secuencias de ADN por secuenciación bicatenaria realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).

Análisis de secuencia de ADN y proteínas y gestión de datos de secuencia

Se usó el paquete de programa informático de GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10.2 y el paquete Vector NT1 Advance, versión 8.0 de Infomax para la creación, cartografía, análisis, anotación e ilustración de secuencias.

Vectores de expresión

Para la expresión de los anticuerpos descritos, se aplicaron variantes de plásmidos de expresión para células de expresión transitoria (por ejemplo, en HEK293) en base a una organización de ADNc con o sin un promotor de cMV-intrón A o bien en una organización genómica con un promotor de CMV.

Además del casete de expresión de anticuerpo los vectores contenían:

un origen de replicación que permite la replicación de este plásmido enE. coli,y

un gen de 13-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo se compuso de los siguientes elementos:

sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 5',

el potenciador y promotor tempranos inmediatos de citomegalovirus humano,

seguido de la secuencia de intrón A en el caso de la organización de ADNc,

una región no traducida en 5' de un gen de anticuerpo humano,

una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina,

la cadena de anticuerpo humano (natural o con intercambio de dominios) como ADNc o bien como organización genómica con la organización exón-intrón de inmunoglobulina,

una región no traducida en 3' con una secuencia señal de poliadenilación, y

sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 3'.

Los genes de fusión que comprenden las cadenas de anticuerpo como se describe a continuación se generaron por PCR y/o síntesis génica y se ensamblaron por procedimientos y técnicas recombinantes conocidos por conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, usando sitios de restricción únicos en los respectivos vectores. Se verificaron las secuencias de ácido nucleico subclonadas por secuenciación de ADN. Para transfecciones transitorias se prepararon cantidades más grandes de los plásmidos por preparación de plásmidos a partir de cultivos deE. co litransformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cu ltivo celular

Se usaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Se expresaron anticuerpos multiespecíficos por cotransfección transitoria de los plásmidos de expresión respectivos en HEK293-EBNA de crecimiento adherente o en células HEK29-F que crecen en suspensión como se describe a continuación.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293

Se generaron todos los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos por transfección transitoria de células 293F usando el sistema Freestyle (ThermoFisher). Aquí, se cultivaron células 293F en medio F17, se transfectaron con 293Free (Novagene) y se alimentaron después de 4 horas con VPA 4 mM y Feed 7 y glucosa al 0,6 % después de 16 h. Además, se usó el kit del sistema de expresión Expi293F™ (ThermoFisher). Aquí, se cultivaron células Expi293F™ en medio de expresión Expi293™ y se transfectaron usando el kit de transfección ExpiFectamine™ 293 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la mejora en la estabilidad y pureza y reducción en la tendencia a agregación de los anticuerpos biespecíficosCrossMAbVh-VLcon pares de aminoácidos cargados introducidos adicionalmente en la interfase CH1/CL (véanse las posiciones en las respectivas secuencias para más detalle), no se han empleado ajustes de proporción de plásmidos. Por lo tanto, se usó la proporción de plásmido relativa de 1:1:1:1 para 1 1 CrossMab o 1:1:1 para 2+2 CrossMab para la cotransfección de plásmidos LC, HC, LC cruzado y HC cruzado. Se recogieron sobrenadantes celulares después de 7 días y se purificaron por procedimientos estándar.

Determinación de proteínas

Se determinó la concentración de proteínas de anticuerpos purificados y derivados determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con Pace,et al.,Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.

Determinación de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes

Se estimó la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular por inmunoprecipitación con microesferas de proteína A agarosa (Roche). Se lavaron 60 |jl de microesferas de proteína A agarosa tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1 %). Posteriormente, se aplicaron 1 -15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las microesferas de proteína A agarosa preequilibradas en TBS-NP40. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las microesferas en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato 2x (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato de Na 100 mM, pH 5,0. Se eluyó el anticuerpo unido por adición de 35 |jl de tampón de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen). Se combinó la mitad de la muestra con el agente reductor de muestras NuPAGE® o se dejó sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 min a 70 °C. En consecuencia, se aplicaron 5-30 j l a un 4-12 % de NuPAGE® Bis-Tris Sd S-PAGE (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo de tampón de migración NuPAGE® Antioxidant (Invitrogen) para SDS-PAGE reducido) y se tiñó con azul de Coomassie.

Se midió la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular cuantitativamente por cromatografía HPLC de afinidad. En resumen, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a proteína A a una columna Poros A/20 de Applied Biosystems en KH<2>PO<4>200 mM, citrato de sodio 100 mM, pH 7,4 y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5, en un sistema Agilent HPLC 1100. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió como patrón.

De forma alternativa, se midió la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular por ELISA de tipo sándwich de IgG. En resumen, se recubren placas de microvaloración de 96 pocillos StreptaWell High Bind Streptavidin A (Roche) con 100 |jl/pocillo de molécula de captura anti-IgG humana biotinilada F(ab')2<h-FcY> BI (Dianova) a 0,1 jg/m l durante 1 hora a temperatura ambiente o de forma alternativa durante la noche a 4 °C y posteriormente se lava tres veces con 200 jl/pocillo de PBS, Tween al 0,05 % (PBST, Sigma). Se añadieron 100 jl/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de los respectivos sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos a los pocillos y se incubó durante 1-2 horas en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con 200 jl/pocillo PBST y se detectó el anticuerpo unido con 100 j l de F(ab')2<hFcY>POD (Dianova) a 0,1 jg/m l como anticuerpo de detección durante 1-2 horas en un agitador de microplacas de valoración a temperatura ambiente. Se retiró por lavado el anticuerpo de detección no unido tres veces con 200 jl/pocillo de PBST y se detectó el anticuerpo de detección unido por adición de 100 j l de ABTS/pocillo. Se realizó la determinación de la absorbancia en un espectrómetro Fluor Tecan a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia 492 nm).

Purificación de proteínas

Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados en referencia a protocolos estándar. En resumen, se aplicaron anticuerpos a una columna Sepharose de proteína A (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. Se logró la elución de anticuerpos a pH 2,8, seguido de neutralización inmediata de la muestra. Se separó la proteína agregada de los anticuerpos monoméricos por cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200; GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se combinaron las fracciones de anticuerpos monoméricos, se concentraron (si se requirió) usando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), se congelaron y se almacenaron a -20 °C o -80 °C. Parte de las muestras se proporcionaron para posterior análisis de proteínas y caracterización analítica, por ejemplo, por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o espectrometría de masas.

SDS-PAGE

Se usó el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En particular, se usaron geles NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast al 10%o al 4-12%(pH 6,4) y un tampón de migración NuPAGE® MES (geles reducidos, con aditivo de tampón de migración antioxidante NuPAGE®) o MOPS (geles no reducidos).

Cromatografía de exclusión por tamaño analítica

Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para la determinación de la agregación y del estado oligomérico de los anticuerpos por cromatografía HPLC. En resumen, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A a una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH<2>PO<4>/K<2>HPO<4>50 mM, pH 7,5 en un sistema Agilent HPLC 1100 o a una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2 x PBS en un sistema Dionex HPLC. Se cuantificó la proteína eluida por absorbancia UV e integración de áreas de picos. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 sirvió como patrón.

Espectrometría de masas

Esta sección describe la caracterización de los anticuerpos multiespecíficos con intercambio de VH/VL (CrossMab VH/VL), con hincapié en su correcto ensamblaje. Se analizaron las estructuras primarias esperadas por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-EM) de los CrossMab intactos desglucosilados y CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o de forma alternativa desglucosilados/digeridos con LysC limitada.

Se desglucosilaron los CrossMab VH/VL con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Se realizaron las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) con 100 jg de CrossMab VH/VL desglucosilados en un tampón Tris pH 8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, se desalaron las muestras por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Se determinó la masa total por medio de ESI-EM en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).

Determinación de la unión y afinidad de unión de anticuerpos multiespecíficos a los respectivos antígenos usando resonancia de plasmón superficial (RPS) (BIACORE)

La unión de los anticuerpos generados a los respectivos antígenos se investiga por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Se usa el respectivo programa informático de evaluación de Biacore para el análisis de sensogramas y para el cálculo de datos de afinidad.

Ejemplo 1

Generación de anticuerpos anti-PD-1

Inmunización de ratones

Se inmunizaron genéticamente ratones NMRI, usando un vector de expresión de plásmido que codifica PD-1 humana de longitud completa por aplicación intradérmica de 100 ug de ADN de vector (plasmid15300_hPD1-fl), seguido de electroporación (2 pulsos cuadrados de 1000 V/cm, duración 0,1 ms, intervalo 0,125 s; seguido de 4 pulsos cuadrados de 287,5 V/cm, duración 10 ms, intervalo 0,125 s. Los ratones recibieron cada uno 6 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 42, 56, 70 y 84. Se extrajo sangre los días 36, 78 y 92 y se preparó suero, que se usó para la determinación de valores por ELISA (véase a continuación). Se seleccionaron los animales con los mayores valores para el refuerzo el día 96, por inyección intravenosa de 50 ug de quimera de Fc humana frente a PD1 humana recombinante, y se aislaron los anticuerpos monoclonales por tecnología de hibridoma, por fusión de esplenocitos a la línea celular de mieloma 3 días después del refuerzo.

Determinación de valores séricos (ELISA)

Se inmovilizó la quimera de Fc humana frente a PD1 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 0,3 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con croteína C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones seriadas de antisueros, por duplicado, en croteína C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con anticuerpo anti-IgG murina de cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Para todas las etapas, se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C. Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 |jl/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 jl/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.

Ejemplo 2

Caracterización de anticuerpos anti-PD1/ Unión de anticuerpos anti-PD1 a PD1 humana

ELISA para huPD1

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 |jl/pocillo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-PD1 humano; Roche/anti-PD1 de ratón; Biolegend; cat.:329912) y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JlR109-036-088)/anti-PoD murino de cabra (GE Healthcare; NA9310) en dilución 1:2000/1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° de catálogo 11835033001) y se incubó hasta una DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE<50>[ng/ml] en la tablas 1 y 2 de sumario a continuación.

ELISA celular para PD1

Se sembró la línea celular CHO-K1 adherida transfectada de forma estable con el plásmido 15311_hPD1-fl_pUC_Neo que codifica PD1 humana de longitud completa y la selección con G418 (marcador de resistencia a la neomicina en el plásmido) a una concentración de 0,01x10E6 células/pocillo en placas de fondo plano de 384 pocillos y se cultivó durante la noche.

Al día siguiente, se añadieron 25 |jl/podMo de muestra de PD1 o anticuerpo de referencia anti-PD1 humano (Roche)/anti-PD1 de ratón (Biolegend; cat.:329912) y se incubó durante 2 h a 4 °C (para evitar la intemalización). Después del lavado cuidadosamente (1x90 jl/pocillo de PBST), se fijaron las células añadiendo 30 jl/pocillo de glutaraldehído al 0,05 % (Sigma, n.° cat.: G5882, 25 %) diluido en tampón IxPBS y se incubó durante 10 min a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario para la detección: anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088)/anti-POD murino de oveja (GE NA9310) seguido de 1 h de incubación a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 |jl/pocillo de PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de solución de sustrato TMB (Roche 11835033001) y se incubó hasta DO 1,0 - 2,0. Se midieron las placas a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores de "CE<50>CHO-PD1" [ng/ml] en la tabla 2 a continuación.

ELISA para PD1 de macaco cangrejero (cyno)

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de cynoPD1-ECD-biotina biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o de anticuerpos de referencia (anti-PD1 humano; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CE<50>[ng/ml] en la tabla 1 y 2 de sumario a continuación.

Ensayo de reemplazo del ligando 1 de PD

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-PD1 de ratón; Biolegend; cat.:329912) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L1 (quimera de Fc B7-H1/PD-L1 humano recombinante; 156-B7, R&D) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109-036-088) en una dilución 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CI<50>[ng/ml] en la tabla 1 de sumario a continuación.

Ensayo de reemplazo del ligando 2 de PD

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-ECD-AviHis biotinilado y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 o anticuerpos de referencia (anti-huPD1 de ratón; Roche) y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de PD-L2 (quimera de Fc B7-DC/PD-L2 humano recombinante; 1224-PL-100, R&D) y se incubó 1 h a T<a>en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, 109-036-088) en una dilución 1:2000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (tetrametilbencidina) (Roche, n.° 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA como valores de CI50 [ng/ml] en la tabla 1 de sumario a continuación.

Ensayo de competencia de unión/ELISA para cartografía de epítopos

Se recubrieron placas Nunc maxisorp (Nunc n.° 464718) con 25 jl/pocillo de anticuerpo de captura (anti-IgG murina de cabra; JIR; 115-006-071) y se incubó durante 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloquearon las placas durante 1 h con tampón PBS que contenía BSA al 2 % a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras anti-PD1 de ratón y se incubó 1 h a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se bloqueó el anticuerpo de captura con 30 jl/pocillo de IgG de ratón (JIR; 015-000-003) durante 1 h a TA en un agitador. Al mismo tiempo, se preincubó PD1-ECD-AviHis biotinilado con un segundo anticuerpo de muestra de durante 1 hora a TA en un agitador. Después del lavado de la placa de ensayo (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se transfirió la mezcla de anticuerpos frente a PD1 a la placa de ensayo y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 |jl/podMo con tampón PBST) se añadieron 25 |jl/podMo de estreptavidina POD (Roche, n.° l1089153001) en una dilución 1:4000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11089153001) y se incubó hasta DO 1,5 - 2,5. La medición tuvo lugar a 370/492 nm. Se definieron grupos de epítopos por agrupamiento jerárquico frente a anticuerpos de referencia.

Tabla 1: unión, inhibición de PD-L1 y grupos de regiones de epítopos de anticuerpos ejemplares (ELISA)

Tabla 2: unión bioquímica y celular de anticuerpos frente a PD1 humanizados derivados del anticuerpo de ratón original PD1-0103 (ELISA)

Caracterización con Biacore de los anticuerpos anti-PD-1 humanizados

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre varias proteínas fijadoras de PD1 murinas así como referencias de unión a PD1 humana. Por lo tanto, se inmovilizó un anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.

Se acoplaron aproximadamente 2000 unidades de respuesta (UR) de 20 |jg/ml de anti-IgG humana (GE Healthcare n.° b R-1008-39) sobre las cubetas de lectura 1 y 2 (alternativamente: 3 y 4) de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare.

La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.

Se inyectaron las muestras durante 20 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron a la segunda cubeta de lectura. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1 humana-ECD (144 nM, 48 nM, 16 nM, 5,33 nM, 1,78 nM, 0,59 nM, 0,20 nM y 0 nM) sobre cada muestra durante 120 s seguido de un tiempo de disociación de 30/300 s y dos etapas de regeneración de 20 s con MgCh 3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración.

Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore T200. Los valores de K<d>, ka y kd resultantes se muestran en la tabla 3. Tabla 3: constantes de velocidad cinética y constantes de equilibrio para AB PD1-0103 quimérico y anti-PD1 humanizado determinadas por Biacore

Como se muestra en la tabla 3, todas las versiones humanizadas de PD1-0103 quimérico (generación, véase el ejemplo 6) presentan propiedades cinéticas similares al anticuerpo original (PD1-0103 quimérico).

Cinética

Se montó un sensor CM5 serie S en el sistema Biacore 4000 y se trataron hidrodinámicamente los puntos de detección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se inmovilizó el anticuerpo IgG de conejo policlonal <IgGFCYM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a 10000 ur en los puntos de detección 1 y 5 en las cubetas de lectura 1, 2, 3 y 4. Se realizó el acoplamiento por medio de química de EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los puntos restantes en las cubetas de lectura sirvieron como referencia. El tampón de muestra fue el tampón del sistema complementado con 1 mg/ml de carboximetildextrano.

En un modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 25 °C. En otro modo de realización, se llevó a cabo el ensayo a 37 °C. Se capturaron 50 nM de cada anticuerpo monoclonal murino en la superficie del sensor por una inyección de 1 min a 10 |jl/min. Posteriormente, se inyectaron los respectivos antígenos en una serie de concentraciones de 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4 nM, 1 nM y tampón del sistema 0 nM a 30 jl/m in durante 4 min de tiempo de fase de asociación. Se siguió la disociación durante otros 4 min. Se regeneró el sistema de captura usando una inyección de 3 min de glicina 10 mM pH 1,5 a 30 |jl/min. Se calcularon los datos cinéticos pertinentes usando el programa informático de evaluación Biacore de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cartografía de epítopos

Se montó un instrumento Biacore 4000 con un sensor CAP de Biacore y se preparó como se recomendó por el fabricante. El tampón del instrumento fue HBS-ET (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,005 % p/v). El instrumento funcionaba a 25 °C.

Se diluyeron todas las muestras en tampón del sistema. Se capturó un antígeno biotinilado de 35 kDa PD1-ECD-AviHis a 200 UR en la superficie del sensor CAP por una inyección de 1 min a 30 jl/m in en las cubetas de lectura 1,2, 3 y 4 en los puntos 1 y 5. Los puntos 2, 3 y 4 sirvieron como referencia. En otro modo de realización, se capturó un antígeno biotinilado de 35 kDa PD1-ECD-AviHis a 200 UR en el sensor CAP de la misma manera. Posteriormente, se inyectó un anticuerpo primario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/m in seguido de la inyección de un anticuerpo secundario a 100 nM durante 3 min a 30 jl/min. Se inyectó el anticuerpo primario hasta que la saturación total de la superficie presentó antígeno. Al final de las fases de inyección de anticuerpo primario y secundario, se fijaron los puntos de informe "unión tardía" (BL) para seguir la respuesta de unión de los respectivos anticuerpos. Se calculó la proporción molar, un cociente entre la respuesta de unión a anticuerpo secundario "BL2" y la respuesta de anticuerpo primario "BL1". Se usó la proporción molar como indicador de la accesibilidad a antígeno del anticuerpo secundario, cuando el antígeno ya estaba complejado por el anticuerpo primario.

Se retiraron por completo los complejos de la superficie del sensor por una inyección durante 2 min a 30 jl/m in de tampón de regeneración de guanidina-HCl 2 M NaOH 250 mM como se recomienda por el fabricante, seguido de una inyección de 1 min a 30 jl/m in de tampón de sistema.

Ejemplo 3

Efecto de diferentes anticuerpos anti-PD-1 sobre la producción de citocinas en una reacción de linfocitos m ixtos (MLR)

3A) La reacción de linfocitos mixtos (MLR) es un ensayo de células inmunitarias que mide la activación de linfocitos de un individuo (donante X) con respecto a linfocitos de otro individuo (donante Y). Se usó una reacción de linfocitos mixtos para demostrar el efecto de bloquear la vía de PD1 sobre células efectoras linfocíticas. Se sometieron a prueba linfocitos T en el ensayo para determinar la activación y la secreción de IFNy en presencia o ausencia de un mAb anti-PD1.

Para realizar una MLR alogénica, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos cuatro donantes sanos de tipo HLA desconocido por centrifugación por gradiente de densidad utilizando Leukosep (Greiner Bio One, 227 288). En resumen, se diluyeron muestras de sangre heparinizada con tres volúmenes de PBS y se colocaron en capa alícuotas de 25 ml de la sangre diluida en tubos Leukosep de 50 ml. Después de la centrifugación a 800 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin rotura), se recogieron las fracciones que contenían linfocitos, se lavaron en PBS y se usaron directamente en un ensayo funcional o se resuspendieron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FCS al 90 %) a 1,0E+07 células/ml y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se prepararon reacciones MLR de 2 vías individuales mezclando PBMC de dos donantes diferentes en una proporción 1:1 de células estimuladoras/respondedoras y se realizaron cocultivos al menos por duplicado en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 6 días a 37 °C, CO<2>al 5 %, en presencia o sin un intervalo de concentraciones diferentes de anticuerpos monoclonales anti-PD1 purificados PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102,<p>D1-0103. Como anticuerpos anti-PD1 de referencia, se sintetizaron anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) o bien pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). No se usó ningún anticuerpo ni anticuerpo de control de isotipo como control negativo y se usó IL-2 hu rec (20 UE/ml) como control positivo. Después del día 6, se tomaron 100 |jl de medio de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma usando el kit de ELISA OptEIA (BD Biosciences).

Los resultados se muestran en la tabla 4 (secreción/liberación de IFN<y>). Los anticuerpos monoclonales anti-PD1 promovieron la activación de linfocitos T y la secreción de IFN<y>de manera dependiente de la concentración. Se calculó el valor del % de incremento de secreción de IFNy en relación con la producción de IFNy de MLR sin adición de ningún mAb de bloqueo (valor de IFN<y>inducido por estimulación alogénica basal como E-c) y MLR con adición de 20 UE/ml rhuIL-2 (control positivo = valor de IFNg de un 100 % como E+c) y se calculó de acuerdo con la fórmula: Estimulación rel. [%] = ((Ejemplo - E-c)/(E+c - E-c)*100

Tabla 4: porcentaje de secreción de IFN gamma después de estimulación alogénica y tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 en comparación con el efecto del tratamiento con IL-2 humana recombinante (20 UE/ml) (= incremento de un 100 %) como control positivo

Varios anticuerpos de bloqueo de PD1 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103 demostraron una fuerte actividad inmunomoduladora potenciando la secreción de interferón gamma (IFNy) (datos no mostrados para todos los anticuerpos).

3B) En otro experimento, se evaluó PD1-0103 quimérico (isotipo IgG1 humano con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). El bloqueo de PD1 con PD1-0103 quimérico potencia fuertemente la secreción de IFN-gamma por linfocitos T humanos primarios estimulados alogénicos. PD1-0103 quimérico fue más potente que los anticuerpos anti-PD1 de referencia. Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).

3C) En experimentos adicionales, se evaluó la actividad inmunomoduladora de las variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD-1 PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, en las figuras 2 y 3, véase también el ejemplo 9 a continuación) a) la liberación (secreción) de IFNy b) la liberación (secreción) de TNF-alfa en MLR como se describe anteriormente. Se comparó el efecto del anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas con los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)). Después de 6 días de cultivo de RLM, se tomaron 50 |jl de sobrenadante y se midieron múltiples citocinas en un único cultivo usando el ensayo Th1/Th2 de citocinas humanas Bio-Plex Pro™ (Bio-Rad Laboratories Inc). (Datos no mostrados para todas las citocinas). El anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus versiones humanizadas (PD1-0103_0312 y PD1-0103_0314) fueron más potentes en comparación con los anticuerpos anti-PD1 de referencia en potenciar la activación de linfocitos T y la secreción de IFN-gamma. Además, el anticuerpo PD1-0103 quimérico y sus variantes de humanización incrementaron la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) e IL-12 por las células presentadoras de antígenos y potencian la capacidad de monocitos/macrófagos o células presentadoras de antígenos para estimular un linfocito T.

Ejemplo 4

Efecto del bloqueo anti-PD-1 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas

Para investigar además el efecto del tratamiento anti-PD-1 en un entorno alogénico, se desarrolló un ensayo en el que se cocultivan linfocitos T CD4 recién purificados durante 5 días en presencia de células dendríticas maduras (CDm) alogénicas derivadas de monocitos. Se aislaron monocitos a partir de PBMC recién obtenidas una semana antes a través de adherencia plástica seguido de la retirada de las células no adheridas. A continuación se generaron CD inmaduras a partir de los monocitos cultivándolos durante 5 días en medios que contenían GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (100 ng/ml). Para inducir la maduración de iDC, se añadió TNF-a, IL-1p (3 e IL-6 (50 ng/ml cada uno) al medio de cultivo durante 2 días adicionales. A continuación se evaluó la maduración de CD midiendo su expresión en superficie del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHCII), CD80, CD83 y CD86 a través de citometría de flujo (LSRFortessa, BD Biosciences).

El día de la reacción de linfocitos mixtos mínimos (mMLR), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidas de un donante no relacionado. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación se plaquearon 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con alo-DC maduras (5:1) en presencia o ausencia de anticuerpo de bloqueo anti-PD1 (PD1-0103, PD1-0103 quimérico o bien anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviado como 0312, 0313, 0314, 0315), a la concentración de 10 |jg/ml si no se indica de forma diferente en las figuras.

Cinco días después se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se usaron para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D systems). Se dejaron las células 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience), IFN-<y>e IL-2 (ambos de eBioscience).

Se descubrió que todas las variantes humanizadas de PD1-0103 (anticuerpos humanizados PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, abreviados como 0312, 0313, 0314, 0315) eran igualmente buenas para potenciar granzima B e interferón gamma (datos no mostrados).

Ejemplo 5

Derivados de anticuerpos para PD1 quiméricos

Se generaron anticuerpos frente a PD1 quiméricos amplificando las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de ratón anti-PD1 PD1-0098, PD1-0103 por medio de PCR y clonándolos en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana / CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)) (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras y vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión para C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Se renombraron los anticuerpos frente a PD1 quiméricos como chiPD1-0098 quimérico (chiPD1-0098) y PD1-0103 quimérico (chiPD1-0103). Para su comparación, se usaron los anticuerpos anti-PD1 de referencia que comprenden los dominios VH y VL de nivolumab (también conocido como MDX-5C4 o MDX-1106) y pembrolizumab (también conocido como MK-3475 u Org 1.09A) se sintetizaron y se clonaron con cadenas principales de IgG1 humana (con mutaciones L234A, L235A y P329G (índice EU de Kabat)).

Ejemplo 6

Generación, expresión y purificación de variantes humanizadas del anticuerpo anti-PD1 PD-0103 (huMab PD-0103) y caracterización

Humanización de los dominios VH y VL del anticuerpo anti-PD1 murino 0103

En base a la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL murinos del anticuerpo anti-PD1 murino PD1-0103 (SEQ ID NO: 7 y 8), se generaron variantes del anticuerpo anti-PD1 humanizadas.

La variante VH humanizada se basa en la línea germinal humana IMGT_hVH_3_23 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGHJ5-01 con varias mutaciones. (Dando como resultado SEQ ID NO: 9). Las variantes humanizadas de VL se basan en las líneas germinales humanas IMGT_hVK_4_1, FMGT_hVK_2_30, EVIGT_hVK_3_11 e EVIGT_hVK_1_39 en combinación con la línea germinal del elemento J humano IGKJ1-01. Diferentes mutaciones dieron como resultado variantes humanizadas de SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 13.

Se tradujeron las secuencias de aminoácidos humanizadas para las regiones variables de la cadena pesada y ligera de PD1-0103 en ADN y se sintetizó el ADNc resultante (GenArt) y a continuación se clonó en vectores de expresión de la cadena pesada como proteínas de fusión con cadenas principales de IgG1 humana/CH1-bisagra-CH2-CH3 humana con mutaciones LALA y PG (leucina 234 a alanina, leucina 235 a alanina, prolina 329 a glicina) anulando funciones efectoras o en vectores de expresión de la cadena ligera como proteínas de fusión a C-kappa humana. A continuación se cotransfectaron los plásmidos de LC y HC en HEK293 y se purificaron después de 7 días de los sobrenadantes por procedimientos estándar para purificación de anticuerpos. Los anticuerpos frente a PD1 humanizados resultantes se nombran como sigue:

Tabla 5: secuencias de VH y VL de anticuerpos variantes humanizados de PD1-0103

Las variantes del anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original se caracterizaron como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6: resumen de resultados para variantes de anticuerpo PD1-0103 humanizado y PD1-0103 quimérico original

La variante humanizada PD-0103-0312 se denomina clon de anticuerpo aPD1 PD1-0376 en lo sucesivo.

Ejemplo 7

Generación de anticuerpos anti-LAG3

Inmunización de conejos

Se inmunizaron conejos transgénicos patentados por Roche que expresaban un repertorio de anticuerpos humanizados con ADN plasmídico que expresaba LAG3.

Se inmunizó genéticamente un conjunto de 3 conejos, usando un vector de expresión de plásmido que codificaba LAG3 humana de longitud completa(15352_pIntronA_fl-hLag3_DNA-IMS),por aplicación intradérmica de 400 ug de ADN de vector, seguido de electroporación (5 pulsos cuadrados de 750 V/cm, duración 10 ms, intervalo 1 s). Los conejos recibieron 7 inmunizaciones consecutivas los días 0, 14, 28, 49, 70, 98 y 126. Se extrajo sangre (un 10 % de la volemia total estimada) los días 35, 77, 105 y 133. Se preparó suero que se usó para la determinación del valor por ELISA (véase a continuación), y se aislaron células mononucleares periféricas que se usaron como fuente de linfocitos B específicos de antígeno en el proceso de clonación de linfocitos B a continuación.

Determinación de valores séricos (ELISA)

Se inmovilizó la proteína LAG3 recombinante humana en una placa NUNC Maxisorp de 96 pocillos a 2 ug/ml, 100 ul/pocillo, en PBS, seguido de: bloqueo de la placa con Crotein C al 2 % en PBS, 200 ul/pocillo; aplicación de diluciones en serie de antisueros, por duplicado, en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo; detección con (1) anticuerpo de burro anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000), o bien (2) anticuerpo de conejo anti-IgG humana conjugado con HRP (Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000), o bien (3) anticuerpo caprino anti-kappa humana biotinilado (Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5000) y estreptavidina-HRP; cada uno diluido en Crotein C al 0,5 % en PBS, 100 ul/pocillo. Para todas las etapas, se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C.

Entre todas las etapas, se lavaron las placas 3 veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se desarrolló la señal por adición de BM Blue POD Substrate soluble (Roche), 100 |jl/pocillo; y se detuvo por adición de HCl 1 M, 100 jl/pocillo. Se leyó la absorbancia a 450 nm, frente a 690 nm como referencia. Se definió el valor como la dilución de antisueros dando como resultado una señal semimáxima.

Aislam iento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conejo

Se extrajeron muestras de sangre de conejos transgénicos inmunizados. Se diluyó a la mitad la sangre completa que contenía EDTA con 1x PBS (PAA, Pasching, Austria) antes de la centrifugación por densidad usando Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se lavaron las PBMC dos veces con 1x PBS.

Medio EL-4 B5

Se usó RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y b-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia).

Recubrimiento de placas con antígeno proteico

Se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular estériles con ECD de LAG3 humana conjugado a una parte de Fc humana (2 |jg/ml) en tampón carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato de disodio 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

Disminución de células

(a) Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad de cultivo celular) recubiertas con una monocapa confluente de células CHO para disminuir los macrófagos/monocitos a través de la adhesión inespecífica así como la unión inespecífica de los linfocitos.

(b) Se usaron placas de 6 pocillos estériles en blanco (calidad de cultivo celular) para disminuir los macrófagos y monocitos y otras células a través de la adhesión inespecífica.

Se usó la mitad de la muestra de PBMC para (a) y la otra mitad para (b).

Se llenó cada pocillo al máximo con 4 ml de medio y hasta 6x106 de PBMC del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la estufa de incubación. Se usaron las células en el sobrenadante (linfocitos en la sangre periférica (PBL)) para la etapa de selección de antígeno.

Enriquecimiento de linfocitos B en antígeno de LAG3

Antígeno proteico: Se sembraron placas de cultivo de tejido de 6 pocilios recubiertas con proteína LAG3-ECD-huFc con hasta 6 x 106 PBL por 4 mi de medio de las etapas de disminución usando la placa de 6 pocilios en blanco y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron las células no adheridas lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adheridas restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la estufa de incubación. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Antígeno de superficie celular: Se sembraron placas de cultivo de tejido de 6 pocillos recubiertas con una monocapa de células CHO positivas para LAG3 humana con hasta 6x10 PBL por 4 ml de medio de las etapas de disminución usando la placa de 6 pocillos recubierta con CHO y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron las células no adheridas lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adheridas restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la estufa de incubación. Se detuvo la tripsinización con medio EL-4 B5. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Tinción con inmunofluorescencia y citometría de flu jo

Se usaron el anticuerpo anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemania) y el anticuerpo anti-huCk PE (Dianova, Hamburgo, Alemania) para la separación de células individuales. Para la tinción de la superficie se incubaron las células de la etapa de disminución y enriquecimiento con el anticuerpo anti-IgG FITC y el anticuerpo anti-huCk PE en PBS y se incubaron durante 45 min en la oscuridad a 4 °C. Después de la tinción, se lavaron las PBMC dos veces con PBS enfriada con hielo. Finalmente, se resuspendieron las PBMC en PBS helada y se sometieron de inmediato a los análisis FACS. Se añadió yoduro de propidio en una concentración de 5 |jg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis FACS para discriminar entre células vivas y muertas. Se usaron un Becton Dickinson FACSAria equipado con un ordenador y el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) para la separación celular individual.

Cultivo de linfocitos B

Se realizó el cultivo de los linfocitos B de conejo por un procedimiento descrito por Seeberet al.(S Seeberet al.PLoS One 9 (2), e86184. 04 feb. 2014). En resumen, se incubaron linfocitos B de conejo separados individuales en placas de 96 pocillos con 200 jl/pocillo de medio EL-4 B5 que contenía células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % (MicroCoat, Bernried, Alemania) y células de timoma EL-4 B5 murino irradiadas con rayos gamma (5 * 10e5 células/pocillo) durante 7 días a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B para el cribado y se extrajeron de inmediato las células restantes y se congelaron a -80 °C en 100 |jl de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

A islam iento de dom inios V de anticuerpos LAG3

Amplificación por PCR de dominios V

Se preparó ARN total a partir de lisado de linfocitos B (resuspendido en tampón RLT - Qiagen - n.° cat. 79216) usando el kit de ARN NucleoSpin 8/96 (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se eluyó ARN con 60 j l de agua sin RNasa. Se usaron 6 j l de ARN para generar ADNc por reacción de retrotranscriptasa usando Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) y cebador oligo-dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron todas las etapas en un sistema Hamilton ML Star. Se usaron 4 j l de ADNc para amplificar las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (VH y VL) con AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 j l usando los cebadores rbHC.up y rbHC.do para la cadena pesada y BcPCR_FHLC_leader.fw y BcPCR_huCkappa.rev para la cadena ligera (tabla 7). Todos los cebadores directos fueron específicos para el péptido señal (de VH y VL respectivamente) mientras que los cebadores inversos fueron específicos para las regiones constantes (de Vh y VL respectivamente). Las condiciones de PCR para RbVH fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min. Las condiciones de la PCR para HuVL fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 40 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 52 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min.

Tabla 7

Se cargaron 8 |jl de solución de PCR de 50 |jl en un 48 E-Gel 2%(Invitrogen G8008-02). Se limpiaron las reacciones de la PCR positivas usando el kit NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyeron en 50 j l de tampón de elución. Se realizaron todas las etapas de limpieza en un sistema Hamilton ML Starlet.

Expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo

Para la expresión recombinante de anticuerpos bivalentes monoclonales de conejo, se clonaron los productos de PCR que codifican VH o VL como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación con protuberancia (RS Haunetal.,BioTechniques (1992) 13, 515-518; MZ Lietal.,Nature Methods (2007) 4, 251-256). Los vectores de expresión contenían un casete de expresión que consistía en un promotor de CMV en 5' que incluía el intrón A y una secuencia de poliadenilación de BGH en 3'. Además del casete de expresión, los plásmidos contenían un origen de replicación derivado de pUC18 y un gen de beta-lactamasa que confería resistencia a la ampicilina para la amplificación del plásmido enE. coli.Se usaron tres variantes del plásmido básico: un plásmido que contenía la región constante de IgG de conejo diseñado para aceptar las regiones VH mientras que contenía la región constante de LC kappa humana para aceptar las regiones VL. Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma y los insertos VL/VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos. Se incubaron los productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4, lo que generó protuberancias monocatenarias. Se detuvo la reacción por adición de dCTP.

En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con recA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron enE. coli.Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación de plásmidos, análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Para la expresión de anticuerpos, se cotransfectaron transitoriamente los plásmidos de HC y LC aislados en células HEK293 y se recogieron los sobrenadantes después de 1 semana.

Ejemplo 8

Caracterización de anticuerpos anti-LAG3

Tabla 8: resumen de caracterización de diferentes anticuerpos anti-LAG3

ELISA para Lag3 humana

Se recubrieron las placas Nunc maxisorp (Nunc 464718) con 25 |jl/podMo de proteína quimera de Fc de LAG-3 humana recombinante (R&D Systems, 2319-L3) a una concentración de proteína de 800 ng/ml y se incubaron a 4 °C durante la noche o durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se incubó cada pocillo con 90 j l de tampón de bloqueo (PBS BSA al 2 % Tween 20 al 0,05 %) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras anti-Lag3 a una concentración de 1-9 ug/ml (diluciones 1:3 en tampón OSEP) y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-cadena k de Ig humana de cabra-HRP (Milipore, AP502P) en una dilución de 1:2000 y se incubó a TA durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 2-10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

ELISA de unión a Lag3 de superficie celular

Se sembraron 25 jl/pocillo de células Lag3 (células CHO recombinantes que expresan Lag3, 10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Corning, 3701) y se incubaron a 37 °C durante uno o dos días. Al día siguiente después de retirar el medio, se añadieron 25 j l de muestras anti-Lag3 (diluciones 1:3 en tampón OSEP, comenzando a una concentración de 6-40 nM) y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST) se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-cadena k de Ig humana de cabra-HRP (Milipore, AP502P) en una dilución de 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 6-10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

Caracterización por SPR (Biacore) de anticuerpos anti-LAG3

Se ha usado un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar los parámetros cinéticos de la unión entre anticuerpos anti-Lag3 en formato bivalente o como fragmentos Fab monovalentes y dominios extracelulares (ECD) de Lag3 humana marcados con Fc humano a 25 °C.

Por lo tanto, se prepararon dos cubetas de lectura de un chip biosensor C1 en un Biacore T200 inmovilizando neutravidina, diluida a 25 |jg/ml en tampón acetato, pH 4,5, sobre el mismo usando el "asistente de inmovilización". Esto proporcionó niveles de inmovilización de alrededor de 1900 UR. A continuación, se unió el conjugado anti-IgG-Fc-biotina (humano) CaptureSelect™ a la neutravidina, usando una dilución de 20 jg/ml en tampón de migración (HBS-EP+, GE Healthcare).

El procedimiento por sí mismo consistió en cuatro comandos por ciclo. Primer comando: captura de ~46 UR de huLag3-Fc (20 s, 10 jl/min). Segundo comando: inyección de muestra durante 120 s seguido de una disociación de 1200 s de duración a una velocidad de flujo de 30 jl/min. Tercer y cuarto comando: regeneración inyectando glicina-HCl, pH 1,5 durante 30 segundos. A continuación, se midieron una serie de diluciones (3,13 nM-200 nM, diluciones dobles en tampón de migración) de cada fragmento Fab de anticuerpo y ciclos en blanco adicionales usando el procedimiento descrito previamente. A continuación, se utilizó el programa informático de evaluación Biacore T200 para obtener valores cinéticos aplicando un ajuste Langmuir 1:1 con el parámetro de ajuste Rmáx establecido en "local", puesto que los niveles de captura no eran perfectamente reproducibles. Los resultados (valores de K<d>y valores de kd) se muestran en la tabla 8.

Cartografía de epítopos

Se realizó el agrupamiento de epítopos usando un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (SPR). Por lo tanto, se unieron proteínas fijadoras de aLag3 a huLag3 en un instrumento Biacore T200. A continuación se evaluó la accesibilidad de otras proteínas fijadoras al complejo proteína fijadora aLag3-huLag3 formado previamente.

Se usó un kit SA CAP (GE Healthcare) para llevar a cabo este ensayo. Si no se describe de otro modo, se realizó el ensayo de acuerdo con el manual del kit SA CAP. La tanda incluyó solo un tipo de ciclo. Después de la hibridación se dejó que una dilución 10 nM de huLag3 marcado con huFc biotinilado se uniera a la estreptavidina en el chip sensor durante 20 s a un caudal de 10 jl/min. A continuación, se inyectó una primera muestra de 200 nM diluida en tampón de migración durante 180 s a un caudal de 30 jl/m in y se siguió de inmediato por una segunda muestra en las mismas condiciones. A continuación, se regeneró la superficie.

A continuación, se asignaron las muestras a diferentes grupos de epítopos con patrones de competencia similares. Se realizó una primera categorización aproximada, en base a la respuesta relativa de la segunda inyección usando un umbral de 6,1 UR, que estaba justo por encima del valor más alto observado cuando se inyectó una proteína fijadora como primera y segunda muestra. Todos los valores y decisiones se validaron finalmente por inspección visual de los sensogramas.

Los resultados se muestran en la tabla 8. Se identificaron tres patrones principales de epítopos (E1, E2 y E3). Puesto que aLag3-0416 y BAP 050 humanizado comparten el mismo grupo pero no se inhiben completamente entre sí, se asignaron a los subgrupos E2b y E2c.

Unión de anticuerpos anti-Lag3 de conejos tg a células HEK positivas para Lag3 de macaco cangrejero recombinantes

Además del análisis de unión usando células HEK que expresan de forma recombinante Lag3 humana en la superficie, también se evaluó la unión a células HEK positivas para Lag3 de macaco cangrejero. Para este experimento se descongelaron células HEK293F congeladas, transfectadas previamente de forma transitoria con cyno-LAG-3, se centrifugaron y se volvieron a complementar en PBS/FBS al 2 %. Se sembraron 1,5x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-Lag3 hasta una concentración final normalizada de 10 |jg/ml. Como referencia y como controles, se prepararon anticuerpos de autofluorescencia y control positivo (Medarex 25F7), así como control de isotipo (hulgGl de Sigma, n.° cat. n.° 15154,datos no mostrados)y se midieron en el experimento. Se incubaron las células HEK con los anticuerpos indicados durante 45 min en hielo, se lavaron dos veces con 200 j l de tampón PBS enfriado con hielo que contenía FBS al 2 %, antes de que se añadiera el anticuerpo secundario (anticuerpo caprino anti-IgG-kappa humana marcado con APC, Invitrogen, n.° de cat. n.° MH10515) (diluido 1:50 en tampón FACS/pocillo) y se incubó adicionalmente durante 30 min en hielo. Se lavaron de nuevo las células dos veces con 200 j l de tampón PBS/FBS al 2 % enfriado con hielo antes de que se resuspendieran las muestras finalmente en 150 j l de tampón FACS y se midió la unión en el módulo FACS CANTO-II HTS.

Resultados: en la tabla a continuación se muestra la unión y la reactividad cruzada de diferentes anticuerpos anti-Lag3 a células HEK293 que expresan cynoLAG3, la unión se da en % de células positivas o bien la media geométrica de la intensidad de la señal.

Tabla 9: unión de diferentes anticuerpos anti-LAG3 a células HEK positivas para Lag3 de macaco cangrejero recombinantes

Unión de anticuerpos anti-Lag3 de conejos tg a PBMC/linfocitos T de macaco cangrejero (activados) que expresan Lag3

Después de la unión a la proteína Lag3 recombinante y Lag3 expresada de forma recombinante en células de mamíferos, también se evaluó la unión a Lag3 expresada en linfocitos T de macaco cangrejero activados.

Las características de unión de los anticuerpos anti-Lag3 recién generados (derivados de conejos transgénicos de Roche) a Lag3 expresada en la superficie celular de linfocitos T o PBMC de macaco cangrejero se confirmaron por análisis FACS. Aunque Lag3 no se expresa en linfocitos T indiferenciados, se regula por incremento tras la activación y/o en linfocitos T agotados. Por tanto, se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de macaco cangrejero a partir de sangre roja de macaco cangrejero y a continuación se activaron por pretratamiento con CD3/CD28 (1 jg/m l) durante 2-3 días. Posteriormente, se analizaron las células activadas para determinar la expresión de Lag3: En resumen, se tiñeron 1-3x105 células activadas durante 30-60 min en hielo con los anticuerpos anti-Lag3 indicados y los respectivos anticuerpos de control a una concentración final de 10 jg/ml. Se detectaron los anticuerpos anti-Lag3 unidos por medio de anticuerpos secundarios anti-IgG humana o anti-IgG de conejo conjugados con fluorocromo. Después de la tinción, se lavaron las células dos veces con PBS/FCS al 2 % y se analizaron en un FACS Fortessa (BD).

Resultados: la siguiente tabla resume el porcentaje de células positivas para Lag3 dentro de las PBMC de macaco cangrejero activadas.

Tabla 10: unión de diferentes anticuerpos anti-LAG3 a PBMC/linfocitos T de macaco cangrejero (activados) que expresan Lag3

En los linfocitos T de macaco cangrejero activados, todos los anticuerpos anti-Lag3 de conejo demostraron una unión significativa a las células Lag3+. De este modo, todos los anticuerpos recién generados mostraron un incremento en el porcentaje de células positivas en comparación con los anticuerpos de referencia anti-Lag3 humanos (por ejemplo, tales como MDX25F7, BMS-986016).

Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas (por ELISA)

Se sembraron 25 |jl/pocillo de células A375 (10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Corning, 3701) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Se preincubaron los anticuerpos anti-Lag3 durante 1 h con Lag3 biotinilada (250 ng/ml) en medio de cultivo celular en diluciones 1:3 comenzando a una concentración de anticuerpo de 3 jg/ml. Después de retirar el medio de los pocillos con las células sembradas, se transfirieron a los pocillos 25 j l de las mezclas preincubadas de anticuerpo-Lag3 y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST), se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 |jl/pocillo de poli-HRP40-estreptavidina (Fitzgerald, 65R-S104Ph Rpx) en una dilución 1:2000 o 1:8000 y se incubó a t.a. durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, n.° 11835033001) y se incubó durante de 2 a 10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

Inhibición de la unión de LAG-3 a MHC-II expresado en células tumorales A375 humanas (por análisis FACS)

Principio de ensayo: para estudiar la función antagónica de los anticuerpos anti-Lag3, se llevó a cabo un ensayo de competencia MHCII:Lag3. Se tiñeron células A375 humanas MHCII+ con proteína de fusión Fc:Lag3 biotinilada generada internamente con o sin incubación previa con anticuerpos anti-Lag3. Este análisis se estudió en un experimento de competencia FACS: Se cultivaron células A375 (ATCC, n.° CRL-1619) durante 2-3 pases en medio<e>M de Eagle complementado con EBSS (PAN, n.° de cat. n.° P04-00509), FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 1x NEAA y 1x piruvato de sodio. Todos los anticuerpos se diluyeron en tampón FACS hasta una concentración final de 20 jg/m l en 25 j l (en placas de fondo en U de 96 pocillos). Se añadieron 25 j l de proteína de fusión Fc:LAG-3 recombinante biotinilada generada internamente a una concentración final de 10 jg/m l al medio o bien a anticuerpos anti-Lag3 o bien controles y se preincubó durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron las células A375 con PBS y se ajustaron a 3x106 células/ml en PBS. Se sembraron 100 j l por pocillo en una placa con fondo en V de 96 pocillos. Se centrifugaron las placas y se retiró el sobrenadante. A continuación, se añadió a las células la mezcla de proteína de fusión Fc:LAG-3/anticuerpo preincubada (50 jl/pocillo) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de esto, se lavaron las células con 200 j l de tampón FACS. Para la detección de la proteína Fc:Lag3 biotinilada unida a MHCII celular, se usó un anticuerpo caprino anti-biotina conjugado con APC a 3 jl/muestra (Miltenyi Biotec, n.° de cat. n.° 130-090-856) y se incubó durante 10-15 min adicionales. Después de la tinción, se lavaron de nuevo las células y a continuación se transfirieron en 150 j l de tampón FACS (PBS/FBS al 2 %) a una placa con fondo en U y se analizaron en un FACS Canto-II usando un módulo HTS.

Dos anticuerpos anti-Lag3 (clones 25F7 y 26H10; Medarex) sirvieron como controles positivos y una IgG1 humana (Sigma, n.° de cat. n.° 15154) como control de isotipo apropiado. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración final de 10 jg/ml.

Resultados: en la tabla a continuación se muestra el resultado del análisis FACS que demuestra el porcentaje de inhibición de la unión de la proteína Lag3 a MHC-II en las células (calculado como la señal de unión reducida en referencia al valor máximo en ausencia de un anticuerpo de bloqueo).

Tabla 11: unión de diferentes anticuerpos anti-LAG3 a PBMC/linfocitos T de macaco cangrejero (activados) que expresan Lag3

Estos datos respaldan una interacción funcional con Lag3 y el bloqueo de la interacción celular de todos los anticuerpos sometidos a prueba.

Potencia neutralizante de los anticuerpos anti-Lag3 novedosos en un bioensayo/ensayo de indicador de bloqueo de LAG3 estándar

Para someter a prueba la potencia neutralizante de los anticuerpos anti-Lag3 novedosos en el restablecimiento de una respuesta de linfocitos T suprimidain vitro,se usó un sistema de indicador disponible comercialmente. Este sistema consiste en células efectoras Jurkat del NFAT Lag3+ (Promega, n.° cat. n.° CS194801), células Raji MHC-IT (ATCC, n.° CLL-86) y un superantígeno. En resumen, el sistema de indicador se basa en tres etapas: (1) activación celular del NFAT inducida por superantígeno, (2) inhibición de la señal de activación mediada por la interacción inhibidora entre el MHCII (células Raji) y las células efectoras Jurkat del NFAT Lag3+, y (3) recuperación de la señal de activación del NFAT por las construcciones de fusión Lag3-antagonista/aVH-Fc neutralizante.

Para este experimento, se cultivaron linfocitos T efectores Jurkat/NFAT-luc2 Lag-3+ y Raji como se describe por el proveedor. Se prepararon diluciones en serie (40 pg/ml-50 |jg/ml) de varios anticuerpos anti-Lag3 y de referencia en medio de ensayo (RPMI 1640 (PAN Biotech, n.° cat. n.° P04-18047), FCS al 1 %) en placas de cultivo de 96 pocillos planas con fondo blanco (Costar, n.° cat. n.° 3917). Se añadieron 1x105 células NFAT-Jurkat Lag3+/pocillo) a la solución de anticuerpos. Después de esta etapa, se añadieron 2,5x104 células Raji/pocillo a la mezcla de células Jurkat/anticuerpos, así como una concentración final de 50 ng/ml del superantígeno SED (Toxin technology, n.° cat. DT303). Después de una incubación de seis horas a 37 °C y CO<2>al 5 %, se calentó el sustrato Bio-Glo (Promega, n.° G7940) hasta temperatura ambiente y se añadieron 75 |jl por pocillo, se incubó durante 5-10 min antes de medirse la luminiscencia global en un lector Tecan Infinite de acuerdo con la recomendación del fabricante del kit.

En la tabla se muestra la restauración de una supresión mediada por MHCII/Lag3 de la señal de luciferasa NFAT por diferentes anticuerpos anti-Lag3 tras estimulación con SED (dada como valores de CE<50>):

Tabla 12: resultados con diferentes anticuerpos anti-LAG3 en el bioensayo/ensayo de indicador de bloqueo LAG3 estándar

n.t. moléculas no sometidas a prueba en este experimento

Ejemplo 9

Caracterización funcional de los anticuerpos anti-LAG3

La tabla 13 resume la actividad biológica y los efectos de diferentes anticuerpos anti-LAG3 (solos o en combinación con anticuerpos anti-PD1) en diferentes ensayos como se describe en el presente documento.

Tabla 13: resumen de la actividad biológica de diferentes anticuerpos anti-LAG3 (solos o en combinación con anticuerpos anti-PD1)

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica y la secreción de IL-2 por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con células dendríticas maduras alogénicas

Para cribar anticuerpos de bloqueo anti-LAG-3 en combinación con anti-PD-1 en un entorno alogénico, se desarrolló un ensayo en el que se cocultivan linfocitos T CD4 recién purificados durante 5 días en presencia de células dendríticas maduras (mDC) alogénicas derivadas de monocitos. Se aislaron monocitos a partir de PBMC recién obtenidas una semana antes a través de adherencia plástica seguido de la retirada de las células no adheridas. A continuación, se generaron DC inmaduras a partir de los monocitos cultivándolos durante 5 días en medio que contenía GM-CSF (50 ng/ml) e IL-4 (100 ng/ml). Para inducir la maduración de iDC, se añadieron TNF-alfa, IL-1beta e IL-6 (50 ng/ml cada uno) al medio de cultivo durante 2 días adicionales. A continuación, se evaluó la maduración de DC midiendo su expresión en superficie del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHCII), CD80, CD83 y CD86 a través de citometría de flujo (LSRFortessa, B<d>Biosciences).

El día de la reacción de linfocitos mixtos mínimos (mMLR), se enriquecieron linfocitos T CD4 por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec) a partir de 108 PBMC obtenidas de un donante no relacionado. Antes del cultivo, se marcaron linfocitos T CD4 con 5 |jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE). A continuación, se plaquearon 105 linfocitos T CD4 en una placa de 96 pocillos conjuntamente con alo-DC maduras (5:1) en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PD-1 de bloqueo aPD1(0376) (= PD1-0103-0312, como se describe anteriormente en el presente documento o en la solicitud PCT PCT/EP2016/073248) solo o en combinación con anticuerpos anti-LAG-3 quiméricos (aLAG3(0403) aLAG(0418)) o anticuerpos de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) a la concentración de 10 jg/ml. DP47 es una IgG humana que no se une con una mutación LALA en la porción Fc para evitar el reconocimiento por FcyR y se usó como control negativo.

Cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se usaron para medir los niveles de IL-2 por ELISA (R&D Systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-y (eBioscience). Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2 B.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la liberación de granzima B cito tóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblastoide-linfocitos B (ARH77).

En estudios funcionales, se cultivaron linfocitos T CD4 con la línea celular tumoral ARH77, una línea celular linfoblastoide de linfocitos B que expresa niveles menores de PDL-1 que mDC, para caracterizar mejor la contribución del antagonismo de LAG-3 al bloqueo de PD-1. El resto de la configuración experimental y la lectura permanecieron sin cambios con respecto a la MLRm. Los anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416), elegidos en base a su capacidad para cosecretar IL-2 y granzima B en la mMLR) en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 provocaron un incremento más significativo en la secreción de granzima B por linfocitos T CD4 que los anticuerpos anti-LAG-3 de referencia ((BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016)) (P<0,05) y anti-PD-1 solo (P<0,01) como se muestra en la figura 3.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la supresión de Treg de la liberación de granzima B e IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con PBMC alogénicas irradiadas.

En estudios funcionales que implican ensayos de supresión de linfocitos T reguladores (T reg), las PBMC del mismo donante se dividieron en dos muestras: una estaba enriquecida con linfocitos T CD4 y la otra con Treg definidos como linfocitos T CD4+CD25alto CD127bajo por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec). Una vez purificadas las dos poblaciones, los linfocitos T CD4 se marcaron con 5 |jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE) mientras que los Treg con 5<j>M de CellTrace Violet (CTV) para poder distinguirlas en el FACS más adelante.

A continuación, tanto los linfocitos T CD4 (105) como Treg (105) se cocultivaron en una placa de 96 pocillos en una proporción 1:1 conjuntamente con PBMC deficitarias en CD4 irradiadas (105) de un donante no relacionado en presencia o ausencia de anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416) o anticuerpos anti-LAG-3 de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 aPD1(0376) a una concentración de 10 jg/ml. Como control para estimar la magnitud de la supresión de las funciones efectoras de linfocitos T CD4 por Treg, los linfocitos T CD4 (105) también se cocultivaron con PBMC irradiadas (105) en ausencia de Treg.

Cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se usaron para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D Systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-<y>(eBioscience). Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4 B.

Los anticuerpos anti-LAG-3 (aLAG3(0414) y aLAG3(0416), en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 aPD1(0376) (= PD1-0103-0312, de la solicitud de PCT PCT/EP2016/073248) provocaron la resistencia de Tconv del control estricto de los linfocitos T reguladores como se demuestra por la secreción de una cantidad significativamente mayor de granzima B que de Tconv en presencia de anti-PD-1 solo (P<0,05) o en ausencia de inhibidores del punto de control (P<0,001). Los anticuerpos anti-LAG-3 de referencia (BAP050 humanizado (LAG525) y BMS 986016) en combinación con anti-PD-1 no rescataron significativamente las funciones efectoras de Tconv de la supresión de Treg. Se obtuvieron resultados similares para IFN-y incluso si la diferencia no alcanzó la significación estadística con solo 4 donantes.

Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la secreción de granzima B e IFN-y por lin focitos T CD4 de PBMC de pacientes con melanoma después de la recuperación con grupos de péptidos de antígeno de melanoma inmunógeno.

Se ha descrito previamente que las PBMC de pacientes con melanoma contienen frecuencias detectables de linfocitos T específicos de antígeno tumoral. Por lo tanto, para propósitos de POC, se sometió a prueba el anticuerpo anti-LAG-3 (0414) más anti-PD-1 frente a anti-PD-1 solo en PBMC de pacientes con melanoma reestimuladas durante la noche con grupos de péptidos de antígenos asociados al melanoma inmunógeno.

Se incubaron de 105 a 106 PBMC de pacientes con melanoma a temperatura ambiente en presencia o ausencia de concentraciones de saturación (10 jg/m l) de anticuerpo anti-PD-1 solo (0376), en combinación con anticuerpo anti-LAG-3 (aLAG3(0414) = (0414), 10 jg/ml). A continuación, los linfocitos T se volvieron a estimular durante la noche con un grupo de antígenos relacionados con el tumor inmunógeno como MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/MART-1, NYESO-1, proteína de melanocitos Pmel 17 gp100, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa 2 en presencia de inhibidores del transporte de proteínas Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina).

A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-<y>(eBioscience).

La combinación de anticuerpos anti-LAG-3 y anti-PD-1 (P<0,01 y P<0,001) potenció significativamente (P<0,01 y P<0,0001) las funciones efectoras de los linfocitos T específicos del antígeno tumoral (es decir, secreción de granzima B e IFN-y) mientras que el bloqueo de PD-1 solo no mostró ningún efecto (datos no mostrados).

Ejemplo 10

Generación y producción de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos

10.1 Producción y expresión de anticuerpos biespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con intercambio/reemplazo de dom inio VH/VL(CrossMAbVh-VL)en un brazo de unión y con sustituciones aminoacídicas con carga única en la interfase CH1/CL

Se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y LAG3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos 1 1 CrossMAbVh-Vl se describen también en el documento WO 2009/080252. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 14. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 1+1CrossMAbVh-Vlse muestra en la fig. 1A.

Tabla 14: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con intercambio/reemplazo de dom inio VH/VL (1+1CrossMAbvh-vl)

Para todas las construcciones, se usó la tecnología de heterodimerización de botones en ojales con una sustitución de botón típica (T366W) en el primer dominio CH3 y las correspondientes sustituciones de ojal (T366S, L368A e Y410V) en el segundo dominio CH3 (así como dos residuos de cisteína introducidos adicionales S354C/Y349'C) (contenido en las respectivas secuencias de la cadena pesada (HC) correspondiente representadas anteriormente).

10.2 Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con intercambio/reemplazo de dom inio CH1/Ck (2+2CrossMabCH1/Ck)en dos brazos de unión y con sustituciones aminoacídicas cargadas en las interfaces CH1/CL del otro (ejemplos comparativos)

En este ejemplo, se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y LAG3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos 2+2CrossMAbCH1/Ckmultiespecíficos se describen también en el documento WO 2010/145792. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 15. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 2+2CrossMabCH1/Ckse muestra en la fig. 1A.

Tabla 15: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con intercambio/reemplazo de dom inio VH/VL (2+2CrossMabCH1/Ck)

_________ _________

10.3 Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con intercambio/reemplazo del dom inio CHl/Ck (2+1CrossMabCH1/Ck)en un brazo de unión (PD1 crossFab fusionado al extremo C de la cadena pesada de botón de Fc) y con sustituciones aminoacídicas cargadas en las interfaces CH1/CL del otro (ejemplos comparativos)

En este ejemplo, se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y TIM3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos 2+1CrossMabCH1/ckmultiespecíficos se describen también en el documento WO2013/026831. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 16. Una estructura esquemática de los anticuerpos 2+1CrossMabCanal 1/ckse muestra en la fig. 1B.

Tabla 16: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con intercambio/reemplazo de dom inio CH1/Ck (2+1CrossMabCH1/ck)

De forma alternativa, el PD1 crossFab fusionado al extremo C de la cadena pesada de botón de Fc se puede reemplazar por Fab monocatenario (scFab). Dichos anticuerpos 2+1 multiespecíficos que comprenden un scFab también se describen en el documento WO2010/136172 y se pueden expresar usando plásmidos de expresión que contienen los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 17. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 2+1 con un scFab fusionado en el extremo C de la cadena pesada de botón de Fc se muestra en la fig. 1C.

Tabla 17: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con scFab PD1

10.4 Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con VH/VL fusionado cada uno en un extremo C de las cadenas pesadas (formato2+1 PRIT)(ejemplo comparativo)

En este ejemplo, se generaron anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 humana y LAG3 humana como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Este tipo de anticuerpos 2+1 multiespecíficos también se describe en el documento WO 2010/115589. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 18. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 2+1 de tipo PRIT se muestra en la fig. 1D.

Tabla 18: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con dom inio VH y VL fusionado en el extremo C a cadenas pesadas

10.5 Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con intercambio/reemplazo de dom inio VH/VL (formato trans 1+1CrossMabVH/VL)en un brazo de unión y con sustituciones aminoacídicas cargadas en las interfaces CH1/CL del Fab LAG3 fusionado al extremo C de la cadena pesada de ojal de Fc

Se produjeron anticuerpos multiespecíficos que se unen monovalentemente tanto a PD1 humana como a LAG3 humana, en los que un Fab LAG3 se fusiona por medio de su dominio pesado variable al extremo C de una de las cadenas pesadas, preferentemente la cadena pesada de ojal de Fc. Se generaron las moléculas como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 19. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 1+1CrossMabVH/VLde tipo trans se muestra en la fig. 1H.

Tabla 19: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), con Fab aLAG3 fusionado en el extremo C a cadenas pesadas

10.6 Producción y expresión de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3 con intercambio/reemplazo de dom inio VH/VL (formato trans 2+1CrossMabVH/VL)en un brazo de unión y con sustituciones aminoacídicas cargadas en las interfaces CH1/CL de los dos Fab LAG3, uno de ellos fusionado al extremo C de la cadena pesada de ojal de Fc (ejemplo comparativo)

Se produjeron anticuerpos multiespecíficos que se unen monovalentemente a PD1 humana y se unen bivalentemente a LAG3 humana en los que un Fab LAG3 se fusiona por medio de su dominio pesado variable al extremo C de una de las cadenas pesadas, preferentemente la cadena pesada de ojal de Fc. Se generaron las moléculas como se describe en la sección de procedimientos generales por técnicas de biología molecular clásicas y se expresaron de forma transitoria en células 293F o Expi293F como se describe anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos se expresaron usando plásmidos de expresión que contenían los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la tabla 20. Una estructura esquemática de los anticuerpos biespecíficos 2+1CrossMabVHNLde tipo trans se muestra en la fig. 1I.

Tabla 20: secuencias de aminoácidos de cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), en las que uno de los Fab aLAG3 se fusiona en el extremo C a cadenas pesadas

10.7 Purificación y caracterización de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3

Se purificaron los anticuerpos multiespecíficos expresados anteriormente del sobrenadante por una combinación de cromatografía de afinidad de proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. Todos los anticuerpos multiespecíficos se pueden producir con buenos rendimientos y son estables. Se caracterizaron los productos obtenidos por su identidad por espectrometría de masas y propiedades analíticas tales como pureza por SDS-PAGE, contenido en monómero y estabilidad.

Espectrometría de masas

Se analizaron las estructuras primarias esperadas por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-EM) de los CrossMab intactos desglucosilados y CrossMab desglucosilados/digeridos con plasmina o de forma alternativa desglucosilados/digeridos con LysC limitada.

Se desglucosilaron los CrossMab CH1/Ck con N-glucosidasa F en un tampón fosfato o Tris a 37 °C durante hasta 17 h a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Se realizaron las digestiones con plasmina o LysC limitada (Roche) con 100 |jg de CrossMab CH1/Ck desglucosilados en un tampón Tris pH 8 a temperatura ambiente durante 120 horas y a 37 °C durante 40 min, respectivamente. Antes de la espectrometría de masas, se desalaron las muestras por medio de HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). Se determinó la masa total por medio de ESI-EM en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).

E sta b ilid a d de a n ticu e rp o s m u ltie sp e c ífico s

Para evaluar la estabilidad de las construcciones de anticuerpos, se evalúan la estabilidad térmica así como las temperaturas de inicio de agregación de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se preparan muestras de los anticuerpos indicados a una concentración de 1 mg/ml en histidina/cloruro de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una matriz de microcubetas de 10 |jl y se registran datos de dispersión de luz estática así como datos de fluorescencia tras excitación con un láser de 266 nm con un instrumento Optim1000 (Avacta Inc.), mientras se calientan las muestras a una tasa de 0,1 °C/min de 25 °C a 90 °C.

La temperatura de inicio de la agregación (Tag) se define como la temperatura a la que la intensidad de luz dispersada comienza a incrementar. La temperatura de fusión (Tf) se define como el punto de inflexión en un gráfico de intensidad de fluorescencia frente a longitud de onda.

Ejemplo 11

Caracterización de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos

11.1 ELISA de unión

ELISA para huPD1

Se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina Nunc maxisorp (MicroCoat n.° 11974998001) con 25 jl/pocillo de PD1-ECD-AviHis biotinilado a una concentración de 500 ng/ml y se incubó a 4 °C durante la noche. Después del lavado (3x90 |jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 |jl de muestras de anticuerpo anti-PD1 en concentraciones crecientes y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-098) en una dilución 1:5000 y se incubó a TA durante 1 h en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó hasta DO 2 - 3. La medición tuvo lugar a 370/492 nm.

ELISA celular para PD1 humana

Al día siguiente, se añadieron 25 jl/pocillo de muestra de PD1 o anticuerpo de referencia anti-PD1 humano (Roche)/anti-PD1 de ratón (Biolegend; cat.:329912) y se incubó durante 2 h a 4 °C (para evitar la internalización). Después del lavado cuidadosamente (1x90 jl/pocillo de PBST), se fijaron las células añadiendo 30 jl/pocillo de glutaraldehído al 0,05 % (Sigma, n.° cat.: G5882, 25 %) diluido en tampón 1xPBS y se incubó durante 10 min a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de anticuerpo secundario para la detección: anti-H+L-POD humano de cabra (JIR, JIR109-036-088)/anti-POD murino de oveja (GE NA9310) seguido de 1 h de incubación a TA en un agitador. Después del lavado (3x90 jl/pocillo de PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de solución de sustrato TMB (Roche 11835033001) y se incubó hasta DO 1,0 - 2,0. Se midieron las placas a 370/492 nm.

Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores de "CE<50>CHO-PD1" [nM] en la tabla 21 a continuación.

ELISA para Lag3 humana

Se recubrieron las placas Nunc maxisorp (Nunc 464718) con 25 jl/pocillo de proteína quimera de Fc de LAG-3 humana recombinante (R&D Systems, 2319-L3) a una concentración de proteína de 800 ng/ml y se incubaron a 4 °C durante la noche o durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se incubó cada pocillo con 90 j l de tampón de bloqueo (PBS BSA al 2 % Tween 20 al 0,05 %) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 j l de muestras anti-Lag3 a una concentración de 1-9 jg/m l (diluciones 1:3 en tampón OSEP) y se incubó 1 h a TA. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-cadena k de Ig humana de cabra-HRP (Milipore, AP502P) en una dilución de 1:2000 y se incubó a TA durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 2-10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm.

ELISA de unión a Lag3 de superficie celular

Se sembraron 25 |jl/podMo de células Lag3 (células CHO recombinantes que expresan Lag3, 10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejido (Corning, 3701) y se incubaron a 37 °C durante uno o dos días. Al día siguiente después de retirar el medio, se añadieron 25 |jl de muestras anti-Lag3 (diluciones 1:3 en tampón OSEP, comenzando a una concentración de 6-40 nM) y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST) se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST), se añadieron 25 jl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-cadena k de Ig humana de cabra-HRP (Milipore, AP502P) en una dilución de 1:1000 y se incubó a TA durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante 6-10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm. Se enumeran los resultados de ELISA celular como valores de "CE<50>CHO-LAG3" [nM] en la tabla 21 a continuación.

Se sembraron 25 jl/pocillo de células A375 (10000 células/pocillo) en placas de 384 pocillos tratadas con cultivo tisular (Coming, 3701) y se incubó a 37 °C durante la noche. Se preincubaron los anticuerpos anti-Lag3 durante 1 h con Lag3 biotinilada (250 ng/ml) en medio de cultivo celular en diluciones 1:3 comenzando a una concentración de anticuerpo de 3 j/m l. Después de retirar el medio de los pocillos con las células sembradas, se transfirieron a los pocillos 25 j l de las mezclas preincubadas de anticuerpo-Lag3 y se incubaron durante 2 h a 4 °C. Después del lavado (1 x 90 j l en PBST), se fijaron las células por adición de 30 jl/pocillo de glutaraldehído hasta una concentración final de un 0,05 % (n.° de cat. de Sigma: G5882), 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de poli-HRP40-estreptavidina (Fitzgerald, 65R-S104P<h>R<px>) en una dilución 1:2000 o 1:8000 y se incubó a t.a. durante 1 h. Después del lavado (3x90 jl/pocillo con tampón PBST) se añadieron 25 jl/pocillo de sustrato TMB (Roche, 11835033001) y se incubó durante de 2 a 10 min. La medición tuvo lugar en un instrumento Tecan Safire 2 a 370/492 nm. Se enumeran los resultados de ELISA de inhibición como valores de "CI<50>MHCII/ELISA" [nM] en la tabla 21 a continuación.

Tabla 21: sumario de la unión de diferentes anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos

11.2 Biacore de unión

Propiedades de unión a antígeno de anticuerpos multiespecíficos que se unen a PD1 y LAG3

Se evaluó la unión de los anticuerpos multiespecíficos a sus respectivos antígenos diana, es decir, PD1 y LAG3 por Biacore®.

La unión a PD1 se puede evaluar de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Se inmovilizó Fc anti-IgG humana por acoplamiento con amina a la superficie de un chip sensor CM5 (Biacore). A continuación, se capturaron las muestras y se unió huPD1-ECD a ellas. Se regeneró la superficie del chip sensor después de cada ciclo de análisis. Finalmente se obtuvieron la constante de equilibrio y las constantes de velocidad cinéticas ajustando los datos a un modelo de interacción de Langmuir 1:1.

Se acoplaron aproximadamente 10.000 unidades de respuesta (UR) de 20 |jg/ml de anti-IgG humana (GE Healthcare n.° BR-1008-39) sobre todas las cubetas de lectura de un chip sensor CM5 en un Biacore T200 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el tampón de migración fueron HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4). Se fijó la temperatura de la cubeta de lectura a 25 °C y la temperatura del compartimento de muestra a 12 °C. Se cebó el sistema con tampón de migración.

Se inyectaron diferentes muestras durante 15 segundos con una concentración de 10 nM y se unieron consecutivamente a las cubetas de lectura 2, 3 y 4. A continuación, se inyectó un conjunto completo de concentraciones de PD1-ECD humana (300 nM, 100 nM, 2 x 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM, 1,2 nM y 2 x 0 nM) sobre cada muestra durante 300 s seguido de un tiempo de disociación de 10/600 s y dos etapas de regeneración de 30 s con MgCl<2>3 M, de las que la última contenía un "lavado adicional después de la inyección" con tampón de migración. Finalmente, se ajustaron los datos referenciados doblemente a un modelo de interacción de Langmuir 1:1 con el programa informático de evaluación BIAcore T200.

Se evaluó la unión a LAG3 de acuerdo con el siguiente procedimiento:

Para realizar este ensayo se usó un kit SA CAP de Biacore proporcionado por GE Healthcare. Se obtuvieron los valores cinéticos a 25 °C en tampón HBS-EP+ (Ge Healthcare).

Se conectó el chip SA CAP a un Biacore T200 como se prescribe en el manual del kit CAP. El procedimiento de ejecución contiene cuatro comandos. En primer lugar, se inyectó reactivo CAP durante 300 s a un caudal de 10 jl/m in para hibridar los ADN monocatenarios inmovilizados usando un comando "General". El comando se siguió de una inyección de 15 segundos de duración de una dilución de 1 jg/m l de dominio extracelular de Lag3 humana marcado con Fc biotinilado en un tampón de migración. Esto da como resultado un nivel de captura de aproximadamente 50 UR. Se usó un comando de ciclo único para inyectar cinco concentraciones de muestra diferentes (100 nM - 6,25 nM, diluciones 2 en dos veces) seguido de una fase de disociación de 1200 segundos de duración. A continuación, se regeneró el chip como se prescribe en el manual del kit SA CAP.

Finalmente, se evaluaron las curvas obtenidas usando el programa informático Biacore T200 Evaluation, versión 3.0.

Resultados: las interacciones no se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1, porque todas las muestras excepto 0799 y 0927 tienen dos restos de unión a Lag3 y, por lo tanto, muestran avidez. Dado que 0799 y 0927 contenían una pequeña población de muestra bivalente mal emparejada, también mostraron cierta avidez.

Por lo tanto, los sensogramas solo se clasificaron de acuerdo con sus tasas de disociación. Esto se realizó por comparación visual de las curvas cinéticas de ciclo único. Al hacer esto, se demostró que el complejo ECD Lag3-0416 es más estable que cualquier otro en este conjunto de muestra. El formato Crossmab <Lag3> monovalente (0799) todavía muestra una tasa de disociación más lenta que cualquier otra muestra en este experimento.

Además, se observó que el complejo ECD Lag3 - Lag3-0414/Lag3-0927 afín es el más débil de los observados en este experimento. Las porciones de unión afines de 0414 y 0416 son aproximadamente comparables a las porciones afines de sus homólogos Crossmab monovalentes 0927 y 0799. Los resultados se indican en la tabla 22.

Tabla 22: calidad de unión de anticuerpos biespecíficos para PD1-LAG3 determinada por medición de SPR

Evaluación de la avidez de los formatos trans en comparación con los anticuerpos biespecíficos 1 10927 y 0799:

Se determinaron las constantes de disociación de las moléculas biespecíficas (muestra) y sus dianas individuales, así como una combinación de PD1 y LAG3 (analito) para evaluar la ganancia de avidez proporcionada por la unión con todas las valencias al mismo tiempo.

Antes de la medición en un Biacore 8K, se preparó un chip sensor CM5 usando el kit de acoplamiento de amina estándar proporcionado por GE Healthcare. Por lo tanto, se diluyó un anticuerpo de producción interna dirigido contra una mutación específica en la parte Fc de la muestra (es decir, una parte Fc que porta las mutaciones PGLALA), denominado en el presente documento anticuerpo anti-PGLALA (dichos anticuerpos se describen en el documento WO 2017/072210), a una concentración de 50 |jg/ml en tampón acetato pH 5,0. Se acopló a todas las celdas y canales de flujo a una velocidad de flujo de 8 jl/m in durante 1200 s, proporcionando una respuesta de unión de aproximadamente 19000 UR.

Se usó tampón HBS-EP+ (GE HC) como tampón de migración para la preparación del chip sensor, así como para propia ejecución principal. El análisis comenzó después de un arranque que consistió en tres inyecciones de muestra de 17 s de duración seguido de una etapa de regeneración utilizando una solución de NaOH de 10 mM. En una primera etapa, se capturaron las diferentes muestras por el anticuerpo anti-PGLALA en la celda de flujo de los dos canales individuales en la superficie del chip sensor inyectándolo durante 17 s a un caudal de 10 jl/min. En segundo lugar, se inyectó uno de los tres analitos (PD1, LAG3-Fc, fusión 2+2 PD1/LAG3-Fc) en ambas celdas de flujo durante 200 s a un caudal de 50 jl/min, seguido de una fase de disociación de 1000 s de duración (600 s en el caso de LAG3-Fc). Finalmente, se disolvió el complejo anticuerpo anti-PGLALA/muestra por dos inyecciones consecutivas (30 s de duración) de NaOH 10 mM. Cada determinación cinética individual consistió en cuatro ciclos con diferentes concentraciones de analito (0 nM, 5 nM, 25 nM y 100 nM).

Los datos resultantes se evaluaron usando el programa informático de 8K Evaluation de Biacore. Se aplicó un ajuste de disociación 1:1 y se convirtieron los valores kd resultantes en semivida de complejo en minutos. Se calculó la diferencia entre la unión de avidez de la molécula de unión a antígeno de fusión PD1/Lag3-Fc y su principal contribuyente individual (PD1 o bien Lag3) y se separó en una de tres categorías que describen la ganancia de estabilidad por unión multivalente y biespecífica (tabla 23).

Tabla 23: incremento de la estabilidad del complejo proporcionada por la avidez de anticuerpos biespecíficos para PD1-LAG3 determinada por medición de<s>P<r>

11.3 Dimerización de PD1 y LAG3 celulares después del acoplamiento simultáneo por medio de anticuerpos biespecíficos anti-PD1 / anti-LAG3 biespecíficos

Se generaron anticuerpos anti-PD1 / anti-LAG3 biespecíficos en diversos formatos como se describe en el ejemplo 10. Este ensayo celular se usó para demostrar la dimerización o, por último, la unión/interacción de dos receptores diferentes, que se fusionan citosólicamente con dos fragmentos de una enzima, tras la ligación o reticulación con un anticuerpo biespecífico contra ambas dianas. Por esto, únicamente un receptor solo no muestra actividad enzimática. Para esta interacción específica, los extremos C terminales citosólicos de ambos receptores se fusionaron individualmente a subunidades heterólogas de una enzima indicadora. Una única subunidad enzimática sola no mostró actividad indicadora. Sin embargo, se esperaba que la unión simultánea de una construcción de anticuerpo biespecífico anti-PD1 / anti-LAG3 a ambos receptores diera lugar a la acumulación citocólica local de ambos receptores, la complementación de las dos subunidades enzimáticas heterólogas y, finalmente, diera como resultado la formación de una enzima específica y funcional que hidroliza un sustrato generando de este modo una señal quimioluminiscente.

Para analizar el efecto de reticulación de los anticuerpos anti-PD1 / anti-LAG3 biespecíficos, se sembraron 10.000 células U2OS humanas PD1+ LAG3+/pocillo en placas de 96 pocillos con fondo plano blancas (costar, n.° cat. n.° 3917) y se cultivaron durante la noche en medio de ensayo. Al día siguiente se desechó el medio celular y se reemplazó por medio nuevo. Se prepararon diluciones de anticuerpos o ligandos y se añadieron cantidades valoradas de anticuerpos (biespecíficos) indicados y se incubó a 37 °C durante 2 horas. A continuación, se añadió una mezcla de sustrato/tampón (por ejemplo, reactivo de detección PathHunterFlash) y se incubó de nuevo durante 1 h. Para medir la quimioluminiscencia inducida tras la unión y dimerización simultáneas se usó un lector Tecan Infinite.

Los resultados se muestran en las figuras 5A y 5B. Se representa la quimioluminiscencia (medida en UR) frente a la concentración de anticuerpo. Los anticuerpos anti-LAG3 monoespecíficos (bivalentes) no pudieron provocar una señal de quimioluminiscencia, mientras que todos los anticuerpos anti-PD1 / anti-LAG3 biespecíficos indujeron una señal de quimioluminiscencia de manera dependiente de la concentración.

Para demostrar la especificidad de la unión simultánea (e inducción de una señal de luminiscencia) se realizó un experimento de competencia: como se muestra antes, el tratamiento con un anticuerpo biespecífico (1252) indujo una señal de luminiscencia de forma dependiente de la dosis (figura 5C). Si se proporcionó el mismo anticuerpo biespecífico en presencia de un anticuerpo aLAG3 (0156, MDX25F7) o un anticuerpo anti-PD1 (0376), la señal casi se inhibió (para la competencia de PD1) o bien se redujo al menos significativamente (LAG3). Ambos anticuerpos originales son las mismas proteínas fijadoras que se comprenden en el anticuerpo biespecífico (1252, formato LAG3/PD1 2+1). Los anticuerpos competidores se suministraron cada uno a una concentración constante de 20 |jg/ml.

Los resultados de otro experimento se muestran en la figura 5D. De manera similar al experimento de competencia previo, la incubación con anticuerpos aLAG3 (0156) o PD1 originales (0376; cada uno constantemente a 10 jg/ml) tuvo un efecto sobre las propiedades de unión del anticuerpo biespecífico (1252, formato 2+1 de aLAG3-0156 y PD1-0376 biespecíficos) para células con doble expresión de PD1 Lag3, como se mide por la señal de luminiscencia. La competencia con el anticuerpo anti-PD1 (0376) y también la proteína LAG3:Fc recombinante (0160) casi suprimió la señal, mientras que la presencia de la única proteína fijadora aLAG3 (0156) solo dio lugar a una inhibición parcial. Los otros dos anticuerpos anti-LAG3, 0414 y 0416, que se unen a un epítopo diferente de 0156, no compitieron por la unión con el anticuerpo biespecífico que comprende la proteína fijadora aLAG3 (0156), porque no modularon la señal significativamente.

En otro experimento, se comparó la unión simultánea de anticuerpos anti-LAG3/anti-PD1 biespecíficos que comprenden diferentes proteínas fijadoras aLAG3 (0414 frente a 0416) y diferentes formatos (1 1 frente a 2+1) (figuras 6A a 6D). Como se describe anteriormente, se sometieron a prueba varios anticuerpos biespecíficos anti-LAG3/anti-PD1, en formato 1: 1 CrossMab (0799 y 0927) o bien en formato 2:1 (dos brazos de unión a Lag3 y un fragmento crossFab PD1 fusionado en el extremo C: 8311 y 8310). En las figuras 6A y 6B se muestran las curvas (absorbancia frente a concentración) para las construcciones con proteína fijadora aLAG3-0416 y en las figuras 6C y 6D las de las correspondientes construcciones con aLAG4-0414. Todas las construcciones sometidas a prueba se pudieron unir a las células e inducir quimioluminiscencia. Los valores de CE<50>calculados para las curvas de unión se muestran en la tabla 24 a continuación.

Tabla 24: valores de CE<50>como se mide en el ensayo de unión por dimerización

En otro experimento, se comparó la unión simultánea de anticuerpos anti-LAG3/anti-PD1 biespecíficos que comprenden diferentes proteínas fijadoras aLAG3 (0414 frente a 0416) y diferentes formatos (2+1 frente a 2+2) (figuras 7A a 7D). Se sometieron a prueba anticuerpos biespecíficos anti-LAG3/anti-PD1, en formato 2+1 (dos brazos de unión a LAG3 y un fragmento crossFab PD1 fusionado en el extremo C: 8311 y 8310) o bien en formato 2+2 crossmab (dos brazos de unión a LAG3 y dos fragmentos crossFab PD1 fusionados en el extremo C: 8970 y 8984). En las figuras 7A y 7B se muestran las curvas (absorbancia frente a concentración) para las construcciones con proteína fijadora aLAG3-0414 y en las figuras 7C y 7D las de las correspondientes construcciones con aLAG4-0416. Todas las construcciones sometidas a prueba se pudieron unir a las células e inducir quimioluminiscencia. Los valores de CE50 calculados para las curvas de unión se muestran en la tabla 25 a continuación.

Tabla 25: valores de CE<50>como se mide en el ensayo de unión por dimerización

Anticuerpo biespecífico Formato PM [kD] CE50 [pM]

En otro experimento, se comparó la unión simultánea del anticuerpo biespecífico anti-LAG3/anti-PD1 PD1/LAG3 0927 en el formato 1 1CrossMAbvh-VLclásico con los anticuerpos anti-LAG3/anti-PD1 biespecíficos en el formato 1 1 trans (PD1/LAG3 0725) y el formato 2+1 trans (PD1/LAG3 0750). Para este experimento, se aplicaron los siguientes cambios en el procedimiento. Para analizar el efecto de reticulación de los diferentes formatos de anticuerpo anti-LAG3/anti-PD1, se sembraron 7500 células U2OS humanas PD1 LAG3+/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano blancas conjuntamente con diluciones no seriadas de anticuerpos (concentración final de 0,29 pM a 5484 pM) y se incubó durante 20 h a 37 °C en estufa de incubación con CO<2>. A continuación, se equilibraron las placas de ensayo a temperatura ambiente y se añadió una mezcla de sustrato/tampón (reactivo de detección PathHunterFlash, Discoverx) y se incubó de nuevo durante 4 h. Para medir la quimioluminiscencia inducida tras la unión y dimerización simultáneas se usó un lector de placas SpectraMax L (Molecular Devices).

En la Figura 7E se representan curvas dosis-respuesta (luminiscencia frente a concentración) de los anticuerpos biespecíficos para PD1-LAG31 1 CrossMab (0927), 1 1 trans CrossMab con aPD1 N terminal y aLAG3 C terminal (0725) así como 2+1 trans CrossMab con Apd1 N terminal y aLAG3 N más C terminal (0750). En comparación con PD1/LAG3 0927, el efecto de reticulación del receptor PD1 LAG3 de PD1/LAG3 0725 es claramente mayor, mientras que es ligeramente menor para PD1/LAG3 0750.

11.4 Medición de variantes CrossMab trans anti-LAG3/anti-PD1 biespecíficas en un ensayo de indicador combinado PD-1 y LAG-3

Para someter a prueba la potencia neutralizante de los diferentes formatos de anticuerpos anti-PD1-LAG3 en el restablecimiento de una respuesta de linfocitos T suprimidain vitrose usó un sistema de indicador disponible comercialmente. El bioensayo combinado PD1 y LAG3 consiste en células indicadoras que expresan PD1, LAG3 y el receptor de linfocitos T (TCR), células tumorales que expresan MHC-II y PDL1 y un antígeno activador de TCR.

Las células efectoras son linfocitos T Jurkat que expresan PD1 humana, LAG3 humana, un TCR humano y un indicador de luciferasa impulsado por un elemento de respuesta NFAT (NFAT-RE). Las células diana son células A375 que expresan PD-L1 humano. En resumen, el sistema de indicador se basa en tres etapas: (1) Activación de células NFAT inducida por antígeno activador de TCR, (2) inhibición de la señal activadora mediada por la interacción entre MHCII (células A375) y LAG3+ (células Jurkat), así como PD-L1 (células A375) y PD1 (células Jurkat), y (3) recuperación de la señal de activación de NFAT por anticuerpos neutralizantes/antagonistas de PD1 y LAG3.

Para este experimento, se incubaron 1 x 104 células diana A375 por pocillo durante la noche con antígeno activador de TCR (Promega) en placas de ensayo de fondo plano de 96 pocillos en una estufa de incubación de CO<2>a 37 °C. A continuación, se retiraron los medios de las placas y se añadieron diluciones seriadas (concentración de ensayo final de 0,01 nM a 857 nM) de anticuerpos anti-LAG3/anti-PD1, así como 5 x 104 células efectoras Jurkat por pocillo. Después de 6 horas de incubación a 37 °C en una estufa de incubación con CO<2>, se equilibraron las placas de ensayo hasta temperatura ambiente y se añadieron 80 |jl de sustrato ONE-Glo Ex (Promega) a cada pocillo. Después de 10 min de incubación, se midió la luminiscencia en un lector de placas SpectraMax L (Molecular Devices). Se esperaba que la unión simultánea de una construcción de anticuerpo biespecífico anti-PD1 / anti-LAG3 a ambos receptores diera lugar a la acumulación citocólica local de ambos receptores, la complementación de las dos subunidades enzimáticas heterólogas y, finalmente, diera como resultado la formación de una enzima específica y funcional que hidroliza un sustrato generando de este modo una señal quimioluminiscente. En la Figura 7F se representan curvas dosis-respuesta (luminiscencia frente a concentración) de los anticuerpos biespecíficos anti-PD1/anti-LAG3 1+1 CrossMab (0927), 1 1 trans CrossMab con aPD1 N terminal y aLAG3 C terminal (0725) así como 2+1 trans CrossMab con aPD1 N terminal y aLAG3 N más C terminal (0750). La capacidad de 0927 y 0725 para recuperar la activación de células indicadoras bloqueando la interacción de PD1 y LAG3 con sus respectivos ligandos es comparable, mientras que es mayor para 0750. Esto se indica además por los valores de CE<50>enumerados en la tabla 26.

Tabla 26: valores de CE<50>como se mide en el ensayo de indicador combinado PD-1 y LAG-3

Ejemplo 12

Caracterización funcional de anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos

12.1 Internalización reducida tras la unión a la superficie de linfocitos T

Medición de la internalización del receptor por citometría de flujo

La internalización representa un deterioro importante para la molécula que se puede degradar en pocas horas mientras los receptores seleccionados se reexpresan rápidamente en la superficie celular listos para inhibir la señalización de TCR. Por lo tanto, se evaluó la internalización del receptor tras la unión de las construcciones de la invención por citometría de flujo, donde se usaron muestras teñidas con diferentes formatos biespecíficos a 4 °C como referencia para la comparación con muestras incubadas a 37 °C durante 3 horas después de la tinción a 4 °C.

Durante tres días, se incubaron linfocitos T CD4 policlonalmente activadas, previamente cultivados con 1 |jg/ml de anticuerpos anti-CD3 unidos a placa y 1 jg/m l de anti-CD28 solubles, en presencia de anticuerpos biespecíficos anti-LAG3 o bien anti-PD1/anti-LAG3 (por duplicado) durante 30 minutos a 4 °C. A continuación, se lavaron las células y se dividieron en dos grupos, de los que uno se incubó durante 3 horas adicionales a 37 °C y el otro se tiñó de inmediato con un anticuerpo secundario marcado (eBioscience) antes de fijarlo con BD Cell Fix. Después de incubaciones de 3 horas, también se tiñó el segundo grupo de las células con el anticuerpo secundario marcado antes de la fijación. Después de la tinción, se lavaron las células dos veces con PBS/FCS al 2 % antes de la adquisición.

Se adquirieron las células en LSRFortessa (BD Biosciences) y se compararon los niveles de expresión del anticuerpo detectable en la superficie celular entre los dos grupos. Los resultados se muestran en la figura 8B. Se observó que después de 3 horas todos los formatos biespecíficos así como el anticuerpo aLAG-3 bivalente monoespecífico se habían internalizado, sin embargo los anticuerpos anti-PD1/anti-LAG3 biespecíficos en el formato 1 1 (PD1/LAG30799 y PD1/LAG30927) fueron los menos internalizados.

Visualización de la localización e internalización de anticuerpos por microscopía confocal de fluorescencia

Se tiñeron linfocitos positivos para CD4 con CMFDA (Invitrogen) y se plaquearon en cubreobjetos redondos tratados con retronectina (Takara Bio). Se dejó que las células se adhirieran durante 4 horas a 37 °C antes de que los anticuerpos marcados con fluorescencia (1 jg/ml: a-LAG3 (1256), 11 PD1/LAG3 biespec. (0927), PD1-LAG3 1 2 biespec. (8310) y PD1-LAG322 biespec. (8970) marcados con Alexa 647) se añadieran directamente al medio de crecimiento durante diferentes duraciones (15 min, 1 hora y 3 horas). Se usó PBS frío (Lonza) para desactivar la reacción y para separar por lavado los anticuerpos no unidos. A continuación, se fijaron las células con Cytofix (BD) durante 20 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con PBS (Lonza). A continuación, los cubreobjetos se transfirieron y se montaron en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G (eBioscience) y se mantuvieron en la oscuridad a 4 °C durante la noche antes de la formación de imágenes. A) Las imágenes fluorescentes se muestran en la figura 9A. La señal blanca representa la localización del anticuerpo marcado. B) Se dividió la intensidad de la señal fluorescente de la ROI de membrana, de células altamente seleccionadas, entre la intensidad de la señal fluorescente de la ROI del citoplasma de las mismas células, dando como resultado una proporción presentada en los gráficos de recuadros. Para comparar muestras se usó el análisis ANOVA unidireccional con LSD de Fisher no corregido (* = p < 0,05; ** = p < 0,01). Los resultados se muestran en la figura 9B. El análisis con el tiempo muestra mayor localización de membrana en los anticuerpos biespecíficos y anticuerpos LAG3 en comparación con la agrupación intracelular de anticuerpos TIM3 (usados como control). Se observó que después de 3 horas todos los formatos biespecíficos así como el anticuerpo aLAG-3 bivalente monoespecífico se habían internalizado con la única excepción del 1 1 PD1/LAG3 biespec. (0927) (figura 9A).

Se realizó la microscopía confocal de fluorescencia con un LSM 700 invertido de Zeiss con un objetivo de aceite de 60x. Se obtuvieron imágenes usando el programa informático Zen (Zeiss) acoplado al microscopio. Se realizó el análisis de las imágenes con el programa informático Imaris (Bitplane; Oxford Instrument) y se realizó el análisis estadístico con GraphPad Prism (Graphpad Software).

12.2 Unión a linfocitos T convencionales frente a Treg

Una propiedad deseada del BsAb PD1-LAG3 principal es la capacidad de unirse preferentemente a linfocitos T convencionales en lugar de a Treg, porque LAG3 en Treg parece regular negativamente su función supresora. Por lo tanto, seleccionar LAG3 en Treg con anticuerpos de bloqueo podría ser perjudicial al incrementar su función supresora y finalmente enmascarar el efecto de bloqueo positivo 3 en otros linfocitos T. Por lo tanto, se evaluó la unión competitiva de los diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos anti-PD1/anti-LAG3 a linfocitos T convencionales y reguladores activadas cultivados juntos.

Se separaron linfocitos T reguladores (Treg) y linfocitos T convencionales (Tconv) de PBMC de donantes sanos (Miltenyi), se marcaron con tintes de membrana CellTraceViolet o CFSE 5 mM respectivamente y se cultivaron conjuntamente a una proporción 1:1 durante 3 días con 1 |jg/ml de anticuerpos anti-CD3 unido a placa y 1 |jg/ml de anti-CD28 solubles. El día 3, se incubaron las células durante 30 min a 4 °C con anticuerpos directamente marcados anti-PD1, anti-LAG3 o bien biespecíficos, fijados con BD Cell Fix y adquiridos en LSRFortessa (BD Biosciences).

Aunque el anticuerpo original anti-LAG3 monoespecífico se une igualmente bien a Treg y a linfocitos T convencionales (figura 10A), el homólogo anti-PD1 se une preferentemente a linfocitos T convencionales debido a mayores niveles de expresión de PD1 en linfocitos T efectores que en Treg (figura 10B). Curiosamente, el formato 1 1 del anticuerpo biespecífico para PD1/LAG3 (0927) también conservó la capacidad de unirse preferentemente a linfocitos T convencionales que a Treg (figura 10C). Esta unión preferencial a linfocitos T convencionales también se puede visualizar al representar la diferencia (delta) de la señal en linfocitos T convencionales frente a la de Treg (figura 10D). Los formatos 2+1 y 2+2 no mostraron una selectividad impulsada por avidez por linfocitos T efectores y son comparables en su unión al anticuerpo anti-LAG3 monoespecífico.

12.3 Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la supresión de Treg de la liberación de granzima B e IFN-y por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con PBMC alogénicas irradiadas

Se evaluó además si las diferencias en la propiedad de unión de los formatos de anticuerpos biespecíficos proporcionarían alguna ventaja funcional a Tconv sobre Treg. En estudios funcionales que implican ensayos de supresión de linfocitos T reguladores (Treg), las PBMC del mismo donante se dividieron en dos muestras: una estaba enriquecida con linfocitos T CD4 y la otra con Treg definidos como linfocitos T CD4+CD25alto CD127bajo por medio de un kit de microesferas (Miltenyi Biotec). Una vez purificadas las dos poblaciones, los linfocitos T CD4 se marcaron con 5 jM de carboxifluoresceína-éster succinimidílico (CFSE) mientras que los Treg se marcaron con 5 jM de Cell-Trace-Violet (CTV) para poder distinguirlos posteriormente en FACS.

A continuación, tanto los linfocitos T CD4 (105) como Treg (105) se cocultivaron en una placa de 96 pocillos en una proporción 1:1 conjuntamente con PBMC irradiadas (105) de un donante no relacionado en presencia o ausencia de anticuerpos anti-LAG3 (0414 principal y 0416 de segunda generación) o anticuerpos anti-LAG3 competidores (BMS-986016 y BAP050 humanizado) de la invención en combinación con el anticuerpo anti-PD1 de la invención a la concentración de 10 jg/ml. Como control para estimar la magnitud de la supresión de las funciones efectoras de linfocitos T CD4 por Treg, los linfocitos T CD4 (105) también se cocultivaron con PBMC irradiadas (105) en ausencia de Treg.

Cinco días después, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular, usados después para medir los niveles de IFN-y por ELISA (R&D Systems), y se dejaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales en presencia de Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina). A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFNy (eBioscience). Los resultados se muestran en la figura 11.

El anticuerpo biespecífico para PD1/LAG-3 de la invención (0927) provocó que Tconv escapara del estricto control de los linfocitos T reguladores, como se demostró por la secreción de una cantidad significativamente mayor de granzima B que Tconv en presencia del anticuerpo anti-PD1 original o Pembrolizumab solo (P<0,05) o en ausencia de inhibidores del punto de control (P<0,001). El anticuerpo anti-LAG3 competidor BMS-986016 en combinación con Nivolumab no rescató significativamente las funciones efectoras de Tconv de la supresión de Treg.

12.4 Efecto de anticuerpos biespecíficos PD-1/LAG-3 sobre la liberación de granzima B citotóxica por linfocitos T CD4 humanos cocultivados con una línea celular linfoblatoide-linfocitos B (ARH77)

Se evaluó la capacidad de los diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos de la invención para inducir la secreción de granzima B por linfocitos T CD4, cuando se cocultivan con la línea celular tumoral ARH77, en comparación con la combinación de anticuerpos originales anti-PD-1 y anti-LAG-3 y con anticuerpos anti-PD1 usados en el tratamiento de referencia.

En total se sometieron a prueba 6 formatos, 3 generados a partir de la combinación de anticuerpos anti-PD1(0376) y anti-LAG3 (hu 1256, chi 0414) y 3 formatos adicionales de anticuerpos anti-PD1(0376) y anti-LAG-3 (hu1257, chi 0416).

Como se puede observar en la figura 13, dos formatos biespecíficos, 1 1 (0927) y 2+2 (8970) generados de anti-LAG3 (hu 1256, anti-LAG3 0414 como IgG1 PGLALA) y anti-PD1 (0376) y así como la combinación de los anticuerpos originales potenciaron significativamente la secreción de granzima B por linfocitos T CD4 en comparación con los linfocitos T CD4 no tratados (P = 0,0005,P= 0,01 yP= 0,0001 respectivamente). El correspondiente formato 2+1 (8310) mostró una tendencia similar, sin embargo no alcanzó significación estadística (P=0,07).

Con respecto a los anticuerpos biespecíficos generados combinando anti-LAG-3 (hu 1257, anti-LAG3 0416 como IgG1<p>G<l>ALA) con anti-PD1(0376), el formato 1 1 (0799) y 2+2 (8984) incrementaron significativamente las frecuencias de linfocitos T CD4 positivos para granzima B en comparación con células CD4 no tratadas (P = 0,0032 yP= 0,0064 respectivamente).

Ni Nivolumab ni Pembrolizumab promovieron significativamente una mayor secreción de granzima B por linfocitos T CD4 en comparación con células cultivadas en ausencia de inhibidores del punto de control. (Figura 13). Tabla 27: efecto de los anticuerpos biespecíficos para PD1-LAG3 sometidos a prueba sobre la liberación de granzima B citotóxica

12.5 Efecto del bloqueo de PD-1 y LAG-3 sobre la secreción de granzima B e IFN-y por linfocitos T CD4 de PBMC de pacientes con melanoma después de la recuperación con grupos de péptidos de antígeno de melanoma inmunógeno

Se ha descrito previamente que las PBMC de pacientes con melanoma contienen frecuencias detectables de linfocitos T específicos de antígeno tumoral. Por lo tanto, para propósitos de viabilidad, se sometieron a prueba la combinación de anticuerpo anti-LAG-3 (0414) más anti-PD-1 (0376) frente al anticuerpo biespecífico derivado en formato 1 1 (0927) o anti-PD-1 solo en PBMC de pacientes con melanoma reestimuladas durante la noche con grupos de péptidos de antígenos inmunógenos asociados a melanoma.

Se incubaron de 105 a 106 PBMC de pacientes con melanoma a temperatura ambiente en presencia o ausencia de concentraciones de saturación (10 |jg/ml) de anti-PD-1 solo (0376), en combinación con anticuerpo anti-LAG-3 (0414, 10 jg/m l) o como anticuerpo biespecífico de formato 1 1 (0927, 20 jg/ml). A continuación, los linfocitos T se volvieron a estimular durante la noche con un grupo de antígenos relacionados con el tumor inmunógeno como MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/MART-1, NYESO-1, proteína de melanocitos Pmel 17 gp100, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa 2 en presencia de inhibidores del transporte de proteínas Golgi Plug (Brefeldin A) y Golgi Stop (monensina).

A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpo anti-CD4 humano y el tinte Live/Dead Fixable Aqua (Invitrogen) antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Se realizó tinción intracelular para granzima B (BD Bioscience) e IFN-y (eBiociencia).

Tanto la combinación de anticuerpos anti-LAG-3 como anti-PD-1 (P<0,01 y P<0,001) y el anticuerpo biespecífico potenciaron significativamente (P<0,01 y P<0,0001) las funciones efectoras de linfocitos T específicos de antígeno tumoral (es decir, secreción de granzima B e IFN-y), mientras que el bloqueo de PD-1 solo no mostró ningún efecto (figura 12).

Ejemplo 13

Efecto antitumoral potente por politerapia de anticuerpos biespecíficos para PD1/LAG3 y CEACAM5 CD3 TCBin vivo

Las moléculas de TCB se han preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 2014/131712 A1 o el documento WO 2016/079076 A1. La preparación del anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 (CEA CD3 TCB o CEA TCB) usado en los experimentos se describe en el ejemplo 3 del documento WO 2014/131712 A1. CEA CD3 TCB es un anticuerpo "2+1 IgG CrossFab" y está compuesto de dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes. Se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio CH3 ("botones en ojales") para promover el ensamblaje de las dos cadenas pesadas diferentes. Se realizó un intercambio de los dominios VH y VL en el Fab de unión a CD3 para promover el ensamblaje correcto de las dos cadenas ligeras diferentes. 2+1 quiere decir que la molécula tiene dos dominios de unión a antígeno específicos para CEA y un dominio de unión a antígeno específico para CD3. CEA CD3 TCB comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 149. CEACAM5 CD3 TCB tiene el mismo formato, pero comprende otra proteína fijadora de CEA y comprende mutaciones puntuales en los dominios CH y CL de la proteína fijadora de CD3 para soportar el emparejamiento correcto de las cadenas ligeras. CEACAM5<c>D TCB comprende las secuencias de aminoácidos de<s>E<q i>D NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO:153.

a)Material y procedimientos experimentales

El anticuerpo biespecífico para PD1/LAG30927 se sometió a prueba en una concentración de 1,5 mg/kg o 3 mg/kg en combinación con el CEACAM5 CD3 TCB humano en un modelo de cáncer BXPC3 de páncreas humano. Se coinjertaron células BXPC3 por vía subcutánea con una línea celular de fibroblastos de ratón (3T3) en ratones humanizados NSG.

Preparación de la línea celular BXPC3: Se obtuvieron originalmente células BXPC3 (células de cáncer de páncreas humano) de ECACC (European Collection of Cell Culture) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno Glycart. Se cultivaron células BXPC3 en RPMl que contenía FCS al 10 % (PAA Laboratories, Austria) y Glutamax al 1 %. Se cultivaron las células a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO<2>al 5 %.

Producción de ratones totalmente humanizados: Se mantuvieron ratones NSG hembra, de 4-5 semanas de edad al inicio del experimento (Jackson Laboratory), en condiciones sin patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). Se revisó el protocolo de estudio experimental y se aprobó por el gobierno local (P 2011/128). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo de manera regular. A ratones NSG se les inyectó i.p. 15 mg/kg de busulfano, seguido un día después por una inyección i.v. de 1x105 células madre hematopoyéticas humanas aisladas de sangre del cordón umbilical. En la semana 14-16 después de la inyección de células madre, se extrajo sangre de los ratones por vía sublingual y se analizó la sangre por citometría de flujo para determinar la humanización satisfactoria. Se aleatorizaron los ratones injertados eficazmente de acuerdo con sus frecuencias de linfocitos T humanos a los diferentes grupos de tratamiento.

Experimento de eficacia: Se expuso a ratones HSC-NSG completamente humanizados por vía subcutánea con 1 x 106 células BXPC3 (línea celular de carcinoma pancreático humano, que expresa CEACAM5) el día 0 en presencia de matrigel en proporción 1:1. Se midieron los tumores de 2 a 3 veces por semana durante todo el experimento por un calibrador. El día 15, se aleatorizaron los ratones por tamaño tumoral, con un tamaño tumoral promedio de 250 mm3 y se inició un tratamiento programado semanal (vehículo (tampón de histidina), anti-PD1(0376), Nivolumab, Pembrolizumab o anti PD1-LAG30927) y se suministró por inyección intraperitoneal en un máximo de 400 |jl. Se midió el crecimiento tumoral 2-3 veces por semana usando un calibrador y se calculó el volumen tumoral como sigue:

Tv: (W2/2) x L (W: anchura, L: longitud)

El estudio finalizó el día 47.

b) Resultados

Las mediciones de volúmenes tumorales (mm3 /- EEM), durante un período de 47 días, se muestran como volumen medio dentro del respectivo grupo de tratamiento de ratones en la figura 14. El tratamiento con CEACAM5-TCB sólo muestra una progresión de enfermedad idéntica al grupo de vehículo no tratado. Por el contrario, Nivolumab y Pembrolizumab redujeron el crecimiento del tumor, sin embargo, sin alcanzar el control del crecimiento tumoral. Sorprendentemente, el anticuerpo biespecífico para PD1/LAG30927, a una concentración de 3 mg/kg, suprimió totalmente el crecimiento tumoral en todos los animales tratados, mostrando sinergismo del cobloqueo de LAG-3 además de PD-1.

En las figuras 15A a 15F las mediciones de volúmenes tumorales (mm3 /- EEM), durante un período de 47 días, se muestran para cada animal individual mostrando la homogeneidad de la respuesta antitumoral en cada grupo.

La significación estadística se calculó usando el procedimiento de Dunnett contra el tratamiento único de CEACAM5 CD3 TCB. Para someter a prueba las diferencias significativas en las medias de grupo para comparaciones múltiples, se produce automáticamente el análisis de varianza estándar (ANOVA), usando el procedimiento de Dunnett. El procedimiento de Dunnett prueba si las medias son diferentes de la media de un grupo de control.

Los valores de TGI y TCR resultantes se muestran en la tabla 28 (TGI quiere decir inhibición del crecimiento tumoral, TGI> 100 quiere decir regresión tumoral y TGI = 100 se define como estasis tumoral, TCR quiere decir proporción tratamiento con respecto a control, TCR = 1 quiere decir sin efecto y TCR = 0 se define como regresión completa).

Tabla 28: inhibición del crecim iento tumoral (TGI) y proporción tratamiento con respecto a control (TCR) el día 46

La comparación con el control se muestra además como valores de lapusando el procedimiento de Dunnett.

El tratamiento con CEACAM5 CD3 TCB no puede controlar el crecimiento tumoral en el contexto de cáncer de páncreas. Sin embargo, su combinación con el anticuerpo biespecífico anti-PD1/LAG3 0927 da lugar a un fuerte impacto sobre el control tumoral de manera específica de la dosis. El análisis estadístico mostró que la combinación con anti-PD1/LAG3 0927, pero no con los anticuerpos anti-PD1 Nivolumab y Pembrolizumab, en ambas concentraciones, dio como resultado una diferencia estadística significativa en el control del crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento único, lo que sugiere la superioridad del anticuerpo anti-PD1/LAG3 biespecífico sobre la inhibición de solo PD1, llevando el crecimiento tumoral a la estasis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína de muerte celular programada 1 (PD1) y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente al gen de activación de linfocitos 3 (LAG3), en el que el anticuerpo biespecífico es bivalente y comprende un dominio Fc,

un primer fragmento Fab que comprende dicho primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y un segundo fragmento Fab que comprende el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que comprende un dominio Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que es una IgG, en particular un dominio Fc de IgG1 o un dominio Fc de IgG4 y en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular hacia el receptor de Fcy.

3. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc de subclase IgG1 humana con las mutaciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

4. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un dominio Fc que comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y segunda subunidad del dominio Fc.

5. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

6. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en uno de los fragmentos Fab los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí de modo que el dominio VH es parte de la cadena ligera y el dominio VL es parte de la cadena pesada.

7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5 o 6, en el que en el primer fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a PD1, los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

8. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento Fab en el que en el dominio constante CL el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

9. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que en el segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 en el dominio constante CL, el aminoácido en la posición 124 se sustituye independientemente por lisina (K), arginina (R) o histidina (H) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el dominio constante CH1 los aminoácidos en las posiciones 147 y 213 se sustituyen independientemente por ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

10. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.

11. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo biespecífico comprende un segundo fragmento Fab que comprende el dominio de unión a antígeno que se une específicamente a LAG3 que se fusiona al extremo C del dominio Fc.

12. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 u 11, que comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una primera cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, y una segunda cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101.

13. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un procedimiento de producción del anticuerpo biespecífico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo biespecífico y recuperar el anticuerpo biespecífico del cultivo.

16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso como medicamento.

18. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento del cáncer.

19. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento de una infección vírica crónica.

20. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso en la prevención o tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un agente quimioterápico, radiación y/u otros agentes para su uso en inmunoterapia contra el cáncer.

21. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer, en el que el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3.