ES2914225T3 - Análogos de cap de ARNm con enlace de fosfato modificado - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (I): **(Ver fórmula)** o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, donde: el anillo B1 es **(Ver fórmula)** en el que R1 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C6-C10, ariloxilo C6-C10, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano; cada uno de Ra y Rb es independientemente H o alquilo C1-C6; y Rc es H, NH2 o alquilo C1-C6; o Rc y uno de Ra y Rb, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6; el anillo B2 es una nucleobase o una nucleobase modificada; X2 es O, S(O)p, NR24 o CR25R26 en el que p es 0, 1 o 2; Y2 es -(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-, en el que Q0 es un enlace, O, S(O)r, NR44 o CR45R46, r es 0, 1 o 2, y cada uno de u y v independientemente es 1, 2, 3 o 4; R2 es halo, ácido nucleico bloqueado (LNA) u OR3; R3 es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R3, cuando es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2- C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6; cada uno de R20, R21, R22 y R23 es independientemente -Q3-T3, en el que Q3 es un enlace o enlazador alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, ciano, OH y alcoxi C1-C6, y T3 es H, halo, OH, NH2, ciano, NO2, N3, RS3 u ORS3, en el que RS3 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, NHC(O)- alquilo C1-C6, mono-alquilamino C1-C6, di-alquilamino C1-C6, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros o heteroarilo de 5 o 6 miembros, y RS3 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en halo, OH, oxo, alquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, ciano, alcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino C1-C6, di-alquilamino C1-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros y heteroarilo de 5 o 6 miembros; cada uno de R24, R25 y R26 es independientemente H o alquilo C1-C6; cada uno de R27 y R28 es independientemente H u OR29; o R27 y R28 juntos forman OR30-O; cada R29 es independientemente H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R29, cuando es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6; R30 es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6; cada uno de R40, R41, R42y R43 es independientemente H, halo, OH, ciano, N3, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, o un R41 y un R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Qo, forman cicloalquilo C4-C10, heterocicloalquilo de 4 a 14 miembros, arilo C6-C10 o heteroarilo de 5 a 14 miembros, y cada uno de los cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, N3, oxo, OP(O)R47R48, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino C1-C6 y di-alquilamino C1- C6; R44 es H, alquilo C1-C6 o un grupo protector de amina; cada uno de R45 y R46 es independientemente H, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, y cada uno de R47 y R48, independientemente es H, halo, alquilo C1-C6, OH, SH, SeH o BH3-.

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de cap de ARNm con enlace de fosfato modificad o

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad a, y el beneficio de, la Solicitud Provisional de los EE.UU. n.° 62/242.845, depositada el viernes, 16 de octubre de 2015.

ANTECEDENTES

La expresión de la información genética codificada por una secuencia de nucleótidos en el ácido desoxirribonucleico (ADN) requiere la biosíntesis de un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) complementario. Este evento de transcripción, que tiene lugar en el núcleo de las células eucariotas, va seguido de la translocación del ARNm al citoplasma, donde se carga en los ribosomas mediante un procedimiento complejo y altamente regulado. Aquí, la secuencia de nucleótidos, presentada como una serie de codones de tres nucleótidos, se traduce en una secuencia correspondiente de aminoácidos que finalmente produce la proteína correspondiente al código genético original. El ARNm exógeno introducido en el citoplasma puede ser aceptado en principio por la maquinaria ribosomal (véase, por ejemplo, Warren y col., Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA (Reprogramación altamente eficiente a pluripotencia y diferenciación dirigida de células humanas con ARNm sintético modificado), Cell Stem Cell (2010)). Si el ARNm codifica una proteína excretada, el ARNm modificado o exógeno puede dirigir la maquinaria celular del cuerpo para producir una proteína de interés, desde proteínas nativas hasta anticuerpos y otras construcciones de proteínas completamente novedosas, que pueden tener actividad terapéutica dentro y fuera de las células.

Existen dificultades con las metodologías anteriores para efectuar la expresión de proteínas. Hay una necesidad en la técnica de modalidades biológicas para abordar la modulación de la traducción intracelular de polinucleótidos.

W. Su y col describen, en RNA, vol. 17, n.° 5, 29 de marzo de 2011, páginas 978-988: "Translation, stability, and resistance to decapping of mRNAs containing caps substituted in the triphosphate chain with BH3, Se, and NH" ("Traducción, estabilidad y resistencia al decapping de ARNm que contienen cap sustituidas en la cadena de trifosfato con BH3, Se y NH"). El documento WO 2009/149253 A2 describe análogos de cap de ARNm. Malwina Strenkowska y col describen, en New Journal of Chemistry, vol. 34, n°. 5, 1 de enero de 2010, páginas 993-1007: "Towards mRNA with superior translational activity: synthesis and properties of ARCA tetraphosphates with single phosphorothioate modifications" ("Hacia un ARNm con actividad de traducción superior: síntesis y propiedades de los tetrafosfatos ARCA con modificaciones de fosforotioato individuales").

RESUMEN

La presente invención proporciona análogos de cap (caperuza) de ARNm como se define en las reivindicaciones adjuntas 1-9 y procedimientos para fabricarlos y usarlos. La presente descripción también proporciona ARNm que contiene los análogos de cap.

En un aspecto, la presente descripción presenta un compuesto de fórmula (I) a continuación o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo:

En la fórmula (I) anterior, el

anillo B¹ es

en el que

Ri es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C6-C10, ariloxilo C6-C10, heteroarilo de 5 a

10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano;

cada uno de Ra y Rb es independientemente H o alquilo C1-C6; y

Rc es H, NH2 o alquilo C1-C6; o Rc y uno de Ra y Rb, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6;

el anillo B2 es una nucleobase o una nucleobase modificada;

X2 es O, S(O)p, NR24 o CR25R26 en el que p es 0, 1 o 2;

Y2 es -(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-, en el que Qo es un enlace, O, S(O)r, NR44, o CR45R46, r es 0, 1 o 2, y cada uno de u y v independientemente es 1,2, 3 o 4;

R2 es halo, LNA u OR3;

R3 es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R3, cuando es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6;

cada uno de R20, R21, R22 y R23 es independientemente -Q3-T3, en el que Q3 es un enlace o enlazador alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, ciano, OH y alcoxi C1-C6, y T3 es H, halo, OH, NH2, ciano, NO2, N3,

Rs3 u ORs3, en el que Rs3 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, NHC(O)-alquilo C1-C6, mono-alquilamino C1-C6, di-alquilamino C1-C6, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros o heteroarilo de 5 o 6 miembros, y Rs3 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en halo, OH, oxo, alquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, ciano, alcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino

C1-C6, di-alquilamino C1-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros y heteroarilo de 5 o

6 miembros;

cada uno de R24, R25 y R26 es independientemente H o alquilo C1-C6;

cada uno de R27 y R28 es independientemente H u OR29; o R27 y R28 juntos forman O-R30-O;

cada R29 es independientemente H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R29, cuando es al alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6;

R30 es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6;

cada uno de R40, R41, R42y R43 es independientemente H, halo, OH, ciano, N3, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, o un R41 y un R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman cicloalquilo C4-C10, heterocicloalquilo de 4 a 14 miembros, arilo C6-C10 o heteroarilo de 5 a

14 miembros, y cada uno de los cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, ⁿ 3, oxo, OP(O)R47R48, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino C1-C6 y di-alquilamino C1-C6;

R44 es H, alquilo C1-C6 o un grupo protector de amina;

cada uno de R45 y R46 es independientemente H, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, y

cada uno de R47 y R48, independientemente es H, halo, alquilo C1-C6, OH, SH, SeH o BH3-.

La presente invención también proporciona una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm) cuyo extremo 5' contiene un compuesto de fórmula (I) como se define en las reivindicaciones adjuntas 10-17. También se proporciona una molécula de ARN que tiene un extremo 5' que comprende un compuesto de fórmula (III):

donde

indica un punto de unión.

También se proporciona en esta invención un kit para llevar a cabo el capping de un transcrito de ARN. El kit incluye un compuesto de fórmula (I) y una ARN polimerasa. El kit también puede incluir uno o más de nucleótidos, inhibidor de ribonucleasa, un tampón de enzima y un tampón de nucleótidos.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona procedimientos para sintetizar el compuesto de fórmula (I). En otro aspecto más, la presente descripción proporciona procedimientos para sintetizar una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm) in vitro. El procedimiento puede incluir hacer reaccionar ATP sin modificar o modificado, CTP sin modificar o modificado, UTP sin modificar o modificado, GTP sin modificar o modificado, un compuesto de fórmula (I) o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, y una plantilla de polinucleótido; en presencia de una ARN polimerasa; en condiciones conducentes a la transcripción por ARN polimerasa de la plantilla de polinucleótido en una o más copias de ARN; por lo que al menos algunas de las copias de ARN incorporan el compuesto de fórmula (I) o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo para formar una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm).

En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un compuesto (por ejemplo, un análogo de cap) o un polinucleótido que contiene el análogo de cap que tiene una afinidad de unión mejorada a eIF4E, una mayor resistencia a la degradación, o ambas, en comparación con, por ejemplo, las cap (caperuzas) de ARNm natural y ARNm naturales. Además, los compuestos o procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para investigación (por ejemplo, estudio de la interacción del transcrito de ARN in vitro con determinadas enzimas) y otros fines no terapéuticos.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. En la memoria descriptiva, las formas en singular también incluyen el plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Los antecedentes citados en esta invención no se admiten como estado de la técnica de la invención reivindicada. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto entre las estructuras químicas y los nombres de los compuestos descritos en esta invención, prevalecerán las estructuras químicas.

Otras características y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un gráfico de unidades de fluorescencia relativa (UFR) normalizadas frente a las concentraciones de los análogos de cap probados a partir de un ensayo de traducción libre de células.

La Figura 2 es un histograma de los niveles de hEPO medidos después de 3 horas de un ensayo de traducción libre de células que usa ARNm portadores de diferentes análogos de cap, comparando los niveles de hEPO normalizados para el % de capping obtenido usando un ARNm portador del Compuesto 7 con los de un ARNm portador de una cap (caperuza) de trifosfato ("Estándar" en la Fig. 2, con una estructura química de

El ARNm portador del Compuesto 7-cap muestra una expresión superior (comparable a la de ARCA1) en un sistema libre de células derivado de HeLa, en comparación con el análogo de trifosfato y/o Cap1. En esta Figura, "ARNm mod" se refiere a un ARNm modificado que comprende N1-metil pseudouridina, que reemplaza cada uridina en la secuencia de ARN.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente descripción proporciona novedosos análogos de cap de ARNm, procedimientos sintéticos para fabricar estos análogos de cap y usos de los mismos. La presente descripción también proporciona nuevas moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) que incorporan los análogos de cap descritos en esta invención que transmiten propiedades que son ventajosas para el desarrollo terapéutico.

El ARNm consiste en un marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por la región no traducida 5' y 3' (5'UTR, 3'UTR), una cola de monofosfato de poliadenosina (poliA) y una estructura de cap (caperuza) invertida que contiene N7-metilguanosina. Es química y enzimáticamente menos estable que el ADN correspondiente, por lo que la producción de proteínas posterior al reclutamiento ribosomal del ARNm es temporal. Además, el ARNm debe estar presente en una conformación denominada de "bucle cerrado" para la producción de la proteína diana. Mientras forma parte de la conformación activa de bucle cerrado, el ARNm entra en contacto con la maquinaria ribosómica a través de la cap que se une al factor de iniciación eucariótico 4E (eIF4E) y la cola poliA unida a través de la proteína de unión a poliA (PABP). El eIF4E y PABP están conectados a través de una proteína esquelética eIF4G que cierra el bucle activo. La interrupción de la forma circularizada del ARNm conduce al cese de la producción de proteínas y, finalmente, a la degradación enzimática del propio ARNm, principalmente por la acción del sistema enzimático de decapping DCP1/2 y/o mediante una desadenilación mediada por poliA ribonucleasa (PARN). Véase, por ejemplo, Richard J. Jackson y col., "The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation" ("El mecanismo de iniciación de la traducción eucariótica y principios de su regulación"), Molecular Cell Biology, vol. 110, 113-127, 2010.

La estructura cap es una característica crucial de todos los ARNm eucarióticos. Es reconocido por el complejo ribosomal a través del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E). Los ARNm que carecen del extremo 5'-cap no son reconocidos por la maquinaria de traducción y son incapaces de producir la proteína diana (véase, por ejemplo, Colin Echeverría Aitken, Jon R Lorsch: "A mechanistic Overview of Translation Iniciation in Eukaryotes" ("Una descripción mecanicista de la iniciación de la traducción en eucariotas"), Nature Structural and Molecular Biology, vol. 16, n.° 6, 568-576, 2012.)

El ARN mensajero sin procesar producido durante el procedimiento de transcripción ("transcripción primaria") se termina con un 5'-trifosfato, que se convierte en el respectivo 5'-difosfato por la acción de la enzima ARN-trifosfatasa. A continuación, una guanilil-transferasa une el monofosfato de guanosina invertida terminal al extremo 5', y una N7-metilación mediada por N7MTasa de la guanosina invertida terminal, completa el procedimiento de capping.

La estructura 5'-cap es vulnerable a la degradación enzimática, que es parte del mecanismo de regulación que controla la expresión de proteínas. Según esto, el sistema enzimático DCP1/2 realiza una hidrólisis de pirofosfato entre el segundo y el tercer grupo fosfato de la estructura de cap, eliminando el resto de difosfato de guanosina metilado en N7, dejando un ARNm terminado en un grupo 5'-monofosfato. Esto, a su vez, es bastante vulnerable a la escisión por exonucleasas y conducirá a una rápida descomposición del oligómero restante. Véase, por ejemplo, R. Parker, H. Song: "The Enzymes and Control of Eukaryotic Turnover" (Las enzimas y el control de la renovación eucariota"), Nature Structural & Molecular Biology, vol. 11, 121-127, 2004.

Los datos cristalográficos de rayos X de alta resolución del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) cocristalizado con P1-N7-metilguanosina-P3-adenosina-5',5'-trifosfato (N7GpppA) sugieren una estrecha interacción molecular entre la purina terminal y el resto trifosfato por un lado y la superficie receptora por el otro. Véase, por ejemplo, Koji Tomoo, y col., "Crystal structures of 7-methylguanosine 5'-triphosphate (m(7)GTP)- and P(1)-7-methylguanosine-P(3)-adenosine-5',5'-triphosphate (m(7)GpppA)-bound human full-length eukaryotic initiation factor 4E: biological importance of the C-terminal flexible region." ("Estructuras cristalinas del factor de iniciación eucariótico humano de longitud completa 4E unido a 7-metilguanosina 5'-trifosfato (m(7)GTP) y P(1)-7-metilguanosina-P(3)-adenosina-5',5'-trifosfato (m(7)GpppA): importancia biológica de la región flexible C-terminal"), Biochem. J. 362(Pt 3): 539-544, 2002. La guanina terminal se intercala entre dos cadenas laterales aromáticas de TRP56 y TRP102 y esta interacción de apilamiento n se estabiliza aún más mediante dos enlaces de hidrógeno entre los hidrógenos NH de N7-guanina y GLU103. Los dos primeros grupos fosfato interactúan con los residuos básicos de ARG112 y ARG157, así como con LYS162, ya sea directamente o a través de enlaces de hidrógeno mediados por agua. El tercer grupo fosfato forma un enlace de hidrógeno con el residuo básico de ARG112. En resumen, los datos cristalográficos de rayos X de alta resolución sugieren que tanto la guanina como el trifosfato hacen contacto directo con la proteína y contribuyen a la eficiencia de unión de los ARNm con capping.

El resto trifosfato de la estructura de cap eucariótica desempeña un papel importante en la unión al eIF4E, así como en la estabilidad del ARNm. Véase, por ejemplo, Anna Niedzwiecka y col., "Biophysical Studies of eIF4E Cap-binding Protein: Recognition of mRNA 50 Cap Structure and Synthetic Fragments of eIF4G and 4E-BP1 Proteins" ("Estudios biofísicos de la proteína de unión a cap de eIF4E: reconocimiento de la estructura de cap 50 del ARNm y fragmentos sintéticos de las proteínas eIF4G y 4E-BP1"), Journal of Molecular Biology, 319, 615-635, 2002. Además una hidrólisis mediada por DCP1/2 del enlace pirofosfato es el principal mecanismo de decapping. Véase, por ejemplo, Ewa Grudzien y col., "RNA: Structure, Metabolism, and Catalysis: Differential Inhibition of mRNA Degradation Pathways by Novel Cap Analogs." ("ARN: estructura, metabolismo y catálisis: inhibición diferencial de las vías de degradación del ARNm por novedosos análogos de cap"), Journal of Biological Chemistry, 281:1857-1867, 2006. Por consiguiente, la presente descripción se basa, al menos en parte, en la suposición de que la sustitución del fosfato central por grupos hidrófilos será capaz de mantener la afinidad con la cavidad de unión. Sin desear limitarse a la teoría, la sustitución de este fosfato con puentes que no son de fosfato podría disminuir la electrofilicidad general del grupo pirofosfato presente en los trifosfatos, y dado que el decapping requiere un ataque nucleofílico de una molécula de agua guiada por enzimas en el y-fosfato, esto a su vez dará como resultado estructuras de cap resistentes a la hidrólisis enzimática. La distancia entre nucleósidos se puede ajustar mediante la elección de un resto de tamaño apropiado que reemplace al trifosfato central, tales como los glicoles (por ejemplo, dietilen o trietilenglicoles). Además de la distancia, la orientación especial general de los dos nucleósidos puede alterarse mediante la inclusión de estructuras cíclicas tales como el ciclohexano-1,3-diol. La presencia de grupos hidrófilos tales como un sulfóxido (SO), sulfona (SO2) o incluso un fosfato puede facilitar la interacción con los grupos polares que recubren la cavidad de unión de eIF4E, manteniendo la estabilidad química y enzimática. Estas modificaciones químicas tendrán un impacto en la afinidad de unión de la cap (caperuza) con el eIF4E. Además del comportamiento de unión alterado, estas modificaciones químicas afectarán la afinidad de estas cap hacia el sistema enzimático DCP1/2, y potencialmente mejorarán la estabilidad del ARNm respectivo. Esto permitirá el desarrollo de SAR distinto y novedoso para estas nuevas estructuras de cap para la proteína eIF4E-cap y conducirá a cap de ARN mensajero con una unión mejorada de eIF4E y una mayor resistencia a la degradación, lo que a su vez puede resultar en una mayor tasa de traducción, mayor estabilidad de la conformación de "bucle cerrado" y la producción mejorada de proteínas diana de valor terapéutico.

En un aspecto, la presente descripción proporciona un compuesto (por ejemplo, un análogo de cap) de fórmula (I) a continuación o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo:

En la formula (I) anterior, el

anillo B¹ es

en el que

R1 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C6-C10, ariloxilo C6-C10, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano;

cada uno de Ra y Rb es independientemente H o alquilo C1-C6; y

Rc es H, NH2 o alquilo C1-C6; o Rc y uno de Ra y Rb, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6;

el anillo B2 es una nucleobase o una nucleobase modificada;

X2 es O, S(O)p, NR24 o CR25R26 en el que p es 0, 1 o 2;

Y2 es -(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-, en el que Q0 es un enlace, O, S(O)r, NR44 o CR45R46, r es 0, 1 o 2, y cada uno de u y v independientemente es 1,2, 3 o 4;

R2 es halo, LNA u OR3;

R3 es H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R3, cuando es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6;

cada uno de R20, R21, R22 y R23 es independientemente -Q3-T3, en el que Q3 es un enlace o enlazador alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, ciano, OH y alcoxi C1-C6, y T3 es H, halo, OH, NH2, ciano, NO2, N3, Rs3 u ORs3, en el que Rs3 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, NHC(O)-alquilo C1-C6, mono-alquilamino C1-C6, di-alquilamino C1-C6, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros o heteroarilo de 5 o 6 miembros, y Rs3 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en halo, OH, oxo, alquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, ciano, alcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino C1-C6, di-alquilamino C1-C6, cicloalquilo C3-C8, arilo C6-C10, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros y heteroarilo de 5 o 6 miembros;

cada uno de R24, R25 y R26 es independientemente H o alquilo C1-C6;

cada uno de R27 y R28 es independientemente H u OR29; o R27 y R28 juntos forman O-R30-O;

cada R29 es independientemente H, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 y R29, cuando es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6;

R30 es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C1-C6;

cada uno de R40, R41, R42y R43 es independientemente H, halo, OH, ciano, N3, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más ^o P^p (O)R47R48, o un R41 y un R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman cicloalquilo C4-C10, heterocicloalquilo de 4 a 14 miembros, arilo C6-C10 o heteroarilo de 5 a 14 miembros, y cada uno de los cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, N3, oxo, OPP(O)R47R48, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, alcoxilo C1-C6, haloalcoxilo C1-C6, amino, mono-alquilamino C1-C6 y di-alquilamino C1-C6;

R44 es H, alquilo C1-C6 o un grupo protector de amina;

cada uno de R45 y R46 es independientemente H, OP(O)R47R48 o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, y

cada uno de R47 y R48, independientemente es H, halo, alquilo C1-C6, OH, SH, SeH o BH3-.

El compuesto de fórmula (I) o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo puede tener una o más de las siguientes características cuando corresponda.

Por ejemplo, R2 es halo (por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo).

Por ejemplo, R2 es flúor.

Por ejemplo, R2 es LNA.

Por ejemplo, R2 es OR3.

Por ejemplo, R3 es H.

Por ejemplo, R3 es alquilo C1-C3, por ejemplo, metilo.

Por ejemplo, R3 es alquilo C1-C3 sustituido con uno o más de alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6.

Por ejemplo, R3 es CH2CH2OCH3.

Por ejemplo, R3 es CH(OCH2CH2OH)2.

Por ejemplo, R3 es CH(OCH2CH2OCOCH3)2.

Por ejemplo, R3 es alquenilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propen-3-ilo.

Por ejemplo, R3 es alquinilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propin-3-ilo.

Por ejemplo, el anillo B1 es

en el que cada uno de Ra, Rb y Rc es independientemente H o alquilo C1-C6.

Por ejemplo, el anillo B1 es

en el que cada uno de Ra, Rb y Rc es independientemente H o alquilo C1-C6.

Por ejemplo, el anillo B1 es

en el que cada uno de Ra, Rb y Rc es independientemente H o alquilo C1-C6, y Ri es alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6 (por ejemplo, propen-3-ilo).

Por ejemplo, cada uno de Ra y Rb es independientemente H o alquilo C1-C3.

Por ejemplo, Rc es H.

Por ejemplo, Rc es NH2.

Por ejemplo, Rc y uno de Ra y Rb, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6. Por ejemplo, el otro de Ra y Rb que no forma el heterociclo está ausente, H o alquilo C1-C6.

Por ejemplo, el anillo B1 es

en el que cada uno de Rg y Rh es independientemente H o alquilo C1-C3.

Por ejemplo, Rg es H o metilo.

Por ejemplo, Rh es H o metilo.

Por ejemplo, R1 es alquilo C1-C3.

Por ejemplo, R1 es metilo.

Por ejemplo, R1 es etilo sustituido con fenoxilo que está sustituido con uno o más de halo y ciano.

Por ejemplo, R1 es 4-clorofenoxiletilo, 4-bromofenoxiletilo o 4-cianofenoxiletilo.

Por ejemplo, R1 es alquenilo C2-C6 (por ejemplo, propen-3-ilo).

Por ejemplo, el anillo B² es

o

en el que

X i es N o N+(R5);

R5 es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C6-C10, ariloxilo C6-C10, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano;

cada uno de Rd y Re es independientemente H o alquilo C1-C6; y

Rf, cuando está presente, es H, NH2 o alquilo C1-C6; o Rf y uno de Rd y Re, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6, o

un estereoisómero, tautómero o sal del mismo.

Por ejemplo, cada uno de Rd y Re es independientemente H o alquilo C1-C3.

Por ejemplo, Rd es H o metilo.

Por ejemplo, Re es H o metilo.

Por ejemplo, Rf, cuando está presente, es H.

Por ejemplo, Rf, cuando está presente, es NH2.

Por ejemplo, Rf, cuando está presente, es alquilo C1-C6.

Por ejemplo, Rf y uno de Rd y Re, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6. Por ejemplo, el otro de Rd y Re que no forma el heterociclo está ausente, H o alquilo C1-C6.

Por ejemplo, el anillo B² es

en el que cada uno de Rg y Rh es independientemente H o alquilo C1-C3. Por ejemplo, Rg es H o metilo. Por ejemplo, Rh es H o metilo.

Por ejemplo, X1 es N.

Por ejemplo, X1 es N+(R5).

Por ejemplo, R5 es metilo.

Por ejemplo, R5 es etilo sustituido con fenoxilo que está sustituido con uno o más de halo y ciano.

Por ejemplo, R5 es 4-clorofenoxiletilo, 4-bromofenoxiletilo o 4-cianofenoxiletilo.

Por ejemplo, X2 es O.

Por ejemplo, X2 es S, SO o SO2.

Por ejemplo, X2 es NR24.

Por ejemplo, X2 es CR25R26.

Por ejemplo, R24 es H.

Por ejemplo, R24 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o C3-C6 ramificado, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t- butilo, n-pentilo, s-pentilo y n-hexilo.

Por ejemplo, R²⁵ es H.

Por ejemplo, R25 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o C3-C6 ramificado, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t- butilo, n-pentilo, s-pentilo y n-hexilo.

Por ejemplo, R26 es H.

Por ejemplo, R26 es alquilo C1-C6 de cadena lineal o C3-C6 ramificado, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t- butilo, n-pentilo, s-pentilo y n-hexilo.

Por ejemplo, cada uno de R25 y R26 es H.

Por ejemplo, R27 es H.

Por ejemplo, R28 es H.

Por ejemplo, R27 es OH.

Por ejemplo, R28 es OH.

Por ejemplo, tanto R27 como R28 son OH.

Por ejemplo, R27 es OR29.

Por ejemplo, R28 es OR29.

Por ejemplo, tanto R27 como R28 son OR29.

Por ejemplo, al menos uno de R27 y R28 es OR29.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente H.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente alquilo C1-C3, por ejemplo, metilo.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente alquilo C1-C3 sustituido con uno o más de alcoxilo C1-C6 que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C1-C6.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente CH2CH2OCH3.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente CH(OCH2CH2OH)2.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente CH(OCH2CH2OCOCH3)2.

Por ejemplo, cada R29 es independientemente alquenilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propen-3-ilo. Por ejemplo, cada R29 es independientemente alquinilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propin-3-ilo. Por ejemplo, R27 es OCH2CH2OCH3 y R1 es etilo sustituido con fenoxilo que está sustituido con uno o más de halo y ciano, por ejemplo, R1 que es 4-clorofenoxiletilo, 4-bromofenoxiletilo o 4-cianofenoxiletilo.

Por ejemplo, R27 y R28 juntos forman O-R30-O.

Por ejemplo, R30 es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo y alcoxilo C1-C6.

Por ejemplo, R30 es -C(CH3)2-, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- o -CH2CH(CH3)2-.

Por ejemplo, un subconjunto de los compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (Ia) o (Ib):

Por ejemplo, otro subconjunto de los compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (IIa) o (IIb):

Por ejemplo, otro subconjunto de los compuestos de fórmula (I) incluye los de fórmula (IIc), (IId), (IIe) o (IIf):

Por ejemplo, cada uno de R20, R21, R22 y R23, independientemente, es -Q3-T3.

Por ejemplo, Q3 es un enlace.

Por ejemplo, Q3 es un enlazador de alquilo C1-C3 no sustituido.

Por ejemplo, T3 es H u OH.

Por ejemplo, T3 es N3.

Por ejemplo, T3 es ciano.

Por ejemplo, T3 es NO2.

Por ejemplo, T3 es NH2.

Por ejemplo, T3 es NHCO-alquilo C1-C6, por ejemplo, NHCOCH3.

Por ejemplo, T3 es Rs3 u ORs3 en el que Rs3 es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C 6 o arilo C6-C10.

Por ejemplo, Rs3 es un alquilo C1-C6 de cadena lineal o C3-C6 ramificado no sustituido o sustituido, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t- butilo, n-pentilo, s-pentilo y n-hexilo.

Por ejemplo, RS3 es alquenilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propen-3-ilo.

Por ejemplo, Rs3 es alquinilo C2-C6 no sustituido o sustituido, por ejemplo, propin-3-ilo.

Por ejemplo, T3 es un alquilo C1-C6 de cadena lineal o C3-C6 ramificado no sustituido o sustituido, incluyendo, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t- butilo, n-pentilo, s-pentilo y n-hexilo.

Por ejemplo, T3 es cicloalquilo C3-C6 opcionalmente sustituido, incluyendo, pero sin limitación, ciclopentilo y ciclohexilo. Por ejemplo, T3 es fenilo opcionalmente sustituido.

Por ejemplo, T3 es halo (por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo).

Por ejemplo, T3 es heterocicloalquilo de 4 a 7 miembros opcionalmente sustituido (por ejemplo azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, triazolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, piperazinilo, tetrahidro-2H-piranilo, 3,6-dihidro-2H-piranilo y morfolinilo, y similares).

Por ejemplo, T3 es heteroarilo de 5 a 6 miembros opcionalmente sustituido (por ejemplo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo y similares). Por ejemplo, cada uno de R20, R21, R22 y R23 es independientemente H, OH, halo, NH2, ciano, NO2, N3, alcoxilo C1-C6, bencilo o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con halo.

Por ejemplo, cada uno de R20, R21, R22 y R23, es independientemente H, ciano, N3, alquilo C1-C6 o bencilo.

Por ejemplo, uno de R20 y R21 es H y el otro R20 es ciano, NO2, N3 o alquilo C1-C3.

Por ejemplo, tanto R20 como R21 son H.

Por ejemplo, al menos uno de R20 y R27 es H.

Por ejemplo, al menos uno de R21 y R28 es H.

Por ejemplo, cada uno de R22 y R23 son H.

Por ejemplo, uno de R22 y R23 es H y el otro es ciano, NO2, N3 o alquilo C1-C3.

Por ejemplo, al menos uno de R20, R21, R22 y R23 no es H.

Por ejemplo, cada uno de R20, R21, R22 y R23 es H.

Por ejemplo, Y2 es -CH2CH2-.

Por ejemplo, Y2 es -CH2CH2-Q0-CH2CH2-.

Por ejemplo, Y2 es -(CR40R41)u-1-CH(R41)-Q0-CH(R43)-(CR42R43)v-1-.

Por ejemplo, u es 1 o 2.

Por ejemplo, u es 3.

Por ejemplo, u es 4.

Por ejemplo, v es 1 o 2.

Por ejemplo, v es 3.

Por ejemplo, v es 4.

Por ejemplo, u es igual que v.

Por ejemplo, u es diferente de v.

Por ejemplo, Q0 es un enlace.

Por ejemplo, Q0 es O.

Por ejemplo, Q0 es S, SO o SO2.

Por ejemplo, Q0 es NR44, por ejemplo, NH.

Por ejemplo, Q0 es CR45R46.

Por ejemplo, cada uno de R⁴¹ y R⁴³ es H.

Por ejemplo, cada uno de R40 y R42 es H.

Por ejemplo, un R41 y un R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Qo, forman cicloalquilo C5-C8, heterocicloalquilo de 5 a 8 miembros, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros, y cada uno de los cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, oxo, alquilo C1-C6 o haloalquilo C1-C6.

Por ejemplo, Y2 es -CH (R41)-Q0-CH (R43)-. Por ejemplo, cada uno de R41 y R43 es H. Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman cicloalquilo C5-C8 (por ejemplo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares). Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman heterocicloalquilo de 5 a 8 miembros (por ejemplo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, triazolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, piperazinilo, tetrahidro-2H-piranilo, 3,6-dihidro-2H-piranilo y morfolinilo, y similares). Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman fenilo. Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman heteroarilo de 5 a 6 miembros (por ejemplo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo y similares). Por ejemplo, cada uno de dichos cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, oxo, OP(O)R47R48 (por ejemplo, OP(O)(OH)2 u OP(O)(F)(OH)), alquilo C1-C6 o haloalquilo C1-C6.

Por ejemplo, Y2 es -C H 2-CH (R41)-Q0-CH (R43)-CH2-. Por ejemplo, cada uno de R41 y R43 es H. Por ejemplo, cada uno de R41 y R43 es OP(O)R47R48, por ejemplo, OP(O)(OH)2. Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman cicloalquilo C5-C8 (por ejemplo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares). Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman heterocicloalquilo de 5 a 8 miembros (por ejemplo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, triazolidinilo, tetrahidrofuranilo, piperidinilo, 1,2 ,3,6-tetrahidropiridinilo, piperazinilo, tetrahidro-2H-piranilo, 3,6-dihidro-2H-piranilo y morfolinilo, y similares). Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman fenilo. Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman heteroarilo de 5 a 6 miembros (por ejemplo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo y similares). Por ejemplo, cada uno de dichos cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, oxo, O p (O)R47R48 (por ejemplo, OP(O)(OH)2 u OP(O)(F)(OH)), alquilo C1-C6 o haloalquilo C1-C6.

Por ejemplo, R41 y R43, junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Q0, forman 1,3-ciclohexilo, 2 ,6-tetrahidropiranilo, 2,6-tetrahidropiranilo o 2 ,5-tiazolilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más OH.

Por ejemplo, R44 es alquilo C1-C6.

Por ejemplo, R44 es H.

Por ejemplo, R44 es un grupo protector de amina (por ejemplo, t-butiloxilcarbonilo).

Por ejemplo, cada uno de R45 y R46 es H.

Por ejemplo, al menos uno de R45 y R46 es OPP(O)R47R48, o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48.

Por ejemplo, al menos uno de R47 y R48 es halo, por ejemplo, F, Cl, Br o I.

Por ejemplo, al menos uno de R47 y R48 es OH.

Por ejemplo, uno de R45 Y R46 es H y el otro es OP(O)(OH)2.

Por ejemplo, uno de R45 Y R46 es H y el otro es OP(O)(F)(OH).

Por ejemplo, uno de R45 y R46 es H y el otro es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, por ejemplo, OP(O)(OH)2.

Por ejemplo, cada uno de R45 y R46 es independientemente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48.

Por ejemplo, cada uno de R45 y R46 es independientemente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)(OH)², por ejemplo, -CH²-OP(O)(OH)².

Por ejemplo, cada uno de R45 y R46 es independientemente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)(F)(OH), por ejemplo, -CH2-OP(O)(F)(OH).

En realizaciones, las variables en las fórmulas (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) son como se definen en esta invención para la fórmula (I), cuando corresponda.

En realizaciones, los compuestos de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) son análogos de cap. En realizaciones, los compuestos de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) son análogos anti-cap inversa (ARCA). En realizaciones, un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) se incorpora en una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm) en el extremo 5'.

En otro aspecto más, la presente descripción también proporciona un compuesto (por ejemplo, un análogo de cap) o un polinucleótido que contiene el análogo de cap que tiene una afinidad de unión mejorada a eIF4E, una mayor resistencia a la degradación, o ambas, en comparación con, por ejemplo, cap de ARNm natural y ARNm naturales. Como se usa en esta invención, kdis es la tasa de disociación, calculada a partir de la fase de disociación, kas es la tasa de asociación, calculada a partir de la fase de asociación; Kd o Kd es la afinidad de unión, que es la relación de kdis / kas, y el tiempo de residencia, t, es la inversa de kdis.

En realizaciones, el compuesto con una afinidad de unión mejorada de eIF4E tiene un tiempo de residencia, t, de alrededor de 2 segundos o más cuando se une con el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) caracterizado por resonancia de plasmón superficial (RPS). Por ejemplo, el t del compuesto es 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 25 segundos, 30 segundos, 50 segundos, 75 segundos, 80 segundos, 90 segundos, 100 segundos o más. Por ejemplo, el compuesto tiene una kdis eIF4E no mayor de 1 s_1 (por ejemplo, no más de 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02 o 0,01 s_1). Por ejemplo, el compuesto que tiene un t de alrededor de 2 segundos o más (por ejemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 25 segundos, 30 segundos, 50 segundos, 75 segundos, 80 segundos, 90 segundos, 100 segundos, o más) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) o un derivado o análogo del mismo. Por ejemplo, el compuesto que tiene un t de alrededor de 2 segundos o más (por ejemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 25 segundos, 30 segundos, 50 segundos, 75 segundos, 80 segundos, 90 segundos, 100 segundos, o más) se selecciona de entre cualquiera de los incluidos en las Tablas 1-2, y los estereoisómeros, tautómeros y sales de los mismos.

En realizaciones, el compuesto con una afinidad de unión mejorada de eIF4E tiene un tiempo de residencia, t, de al menos 2 veces el de una cap natural cuando se une con eIF4E caracterizado por resonancia de plasmón superficial (RPS). Por ejemplo, el t del compuesto es al menos 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces el de una cap natural. Por ejemplo, el compuesto que tiene un t de al menos 2 veces (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces) el de una cap natural es un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) o un derivado o análogo del mismo. Por ejemplo, el compuesto que tiene un t de al menos 2 veces (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces) el de una cap natural se selecciona de entre cualquiera de los incluidos en las Tablas 1-2, y los estereoisómeros, tautómeros y sales de los mismos.

En realizaciones, el compuesto con una afinidad de unión mejorada de eIF4E tiene una Kd o Kd no mayor de 10 pM, por ejemplo, usando RPS. Por ejemplo, la Kd del compuesto no es mayor de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 pM. Por ejemplo, el compuesto tiene una Kd eIF4E no mayor de 10 pM (por ejemplo, no mayor de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 pM) y un t de alrededor de 2 segundos o más (por ejemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 20 segundos, 25 segundos, 30 segundos, 50 segundos, 75 segundos, 80 segundos, 90 segundos, 100 segundos o más) . Por ejemplo, el compuesto que tiene una Kd no mayor de 10 pM (por ejemplo, no mayor de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 pM) es un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) o un derivado o análogo del mismo. Por ejemplo, el compuesto que tiene una Kd no mayor de 10 pM (por ejemplo, no mayor de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,7, 0,5, 0,3 o 0,1 pM) se selecciona de entre cualquiera de los incluidos en las Tablas 1-2, y estereoisómeros, tautómeros y sales de los mismos.

En realizaciones, la molécula de ARN que porta el compuesto (por ejemplo, un análogo de cap) descrito en esta invención tiene una mayor resistencia a la degradación. Por ejemplo, la molécula de ARN modificada tiene una vida media que es al menos 1,2 veces la de una molécula de ARN natural correspondiente en un entorno celular. Por ejemplo, la vida media de la molécula de ARN modificada es al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces la de una molécula de ARN natural correspondiente en un entorno celular. Por ejemplo, la molécula de ARN modificada porta un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I), (Ia), (Ib) y (IIa)-(IIf) o un derivado o análogo del mismo. Por ejemplo, la molécula de ARN modificada porta un compuesto seleccionado de entre cualquiera de los incluidos en las Tablas 1-2, y estereoisómeros, tautómeros y sales de los mismos.

Los compuestos representativos de la presente descripción incluyen los compuestos enumerados en las Tablas 1 y 2 y estereoisómeros, tautómeros y sales de los mismos.

Tabla 1

N

Tabla 2

Por ejemplo, los compuestos enumerados en las Tablas 1 y 2 pueden o pueden tener el anillo Bi reemplazado por cualquiera de los definidos en la fórmula (I), por ejemplo, aquellos en los que Ri es 4-clorofenoxiletilo, 4-bromofenoxiletilo o 4-cianofenoxiletilo. Como alternativa o adicionalmente, los compuestos enumerados en las Tablas 1-2 pueden o pueden tener el anilloB2 reemplazado por cualquiera de los definidos en la fórmula (I), por ejemplo, citosina o uracilo no modificado o modificado. Como otro ejemplo, los compuestos enumerados en las Tablas 1-2 pueden o pueden tener R2 (por ejemplo, OH) reemplazado por cualquiera de los definidas en la fórmula (I), por ejemplo, OCH3, OCH(OCH2CH2OH)2 o OCH(OCH2CH2OCOCH3)2.

Como se usa en esta invención, el término "LNA" o "ácido nucleico bloqueado" se refiere a un puente de metileno entre el 2'O y el 4'C del monómero de nucleótido y también se refiere a un análogo de azúcar, un nucleósido, un monómero de nucleótido o un ácido nucleico, cada uno de los cuales contiene dicho puente. Por ejemplo, LNA tiene la siguiente estructura

o las descritas en el documento WO 99/14226 y Kore y col., J. AM. CHEM. SOC. 2009, 131,6364-6365.

Como se usa en esta invención, el término "nudeobase" se refiere a un resto heterocíclico que contiene nitrógeno, que son las partes de los ácidos nucleicos que están involucradas en el enlace de hidrógeno que une una hebra de ácido nucleico a otra hebra complementaria de una manera específica de secuencia. Las nucleobases naturales más comunes son : adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U).

El término "nucleobase modificada" se refiere a un resto que puede reemplazar una nucleobase. La nucleobase modificada imita la disposición espacial, las propiedades electrónicas o alguna otra propiedad fisicoquímica de la nucleobase y conserva la propiedad del enlace de hidrógeno que une una hebra de ácido nucleico a otra de una manera específica de secuencia. Una nucleobase modificada puede emparejarse con al menos una de las cinco bases naturales (uracilo, timina, adenina, citosina o guanina) sin afectar sustancialmente el comportamiento de fusión, el reconocimiento por enzimas intracelulares o la actividad del dúplex de oligonucleótidos. El término "nucleósido modificado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleósido o nucleótido que contiene una nucleobase modificada y/u otra modificación química descrita en esta invención, tal como azúcar modificado, puentes de átomos de fósforo modificados o enlace internucleósido modificado.

Los ejemplos no limitativos de nucleobases adecuadas incluyen, pero sin limitación, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina que tienen opcionalmente sus respectivos grupos amino protegidos por, por ejemplo, grupos protectores de acilo, 5-propinil-uracilo, 2-tio-5-propinil-uracilo, 5-metilcitosina, 2-fluorouracilo, 2-fluorocitosina, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, 2,6-diaminopurina, azacitosina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 2-aminopurina, N9-(2-amino-6-cloropurina), N9-(2,6-diaminopurina), hipoxantina, N9-(7-deaza-guanina), N9-(7-deaza-8-aza-guanina), N8-(8-aza-7-deazaadenina), análogos de pirimidina tales como pseudoisocitosina y pseudouracilo y otras nucleobases modificadas tales como purinas sustituidas en 8, xantina o hipoxantina (siendo las dos últimas los productos de degradación natural). Las nucleobases modificadas ejemplares se describen en Chiu y Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach y col. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196 y Revankar y Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 7, 313.

Los compuestos representados por las siguientes fórmulas generales también se contemplan como nucleobases:

cada uno de R¹⁰⁰ y R¹⁰¹ es independientemente H, alquilo C¹-C⁶ o un grupo protector de amina (tal como -C(O)R' en el que R' es un grupo lineal o ramificado opcionalmente sustituido seleccionado de entre grupo alifático, arilo, aralquilo, ariloxialquilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo que tiene de 1 a 15 átomos de carbono, incluyendo, a modo de ejemplo únicamente, un grupo metilo, isopropilo, fenilo, bencilo o fenoximetilo), o R¹⁰⁰ y R¹⁰¹ junto con el átomo de N al que están unidos forman -N=CH-NR'R" en el que cada uno de R' y R" es independientemente un carbociclilo, arilo, heterociclilo o heteroarilo alifático opcionalmente sustituido; o R¹⁰⁰ y R¹⁰¹ junto con el átomo de N al que están unidos forman un heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros (por ejemplo, ftalimidilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre OH y halo), -N=CH-R103, o -N=N-R103, donde R103 es fenilo, y cada uno de los heterocicloalquilos de 4 a 12 miembros y R103 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre OH, oxo, halo, alquilo C1-C6, COOH, C(O)O-alquilo C1-C6, ciano, alcoxilo C1-C6, amino, monoalquilamino C1-C6 y di-alquilamino C1-C6; y

cada R102 es independientemente H, NH2 o alquilo C1-C6; o R102 y uno de R100 y R101, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6, o un estereoisómero, tautómero o sal de los mismos. Por ejemplo, el otro de R100 y R101 que no forma el heterociclo está ausente, H o alquilo C1-C6.

Las nucleobases modificadas también incluyen nucleobases de tamaño expandido en las que se han añadido uno o más anillos de arilo, tales como anillos de fenilo. A continuación se muestran algunos ejemplos de estas nucleobases de tamaño expandido:

El término "azúcar modificado" o "análogo de azúcar" se refiere a un resto que puede reemplazar un azúcar. El azúcar modificado imita la disposición espacial, las propiedades electrónicas o alguna otra propiedad fisicoquímica de un azúcar.

Como se usa en esta invención, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a polímeros u oligómeros monocatenarios y bicatenarios de monómeros de nucleótidos, incluyendo ribonucleótidos (ARN) y 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) unidos por enlaces de enlace fosfodiéster internucleótido. Un polinucleótido puede estar compuesto completamente de desoxirribonucleótidos, completamente de ribonucleótidos o mezclas quiméricas de los mismos.

Como se usa en esta invención, el término "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido que codifica al menos un péptido o polipéptido de interés y que es capaz de traducirse para producir el péptido polipéptido de interés codificado in vitro, in vivo, in situ o ex vivo. Un ARNm ha sido transcrito a partir de una secuencia de ADN por una enzima ARN polimerasa e interactúa con un ribosoma para sintetizar información genética codificada por a Dn . En general, los ARNm se clasifican en dos subclases: pre-ARNm y ARNm maduro. El ARNm precursor (pre-ARNm) es ARNm que ha sido transcrito por la ARN polimerasa pero que no ha experimentado ningún procesamiento postranscripcional (porejemplo, capping en 5', splicing, edición y poliadenilación). El ARNm maduro se ha modificado a través del procesamiento postranscripcional (por ejemplo, con splicing para eliminar los intrones y poliadenilado) y es capaz de interactuar con los ribosomas para realizar la síntesis de proteínas. El ARNm se puede aislar de tejidos o células mediante una variedad de procedimientos. Por ejemplo, se puede realizar una extracción de ARN total en células o en un lisado celular y el ARN total extraído resultante se puede purificar (porejemplo, en una columna que comprende perlas de oligo-dT) para obtener ARNm extraído.

Alternativamente, el ARNm se puede sintetizar en un entorno libre de células, por ejemplo, mediante transcripción in vitro (IVT). Una " plantilla de transcripción in vitro" como se usa en esta invención, se refiere al ácido desoxirribonucleico (ADN) adecuado para usar en una reacción IVT para la producción de ARN mensajero (ARNm). En algunas realizaciones, una plantilla IVT codifica una región no traducida 5', contiene un marco de lectura abierto y codifica una región no traducida 3’ y una cola poli A. La composición particular de la secuencia de nucleótidos y la longitud de una plantilla IVT dependerán del ARNm de interés codificado por la plantilla.

Una "región no traducida 5' (UTR)" hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas arriba (es decir, en dirección 5') respecto al codón de inicio (es decir, el primer codón de un transcrito de ARNm traducido por un ribosoma) que no codifica una proteína o un péptido.

Una "región no traducida 3' (UTR)" hace referencia a una región de un ARNm que se encuentra directamente aguas abajo (es decir, en dirección 3') respecto al codón de terminación (es decir, el codón de un transcrito de ARNm que indica la terminación de la traducción) que no codifica una proteína o un péptido.

Un "marco de lectura abierto" es una extensión continua de ADN que comienza con un codón de inicio (por ejemplo, metionina (ATG)) y que finaliza con un codón de terminación (por ejemplo, TAA, TAG o TGA) y codifica una proteína o un péptido.

Una "cola poliA" es una región del ARNm que se encuentra aguas abajo, por ejemplo, directamente aguas abajo (es decir, en dirección 3'), respecto a la UTR 3' que contiene monofosfatos de adenosina consecutivos múltiples. Una cola poliA puede contener de 10 a 300 monofosfatos de adenosina. Por ejemplo, una cola poliA puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 monofosfatos de adenosina. En algunas realizaciones, una cola de poliA contiene de 50 a 250 monofosfatos de adenosina. En un entorno biológico relevante (por ejemplo, en células, in vivo, etc.) la cola de poliA protege al ARNm de la degradación enzimática, por ejemplo, en el citoplasma y ayuda con la finalización de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo y la traducción.

Por lo tanto, el polinucleótido puede comprender en algunas realizaciones (a) una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés; (b) una primera región terminal situada en 5' con respecto a dicha primera región que comprende una región no traducida (UTR) 5'; (c) una segunda región terminal situada en 3' con respecto a dicha primera región; y (d) una región de colas. Los términos polinucleótido y ácido nucleico se utilizan indistintamente en esta invención.

En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye de alrededor de 200 a alrededor de 3000 nucleótidos (por ejemplo, de 200 a 500, de 200 a 1000, de 200 a 1500, de 200 a 3000, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 3000, de 1500 a 3000 o de 2000 a 3000 nucleótidos).

El ARNm IVT descrito en esta invención puede funcionar como ARNm, pero se puede distinguir del ARNm de tipo natural en sus características de diseño funcional y/o estructural que sirven para superar los problemas existentes de producción eficaz de polipéptidos utilizando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ARNm IVT puede modificarse estructuralmente o modificarse químicamente. Como se usa en esta invención, una modificación "estructural" es aquella en la que se insertan, eliminan, duplican, invierten o aleatorizan dos o más nucleósidos enlazados en un polinucleótido sin una modificación química significativa de los propios nucleótidos. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido "ATCG" puede modificarse químicamente a "AT-5meC-G". El mismo polinucleótido se puede modificar estructuralmente de "ATCG" a "ATCCCG". En este caso, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.

El ADNc que codifica los polinucleótidos descritos en esta invención se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP se pueden fabricar internamente, se pueden seleccionar de un proveedor o se pueden sintetizar como se describe en esta invención. Los NTP pueden seleccionarse, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluidos los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa se puede seleccionar de entre, pero sin limitación, ARN polimerasa T7, a Rn polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero sin limitación, polimerasas capaces de incorporar polinucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos modificados). TP como se usa en esta invención significa trifosfato.

En realizaciones, los polinucleótidos de la descripción pueden incluir al menos una modificación química. Los polinucleótidos descritos en esta invención pueden incluir varias sustituciones y/o inserciones de polinucleótidos nativos o de origen natural, por ejemplo, además de la modificación en los restos de cap de ARNm terminal 5' descritos en esta invención. Como se usa en esta invención, cuando se hace referencia a un polinucleótido, los términos "modificación química" o, según corresponda, "modificado químicamente" se refieren a la modificación con respecto a la adenosina (A), guanosina (G), uridina (U), timidina (T) o citidina (C) de ribo o desoxirribonucleósidos y los enlaces internucleosídicos en una o más de sus posiciones, patrón, porcentaje o población. En general, en esta invención, estas expresiones no pretenden hacer referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de cap de ARNm 5'-terminal de origen natural.

Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. En algunas realizaciones, las regiones pueden contener una, dos o más modificaciones (opcionalmente diferentes) de nucleósidos o nucleótidos. En algunas realizaciones, un polinucleótido modificado, introducido en una célula, puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido no modificado.

Las modificaciones de los polinucleótidos de la descripción incluyen, pero sin limitación, las enumeradas en detalle a continuación. El polinucleótido puede comprender modificaciones que se producen de forma natural, que se producen de forma no natural o el polinucleótido puede comprender modificaciones que se producen tanto de forma natural como no natural.

Los polinucleótidos de la descripción pueden incluir cualquier modificación útil, tal como en el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleósido (por ejemplo, en un enlace fosfato/en un enlace fosfodiéster/en la cadena principal fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina o purina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, metilo o etilo) o halo (por ejemplo, cloro o flúor).

En determinadas realizaciones, están presentes modificaciones (por ejemplo, una o más modificaciones) en cada uno del azúcar y el enlace internucleosídico. Las modificaciones según la presente descripción pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos). En esta invención se describen modificaciones adicionales.

Se pueden introducir nucleótidos modificados no naturales en polinucleótidos durante la síntesis o post-síntesis de las cadenas para lograr las funciones o propiedades deseadas. Las modificaciones pueden estar en un enlace internucleótido, bases de purina o pirimidina o azúcar. La modificación puede introducirse en el extremo terminal de una cadena o en cualquier otro lugar de la cadena; con síntesis química o con una enzima polimerasa. Cualquiera de las regiones de los polinucleótidos puede modificarse químicamente.

La presente descripción proporciona polinucleótidos que comprenden nucleósidos y nucleótidos no modificados o modificados y combinaciones de los mismos. Como se describe en esta invención, "nucleósido" se define como un compuesto que contiene una molécula de azúcar (por ejemplo, una pentosa o ribosa) o un derivado de la misma, en combinación con una base orgánica (por ejemplo, una purina o pirimidina) o un derivado de la misma (también denominado "nucleobase" en esta invención). Tal como se describe en esta invención, "nucleótido" se define como un nucleósido que incluye un grupo fosfato. Los nucleótidos modificados pueden sintetizarse mediante cualquier procedimiento útil, tal como se describe en esta invención (por ejemplo, de forma química, enzimática o recombinante, para incluir uno o más nucleósidos no naturales o modificados). Los polinucleótidos pueden comprender una región o regiones de nucleósidos enlazados. Dichas regiones pueden tener enlaces de cadena principal variable. Los enlaces pueden ser enlaces fosfodiéster estándares, en cuyo caso los polinucleótidos comprenderían regiones de nucleótidos. Cualquier combinación de base/azúcar o enlazador puede incorporarse en los polinucleótidos de la descripción.

Las modificaciones de polinucleótidos (por ejemplo, los polinucleótidos de ARN, tales como los polinucleótidos de ARNm), incluyendo, pero sin limitación, la modificación química, que son útiles en las composiciones, los procedimientos y los procedimientos sintéticos de la presente descripción incluyen, pero sin limitación, los siguientes: 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; 2-metiltio-N6-metiladenosina; 2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina; N6-glicinilcarbamoiladenosina; N6-isopenteniladenosina; N6-metiladenosina; N6-treonilcarbamoiladenosina; 1,2'-O-dimetiladenosina; 1-metiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2'-O-ribosiladenosina (fosfato); 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6 isopenteniladenosina; 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilo carbamoiladenosina; 2'-O-metiladenosina; 2-O-ribosiladenosina (fosfato); Isopenteniladenosina; N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,2'-O-dimetiladenosina; N6,N6,2'-O-trimetiladenosina; N6,N6-dimetiladenosina; N6-acetiladenosina; N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina; N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina; 2-metiladenosina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina; 7-deaza-adenosina; Nl-metiladenosina; N6,N6 (dimetil)adenina; N6-cis-hidroxiisopentenil-adenosina; a-tio-adenosina; 2 (amino)adenina; 2 (aminopropil)adenina; 2 (metiltio) N6 (isopentenil)adenina; 2-(alquil)adenina; 2-(aminoalquil)adenina; 2-(aminopropil)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(halo)adenina; 2-(propil)adenina; 2'-Amino-2'-desoxi-ATP; 2'-Azido-2'-desoxi-ATP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidoadenosina TP; 6 (alquil)adenina; 6 (metil)adenina; 6-(alquil)adenina; 6-(metil)adenina; 7 (deaza)adenina; 8 (alquenil)adenina; 8 (alquinil)adenina; 8 (amino)adenina; 8 (tioalquil)adenina; 8-(alquenil)adenina; 8-(alquil)adenina; 8-(alquinil)adenina; 8-(amino)adenina; 8-(halo)adenina; 8-(hidroxil)adenina; 8-(tioalquil)adenina; 8-(tiol)adenina; 8-azido-adenosina; aza adenina; deaza adenina; N6 (metil)adenina; N6-(isopentil)adenina; 7-deaza-8-aza-adenosina; 7-metiladenina; 1-Deazaadenosina TP; 2'Fluoro-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-OMe-2-Amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-desoxiadenosina TP; 2'-a-Etiniladenosina TP; 2-aminoadenina; 2-Aminoadenosina TP; 2-Amino-ATP; 2'-a-Trifluorometiladenosina TP; 2-Azidoadenosina TP; 2'-b-Etiniladenosina TP; 2-Bromoadenosina TP; 2'-b-Trifluorometiladenosina TP; 2-Cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-amercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-thiometoxiadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-bazidoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-bfluoroadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptoadenosina TP; 2'-Desoxi-2'-btiometoxiadenosina TP; 2-Fluoroadenosina TP; 2-yodoadenosina TP; 2-Mercaptoadenosina TP; 2-metoxi-adenina; 2-metiltio-adenina; 2-Trifluorometiladenosina TP; 3-Deaza-3-bromoadenosina TP; 3-Deaza-3-cloroadenosina TP; 3-Deaza-3-fluoroadenosina TP; 3-Deaza-3-yodoadenosina TP; 3-Deazaadenosina TP; 4'-Azidoadenosina TP; Adenosina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etiniladenosina TP; 5'-Homo-adenosina TP; 8-Aza-ATP; 8-bromoadenosina TP; 8Trifluorometiladenosina TP; 9-Deazaadenosina TP; 2-aminopurina; 7-deaza-2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-2-aminopurina; 2,6-diaminopurina; 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina; 2-tiocitidina; 3-metilcitidina; 5-formilcitidina; 5-hidroximetilcitidina; 5-metilcitidina; N4-acetilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 2'-O-metilcitidina; 5,2'-O-dimetilcitidina; 5-formil-2'-O-metilcitidina; Lisidina; N4,2'-O-dimetilcitidina; N4-acetil-2'-O-metilcitidina; N4-metilcitidina; N4,N4-Dimetil-2'-OMe-Citidina TP; 4-metilcitidina; 5-aza-citidina; Pseudo-iso-citidina; pirrolo-citidina; a-tio-citidina; 2-(tio)citosina; 2'-Amino-2'-desoxi-CTP; 2'-Azido-2'-desoxi-CTP; 2'-Desoxi-2'-aaminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidocitidina TP; 3 (deaza) 5 (aza)citosina; 3 (metil)citosina; 3-(alquil)citosina; 3-(deaza) 5 (aza)citosina; 3-(metil)citidina; 4,2'-O-dimetilcitidina; 5 (halo)citosina; 5 (metil)citosina; 5 (propinil)citosina; 5 (trifluorometil)citosina; 5-(alquil)citosina; 5-(alquinil)citosina; 5-(halo)citosina; 5-(propinil)citosina; 5-(trifluorometil)citosina; 5-bromo-citidina; 5-yodo-citidina; 5-propinil citosina; 6-(azo)citosina; 6-aza-citidina; aza citosina; deaza citosina; N4 (acetil)citosina; 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina; 1-metil-pseudoisocitidina; 2-metoxi-5-metilcitidina; 2-metoxi-citidina; 2-tio-5-metil-citidina; 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina; 4-metoxi-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina; 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina; 4-tio-pseudoisocitidina; 5-aza-zebularina; 5-metilzebularina; pirrolo-pseudoisocitidina; Zebularina; (E)-5-(2-Bromo-vinil)citidina TP; clorhidrato de 2,2'-anhidro-citidina TP; 2'Fluor-N4-Bz-citidina TP; 2'Fluoro-N4-Acetil-citidina TP; 2'-O-Metil-N4-Acetil-citidina TP; 2'O-metil-N4-Bz-citidina TP; 2'-a-Etinilcitidina TP; 2'-a-Trifluorometilcitidina TP; 2'-b-Etinilcitidina TP; 2'-b-Trifluorometilcitidina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxicitidina TP; 2'-Desoxi-2'-baminocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-clorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluorocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptocitidina TP; 2'-Desoxi-2'-btiometoxicitidine TP; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)citidina TP; 3'-Etinilcitidina TP; 4'-Azidocitidina TP; Citidina 4'-carbocílica TP; 4'-Etinilcitidina TP; 5-(1-Propinil)ara-citidina TP; 5-(2-Cloro-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-(4-Amino-fenil)-2-tiocitidina TP; 5-Aminoalil-CTP; 5-Cianocitidina TP; 5-Etinilara-citidina TP; 5-Etinilcitidina TP; 5'-Homo-citidina TP; 5-Metoxicitidina TP; 5-Trifluorometil-Citidina TP; N4-Amino-citidina TP; N4-Benzoil-citidina TP; Pseudoisocitidina; 7-metilguanosina; N2,2'-O-dimetilguanosina; N2-metilguanosina; Wiosina; 1,2'-O-dimetilguanosina; 1-metilguanosina; 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 2'-O-metilguanosina; 2'-O-ribosilguanosina (fosfato); 7-aminometil-7-deazaguanosina; 7-ciano-7-deazaguanosina; Archaeosina; Metilwiosina; N2,7-dimetilguanosina; N2,N2,2'-O-trimetilguanosina; N2,N2,7-trimetilguanosina; N2,N2-dimetilguanosina; N2,7,2'-O-trimetilguanosina; 6-tio-guanosina; 7-deaza-guanosina; 8-oxo-guanosina; Nl-metil-guanosina; a-tio-guanosina; 2 (propil)guanina; 2-(alquil)guanina; 2'-Amino-2'-desoxi-GTP; 2'-Azido-2'-desoxi-GTP; 2'-Desoxi-2'-a-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidoguanosina TP; 6 (metil)guanina; 6-(alquil)guanina; 6-(metil)guanina; 6-metil-guanosina; 7 (alquil)guanina; 7 (deaza)guanina; 7 (metil)guanina; 7-(alquil)guanina; 7-(deaza)guanina; 7-(metil)guanina; 8 (alquil)guanina; 8 (alquinil)guanina; 8 (halo)guanina; 8 (tioalquil)guanina; 8-(alquenil)guanina; 8-(alquil)guanina; 8-(alquinil)guanina; 8-(amino)guanina; 8-(halo)guanina; 8-(hidroxil)guanina; 8-(tioalquil)guanina; 8-(tiol)guanina; aza guanina; deaza guanina; N (metil)guanina; N-(metil)guanina; 1-metil-6-tio-guanosina; 6-metoxi-guanosina; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina; 6-tio-7-deazaguanosina; 6-tio-7-metil-guanosina; 7-deaza-8-aza-guanosina; 7-metil-8-oxo-guanosina; N2,N2-dimetil-6-tioguanosina; N2-metil-6-tio-guanosina; 1-Me-GTP; 2'Fluoro-N2-isobutil-guanosina TP; 2'O-metil-N2-isobutil-guanosina TP; 2'-a-Etinilguanosina TP; 2'-a-Trifluorometilguanosina TP; 2'-b-Etinilguanosina TP; 2'-b-Trifluorometilguanosina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluoroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxiguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-bromoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-cloroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluoroguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-bmercaptoguanosina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxiguanosina TP; 4'-Azidoguanosina TP; Guanosina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etinilguanosina TP; 5'-Homo-guanosina TP; 8-bromo-guanosina TP; 9-Deazaguanosina TP; N2-isobutil-guanosina TP; 1-metilinosina; Inosina; 1,2'-O-dimetilinosina; 2'-O-metilinosina; 7-metilinosina; 2'-O-metilinosina; Epoxiqueuosina; galactosil-queuosina; Manosilqueuosina; Queuosina; aliamino-timidina; aza timidina; deaza timidina; desoxi-timidina; 2'-O-metiluridina; 2-tiouridina; 3-metiluridina; 5-carboximetiluridina; 5-hidroxiuridina; 5-metiluridina; 5-taurinometil-2-tiouridina; 5-taurinometiluridina; Dihidrouridina; Pseudouridina; (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 1-metil-3-(3-amino-5-carboxipropil)pseudouridina; 1-metilpseduouridina; 1-etil-pseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2'-O-metilpseudouridina; 2'-O-metiluridina; 2-tio-2'-O-metiluridina; 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina; 3,2'-O-dimetiluridina; 3-Metil-pseudo-Uridina TP; 4-tiouridina; 5-(carboxihidroximetil)uridina; éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina; 5,2'-O-dimetiluridina; 5,6-dihidro-uridina; 5-aminometil-2-tiouridina; 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina; 5-carbamoilmetiluridina; 5-carboxihidroximetiluridina; éster metílico de 5-carboxihidroximetiluridina; 5-carboximetilaminometil-2'-O-metiluridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-carboximetilaminometiluridina; 5-Carbamoilmetiluridina TP; 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metiluridina; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina; 5-metoxicarbonilmetiluridina; 5-metoxiuridina; 5-metil-2-tiouridina; 5-metilaminometil-2-selenouridina; 5-metilaminometil-2-tiouridina; 5-metilaminometiluridina; 5-Metildihidrouridina; ácido 5-Oxiacético- Uridina TP; ácido 5-Oxiacético-metil éster-Uridina TP; Nl-metil-pseudouracilo; Nl-etil-pseudouracilo; ácido uridin 5-oxiacético; éster metílico del ácido uridin 5-oxiacético; 3-(3-Amino-3-carboxipropil)-Uridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)- 2-tiouridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)-2'-O-metiluridina TP; 5-(iso-Pentenilaminometil)uridina TP; 5-propinil uracilo; a-tio-uridina; 1 (aminoalquilamino-carboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminoalquilaminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracilo; 1 (aminocarboniletilenil)-pseudouracilo; 2(tio)-pseudouracilo sustituido en 1; 2,4-(ditio)pseudouracilo sustituido en 1; 4 (tio)pseudouracilo sustituido en 1; pseudouracilo sustituido en 1; 1-(aminoalquilamino-carboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracilo; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina TP; 1-Metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-Metil-pseudo-UTP; 1-Etilpseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracilo; 2' desoxi uridina; 2' fluorouridina; 2-(tio)uracilo; 2,4-(ditio)psuedouracilo; 2' metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-guanosina; 2'-Amino-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-2'-desoxi-UTP; 2'-Azido-deoxiuridina TP; 2'-O-metilpseudouridina; 2' desoxi uridina; 2' fluorouridina; 2'-Desoxi-2'-a-aminouridina TP; 2'-Desoxi-2'-a-azidouridina TP; 2-metilpseudouridina; 3 (3 amino-3 carboxipropil)uracilo; 4 (tio)pseudouracilo; 4-(tio )pseudouracilo; 4-(tio)uracilo; 4-tiouracilo; 5 (1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5 (2-aminopropil)uracilo; 5 (aminoalquil)uracilo; 5 (dimetilaminoalquil)uracilo; 5 (guanidinioalquil)uracilo; 5 (metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5 (metoxicarbonil-metil)uracilo; 5 (metil) 2 (tio)uracilo; 5 (metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5 (metil) 4 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracilo; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracilo; 5 (propinil)uracilo; 5 (trifluorometil)uracilo; 5-(2-aminopropil)uracilo; 5-(alquil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(alquil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(alquil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(alquil)pseudouracilo; 5-(alquil)uracilo; 5-(alquinil)uracilo; 5-(alilamino)uracilo; 5-(cianoalquil)uracilo; 5-(dialquilaminoalquil)uracilo; 5-(dimetilaminoalquil)uracilo; 5-(guanidiniumalquil)uracilo; 5-(halo)uracilo; 5-(1,3-diazol-1-alquil)uracilo; 5-(metoxi)uracilo; 5-(metoxicarbonilmetil)-2-(tio)uracilo; 5-(metoxicarbonil-metil)uracilo; 5-(metil) 2(tio)uracilo; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracilo; 5-(metil) 4 (tio)uracilo; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracilo; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracilo; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracilo; 5-(metil)pseudouracilo; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracilo; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracilo; 5-(metilaminometil)-4-(tio)uracilo; 5-(propinil)uracilo; 5-(trifluorometil)uracilo; 5-aminoalil-uridina; 5-bromo-uridina; 5-yodo-uridina; 5-uracilo; 6 (azo)uracilo; 6-(azo)uracilo; 6-aza-uridina; aliamino-uracilo; aza uracilo; deaza uracilo; N3 (metil)uracilo; ácido Pseudo-UTP-1-2-etanoico; Pseudouracilo; 4-Tio-pseudo-UTP; 1-carboximetil-pseudouridina; 1-metil-1-deaza-pseudouridina; 1-propinil-uridina; 1-taurinometil-1-metil-uridina; 1-taurinometil-4-tio-uridina; 1-taurinometil-pseudouridina; 2-metoxi-4-tio-pseudouridina; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina; 2-tio-1-metilpseudouridina; 2-tio-5-aza-uridina; 2-tio-dihidropseudouridina; 2-tio-dihidrouridina; 2-tio-pseudouridina; 4-metoxi-2-tiopseudouridina; 4-metoxi-pseudouridina; 4-tio-1-metil-pseudouridina; 4-tio-pseudouridina; 5-aza-uridina; Dihidropseudouridina; (±)1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2R)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (2S)-1-(2-Hidroxipropil)pseudouridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)ara-uridina TP; (E)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; (Z)-5-(2-Bromovinil)ara-uridina TP; (Z)-5-(2-Bromo-vinil)uridina TP; 1-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropil)pseudouridina TP; 1-(2,2-Dietoxietil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetilbencil)pseudouridina TP; 1-(2,4,6-Trimetil-bencil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-Trimetil-fenil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-2-carboxietil)pseudo-UTP; 1-(2-Amino-etil)pseudo-UTP; 1-(2-Hidroxietil)pseudouridina TP; 1-(2-Metoxietil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Bistrifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3,4-Dimetoxibencil)pseudouridina TP; 1-(3-Amino-3-carboxipropil)pseudo-UTP; 1-(3-Amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)pseudouridina TP; 1-(4-Amino-4-carboxibutil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-Amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Azidobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Bromobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Clorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Fluorobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Yodobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metanosulfonilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metoxi-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Metoxi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Metilbencil)pseudouridina TP; 1-(4-Metil-bencil)pseudo-UTP; 1-(4-Nitrobencil)pseudouridina TP; 1-(4-Nitrobencil)pseudo-UTP; 1(4-Nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-Tiometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometoxibencil)pseudouridina TP; 1-(4-Trifluorometilbencil)pseudouridina TP; 1-(5-Amino-pentil)pseudo-UTP; 1-(6-Amino-hexil)pseudo-UTP; 1,6-Dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionil]pseudouridina TP; 1-{3-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-propionil } pseudouridina TP; 1-Acetilpseudouridina TP; 1-Alquil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-alil-pseudo-UTP; 1 -Alquil-6-etinilpseudo-UTP; 1-Alquil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-Alquil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-Alilpseudouridina TP; 1-Aminometilpseudo-UTP; 1-Benzoilpseudouridina TP; 1-Benciloximetilpseudouridina TP; 1-Bencil-pseudo-UTP; 1-Biotinil-PEG2-pseudouridina TP; 1-Biotinilpseudouridina TP; 1-Butil-pseudo-UTP; 1-Cianometilpseudouridina TP; 1-Ciclobutilmetilpseudo-UTP; 1-Ciclobutil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-Cicloheptil-pseudo-UTP; 1-Ciclohexilmetilpseudo-UTP; 1-Ciclohexil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclooctil-pseudo-UTP; 1-Ciclopentilmetilpseudo-UTP; 1-Ciclopentil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropilmetil-pseudo-UTP; 1-Ciclopropil-pseudo-UTP; 1-Etil-pseudo-UTP; 1-Hexil-pseudo-UTP; 1-Homoalilpseudouridina TP; 1-Hidroximetilpseudouridina TP; 1-iso-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tio-pseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-Metanosulfonilmetilpseudouridina TP; 1-Metoximetilpseudouridina TP; 1-Metil-6-(2,2,2-Trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-Metil-6-(fenil sustituido)pseudo-UTP; 1-Metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-azidopseudo-UTP; 1-Metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-cloro-pseudo-UTP; 1-Metil-6-cianopseudo-UTP; 1-Metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etilcarboxilato-pseudo-UTP; 1-Metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-Metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-hidroxiaminopseudo-UTP; 1-Metil-6-hidroxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-yodo-pseudo-UTP; 1-Metil-6-iso-propil-pseudo-UTP; 1 -Metil-6-metoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-Metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometoxi-pseudo-UTP; 1-Metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Morfolinometilpseudouridina TP; 1-Pentil-pseudo-UTP; 1-Fenil-pseudo-UTP; 1-Pivaloilpseudouridina TP; 1-Propargilpseudouridina TP; 1-Propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridina; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-Butil-pseudo-UTP; 1-Tiometoximetilpseudouridina TP; 1-Tiomorfolinometilpseudouridina TP; 1-Trifluoroacetilpseudouridina TP; 1-Trifluorometil-pseudo-UTP; 1-Vinilpseudouridina TP; 2,2'-anhidro-uridina TP; 2'-bromo-desoxiuridina TP; 2'-F-5-Metil-2'-desoxi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-Etiniluridina TP; 2'-a-Trifluorometiluridina TP; 2'-b-Etiniluridina TP; 2'-b-Trifluorometiluridina TP; 2'-Desoxi-2',2'-difluorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-a-mercaptouridina TP; 2'-Desoxi-2'-a-tiometoxiuridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-aminouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-azidouridina TP; 2'-Desoxi-2'-bbromouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-clorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-fluorouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-yodouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-mercaptouridina TP; 2'-Desoxi-2'-b-tiometoxiuridina TP; 2-metoxi-4-tio-uridina; 2-metoxiuridina; 2'-O-Metil-5-(1-propinil)uridina TP; 3-Alquil-pseudo-UTP; 4'-Azidouridina TP; Uridina 4'-carbocíclica TP; 4'-Etiniluridina TP; 5-(1-Propinil)ara-uridina TP; 5-(2-Furanil)uridina TP; 5-Cianouridina TP; 5-Dimetilaminouridina TP; 5'-Homo-uridina TP; 5-yodo-2'-fluoro-desoxiuridina TP; 5-Feniletiniluridina TP; 5-Trideuterometil-6-deuterouridina TP; 5-Trifluorometil-Uridina TP; 5-Vinilarauridina TP; 6-(2,2,2-Trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-Morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-Tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(Fenil Sustituido)-pseudo-UTP; 6-Amino-pseudo-UTP; 6-Azido-pseudo-UTP; 6-Bromo-pseudo-UTp; 6-Butilpseudo-UTP; 6-Cloro-pseudo-UTP; 6-Ciano-pseudo-UTP; 6-Dimetilamino-pseudo-UTP; 6-Etoxi-pseudo-UTP; 6-Etilcarboxilate-pseudo-UTP; 6-Etil-pseudo-UTP; 6-Fluoro-pseudo-UTP; 6-Formil-pseudo-UTP; 6-Hidroxiaminopseudo-UTP; 6-Hidroxi-pseudo-UTP; 6-Yodo-pseudo-UTP; 6-iso-Propil-pseudo-UTP; 6-Metoxi-pseudo-UTP; 6-Metilamino-pseudo-UTP; 6-Metil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Fenil-pseudo-UTP; 6-Propil-pseudo-UTP; 6-terc-Butil-pseudo-UTP; 6-T rifluorometoxi-pseudo-UTP; 6-T rifluorometil-pseudo-UTP; Alfa-tio-pseudo-UTP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbenzenosulfónico) TP; Pseudouridina 1-(ácido 4-metilbenzoico) TP; ácido Pseudouridin TP 1-[3-(2-etoxi)]propiónico; ácido Pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoxi )-etoxi]-etoxi)-etoxi}]propiónico; ácido Pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoxi )-etoxi}-etoxi]-etoxi )-etoxi}]propiónico; ácido Pseudouridin t P 1-[3-{2-(2-[2-etoxi ]-etoxi)-etoxi}]propiónico; ácido Pseudouridin t P 1-[3-{2-(2-etoxi)-etoxi}] propiónico; ácido Pseudouridin TP 1-metilfosfónico; Éster dietílico del ácido pseudouridin 1-metilfosfónico dietil éster; ácido Pseudo-UTP-N1-3-propiónico; ácido Pseudo-UTP-N1-4-butanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-5-pentanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-6-hexanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-7-heptanoico; ácido Pseudo-UTP-N1-metil-p-benzoico; ácido Pseudo-UTP-N1-p-benzoico; Wibutosina; Hidroxiwibutosina; Isowiosina; Peroxiwibutosina; hidroxiwibutosina submodificada; 4-demetilwiosina; 2,6-(diamino)purina;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazina-1-ilo;1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioxa)-naftaleno;2 (amino)purina;2,4,5-(trimetil)fenilo;2' metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorocitidina;2' metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluoroadenina;2'metilo, 2'amino, 2'azido, 2'fluorouridina;2'-amino-2'-desoxirribosa; 2-amino-6-Cloro-purina; 2-aza-inosinilo; 2'-azido-2'-desoxirribosa; 2'fluoro-2'-desoxirribosa; bases modificadas con 2'-fluoro; 2'-O-metil-ribosa; 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; 2-oxo-piridopirimidin-3-ilo; 2-piridinona; 3 nitropirrol; 3-(metil)-7-(propinil)isocarboestirililo; 3-(metil)isocarboestirililo; 4-(fluoro)-6-(metil)bencimidazol; 4-(metil)bencimidazol; 4-(metil)indolilo; 4,6-(dimetil)indolilo; 5 nitroindol; 5 pirimidinas sustituidas; 5-(metil)isocarboestirililo; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidina; 6-(azo)timina; 6-(metil)-7-(aza)indolilo; 6-cloro-purina; 6-fenilpirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(aminoalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(aza)indolilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-Ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquil-hidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fentiazin-1-ilo; 7-(guanidinioalquilhidroxi)-1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo; 7-(propinil)isocarboestirililo; 7-(propinil)isocarboestirilo, propinil-7-(aza)indolilo; 7-deaza-inosinilo; 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoxazin-1-ilo sustituido en 7; 1,3-(diaza)-2-(oxo)-fenoxazin-1-ilo sustituido en 7; 9-(metil)-imidizopiridinilo; Aminoindolilo; Antracenilo; bis-orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo bis-orto-sustituido; Difluorotolilo; Hipoxantina;Imidizopiridinilo; Inosinilo; Isocarboestirilo; Isoguanisina; purinas sustituidas en N2; N6-metil-2-aminopurina; purinas sustituidas en N6; derivado N-alquilado; Naftalenilo; Nitrobencimidazolilo; Nitroimidazolilo; Nitroindazolilo; Nitropirazolilo; Nubularina; purinas sustituidas en O6; derivado O-alquilado; orto-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo orto-sustituido; Oxoformicina TP; para-(aminoalquilhidroxi)-6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; 6-fenil-pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo para-sustituido; Pentacenilo; Fenantracenilo; Fenilo; propinil-7-(aza)indolilo; Pirenilo; piridopirimidin-3-ilo; piridopirimidin-3-ilo, 2-oxo-7-aminopiridopirimidin-3-ilo; pirrolo-pirimidin-2-on-3-ilo; Pirrolopirimidinilo; Pirrolopirizinilo; Estilbencilo; 1,2,4-triazoles sustituidos; Tetracenilo; Tubercidina; Xantina; Xantosina-5'-TP; 2-tio-zebularina; 5-aza-2-tio-zebularina; 7-deaza-2-amino-purina; ribonucleósido de piridin-4-ona; 2-Amino-ribosido-TP; Formicina A TP; Formicina B TP; Pirrolosina TP; 2'-OH-ara-adenosina TP; 2'-OH-ara-citidina TP; 2'-OH-ara-uridina TP; 2'-OH-ara-guanosina TP; 5-(2-carbometoxivinil)uridina TP; y N6-(19-Amino-pentaoxanonadecil)adenosina TP.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) incluyen una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.

En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas en polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm), se seleccionan de entre el grupo que consiste en pseudouridina (y ), 2-tiouridina (s2U), 4'-tiouridina, 5-metilcitosina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 4-metoxipseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-uridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina, 2'-O-metil uridina, 1-metil-pseudouridina (m l^ ), 1-etil-pseudouridina (e l^ ), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), a-tio-guanosina, a-tio-adenosina, 5-ciano uridina, 4'-tio uridina 7-deaza-adenina, 1-metiladenosina (mIA), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), y 2,6-Diaminopurina, (I), 1-metil-inosina (m il), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-deaza-guanosina, 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-deazaguanosina (preQI), 7-metil-guanosina (m7G), 1-metil-guanosina (mIG), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 2,8-dimetiladenosina, 2-geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-selenouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)-5,6-dihidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 3-metilpseudouridina, éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)-2'-O-metiluridina, 5-aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5-aminometiluridina, 5-carbamoilhidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5-cianometiluridina, 5-hidroxicitidina, 5-metilaminometil-2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-demetilwiosina, 7-aminocarboxipropilwiosina, éster metílico de 7-aminocarboxipropilwiosina, 8-metiladenosina, N4,N4-dimetilcitidina, N6-formiladenosina, N6-hidroximetiladenosina, agmatidina, N6-treonilcarbamoiladenosina cíclica, glutamil-queuosina, hidroxiwibutosina submodificada metilada, N4,N4,2'-O-trimetilcitidina, 5-metilaminometil-2-tiouridina geranilada, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina geranilada, Qbase, preQObase, preQIbase y dos o más combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el al menos un nucleósido modificado químicamente se selecciona de entre el grupo que consiste en pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 1-etil-pseudouridina, 5-metilcitosina, 5-metoxiuridina y una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido (por ejemplo, polirribonucleótido de ARN, tal como polirribonucleótido de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) incluyen una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente.

En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas en los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) se seleccionan de entre el grupo que consiste en 1-metil-pseudouridina (m1^), 1- etil-pseudouridina (e1^), 5-metoxiuridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (y ), a-tio-guanosina y a-tioadenosina. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una combinación de al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, incluyendo, pero sin limitación, modificaciones químicas.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) comprenden pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, a Rn , tales como ARNm) comprenden 1-metil-pseudouridina (m1^). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 1-etil-pseudouridina (e1^). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 1-metil-pseudouridina (m1^) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 1-etil-pseudouridina (e1^) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 2-tiouridina (s2U). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo ARN, tales como ARNm) comprenden 2-tiouridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden metoxi-uridina (mo5U). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 5-metoxi-uridina (mo5U) y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 2'-O-metil uridina. En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden 2'-O-metil uridina y 5-metil-citidina (m5C). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden N6-metil-adenosina (m6A). En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos (por ejemplo, ARN, tales como ARNm) comprenden N6-metil-adenosina (m6A) y 5-metil-citidina (m5C).

En algunas realizaciones, los polinucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de ARN, tales como polinucleótidos de ARNm) se modifican de forma uniforme (por ejemplo, completamente modificados, modificados en toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, se puede modificar de forma uniforme un polinucleótido con 1-metilpseudouridina, lo que significa que se reemplazan todos los residuos uridina en la secuencia de ARNm con 1-metilpseudouridina. De manera similar, se puede modificar de forma uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo con un residuo modificado tal como los establecidos anteriormente.

Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una citosina modificada incluyen N4-acetil-citidina (ac4C), 5-metilcitidina (m5C), 5-halo-citidina (por ejemplo, 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, 2- tio-citidina (s2C) y 2-tio-5-metil-citidina.

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una uridina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una uridina modificada incluyen 1-metil-pseudouridina (m1^), 1-etil-pseudouridina (e1^), 5-metoxi uridina, 2-tio uridina, 5-ciano uridina, 2'-O-metil uridina y 4'-tio uridina.

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una adenina modificada incluyen 7-desaza-adenina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A) y N6-metil-adenosina (m6A).

En algunas realizaciones, una nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 7-desaza-guanosina, 7-ciano-7-desaza-guanosina (preQO), 7-aminometil-7-desaza-guanosina (preQ1), 7-metilguanosina (m7G), 1-metil-guanosina (m1G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina.

Los polinucleótidos de la presente descripción pueden modificarse de forma parcial o total en toda la longitud de la molécula. Por ejemplo, uno o más o todos o un tipo determinado de nucleótido (por ejemplo, purina o pirimidina, o uno cualquiera o más o todos de los A, G, U, C) se pueden modificar uniformemente en un polinucleótido de la invención, o en una región de secuencia predeterminada dada del mismo (por ejemplo, en el ARNm que incluye o excluye la cola poliA). En algunas realizaciones, todos los nucleótidos X de un polinucleótido de la presente descripción (o de una región de secuencia dada del mismo) son nucleótidos modificados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.

El polinucleótido puede contener de alrededor del 1 % a alrededor del 100 % de nucleótidos modificados (ya sea con relación al contenido de nucleótidos total, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje intermedio (es decir, del 1 % al 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 %). Se entenderá que cualquier porcentaje restante está representado por la presencia de A, G, U o C no modificados.

Los polinucleótidos pueden contener un mínimo del 1 % y un máximo del 100 % de nucleótidos modificados, o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos el 5 % de nucleótidos modificados, al menos el 10 % de nucleótidos modificados, al menos el 25 % de nucleótidos modificados, al menos el 50 % de nucleótidos modificados, al menos el 80 % de nucleótidos modificados o al menos el 90 % de nucleótidos modificados. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden contener una pirimidina modificada, tal como un uracilo o citosina modificados. En algunas realizaciones, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % del uracilo del polinucleótido se reemplaza con un uracilo modificado (por ejemplo, un uracilo sustituido en la posición 5). El uracilo modificado se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple, o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas). En algunas realizaciones, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % de la citosina del polinucleótido se reemplaza con una citosina modificada (por ejemplo, una citosina sustituida en 5). La citosina modificada se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas).

Por lo tanto, en algunas realizaciones, las moléculas de ARN de la invención comprenden un elemento de UTR 5', un marco de lectura abierto opcionalmente optimizado por codón y un elemento de u Tr 3', una secuencia poli(A) y/o una señal de poliadenilación donde no se modifica químicamente el ARN.

En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoalil-uridina, 5-halo-uridina (por ejemplo, 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), 3-metiluridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), ácido uridin 5-oxiacético (cmo5U), éster metílico del ácido uridin 5-oxiacético (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uridina (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, es decir, que tiene la nucleobase desoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 1-etil-pseudouridina (e1^), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^ ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetiluridina (m3Um), and 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uridina, desoxitimidina, 2' - F - ara -uridina, 2' - F - uridina, 2' - OH - ara - uridina, 5 - (2 - carbometoxivinil) uridina y 5 - [3 - (1 - E -propenilamino)]uridina.

En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (por ejemplo, 5-yodo-citidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tio-citidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metilzebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxipseudoisocitidina, 4-metoxM-metN-pseudoisocitidina, lisidina (k2C), a-tio-citidina, 2'-O-metil-citidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metilcitidina (f5Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1-tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina y 2'-OH-ara-citidina.

En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una adenina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azidoadenosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-azaadenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenosina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetiladenosina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetil-adenosina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina (Am), N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetiladenosina (m1Am), 2'-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azidoadenosina, 2' - F - ara - adenosina, 2' - F - adenosina, 2' - OH - ara - adenosina y N6 - (19 - amino -pentaoxanonadecil)-adenosina.

En algunas realizaciones, la nucleobase modificada es una guanina modificada. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OhyW), hidroxiwibutosina submodificada (OhyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosilqueuosina (galQ), manosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQo), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ1), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-azaguanosina, 7-metil-guanosina (m7G), 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metil-guanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m22G), N2,7-dimetil-guanosina (m27G), N2,N2,7-dimetilguanosina (m227G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, a-tio-guanosina, 2'-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m27Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1Im), 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)), 1-tioguanosina, O6-metil-guanosina, 2' - F - ara - guanosina y 2 - F - guanosina.

En una realización, los polinucleótidos de la presente descripción, tales como los polinucleótidos IVT, pueden tener una modificación química uniforme de todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido o una población de modificaciones producidas por mera titulación descendente de la misma modificación inicial en todos o cualquiera del mismo tipo de nucleósido, o un porcentaje medido de una modificación química de cualquiera del mismo tipo de nucleósido pero con incorporación aleatoria, tal como cuando todas las uridinas se reemplazan por un análogo de uridina, por ejemplo, pseudouridina. En otra realización, los polinucleótidos pueden tener una modificación química uniforme de dos, tres o cuatro de los tipos de nucleósidos en todo el polinucleótido (tal como todas las uridinas y todas las citosinas, etc. se modifican de la misma manera). Cuando los polinucleótidos de la presente descripción son química y/o estructuralmente modificados, los polinucleótidos pueden denominarse "polinucleótidos modificados".

Como se usa en esta invención, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido, así como a una colección o intervalo de valores que están incluidos. En determinadas realizaciones, la expresión "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia establecido, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente de otro modo a partir del contexto (salvo que dicho número exceda el 100 % de un valor posible). Por ejemplo, "alrededor de X" incluye un intervalo de valores que son ±20 %, ±10 %, ±5 %, ±2 %, ±1 %, ±0,5 %, ±0,2 % o ±0,1 % de X, donde X es un valor numérico. En una realización, el término "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que son un 5 % más o menos que el valor especificado. En otra realización, el término "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que son un 2 % más o menos que el valor especificado. En otra realización, el término "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que son un 1 % más o menos que el valor especificado.

Como se usa en esta invención "alquilo", "alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6" o "alquilo C1-C6" pretende incluir grupos hidrocarbonados alifáticos saturados de cadena lineal (lineales) C1, C2, C3, C4, C5 o C6 y grupos hidrocarbonados alifáticos saturados ramificados C3, C4, C5 o C6. Por ejemplo, alquilo C1-C6 pretende incluir grupos alquilo C1, C2, C3, C4, C5 y C6. Los ejemplos de alquilo incluyen restos que tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como, pero sin limitación, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, s-pentilo o n-hexilo.

En determinadas realizaciones, un alquilo de cadena lineal o ramificado tiene seis o menos átomos de carbono (por ejemplo, C1-C6 para cadena lineal, C 3-C6 para cadena ramificada), y en otra realización, un alquilo de cadena lineal o ramificado tiene cuatro o menos átomos de carbono.

Como se usa en esta invención, el término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de uno o varios anillos de hidrocarburo no aromático saturado o insaturado (por ejemplo, anillos condensados, con puente o espiro) que tiene de 3 a 30 átomos de carbono (por ejemplo, C3-C10). Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y adamantilo. El término "heterocicloalquilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico de 3-8 miembros, bicíclico de 7-12 miembros (anillos condensados, con puente o espiro) o tricíclico de 11-14 miembros (anillos condensados, con puente o espiro) saturado o insaturado no aromático que tiene uno o más heteroátomos (tales como O, N, S o Se), a menos que se especifique lo contrario. Los ejemplos de grupos heterocicloalquilo incluyen, pero sin limitación, piperidinilo, piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, tetrahidrofuranilo, isoindolinilo, indolinilo, imidazolidinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, triazolidinilo, oxiranilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, piranilo, morfolinilo, tetrahidrotiopiranilo, 1,4-diazepanilo, 1,4-oxazepanilo, 2-oxa-5-azabiciclo[2.2.1]heptanilo, 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptanilo, 2-oxa-6-azaespiro[3.3]heptanilo, 2,6-diazaespiro[3.3]heptanilo, 1,4-dioxa-8-azaespiro[4.5]decanilo, 1,4-dioxaespiro[4.5]decanilo, 1-oxaespiro[4.5]decanilo, 1-azaespiro[4.5]decanilo, 3'H-espiro[ciclohexano-1,1'-isobenzofuran]-ilo, 7'H-espiro[ciclohexano-1,5'-furo[3,4-b]piridin]-ilo, 3'H-espiro[ciclohexano-1,1'-furo[3,4-c]piridin]-ilo y similares.

El término "alquilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquilo no sustituido o alquilo que tiene sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más carbonos de la cadena principal de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático.

Un resto "arilalquilo" o "aralquilo" es un alquilo sustituido con un arilo (por ejemplo, fenilmetilo (bencilo)). Un resto "alquilarilo" es un arilo sustituido con un alquilo (por ejemplo, metilfenilo).

Como se usa en esta invención, "enlazador de alquilo" pretende incluir grupos de hidrocarburo alifáticos divalentes saturados de cadena lineal (lineales) C1, C2, C3, C4, C5 o C6 y grupos de hidrocarburo alifáticos saturados ramificados C3, C4, C5 o C6. Por ejemplo, el enlazador de alquilo C1-C6 pretende incluir grupos enlazadores de alquilo C1, C2, C3, C4, C5 o C6. Los ejemplos de enlazadores de alquilo incluyen restos que tienen de uno a seis átomos de carbono, tales como, pero sin limitación, metilo (-CH2-), etilo (-CH2CH2-), n-propilo (-CH2CH2CH2-), i-propilo (-CHCH3CH2-), n-butilo (-CH2CH2CH2CH2-), s-butilo (-CHCH3CH2CH2-), i-butilo (-C(CH3)2CH2-), n-pentilo (-CH2CH2CH2CH2CH2-), s-pentilo (-CHCH3CH2CH2CH2-) o n-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-).

"Alquenilo" incluye grupos alifáticos insaturados de longitud análoga y posible sustitución de los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace doble. Por ejemplo, el término "alquenilo" incluye grupos alquenilo de cadena lineal (por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo) y grupos alquenilo ramificados.

En determinadas realizaciones, un grupo alquenilo de cadena lineal o ramificado tiene seis o menos átomos de carbono en su cadena principal (por ejemplo, C2-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada). El término "C2-C6" incluye grupos alquenilo que contienen de dos a seis átomos de carbono. El término "C3-C6" incluye grupos alquenilo que contienen de tres a seis átomos de carbono.

El término "alquenilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquenilo no sustituido o alquenilo que tiene sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más átomos de carbonos de la cadena principal de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático.

"Alquinilo" incluye grupos alifáticos insaturados de longitud análoga y posible sustitución de los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un enlace triple. Por ejemplo, "alquinilo" incluye grupos alquinilo de cadena lineal (por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo) y grupos alquinilo ramificados. En determinadas realizaciones, un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado tiene seis o menos átomos de carbono en su cadena principal (por ejemplo, C2-C6 para cadena lineal, C3-C6 para cadena ramificada) El término "C2-C6" incluye grupos alquinilo que contienen de dos a seis átomos de carbono. El término "C3-C6" incluye grupos alquinilo que contienen de tres a seis átomos de carbono.

El término "alquinilo opcionalmente sustituido" se refiere a alquinilo no sustituido o alquinilo que tiene sustituyentes designados que reemplazan uno o más átomos de hidrógeno en uno o más átomos de carbonos de la cadena principal de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático.

Otros restos opcionalmente sustituidos (tales como cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos) incluyen tanto los restos no sustituidos como los restos que tienen uno o más de los sustituyentes designados. Por ejemplo, heterocicloalquilo sustituido incluye aquellos sustituidos con uno o más grupos alquilo, tales como 2,2,6,6-tetrametil-piperidinilo y 2,2,6,6-tetrametil-1,2,3,6-tetrahidropiridinilo.

"Arilo" incluye grupos con aromaticidad, incluyendo los sistemas "conjugados" o multicíclicos con al menos un anillo aromático y que no contienen ningún heteroátomo en la estructura del anillo. Los ejemplos incluyen fenilo, bencilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftalenilo, etc.

Los grupos "heteroarilo" son grupos arilo, como se ha definido anteriormente, excepto que tienen de uno a cuatro heteroátomos en la estructura del anillo, y también pueden denominarse "heterociclos de arilo" o "heteroaromáticos". Como se usa en esta invención, el término "heteroarilo" pretende incluir un anillo estable monocíclico de 5, 6 o 7 miembros o heterocíclico aromático bicíclico de 7, 8, 9, 10, 11 o 12 miembros que consiste en átomos de carbono y uno o más heteroátomos, por ejemplo, 1 o 1-2 o 1-3 o 1-4 o 1-5 o 1-6 heteroátomos, o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 heteroátomos, seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. El átomo de nitrógeno puede estar sustituido o no sustituido (es decir, N o NR donde R es H u otros sustituyentes, según se define). Los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente (es decir, N ^ O y S(O)p, donde p = 1 o 2). Cabe señalar que el número total de átomos de S y O en el heterociclo aromático no es superior a 1.

Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina y similares.

Además, los términos "arilo" y "heteroarilo" incluyen grupos arilo y heteroarilo multicíclicos, por ejemplo, tricíclicos, bicíclicos, por ejemplo, naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofeno, quinolina, isoquinolina, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, indolizina.

En el caso de anillos aromáticos multicíclicos, solo uno de los anillos debe ser aromático (por ejemplo, 2,3-dihidroindol), aunque todos los anillos pueden ser aromáticos (por ejemplo, quinolina). El segundo anillo también se puede condensar o puentear.

El anillo de cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo (por ejemplo, el carbono que forma el anillo o el heteroátomo, tal como N) con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alquilaminocarbonilo, aralquilaminocarbonilo, alquenilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático. Los grupos arilo y heteroarilo también se pueden condensar o formar puentes con anillos alicíclicos o heterocíclicos, que no son aromáticos para formar un sistema multicíclico (por ejemplo, tetralina, metilenodioxifenilo tal como benzo[d][1,3]dioxol-5-ilo).

Como se usa en esta invención, "carbociclo" o "anillo carbocíclico" pretende incluir cualquier anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico estable que tenga el número especificado de carbonos, cualquiera de los cuales puede ser saturado, insaturado o aromático. El carbociclo incluye cicloalquilo y arilo. Por ejemplo, se pretende que un carbociclo C³-C¹⁴ incluya un anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico que tenga 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 átomos de carbono. Los ejemplos de carbociclos incluyen, pero sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclobutenilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, cicloheptenilo, cicloheptilo, cicloheptenilo, adamantilo, ciclooctilo, ciclooctenilo, ciclooctadienilo, fluorenilo, fenilo, naftilo, indanilo, adamantilo y tetrahidronaftilo. Los anillos con puente también se incluyen en la definición de carbociclo, incluyendo, por ejemplo, [3.3.0]biciclooctano, [4.3.0]biciclononano, y [4.4.0] biciclodecano y [2.2.2] biciclooctano. Un anillo con puente se produce cuando uno o más átomos de carbono unen dos átomos de carbono no adyacentes. En una realización, los anillos puente son uno o dos átomos de carbono. Se observa que un puente siempre convierte un anillo monocíclico en un anillo tricíclico. Cuando un anillo tiene un puente, los sustituyentes enumerados para el anillo también pueden estar presentes en el puente. También se incluyen anillos condensados (por ejemplo, naftilo, tetrahidronaftilo) y espiro.

Como se usa en esta invención, "heterocido" o "grupo heterocíclico" incluye cualquier estructura de anillo (saturada, insaturada o aromática) que contiene al menos un heteroátomo en el anillo (por ejemplo, N, O o S). Heterociclo incluye heterocicloalquilo y heteroarilo. Los ejemplos de heterociclos incluyen, pero sin limitación, morfolina, pirrolidina, tetrahidrotiofeno, piperidina, piperazina, oxetano, pirano, tetrahidropirano, azetidina y tetrahidrofurano.

Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen, pero sin limitación, acridinilo, azocinilo, benzimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benztiazolilo, benztriazolilo, benztetrazolilo, benzisoxazolilo, benzisotiazolilo, benzimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-6]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, IH-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilendioxifenilo (por ejemplo, benzo[d][1,3]dioxol-5-ilo), morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1.2.3- oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazol5(4H)-ona, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1.2.4- tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo, triazinilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,5-triazolilo, 1,3,4-triazolilo y xantenilo.

El término "sustituido", como se usa en esta invención, significa que uno o más átomos de hidrógeno en el átomo designado se reemplazan con una selección de los grupos indicados, siempre que no se exceda la valencia normal del átomo designado, y que la sustitución resulte en un compuesto estable. Cuando un sustituyente sea oxo o ceto (es decir, =O), entonces se reemplazan 2 átomos de hidrógeno en el átomo. Los sustituyentes ceto no están presentes en los restos aromáticos. Los dobles enlaces del anillo, como se usan en esta invención, son dobles enlaces que se forman entre dos átomos del anillo adyacente (por ejemplo, C=C, C=N o N=N). "Compuesto estable" y "estructura estable" pretenden indicar un compuesto que es lo suficientemente sólido para sobrevivir al aislamiento con un grado de pureza adecuado a partir de una mezcla de reacción y ser formulado como un agente terapéutico eficaz.

Cuando se muestra que un enlace en un sustituyente cruza un enlace que conecta dos átomos en un anillo, entonces dicho sustituyente puede estar unido a cualquier átomo en el anillo. Cuando se enumera un sustituyente sin indicar el átomo a través del cual dicho sustituyente está unido al resto del compuesto de una fórmula dada, entonces dicho sustituyente puede estar unido a través de cualquier átomo en dicha fórmula. Se permiten combinaciones de sustituyentes y/o variables pero solo si dichas combinaciones resultan en compuestos estables.

Cuando cualquier variable (por ejemplo, R²⁹ ) aparece más de una vez en cualquier constituyente o fórmula de un compuesto, su definición en cada aparición es independiente de su definición en cualquier otra aparición. Así, por ejemplo, si se muestra que un grupo contiene 0-2 restos R²⁹ , entonces el grupo puede contener hasta dos restos R²⁹ y R²⁹ en cada aparición se selecciona independientemente de entre la definición de R²⁹. Además, las combinaciones de sustituyentes y/o variables están permitidas pero solo si dichas combinaciones resultan en compuestos estables.

El término "hidroxi" o "hidroxilo" incluye grupos con un -OH u -O'.

Como se usa en esta invención, "halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo. El término "perhalogenado" generalmente se refiere a un resto donde todos los átomos de hidrógeno se reemplazan por átomos de halógeno. El término "haloalquilo" o "haloalcoxilo" se refiere a un alquilo o alcoxilo sustituido con uno o más átomos de halógeno.

El término "carbonilo" incluye compuestos y restos que contienen un carbono conectado con un doble enlace a un átomo de oxígeno. Los ejemplos de restos que contienen un carbonilo incluyen, pero sin limitación, aldehidos, cetonas, ácidos carboxílicos, amidas, ésteres, anhídridos, etc.

El término "carboxilo" se refiere a -COOH o su éster de alquilo C¹-C⁶.

"Acilo" incluye restos que contienen el radical acilo (R-C(O)-) o un grupo carbonilo. "Acilo sustituido" incluye grupos acilo donde uno o más de los átomos de hidrógeno se reemplazan por, por ejemplo, grupos alquilo, grupos alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático.

"Aroílo" incluye restos con un resto arilo o heteroaromático unido a un grupo carbonilo. Los ejemplos de grupos aroílo incluyen fenilcarboxi, naftil carboxi, etc.

"Alcoxialquilo", "alquilaminoalquilo" y "tioalcoxialquilo" incluyen grupos alquilo, como se ha descrito anteriormente, donde los átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre reemplazan a uno o más átomos de carbono de la cadena principal de hidrocarburo.

El término "alcoxi" o "alcoxilo" incluye grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos unidos covalentemente a un átomo de oxígeno. Los ejemplos de grupos alcoxi o radicales alcoxilo incluyen, pero sin limitación, grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi. Los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos incluyen grupos alcoxi halogenados. Los grupos alcoxi pueden estar sustituidos con grupos tales como alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático. Los ejemplos de grupos alcoxi sustituidos con halógeno incluyen, pero sin limitación, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi y triclorometoxi.

El término "éter" o "alcoxi" incluye compuestos o restos que contienen un oxígeno unido a dos átomos de carbono o heteroátomos. Por ejemplo, el término incluye "alcoxialquilo", que se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido covalentemente a un átomo de oxígeno que está unido covalentemente a un grupo alquilo.

El término "éster" incluye compuestos o restos que contienen un carbono o un heteroátomo unido a un átomo de oxígeno que está unido al carbono de un grupo carbonilo. El término "éster" incluye grupos alcoxicarboxi tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo, pentoxicarbonilo, etc.

El término "tioalquilo" incluye compuestos o restos que contienen un grupo alquilo conectado con un átomo de azufre. Los grupos tioalquilo pueden estar sustituidos con grupos tales como alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, carboxiácido, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o un resto aromático o heteroaromático.

El término "tiocarbonilo" o "tiocarboxi" incluye compuestos y restos que contienen un carbono conectado con un doble enlace a un átomo de azufre.

El término "tioéter" incluye restos que contienen un átomo de azufre unido a dos átomos de carbono o heteroátomos. Los ejemplos de tioéteres incluyen, pero sin limitación, alqtioalquilos, alqtioalquenilos y alqtioalquinilos. El término "alqtioalquilos" incluye restos con un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido a un átomo de azufre que está unido a un grupo alquilo. De manera similar, el término "alqtioalquenilos" se refiere a restos donde un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está unido a un átomo de azufre que está unido covalentemente a un grupo alquenilo; y "alqutioalquinilos" se refiere a restos donde un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está unido a un átomo de azufre que está unido covalentemente a un grupo alquinilo.

Como se usa en esta invención, "amina" o "amino" se refiere a -NH ². "Alquilamino" incluye grupos de compuestos donde el nitrógeno de -NH² está unido a al menos un grupo alquilo. Los ejemplos de grupos alquilamino incluyen bencilamino, metilamino, etilamino, fenetilamino, etc. "Dialquilamino" incluye grupos donde el nitrógeno de -NH² está unido a dos grupos alquilo. Los ejemplos de grupos dalquilamino incluyen, pero sin limitación, dimetilamino y dietilamino. "Arilamino" y "diarilamino" incluyen grupos donde el nitrógeno está unido a al menos uno o dos grupos arilo, respectivamente. "Aminoarilo" y "aminoariloxi" se refieren a arilo y ariloxi sustituido con amino. "Alquilarilamino", "alquilaminoarilo" o "arilaminoalquilo" se refiere a un grupo amino que está unido a al menos un grupo alquilo y a al menos un grupo arilo. "Alcaminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido a un átomo de nitrógeno que también está unido a un grupo alquilo. "Acilamino" incluye grupos donde el nitrógeno está unido a un grupo acilo. Los ejemplos de acilamino incluyen, pero sin limitación, grupos alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoílo y ureido.

El término "amida" o "aminocarboxi" incluye compuestos o restos que contienen un átomo de nitrógeno que está unido al carbono de un grupo carbonilo o tiocarbonilo. El término incluye grupos "alcaminocarboxi" que incluyen grupos alquilo, alquenilo o alquinilo unidos a un grupo amino que está unido al carbono de un grupo carbonilo o tiocarbonilo. También incluye grupos "arilaminocarboxi" que incluyen restos arilo o heteroarilo unidos a un grupo amino que está unido al carbono de un grupo carbonilo o tiocarbonilo. Los términos "alquilaminocarboxi", "alquenilaminocarboxi", "alquinilaminocarboxi" y "arilaminocarboxi" incluyen restos donde los restos alquilo, alquenilo, alquinilo y arilo, respectivamente, están unidos a un átomo de nitrógeno que a su vez está unido al carbono de un grupo carbonilo.

Las amidas pueden estar sustituidas con sustituyentes tales como alquilo de cadena lineal, alquilo ramificado, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterociclo. Los sustituyentes de los grupos amida pueden sustituirse adicionalmente.

El término "grupo protector de amina" se refiere a un grupo protector de aminas. Los ejemplos de grupos protectores de amina incluyen, pero sin limitación, fluorenilmetiloxicarbonilo ("Fmoc"), carboxibencilo ("Cbz"), terc-butiloxicarbonilo ("BOC"), dimetoxibencilo ("DMB"), acetilo ("Ac"), trifluoroacetilo, ftalimida, bencilo ("Bn"), tritilo (trifenilmetilo, Tr), bencilidenamina, tosilo (Ts). Véase también Chem. Rev. 2009, 109, 2455-2504 para grupos protectores de amina adicionales.

Los compuestos de la presente descripción que contienen nitrógeno se pueden convertir en N-óxidos mediante el tratamiento con un agente oxidante (por ejemplo, ácido 3-cloroperoxibenzoico (mCPBA) y/o peróxidos de hidrógeno) para proporcionar otros compuestos de la presente descripción. Por lo tanto, se considera que todos los compuestos que contienen nitrógeno mostrados y reivindicados, cuando lo permitan la valencia y la estructura, incluyen tanto el compuesto como se muestra y su derivado de N-óxido (que puede designarse como N ^ O o

N+-O'). Además, en otros aspectos, los nitrógenos en los compuestos de la presente descripción se pueden convertir en compuestos N-hidroxi o N-alcoxi. Por ejemplo, los compuestos N-hidroxi pueden prepararse por oxidación de la amina original con un agente oxidante tal como m-CPBA. Todos los compuestos que contienen nitrógeno mostrados y reivindicados también se consideran, cuando lo permiten la valencia y la estructura, que incluyen tanto el compuesto como se muestra y su N-hidroxi (es decir, N-OH) y N-alcoxi (es decir, N-OR, donde R es derivados de alquilo C¹-C⁶ , alquenilo C¹-C⁶ , alquinilo C¹-C⁶ , carbociclo de 3-14 miembros o heterociclo de 3-14 miembros sustituidos o no sustituidos).

En la presente memoria descriptiva, la fórmula estructural del compuesto representa un determinado isómero por conveniencia en algunos casos, pero la presente descripción incluye todos los isómeros, tales como los isómeros geométricos, los isómeros ópticos basados en un carbono asimétrico, los estereoisómeros, los tautómeros y similares, entendiéndose que no todos los isómeros pueden tener el mismo nivel de actividad. Además, puede estar presente un polimorfismo cristalino para los compuestos representados por la fórmula. Cabe destacar que cualquier forma de cristal, mezcla de forma de cristal o anhídrido o hidrato de las mismas está incluida en el alcance de la presente descripción.

"Isomería" significa cualquier compuesto que tiene fórmulas moleculares idénticas pero que difieren en la secuencia de unión de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio. Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diastereoisómeros" y los estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí se denominan "enantiómeros" o en ocasiones, isómeros ópticos. Una mezcla que contiene cantidades iguales de formas enantioméricas individuales de quiralidad opuesta se denomina "mezcla racémica".

Un átomo de carbono unido a cuatro sustituyentes no idénticos se denomina "centro quiral".

"Isómero quiral" significa un compuesto con al menos un centro quiral. Los compuestos con más de un centro quiral pueden existir como un diastereómero individual o como una mezcla de diastereómeros, denominada "mezcla diastereomérica". Cuando un centro quiral está presente, un estereoisómero puede caracterizarse mediante la configuración absoluta (R o S) de ese centro quiral. La configuración absoluta hace referencia a la disposición en el espacio de los sustituyentes unidos al centro quiral. Los sustituyentes unidos al centro quiral en consideración se clasifican según la regla de secuencia de Cahn, Ingold y Prelog. (Cahn y col., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; fe de erratas 511; Cahn y col., Angew. Chem 1966, 78, 413; Cahn e Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (Londres), 612; Cahn y col., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116).

"Isómero geométrico" significa los diastereómeros que deben su existencia a la rotación impedida alrededor de los dobles enlaces o un enlazador cicloalquilo (por ejemplo, 1,3-ciclobutilo). Estas configuraciones se diferencian en sus nombres por los prefijos cis y trans, o Z y E, que indican que los grupos están en el mismo lado o en el lado opuesto del doble enlace en la molécula según las reglas de Cahn-Ingold-Prelog.

Debe entenderse que los compuestos de la presente descripción pueden representarse como diferentes isómeros quirales o isómeros geométricos. También debe entenderse que cuando los compuestos tienen formas isoméricas quirales o isoméricas geométricas, se pretende que todas las formas isoméricas estén incluidas en el alcance de la presente descripción, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna forma isomérica, entendiéndose que no todos los isómeros pueden tener el mismo nivel de actividad.

Además, las estructuras y otros compuestos analizados en esta descripción incluyen todos los isómeros atrópicos de los mismos, entendiéndose que no todos los isómeros atrópicos pueden tener el mismo nivel de actividad. Los "isómeros atrópicos" son un tipo de estereoisómero en el que los átomos de dos isómeros están dispuestos de manera diferente en el espacio. Los isómeros atrópicos deben su existencia a una rotación restringida provocada por el impedimento de la rotación de grandes grupos alrededor de un enlace central. Dichos isómeros atrópicos existen típicamente como una mezcla, sin embargo, como resultado de los avances recientes en las técnicas de cromatografía, ha sido posible separar mezclas de dos isómeros atrópicos en casos seleccionados.

"Tautomero" es uno de dos o más isómeros estructurales que existen en equilibrio y se convierte fácilmente de una forma isomérica a otra. Esta conversión da como resultado la migración formal de un átomo de hidrógeno acompañada de un cambio de dobles enlaces conjugados adyacentes. Los tautómeros existen como una mezcla de un conjunto tautomérico en solución. En soluciones donde es posible la tautomerización, se alcanzará un equilibrio químico de los tautómeros. La relación exacta de los tautómeros depende de varios factores, incluyendo la temperatura, el disolvente y el pH. El concepto de tautómeros que son interconvertibles por tautomerizaciones se denomina tautomerismo.

De los diversos tipos de tautomerismo que son posibles, dos se observan comúnmente. En el tautomerismo de cetoenol se produce un desplazamiento simultáneo de electrones y un átomo de hidrógeno. El tautomerismo de la cadenaanillo surge como resultado del grupo aldehído (-CHO) en una molécula de cadena de azúcar que reacciona con uno de los grupos hidroxi (-OH) en la misma molécula para darle una forma cíclica (en forma de anillo) como la que muestra la glucosa.

Los pares tautoméricos comunes son: cetona-enol, amida-nitrilo, lactama-lactima, tautomerismo de amida-ácido imídico en anillos heterocíclicos (porejemplo, en nucleobases tales como guanina, timina y citosina), imina-enamina y enamina-enamina. A continuación se muestran ejemplos de tautomerismo lactama-lactima.

Debe entenderse que los compuestos de la presente descripción pueden representarse como diferentes tautómeros. También debe entenderse que cuando los compuestos tienen formas tautoméricas, todas las formas tautoméricas están destinadas a estar incluidas en el alcance de la presente descripción, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna forma tautómera. Se entenderá que determinados tautómeros pueden tener un nivel de actividad más alto que otros.

El término "cristales polimorfos", "polimorfos" o "formas cristalinas" significa estructuras cristalinas en las que un compuesto (o una sal o solvato del mismo) puede cristalizar en diferentes disposiciones de empaquetamiento de cristales, todas las cuales tienen la misma composición elemental. Las diferentes formas de cristal generalmente tienen diferentes patrones de difracción de rayos X, espectros infrarrojos, puntos de fusión, densidad, dureza, forma de cristal, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad. El disolvente de recristalización, la velocidad de cristalización, la temperatura de almacenamiento y otros factores pueden ocasionar que una única forma cristalina sea dominante. Los polimorfos cristalinos de los compuestos se pueden preparar por cristalización en diferentes condiciones.

Los compuestos de cualquier fórmula descritos en esta invención incluyen los propios compuestos, así como sus sales y sus solvatos, si corresponde.

Una sal, por ejemplo, se puede formar entre un anión y un grupo cargado positivamente (por ejemplo, amino) en un compuesto o un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) descrito en esta invención. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, sulfamato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, glutamato, glucuronato, glutarato, malato, maleato, succinato, fumarato, tartrato, tosilato, salicilato, lactato, naftalenosulfonato y acetato (por ejemplo, trifluoroacetato). Los aniones adecuados incluyen aniones farmacéuticamente aceptables. El término "anión farmacéuticamente aceptable" hace referencia a un anión adecuado para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Asimismo, también se puede formar una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente (por ejemplo, carboxilato) en un compuesto o un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) descrito en esta invención. Los cationes adecuados incluyen ion de sodio, ion de potasio, ion de magnesio, ion de calcio y un catión de amonio tal como ion de tetrametilamonio. Los compuestos y polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) descritos en esta invención también pueden incluir aquellas sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternario.

Además, los compuestos de la presente descripción, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir en forma hidratada o sin hidratar (la anhidra) o como solvatos con otras moléculas de disolvente. Los ejemplos no limitativos de hidratos incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Los ejemplos no limitativos de solvatos incluyen solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.

"Solvato" significa formas de adición de disolvente que contienen cantidades estequiométricas o no estequiométricas de disolvente. Algunos compuestos tienen tendencia a atrapar una relación molar fija de moléculas de disolvente en estado sólido cristalino, formando así un solvato. Si el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato; y si el disolvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman por la combinación de una o más moléculas de agua con una molécula de la sustancia en la que el agua conserva su estado molecular como H² O.

Como se usa en esta invención, el término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro pero que difiere ligeramente en composición (como en el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o el reemplazo de un grupo funcional por otro grupo funcional). Por lo tanto, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en función y aspecto, pero no en la estructura u origen, a un compuesto de referencia.

Como se define en esta invención, el término "derivado" se refiere a compuestos que tienen una estructura de núcleo común y están sustituidos con varios grupos como se describe en esta invención. Por ejemplo, todos los compuestos representados por la fórmula (I) son cap de ARNm modificadas con el grupo ribosa reemplazado por una estructura cíclica de 6 miembros y tienen la fórmula (I) como núcleo común.

El término "bioisóstero" se refiere a un compuesto resultante del intercambio de un átomo o de un grupo de átomos con otro átomo o grupo de átomos, a grandes rasgos similar. El objetivo de un reemplazo bioisotérico es crear un nuevo compuesto con propiedades biológicas similares al compuesto original. El reemplazo bioisotérico puede tener una base fisicoquímica o topológica. Los ejemplos de bioisósteros de ácido carboxílico incluyen, pero sin limitación, acilo sulfonimidas, tetrazoles, sulfonatos y fosfonatos. Véase, por ejemplo, Patani y LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147­ 3176, 1996.

La presente descripción pretende incluir todos los isótopos de átomos que se encuentran en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14. Por ejemplo, cuando una determinada variable (por ejemplo, cualquiera de R²⁰ -R²³ ) en la fórmula (I) es H o hidrógeno, puede ser hidrógeno o deuterio.

Se debe interpretar que el uso de los términos "un", "uno", "una" y "el" y "la" tanto en la siguiente descripción como en las reivindicaciones incluye tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en esta invención o que el contexto lo contradiga claramente. Se debe interpretar que las expresiones "que comprende", "que tiene", "que es de" como en "que es de fórmula química", "que incluye" y "que contiene" son expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye, pero sin limitación"), a menos que se indique lo contrario. Además, siempre que se utilice "que comprende" u otra expresión abierta en una realización, debe entenderse que la misma realización se puede reivindicar de forma más estricta utilizando la expresión intermedia "que consiste esencialmente en" o la expresión cerrada "que consiste en".

Como se usa en esta invención, las expresiones "uno o más de A, B o C", "uno o más A, B o C", "uno o más de A, B y C", "uno o más A, B, y C" y similares se usan indistintamente y todos se refieren a una selección de entre un grupo que consiste en A, B y/o C, es decir, uno o más A, uno o más B, uno o más C, o cualquier combinación de los mismos.

La presente descripción proporciona procedimientos para la síntesis de los compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en esta invención. La presente descripción también proporciona procedimientos detallados para la síntesis de varios compuestos descritos según los siguientes esquemas como se muestra en los Ejemplos.

A lo largo de la descripción, donde se describe que las composiciones tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, se contempla que las composiciones también consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes enumerados. De manera similar, cuando se describe que los procedimientos tienen, incluyen o comprenden etapas de procedimiento específicas, los procedimientos también consisten esencialmente en, o consisten en, las etapas de procesamiento enumeradas. Además, debe entenderse que el orden de las etapas o el orden para realizar determinadas acciones es irrelevante siempre que la invención siga siendo operativa. Además, se pueden realizar dos o más etapas o acciones simultáneamente.

Los procedimientos sintéticos de la descripción pueden tolerar una amplia variedad de grupos funcionales, por lo tanto, se pueden usar varios materiales de partida sustituidos. Los procedimientos generalmente proporcionan el compuesto final deseado al final o cerca del final del procedimiento global, aunque puede ser deseable en determinados aspectos convertir adicionalmente el compuesto en una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los compuestos de la presente descripción se pueden preparar de diversas maneras usando materiales de partida disponibles en el mercado, compuestos conocidos en la bibliografía o a partir de intermedios fácilmente preparados, empleando procedimientos sintéticos convencionales conocidos por los expertos en la materia o que sean evidentes para el experto en la materia a la luz de las enseñanzas de esta invención. Los procedimientos sintéticos convencionales para la preparación de moléculas orgánicas y transformaciones y manipulaciones de grupos funcionales se pueden obtener de la bibliografía científica relevante o de libros de texto estándar en el campo. Aunque sin limitación a una o varias fuentes, textos clásicos tales como Smith, M.B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5a edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3.a edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic T ransformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser y M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) son libros de texto de referencia útiles y reconocidos de síntesis orgánica conocidos por los expertos en la materia. Las siguientes descripciones de procedimientos sintéticos están diseñadas para ilustrar, pero no limitar, los procedimientos generales para la preparación de los compuestos de la presente descripción.

Los compuestos de esta descripción que tienen cualquiera de las fórmulas descritas en esta invención pueden prepararse según los procedimientos ilustrados en los Esquemas 1-3 a continuación, a partir de materiales de partida disponibles en el mercado o materiales de partida que pueden prepararse usando procedimientos de la bibliografía. Las variables (por ejemplo, Y ² ) en el esquema son como se definen en esta invención para la fórmula (I) a menos que se especifique lo contrario.

Un experto en la materia observará que, durante las secuencias de reacción y los esquemas sintéticos descritos en esta invención, se puede cambiar el orden de determinadas etapas, tales como la introducción y eliminación de grupos protectores.

Un experto en la materia reconocerá que determinados grupos pueden requerir protección de las condiciones de reacción mediante el uso de grupos protectores. Los grupos protectores también pueden usarse para diferenciar grupos funcionales similares en moléculas. Se puede encontrar una lista de grupos protectores y cómo introducir y eliminar estos grupos en Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, ³ a edición, John Wiley & Sons: Nueva York, 1999.

Los grupos protectores preferidos incluyen, pero sin limitación:

Para un resto hidroxilo: TBS, bencilo, THP, Ac

Para ácidos carboxílicos: éster bencílico, éster metílico, éster etílico, éster alílico

Para aminas: Fmoc, Cbz, BOC, DMB, Ac, Bn, Tr, Ts, trifluoroacetilo, ftalimida, bencilidenamina

Para dioles: Ac (x2) TBS (x2), o cuando se toman juntos acetónidos

Para tioles: Ac

Para bencimidazoles: SEM, bencilo, PMB, DMB

Para aldehídos: acetales de dialquilo tales como dimetoxi acetal o dietil acetilo.

En los esquemas de reacción descritos en esta invención, se pueden producir múltiples estereoisómeros. Cuando no se indica ningún estereoisómero particular, se entiende que significa todos los estereoisómeros posibles que podrían producirse a partir de la reacción. Un experto en la materia reconocerá que las reacciones se pueden optimizar para dar preferentemente un isómero, o se pueden idear nuevos esquemas para producir un solo isómero. Si se producen mezclas, se pueden utilizar técnicas tales como la cromatografía en capa fina preparativa, la HPLC preparativa, la HPLC quiral preparativa o la S F C preparativa para separar los isómeros.

Como se ilustra en el Esquema 1 anterior, la fosforamidita (a) disponible en el mercado se condensa en condiciones ácidas con el diol HO-Y² -OH apropiado (por ejemplo, etilenglicol). La relación inicial de fosforamidita a diol es equimolar, y la formación del éster de P(III) monosustituido se controla mediante LCMS. Cuando se encuentra que la adición es completa, se añade 1 equivalente molar adicional de fosforamidita (a). El bis-P(NI)-fosfodiéster resultante se oxida con hidroperóxido de terc-butilo. El tratamiento con una base, tal como la dietilamina, induce una eliminación p de los grupos cianoetilo para producir el éster bis-fosfato (b). El tratamiento con una base nucleófila, tal como la metilamina, induce la eliminación de los grupos protectores de amida para producir (c) y esto es seguido por 2'-O-desililación mediada por fluoruro. El tratamiento con ácido (TFA) completa la desprotección global y la bis-N-7-metilación final proporcionó el compuesto final (d).

El Esquema 2 anterior ilustra una estrategia alternativa para sintetizar los compuestos descritos en esta invención. Según esto, la guanosina (aa) se convierte en el 2-3'-fenilboronato lábil (bb), que se condensa con la bis-fosforamidita (ee). El aducto primario (ff) se oxida al fosfotriéster respectivo (gg), y los grupos protectores se eliminan secuencialmente. El compuesto se puede purificar mediante cromatografía de intercambio iónico y una metilación N7 simétrica produce el Compuesto 3.

El Esquema 3 anterior ilustra una estrategia para sintetizar los compuestos descritos en esta invención. La fosforamidita (aaa) y el fosfato de bis(2-cianoetilo) (bbb) se acoplan para formar (bis(2-cianoetoxi)fosforil)oxi)-hidroxipropil(cianoetil)fosfato (ccc), que a continuación se acopla con otro 1 equivalente molar de fosforamidita (aaa) para producir el aducto primario (ddd). Una metilación N7 simétrica de ddd produce el Compuesto 7. El compuesto puede purificarse mediante cromatografía de fase inversa.

Un experto en la materia reconocerá que en los esquemas anteriores el orden de determinadas etapas puede intercambiarse.

Los análogos de cap descritos en esta invención se utilizan para la síntesis de moléculas de ARN con capping en 5' en reacciones de transcripción in vitro. La sustitución del análogo de cap por una porción del GTP en una reacción de transcripción da como resultado la incorporación de la estructura de cap en una fracción correspondiente de los transcritos. Los ARNm con capping generalmente se traducen más eficientemente en sistemas de traducción in vitro de lisado de reticulocitos y germen de trigo. Es importante que los transcritos in vitro sean sometidos a capping para los experimentos de microinyección porque los ARNm sin capping se degradan rápidamente. Los análogos de cap también se utilizan como un inhibidor altamente específico de la etapa de iniciación de la síntesis de proteínas. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente descripción proporciona procedimientos para sintetizar una molécula de ARN in vitro. El procedimiento puede incluir hacer reaccionar ATP sin modificar o modificado, CTP sin modificar o modificado, UTP sin modificar o modificado, GTP sin modificar o modificado, un compuesto de fórmula (I) o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, y una plantilla de polinucleótido; en presencia de una ARN polimerasa; en condiciones conducentes a la transcripción por ARN polimerasa de la plantilla de polinucleótido en una o más copias de ARN; por lo que al menos algunas de las copias de ARN incorporan el compuesto de fórmula (I) o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo para formar una molécula de ARN.

También se proporciona en esta invención un kit para realizar el capping de un transcrito de ARN. El kit incluye un compuesto de fórmula (I) y una ARN polimerasa. El kit también puede incluir uno o más de nucleótidos, inhibidor de ribonucleasa, un tampón de enzima y un tampón de nucleótidos.

En otro aspecto, la molécula de ARN se puede someter a capping después de la transcripción. Por ejemplo, la enzima de capping contra el virus vaccinia recombinante y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-terminal de un ARNm y un nucleótido de cap de guanina donde la cap de guanina contiene una metilación de N7 y el nucleótido 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. En otro aspecto más, la presente descripción proporciona una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm) cuyo extremo 5' comprende un compuesto (por ejemplo, un análogo de cap) descrito en esta invención. Por ejemplo, el extremo 5' de la molécula de ARN comprende un compuesto de fórmula (III):

donde la línea ondulada indica el punto de unión al resto de la molécula de ARN.

En realizaciones, las variables en la fórmula (III) son como se definen en esta invención para la fórmula (I), cuando corresponda.

En realizaciones, la molécula de ARN es una molécula de ARNm.

En realizaciones, la molécula de ARN es una molécula de ARNm transcrita in vitro (ARNm IVT).

En algunas realizaciones, el ARN y el ARNm de la descripción, a excepción de la cap del extremo 5' del mismo, es una molécula de ARN o ARNm sin modificar que tiene la misma secuencia y estructura que la de una molécula de ARN o ARNm natural. En otras realizaciones, el ARN y el ARNm de la descripción, además de las modificaciones en la cap del extremo 5' descritas en esta invención, pueden incluir al menos una modificación química como se describe en esta invención.

Generalmente, la longitud del polinucleótido IVT (por ejemplo, ARNm IVT) que codifica un polipéptido de interés es mayor que alrededor de 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos o mayor que alrededor de 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos).

En algunas realizaciones, el polinucleótido IVT (por ejemplo, ARNm IVT) incluye de alrededor de 30 a alrededor de 100.000 nucleótidos (por ejemplo, de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1.000, de 100 a 1.500, de 100 a 3.000, de 100 a 5.000, de 100 a 7.000, de 100 a 10.000, de 100 a 25.000, de 100 a 50.000, de 100 a 70.000, de 100 a 100.000, de 500 a 1.000, de 500 a 1,500, de 500 a 2.000, de 500 a 3.000, de 500 a 5.000, de 500 a 7.000, de 500 a 10.000, de 500 a 25.000, de 500 a 50.000, de 500 a 70.000, de 500 a 100.000, de 1.000 a 1,500, de 1.000 a 2.000, de 1.000 a 3.000, de 1.000 a 5.000, de 1.000 a 7.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 25.000, de 1.000 a 50.000, de 1.000 a 70.000, de 1.000 a 100.000, de 1.500 a 3.000, de 1.500 a 5.000, de 1.500 a 7.000, de 1.500 a 10.000, de 1.500 a 25.000, de 1.500 a 50.000, de 1.500 a 70.000, de 1.500 a 100.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000 o de 2.000 a 100.000 nucleótidos).

En algunas realizaciones, un ácido nucleico como se describe en la presente invención es un polinucleótido quimérico. Los polinucleótidos quiméricos o construcciones de ARN mantienen una organización modular similar a los polinucleótidos IVT, pero los polinucleótidos quiméricos comprenden una o más modificaciones o alteraciones estructurales y/o químicas que transmiten propiedades útiles al polinucleótido. Como tales, los polinucleótidos quiméricos que son moléculas de ARNm modificadas de la presente descripción se denominan "ARNm quimérico modificado" o "ARNm quimérico". Los polinucleótidos quiméricos tienen porciones o regiones que difieren en tamaño y/o patrón de modificación química, posición de modificación química, porcentaje de modificación química o población de modificación química y combinaciones de los anteriores.

En realizaciones, el ARN y el ARNm de la descripción son un componente de un complejo de ARNm multimérico.

En otro aspecto, la descripción también proporciona un procedimiento para producir un complejo de ARNm multimérico. En algunas realizaciones, se forma un complejo de ARNm multimérico mediante un protocolo de calentamiento y enfriamiento por etapas. Por ejemplo, una mezcla de 5 pM de cada ARNm que se desea incorporar al complejo multimérico puede colocarse en un tampón que contiene 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris) 50 mM pH 7,5, cloruro de sodio (NaCl) 150 mM y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. La mezcla se puede calentar a 65 °C durante 5 minutos, 60 °C durante 5 minutos, 40 °C durante 2 minutos y a continuación enfriar a 4 °C durante 10 minutos, lo que da como resultado la formación de un complejo multimérico.

En realizaciones, el ARN y el ARNm de la descripción son sustancialmente no tóxicos y no mutagénicos.

En algunas realizaciones, el ARN y el ARNm de la descripción, cuando se introducen en una célula, pueden presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido natural.

Como se describe en esta invención, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la descripción preferiblemente no inducen sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduce el polinucleótido (por ejemplo, ARNm). Las características de una respuesta inmunitaria innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc. y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos descritos en esta invención incluyen una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés (por ejemplo, una región codificante), una primera región flanqueante ubicada en el extremo 5' de la primera región (por ejemplo, una 5'-UTR), una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de la primera región (por ejemplo, una 3'-UTR), al menos una región de cap 5' y una región estabilizadora en 3'. En algunas realizaciones, un ácido nucleico o polinucleótido incluye además una región poli-A o una secuencia Kozak (por ejemplo, en la 5'-UTR). En algunos casos, los polinucleótidos pueden contener una o más secuencias de nucleótidos intrónicos capaces de escindirse del polinucleótido. En algunas realizaciones, un polinucleótido o ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm) puede incluir una estructura de cap en 5', un nucleótido de terminación de cadena, un bucle en horquilla, una secuencia poliA y/o una señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, cualquiera de las regiones de los polinucleótidos de la descripción incluye al menos un nucleósido alternativo. Por ejemplo, la región estabilizadora en 3' puede contener un nucleósido alternativo, tal como un nucleósido L, una timidina invertida o un nucleósido 2'-O-metilo y/o la región codificante, 5'-UTR, 3'-UTR o la región de cap puede incluir un nucleósido alternativo tal como una uridina sustituida en 5 (por ejemplo, 5-metoxiuridina), una pseudouridina sustituida en 1 (por ejemplo, 1-metil-pseudouridina) y/o una citidina sustituida en 5 (por ejemplo, 5-metil-citidina).

Generalmente, la longitud más corta de un polinucleótido puede ser la longitud de la secuencia de polinucleótidos que sea suficiente para codificar un dipéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un tripéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un tetrapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un pentapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un hexapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un heptapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un octapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un nonapéptido. En otra realización, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un decapéptido.

Los ejemplos de dipéptidos que las secuencias de polinucleótidos alternativas pueden codificar incluyen, pero sin limitación, carnosina y anserina.

En algunos casos, un polinucleótido tiene más de 30 nucleótidos de longitud. En otra realización, la molécula de polinucleótido tiene más de 35 nucleótidos de longitud. En otra realización, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 50 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 4000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 5000 nucleótidos o mayor que 5000 nucleótidos.

Los ácidos nucleicos y los polinucleótidos descritos en esta invención pueden incluir uno o más componentes naturales, incluyendo cualquiera de los nucleótidos canónicos A (adenosina), G (guanosina), C (citosina), U (uridina) o T (timidina). En una realización, todos o sustancialmente los nucleótidos que comprenden (a) la 5'-UTR, (b) el marco de lectura abierto (ORF), (c) la 3'-UTR, (d) la cola poli A y cualquier combinación de (a, b, c o d anterior) comprenden los nucleótidos canónicos naturales A (adenosina), G (guanosina), C (citosina), U (uridina) o T (timidina).

Los ácidos nucleicos y los polinucleótidos descritos en esta invención pueden incluir uno o más componentes alternativos (por ejemplo, en una región estabilizadora 3'), como se describe en esta invención, que transmiten propiedades útiles, incluyendo una mayor estabilidad y/o la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmunitaria innata de una célula en la que se introduce el polinucleótido. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico modificado (por ejemplo, alterado o alternativo) muestra una degradación reducida en una célula en la que se introduce el polinucleótido o ácido nucleico, en relación con un polinucleótido o ácido nucleico no alterado correspondiente. Estas especies alternativas pueden mejorar la eficiencia de la producción de proteínas, la retención intracelular de los polinucleótidos y/o la viabilidad de las células en contacto, así como poseer inmunogenicidad reducida.

Los polinucleótidos y los ácidos nucleicos pueden ser naturales o no naturales. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden incluir una o más nucleobases, nucleósidos, nucleótidos o combinaciones de los mismos modificados (por ejemplo, alterados o alternativos). Los ácidos nucleicos y polinucleótidos descritos en esta invención pueden incluir cualquier modificación o alteración adecuada, tal como la nucleobase, el azúcar o el enlace internucleósido (por ejemplo, en un enlace fosfato/en un enlace fosfodiéster/en la cadena principal fosfodiéster). En determinadas realizaciones, están presentes alteraciones (por ejemplo, una o más alteraciones) en cada uno de la nucleobase, el azúcar y el enlace internucleosídico. Las alteraciones según la presente descripción pueden ser alteraciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), por ejemplo, la sustitución del 2'-OH del anillo de ribofuranosilo a 2'-H, ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos. En esta invención se describen alteraciones adicionales.

Los polinucleótidos y los ácidos nucleicos pueden o no estar uniformemente alterados a lo largo de toda la longitud de la molécula. Por ejemplo, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (por ejemplo, purina o pirimidina, o uno cualquiera o más o todos de A, G, U, C) pueden alterarse uniformemente o no en un polinucleótido o ácido nucleico, o en una región de secuencia predeterminada dada del mismo. En algunos casos, todos los nucleótidos X de un polinucleótido de la descripción (o de una región de secuencia determinada del mismo) están alterados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.

Diferentes alteraciones de azúcar y/o enlaces internucleosídicos (por ejemplo, estructuras de cadena principal) pueden existir en varias posiciones en el polinucleótido. Un experto en la materia apreciará que los análogos de nucleótidos u otra alteración o alteraciones se pueden encontrar en cualquier posición de un polinucleótido de manera que la función del polinucleótido no se vea sustancialmente disminuida. Una alteración también puede ser una alteración terminal 5' o 3'. En algunas realizaciones, el polinucleótido incluye una alteración en el extremo 3'. El polinucleótido puede contener de alrededor del 1 % a alrededor del 100 % de nucleótidos alternativos (ya sea en relación con el contenido de nucleótidos total, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje intermedio (es decir, del 1 % al 20 % , del 1 % al 25 % , del 1 % al 50 % , del 1 % al 60 % , del 1 % al 70 % , del 1 % al 80 % , del 1 % al 90 % , del 1 % al 95 % , del 10 % al 20 % , del 10 % al 25 % , del 10 % al 50 % , del 10 % al 60 % , del 10 % al 70 % , del 10 % al 80 % , del 10 % al 90 % , del 10 % al 95 % , del 10 % al 100 % , del 20 % al 25 % , del 20 % al 50 % , del 20 % al 60 % , del 20 % al 70 % , del 20 % al 80 % , del 20 % al 90 % , del 20 % al 95 % , del 20 % al 100 % , del 50 % al 60 % , del 50 % al 70 % , del 50 % al 80 % , del 50 % al 90 % , del 50 % al 95 % , del 50 % al 100 % , del 70 % al 80 % , del 70 % al 90 % , del 70 % al 95 % , del 70 % al 100 % , del 80 % al 90 % , del 80 % al 95 % , del 80 % al 100 % , del 90 % al 95 % , del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 %). Se entenderá que cualquier porcentaje restante está representado por la presencia de A, G, U o C.

Los polinucleótidos pueden contener un mínimo del uno y un máximo del 100 % de nucleótidos alternativos o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos el 5 % de nucleótidos alternativos, al menos el 10 % de nucleótidos alternativos, al menos el 25 % de nucleótidos alternativos, al menos el 50 % de nucleótidos alternativos, al menos el 80 % de nucleótidos alternativos o al menos el 90 % de nucleótidos alternativos. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden contener una pirimidina alternativa, tal como un uracilo o citosina alternativas. En algunas realizaciones, al menos el 5 % , al menos el 10 % , al menos el 25 % , al menos el 50 % , al menos el 80 % , al menos el 90 % o el 100 % del uracilo del polinucleótido se reemplaza con un uracilo alternativo (por ejemplo, un uracilo sustituido en la posición 5). El uracilo alternativo se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple, o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas). En algunas realizaciones, al menos el 5 % , al menos el 10 % , al menos el 25 % , al menos el 50 % , al menos el 80 % , al menos el 90 % o el 100 % de la citosina del polinucleótido se reemplaza con una citosina alternativa (por ejemplo, una citosina sustituida en 5). La citosina alternativa se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple o se puede reemplazar por una pluralidad de compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas).

En determinadas realizaciones, puede ser deseable que una molécula de ARN (por ejemplo, ARNm) introducida en la célula se degrade intracelularmente. Por ejemplo, puede ser preferible la degradación de una molécula de ARN si se desea un tiempo preciso de la producción de proteínas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la descripción proporciona una molécula de ARN que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula.

El término "polinucleótido" en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que se encuentre o se pueda incorporar en una cadena de oligonucleótidos. Los polinucleótidos ejemplares para su uso según la presente descripción incluyen, pero sin limitación, uno o más de ADN, ARN que incluye ARNm mensajero (ARNm), híbridos de los mismos, agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, ARNpi, ARNhc, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros, vectores, etc., descritos en detalle en esta invención. En algunas realizaciones, los polinucleótidos pueden incluir uno o más ARN mensajeros (ARNm) que tienen uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados (es decir, moléculas de ARNm no naturales).

En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ARNm), fórmula, composición o procedimiento asociado con la misma comprende uno o más polinucleótidos que comprenden características como se describe en los documentos WO2002/098443, WO2003/051401, WO2008/052770, WO2009127230, WO2006122828, WO2008/083949, WO2010088927, WO2010/037539, WO2004/004743, WO2005/016376, WO2006/024518, WO2007/095976, WO2008/014979, WO2008/077592, WO2009/030481, WO2009/095226, WO2011069586, W O2011026641, W O2011/144358, W O2012019780, W O2012013326, WO2012089338, W O 2012113513, W O 2012116811, W O 2012116810, W O2013113502, W O 2013113501, W O 2013113736, WO2013143698, WO2013143699, W O2013143700, W O2013/120626, W O2013120627, WO2013120628, WO2013120629, W O2013174409, W O 2014127917, WO2015/024669, WO2015/024668, WO2015/024667, WO2015/024665, WO2015/024666, WO2015/024664, W O 2015101415, W O 2015101414, W O 2015024667, WO2015062738, W O2015101416.

Alternativas de nucleobase

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden incluir una nucleobase alternativa. Una nucleobase de un ácido nucleico es una base orgánica tal como una purina o pirimidina o un derivado de las mismas. Una nucleobase puede ser una base canónica (por ejemplo, adenina, guanina, uracilo, timina y citosina). Estas nucleobases se pueden alterar o reemplazar por completo para proporcionar moléculas de polinucleótidos que tengan propiedades mejoradas, por ejemplo, mayor estabilidad, tal como resistencia a las nucleasas. Las bases no canónicas o modificadas pueden incluir, por ejemplo, una o más sustituciones o modificaciones incluyendo, pero sin limitación, sustituciones de alquilo, arilo, halo, oxo, hidroxilo, alquiloxi y/o tio; uno o más anillos condensados o abiertos; oxidación; y/o reducción.

La formación de pares de bases de nucleótidos abarca no sólo los pares de bases estándares adenina-timina, adeninauracilo o guanina-citosina, sino también a los pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos alternativos que incluyen bases no estándares o alternativas, donde la disposición de donantes de enlaces de hidrógeno y aceptores de enlaces de hidrógeno permite la unión de hidrógenos entre una base no estándar y una base estándar, o entre dos estructuras complementarias de bases no estándar. Un ejemplo de dicha formación de pares de bases no estándar es la formación de pares de bases entre la inosina y adenina, citosina o uracilo del nucleótido alternativo.

En algunas realizaciones, la nucleobase es un uracilo alternativo. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con un uracilo alternativo incluyen pseudouridina (y ), ribonucleósido de piridin-4-ona, 5-aza-uracilo, 6-aza-uracilo, 2-tio-5-aza-uracilo, 2-tio-uracilo (^s2U), 4-tio-uracilo (^s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uracilo (ho5U), 5-aminoalil-uracilo, 5-halo-uracilo (por ejemplo, 5-yodo-uracilo o 5-bromo-uracilo), 3-metil-uracilo (m3U), 5-metoxi-uracilo (mo5U), ácido uracil 5-oxiacético (cmo5U), éster metílico del ácido uracil 5-oxiacético (mcmo5U), 5-carboximetil-uracilo (cm5u), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uracilo (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetiluracilo (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uracilo (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uracilo (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uracilo (nm5s2U), 5-metilaminometil-uracilo (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uracilo (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uracilo (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uracilo (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uracilo (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo (cmnm5s2U), 5-propinil-uracilo, 1-propinil-pseudouracilo, 5-taurinometil-uracilo (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uracilo (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 5-metil-uracilo (m5U, es decir, que tiene la nucleobase desoxitimina), 1-metil-pseudouridina (m1^), 5-metil-2-tio-uracilo (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouracilo (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metil-dihidrouracilo (m5D), 2-tio-dihidrouracilo, 2-tiodihidropseudouridina, 2-metoxi-uracilo, 2-metoxi-4-tio-uracilo, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3^), 5-(isopentenilaminometil)uracilo (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uracilo (inm5s2U), 5,2'-O-dimetiluridina (m5Um), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um) y 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uracilo, desoxitimidina, 5 -(2 - carbometoxivinil)-uracilo, 5- (carbamoilhidroximetil)-uracilo, 5-carbamoilmetil-2-tio-uracilo, 5-carboximetil-2-tio-uracilo, 5-cianometil-uracilo, 5-metoxi-2-tio-uracilo y 5 -[3 -(1 - E - propenilamino)]uracilo.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una citosina alternativa. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una citosina alternativa incluyen 5-aza-citosina, 6-aza-citosina, pseudoisocitidina, 3-metil-citosina (m3C), N4-acetil-citosina (ac4C), 5-formil-citosina (f5C), N4-metil-citosina (m4C), 5-metil-citosina (m5C), 5-halo-citosina (por ejemplo, 5-yodo-citosina), 5-hidroximetil-citosina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citosina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tio-citosina (s2C), 2-tio-5-metil-citosina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metilzebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citosina, 2-metoxi-5-metil-citosina, 4-metoxipseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, lisidina (k2C), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f5Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1-tio-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-(3-azidopropil)-citosina y 5-(2-azidoetil)-citosina.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una adenina alternativa. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una adenina alternativa incluyen 2-amino-purina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2-amino-6- cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenina, 7-deazaadenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenina (m6t6A), 2 -metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenina (ms2hn6A), N6-acetil-adenina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenina, 8-azido-adenina, N6 - (19 - amino -pentaoxanonadecil)-adenina, 2,8-dimetil-adenina, N6-formil-adenina y N6-hidroximetil-adenina.

En algunas realizaciones, la nucleobase es una guanina alternativa. Las nucleobases y los nucleósidos ejemplares con una guanina alternativa incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetilwiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina submodificada (OHyW *), 7-deaza-guanina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosilqueuosina (galQ), manosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanina (preQ1), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanina, 6-tio-guanina, 6-tio-7-deaza-guanina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanina, 7-metil-guanina (m7G), 6-tio-7-metil-guanina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanina, 1-metil-guanina (m1G), N2-metilguanina (m2G), N2,N2-dimetil-guanina (m22G), N2,7-dimetil-guanina (m2,7G), N2,N2,7-dimetil-guanina (m2,2,7G), 8-oxo-guanina, 7-metil-8-oxo-guanina, 1-metil-6-tio-guanina, N2-metil-6-tio-guanina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanina, N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2,7Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1Im), 1-tioguanina y O-6-metil-guanina.

La nucleobase alternativa de un nucleótido puede ser independientemente una purina, una pirimidina, una purina o un análogo de pirimidina. Por ejemplo, la nucleobase puede ser una alternativa a la adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina. En otra realización, la nucleobase también puede incluir, por ejemplo, derivados naturales y sintéticos de una base, incluyendo pirazolo[3,4-d]pirimidinas, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo (por ejemplo, 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, deazaguanina, 7-deazaguanina, 3-deazaguanina, deazaadenina, 7-deazaadenina, 3-deazaadenina, pirazolo[3,4-d]pirimidina, imidazo[1,5-a]1,3,5 triazinonas, 9-deazapurinas, imidazo[4,5-d]pirazinas, tiazolo[4,5-d]pirimidinas, pirazin-2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; o 1,3,5 triazina. Cuando los nucleótidos se representan usando la abreviatura A, G, C, T o U, cada letra se refiere a la base representativa y/o derivados de las mismas, por ejemplo, A incluye adenina o análogos de adenina, por ejemplo, 7-deaza adenina).

Alteraciones en el Azúcar

Los nucleósidos incluyen una molécula de azúcar (por ejemplo, un azúcar de 5 carbonos o 6 carbonos, tales como pentosa, ribosa, arabinosa, xilosa, glucosa, galactosa o un derivado desoxi de los mismos) en combinación con una nucleobase, mientras que los nucleótidos son nucleósidos que contiene un nucleósido y un grupo fosfato o un grupo alternativo (por ejemplo, boranofosfato, tiofosfato, selenofosfato, fosfonato, grupo alquilo, amidato y glicerol). Un nucleósido o nucleótido puede ser una especie canónica, por ejemplo, un nucleósido o nucleótido que incluye una nucleobase canónica, azúcar y, en el caso de los nucleótidos, un grupo fosfato, o puede ser un nucleósido o nucleótido alternativo que incluye uno o más componentes alternativos. Por ejemplo, los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden alterarse en el azúcar del nucleósido o nucleótido. En algunas realizaciones, los nucleósidos o nucleótidos alternativos incluyen la estructura:

En cada una de las Fórmulas II', III', IV' y V',

cada uno de m y n es independientemente, un número entero de 0 a 5,

cada uno de U y U' independientemente, es O, S, N(Ru)nuo C(RU)nu, donde nu es un número entero de 0 a 2 y cada RU es, independientemente, H, halo o alquilo opcionalmente sustituido;

cada uno de R1', R2', R1", R2", R1', R2, R3, R4 y R5 es, independientemente, si está presente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo opcionalmente sustituido, alcoxi opcionalmente sustituido, alqueniloxi opcionalmente sustituido, alquiniloxi opcionalmente sustituido, aminoalcoxi opcionalmente sustituido, alcoxialcoxi opcionalmente sustituido, hidroxialcoxi opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, arilo opcionalmente sustituido, aminoalquilo opcionalmente sustituido, aminoalquenilo opcionalmente sustituido, aminoalquinilo opcionalmente sustituido, o ausente; donde la combinación de R3 con uno o más de R1', R1", R2', R2"o R5 (por ejemplo, la combinación de R1' y R3, la combinación de R1" y R3, la combinación de R2' y R3, la combinación de R2" y R3, o la combinación de R5 y R3) pueden unirse entre sí para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están unidos proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); donde la combinación de R5 con uno o más de R1', R1", R2'o R2" (por ejemplo, la combinación de R1' y R5, la combinación de R1" y R5, la combinación de R2' y R5, o la combinación de R2" y R5) pueden unirse entre sí para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están unidos, proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); y donde la combinación de R4 y uno o más de R1' R1", R2', R2", R3o R5 pueden unirse entre sí para formar alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido y, tomados junto con los carbonos a los que están unidos proporcionan un heterociclilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, un heterociclilo bicíclico, tricíclico o tetracíclico); cada uno de m' y m" es, independientemente, un número entero de 0 a 3 (por ejemplo, de 0 a 2, de 0 a 1, de 1 a 3 o de 1 a 2);

cada uno de Y1, Y2 e Y3 es, independientemente, O, S, Se,-NRN1-, alquileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido, donde RN1es H, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o está ausente;

cada Y4 es, independientemente, H, hidroxi, tiol, boranilo, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, alcoxi opcionalmente sustituido, alqueniloxi opcionalmente sustituido, alquiniloxi opcionalmente sustituido, tioalcoxi opcionalmente sustituido, alcoxialcoxi opcionalmente sustituido o amino opcionalmente sustituido;

cada Y5 es, independientemente, O, S, Se, alquileno opcionalmente sustituido (por ejemplo, metileno) o heteroalquileno opcionalmente sustituido; y

B es una nucleobase, ya sea modificada o sin modificar. En algunas realizaciones, el grupo 2'-hidroxi (OH) puede modificarse o reemplazarse con varios sustituyentes diferentes. Las sustituciones ejemplares en la posición 2' incluyen, pero sin limitación, H, azido, halo (por ejemplo, fluoro, alquilo C^{1 -6} opcionalmente sustituido; alcoxi C^1-6 opcionalmente sustituido (por ejemplo, metoxi o etoxi); ariloxi C^{6 -10} opcionalmente sustituido; cicloalquilo C^{3 -8} opcionalmente sustituido; aril C^{6 -10} -alcoxi C^{1 -6} opcionalmente sustituido; (heterociclil)oxi C^{1 -12} opcionalmente sustituido; un azúcar (por ejemplo, ribosa, pentosa o cualquiera de las descritas en esta invención); un polietilenglicol (PEG), -O(CH² CH² O)nCH² CH² OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 8, de 0 a 10, de 0 a 16, de 1 a 4, de 1 a 8, de 1 a 10, de 1 a 16, de 1 a 20, de 2 a 4, de 2 a 8, de 2 a 10, de 2 a 16, de 2 a 20, de 4 a 8, de 4 a 10, de 4 a 16 y de 4 a 20); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los que el 2'-hidroxilo está conectado por un puente de alquileno C^{1 -6} o heteroalquileno C^{1 -6} al carbono 4' del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ejemplares incluyen puentes de metileno, propileno, éter o amino; aminoalquilo, como se define en esta invención; aminoalcoxi, como se define en esta invención; amino como se define en esta invención; y aminoácido, como se define en esta invención.

Generalmente, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene un oxígeno. Los ejemplos de nucleótidos alternativos no limitativos incluyen el reemplazo del oxígeno en la ribosa (por ejemplo, con S, Se o alquileno, tal como metileno o etileno); adición de un doble enlace (por ejemplo, para reemplazar la ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión de anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como para anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino (que también tiene una cadena principal de fosforamidato); formas multicíclicas (por ejemplo, triciclo; y formas "desbloqueadas", tales como ácido nucleico de glicol (GNA) (por ejemplo, R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treósico (TNA, donde la ribosa se reemplaza con a-L-treofuranosil-(3^2')) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces 2-amino-etil-glicina reemplazan la cadena principal de ribosa y fosfodiéster).

En algunas realizaciones, el grupo de azúcar contiene uno o más carbonos que posean la configuración estereoquímica opuesta a la del carbono correspondiente en la ribosa. Por lo tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, por ejemplo, arabinosa o L-ribosa, como azúcar.

En algunas realizaciones, el polinucleótido de la descripción incluye al menos un nucleósido donde el azúcar es L-ribosa, 2'-O-metil-ribosa, 2'-fluoro-ribosa, arabinosa, hexitol, un LNA o un PNA.

Alteraciones en el enlace internucleósido

Se pueden alterar nucleótidos alternativos en el enlace internucleósido (por ejemplo, cadena principal de fosfato). En esta invención, en el contexto de la cadena principal polinucleotídica, los términos "fosfato" y "fosfodiéster" se usan indistintamente. Los grupos fosfato de la cadena principal se pueden alterar reemplazando uno o más de los átomos de oxígeno con un sustituyente diferente.

Los nucleótidos alternativos pueden incluir el reemplazo total de un resto de fosfato inalterado con otro enlace internucleósido como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos fosfato alternativos incluyen, pero sin limitación, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrógeno fosfonatos, fosforamidatos, fosforodiamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. El enlazador de fosfato también se puede alterar mediante la sustitución de un enlace de oxígeno con nitrógeno (fosforamidatos en puente), azufre (fosforotioatos en puente) y carbono (fosfonatos de metileno en puente).

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden incluir el reemplazo de uno o más de los oxígenos que no forman puentes con un resto borano (BH³ ), azufre (tio), metilo, etilo y/o metoxi. Como ejemplo no limitativo, dos oxígenos que no forman puentes en la misma posición (por ejemplo, la posición alfa (a), beta (p) o gamma (^y )) pueden reemplazarse con un azufre (tio) y un metoxi.

El reemplazo de uno o más de los átomos de oxígeno en la posición a del resto fosfato (por ejemplo, a-tio fosfato) se proporciona para conferir estabilidad (tal como frente a exonucleasas y endonucleasas) al ARN y al ADN a través de los enlaces de la cadena principal de fosforotioato no naturales. El ^a Dⁿ y el ARN de fosforotioato tienen una mayor resistencia a las nucleasas y, posteriormente, una vida media más prolongada en un entorno celular.

En esta invención se describen otros enlaces internucleósido que pueden emplearse según la presente descripción, incluyendo los enlaces internucleósido que no contienen un átomo de fósforo.

Sitios internos de entrada al ribosoma

Los polinucleótidos pueden contener un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma, o puede servir como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Un polinucleótido que contiene más de un sitio de unión al ribosoma funcional puede codificar varios péptidos o polipéptidos que los ribosomas traducen de forma independiente (por ejemplo, ARNm multicistrónico). Cuando los polinucleótidos se proporcionan con un IRES, además se proporciona opcionalmente una segunda región traducible. Los ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar según la presente descripción incluyen, sin limitación, los de picornavirus (por ejemplo, FMDV), virus de plagas (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

5'-UTR

Se puede proporcionar una 5'-UTR como una región flanqueante para los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm). Una 5'-UTR puede ser homóloga o heteróloga a la región codificante que se encuentra en un polinucleótido. Pueden incluirse múltiples 5'-UTR en la región flanqueante y pueden ser iguales o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluyendo ninguna, puede optimizarse por codones y cualquiera puede contener independientemente una o más alteraciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.

Se muestra en la Tabla 21 en la Solicitud Provisional de EE.UU. n.° 61/775.509, y en la Tabla 21 y en la Tabla 22 en la Solicitud Provisional de EE.UU. n.° 61/829.372, una lista del sitio de inicio y finalización de polinucleótidos alternativos (por ejemplo, ARNm) de la descripción. En la Tabla 21, cada 5'-UTR (5-UTR-005 a 5'-U^t R 68511) se identifica por su sitio de inicio y finalización en relación con su transcrito nativo o natural (homólogo) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos de ENSEMBL).

Para alterar una o más propiedades de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm), se pueden diseñar 5'-UTR que son heterólogas a la región codificante de un polinucleótido alternativo (por ejemplo, ARNm). A continuación, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) pueden administrarse a células, tejidos u organismos y obtener resultados tales como el nivel de proteína, la localización, y/o la vida media para evaluar los efectos beneficiosos que la 5'-UTR heteróloga puede tener sobre los polinucleótidos alternativos (ARNm). Pueden utilizarse variantes de las 5'-UTR donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluyendo A, T, C o G. Las 5'-UTR también se pueden optimizar por codones o alterar de cualquier manera descrita en esta invención.

5'-UTR, 3'-UTR y elementos de mejora de la traducción (TEE)

La 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos un elemento de mejora de la traducción. El término "elemento de mejora de la traducción" se refiere a secuencias que aumentan la cantidad de polipéptido o proteína producida a partir de un polinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el T E E puede ubicarse entre el promotor de la transcripción y el codón de inicio. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) con al menos un T E E en la 5'-UTR pueden incluir una cap en la 5'-UTR. Además, al menos un TEE puede ubicarse en la 5'-UTR de polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que experimentan una traducción dependiente de cap o independiente de cap.

En un aspecto, los T E E son elementos conservados en la UTR que pueden promover la actividad de traducción de un polinucleótido tal como, pero sin limitación, la traducción dependiente de cap o independiente de cap. La conservación de estas secuencias ha sido previamente demostrada por Panek y col. (Nucleic Acids Research, 2013, 1-10) en 14 especies, incluyendo los seres humanos.

En un ejemplo no limitativo, los T E E conocidos pueden estar en el líder 5' de la proteína del homeodominio Gtx (Chappell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004).

En otro ejemplo no limitativo, los T E E se describen como SEQ ID NO: 1-35 en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° 2009/0226470, SEQ ID NO: 1-35 en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° 2013/0177581, SEQ ID NO: 1-35 en la Publicación de Patente Internacional n.° WO2009/075886, SEQ ID NO: 1-5 y 7-645 en la Publicación de Patente Internacional n.° WO2012/009644, SEQ ID NO: 1 en la Publicación de Patente Internacional n.° WO1999/024595, SEQ ID NO: 1 en la Patente de EE.UU n.° 6.310.197 y SEQ ID NO: 1 en la Patente de EE.UU. n.° 6.849.405.

En otro ejemplo no limitativo más, el T E E puede ser un sitio interno de entrada a ribosoma (IRES), H CV-IR ES o un elemento IRES tales como, pero sin limitación, los descritos en la Patente de EE.UU. n.° 7.468.275, las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2007/0048776 y 2011/0124100 y las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO2007/025008 y WO2001/055369. Los elementos IRES pueden incluir, pero sin limitación, las secuencias Gtx (por ejemplo, Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) descritas por Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS 102:6273-6278, 2005) y en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2007/0048776 y 2011/0124100 y la Publicación de Patente Internacional n.° WO2007/025008.

Los "polinucleótidos potenciadores de la traducción" son polinucleótidos que incluyen uno o más de los TEE específicos ejemplificados en esta invención y/o descritos en la técnica (véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. n.° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273, 7.183.395, las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 20090/226470, 2007/0048776, 2011/0124100, 2009/0093049, 2013/0177581, las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° WO2009/075886, WO2007/025008, WO2012/009644, WO2001/055371

WO 1999/024595 y las Patentes Europeas n.° 2610341 y 2610340) o sus variantes, homólogos o derivados funcionales. Una o varias copias de un T E E específico pueden estar presentes en un polinucleótido (por ejemplo, ARNm). Los T E E en los polinucleótidos potenciadores de la traducción se pueden organizar en uno o más segmentos de secuencia. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los T E E específicos ejemplificados en esta invención, estando presente cada T E E en una o más copias. Cuando están presentes múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción, pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por lo tanto, los múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción pueden albergar tipos idénticos o diferentes de los T E E específicos ejemplificados en esta invención, un número idéntico o diferente de copias de cada uno de los T E E específicos y/o una organización idéntica o diferente de los T E E dentro de cada segmento de secuencia.

Un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos un T EE que se describe en las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886, WO2007/025008, WO1999/024595, las Publicaciones de Patentes Europeas n.° 2610341 y 2610340, las Patentes de EE.UU. n.° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273, 7.183.395 y las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2009/0226470, 2011/0124100, 2007/0048776, 2009/0093049 y 2013/0177581. El T E E puede estar ubicado en la 5'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm).

Un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos un T EE que tenga al menos el 50 % , al menos el 55 % , al menos el 60 % , al menos el 65 % , al menos el 70 % , al menos el 75 % , al menos el 80 % , al menos el 85 % , al menos el 90 % , al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad con los T EE descritos en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 y 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes Europeas n.° 2610341 y 2610340, las Patentes de EE.UU. n.° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273, 7.183.395.

La 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias TEE. Las secuencias de T E E en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) pueden ser secuencias de T E E iguales o diferentes. Las secuencias TEE pueden estar en un patrón tal como ABABAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes de las mismas, repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una secuencia T EE diferente a nivel de nucleótidos.

En algunos casos, la 5'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias TEE. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, la 5'-UTR puede incluir un módulo espaciador de secuencia T E E repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o más de 9 veces en la 5'-UTR.

En otros aspectos, el espaciador que separa dos secuencias T E E puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción, tales como, pero sin limitación, secuencias miR (por ejemplo, sitios de unión de miR y semillas de miR). Como ejemplo no limitativo, cada espaciador usado para separar dos secuencias T EE puede incluir una secuencia miR diferente o un componente de una secuencia miR (por ejemplo, secuencia semilla miR).

En algunos aspectos, el T E E en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos el 5 % , al menos el 10 % , al menos el 15 % , al menos el 20 % , al menos el 25 % , al menos el 30 % , al menos el 35 % , al menos el 40 % , al menos el 45 % , al menos el 50 % , al menos el 55 % , al menos el 60 % , al menos el 65 % , al menos el 70 % , al menos el 75 % , al menos el 80 % , al menos el 85 % , al menos el 90 % , al menos el 95 % , al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias T E E descritas en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 and 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes Europeas n.° 2610341 y 2610340 y las Patentes de EE.UU. n.° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273 y 7.183.395. En otra realización, el T E E en la 5'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5 -15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias T E E descritas en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 and 2011/0124100, las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y WO2007/025008, las Publicaciones de Patentes Europeas n.° 2610341 y 2610340 y las Patente de EE.UU. n.° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273 y 7.183.395.

En determinados casos, el T E E en la 5'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción puede incluir al menos el 5 % , al menos el 10 % , al menos el 15 % , al menos el 20 % , al menos el 25 % , al menos el 30 % , al menos el 35 % , al menos el 40 % , al menos el 45 % , al menos el 50 % , al menos el 55 % , al menos el 60 % , al menos el 65 % , al menos el 70 %, al menos el 75 % , al menos el 80%, al menos el 85 % , al menos el 90 % , al menos el 95 % , al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias T E E descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS 102:6273-6278, 2005), en la Tabla complementaria 1 y en la Tabla complementaria 2 descritas por Wellensiek y col (Genome-wide profiling of human cap-independent translationenhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522). En otra realización, el T ^e E en la 5'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5 -15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias T EE descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (PNAS 102:6273-6278, 2005), en la Tabla complementaria 1 y en la Tabla complementaria 2 descritas por Wellensiek y col (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522).

En algunos casos, el T E E utilizado en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) es una secuencia IRES tales como, pero sin limitación, las descritas en la Patente de EE.UU. n.° 7.468.275 y la Publicación de Patente Internacional n.° WO2001/055369.

En algunos aspectos, los T EE utilizados en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones de Patentes de E ^e .^u U. n.° 2007/0048776 y 2011/0124100 y las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO2007/025008 y WO2012/009644.

En algunos casos, los T E E utilizados en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden ser un elemento regulador de la transcripción descrito en las Patentes de EE.UU. n.° 7.456.273 y 7.183.395, la Publicación de Patente de EE.UU. n.° 2009/0093049 y la Publicación Internacional n.° W O2001/055371. Los elementos reguladores de la transcripción pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitación, los procedimientos descritos en las Patentes de EE.UU. n.° 7.456.273 y 7.183.395, la Publicación de Patente de EE.UU. n.° 2009/0093049 y la Publicación Internacional n.° W O2001/055371.

En otros aspectos más, el T E E utilizado en la 5'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) es un polinucleótido o una porción del mismo como se describe en las Patentes de EE.UU. n.° 7.456.273 y 7.183.395, la Publicación de Patente de EE.UU. n.° 2009/0093049 y la Publicación Internacional n.° WO2001/055371.

La 5'-UTR que incluye al menos un T E E descrito en esta invención puede incorporarse en una secuencia monocistrónica tal como, pero sin limitación, un sistema de vector o un vector de polinucleótido. Como ejemplo no limitativo, los sistemas de vectores y los vectores de polinucleótidos pueden incluir los descritos en las Patentes de EE.UU. n.° 7.456.273 y 7.183.395, las Publicaciones de Patentes de EE.UU. n.° 2007/0048776, 2009/0093049 y 2011/0124100 y las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° WO2007/025008 y W O2001/055371.

Los T EE descritos en esta invención pueden estar ubicados en la 5'-UTR y/o la 3'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm). Los T EE ubicados en la 3'-UTR pueden ser los mismos y/o diferentes a los T E E ubicados en y/o descritos para su incorporación en la 5'-UTR.

En algunos casos, la 3'-UTR de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11 , al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias TEE. Las secuencias de T E E en la 3'-UTR de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden ser secuencias de T E E iguales o diferentes. Las secuencias TEE pueden estar en un patrón tal como ABABAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes de las mismas, repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una secuencia T E E diferente a nivel de nucleótidos.

En un aspecto, la 3'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias TEE. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, la 3'-UTR puede incluir un módulo espaciador de secuencia T EE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o más de 9 veces en la 3'-UTR.

En otros casos, el espaciador que separa dos secuencias T E E puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción, tales como, pero sin limitación, secuencias miR descritas en esta invención (por ejemplo, sitios de unión de miR y semillas de miR). Como ejemplo no limitativo, cada espaciador usado para separar dos secuencias T EE puede incluir una secuencia miR diferente o un componente de una secuencia miR (por ejemplo, secuencia semilla miR).

En otros casos más, la incorporación de una secuencia miR y(o una secuencia T E E cambia la forma de la región del bucle en horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (véase por ejemplo, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility (Un cambio de estructura de ARN inducido por Pumilio en p27-3'UTR controla la accesibilidad de miR-221 y miR-22). Nature Cell Biology. 2010). Bucles en horquilla

Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) pueden incluir un bucle en horquilla tal como, pero sin limitación, un bucle en horquilla de histona. El bucle en horquilla puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud de alrededor de 25 o alrededor de 26 nucleótidos, tal como, pero sin limitación, las SEQ ID NO: 7-17, como se describe en la Publicación de Patente Internacional n.° WO2013/103659. El bucle en horquilla de la histona puede ubicarse 3' con respecto a la región codificante (por ejemplo, en el extremo 3' de la región codificante). Como ejemplo no limitativo, el bucle en horquilla puede ubicarse en el extremo 3' de un polinucleótido descrito en esta invención. En algunos casos, un polinucleótido (por ejemplo, un ARNm) incluye más de un bucle en horquilla (por ejemplo, dos bucles en horquilla). Los ejemplos de secuencias de bucle en horquilla se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales n.° W O2012/019780 y WO201502667. En algunos aspectos, un polinucleótido incluye la secuencia de bucle en horquilla C A A A G G C TCTTTTC A G A G C C A C C A (SEQ ID NO: 5). En otros, un polinucleótido incluye la secuencia de bucle en horquilla CA A A GG CU CU U U U CAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 6).

Un bucle en horquilla puede estar ubicado en una segunda región terminal de un polinucleótido. Como ejemplo no limitativo, el bucle en horquilla puede ubicarse dentro de una región no traducida (por ejemplo, 3'-UTR) en una segunda región terminal.

En algunos casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitación, ARNm, que incluye el bucle en horquilla de la histona, se puede estabilizar mediante la adición de una región estabilizadora en 3' (por ejemplo una región estabilizadora en 3' que incluye al menos un nucleósido de terminación de la cadena). Sin desear limitarse a la teoría, la adición de al menos un nucleósido de terminación de la cadena puede ralentizar la degradación de un polinucleótido y, por lo tanto, puede aumentar la vida media del polinucleótido.

En otros casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitación, ARNm, que incluye el bucle en horquilla de la histona, puede estabilizarse mediante una alteración en la región 3' del polinucleótido que puede evitar y/o inhibir la adición de oligio(U) (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional n.° WO2013/103659,).

En otros casos más, un polinucleótido tal como, pero sin limitación, ARNm, que incluye el bucle en horquilla de la histona, puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'-O-metilnucleósidos, 3'-O-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir un bucle en horquilla de histona, una región poli-A y/o una estructura de 5'-cap. El bucle en horquilla de la histona puede estar antes y/o después de la región poli-A. Los polinucleótidos que incluyen el bucle en horquilla de histona y una secuencia de región poli-A pueden incluir un nucleósido de terminación de cadena descrito en esta invención.

En otros aspectos, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir un bucle en horquilla de histona y una estructura de 5'-cap. La estructura 5'-cap puede incluir, pero sin limitación, las descritas en esta invención y/o conocidas en la técnica.

En algunos casos, la región de bucle en horquilla conservada puede incluir una secuencia miR descrita en esta invención. Como ejemplo no limitativo, la región del bucle en horquilla puede incluir la secuencia semilla de una secuencia miR descrita en esta invención. En otro ejemplo no limitativo, la región del bucle en horquilla puede incluir una secuencia semilla de m iR-122.

En determinados aspectos, la región de bucle de en horquilla conservada puede incluir una secuencia miR descrita en esta invención y también puede incluir una secuencia TEE.

En algunos casos, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia T E E cambia la forma de la región del bucle en horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (véase, por ejemplo, Kedde y col. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility (Un cambio de estructura de ARN inducido por Pumilio en p27-3'UTR controla la accesibilidad de miR-221 y miR-22). Nature Cell Biology. 2010).

Los polinucleótidos pueden incluir al menos un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o señal de poliadenilación. Los ejemplos no limitativos de secuencias de polinucleótidos que codifican al menos un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación se describen en la Publicación de Patentes Internacionales n.° WO2013/120497, W O2013/120629, WO2013/120500, W O2013/120627, WO2013/120498, W O2013/120626, W O2013/120499 y W O2013/120628. En determinados casos, el polinucleótido que codifica un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno patógeno o un fragmento del mismo, tales como las secuencias de polinucleótidos descritas en la Publicación de Patente Internacional n.° W O2013/120499 y W O2013/120628. En otros casos, el polinucleótido que codifica un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar una proteína terapéutica, tales como las secuencias de polinucleótidos descritas en la Publicación de Patente Internacional n.° W O2013/120497 y W O2013/120629. En algunos casos, el polinucleótido que codifica un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno tumoral o un fragmento del mismo, tales como las secuencias de polinucleótidos descritas en la Publicación de Patente Internacional n.° W O2013/120500 y W O2013/120627. En otros casos, el polinucleótido que codifica un bucle en horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno alérgeno o un autoantígeno autoinmune, tales como las secuencias de polinucleótidos descritas en la Publicación de Patente Internacional n.° W O2013/120498 y WO2013/120626.

Regiones poli-A

Un polinucleótido o ácido nucleico (por ejemplo, un ARNm) puede incluir una secuencia poliA y/o señal de poliadenilación. Una secuencia poliA puede estar compuesta en su totalidad o en su mayor parte por nucleótidos de adenina o análogos o derivados de los mismos. Una secuencia poliA puede ser una cola situada adyacente a una región 3' no traducida de un ácido nucleico.

Durante el procesamiento del ARN, normalmente se añade una cadena larga de nucleótidos de adenosina (región poli-A) a las moléculas de ARN mensajero (ARNm) para aumentar la estabilidad de la molécula. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se escinde para liberar un 3'-hidroxilo. A continuación, la poli-A polimerasa añade una cadena de nucleótidos de adenosina al ARN. El procedimiento, denominado poliadenilación, añade una región poli-A que tiene entre 100 y 250 residuos de longitud.

Las longitudes únicas de la región poli-A pueden proporcionar determinadas ventajas a los polinucleótidos alternativos de la presente descripción.

Generalmente, la longitud de una región poli-A de la presente descripción tiene al menos 30 nucleótidos de longitud. En otra realización, la región poli-A tiene al menos 35 nucleótidos de longitud. En otra realización, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 70 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1700 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 1900 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otra realización, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos.

En algunos aspectos, la región poli-A puede tener una longitud de 80 nucleótidos, 120 nucleótidos, 160 nucleótidos en una molécula polinucleotídica alternativa descrita en esta invención.

En otros aspectos, la región poli-A puede tener una longitud de 20, 40, 80, 100, 120, 140 ó 160 nucleótidos en una molécula polinucleotídica alternativa descrita en esta invención.

En algunos casos, la región poli-A se diseña en relación con la longitud de los polinucleótidos totales alternativos. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante del polinucleótido alternativo, la longitud de una característica o región particular del polinucleótido alternativo (tal como ARNm) o en la longitud del producto final expresado a partir del polinucleótido alternativo. Cuando se relaciona con cualquier característica del polinucleótido alternativo (por ejemplo, que no sea la porción de ARNm que incluye la región poli-A), la región poli-A puede ser el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o el 100 % mayor en longitud que la característica adicional. La región poli-A también puede diseñarse como una fracción del polinucleótido alternativo al que pertenece. En este contexto, la región poli-A puede ser el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o el 90 % o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la región poli-A.

En determinados casos, pueden usarse los sitios de unión diseñados y/o la conjugación de polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) para la proteína de unión a poli-A para mejorar la expresión. Los sitios de unión diseñados pueden ser secuencias sensoras que pueden funcionar como sitios de unión para ligandos del microentorno local de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm). Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) pueden incluir al menos un sitio de unión diseñado para alterar la afinidad de unión de la proteína de unión poli-A (PABP) y análogos de la misma. La incorporación de al menos un sitio de unión diseñado puede aumentar la afinidad de unión de la PABP y análogos de la misma.

Además, múltiples polinucleótidos distintos (por ejemplo, ARNm) se pueden unir a la PABP (proteína de unión a poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos alternativos en el extremo 3' de la región poli-A. Los experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y el día 7 después de la transfección. Como ejemplo no limitativo, los experimentos de transfección pueden usarse para evaluar el efecto sobre la afinidad de unión de PABP o análogos de la misma como resultado de la adición de al menos un sitio de unión diseñado.

En determinados casos, se puede usar una región poli-A para modular el inicio de la traducción. Aunque sin desear limitarse a la teoría, la región poli-A recluta PABP que, a su vez, puede interactuar con el complejo de iniciación de la traducción y, por lo tanto, puede ser esencial para la síntesis de proteínas.

En algunos casos, también se puede usar una región poli-A en la presente descripción para proteger contra la digestión con 3'-5'-exonucleasa.

En algunos aspectos, un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir un cuarteto poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanosina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En esta realización, el cuarteto G se incorpora al final de la región poli-A. Los polinucleótidos resultantes (por ejemplo, ARNm) pueden ensayarse en cuanto a estabilidad, producción de proteínas y otros parámetros, incluyendo la vida media en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto poliA-G da como resultado una producción de proteínas equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una región poli-A de 120 nucleótidos sola.

En algunos casos, un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir una región poli-A y puede estabilizarse mediante la adición de una región estabilizadora en 3'. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) con una región poli-A pueden incluir además una estructura 5'-cap.

En otros casos, un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) puede incluir un cuarteto poli-A-G. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) con un cuarteto de poli-A-G pueden incluir además una estructura 5'-cap.

En algunos casos, la región estabilizadora 3' que se puede usar para estabilizar un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) que incluye una región poli-A o un cuarteto poli-A-G puede ser, pero sin limitación, las descritas en la Publicación de Patente Internacional n.° WO2013/103659. En otros casos, la región estabilizadora en 3' que puede usarse con la presente descripción incluye un nucleósido de terminación de cadena tal como 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina, 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-dideoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina, 2',3' -didesoxitimina, un 2'-desoxinucleósido o un O-metilnucleósido.

En otros casos, un polinucleótido tal como, pero sin limitación, ARNm, que incluye una región poliA o un cuarteto poli-A-G, puede estabilizarse mediante una alteración en la región 3' del polinucleótido que puede evitar y/o inhibir la adición de oligo(U) (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional n.° WO2013/103659).

En otros aspectos más, un polinucleótido tal como, pero sin limitación, ARNm, que incluye una región poli-A o un cuarteto poli-A-G, puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'-O-metilnucleósidos, 3'-O-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.

Nucleósidos de terminación de cadena

Un ácido nucleico puede incluir un nucleósido de terminación de cadena. Por ejemplo, un nucleósido de terminación de cadena puede incluir aquellos nucleósidos desoxigenados en las posiciones 2' y/o 3' de su grupo de azúcar. Dichas especies pueden incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitimina y 2',3'-didesoxinucleósidos, tales como 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiuridina, 2',3'-didesoxicitosina, 2',3'-didesoxiguanosina y 2',3'-didesoxitimina.

Los ARN y los complejos de ácido nucleico multimérico descritos en esta invención se pueden usar como agentes terapéuticos o son ARNm terapéuticos. Como se usa en esta invención, el término "ARNm terapéutico" se refiere a un ARNm que codifica una proteína terapéutica. Las proteínas terapéuticas median una variedad de efectos en una célula huésped o un sujeto para tratar una enfermedad o mejorar los signos y síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, un ARN o una estructura multimérica descrita en esta invención se puede administrar a un sujeto animal o humano, donde el ARN se traduce in vivo para producir un péptido terapéutico en el sujeto que lo necesita. Por consiguiente, en esta invención se proporcionan composiciones, procedimientos, kits y reactivos para el tratamiento o la prevención de enfermedades o afecciones en seres humanos y otros mamíferos. Los agentes terapéuticos activos de la presente descripción incluyen ARN (por ejemplo, ARNm) descritos en esta invención, células que contienen los ARNm o polipéptidos traducidos de los ARNm, polipéptidos traducidos de los ARNm, células en contacto con células que contienen ARNm o polipéptidos traducidos de los mismos, tejidos que contienen células que contienen los ARNm descritos en esta invención y órganos que contienen tejidos que contienen células que contienen los ARNm descritos en esta invención.

En otro aspecto, la descripción proporciona procedimientos y composiciones útiles para proteger los ARN descritos en esta invención (por ejemplo, transcritos de ARN) de la degradación (por ejemplo, degradación mediada por exonucleasas), tales como los procedimientos y composiciones descritos en los documentos US20150050738A1 y WO2015023975A1.

En algunas realizaciones, los ARN protegidos están presentes fuera de las células. En algunas realizaciones, los ARN protegidos están presentes en las células. En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos y composiciones que son útiles para alterar de manera dirigida los niveles de proteína y/o a Rn después de la transcripción. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en esta invención implican reducir o evitar la degradación o el procesamiento de los ARN diana, elevando así los niveles en estado estacionario de los ARN diana. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en esta invención también, o alternativamente, pueden implicar aumentar la traducción o aumentar la transcripción de los ARN diana, elevando así los niveles de ARN y/o los niveles de proteína de manera dirigida.

Se reconoce que cierta degradación del ARN está mediada por exonucleasas. En algunas realizaciones, las exonucleasas pueden destruir el ARN desde su extremo 3' y/o extremo 5'. Sin desear limitarse a la teoría, en algunas realizaciones, se cree que uno o ambos extremos del ARN pueden protegerse de la actividad de la enzima exonucleasa poniendo en contacto el ARN con oligonucleótidos (oligos) que hibridan con el ARN en o cerca de uno o ambos extremos, aumentando así la estabilidad y/o los niveles del ARN. La capacidad de aumentar la estabilidad y/o los niveles de un ARN dirigiendo el ARN en o cerca de uno o ambos extremos, como se describe en esta invención, es sorprendente en parte debido a la presencia de endonucleasas (por ejemplo, en células) capaces de destruir el ARN a través de la escisión interna. Además, en algunas realizaciones, es sorprendente que un oligonucleótido dirigido a 5' sea efectivo solo (por ejemplo, no en combinación con un oligonucleótido dirigido a 3' o en el contexto de un oligonucleótido de pseudocircularización) para estabilizar los ARN o aumentar los niveles de ARN porque en las células, por ejemplo, las exonucleasas de procesamiento del extremo 3' pueden ser dominantes (por ejemplo, en comparación con las exonucleasas de procesamiento del extremo 5'). Sin embargo, en algunas realizaciones, los oligonucleótidos dirigidos a 3' se usan en combinación con oligonucleótidos dirigidos a 5', o solos, para estabilizar un ARN diana.

En algunas realizaciones, los procedimientos proporcionados en esta invención implican el uso de oligonucleótidos que estabilizan un ARN al hibridar en un región 5' y/o 3' del ARN. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos que evitan o inhiben la degradación de un ARN mediante la hibridación con el ARN pueden denominarse en esta invención "oligonucleótidos estabilizadores". En algunos ejemplos, dichos oligonucleótidos hibridan con un ARN y evitan o inhiben la degradación mediada por exonucleasas. La inhibición de la degradación mediada por exonucleasas incluye, pero sin limitación, reducir el grado de degradación de un ARN particular por exonucleasas. Por ejemplo, una exonucleasa que procesa solo ARN monocatenario puede escindir una porción del ARN hasta una región en la que un oligonucleótido se hibrida con el ARN porque la exonucleasa no puede procesar eficazmente (por ejemplo, atravesar) la región dúplex. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el uso de un oligonucleótido que se dirige a una región particular de un ARN hace posible controlar el grado de degradación del ARN por exonucleasas hasta esa región.

Por ejemplo, el uso de un oligonucleótido (oligo) que hibrida en un extremo de un ARN puede reducir o eliminar la degradación por una exonucleasa que procesa solo ARN monocatenarios de ese extremo. Por ejemplo, el uso de un oligonucleótido que hibrida en el extremo 5' de un ARN puede reducir o eliminar la degradación por una exonucleasa que procesa los ARN monocatenarios en una dirección de 5' a 3'. De manera similar, el uso de un oligonucleótido que hibrida en el extremo 3' de un ARN puede reducir o eliminar la degradación por una exonucleasa que procesa los ARN monocatenarios en una dirección de 3' a 5'. En algunas realizaciones, se pueden usar concentraciones más bajas de un oligo cuando el oligo hibrida en las regiones 5' y 3' del ARN. En algunas realizaciones, un oligo que hibrida en las regiones 5' y 3' del ARN protege las regiones 5' y 3' del ARN de la degradación (por ejemplo, por una exonucleasa). En algunas realizaciones, un oligo que hibrida en las regiones 5' y 3' del ARN crea un ARN pseudocircular (por ejemplo, un ARN circularizado con una región de la cola poliA que sobresale del círculo). En algunas realizaciones, un ARN pseudocircular se traduce con mayor eficacia que un a Rn no pseudocircular.

En algunos aspectos, se proporcionan procedimientos para estabilizar un ARN sintético descrito en esta invención (por ejemplo, un ARN sintético que se va a suministrar a una célula). En algunas realizaciones, los procedimientos implican poner en contacto un ARN sintético con uno o más oligonucleótidos que se unen a una región 5' del ARN sintético y a una región 3' del ARN sintético y que cuando se unen al ARN sintético forman un producto circularizado con el a Rn sintético. En algunas realizaciones, el ARN sintético se pone en contacto con uno o más oligonucleótidos fuera de una célula. En algunas realizaciones, los procedimientos implican además el suministro del producto circularizado a una célula.

En algunos aspectos de la invención, se proporcionan procedimientos para aumentar la expresión de una proteína en una célula que implican el suministro a una célula de un ARN sintético circularizado que codifica la proteína, en el que la síntesis de la proteína en la célula aumenta después del suministro del ARN circularizado a la célula. En algunas realizaciones, el ARN sintético circularizado comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos que implican el suministro a una célula de un ARN sintético circularizado que codifica una proteína, en el que la síntesis de la proteína en la célula aumenta tras el suministro del ARN sintético circularizado a la célula. En algunas realizaciones, un ARN sintético circularizado es un ARN circularizado covalentemente cerrado monocatenario. En algunas realizaciones, un ARN circular covalentemente cerrado monocatenario comprende uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el ARN sintético circularizado se forma sintetizando un ARN que tiene un extremo 5' y uno 3' y ligando los extremos 5' y 3'. En algunas realizaciones, el ARN sintético circularizado se forma mediante la producción de un ARN sintético (por ejemplo, mediante transcripción in vitro o síntesis química artificial (no natural)) y poniendo en contacto el ARN sintético con uno o más oligonucleótidos que se unen a una región 5' del ARN sintético y a una región 3' del ARN sintético, y que cuando se unen al ARN sintético forman un producto circularizado con el ARN sintético.

En algunos aspectos de la invención, se proporciona un oligonucleótido que comprende una región de complementariedad que es complementaria con al menos 5 nucleótidos contiguos de un transcrito de ARN, en el que el nucleótido en el extremo 3' de la región de complementariedad es complementario con un nucleótido dentro de los 10 nucleótidos del sitio de inicio de la transcripción del transcrito de ARN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende nucleótidos unidos por al menos un enlace internucleósido modificado o al menos un nucleótido con puente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene de 8 a 80, de 8 a 50, de 9 a 50, de 10 a 50, de 8 a 30, de 9 a 30, de 10 a 30, de 15 a 30, de 9 a 20, de 8 a 20, de 8 a 15 o de 9 a 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 o más nucleótidos de longitud.

En algunos aspectos de la invención, se proporciona un oligonucleótido que comprende dos regiones de complementariedad, cada una de las cuales es complementaria con al menos 5 nucleótidos contiguos de un transcrito de ARN, en el que el nucleótido en el extremo 3' de la primera región de complementariedad es complementario con un nucleótido dentro de los 100 nucleótidos del sitio de inicio de la transcripción del transcrito de ARN y en el que la segunda región de complementariedad es complementaria con una región del transcrito de ARN que termina dentro de los 300 nucleótidos del extremo 3' del transcrito de ARN.

En esta invención se contemplan varios esquemas de diseño de oligonucleótidos ejemplares para aumentar la estabilidad de las moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) descritas en esta invención. Con respecto a los oligonucleótidos que se dirigen al extremo 3' de un ARN, se contemplan al menos dos esquemas de diseño ejemplares. Como primer esquema, se diseña un oligonucleótido para que sea complementario al extremo 3' de un ARN, antes de la cola poliA. Como segundo esquema, se diseña un oligonucleótido para que sea complementario al extremo 3' del ARN y el oligonucleótido tiene una región poli-T en 5' que hibrida con la cola poliA del ARN.

Con respecto a los oligonucleótidos que se dirigen al extremo 5' de un ARN, se contemplan al menos tres esquemas de diseño ejemplares. Para el esquema uno, se diseña un oligonucleótido para que sea complementario al extremo 5' del ARN. Para el esquema dos, se diseña un oligonucleótido para que sea complementario al extremo 5' del ARN y tiene un saliente en 3' para crear un dúplex de ARN-oligo con un extremo rebajado. En este esquema, el saliente es uno o más nucleótidos C, por ejemplo, dos C, que potencialmente pueden interactuar con una cap de metilguanosina en 5' y estabilizar aún más la cap. El saliente también podría ser potencialmente otro tipo de nucleótido, y sin limitación a C. Para el esquema tres, se diseña un oligonucleótido para incluir una región de bucle para estabilizar una cap de ARN 5'. El ejemplo muestra oligos con bucles para estabilizar una cap de ARN 5' u oligos. En otra realización más, se diseña un oligonucleótido para que se una a los extremos 5' y 3' de un ARN para crear un ARN pseudocircularizado. Por ejemplo, un oligo de mezcla de LNA que se une a las regiones 5' y 3' de un ARN puede lograr una pseudo circularización de ARN mediada por oligo.

Un oligonucleótido diseñado como se ha descrito anteriormente puede probarse para determinar su capacidad para regular al alza el ARN aumentando la estabilidad del ARNm usando los procedimientos descritos en los documentos US20150050738A1 y WO2015023975A1.

Se proporcionan procedimientos para inducir la traducción de un polinucleótido sintético (por ejemplo, un ARNm modificado como se describe en esta invención) para producir un polipéptido en una población celular utilizando los ARNm descritos en esta invención. Dicha traducción puede ser in vivo, ex vivo, en cultivo o in vitro. La población celular se pone en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene un polinucleótido que incorpora el análogo de cap de la descripción y una región traducible que codifica el polipéptido. La población se pone en contacto en condiciones tales que el polinucleótido se localiza en una o más células de la población celular y el polipéptido se traduce en la célula a partir del polinucleótido.

Se proporciona una cantidad efectiva de la composición de un polinucleótido descrito en esta invención en función, al menos en parte, del tejido diana, el tipo de célula diana, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición proporciona una producción eficaz de proteínas en la célula, preferiblemente más eficaz que una composición que contiene un polinucleótido natural correspondiente. El aumento de la eficacia puede demostrarse mediante el aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con el polinucleótido), el aumento de la traducción de proteínas del polinucleótido, la disminución de la degradación del polinucleótido (como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la duración de la traducción de proteínas de una molécula de ARN, o la reducción de la respuesta inmunitaria innata de la célula huésped o la mejora de la utilidad terapéutica.

Los aspectos de la presente descripción se refieren a procedimientos para inducir la traducción in vivo de un polipéptido en un sujeto mamífero que lo necesita. Allí, se administra al sujeto una cantidad efectiva de una composición que contiene un polinucleótido de la descripción que tiene el análogo de cap de la descripción y una región traducible que codifica el polipéptido usando los procedimientos de administración descritos en esta invención. El polinucleótido también puede contener al menos un nucleósido modificado. El polinucleótido se proporciona en una cantidad y en otras condiciones tales que el polinucleótido se localiza en una célula o células del sujeto y el polipéptido de interés se traduce en la célula a partir del polinucleótido. La célula en la que se localiza el polinucleótido, o el tejido en el que está presente la célula, puede ser alcanzada con una o más rondas de administración de polinucleótidos.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren al trasplante de células que contienen moléculas de ARN de la descripción a un sujeto mamífero. La administración de células a sujetos mamíferos es conocida por los expertos en la materia, tales como la implantación local (por ejemplo, administración tópica o subcutánea), el suministro de órganos o inyección sistémica (por ejemplo, inyección intravenosa o inhalación) y la formulación de células en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que contienen moléculas de ARN de la descripción se formulan para la administración por vía intramuscular, transarterial, intraperitoneal, intravenosa, intranasal, subcutánea, endoscópica, transdérmica o intratecal. En algunas realizaciones, la composición se formula para una liberación prolongada.

El sujeto al que se administra el agente terapéutico padece o corre el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección deletérea. Se proporcionan procedimientos para identificar, diagnosticar y clasificar sujetos sobre estas bases, que pueden incluir diagnóstico clínico, niveles de biomarcadores, estudios de asociación del genoma completo (GWAS) y otros procedimientos conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, la la molécula de ARN administrada de la descripción dirige la producción de uno o más polipéptidos que proporcionan una actividad funcional que está sustancialmente ausente en la célula en la que se traduce el polipéptido. Por ejemplo, la actividad funcional faltante puede ser de naturaleza enzimática, estructural o reguladora de genes.

En otras realizaciones, la molécula de ARN administrada de la descripción dirige la producción de uno o más polipéptidos que reemplazan un polipéptido (o múltiples polipéptidos) que está sustancialmente ausente en la célula en la que se traducen el uno o más polipéptidos. Tal ausencia puede deberse a una mutación genética del gen codificante o vía reguladora del mismo. En otras realizaciones, la molécula de ARN administrada de la descripción dirige la producción de uno o más polipéptidos para complementar la cantidad de polipéptido (o múltiples polipéptidos) que está presente en la célula en la que se traducen el uno o más polipéptidos. Alternativamente, el polipéptido traducido sirve para antagonizar la actividad de una proteína endógena presente en, sobre la superficie de, o secretada de la célula. Generalmente, la actividad de la proteína endógena es perjudicial para el sujeto, por ejemplo, debido a la mutación de la proteína endógena que da como resultado una actividad o localización alterada. Además, el polipéptido traducido antagoniza, directa o indirectamente, la actividad de un resto biológico presente en, sobre la superficie de, o secretado de la célula. Los ejemplos de restos biológicos antagonizados incluyen lípidos (por ejemplo, colesterol), una lipoproteína (por ejemplo, lipoproteína de baja densidad), un polinucleótido, un carbohidrato o una toxina de molécula pequeña.

Las proteínas traducidas descritas en esta invención están diseñadas para la localización dentro de la célula, potencialmente dentro de un compartimento específico tal como el núcleo, o están diseñadas para la secreción de la célula o la translocación a la membrana plasmática de la célula.

Como se describe en esta invención, una característica útil de las moléculas de ARN de la descripción de la presente descripción es la capacidad de reducir, evadir, evitar o eliminar la respuesta inmunitaria innata de una célula a un ARN exógeno. Se proporcionan procedimientos para realizar la titulación, reducción o eliminación de la respuesta inmunitaria en una célula o una población de células. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con una primera composición que contiene una primera dosis de un primer ARN exógeno que incluye una región traducible, el análogo cap de la descripción y, opcionalmente, al menos un nucleósido modificado, y se determina el nivel de la respuesta inmunitaria innata de la célula al primer polinucleótido exógeno. Posteriormente, la célula se pone en contacto con una segunda composición, que incluye una segunda dosis del primer polinucleótido exógeno, conteniendo la segunda dosis una cantidad menor del primer polinucleótido exógeno en comparación con la primera dosis. Alternativamente, la célula se pone en contacto con una primera dosis de un segundo polinucleótido exógeno. El segundo polinucleótido exógeno puede contener el análogo de cap de la descripción, que puede ser igual o diferente del primer polinucleótido exógeno o, alternativamente, el segundo polinucleótido exógeno puede no contener el análogo de cap de la descripción. Las etapas de contacto de la célula con la primera composición y/o la segunda composición pueden repetirse una o más veces. Además, la eficiencia de la producción de proteínas (por ejemplo, traducción de proteínas) en la célula se determina opcionalmente, y la célula se puede volver a transfectar con la primera y/o segunda composición repetidamente hasta que se logre una eficiencia de producción de proteína diana.

También se proporcionan en esta invención procedimientos para tratar o prevenir un síntoma de enfermedades caracterizadas por una actividad proteica faltante o aberrante, reemplazando la actividad proteica faltante o superando la actividad proteica aberrante. Debido al rápido inicio de la producción de proteínas tras la introducción de ARNm no naturales, en comparación con los vectores de ADN viral, los compuestos y los ARN de la presente descripción son particularmente ventajosos en el tratamiento de enfermedades agudas tales como sepsis, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. Además, la falta de regulación transcripcional de los ARNm no naturales de la presente descripción es ventajosa porque se puede lograr una titulación precisa de la producción de proteínas. Múltiples enfermedades se caracterizan por la ausencia (o disminución sustancial de tal manera que no se produce la función proteica adecuada) de la actividad proteica. Dichas proteínas pueden no estar presentes, están presentes en cantidades muy bajas o son esencialmente no funcionales. La presente descripción proporciona un procedimiento para tratar dichas afecciones o enfermedades en un sujeto mediante la introducción de agentes terapéuticos basados en células o polinucleótidos que contienen las moléculas de ARN de la descripción proporcionada en esta invención, donde las moléculas de ARN de la descripción codifican una proteína que reemplaza la actividad de la proteína que falta de las células diana del sujeto.

Las enfermedades caracterizadas por una actividad proteica disfuncional o aberrante incluyen, pero sin limitación, cáncer y enfermedades proliferativas, enfermedades genéticas (por ejemplo, fibrosis quística), enfermedades autoinmunes, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades metabólicas. La presente descripción proporciona un procedimiento para tratar dichas afecciones o enfermedades en un sujeto introduciendo las moléculas de ARN de la descripción o agentes terapéuticos basados en células que contienen las moléculas de ARN proporcionadas en esta invención, donde las moléculas de ARN de la descripción codifican una proteína que antagoniza o de otro modo supera la actividad proteica aberrante presente en la célula del sujeto.

Los ejemplos específicos de una proteína disfuncional son las variantes de mutación sin sentido o de sentido erróneo del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que producen una variante proteica disfuncional o no funcional, respectivamente, de la proteína CFTR, que provoca la fibrosis quística.

Por lo tanto, se proporcionan procedimientos para tratar la fibrosis quística en un sujeto mamífero poniendo en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN de la descripción que tiene una región traducible que codifica un polipéptido CFTR funcional, en condiciones tales que una cantidad efectiva del polipéptido CFTR está presente en la célula. Las células diana preferidas son las células epiteliales, tales como las de pulmón, y los procedimientos de administración se determinan teniendo en cuenta el tejido diana; es decir, para la administración pulmonar, las moléculas de ARN se formulan para administración por inhalación.

En otra realización, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar la hiperlipidemia en un sujeto, introduciendo en una población celular del sujeto una molécula de ARNm no natural que codifica sortilina, una proteína recientemente caracterizada por estudios genómicos, mejorando así la hiperlipidemia en un sujeto. El gen SORT1 codifica una proteína transmembrana de la red trans-Golgi (TGN) llamada sortilina. Los estudios genéticos han demostrado que uno de cada cinco individuos tiene un polimorfismo de un solo nucleótido, rs12740374, en el locus 1p13 del gen SORT1 que los predispone a tener niveles bajos de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) . Cada copia del alelo menor, presente en alrededor del 30 % de las personas, altera el colesterol LDL en 8 mg/dl, mientras que dos copias del alelo menor, presente en alrededor del 5 % de la población, reduce el colesterol LDL 16 mg/dl. También se ha demostrado que los vehículos del alelo menor tienen un 40 % menos de riesgo de infarto de miocardio. Los estudios funcionales in vivo en ratones describen que la sobreexpresión de SORT1 en tejido hepático de ratón condujo a niveles de colesterol LDL significativamente más bajos, hasta un 80 % más bajos, y que silenciar SORT 1 aumentó el colesterol LDL aproximadamente en un 200 % (Musunuru K y col. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus (De la variante no codificante al fenotipo a través de SORT1 en el locus de colesterol 1p13). Nature 2010; 466: 714-721).

Los procedimientos de la presente descripción pueden mejorar la administración de polinucleótidos en una población celular, in vivo, ex vivo o en cultivo. Por ejemplo, un cultivo celular que contiene una pluralidad de células huésped (por ejemplo, células eucariotas tales como células de levadura o de mamífero) se pone en contacto con una composición que contiene una molécula de ARN descrita en esta invención. La composición también contiene generalmente un reactivo de transfección u otro compuesto que aumenta la eficacia de la captación de ARN en las células huésped. Los ARN de la descripción pueden mostrar una mayor retención en la población celular, en relación con un polinucleótido natural correspondiente. Por ejemplo, la retención del ARN de la descripción es mayor que la retención del polinucleótido correspondiente. En algunas realizaciones, es de al menos alrededor del 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 % o más del 200 % mayor que la retención del polinucleótido natural. Tal ventaja de retención puede lograrse mediante una ronda de transfección con el ARN de la descripción, o puede obtenerse después de repetidas rondas de transfección.

En algunas realizaciones, el ARN de la descripción se administra a una población de células diana con uno o más polinucleótidos adicionales. Tal administración puede ser al mismo tiempo, o el ARN de la descripción se administra antes de la administración del uno o más polinucleótidos adicionales. El uno o más polinucleótidos adicionales pueden ser moléculas de ARN de la descripción o polinucleótidos naturales. Se entiende que la presencia inicial del ARN de la descripción no induce sustancialmente una respuesta inmunitaria innata de la población celular y, además, que la respuesta inmunitaria innata no será activada por la presencia posterior de los polinucleótidos naturales. A este respecto, el ARN de la descripción puede no contener por sí mismo una región traducible, si la proteína que se desea que esté presente en la población de células diana se traduce a partir de los polinucleótidos naturales.

La presente descripción también proporciona proteínas generadas a partir de ARNm no naturales.

La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas de moléculas de ARN o estructuras multiméricas descritas en esta invención, opcionalmente en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas de proteínas generadas a partir de moléculas de ARN o estructuras multiméricas descritas en esta invención, opcionalmente en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden ser estériles y/o estar libres de pirógenos. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias terapéuticamente activas adicionales. Según algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento para administrar composiciones farmacéuticas que comprenden un ARN de la descripción, que codifica una o más proteínas para administrarlas a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, las composiciones se administran a seres humanos. Para los fines de la presente descripción, el término "ingrediente activo" generalmente se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que codifica el ARNm que se va a administrar), una estructura multimérica, una proteína, un complejo que codifica una proteína o que contiene una proteína como se describe en esta invención y sales del mismo.

Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta invención se refieren principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su administración a seres humanos, los expertos en la materia entenderán que dichas composiciones son generalmente adecuadas para su administración a animales de todo tipo.

La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para su administración a diversos animales es bien conocida y el farmacólogo veterinario con experiencia habitual puede diseñar y/o realizar dicha modificación con experimentación habitual, si es que la hay. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluyendo mamíferos pertinentes en términos comerciales, tales como vacunos, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves pertinentes en términos comerciales, tales como pollos, patos, gansos y/o pavos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, dichos procedimientos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes adicionales, y a continuación, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Una composición farmacéutica según la presente descripción puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad dosis unitarias individuales. Como se usa en esta invención una "dosis unitaria" es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente descripción variarán conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía por la que se va a administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 % y el 100 % (p/p), por ejemplo, entre el 0,1 % y el 99 % , entre el 0,5 y el 50 % , entre el 1-30 % , entre el 5-80 % o al menos el 80 % (p/p) de ingrediente activo.

Los polinucleótidos y las estructuras multiméricas de la descripción se pueden formular utilizando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad; (2) aumentar la transfección celular; (3) permitir la liberación sostenida o retardada (por ejemplo, a partir de una formulación de depósito); (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, dirigirse a tejidos o tipos de células específicos); (5) aumentar la traducción de la proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de la proteína codificada in vivo. Además de los excipientes tradicionales tales como cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente descripción pueden incluir, sin limitación, lipidoides, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas de núcleo-envoltura, péptidos, proteínas, células transfectadas con estructuras multiméricas, hialuronidasa, imitadores de nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm o ARNm IVT) y las moléculas de ácido nucleico multimérico de la descripción (por ejemplo, moléculas de ARNm multimérico) se pueden formular usando uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En una realización, las composiciones farmacéuticas de ácidos nucleicos o moléculas de ácido nucleico multimérico incluyen nanopartículas lipídicas (LNP). En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas son nanopartículas lipídicas basadas en MC3.

El número de polinucleótidos encapsulados por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 1 polinucleótido a alrededor de 100 polinucleótidos. En algunas realizaciones, el número de polinucleótidos encapsulados por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 50 a alrededor de 500 polinucleótidos. En algunas realizaciones, el número de polinucleótidos encapsulados por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 250 a alrededor de 1000 polinucleótidos. En algunas realizaciones, el número de polinucleótidos encapsulados por una nanopartícula lipídica es superior a 1000.

El número de moléculas multiméricas encapsuladas por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 1 molécula multimérica a alrededor de 100 moléculas multiméricas. En algunas realizaciones, el número de moléculas multiméricas encapsuladas por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 50 moléculas multiméricas a alrededor de 500 moléculas multiméricas. En algunas realizaciones, el número de moléculas multiméricas encapsuladas por una nanopartícula lipídica oscila de entre alrededor de 250 moléculas multiméricas a alrededor de 1000 moléculas multiméricas. En algunas realizaciones, el número de moléculas multiméricas encapsuladas por una nanopartícula lipídica es superior a 1000 moléculas multiméricas.

En una realización, los polinucleótidos o las estructuras multiméricas se pueden formular en un complejo de lípidopolicatión. La formación del complejo lípido-policatión se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la técnica. A modo de ejemplo no limitativo, el policatión puede incluir un péptido catiónico o un polipéptido, tal como, pero sin limitación, polilisina, poliornitina y/o poliarginina. En otra realización, los polinucleótidos o estructuras multiméricas pueden formularse en un complejo de lípido-policatión que puede incluir además un lípido no catiónico tal como, pero sin limitación, colesterol o dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE).

La formulación de liposomas puede verse afectada, pero sin limitación, por la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación lipídica catiónica, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple y col. (Semple y col. Nature Biotech. 2010 28:172-176), la formulación de liposomas se compone del 57,1 % de lípido catiónico, 7,1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, 34,3 % de colesterol y 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, cambiar la composición del lípido catiónico podría suministrar ARNpi de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha y col. Mol Ther. 2011 19:2186-2200). En algunas realizaciones, las formulaciones de liposomas pueden comprender de alrededor del 35 a alrededor del 45 % de lípido catiónico, de alrededor del 40 % a alrededor del 50 % de lípido catiónico, de alrededor del 50 % a alrededor del 60 % de lípido catiónico y/o de alrededor del 55 % a alrededor de 65 % de lípido catiónico. En algunas realizaciones, la relación de lípido a ARNm en liposomas puede ser de alrededor de 5:1 a alrededor de 20:1, de alrededor de 10:1 a alrededor de 25:1, de alrededor de 15:1 a alrededor de 30:1 y/o al menos 30:1.

En algunas realizaciones, la relación de PEG en las formulaciones de nanopartículas lipídicas (NPL) se puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG se puede modificar de C 14 a C 18 para alterar la farmacocinética y/o la biodistribución de las formulaciones de LNP. Como ejemplo no limitativo, las formulaciones de LNP pueden contener de alrededor del 0,5 % a alrededor del 3,0 % , de alrededor del 1,0 % a alrededor del 3,5 % , de alrededor del 1,5 % a alrededor del 4,0 % , de alrededor del 2,0 % a alrededor del 4,5 % , de alrededor del 2,5 % a alrededor del 5,0 % y/o de alrededor del 3,0 % a alrededor del 6,0 % de la relación molar lipídica de PEG-c-DOM G (R-3-[(u>-metoxi-poli(etilenglicol)2000)carbamoil)]-1,2-dimiristiloxipropil-3-amina) (también denominada en esta invención PEG-DOMG) en comparación con el lípido catiónico, D^s P^c y colesterol. En otra realización, el PEG-c-DOM G se puede reemplazar con un lípido PE G como, entre otros, P E G -D SG (1,2-Distearoil-snglicerol, metoxipolietilenglicol), PEG-DM G (1,2 - dimiristoil-sn-glicerol) y/o PEG -D PG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, pero sin limitación, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.

En una realización, los polinucleótidos o las estructuras multiméricas descritas en esta invención se formulan en una nanopartícula que puede comprender al menos un lípido. El lípido se puede seleccionar, pero sin limitación, de entre DLin-DMA, Dlin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, lípidos PEGilados y lípidos de aminoalcoholes. En otros aspectos, el lípido puede ser un lípido catiónico tal como, pero sin limitación, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA y lípidos de aminoalcoholes. El lípido catiónico de aminoalcohol puede ser los lípidos descritos y/o producidos mediante los procedimientos descritos en la Publicación de Patente de EE.UU. n.° US20130150625. Como ejemplo no limitativo, el lípido catiónico puede ser 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,2Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 1 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9z)-octadeca-9-en-1-iloxi]-2-{[(9Z)-octadeca-9-en-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 2 en el documento US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-[(octiloxi)metil]propan-1-ol (Compuesto 3 en el documento US20130150625); y 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-2-{[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]metil}propan-1-ol (Compuesto 4 en el documento US20130150625); o cualquier sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo.

Típicamente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas comprenden un lípido, en particular, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) o 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), y comprenden además un lípido neutro, un esterol y una molécula capaz de reducir la agregación de partículas, por ejemplo, un lípido PEG o modificado con PEG.

En una realización, la formulación de nanopartículas lipídicas consiste esencialmente en (i) al menos un lípido seleccionado de entre el grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA), y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319); (ii) un lípido neutro seleccionado de entre DSPC, DPPC, Po Pc , DOPE y SM; (iii) un esterol, por ejemplo, colesterol; y (iv) un PEG-lípido, por ejemplo, PEG-DM G o PEG-cDMA, en una relación molar de alrededor del 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de esterol; 0,5-15 % de PEG-lípido.

En una realización, la formulación incluye de alrededor del 25 % a alrededor del 75 % en base molar de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), por ejemplo, de alrededor del 35 a alrededor del 65 % , de alrededor del 45 a alrededor del 65 % , alrededor del 60 % , alrededor del 57,5 % , alrededor del 50 % o alrededor del 40 % en una base molar.

En una realización, la formulación incluye de alrededor del 0,5 % a alrededor del 15 % en base molar del lípido neutro, por ejemplo, de alrededor del 3 a alrededor del 12 % , de alrededor del 5 a alrededor del 10 % o alrededor del 15 % , alrededor del 10 % o alrededor del 7,5 % en una base molar. Los lípidos neutros ejemplares incluyen, pero sin limitación, DSPC, POPC, DPPC, DOPE y SM. En una realización, la formulación incluye de alrededor del 5 % a alrededor del 50 % en base molar del esterol (por ejemplo, de alrededor del 15 a alrededor del 45 % , de alrededor del 20 a alrededor del 40 % , alrededor del 40 % , alrededor del 38,5 % , alrededor del 35 % o alrededor del 31 % en una base molar. Un esterol ejemplar es el colesterol. En una realización, la formulación incluye de alrededor del 0,5 % a alrededor del 20 % en base molar del PEG o lípido modificado con PEG (por ejemplo, de alrededor del 0,5 a alrededor del 10 % , de alrededor del 0,5 a alrededor del 5 % , alrededor del 1,5 % , alrededor del 0,5 % , alrededor del 1,5 % , alrededor del 3,5 % o alrededor del 5 % en una base molar. En algunas realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio de 2.000 Da. En otras realizaciones, el PEG o lípido modificado con PEG comprende una molécula de PEG de un peso molecular promedio menor que 2.000 Da, por ejemplo, alrededor de 1.500 Da, alrededor de 1.000 Da o alrededor de 500 Da. Los lípidos modificados con PEG ejemplares incluyen, pero sin limitación, PEG-diestearoil glicerol (PEG-DMG) (también denominado en esta invención P E G -C 14 o C14-PEG ), PEG-cDMA.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen el 25-75 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 0,5-15 % del lípido neutro, el 5-50 % del esterol y el 0,5-20 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen el 35-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 3 -12 % del lípido neutro, el 15-45 % del esterol y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen el 45-65 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), el 5-10 % del lípido neutro, el 25-40 % del esterol y el 0,5-10 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 60 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), alrededor del 7,5 % del lípido neutro, alrededor del 31 % del esterol y alrededor del 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), alrededor del 10 % del lípido neutro, alrededor del 38,5 % del esterol y alrededor del 1,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 50 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), alrededor del 10 % del lípido neutro, alrededor del 35 % del esterol, alrededor del 4,5 % o alrededor del 5 % del PEG o lípido modificado con PEG, y alrededor del 0,5 % del lípido de direccionamiento en una base molar. En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 40 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), alrededor del 15 % del lípido neutro, alrededor del 40 % del esterol y alrededor del 5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 57,2 % de un lípido catiónico seleccionado de entre 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-d ioxolano (Dlin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (Dlin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-non-2-en-1-ilo) (L319), alrededor del 7,1 % del lípido neutro, alrededor del 34,3 % del esterol y alrededor del 1,4 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En una realización, las formulaciones descritas en esta invención incluyen alrededor del 57,5 % de un lípido catiónico seleccionado de entre el lípido PEG que es PEG-cDM A (PEG-cDMA se analiza con más detalle en Reyes y col. (J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005), alrededor del 7,5 % del lípido neutro, alrededor del 31,5 % del esterol, y alrededor del 3,5 % del PEG o lípido modificado con PEG en una base molar.

En realizaciones preferidas de la invención, la formulación de nanopartículas de lípidos consiste esencialmente en una mezcla de lípidos en relaciones molares de aproximadamente 20-70 % de lípido catiónico: 5-45 % de lípido neutro: 20-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG; más preferiblemente en una relación molar de aproximadamente 20-60 % de lípido catiónico: 5-25 % de lípido neutro: 25-55 % de colesterol: 0,5-15 % de lípido modificado con PEG.

En realizaciones particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 50/10/38,5/1,5 ( % en mol de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DM G, P E G -D S G o P EG -DPG), 57,2/7,1134,3/1,4 ( % en mol de lípido catiónico/lípido neutro, por ejemplo, DPPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-cDMA), 40/15/40/5 ( % en mol de lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DMG), 50/10/35/4,5/0,5 ( % en mol de lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-D SG), 50/10/35/5 (lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, P e G-DMG), 40/10/40/10 ( % en mol de lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por eejemplo, PEG-DM G o PEG-cDMA), 35/15/40/10 ( % en mol de lípido catiónico/ lípido neutro, por ejemplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, P ^e G-DMG o PEG-cDMA) o 52/13/30/5 ( % en mol de lípido catiónico/ lípido neutro, por eejmplo, DSPC/Col/ lípido modificado con PEG, por ejemplo, PEG-DM G o PEG-cDMA).

Se describen composiciones de nanopartículas lípídicas ejemplares y procedimientos de preparación de las mismas en, por ejemplo, Semple y col. (2010) Nat. Biotechnol. 28:172-176; Jayarama y col. (2012), Angew. Chem. Int. Ed., 51: 8529-8533; y Maier y col. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.

En una realización las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden comprender un lípido catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural, y opcionalmente comprenden un lípido no catiónico. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 40-60 % de lípido catiónico, alrededor del 5 -15 % de un lípido no catiónico, alrededor del 1-2 % de un lípido PEG y alrededor del 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 50 % de lípido catiónico, alrededor del 10 % de lípido no catiónico, alrededor del 1,5 % de lípido PEG y alrededor del 38,5 % de lípido estructural. Como otro ejemplo no limitativo más, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 55 % de lípido catiónico, alrededor del 10 % de lípido no catiónico, alrededor del 2,5 % de lípido PEG y alrededor del 32,5 % de lípido estructural. En una realización, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero sin limitación, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.

En una realización, las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden ser nanopartículas lipídicas de 4 componentes. La nanopartícula lipídica puede comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 40-60 % de lípido catiónico, alrededor del 5 -15 % de un lípido no catiónico, alrededor del 1 ­ 2 % de un lípido PEG y alrededor del 30-50 % de un lípido estructural. Como otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 50 % de lípido catiónico, alrededor del 10 % de lípido no catiónico, alrededor del 1,5 % de lípido PEG y alrededor del 38,5 % de lípido estructural. Como otro ejemplo no limitativo más, la nanopartícula lipídica puede comprender alrededor del 55 % de lípido catiónico, alrededor del 10 % de lípido no catiónico, alrededor del 2,5 % de lípido PEG y alrededor del 32,5 % de lípido estructural. En una realización, el lípido catiónico puede ser cualquier lípido catiónico descrito en esta invención, tal como, pero sin limitación, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA y L319.

En una realización las formulaciones de nanopartículas lipídicas descritas en esta invención pueden comprender un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido PEG y un lípido estructural. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula lipídica comprende alrededor del 50 % del lípido catiónico DLin-KC2-DMA, alrededor del 10 % del lípido no catiónico ^d S ^p C, alrededor del 1,5 % del lípido PEG PEG-DOM G y alrededor del 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DOM G y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica comprende aproximadamente 50 % del lípido catiónico Dlin-MC3-DMA, aproximadamente 10 % del lípido no catiónico DSPC, aproximadamente 1,5 % del lípido con PEG PEG-DM G y aproximadamente 38,5 % del lípido estructural colesterol. Como otro ejemplo no limitativo más, la nanopartícula lipídica comprende alrededor del 55 % del lípido catiónico L319, alrededor del 10 % del lípido no catiónico DSPC, alrededor del 2,5 % del lípido con PEG PEG-DM G y alrededor del 32,5 % del lípido estructural colesterol.

En una realización, los polinucleótidos o las moléculas multiméricas (por ejemplo, moléculas de ARNm multiméricas) de la descripción pueden formularse en nanopartículas lipídicas con un diámetro de alrededor de 10 a alrededor de 100 nm tal como, pero sin limitación, de alrededor de 10 a alrededor de 20 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 30 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 40 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 50 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 60 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 10 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 30 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 40 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 50 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 60 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 20 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 40 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 50 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 60 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 30 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 50 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 60 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 40 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 50 a alrededor de 60 nm, de alrededor de 50 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 50 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 50 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 50 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 60 a alrededor de 70 nm, de alrededor de 60 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 60 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 60 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 70 a alrededor de 80 nm, de alrededor de 70 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 70 a alrededor de 100 nm, de alrededor de 80 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 80 a alrededor de 100 nm y/o de alrededor de 90 a alrededor de 100 nm.

En una realización, las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro de alrededor de 10 a 500 nm. En una realización, la nanopartícula lipídica puede tener un diámetro mayor que 100 nm, mayor que 150 nm, mayor que 200 nm, mayor que 250 nm, mayor que 300 nm, mayor que 350 nm, mayor que 400 nm, mayor que 450 nm, mayor que 500 nm, mayor que 550 nm, mayor que 600 nm, mayor que 650 nm, mayor que 700 nm, mayor que 750 nm, mayor que 800 nm, mayor que 850 nm, mayor que 900 nm, mayor que 950 nm o mayor que 1000 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica catiónica tiene un diámetro medio de 50-150 nm. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica catiónica tiene un diámetro medio de 80-100 nm.

En una realización, las composiciones pueden comprender los polinucleótidos o polinucleótidos multiméricos descritos en esta invención, formulados en una nanopartícula lipídica que comprende MC3, colesterol, D SPC y PEG2000-DMG, el tampón citrato trisódico, sacarosa y agua para inyección. Como ejemplo no limitativo, la composición comprende: 2,0 mg/ml de la sustancia farmacológica (por ejemplo, polinucleótidos multiméricos), 21,8 mg/ml de MC3, 10,1 mg/ml de colesterol, 5,4 mg/ml de DSPC, 2,7 mg/ml de PEG2000-DMG, 5,16 mg/ml de citrato trisódico, 71 mg/ml de sacarosa y 1,0 ml de agua para inyección.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual, tal como se usa en esta invención, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos y lubricantes, según se adapte a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21 a edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de los mismos. Salvo en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como al producir cualquier efecto biológico no deseado o en la interacción de otro modo de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se contempla que su uso sea dentro del alcance de esta presente descripción.

En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable tiene una pureza de al menos el 95 % , al menos el 96 % , al menos el 97 % , al menos el 98 % , al menos el 99 % o del 100 % . En algunas realizaciones, un excipiente se aprueba para su uso en seres humanos y para uso veterinario. En algunas realizaciones, un excipiente es aprobado por la administración de alimentos y medicamentos de los EE. UU.. En algunas realizaciones, un excipiente tiene un grado farmacéutico. En algunas realizaciones, un excipiente cumple con los estándares de la Farmacopea de los EE.UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitación, diluyentes inertes, agentes de dispersión y/o granulación, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en formulaciones farmacéuticas. Los excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.

Otros componentes

Una composición de nanopartículas puede incluir uno o más componentes además de los descritos en las secciones anteriores. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede incluir una o más moléculas hidrofóbicas pequeñas tales como una vitamina (por ejemplo, vitamina A o vitamina E) o un esterol.

Las composiciones de nanopartículas también pueden incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes que alteran la superficie u otros componentes. Una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2005/0222064, por ejemplo. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (por ejemplo, glucosa) y polisacáridos (por ejemplo, glucógeno y derivados y análogos de los mismos).

Se puede incluir y/o utilizar un polímero para encapsular o encapsular parcialmente una composición de nanopartículas. Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero puede seleccionarse de entre, pero sin limitación, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poliestirenos, poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. Por ejemplo, un polímero puede incluir poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido L-láctico) (PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido láctico-ácido co-glicólico) (PLGA), poli(ácido L-láctico-ácido co-glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactida) (PDLA), poli(L-lactida) (PLLA), poli(D,L-lactida-co-caprolactona), poli(D,L-lactida-co-caprolactona-coglicólido), poli(D,L-lactida-co-PEO-co-D,L-lactida), poli(D,L-lactida-co-PPO-co-D,L-lactida), cianoacrilato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietilenglicol, ácido poli-L-glutámico, poli(hidroxiácidos), polianhídridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poliamidas, poli(éster éteres), policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como poli(tereftalato de etileno), alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como poli(acetato de vinilo), haluros de polivinilo, tales como poli(cloruro de vinilo) (PVC), polivinilpirrolidona (PVP), polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celulosas derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, polioxaminas, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactida-co-caprolactona), carbonato de trimetileno, poli(W-acriloilmorfolina) (PAcM), poli(2-metil-2-oxazolina) (PMOX), poli(2-etil-2-oxazolina) (Pe OZ) y poliglicerol.

Los agentes que alteran la superficie pueden incluir, pero sin limitación, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), tensioactivos (por ejemplo, tnsioactivos catiónicos tales como bromuro de dimetildioctadecilamonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, acetilcisteína, artemisa, bromelaína, papaína, clerodendrum, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina y erdosteína) y DNasas (por ejemplo, rhDNasa). Un agente que altera la superficie se puede disponer dentro de una nanopartícula y/o sobre la superficie de una composición de nanopartículas (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro procedimiento).

Una composición de nanopartículas también puede comprender uno o más lípidos funcionalizados. Por ejemplo, un lípido puede funcionalizarse con un grupo alquino que, cuando se expone a una azida en condiciones de reacción apropiadas, puede experimentar una reacción de cicloadición. En particular, una bicapa lipídica puede funcionalizarse de esta manera con uno o más grupos útiles para facilitar la permeación de la membrana, el reconocimiento celular o la formación de imágenes. La superficie de una composición de nanopartículas también puede conjugarse con uno o más anticuerpos útiles. Los grupos funcionales y los conjugados útiles en el suministro de células dirigidas, la formación de imágenes y la permeación de la membrana son bien conocidos en la técnica.

Además de estos componentes, las composiciones de nanopartículas de la descripción pueden incluir cualquier sustancia útil en las composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables o ingredientes auxiliares tales como, pero sin limitación, uno o más disolventes, medios de dispersión, diluyentes, auxiliares de dispersión, auxiliares de suspensión, auxiliares de granulación, desintegrantes, cargas, deslizantes, vehículos líquidos, aglutinantes, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, aceites, conservantes y otras especies. También pueden incluirse excipientes tales como ceras, mantecas, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, saborizantes y agentes perfumantes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21 a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

Los ejemplos de diluyentes pueden incluir, pero sin limitación, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo y/o combinaciones de los mismos. Los agentes de granulación y/o dispersión se pueden seleccionar de entre la lista no limitativa que consiste en almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes tensioactivos y/o emulsionantes pueden incluir, pero sin limitación, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [silicato de aluminio y magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa en polvo, hidroximetil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEEN®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [SPAN®60], triestearato de sorbitán [SPAN®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTO ^l®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinil-pirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLURONIC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato de sodio y/o combinaciones de los mismos.

Un agentes aglutinante puede ser almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,); gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinil-pirrolidona), silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM®), y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; y combinaciones de los mismos o cualquier otro agente aglutinante adecuado.

Los ejemplos de conservantes pueden incluir, pero sin limitación, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero sin limitación, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Los ejemplos de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sodio, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los ejemplos de conservantes antimicrobianos incluyen, pero sin limitación, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Los ejemplos de conservantes antifúngicos incluyen, pero sin limitación, butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los ejemplos de conservantes de alcohol incluyen, pero sin limitación, etanol, polietilen glicol, alcohol bencílico, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los ejemplos de conservantes ácidos incluyen, pero sin limitación, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroascórbico, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero sin limitación, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ y/o EUXYL®.

Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero sin limitación, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido d-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, lactobionato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, tampones de aminosulfonato (por ejemplo, HEPES), hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico y/o combinaciones de los mismos. Los agentes lubricantes pueden seleccionarse de entre el grupo no limitativo que consiste en estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behenato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de aceites incluyen, pero sin limitación, aceites de almendra, de semilla de albaricoque, de aguacate, de babasú, de bergamota, de semilla de grosella negra, de borraja, de enebro, de manzanilla, de canola, de alcaravea, de carnauba, de ricino, de canela, de manteca de cacao, de coco, de hígado de bacalao, de café, de maíz, de semilla de algodón, de emú, de eucalipto, de onagra, de pescado, de linaza, de geraniol, de calabaza, de semilla de uva, de avellana, de hisopo, de miristato de isopropilo, de jojoba, de kukui, de lavandina, de lavanda, de limón, de litsea cubeba, de nuez de macadamia, de malva, de semilla de mango, de semilla de semilla de espuma de la pradera, de visón, de nuez moscada, de oliva, de naranja, de pargo alazán, de palma, de palmiste, de semilla de melocotón, de cacahuete, de semilla de amapola, de semilla de calabaza, de colza, de salvado de arroz, de romero, de cártamo, de sándalo, de sasquana, saborizado, de espino amarillo, de sésamo, de manteca de karité, de silicona, de soja, de girasol, de árbol de té, de cardo, de camelia, de vetiver, de nuez y de germen de trigo, así como estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, simeticona, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y combinaciones de los mismos.

Ejemplos adicionales y alternativos de formulaciones

Las composiciones de nanopartículas pueden incluir un componente lipídico y uno o más componentes adicionales, tales como un agente terapéutico. Una composición de nanopartículas puede diseñarse para una o más aplicaciones u objetivos específicos. Los elementos de una composición de nanopartículas pueden seleccionarse en función de una aplicación u objetivo particular, y/o en función de la eficacia, toxicidad, coste, facilidad de uso, disponibilidad u otra característica de uno o más elementos. De manera similar, la formulación particular de una composición de nanopartículas puede seleccionarse para una aplicación u objetivo particular según, por ejemplo, la eficacia y toxicidad de combinaciones particulares de elementos.

El componente lipídico de una composición de nanopartículas de la descripción puede incluir, por ejemplo, un lípido según la fórmula (I), un fosfolípido (tal como un lípido insaturado, por ejemplo, DOPE o DSPC), un lípido PEG y un lípido estructural. Los elementos del componente lipídico pueden proporcionarse en fracciones específicas.

En algunas realizaciones, el componente lipídico de una composición de nanopartículas incluye un lípido según la fórmula (I), un fosfolípido, un lípido PEG y un lípido estructural. En determinadas realizaciones, el componente lipídico de la composición de nanopartículas incluye de alrededor del 30 % en moles a alrededor del 60 % en moles de compuesto de fórmula (I), de alrededor del 0 % en moles a alrededor del 30 % en moles de fosfolípido, de alrededor del 18,5 % en moles a alrededor del 48,5 % en moles de lípido estructural y de alrededor del 0 % en moles a alrededor del 10 % en moles de lípido PEG, siempre que el % en moles total no exceda del 100 % . En algunas realizaciones, el componente lipídico de la composición de nanopartículas incluye de alrededor del 35 % en moles a alrededor del 55 % en moles de compuesto de fórmula (I), de alrededor del 5 % en moles a alrededor del 25 % en moles de fosfolípido, de alrededor del 30 % en moles a alrededor del 40 % en moles de lípido estructural y de alrededor del 0 % en moles a alrededor del 10 % en moles de lípido PEG. En una realización particular, el componente lipídico incluye alrededor del 50 % en moles de dicho compuesto, alrededor del 10 % en moles de fosfolípido, alrededor del 38,5 % en moles de lípido estructural y alrededor del 1,5 % en moles de lípido PEG. En otra realización particular, el componente lipídico incluye alrededor del 40 % en moles de dicho compuesto, alrededor del 20 % en moles de fosfolípido, alrededor del 38,5 % en moles de lípido estructural y alrededor del 1,5 % en moles de lípido PEG. En algunas realizaciones, el fosfolípido puede ser DOPE o DSPC. En otras realizaciones, el lípido PEG puede ser PEG-DM G y/o el lípido estructural puede ser colesterol.

Las composición de nanopartículas pueden diseñarse para una o más aplicaciones u objetivos específicos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede diseñarse para administrar un agente terapéutico tal como un ARN a una célula, tejido, órgano o sistema particular o grupo de los mismos en el cuerpo de un mamífero. Las propiedades fisicoquímicas de las composiciones de nanopartículas pueden alterarse para aumentar la selectividad para objetivos corporales particulares. Por ejemplo, los tamaños de partículas se pueden ajustar en función de los tamaños de ventana de diferentes órganos. El agente terapéutico incluido en una composición de nanopartículas también se puede seleccionar en función del objetivo o los objetivos de administración deseados. Por ejemplo, un agente terapéutico puede seleccionarse para una indicación, afección, enfermedad o trastorno particular y/o para el suministro a una célula, tejido, órgano o sistema particular o grupo de los mismos (por ejemplo, suministro localizado o específico). En determinadas realizaciones, una composición de nanopartículas puede incluir un ARNm que codifica un polipéptido de interés capaz de traducirse dentro de una célula para producir el polipéptido de interés. Una composición de este tipo puede estar diseñada para administrarse específicamente a un órgano en particular. En realizaciones particulares, se puede diseñar una composición para que se administre específicamente al hígado de un mamífero.

La cantidad de un agente terapéutico en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño, la composición, el objetivo deseado y/o aplicación u otras propiedades de la composición de nanopartículas, así como de las propiedades del agente terapéutico. Por ejemplo, la cantidad de ARN útil en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño, la secuencia y otras características del ARN. Las cantidades relativas de un agente terapéutico y otros elementos (por ejemplo, lípidos) en una composición de nanopartículas también pueden variar. En algunas realizaciones, la relación p/p del componente lipídico con respecto a un agente terapéutico en una composición de nanopartículas puede ser de alrededor de 5:1 a alrededor de 60:1, tal como 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11 :1, 12 :1, 13:1, 14:1, 15 :1, 16:1, 17 :1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, y 60:1. por ejemplo, la relación p/p del componente lipídico con respecto a un agente terapéutico puede ser de alrededor de 10:1 a alrededor de 40:1. En realizaciones preferidas de la invención, la relación p/p es de alrededor de 20:1. La cantidad de un agente terapéutico en una composición de nanopartículas puede medirse, por ejemplo, utilizando espectroscopia de absorción (por ejemplo, espectroscopia ultravioleta-visible).

En algunas realizaciones, una composición de nanopartículas incluye uno o más ARN, y el uno o más ARN, lípidos y cantidades de los mismos pueden seleccionarse para proporcionar una relación N:P específica. La relación N:P de la composición se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno en uno o más lípidos con respecto al número de grupos fosfato en un ARN. En general, se prefiere una relación N:P más baja. El uno o más ARN, lípidos y cantidades de los mismos pueden seleccionarse para proporcionar una relación N:P de alrededor de 2:1 a alrededor 30:1, tal como 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 12 :1, 14:1, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 24:1, 26:1, 28:1, o 30:1. En determinadas realizaciones, la relación N:P puede ser de alrededor de 2:1 a alrededor de 8:1. En otras realizaciones, la relación N:P es de alrededor de 5:1 a alrededor de 8:1. Por ejemplo, la relación N:P puede ser de alrededor de 5,0:1 a alrededor de 5,5:1, alrededor de 5,67:1, alrededor de 6,0:1, alrededor de 6,5:1 o alrededor de 7,0:1. Por ejemplo, la relación N:P puede ser de alrededor de 5,67:1.

Propiedades físicas

Las características de una composición de nanopartículas pueden depender de los componentes de la misma. Por ejemplo, una composición de nanopartículas que incluye colesterol como lípido estructural puede tener características diferentes a las de una composición de nanopartículas que incluye un lípido estructural diferente. De manera similar, las características de una composición de nanopartículas pueden depender de las cantidades absolutas o relativas de sus componentes. Por ejemplo, una composición de nanopartículas que incluye una fracción molar superior de un fosfolípido puede tener características diferentes a las de una composición de nanopartículas que incluye una fracción molar inferior de un fosfolípido. Las características también pueden variar según el procedimiento y las condiciones de preparación de la composición de nanopartículas.

Las composiciones de nanopartículas se pueden caracterizar por una variedad de procedimientos. Por ejemplo, puede usarse microscopía (por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión o microscopía electrónica de barrido) para examinar la morfología y distribución de tamaño de una composición de nanopartículas. La dispersión de luz dinámica o la potenciometría (por ejemplo, titulaciones potenciométricas) se pueden utilizar para medir los potenciales zeta. La dispersión dinámica de la luz también se puede utilizar para determinar tamaños de partículas. También se pueden utilizar instrumentos tales como el Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Reino Unido) para medir múltiples características de una composición de nanopartículas, tales como el tamaño de partícula, el índice de polidispersión y el potencial zeta.

El tamaño medio de una composición de nanopartículas de la descripción puede estar entre decenas de nm y centenas de nm. Por ejemplo, el tamaño medio puede ser de alrededor 40 nm a alrededor de 150 nm, tal como alrededor de 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm o 150 nm. En algunas realizaciones, el tamaño medio de una composición de nanopartículas puede ser de alrededor de 50 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 80 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 70 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 60 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 80 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 70 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 80 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 90 nm o de alrededor de 90 nm a alrededor de 100 nm. En determinadas realizaciones, el tamaño medio de una composición de nanopartículas puede ser de alrededor de 70 nm a alrededor de 100 nm. En una realización particular, el tamaño medio puede ser alrededor de 80 nm. En otras realizaciones, el tamaño medio puede ser alrededor de 100 nm.

Una composición de nanopartículas de la descripción puede ser relativamente homogénea. Puede usarse un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, por ejemplo, la distribución del tamaño de partículas de las composiciones de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (por ejemplo, inferior a 0,3) generalmente indica una distribución de tamaño de partícula estrecha. Una composición de nanopartículas de la descripción puede tener un índice de polidispersidad de alrededor de 0 a alrededor de 0,25, tal como 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0 ,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 o 0,25. En algunas realizaciones, el índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas puede ser de alrededor de 0,10 a alrededor de 0,20.

El potencial zeta de una composición de nanopartículas puede usarse para indicar el potencial electrocinético de la composición. Por ejemplo, el potencial zeta puede describir la carga superficial de una composición de nanopartículas. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más cargadas pueden interactuar de forma no deseada con células, tejidos y otros elementos del cuerpo. En algunas realizaciones, el potencial zeta de una composición de nanopartículas de la descripción puede ser de alrededor de -10 mV a alrededor de 20 mV, de alrededor de -10 mV a alrededor de 15 mV, de alrededor de -10 mV a alrededor de 10 mV, de alrededor de -10 mV a alrededor de 5 mV, de alrededor de -10 mV a alrededor de 0 mV, de alrededor de -10 mV a alrededor de -5 mV, de alrededor de -5 mV a alrededor de 20 mV, de alrededor de -5 mV a alrededor de 15 mV, de alrededor de -5 mV a alrededor de 10 mV, de alrededor de -5 mV a alrededor de 5 mV, de alrededor de-5 mV a alrededor de 0 mV, de alrededor de 0 mV a alrededor de 20 mV, de alrededor de 0 mV a alrededor de 15 mV, de alrededor de 0 mV a alrededor de 10 mV, de alrededor de 0 mV a alrededor de 5 mV, de alrededor de 5 mV a alrededor de 20 mV, de alrededor de 5 mV a alrededor de 15 mV o de alrededor de 5 mV a alrededor de 10 mV.

La eficiencia de encapsulación de un agente terapéutico describe la cantidad de agente terapéutico que se encapsula o se asocia de otro modo con una composición de nanopartículas después de la preparación, en relación con la cantidad inicial proporcionada. La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (por ejemplo, cerca del 100 %). La eficiencia de encapsulación se puede medir, por ejemplo, comparando la cantidad de agente terapéutico en una solución que contiene la composición de nanopartículas antes y después de romper la composición de nanopartículas con uno o más disolventes orgánicos o detergentes. La fluorescencia se puede utilizar para medir la cantidad de agente terapéutico libre (por ejemplo, ARN) en una solución. Para las composiciones de nanopartículas de la descripción, la eficiencia de encapsulación de un agente terapéutico puede ser de al menos el 50 %, por ejemplo el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. En algunas realizaciones, la eficiencia de encapsulación puede ser de al menos el 80 %. En determinadas realizaciones, la eficiencia de encapsulación puede ser de al menos el 90 %.

Una composición de nanopartículas descrita en esta invención puede comprender opcionalmente uno o más recubrimientos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas se puede formular en una cápsula, película o comprimido que tenga un recubrimiento. Una cápsula, película o comprimido que incluya una composición de la descripción puede tener cualquier tamaño, resistencia a la tracción, dureza o densidad útiles.

Como se usa en esta invención "que trata" o "tratar" describe el manejo y cuidado de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un ingrediente activo de la presente descripción para aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno, o para eliminar la enfermedad, afección o trastorno. El término "tratar" también puede incluir el tratamiento de una célula in vitro o un modelo animal.

Un ingrediente activo de la presente descripción puede o también puede usarse para prevenir una enfermedad, afección o trastorno relevante, o puede usarse para identificar candidatos adecuados para tales fines. Como se usa en esta invención, "que previene", "prevenir" o "proteger contra" describe reducir o eliminar la aparición de los síntomas o complicaciones de tal enfermedad, afección o trastorno.

Como se usa en esta invención, "terapia combinada" o "coterapia" incluye la administración de un ingrediente activo de la presente descripción y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar el efecto beneficioso de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero in limitación, acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica que se produce a partir de la combinación de los agentes terapéuticos.

Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene el ingrediente activo de la presente descripción en una forma adecuada para su administración a un sujeto. En una realización, la composición farmacéutica se encuentra a granel o en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, que incluyen, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, un comprimido, una sola bomba en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto descrito o sal, hidrato, solvato o isómero del mismo) en una dosis unitaria de composición es una cantidad efectiva y varía según el tratamiento particular implicado. Un experto en la materia apreciará que a veces es necesario realizar variaciones de rutina en la dosificación dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contempla una variedad de vías, que incluyen oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por inhalación, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un ingrediente activo de la descripción incluyen polvos, pulverizaciones, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que sea necesario.

Como se usa en esta invención, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, aniones, cationes, materiales, composiciones, vehículos y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico sensato, son adecuados para su uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales sin provocar una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, con una relación beneficio/riesgo acorde razonable.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y ni biológica ni de otro modo indeseable, e incluye excipiente que es aceptable para uso veterinario, así como para uso farmacéutico humano. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluye tanto uno como más de uno de dichos excipientes.

Se formula una composición farmacéutica de la descripción para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede introducir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Un ingrediente activo de la presente descripción se puede administrar a un sujeto en muchos de los procedimientos bien conocidos que se usan actualmente para el tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, para el tratamiento de cánceres, un ingrediente activo de la presente descripción puede inyectarse directamente en tumores, inyectarse en el torrente sanguíneo o cavidades corporales o tomarse por vía oral o aplicarse a través de la piel con parches. La dosis elegida debe ser suficiente para constituir un tratamiento efectivo, pero no tan alta como para causar efectos secundarios inaceptables. Preferiblemente, la patología (por ejemplo, cáncer, precáncer y similares) y la salud del paciente deben controlarse de cerca durante y por un período razonable después del tratamiento.

Una "cantidad efectiva" de los polinucleótidos (por ejemplo, ARN o ARNm) o estructuras multiméricas descritas en esta invención se basa, al menos en parte, en el tejido diana, el tipo de célula diana, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros componentes de las estructuras multiméricas, y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de ARN o la estructura multimérica proporciona una producción de péptido inducida o potenciada en la célula, preferiblemente más eficiente que una composición que contiene un polinucleótido no modificado correspondiente que codifica el mismo péptido o aproximadamente igual o más eficiente que los ARNm separados que no forman parte de una estructura multimérica. El aumento de la producción de péptidos puede demostrarse mediante el aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con las estructuras multiméricas), el aumento de la traducción de proteínas del polinucleótido, la disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, mediante el aumento de la duración de la traducción de proteínas de un polinucleótido modificado), o la respuesta inmunitaria innata alterada de la célula huésped.

El ARNm de la presente descripción puede diseñarse para codificar polipéptidos de interés seleccionados de entre cualquiera de varias categorías de dianas que incluyen, pero sin limitación, productos biológicos, anticuerpos, vacunas, proteínas o péptidos terapéuticos, péptidos de penetración celular, proteínas secretadas, proteínas de membrana plasmática, proteínas citoplasmáticas o citoesqueléticas, proteínas unidas a la membrana intracelular, proteínas nucleares, proteínas asociadas con enfermedades humanas, restos de direccionamiento o aquellas proteínas codificadas por el genoma humano para las que no se ha identificado una indicación terapéutica pero que, no obstante, tienen utilidad en áreas de investigación y descubrimiento . "Proteína terapéutica" se refiere a una proteína que, cuando se administra a una célula, tiene un efecto terapéutico, de diagnóstico y/o profiláctico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en esta invención, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para mostrar un efecto inhibidor o terapéutico detectable. El efecto puede detectarse mediante cualquier procedimiento de ensayo conocido en la técnica. La cantidad efectiva precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, el tamaño y la salud del sujeto; la naturaleza y extensión de la afección; y el agente terapéutico o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para la administración. Las cantidades terapéuticamente efectivas para una situación dada pueden determinarse mediante experimentación de rutina que esté dentro de la habilidad y el juicio del médico. En un aspecto preferido, la enfermedad o afección a tratar es el cáncer. En otro aspecto, la enfermedad o afección a tratar es un trastorno de proliferación celular.

Para cualquier compuesto, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, generalmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se puede utilizar para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. A continuación, dicha información puede utilizarse para determinar con más precisión dosis y vías útiles para la administración en seres humanos. La eficacia terapéutica/profiláctica y toxicidad se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, DE⁵⁰ (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 % de la población) y DL⁵⁰ (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL⁵⁰ /D E ⁵⁰.. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos considerables. La dosis puede variar dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del agente o agentes activos o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad de la patología, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, en función de la vida media y la tasa de aclaramiento de la formulación particular.

En determinadas realizaciones, las composiciones según la presente descripción pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para suministrar de alrededor de 0,0001 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg, de alrededor de 0,001 mg/kg a alrededor de 0,05 mg/kg, de alrededor de 0,005 mg/kg a alrededor de 0,05 mg/kg, de alrededor de 0,001 mg/kg a alrededor de 0,005 mg/kg, de alrededor de 0,05 mg/kg a alrededor de 0,5 mg/kg, de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg, de alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 40 mg/kg, de alrededor de 0,5 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg, de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg, de alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg o de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 25 mg/kg de peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado. La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En determinadas realizaciones, la dosis deseada puede suministrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones). Cuando se emplean múltiples administraciones, se pueden utilizar pautas de dosificación dividida, tales como las descritas en esta invención.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo de la presente descripción pueden fabricarse de una forma generalmente conocida, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofiliación. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de forma convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. Por supuesto, la formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF; Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo, en la cantidad requerida, en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes anteriormente enumerados, según sea necesario, seguida de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son secado a vacío y liofilización, que procuran un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo farmacéuticamente aceptable comestible. Pueden introducirse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. A los efectos de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para utilizar como enjuague bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica oralmente y se utiliza como enjuague y se expectora o se traga. Se pueden incluir materiales adyuvantes y/o agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio; o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, el ingrediente activo de la presente descripción se suministra en forma de una pulverización de aerosol desde un dispensador o recipiente presurizado que contenga un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas tal como se conoce de manera general en la técnica.

Se pueden encontrar más ejemplos de excipientes, formas de dosificación, kits, vías de administración y procedimientos de tratamiento farmacéuticamente aceptables en los documentos WO 2015051173 y w O 2015051169.

Todos los porcentajes y relaciones utilizados en esta invención, a menos que se indique lo contrario, son en peso. Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada siempre que estén dentro del alcance de las reivindicaciones. Basándose en la presente descripción, el experto en la materia puede identificar y emplear otros componentes y metodologías útiles para la práctica la presente invención.

En los esquemas sintéticos descritos en esta invención, los compuestos pueden dibujarse con una configuración particular por simplicidad. Tales configuraciones particulares no deben interpretarse como limitativas de la invención a uno u otro isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero, ni excluye mezclas de isómeros, tautómeros, regioisómeros o estereoisómeros; sin embargo, se entenderá que un isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero dado puede tener un mayor nivel de actividad que otro isómero, tautómero, regioisómero o estereoisómero.

Los compuestos (incluidos los análogos de cap) y polinucleótidos descritos en esta invención, o diseñados, seleccionados y/u optimizados mediante los procedimientos descritos anteriormente, una vez producidos, pueden caracterizarse usando una variedad de ensayos conocidos por los expertos en la materia para determinar si los compuestos tienen actividad biológica. Por ejemplo, las moléculas se pueden caracterizar mediante ensayos convencionales, incluyendo, pero sin limitación, ensayos de producción de proteínas (por ejemplo, ensayos de traducción sin células o ensayos de expresión basados en células), ensayos de degradación, ensayos de cultivo celular (por ejemplo, de células neoplásicas), en animales modelos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, perros o cerdos) y los ensayos que se describen a continuación, para determinar si tienen una actividad predicha, por ejemplo, actividad de unión y/o especificidad de unión y estabilidad.

Además, el cribado de alto rendimiento se puede utilizar para acelerar el análisis mediante dichos ensayos. Como resultado, puede ser posible detectar rápidamente las moléculas descritas en esta invención para la actividad, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Las metodologías generales para realizar un cribado de alto rendimiento se describen, por ejemplo, en Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; y la Patente de EE.UU. n.° 5.763.263. Los ensayos de alto rendimiento pueden utilizar una o más técnicas de ensayo diferentes, incluyendo, pero sin limitación, las que se describen a continuación.

La cita de publicaciones y documentos de patentes no pretende ser una admisión de que alguno es un estado de la técnica pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de los mismos. Habiéndose descrito ahora la invención a modo de descripción escrita, los expertos en la materia reconocerán que la invención se puede poner en práctica en una variedad de realizaciones siempre que estén dentro del alcance de las reivindicaciones, y que la descripción anterior y los ejemplos a continuación son para fines ilustrativos y no limitativos de las afirmaciones que siguen.

Ejemplo 1: Síntesis de compuestos de la descripción

Síntesis del Compuesto 1

Etapa 1: Síntesis de éster bis-fosfato (5-2)

A una solución de 5-1 (1,0 g, 0,94 mmol) y etilenglicol (0,0263 ml, 0,47 mmol) en acetonitrilo (20 ml) se añadió 1H-tetrazol en acetonitrilo (solución 0,45 M, 3,14 ml, 1,41 mmol) gota a gota durante 3 minutos. Después de agitar a 20 °C durante 1,5 h, la mezcla de reacción se enfrió a < -20 °C y se trató con hidroperóxido de í-butilo en n-decano (solución 5,5 M, 0,514 ml, 2,83 mmol) durante 5 min. La mezcla de reacción se dejó calentar a 20 °C durante la noche. La reacción se inactivó con H² O (grado Milli Q, 60 ml) seguido de diclorometano (60 ml). La capa acuosa se separó de la capa orgánica y se extrajo con diclorometano (60 ml x 2). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron a través de un embudo de vidrio sinterizado y se concentraron al vacío a 30 °C para proporcionar un aceite de color amarillo pálido (1,8 g). El producto se purificó mediante cromatografía en columna (25 g de gel de sílice) eluyendo con un gradiente de diclorometano hasta el 8 % de metanol en diclorometano. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y concentraron al vacío a 30 °C para proporcionar el compuesto del título como un sólido de color blanquecino (449 mg, rendimiento del 47 %).

RMN 1H (400MHz, DMSO-d6) -0,49 (s, 6H, 2 Crt¡-S¡), 0,03 (s, 6H, 2 Crt¡-S¡), 0,79 (s, 18H, 2 tBu-Si), 1,14 (s, 12H, 2 Me2CH), 2,71 (m, 2H, 2 CHMe² ), 2,81 (m, 4H, 2 CH² CN), 3,17 (m, 2H, 2 H-3'), 3,61 (m, 4H, 2 H2-5'), 3,70 & 3,73 (2s, 12H, 4 O CH³ ), 3,91 (m, 2H, 2 H-2'), 3,99 (m, 4H, 2 OCH² CH² CN), 4,82 (s, 4H, 2 OCHAr), 4,85 (m, 2H, 2 H-4'), 6,06 (d, 2H, 2 H-1'), 6,87-8,21 (m, 34H, 8 Ar), 11,56 (br s, 2H, 2 NH-1), 11,81 (s, 2H, 2 H-8); RMN 31P (161MHz, D² O) 8 1,01.

Ejemplo 2: Síntesis del Compuesto 1

Una solución de 5-2 (0,31 g, 0,154 mmol) y amoníaco metanólico (solución 2 M, 5 ml, 10,0 mmol) se agitó a 20 °C durante 4 h y se concentró al vacío a 20 °C para proporcionar un aceite. El aceite se disolvió en acetonitrilo (6 ml) y N,N-dimetilformamida (3 ml) y se trató con trihidrofluoruro de trietilamina (0,064 ml, 0,391 mmol) a 20 °C. Después de 3 h, se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (0,192 ml, 1,173 mmol) a la mezcla de reacción a 20 °C y la mezcla se agitó a 20 °C durante 3 días. A la mezcla de reacción se añadió ácido trifluoroacético (0,015 ml, 0,195 mmol) y 1-dodecanotiol (0,103 ml, 0,409 mmol) a 20 °C durante 8 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 días. Se añadió 1-dodecanotiol (0,052 ml) seguido de ácido trifluoroacético (0,345 ml) a la mezcla de reacción y la mezcla se agitó durante la noche. Después de 1 día, la reacción se inactivó con H² O (grado Milli Q, 15 ml) y diclorometano (10 ml). La capa acuosa se separó de la capa orgánica y se extrajo con diclorometano (10 ml). Las capas orgánicas combinadas se purificaron mediante cromatografía en columna (columna C18 de 50 g) eluyendo con tampón de bicarbonato de N,N-dimetilhexilamonio 10 mM (pH 7,5) hasta el 30 % de acetonitrilo en tampón de bicarbonato de N,N-dimetilhexilamonio 10 mM (pH 7,5). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se concentraron al vacío para proporcionar el compuesto del título (197 mg).

RMN 1H (400MHz, D² O) 80,84 (s, 9H, 3 Me(CH² )sN), 1,29 (s, ) 1,29 (m, 18H, 3 MeCH² CH² CH² CH² CH² N) , 1,67 (m, 6H, 3 CH² CH² N), 2,84 (s, 18H, 3 Me² N), 3,09 (m, 6H, 3 NCH² ), 3,98-4,18 (m, 4H, 2 H2-5), 4,24 (m, 2H, 2 H-2'), 4,43 (m, 2H, 2 H-3'), 4,71 (m, 2H, 2 H-2'), 5,80 (d, 2H, 2 H-1'), 7,97 (s, 2H, 2 H-8) ; RMN 31P (161MHz, D² O) 81,03.

Síntesis del Compuesto 2

Etapa 1:

A un matraz de fondo redondo secado a la llama que contenía tamices moleculares de 4 Á en acetonitrilo (4 ml) se añadió 2'-tBDSilil-3'-DMT-Guanosina (n-IPr-PAC)-5'-CED fosforamidita (0,3 g, 0,28 mmol), seguido de dietilenglicol (0,03 ml, 0,31 mmol). A continuación se añadió 1 H-tetrazol (0,45 M en acetonitrilo, 0,14 ml, 0,06 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente bajo N² hasta que la RMN 31P indicó la desaparición de la fosforamidita (3 días). Se añadió hidroperóxido de terc-butilo (5,5 M en decano, 0,11 ml, 0,6 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo N². A continuación, la reacción se filtró y se concentró para proporcionar un producto bruto que se utilizó sin purificación adicional. RMN 31P (CD³ CN) 5 139,9 (1P), 140,3 (1P).

Etapa 2:

A una suspensión que contenía el producto de la Etapa 1 (0,28 mmol) en THF (5 ml) se añadió metilamina (2 M en THF, 1,4 ml, 2,8 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente bajo N² hasta que la RMN 31P indicó el consumo de material de partida y la LCMS indicó la eliminación del grupo protector n-isopropil-PAC (24 horas). La reacción se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos se concentraron para proporcionar un producto bruto que se usó sin purificación adicional. RMN 31P (CD³ CN) 5-1,22 (2P).

Etapa 3:

A una solución que contenía el producto de la Etapa 2 (0,28 mmol) en THF (4 ml) se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (1 M en THF, 3 ml, 3 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente bajo N² hasta que la LCMS indicó la eliminación del grupo protector 2' sililo (16 horas). La reacción se diluyó con agua y se extrajo con cloroformo. Los extractos orgánicos se concentraron para proporcionar un producto bruto que se usó sin purificación adicional.

Etapa 4:

A una solución que contenía el producto de la Etapa 3 (0,28 mmol) en THF (3 ml) se añadió ácido trifluoroacético (0,35 ml, 4,5 mmol) seguido de 1-decanotiol (0,22 ml, 0,9 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche, a continuación se concentró a presión reducida. El material bruto resultante se purificó mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico débil (Sepharose, 0-100 % de bicarbonato de trietilamonio 1 M/agua) para proporcionar 0 ,117 g del producto deseado como un sólido de color blanco.

Etapa 5:

El producto obtenido en la Etapa 4 (0,117 g, 0,11 mmol) se disolvió en agua y el pH se ajustó a 4 mediante la adición de ácido acético glacial. Se añadió gota a gota sulfato de dimetilo (0,16 ml, 1,7 mmol) durante 90 minutos y el pH se mantuvo entre 4,0-4,1 mediante la adición de NaOH 5M. La reacción se agitó durante 30 minutos adicionales después de la adición, a continuación se diluyó con agua hasta 900 ml. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico débil (Sepharose, 0-100 % de bicarbonato de trietilamonio 1 M/agua) para proporcionar el producto como la sal de trietilamonio. A continuación, la sal de trietilamonio se convirtió en la sal de dimetilhexilamonio mediante cromatografía de fase inversa (Isco, C18, 0-40 % de bicarbonato de dimetilhexilamonio 10 mM/acetonitrilo). Por último, el producto se convirtió en la sal de amonio por precipitación con perclorato de amonio/acetona. RMN 1H (D² O) 5 3,67 (4H, s), 3,94 (4H, bs), 4,03 (6H, s), 4,15 (2H, m), 4,30 (2H, bs), 4,38 (2H, m), 4,57 (2H, m), 5,94 (2H, m). RMN 301 *35P (D² O) 50,32 (2P, s).

El Compuesto 25 se sintetizó de manera similar a la descrita anteriormente para el Compuesto 2.

Compuesto 25:

Etapa 1 Síntesis de bis(2-metilpropanoato) de (2R,3R,4R,5R)-2-((((2-((bis(2-cianoetoxi)fosforil)oxi)-3-hidroxipropoxi)(2-cianoetoxi)fosforil)oxi)metil)-5-(2-isobutiramido-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)tetrahidrofuran-3,4-diilo (7C).

Un matraz de fondo redondo de una sola boca de 250 ml equipado con una barra de agitación y un adaptador de entrada de nitrógeno se cargó con bis(2-metilpropanoato) de (2R,3R,4R,5R)-2-((((2-cianoetoxi)(diisopropilamino)fosfanil)oxi)metil-5-(2-isobutiramido-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)tetrahidrofuran-3,4-diilo (7A) [3,37 g, 4,86 mmol, 1 eq.] en 27 ml de CH ³ CN (Kf = 2743 ppm). Se añadieron tamices moleculares de 3 Á al matraz. Se destiló azeotrópicamente bis(2-cianoetil)fosfato de 1-((terc-butildimetilsilil)oxi)-3-hidroxipropan-2-ilo (7B) [1,91 g, 4,86 mmol, 1 eq.] dos veces con CH ³ CN, se disolvió en 30 ml de CH ³ CN, y se añadió al matraz de reacción para proporcionar una lectura final de Kf de 1507 ppm. El matraz se cargó con 1H-tetrazol [11,87 ml 0,5 M, 5,34 mmol, 1,1 eq.], dando como resultado una mezcla blanca y turbia después de 5 min. La LCMS indicó el consumo completo del análogo de guanosina de partida después de 45 min, momento en el cual el matraz se enfrió a 0 °C en un baño de agua con hielo y se cargó con hidroperóxido de terc-Butilo [1,77 ml 5,5 M, 9,72 mmol, 2 eq.]. La mezcla de reacción se agitó a TA durante 15 h y la LCMS mostró el consumo del intermedio después de 15 h. La filtración y concentración por evaporación rotatoria proporcionó 6,1 g de una suspensión de color amarillo, que se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (80 g) con 5 % de MeOH/DCM. La concentración de las fracciones que contenían el producto produjo 3,7 g (76 % ) de intermedio protegido, 2-metilpropanoato de (2R,3R,4R,5R)-5-{[(2-{[bis(2-cianoetoxi)fosforil]oxi}-3-[(terc-butildimetilsilil)oxi]propoxi(2-cianoetoxi)fosforil)oxi]metil}-2-[2-(2-metilpropanamido)-6-oxo-1H-purin-9-il]-4-[(2-metilpropanoil)oxi]oxolan-3-ilo, como un aceite viscoso e incoloro. Un matraz de fondo redondo de una sola boca de 500 ml equipado con una barra de agitación y un adaptador de entrada de nitrógeno se cargó con 2-metilpropanoato de (2R,3R,4R,5R)-5-{[(2-{[bis(2-cianoetoxi)fosforil]oxi}-3-[(tercbutildimetilsilil)oxi]propoxi(2-cianoetoxi)fosforil)oxi]metil}-2-[2-(2-metilpropanamido)-6-oxo-1H-purin-9-il]-4-[(2-metilpropanoil)oxi]oxolan-3-ilo [3,6 g, 3,6 mmol, 1 eq.] y 100 ml de DCM. A continuación se cargó el matraz con eterato de BF³ [0,89 ml, 7,19 mmol, 2 eq.], provocando inmediatamente que la solución incolora se vuelva naranja. La LC/MS mostró poco consumo del material de partida después de 6 min, por lo que se añadió otro equiv. de eterato de BF³. Se añadió un equivalente adicional. (total de 4,0 equiv.) después de un total de 50 min de tiempo de reacción. La LC/MS indicó el consumo completo del material de partida después de 80 min, momento en el cual la mezcla de reacción se neutralizó con 100 ml de 5 % de NaHCO3 (ac) y se agitó durante 5 min. Las capas acuosa y orgánica de la mezcla turbia de color naranja claro se separaron utilizando un embudo de decantación de 500 ml. La capa acuosa se volvió a extraer con 100 ml adicionales de DCM. Las capas orgánicas combinadas se concentraron mediante evaporación rotatoria y se purificaron mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (80 g) con 0-10 % MeOH/DCM proporcionando 1,15 g de bis(2-metilpropanoato) de (2R,3R,4R,5R)-2-((((2-((bis(2-cianoetoxi)fosforil)oxi)-3-hidroxipropoxi)(2-cianoetoxi)fosforil)oxi)metil)-5-(2-isobutiramido-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)tetrahidrofuran-3,4-diilo (7C) con un rendimiento del 36 % . RMN 31P (D² O) 8-2,1 (1P), 8-2,3 (1P); MS (m/z) 885 [M-H].

Etapa 2: Síntesis del Compuesto 7

Un matraz de fondo redondo de una sola boca de 250 ml equipado con una barra agitadora y un adaptador de entrada de nitrógeno se cargó con 2-metilpropanoato de (2R,3R,4R,5R)-2-({[(2-cianoetoxi)(diisopropilamino)fosfanil]oxi}metil)-5-[2-(2-metilpropanamido)-6-oxo-1H-purin-9-il]-4-[(2-metilpropanoil)oxi]oxolan-3-ilo (7A) [1,64 g, 2,36 mmol, 1,8 eq.] en 12 ml de MeCN y se agitó sobre tamices moleculares de 4 A durante alrededor de 48 h (Kf < 1000 ppm). Se disolvió 2-metilpropanoato de (2R,3R,4R,5R)-5-{[(2-{[bis(2-cianoetoxi)fosforil]oxi}-3-hidroxipropoxi(2-cianoetoxi)fosforil)oxi]metil}-2-[2-(2-metilpropanamido)-6-oxo-1H-purin-9-il]-4-[(2-metilpropanoil)oxi]oxolan-3-ilo (7C) [1,15 g, 1,3 mmol, 1 eq.] en 4 ml de MeCN y se añadió al matraz de reacción para proporcionar una lectura final de Kf de <800 ppm. El matraz se cargó con 1H-tetrazol [2,88 ml 0,5 M, 1,3 mmol, 1 eq.], dando como resultado una mezcla blanca y turbia después de 5 min. La LCMS indicó el consumo completo del análogo de guanosina de partida después de 45 min, momento en el cual el matraz se enfrió a 0 °C en un baño de agua con hielo y se cargó con hidroperóxido de terc-Butilo [0,47 ml 5,5 M, 2,59 mmol, 2 eq.]. La mezcla de reacción se agitó a TA durante la noche y la LCMS mostró el consumo del intermedio en las siguientes 15 h. La filtración y concentración por evaporación rotatoria proporcionó una suspensión de color amarillo, que se purificó mediante cromatografía en columna con 5 % de MeOH/DCM, proporcionando 520 mg del intermedio protegido (es decir, el intermedio que porta todos los grupos protectores) con un rendimiento del 27 % .

Un matraz de fondo redondo de una sola boca de 100 ml equipado con una barra de agitación y un adaptador de entrada de nitrógeno se cargó con 0,52 g del material de partida, 9 ml de MeCN y 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno [0,78 ml, 5,22 mmol, 15 eq.]. Después de 1 hora, la mezcla de reacción de color marrón claro se concentró a sequedad y se recogió en 8,5 ml de agua. La solución se añadió a metilamina [2,61 ml 2 M, 5,22 mmol, 15 eq.] y 2,6 ml de hidróxido de amonio, y se agitó a 60 °C durante 2 horas, a continuación se enfrió a temperatura ambiente y se cargó en una columna C 18 eluyendo con tampón DMHA/CAN. Las fracciones deseadas se concentraron parcialmente y se liofilizaron durante la noche, proporcionando 150 mg del intermedio completamente desprotegido, ácido [1,3-bis({[(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]metoxi(hidroxi)fosforil}oxi)propan-2-il]oxifosfónico (7D), con un rendimiento del 50 % .

Un matraz de fondo redondo de una sola boca de 250 ml se cargó con ácido [1,3-bis({[(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-il)-3,4-dihidroxioxolan-2-il]metoxi(hidroxi)fosforil}oxi)propan-2-il]oxifosfónico [0,15 g, 0,17 mmol, 1 eq.] y 20 ml de agua. La solución se ajusta a pH = 4,0 con AcOH. Se añadió sulfato de dimetilo [1,25 ml, 13,04 mmol, 75 eq.] en porciones de 5 ul durante 2 horas mediante una bomba de jeringa mientras se mantenía el pH en 4,0 con adiciones de 7 ul de NaOH 5 M(ac). La LCMS indicó dimetilación completa. La mezcla de reacción se diluyó con 500 ml de agua y se extrajo dos veces con 400 ml de DCM. La fase acuosa se ajustó a pH = 7,8 para que coincida con el tampón de bicarbonato de trietilamonio 1 M. La mezcla bruta se bombeó a una columna de Sepharose. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se mezclaron con 60 ml de tampón DMHA 100 mM y se bombearon a una columna C 18 de 150 g. La fracción deseada se concentró parcialmente y a continuación se liofilizó durante la noche. Se obtuvieron 130 mg del producto dimetilado (Compuesto 7) con un rendimiento del 83 % . RMN 31P (D² O) 80,9 (1P), 80,1 (1P), 8- 0,8 (1P); MS (m/z) 891,2 [M-H]-.

Síntesis del Compuesto 3

A una suspensión que contenía guanosina (10,0 g, 35,3 mmol) en acetonitrilo (100 ml) se añadió sulfato de sodio (12,5 g, 88,3 mmol) seguido de ácido fenilborónico (4,52 g, 37,0 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a reflujo y se agitó bajo N² hasta que la RMN indicó la conversión completa de guanosina (3 horas). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el producto se aisló por filtración para proporcionar 11 ,1 g de un sólido de color blanco, que se usó sin más purificación.

Etapa 2:

A una solución que contenía tiodietanol (0,75 g, 6,1 mmol) en diclorometano (60 ml) se añadió diisopropiletilamina (3,2 ml, 18,3 mmol) y la reacción se enfrió a 0 °C. Se añadió gota a gota N,N-diisopropilclorofosforamidita de 2-cianoetilo (2,8 ml, 12,8 mmol) durante 15 minutos. La mezcla de reacción resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó bajo N². Después de 2 horas, la reacción se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. El producto se utilizó sin purificación adicional.

Etapa 3:

A una solución que contenía el producto de la Etapa 1 (0,71 g, 1,92 mmol) y la Etapa 2 (0,5 g, 0,96 mmol) en DMF (15 ml) se añadió 5-(etiltio)-1H-tetrazol (0,1 g, 0,72 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente bajo N² hasta que la RMN 31P indicó la conversión al producto deseado (3 horas). La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se usó sin purificación adicional.

Etapa 4:

A una solución que contenía el producto de la Etapa 3 (1,92mmol) en THF (20ml) se añadió hidroperóxido de tercbutilo ( 0,7 ml, 3,84 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió DBU (2,9 ml, 19,2 mmol) y la reacción se agitó durante 16 horas más. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se recogió en 900 ml de agua. El producto se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico débil (Sepharose, 0-100 % de bicarbonato de trietilamonio 1M/agua).

E tap a 5:

Este compuesto se preparó de manera similar a la Etapa 5 de síntesis del Compuesto ² .

Los Compuestos ^{26 -29} se sintetizaron de manera similar a la descrita anteriormente para el Compuesto 3.

E jem p lo 2: S ín te s is de A R N m m e d ia n te tra n s c rip c ió n in vitro (IV T )

Los ARNm diana se preparan siguiendo el Protocolo de reacción IVT - Capping cotranscripcional descrito en esta invención.

M ateria les :

1. La relación de A:U:C:G varía entre 1:1:1:0 ,1 y 1 :1 :1 :1, con la cap añadida en un exceso de 10 veces con respecto a G.

2. La ARN polimerasa T7 se añade después de otros componentes excepto el agua.

3. Se añade agua para un volumen de reacción total de 100 ul.

4. La mezcla se mezcla bien y se centrifuga en una centrífuga de sobremesa durante 1 minuto.

5. El cóctel se incuba a 37 grados durante 4 horas.

6. Se añaden 2,5 ul de ADNasa I libre de ARNasa.

7. El cóctel se incuba a 37 °C durante 45 minutos.

Como se describe en este Ejemplo, cada uno de A, U, C y G incluye NTP modificado y no modificado. Una vez completada la reacción IVT, la mezcla se limpia mediante purificación por membrana (MegaClear o equivalente) y Oligo dT. La concentración de la muestra se determina usando un espectrofotómetro y la degradación se cuantifica usando un bioanalizador.

Ejemplo 3: Afinidades de unión a eIF4E mediante resonancia de plasmones superficiales (RPS) Descripción general del procedimiento de ensayo

Un chip sensor SA (GE Healthcare) se acopla a un instrumento Biacore 3000. Después de lavar la superficie, la proteína eIF4E (factor de inicio de elongación 4E, HNAVIpeptTEVeIF4E 32 -217 (biotinilado); pbCPSS1560) se captura de forma no covalente con las proteínas de estreptavidina ya inmovilizadas.

Las series de concentración del compuesto se inyectan sobre la proteína inmovilizada en serie en concentración creciente. Los modelos de interacción se ajustan globalmente a las trazas experimentales, lo que permite la determinación de Kd o K^d (afinidad de unión; unidad: M) y posiblemente kas (velocidad de asociación, calculada a partir de la fase de asociación; unidad: M 'V ) y kdes (velocidad de disociación, calculada a partir de la fase de disociación; unidad: s-1).

Procedimientos

Preparación del ch ip sensor

Se acopló un chip sensor (SAD5001 o SA) en un instrumento Biacore 3000, se lavó con NaOH 50 mM, NaCl 1 M. La proteína eIF4E se diluyó en tampón de corrida (H EPES 50 mM, KCl 150 mM, MgCl2 10 mM, T C E P 2 mM) para ~1 |jM. La solución de proteína diluida se inyectó durante 300-600 segundos. Los niveles de captura típicos fueron 5000­ 6000 RU.

Los compuestos de prueba se solubilizaron en ddH² O o DMSO a 10 mM. Se prepararon soluciones madre 100 jM mediante una dilución con un factor de dilución de 100 en tampón de corrida (H EPES 50 mM, KCl 150 mM, MgCb 10 mM). El ensayo se realizó con o sin DMSO al 1 % .

Los datos se analizaron en GeneData. El ajuste de la curva se aceptó o rechazó observando los sensogramas resultantes y los ajustes de estado estacionario.

Validación del ensayo

La proteína eIF4E se capturó según el procedimiento anterior y se inyectaron un conjunto de compuestos de 7-metil (m7) guanosina fosfato (m7GMP, m7GDP, m7GTP), así como un compuesto con un residuo de guanosina adicional después de la cadena de trifosfato (m7GTPG) en respuesta a la dosis El ensayo se ha validado utilizando un tampón de corrida con y sin DMSO. Se encontró que la actividad superficial y la Kd para m7GTP no se ven afectadas por el DMSO. También se encontró que la superficie es extremadamente estable (el uso continuo durante >6 semanas dio como resultado una pérdida del 5-10 % de la actividad superficial). Además, la proteína recién capturada se estabiliza lentamente, lo que genera respuestas negativas durante la fase de disociación para los compuestos inyectados sobre la proteína recién capturada.

La Tabla 3 a continuación incluye los resultados para determinados compuestos de la descripción.

Tabla 3

E jem p lo 4: E n sa yo d e tra d u c c ió n in vitro s in c é lu la s c in é tic a s y e n s a y o d e c o m p e tic ió n C ap

El ensayo de traducción in vitro se realizó con el kit IVT acoplado de 1 etapa HeLa (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante para evaluar el rendimiento de nuevos análogos de cap como compuestos libres o como parte integral del ARNm con capping. Los análogos de cap con afinidad por la proteína eIF4E pueden reducir la tasa de síntesis de proteínas en la traducción sin células. Además, los ARN que contienen dichos análogos de cap ("Cap-ARNmod") muestran una potencia diferente de síntesis de proteínas en la traducción libre de células.

Los ARN modificados ("ARNmod") de eGFP y mCitrine-degron, que albergan modificaciones químicas en las estructuras de CAP, las unidades de ribosa seleccionadas y/o las bases, se diluyeron en agua estéril libre de nucleasas hasta una cantidad final de 500 ng en 5 ul. Este volumen se añadió a 20 ul de lisado de HeLa recién preparado. La reacción de traducción in vitro se realizó en una placa estándar de fondo redondo de 96 pocillos (Coming, Corning, NY), cubierta con un sello autoadhesivo compatible con fluorescencia (BioRad, Hercules, CA) a 30 °C dentro del lector de placas Cytation 3 (BioTek, Winooski, VT).

La señal fluorescente por reacción aumentó con el tiempo y se considera proporcional a la síntesis de proteínas que se produce. Cada reacción de traducción sin células se controló durante 120-180 min con los siguientes ajustes: proteína eGFP - ex. 485 nm, em. 515 nm, ganancia 80; proteína mCitrine-degron - ex. 515, em. 545, ganancia 70 u 80. La altura del cabezal de lectura se fijó a 1 mm por encima de la placa y una velocidad de lectura de uno por muestra cada 17 segundos.

Para los ensayos de competición, el volumen total de la reacción de traducción sin células se incrementó a 27,8 ul mediante la adición de agua o análogos de CAP libres diluidos en agua. La concentración madre de los análogos de CAP libres fue de 1 mM. Con diluciones dobles en agua, la concentración se redujo secuencialmente. Después de la reacción de traducción libre de células, se combinaron el ARNmod (por ejemplo, un ARNm con capping m7GpppG(2'-Om) (es decir, un ARNm con extremo Capl) que codifica para eGFP) y análogos de CAP diluidos, la curva de titulación tenía una concentración final de 100 uM, 50 uM, 25 uM, 12,5 uM, 6,25 uM, 3,12 uM y 0 uM de análogos de CAP libres. Los análogos de CAP usados en este estudio eran productos comerciales que servían como material de referencia (TriLink, San Diego, CA) o compuestos descritos en esta invención. Se plantea la hipótesis de que los análogos de cap de molécula pequeña interfieren con el ensamblaje del "bucle cerrado" en una forma dependiente de Kd.

Después de que la señal fluorescente en la reacción de traducción libre de células alcanzó un nivel estable, los valores absolutos de la misma se transfirieron a un programa de análisis estadístico (GraphPad Software, La Jolla, CA) y se derivaron cálculos de ajuste de curva o CI⁵⁰ con ajustes según las instrucciones del fabricante.

Los resultados del ensayo de competencia cap se ilustran en la Figura 1. En este estudio, el ARNmod utilizado comprende 1-metil-pseudouridina, que reemplaza a cada uridina en la secuencia de ARN y 5-metilcitidina, que reemplaza a cada citidina en la secuencia de ARN. Además, la Tabla 4 a continuación incluye los valores CI⁵⁰ de determinados compuestos de la descripción.

T a b la 4

Los ensayos de traducción sin células también se realizaron utilizando ARNmod que comprenden 5-metoxi uridina, que reemplaza cada uridina en la secuencia de ARN, salvo que se especifique lo contrario. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La Tabla 5 describe los niveles de hEPO después de 3 horas de un ensayo de traducción sin células.

Tabla 5

Ejemplo 5: Ensayo de expresión basado en células

El ensayo de expresión basado en células se realizó siguiendo el protocolo que se describe a continuación.

1) Día 1: Siembra de Hela/Vero/BJ-Fibroblast a 20 K células en 100 ul de medio/pocillo de una placa de 96 pocillos 2) Día 2: Transfección

• Transfecte 250 ng/rxn en mCherry/mCitrine deg; 25 ng/rxn en nanoLuc

• Diluya el ARNm de nanoLuc a 10 ng/ul, en placas de 96 pocillos.

Mapa de placa de Fabricación (100 ng/ul, por pocillo)

m c h e rry

n anoluc

- Prepare una placa de dilución NanoLuc (1:10 dil de fábrica, proporcionado 10 ng/ul, por pocillo)

Mapa de placa de mezcla Maestra:

- Prepare una placa de mezcla maestra mCherry/mCitrine deg y una placa de mezcla Maestra nanoLuc de duplicados, utilizando el diseño anterior.

- Retire las muestras de mCherry/mCitrine deg directamente de la placa de fábrica. Utilice el mismo mapa de placas que NanoLuc.

Mapa de placa de destino (placas de células):

- Incube Lipofectamine/Optimem durante 15 minutos, se añaden 70 ul a cada pocilio de la placa de mezcla maestra. - Añada 10 ul de ARNm (por pocillo) a 70 ul de mezcla L2K/Optimem.

- Incube ARNm con la mezcla L2K/Optimem durante otros 15 minutos.

- Añada 20 ul de mezcla de ARNm a cada pocillo de CELL PLATE.

3) Día 3: Ensayo (24 horas para expresión; 48 horas para citocina):

- mCherry:

- Lave con 100 ul de PBS 1x

- Añada 100 ul de PBS para lectura

- Lea sobre Synergy:

Programa: punto final de fluorescencia en Excitación:585, emisión:615,

Ganancia: 100

- mCitrine degron

- Lave con 100 ul de PBS 1x

- Añada 100 ul de PBS para lectura

- Lea sobre Synergy en Excitación:510; emisión:540, Ganancia: 100.

- NanoLuc:

- Lave con 100 ul de PBS 1x

- Añada 100 ul de tampón Glo Lysis 1*

- Lea sobre Synergy

Programa: luminiscencia en ganancia 115 (predeterminado)

4) Ensayo del día 4 (ENSAYO IFN-b):

- Utilice el kit ELISA Beta de interferón humano de VeriKine (n.° 41410-2, PBL Biosciences)

- Siga el protocolo del kit.

Los resultados de los ensayos de expresión basados en células en hepatocitos primarios humanos se incluyen en la Tabla 6. En este estudio, cada uno de los ARNm que llevan varias cap (por ejemplo, C a p 1, A RCA o análogos de cap descritos en esta invención) también comprende 5-metoxiuridina, que reemplaza cada uridina en la secuencia de ARN. La Tabla 6 a continuación muestra el nivel de expresión normalizado utilizando ARNm modificados que portan varias cap en comparación con el ARNm que porta Cap1, en el que el ARNm que porta el Compuesto 7 no está metilado en 2'-OH de la penúltima guanosina (similar a CapO) mientras que todas las demás cap son tipo Capl, es decir, que contienen la estructura de pppG(2'-Om).

Tabla 6

E jem p lo 6: E n sa yo d e ex p re s ió n in vivo

Los ARNm que codifican hEPO se sintetizan según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 anterior, incorporando cotrancripcionalmente los análogos cap de la descripción. Como en el estudio del Ejemplo 5, cada uno de los ARNm que llevan varias cap (por ejemplo, Cap1, A R CA o análogos de cap descritos en esta invención) también comprende 5-metoxiuridina, que reemplaza cada uridina en la secuencia de a R n . Se produce una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP) basada en MC3 del ARNm sintetizado y se administra por vía intravenosa a ratones CD -1 (n=3) a una dosis en bolo de 0,05 mg/kg. El nivel de hEPO se probó a las 6 h, 24 h o 48 h después de la inyección. La Tabla 7 muestra los niveles normalizados de hEPO medidos 6 h después de la inyección, en los que el ARNm que porta el Compuesto 7 no está metilado en 2'-OH de la penúltima guanosina (similar a CapO) mientras que todas las demás cap son similares a Cap 1, es decir, contienen la estructura de pppG(2'-Om).

T a b la 7

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (I):

o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, donde:

el anillo B¹ es

en el que

R ¹ es alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C ⁶ , cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C ⁶ -C ¹⁰ , ariloxilo C ⁶ -C ¹⁰ , heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano;

cada uno de Ra y Rb es independientemente H o alquilo C ¹-C ⁶ ; y

Rc es H, NH² o alquilo C ¹-C ⁶ ; o Rc y uno de Ra y Rb, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o ⁶ miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ y alquinilo C ² -C ⁶ ;

el anillo B² es una nucleobase o una nucleobase modificada;

X ² es O, S(O)p, NR²⁴ o C R ²⁵ R²⁶ en el que p es 0, 1 o 2;

Y ² es -(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-, en el que Q⁰ es un enlace, O, S(O)r, NR⁴⁴ o C R ⁴⁵ R⁴⁶ , r es 0, 1 o 2, y cada uno de u y v independientemente es 1, 2 , 3 o 4;

R² es halo, ácido nucleico bloqueado (LNA) u OR ³ ;

R³ es H, alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C ⁶ y R³ , cuando es alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C6, está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C ¹-C ⁶ que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C ¹-C ⁶ ;

cada uno de R²⁰ , R^{2 1} , R²² y R²³ es independientemente -Q ³ -T ³ , en el que Q³ es un enlace o enlazador alquilo C ¹-C ³ opcionalmente sustituido con uno o más de halo, ciano, OH y alcoxi C ¹-C ⁶ , y T ³ es H, halo, OH, NH² , ciano, NO² , N³ , R^s3 u OR^s3 , en el que R^s3 es alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ , alquinilo C ² -C ⁶ , cicloalquilo C ³ -C ⁸ , arilo C ⁶ -C ¹⁰ , NHC(O)-alquilo C ¹-C ⁶ , mono-alquilamino C ¹-C ⁶ , di-alquilamino C ¹-C ⁶ , heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros o heteroarilo de 5 o ⁶ miembros, y Rs³ está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en halo, OH, oxo, alquilo C ¹-C ⁶ , COOH, C(O)O-alquilo C ¹-C ⁶ , ciano, alcoxilo C ¹-C ⁶ , amino, mono-alquilamino C ¹-C ⁶ , di-alquilamino C ¹-C ⁶ , cicloalquilo C ³ -C ⁸ , arilo C ⁶ -C ¹⁰ , heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros y heteroarilo de 5 o ⁶ miembros;

cada uno de R^{2 4} , R²⁵ y R²⁶ es independientemente H o alquilo C ¹-C ⁶ ;

cada uno de R²⁷ y R²⁸ es independientemente H u OR ²⁹ ; o R²⁷ y R²⁸ juntos forman OR³⁰ -O;

cada R²⁹ es independientemente H, alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C ⁶ y R²⁹ , cuando es alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C ⁶ , está opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C ¹-C ⁶ que está opcionalmente sustituido con uno o más OH u OC(O)-alquilo C ¹-C ⁶ ;

R³⁰ es alquileno C ¹-C ⁶ opcionalmente sustituido con uno o más de halo, OH y alcoxilo C ¹-C ⁶ ;

cada uno de R⁴⁰ , R⁴¹ , R42y R⁴³ es independientemente H, halo, OH, ciano, N³ , OP(O)R47R48 o alquilo C ¹-C ⁶ opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, o un R⁴¹ y un R⁴³ , junto con los átomos de carbono a los que están unidos y Qo, forman cicloalquilo C ⁴ -C ¹⁰ , heterocicloalquilo de 4 a 14 miembros, arilo C ⁶ -C ¹⁰ o heteroarilo de 5 a 14 miembros, y cada uno de los cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 a ⁶ miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, ciano, N³ , oxo, OP(O)R47R48, alquilo C ¹-C ⁶ , haloalquilo C ¹-C ⁶ , COOH, C(O)O-alquilo C ¹-C ⁶ , alcoxilo C ¹-C ⁶ , haloalcoxilo C ¹-C ⁶ , amino, mono-alquilamino C ¹-C ⁶ y di-alquilamino C ¹-C6;

R⁴⁴ es H, alquilo C ¹-C ⁶ o un grupo protector de amina;

cada uno de R⁴⁵ y R⁴⁶ es independientemente H, OP(O)R47R48 o alquilo C ¹-C ⁶ opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, y

cada uno de R⁴⁷ y R⁴⁸ , independientemente es H, halo, alquilo C ¹-C ⁶ , OH, SH, SeH o BH³ -.

2. El compuesto de la reivindicación 1, donde el anillo B² es

en el que

X ¹ es N o N+(R5);

R⁵ es alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ o alquinilo C ² -C ⁶ , cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre el grupo que consiste en arilo C ⁶ -C ¹⁰ , ariloxilo C ⁶ -C ¹⁰ , heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroariloxilo de 5 a 10 miembros, estando cada uno opcionalmente sustituido con uno o más de halo y ciano;

cada uno de Rd y Re es independientemente H o alquilo C ¹-C ⁶ ; y

Rf, cuando está presente, es H, NH² o alquilo C ¹-C ⁶ ; o Rf y uno de Rd y Re, junto con los dos átomos de nitrógeno a los que se unen y el átomo de carbono que conecta los dos átomos de nitrógeno forman un heterociclo de 5 o 6 miembros que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halo, alquilo C ¹-C ⁶ , alquenilo C ² -C ⁶ y alquinilo C ² -C6, o

un estereoisómero, tautómero o sal del mismo.

3. El compuesto de la reivindicación 2, que tiene la fórmula (Ia) o (Ib):

o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo.

4. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que tiene la fórmula (IIa) o (IIb):

o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el anillo Bi es

en el que cada uno de Rg y Rh es independientemente H o alquilo C ¹-C ³.

6. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente fórmula

donde Y ² y X ¹ se seleccionan de entre:

y estereoisómeros, tautómeros y sales del mismo.

7. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente fórmula

donde Y ² y X ¹ se seleccionan de entre:

y estereoisómeros, tautómeros y sales del mismo.

8. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado de entre cualquiera de

y estereoisómeros, tautómeros y sales del mismo.

9. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado de entre cualquiera de

y estereoisómeros, tautómeros y sales del mismo.

10. Una molécula de ARN cuyo extremo 5' comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. La molécula de ARN de la reivindicación 10, cuyo extremo 5' comprende un compuesto de fórmula (IIIa) o (IIIb):

o

12. La molécula de ARN de la reivindicación 10 que tiene

un extremo 5' que comprende un compuesto de fórmula (III):

indica un punto de unión.

13. La molécula de ARN de la reivindicación 12, que tiene un extremo 5' que comprende un compuesto seleccionado de entre

donde

indica el punto de unión.

14. La molécula de ARN de la reivindicación 12 o 13, donde X ¹ es N.

15. La molécula de ARN de la reivindicación 12 o 13, donde X ¹ es N+(CH3).

16. Una molécula de ARNm cuyo extremo 5' comprende un compuesto que tiene la siguiente fórmula

donde Y ² y X ¹ se seleccionan de entre:

17. La molécula de ARN de cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde la molécula de ARN tiene una vida media que es al menos 1,2 veces la de una molécula de ARN natural correspondiente en un entorno celular.

18. Un kit para realizar el capping de un transcrito de ARN que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y una ARN polimerasa.19

19. Un procedimiento de síntesis de una molécula de ARN de cualquiera de las reivindicaciones 10-17 in vitro, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar ATP no modificado o modificado, CTP no modificado o modificado, UTP no modificado o modificado, GTP no modificado o modificado, el compuesto de cualquiera de reivindicaciones 1-9 o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, y una plantilla de polinucleótido; en presencia de una ARN polimerasa; en condiciones conducentes a la transcripción por la ARN polimerasa de la plantilla de polinucleótido en una o más copias de ARN; por lo que al menos algunas de las copias de ARN incorporan el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9

o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo para formar la molécula de ARN.