TWI874791B - 抗病毒化合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種
式 I化合物：
Description
肺病毒科(
Pneumoviridae)病毒為造成許多流行性人類及動物疾病之反義單股RNA病毒。肺病毒科病毒家族包括人類呼吸道融合性病毒(HRSV)及人類間質肺炎病毒。幾乎所有兒童在兩歲前都會經歷HRSV感染。HRSV為嬰兒期及孩童期中下呼吸道感染之主要原因，其中0.5%至2%的感染者需要住院。
目前還沒有可用於預防HRSV感染的疫苗。單株抗體帕利珠單抗(palivizumab)可用於免疫預防，但其使用限於高風險的嬰兒，例如早產嬰兒或患有先天性心臟或肺部疾病之嬰兒，並且就一般使用而言成本通常過高。另外，核苷類似物利巴韋林(ribavirin)已作為唯一的用於治療HRSV感染之抗病毒劑審批通過，但功效有限。因此，需要抗肺病毒科治療劑。
患有慢性心臟疾病、肺部疾病或已經免疫抑制之彼等疾病的老年人及成年人亦具有罹患嚴重HRSV疾病之高風險(http://www.cdc.gov/rsv/index.html)。特定言之，患有慢性呼吸道疾病，諸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)之患者處於罹患急性呼吸道惡化之高風險下。急性呼吸道惡化為COPD患者之發病率、死亡率及生活品質降低的主要原因(Frickmann，J. Microbiol. Immun. 2012年9月. 2(3): 176-185)。
COPD患者中之約二分之一至三分之二之呼吸道惡化係由於病毒感染所致。引起這類呼吸道惡化之一些常見病毒病原體包括(但不限於)HRSV、人類間質肺炎病毒(HMPV)及人類鼻病毒(HRV)。相比於具有非感染性惡化之彼等患者，具有感染性惡化之COPD患者通常會經歷更長的住院時間段且遭受更大的肺部損害(Frickmann，Eur. J. Microbiol. Immun. 2012年9月. 2(3):176-185)。
仍需要適用於治療肺病毒科病毒感染(諸如HRSV感染)之有效且具有可接受之毒性概況的新穎抗病毒劑。
2015年5月14日公佈之WO2015/069939揭示了適用於治療肺病毒亞科病毒感染之化合物。此外，WO2015/069939係關於下式之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽：
其中：
R
1為H或F；
R
2為H或F；
R
3為OH或F；
R
4為CN、C
1-C
4烷基、C
2-C
4烯基、C
2-C
4炔基、C
3-C
4環烷基、疊氮基、鹵素或C
1-C
2鹵烷基；
R
6為OH；
R
5係選自由H及以下組成之群：
；
其中：
n'係選自1、2、3及4；
R
8係選自C
1-C
8烷基、-O-C
1-C
8烷基、苯甲基、-O-苯甲基、-CH
2-C
3-C
6環烷基、-O-CH
2-C
3-C
6環烷基及CF
3；
R
9係選自苯基、1-萘基、2-萘基、
；
R
10係選自H及CH
3；
R
11係選自H或C
1-C
6烷基；
R
12係選自H、C
1-C
8烷基、苯甲基、C
3-C
6環烷基及-CH
2-C
3-C
6環烷基。
在一個實施例中，本發明提供一種
式 I化合物：
式 I或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種醫藥調配物，其包含治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在另一實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要人類之肺病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防有需要人類之黃病毒科病毒感染之方法，該方法包含向該人類投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療或預防有需要人類之絲狀病毒科病毒感染之方法，該方法包含向該人類投與治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類之肺病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類之黃病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類之絲狀病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造供治療或預防人類之肺病毒科病毒感染的藥劑。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的藥劑。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類之黃病毒科病毒感染的藥劑。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類之絲狀病毒科病毒感染的藥劑。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類之肺病毒科病毒感染的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類之黃病毒科病毒感染的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類之絲狀病毒科病毒感染的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。
在另一實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為哮喘。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。
在另一實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為哮喘。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。
在另一實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑，其中該呼吸道病況為哮喘。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。
在另一實施例中，本發明提供用於治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為哮喘。
在另一實施例中，本發明提供用於醫學療法的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明提供一種製造式I-11之化合物的方法：
其中該方法包含：
(i)使式I-7之化合物：
，與
(ii)式I-12之化合物：
在存在NdCl
3及氯化四丁基銨之情況下反應；其中R為羥基保護基。在一些實施例中，R為苯甲基。在一些實施例中，R為矽基保護基。在一些實施例中，R為三級丁基二甲基矽基(TBS)。
在另一實施例中，本發明提供一種製造式I-6之化合物的方法：
其中該方法包含：
(i)使式I-7之化合物：
，與
(ii)式I-5之化合物：
在存在NdCl
3及氯化四丁基銨之情況下反應；其中R為羥基保護基。在一些實施例中，R為苯甲基。在一些實施例中，R為矽基保護基。在一些實施例中，R為三級丁基二甲基矽基(TBS)。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年2月18日申請且名稱為「Antiviral Compounds」的美國臨時專利申請案第62/977,969號之優先權益，該申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。
在本發明被視為所主張之主題的例證且不意欲將所附申請專利範圍限於所說明之具體實施例的理解下進行以下描述。為方便起見，提供在本發明通篇中使用的標題，且不認為該等標題以任何方式限制申請專利範圍。在任何標題下說明之實施例可與在任何其他標題下說明之實施例組合。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有如一般熟習此項技術者通常所理解的相同含義。
I. 綜述
本發明提供用於治療病毒性感染之2',3'-羥基-4'-氰基核苷類似物，該等病毒性感染諸如肺病毒科病毒感染以及其他病毒性感染，包括(但不限於)小核糖核酸病毒科、黃病毒科、絲狀病毒科及其他病毒感染。
II. 定義
「本發明化合物」係指
式 I化合物。
「醫藥學上有效量」係指提供所希望之治療或醫藥結果的調配物或其組合中本發明化合物的量。
「醫藥學上可接受之賦形劑」包括(但不限於)任何佐劑、載劑、賦形劑、助滑劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、風味增強劑、界面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑，其已經美國食品與藥物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准為可接受用於人類或家畜。
如本文所使用，「治療(treatment/treat/treating)」係指用於獲得有益或所希望之結果的方法。出於本發明之目的，有益或所希望之結果包括(但不限於)症狀緩解及/或症狀程度減輕及/或預防與疾病或病況相關之症狀的惡化。在一個實施例中，「治療(treatment/treating)」包括以下中之一或多者：a)抑制疾病或病況(例如，減少由疾病或病況引起之一或多種症狀，及/或減弱疾病或病況之程度)；b)減緩或遏制與疾病或病況相關之一或多種症狀的發展(例如，使疾病或病況穩定、延緩疾病或病況之惡化或進展)；及c)緩解疾病或病況，例如使臨床症狀消退、改善疾病狀態、延緩疾病進展、提高生活品質及/或延長存活期。
「預防」係指預防或延遲患有病毒感染之患者之臨床疾病之發展。
「呼吸道病況」係指一種疾病或病況，諸如由病毒感染引起之呼吸道感染、過敏性鼻炎、鼻充血、鼻漏、常年性鼻炎、鼻發炎、所有類型哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性或急性支氣管收縮、慢性支氣管炎、小氣管阻塞、肺氣腫、慢性嗜酸性肺炎、成人呼吸窘迫症候群、由其他藥物療法所致之氣管過度反應性惡化、肺部血管疾病(包括肺部動脈高血壓)、急性肺損傷、支氣管擴張、竇炎、過敏性結膜炎、特發性肺部纖維化或異位性皮膚炎，尤其哮喘或過敏性鼻炎或異位性皮膚炎或過敏性結膜炎。
「呼吸道病況之惡化」係指由病毒感染誘發之惡化。代表性病毒感染包括(但不限於)呼吸道融合性病毒(RSV)、鼻病毒及間質肺炎病毒。
如本文所使用之「治療有效量」或「有效量」係指有效地引發所要生物學或醫學反應之量，包括在向個體投與以用於治療疾病時足以實現此類疾病治療之化合物的量。有效量將視化合物、待治療個體之疾病及其嚴重程度及年齡、體重等而變化。有效量可包括一定範圍之量。如所屬領域中所瞭解，有效量可以是一或多次劑量，亦即，達成所需治療終點可能需要單次劑量或多次劑量。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮有效量，且若與一或多種其他藥劑結合可獲得或已獲得所希望或有利的結果，則單一藥劑可視為以有效量投與。任何共投與化合物之適合劑量可視情況因化合物之組合作用(例如累加或協同效應)而減少。
如本文所使用，「共同投與」包括在投與單位劑量之一或多種額外治療劑之前或之後投與單位劑量之本文所揭示化合物，例如在投與一或多種額外治療劑的數秒、數分鐘或數小時內投與本文所揭示化合物。舉例而言，在一些實施例中，首先投與單位劑量之本發明化合物，隨後在數秒或數分鐘內投與單位劑量之一或多種額外治療劑。或者，在其他實施例中，首先投與單位劑量之一或多種其他治療劑，接著在數秒或數分鐘內投與單位劑量之本發明化合物。在一些實施例中，首先投與單位劑量之本發明化合物，接著在數小時(例如1至12小時)之後投與單位劑量之一或多種其他治療劑。在其他實施例中，首先投與單位劑量之一或多種其他治療劑，接著在數小時(例如1至12小時)之後投與單位劑量之本發明化合物。本文所揭示化合物與一或多種其他治療劑之共同投與通常係指同時或依序投與本文所揭示化合物及一或多種其他治療劑，使得在患者體內存在治療有效量之每種藥劑。
亦提供本文所描述之化合物的醫藥學上可接受之鹽、水合物、溶劑合物、互變異構形式、多晶型物及前藥。「醫藥學上可接受」或「生理學上可接受」係指適用於製備適用於獸醫學或人類醫藥用途之醫藥組合物的化合物、鹽、組合物、劑型及其他物質。
本文所描述之化合物可製備及/或調配為醫藥學上可接受之鹽或在適當時製備及/或調配為游離鹼。醫藥學上可接受之鹽為具有游離鹼之所需藥理學活性的化合物之游離鹼形式之無毒鹽。此等鹽可衍生自無機或有機酸或鹼。舉例而言，含有鹼氮之化合物可藉由使該化合物與無機酸或有機酸接觸而製備為醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽之非限制性實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸單氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥丁酸鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽及杏仁酸鹽(mandelate)。其他適合的醫藥學上可接受之鹽的清單見於Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, Lippincott Wiliams and Wilkins, Philadelphia, Pa., 2006中。
本文所揭示化合物之「醫藥學上可接受之鹽」的實例亦包括衍生自適當鹼之鹽，該鹼諸如鹼金屬(例如，鈉、鉀)、鹼土金屬(例如，鎂)、銨及NX
4 +(其中X為C
1-C
4烷基)。亦包括諸如鈉鹽或鉀鹽之鹼加成鹽。
亦提供本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、異構體或混合物，其中連接至碳原子之1至n個氫原子可經氘原子或D置換，其中n為分子中之氫原子的數目。如此項技術中已知，氘原子為氫原子之非放射性同位素。該等化合物可增加代謝抗性，且因此當向哺乳動物投與時，可適用於增加本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、異構體或混合物之半衰期。參見例如，Foster, 「Deuterium Isotope Effects in Studies of Drug Metabolism」, Trends Pharmacol. Sci., 5(12):524-527 (1984)。藉由此項技術中熟知之手段，例如藉由採用其中一或多個氫原子已經氘置換之起始物質，合成此等化合物。
可併入所揭示化合物中之同位素之實例亦包括氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯及碘之同位素，諸如分別為
2H、
3H、
11C、
13C、
14C、
13N、
15N、
15O、
17O、
18O、
31P、
32P、
35S、
18F、
36Cl、
123I及
125I。經正電子發射同位素(諸如
11C、
18F、
15O及
13N)取代可適用於正電子發射斷層攝影術(PET)研究，以檢查受質受體佔用率。經同位素標記之
式 I化合物可通常藉由熟習此項技術者已知的習知技術或藉由與如下文闡述之實例中所描述之方法類似的方法，使用合適的經同位素標記之試劑代替先前所用之未經標記之試劑來製備。
本文所揭示之實施例之化合物或其醫藥學上可接受之鹽可含有一或多個不對稱中心(例如，對掌性碳及磷原子)，且可因此產生對映異構體、非對映異構體及其他立體異構形式，該等立體異構形式就絕對立體化學而言可定義為(
R)-或(
S)-，或針對胺基酸定義為(D)-或(L)-。本發明意謂包括所有該等可能的異構體，以及其外消旋及光學純形式。具光學活性之(+)及(-)、(
R)-及(
S)-或(D)-及(L)-異構體可使用對掌性合成子或對掌性試劑來製備，或使用習知技術(例如層析及分步結晶)來解析。用於製備/分離個別對映異構體之習知技術包括自適合之光學純前驅體進行對掌性合成或使用例如對掌性高壓液相層析(HPLC)對外消旋體(或鹽或衍生物之外消旋體)進行解析。在化合物以其對掌性形式表示時，應理解，實施例涵蓋但不限於特定非對映異構性或對映異構性增濃形式。在未指定但存在對掌性時，應理解，實施例係針對特定非對映異構性或對映異構性增濃形式；或此類化合物之外消旋或非外消旋混合物。如本文中所使用，「非外消旋混合物」為比率不為1:1的立體異構體之混合物。
「外消旋體」係指對映異構體之混合物。該混合物可包含相等或不相等量之各對映異構體。
「立體異構體(stereoisomer/stereoisomers)」係指一或多個立體中心之對掌性不同的化合物。立體異構體包括對映異構體及非對映異構體。若化合物具有一或多個不對稱中心或不對稱取代之雙鍵，則其可以立體異構形式存在且因此可以單獨的立體異構體或以混合物形式產生。除非另外指明，否則該描述意欲包括個別立體異構體以及混合物。判定立體化學及分離立體異構體之方法為此項技術中所熟知(參見例如Advanced Organic Chemistry, 第4章, 第4版, 3月期刊, John Wiley及Sons, 紐約, 1992)。
「互變異構體」係指質子位置不同的化合物之替代形式，諸如烯醇-酮基及亞胺-烯胺互變異構體，或含有連接至環-NH-及環=N-兩者之環原子之雜芳基的互變異構形式，諸如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有如一般熟習此項技術者通常所理解的相同含義。
如本文所使用，「溶劑合物」係指溶劑與化合物之相互作用之產物。亦提供本文所描述之化合物之鹽的溶劑合物。亦提供本文所描述之化合物之水合物。
如本文所使用之「前藥」係指藥物之衍生物，其在投與人體時根據一些化學或酶促路徑轉化成活性藥物。
III. 化合物
本發明提供一種
式 I化合物：
式 I，
或其醫藥學上可接受之鹽。
同樣屬於本文之範疇內的是本文中所描述之
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之活體內代謝產物，在該情況下相比於先前技術，此類產物為新穎且非顯著的。此類產物可例如由所投與化合物之氧化、還原、水解、醯胺化、酯化及其類似作用產生，主要由於酶促過程產生。因此，包括藉由包含使化合物與哺乳動物接觸足以產生其代謝產物的時間段之製程而製備的新穎及非顯著化合物。此類產物通常由製備放射性標記(例如
14C或
3H)之化合物，將其以可偵測劑量(例如大於約0.5 mg/kg)非經腸投與動物(諸如大鼠、小鼠、天竺鼠、猴)或人類，使代謝進行充足的時間(通常約30秒至30小時)且自尿液、血液或其他生物樣品分離其轉化產物來鑑別。此等產物因為其經標記而容易分離(其他藉由使用能夠結合代謝物中存活之抗原決定基的抗體來分離)。以習知方式，例如藉由MS或NMR分析測定代謝物結構。一般而言，代謝物之分析以與熟習此項技術者熟知之習知藥物代謝研究相同的方式進行。轉化產物只要未以其他方式在活體內發現，則適用於診斷分析以用於
式 I化合物之治療性給藥，即使其自身不具有抗病毒活性。
期望目標為探索一種具有較低EC
50值之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。EC
50值係指分析中實現最大功效的50%之化合物濃度。相對於具有較高EC
50之化合物，具有較低EC
50之化合物實現與較低化合物濃度類似的功效。因此，對於藥物開發，較低EC
50一般為較佳的。
另外期望探索一種具有高選擇性指數(SI)之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。SI為藉由將給定AVA值除以毒性(TOX)值(AVA/TOX)來量測細胞毒性與抗病毒活性(AVA)之間的窗口的比率。SI比率愈高，理論上藥物在活體內治療給定病毒感染期間將更有效且安全。理想藥物將僅在極高濃度下具有細胞毒性且在極低濃度下具有抗病毒活性，由此得到高SI值(高AVA/低TOX)且藉此能夠在剛好低於其細胞毒性濃度之濃度下消除目標病毒(Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B & HHV-7(第三版)，Diagnosis and Clinical Management，2014，第19章，第311-331頁)。
亦期望探索一種具有良好物理及/或化學穩定性的化合物或其醫藥學上可接受之鹽。化合物之整體穩定性增加可提供在體內之循環時間增加。在降解較少時，穩定化合物可以較低劑量投與且仍維持功效。另外，在降解較少時，關於由化合物降解產生之副產物的問題也較少。藥物之更高穩定性意謂更多藥物可用於目標細胞而未進行代謝。
進一步期望探索一種具有改良之藥物動力學及/或藥效動力學概況及長半衰期的化合物或其醫藥學上可接受之鹽。有利的是藥物具有中等或低清除率及長半衰期，因為此可產生良好的生物可用性及較高的全身性暴露。降低化合物之清除率及增加其半衰期時間可減小功效所需要之日劑量且因此得到更佳功效及安全概況。因此，改良之藥物動力學及/或藥效動力學概況及長半衰期可提供更佳的患者順應性。
亦期望研發具有改良之溶解性的化合物。較低溶解性化合物之特徵通常在於較差的吸附及生物可用性。低溶解性化合物通常亦難以調配且面臨導致研發成本及/或時間增加的研發挑戰。
進一步期望研發可在目標細胞及/或組織中進行選擇性代謝之前藥化合物。目標細胞/組織中之選擇性代謝確保將活性代謝物遞送至目標細胞/組織，進而導致功效增加。此亦可導致較低的劑量要求及副作用。
有利地，如與WO2015/069939中所描述的結構上相關之化合物(後文指定為化合物
1及
2)相比，
式 I化合物展現出改良之性質。
IV. 醫藥調配物
在一些實施例中，本發明提供一種醫藥調配物，其包含治療有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽(活性成分)及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。本文中亦提供一種醫藥調配物，其包含治療有效量之
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物及/或酯，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本文中所描述之
式 I化合物調配有將根據習知實踐選擇之習知載劑及賦形劑。錠劑將含有賦形劑、助滑劑、填充劑、黏合劑及其類似物。水性調配物以無菌形式製備，且在意欲藉由除經口投藥以外的方式遞送時通常為等滲的。所有調配物將視情況含有賦形劑，諸如「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(1986)中所闡述之賦形劑。賦形劑包括抗壞血酸及其他抗氧化劑、螯合劑(諸如EDTA)、碳水化合物(諸如聚葡萄糖)、羥烷基纖維素、羥烷基甲基纖維素、硬脂酸及其類似物。調配物之pH值在約3至約11範圍內，但通常為約7至10。
儘管活性成分可單獨投與，但其較佳可呈醫藥調配物形式。用於獸醫及人類用途之調配物均包含如上文所定義之活性成分，以及一或多種可接受之載劑及視情況選用之其他治療成分，尤其如本文所論述之彼等額外治療成分。載劑必須在與調配物之其他成分相容及對其受體生理學無害之意義上為「可接受」的。
調配物可宜以單位劑型呈現且可利用藥劑學技術中熟知之任何方法來製備。技術及調配物通常見於Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)中。該等方法包括使活性成分與構成一或多種附屬成分之載劑結合的步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密結合且隨後視需要使產物成形來製備調配物。
適合於經口投與的調配物可呈現為離散單元形式，諸如各含有預定量之活性成分的膠囊、扁囊劑或錠劑；粉末或粒子形式；於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或水包油液體乳液或油包水液體乳液形式。活性成分亦可以推注、舐劑或糊劑形式投與。
錠劑可藉由視情況與一或多種附屬成分一起壓縮或模製來製造。壓縮錠劑可藉由在適合機器中壓縮視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合的呈自由流動形式之活性成分(諸如粉末或粒子)來製備。模製錠劑可藉由在適合機器中模製經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀活性成分之混合物來製備。可將錠劑視情況包覆包衣或刻痕且視情況調配，以便提供活性成分自其之緩慢或控制釋放。
對於眼部或其他外部組織(例如口腔及皮膚)感染，調配物較佳以含有例如0.075至20% w/w (包括以0.1% w/w (諸如0.6% w/w、0.7% w/w等)遞增之在0.1%與20%之間的範圍內的活性成分)，較佳0.2至15% w/w且最佳0.5至10% w/w之量的活性成分的局部軟膏或乳膏形式施用。當調配成軟膏時，活性成分可與石蠟或水可混溶性軟膏基劑一起使用。或者，活性成分可與水包油乳膏基劑一起調配成乳膏。
視需要，乳膏基劑之水相可包括例如至少30% w/w之多元醇，亦即具有兩個或更多個羥基之醇，諸如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、丙三醇及聚乙二醇(包括PEG 400)及其混合物。局部調配物宜包括增強活性成分經由皮膚或其他受影響區域吸收或滲透之化合物。該等經皮滲透增強劑之實例包括二甲亞碸及相關類似物。
乳液之油相可由已知成分以已知方式構成。儘管該相可僅包含乳化劑(或稱為利泄劑)，但其宜包含至少一種乳化劑與脂肪或油或與脂肪及油之混合物。較佳地，包括親水性乳化劑以及充當穩定劑之親脂性乳化劑。在一些實施例中，可包括油及脂肪兩者。乳化劑與穩定劑一起或不與穩定劑一起構成所謂乳化蠟，且蠟與油及脂肪一起構成所謂乳化軟膏基劑，其形成乳膏調配物之油性分散相。
適用於調配物之利泄劑及乳液穩定劑包括Tween® 60、Span® 80、鯨蠟硬脂醇、苯甲醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯及月桂基硫酸鈉。
用於調配物之適合的油或脂肪之選擇係基於實現所需化妝品特性。乳膏應較佳為非油膩、非染色及可洗產物，具有適合的稠度以避免自試管或其他容器洩漏。可使用直鏈或分支鏈、單元或二元烷基酯，諸如二異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子脂肪酸之丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己酯或分支鏈酯之摻合物(稱為Crodamol CAP)。視所需特性而定，此等酯可單獨或組合使用。或者，使用高熔點脂質，諸如白色軟石蠟及/或液體石蠟或其他礦物油。
本文之醫藥調配物包含活性成分以及一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及視情況使用之其他治療劑。含有活性成分之醫藥調配物可呈適用於所欲投藥方法之任何形式。當用於例如經口投與時，可製備錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉末或粒子、乳液、硬或軟膠囊、溶液、糖漿或酏劑。可根據製造醫藥組合物之技術中已知的任何方法製備意欲用於經口使用的組合物，且該等組合物可含有一或多種劑，包括甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以便提供可口製劑。含有與適用於製造錠劑之醫藥學上可接受無毒賦形劑混合的活性成分之錠劑為可接受的。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，諸如玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包覆或可利用已知技術(包括微囊封裝)包覆以延緩在胃腸道中之崩解及吸附，且因此提供較長時段的持久作用。舉例而言，可單獨或與蠟一起使用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之延時材料。
用於經口使用之調配物亦可呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(諸如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
水性懸浮液含有與適用於製造水性懸浮液之賦形劑摻合的活性材料。此類賦形劑包括懸浮劑，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；及分散劑或潤濕劑，諸如天然存在之磷脂(例如卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物(例如十七伸乙氧基鯨蠟醇)、環氧乙烷與衍生自脂肪酸之偏酯及己糖醇酐之縮合產物(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，諸如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種調味劑及一或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。
油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於植物油(諸如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油(諸如液體石蠟)中來調配。口服懸浮液可含有增稠劑，諸如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟基醇。可添加甜味劑(諸如上述甜味劑)及調味劑，以提供適口之口服製劑。此等組合物可藉由添加抗氧化劑(諸如抗壞血酸)來保存。
適合於藉由添加水來製備水性懸浮液的可分散粉末及粒子提供活性成分與分散劑或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之混合物。合適之分散劑或潤濕劑及懸浮劑由上文所揭示之彼等試劑例示。亦可存在額外賦形劑，例如甜味劑、調味劑及著色劑。
醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油，諸如橄欖油或花生油，礦物油，諸如液體石蠟，或此等物質之混合物。適合的乳化劑包括天然存在之膠，諸如阿拉伯膠及膠狀黃蓍；天然存在之磷脂，諸如大豆卵磷脂；來源於脂肪酸及己糖醇酐之酯或偏酯，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯；及此等偏酯與環氧乙烷之縮合產物，諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及調味劑。糖漿及酏劑可與甜味劑(諸如丙三醇、山梨糖醇或蔗糖)一起調配。此類調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑或著色劑。
醫藥組合物可呈無菌可注射或靜脈內製劑形式，諸如呈無菌可注射水性或油性懸浮液形式。此懸浮液可根據已知技術使用上文已提及之彼等適合分散劑或潤濕劑及懸浮劑來調配。無菌可注射或靜脈內製劑亦可為於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液；或製備成凍乾粉末。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用的有水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等滲氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發性油可常用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成性單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸同樣可用於製備可注射劑。
可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成分的量將視所治療之主體及特定投藥模式而變化。舉例而言，意欲用於向人類經口投與之延時釋放調配物可含有大約1至1000 mg具有適當且適宜量之載劑材料的活性材料化合物，該量可在總組合物之約5%至約95% (重量:重量)範圍內變化。醫藥組合物可製備成提供容易量測之量以供投與。舉例而言，意欲用於靜脈內輸注之水溶液每毫升溶液可含有約3至500 μg活性成分，以便可以約30 mL/hr之速率進行適合體積之輸注。
適用於局部投與至眼睛之調配物亦包括滴眼劑，其中活性成分溶解或懸浮於適合載劑中，尤其用於活性成分之水性溶劑中。活性成分較佳以0.5至20%，有利地0.5至10%且尤其約1.5% w/w之濃度存在於此類調配物中。
適用於在口腔中局部投與之調配物包括在調味基劑(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍)中包含活性成分之口含錠；在惰性基劑(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)中包含活性成分之片劑；以及在適合液體載劑中包含活性成分之漱口水。
用於直腸投與之調配物可以具有適合的基劑(包含例如可可脂或水楊酸酯)之栓劑形式呈現。
適用於肺內或經鼻投與之調配物具有例如在0.1至500微米範圍內之粒度，諸如0.5、1、30、35等，其藉由經鼻孔吸入或藉由經口腔吸入來投與。適合的調配物包括活性成分之水性或油性溶液。適用於以氣霧劑或乾燥粉末形式投與之調配物可根據習知方法製備且可與其他治療劑一起遞送，該等治療劑諸如迄今為止用於治療或預防如下文所描述之肺病毒科感染的化合物。
另一實施例提供一種新穎、有效、安全、無刺激性及生理上相容的包含
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽的可吸入組合物，其適用於治療肺病毒科感染及潛在相關的細支氣管炎。非限制例示性醫藥學上可接受之鹽為無機酸鹽，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，因為其可引起較少肺部刺激。在一些實施例中，可吸入調配物係以包含質量中數氣動粒徑(MMAD)在約1與約5 µm之間的粒子的氣霧劑遞送至支氣管內空間。在一些實施例中，
式 I化合物經調配以供使用噴霧器、加壓定劑量吸入器(pMDI)或乾粉吸入器(DPI)進行氣霧劑遞送。
噴霧器之非限制性實例包括霧化、噴射、超音波、加壓、振動多孔板或等效噴霧器，包括利用適應性氣霧劑遞送技術之彼等噴霧器(Denyer,
J. Aerosol medicine Pulmonary Drug Delivery2010,
23增刊1, S1-S10)。噴射式噴霧器利用空氣壓力將溶液破碎成氣霧劑液滴。超音噴霧器藉由壓電晶體將液體剪切成小氣霧劑液滴來起作用。加壓噴霧系統在壓力下迫使溶液穿過小孔以產生氣霧劑液滴。振動式多孔板裝置利用快速振動將液體流剪切成適當液滴大小。
在一些實施例中，用於噴霧之調配物係以包含MMAD主要介於約1 µm與約5 µm之間的粒子的氣霧劑之形式，使用能夠使
式 I化合物之調配物霧化為所需MMAD之粒子的噴霧器遞送至支氣管內空間。為達到最佳治療效果且避免上呼吸道及全身副作用，大多數霧化粒子之MMAD不應大於約5 µm。若氣霧劑含有大量MMAD大於5 µm之粒子，則該等粒子沈積於上呼吸道中，由此減少遞送至炎症部位之藥物的量及下呼吸道中之支氣管收縮。若氣霧劑之MMAD小於約1 µm，則該等粒子傾向於保持懸浮於吸入之空氣中且隨後在呼氣期間呼出。
當根據本文中之方法調配及遞送時，用於噴霧之氣霧劑調配物將足以治療肺病毒科感染的治療有效劑量之
式 I化合物遞送至肺病毒科感染部位。必須調節所投與之藥物之量以反映治療有效劑量之
式 I化合物之遞送效率。在一些實施例中，視噴霧器而定，水性氣霧劑調配物與霧化、噴射、加壓、振動多孔板或超音波噴霧器之組合准許約至少20%至約90%，例如約70%所投與劑量之
式 I化合物遞送至呼吸道中。在一些實施例中，遞送至少約30%至約50%之活性化合物。在一些實施例中，遞送約70%至約90%之活性化合物。
在另一實施例中，
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽以乾燥可吸入粉末形式遞送。該等化合物係使用乾燥粉末或定劑量吸入器以乾燥粉末調配物形式經支氣管內投與以將化合物之細粒有效遞送至支氣管內空間。對於藉由DPI遞送，藉由研磨噴霧乾燥、臨界流體處理或自溶液沈澱將
式 I化合物處理為MMAD主要介於約1 µm與約5 µm之間的粒子。能夠製造MMAD在約1 µm與約5 µm之間的粒度的介質研磨、噴射研磨及噴霧乾燥裝置及程序係此項技術中熟知的。在一個實施例中，賦形劑在加工成所需大小之粒子之前添加至
式 I化合物中。在另一實施例中，將賦形劑與所需大小之粒子共混合以幫助藥物粒子之分散，例如藉由使用乳糖作為賦形劑。
粒度測定係使用此項技術中熟知之裝置進行。舉例而言，多級Anderson級聯衝擊器或其他適合方法，諸如美國藥典第601章內特別引用的方法，作為表徵定劑量及乾燥粉末吸入器內之氣霧劑的裝置。
在一些實施例中，
式 I化合物係使用諸如乾燥粉末吸入器之裝置或其他乾燥粉末分散裝置以乾燥粉末形式遞送。乾燥粉末吸入器及裝置之非限制性實例包括揭示於以下文獻中之彼等者：US5,458,135；US5,740,794；US5775320；US5,785,049；US3,906,950；US4,013,075；US4,069,819；US4,995,385；US5,522,385；US4,668,218；US4,667,668；US4,805,811；及US5,388,572。乾燥粉末吸入器有兩種主要設計。一種設計係計量裝置，其中藥物之儲集器置放於該裝置內且患者將一定劑量藥物添加至吸入腔室中。第二種設計係工廠計量裝置，其中各個別劑量係在獨立容器中製造。兩種系統均取決於將藥物調配成MMAD為約1 µm至約5 µm之小粒子且通常涉及與較大賦形劑粒子(諸如但不限於乳糖)共調配。將藥物粉末置放於吸入腔室(藉由裝置計量或藉由工廠計量劑量耗損)中且患者之吸氣流體加快粉末離開裝置且進入口腔。粉末路徑之非層流特徵使賦形劑-藥物聚集物分散，且大賦形劑粒子之質量造成其衝擊喉底，而較小藥物粒子於肺中深部沈積。在一些實施例中，
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係以乾燥粉末形式使用如本文所描述之任一類型的乾燥粉末吸入器遞送，其中不包括任何賦形劑之乾燥粉末之MMAD主要在1 µm至約5 µm範圍內。
在另一實施例中，
式 I化合物係以乾燥粉末形式使用定劑量吸入器遞送。定劑量吸入器及裝置之非限制性實例包括以下文獻中所揭示之彼等者：US5,261,538；US5,544,647；US5,622,163；US4,955,371；US3,565,070；US3,361306；及US6,116,234。在一些實施例中，
式 I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係以乾燥粉末形式使用定劑量吸入器遞送，其中不包括任何賦形劑之乾燥粉末之MMAD主要在約1至5 µm範圍內。
適用於經陰道投與之調配物可呈現為子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊狀物、發泡體或噴霧調配物形式，該等調配物除了含有活性成分以外，亦含有諸如此項技術中已知為合適之載劑。
適於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。
調配物可於單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿及小瓶)中呈現，且可在冷凍乾燥(凍乾)條件下儲存，其僅需要在臨使用前添加無菌液體載劑(例如注射用水)。自先前所描述種類之無菌粉末、粒子及錠劑製備即用型注射溶液及懸浮液。例示性單位劑量調配物為含有如上文中所述之日劑量或單位每日子劑量或其適當部分之活性成分的彼等調配物。
應理解，除上文特定提及之成分之外，該等調配物亦可包括關於所討論調配物之類型的此項技術中習知的其他藥劑，例如適用於經口投與之調配物可包括調味劑。
進一步提供包含至少一種如上文所定義之活性成分以及其相關獸醫用載劑之獸醫用組合物。
獸醫用載劑為適用於投與組合物之目的的物質且可為固體、液體或氣體物質，其另外為惰性的或在獸醫領域中可接受且與活性成分相容。此等獸醫用組合物可經口、非經腸或藉由任何其他所需途徑投與。
在一些實施例中，調配
式 I化合物以提供控制釋放醫藥調配物(「控制釋放調配物」)，其中控制及調節
式 I化合物之釋放以實現不太頻繁地給藥或改良既定活性成分之藥物動力學或毒性概況。
活性成分之有效劑量至少取決於所治療之病狀之性質、毒性、預防性(較低劑量)或針對活性病毒感染使用化合物、遞送方法及醫藥調配物，且將由臨床醫師使用習知劑量遞增研究決定。其可預期為每天約0.0001至約100毫克/公斤體重；例如每天約0.01至約10毫克/公斤體重。在一些實施例中，有效劑量為每天約0.01至約5毫克/公斤體重；例如每天約0.05至約0.5毫克/公斤體重。舉例而言，用於約70 kg體重之成人之日候選劑量將在1 mg至1000 mg範圍內，例如在5 mg與500 mg之間，且可呈單劑量或多劑量形式。
V. 投藥途徑
式 I化合物(在本文中又稱為活性成分)可藉由任何適當的途徑投與。適合途徑包括經口、經直腸、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、經皮、經陰道及非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、鞘內及硬膜外)及其類似途徑。應瞭解，較佳途徑可隨例如接受者之病況而變化。
本發明化合物可根據有效的給藥方案向個體投與所需時間段或持續時間，諸如至少約一週、至少約兩週、至少約三週、一個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約6個月或至少約12個月或更長時間。在一個變化形式中，化合物按每日或間歇性時程投與所需持續時間，至多個體之終身。
本發明化合物之劑量或給藥頻率可在治療療程內基於投藥醫師之判斷來調節。
可向個體(例如，人類)投與有效量之化合物。在一些實施例中，化合物每日投與一次。
化合物可藉由任何適用途徑及方式，諸如藉由經口或非經腸(例如靜脈內)投與來投與。化合物之治療有效量可包括每日每公斤體重約0.00001 mg至每日每公斤體重約10 mg，諸如每日每公斤體重約0.0001 mg至每日每公斤體重約10 mg，或諸如每日每公斤體重約0.001 mg至每日每公斤體重約1 mg，或諸如每日每公斤體重約0.01 mg至每日每公斤體重約1 mg，或諸如每日每公斤體重約0.05 mg至每日每公斤體重約0.5 mg，或諸如每日約0.3 mg至約30 mg，或諸如每日約30 mg至約300 mg。
本發明化合物可以任何劑量之本發明化合物(例如，1 mg至1000 mg化合物)與一或多種額外治療劑組合。治療有效量可包括每劑量約1 mg至每劑量約1000 mg，諸如每劑量約50 mg至每劑量約500 mg，或諸如每劑量約100 mg至每劑量約400 mg，或諸如每劑量約150 mg至每劑量約350 mg，或諸如每劑量約200 mg至每劑量約300 mg。本發明化合物之其他治療有效量係每劑量約100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或約500 mg。本發明化合物之其他治療有效量為每劑量約100 mg，或每劑量約125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450或約500 mg。單次劑量可每小時、每日或每週投與。舉例而言，單次劑量可每隔1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時投與一次或每隔24小時投與一次。單次劑量亦可每隔1天、2天、3天、4天、5天、6天投與一次或每隔7天投與一次。單次劑量亦可每隔1週、2週、3週投與一次或每隔4週投與一次。在一些實施例中，單次劑量可每週投與一次。單次劑量亦可每月投與一次。
本發明化合物之其他治療有效量係每劑量約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或約100 mg。
本發明化合物之給藥頻率由個別患者之需求確定，且可為例如每日一次或每日兩次或更多次。化合物之投與持續治療病毒感染所必需的時長。舉例而言，可向感染病毒之人類投與化合物持續20天至180天之時間段，或例如20天至90天之時間段，或例如30天至60天之時間段。
投與可為間歇性的，其中在數天或更多天之時段期間患者接受日劑量之本發明化合物，接著在數天或更多天之時段期間患者不接受日劑量之化合物。舉例而言，患者可每隔一天或每週三次接受一劑量之化合物。再次藉助於實例，患者可每天接受一劑量之化合物持續1至14天之時段，隨後在7至21天之時段期間患者不接受一劑量之化合物，隨後在後續時段(例如，1至14天)期間患者再次接受日劑量之化合物。可視治療患者之臨床需要來重複交替時段之化合物投與，繼而化合物不投與。
在一個實施例中，提供醫藥組合物，其包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種(例如，一種、兩種、三種、四種、一或兩種、一至三種或一至四種)額外治療劑的組合，及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個實施例中，提供套組，其包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種(例如一種、兩種、三種、四種、一或兩種、一至三種或一至四種)額外治療劑的組合。
在一些實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一種、兩種、三種、四種或更多種額外治療劑組合。在一些實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與兩種額外治療劑組合。在其他實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與三種額外治療劑組合。在其他實施例中，本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與四種額外治療劑組合。一種、兩種、三種、四種或更多種額外治療劑可為選自相同類別之治療劑的不同治療劑及/或其可選自不同類別之治療劑。
在一些實施例中，當本發明之化合物與如本文所述之一或多種額外治療劑組合時，組合物之組分按同時或依序方案投與。當依序投與時，該組合可以兩次或更多次投與形式投與。
在一些實施例中，本發明之化合物與一或多種額外治療劑以單一劑型組合以用於同時向患者投與，例如呈用於經口投與之固體劑型。
在一些實施例中，本發明之化合物與一或多種額外治療劑共同投與。
為延長本發明化合物之作用，通常需要減慢化合物自皮下或肌肉內注射吸收。此可藉由使用具有不良水溶性之結晶或非晶形材料之液體懸浮液來達成。則化合物之吸收率視其溶解率而定，溶解率又可視晶體尺寸及結晶形態而定。或者，藉由將化合物溶解或懸浮於油媒劑中來實現非經腸投與之化合物之延遲吸收。藉由在諸如聚丙交酯-聚乙交酯之生物可降解聚合物中形成化合物之微膠囊基劑來製造可注射積存形式。視化合物與聚合物之比率及所使用之特定聚合物的性質而定，可控制化合物釋放速率。其他可生物降解之聚合物的實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。亦藉由將化合物包覆於與身體組織相容之脂質體或微乳液中來製備儲槽式可注射調配物。
VI. 組合療法
本文所提供之式I化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合用於治療病毒感染，諸如肺病毒科、小核糖核酸病毒科、黃病毒科或絲狀病毒科病毒感染。
用於治療肺病毒科之組合療法
本文所提供之化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合使用。對於治療肺病毒科病毒感染，其他活性治療劑較佳具有抗肺病毒科病毒感染，尤其呼吸道融合性病毒感染及/或間質肺炎病毒感染之活性。具有抗RSV活性的此等其他活性治療劑之非限制性實例為利巴韋林、帕利珠單抗、莫維珠單抗(motavizumab)、RSV-IGIV (RespiGam
®)、MEDI-557、A-60444 (亦稱作RSV604)、MDT-637、BMS-433771、ALN-RSV0、ALX-0171及其混合物。具有抗呼吸道融合性病毒感染活性的其他活性治療劑之其他非限制性實例包括呼吸道融合性病毒蛋白F抑制劑，諸如AK-0529、RV-521、ALX-0171、JNJ-53718678、BTA-585及普沙托韋(presatovir)；RNA聚合酶抑制劑，諸如盧米西他濱(lumicitabine)及ALS-8112；抗RSV G蛋白抗體，諸如抗G蛋白mAb；病毒複製抑制劑，諸如硝唑沙奈(nitazoxanide)。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為用於治療或預防RSV之疫苗，包括(但不限於) MVA-BN RSV、RSV-F、MEDI-8897、JNJ-64400141、DPX-RSV、SynGEM、GSK-3389245A、GSK-300389-1A、RSV-MEDI δM2-2疫苗、VRC-RSVRGP084-00VP、Ad35-RSV-FA2、Ad26-RSV-FA2及RSV融合醣蛋白次單元疫苗。
具有抗間質肺炎病毒感染活性的其他活性治療劑之非限制性實例包括唾液酸酶調節劑，諸如DAS-181；RNA聚合酶抑制劑，諸如ALS-8112；及用於治療間質肺炎病毒感染之抗體，諸如EV-046113。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為用於治療或預防間質肺炎病毒感染之疫苗，包括(但不限於) mRNA-1653及rHMPV-Pa疫苗。
用於治療小核糖核酸病毒科之組合療法
本文所提供之化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合使用。對於治療小核糖核酸病毒科病毒感染，其他活性治療劑較佳具有抗小核糖核酸病毒科病毒感染，尤其腸病毒(Enterovirus)感染之活性。此等其他活性治療劑之非限制性實例為衣殼結合抑制劑，諸如普來可那立(pleconaril)、BTA-798 (伐彭達韋(vapendavir))以及Wu等人(US 7,078,403)及Watson (US 7,166,604)所揭示之其他化合物；融合唾液酸酶蛋白，諸如DAS-181；衣殼蛋白VP1抑制劑，諸如VVX-003及AZN-001；病毒蛋白酶抑制劑，諸如CW-33；磷脂酸肌醇4激酶β抑制劑，諸如GSK-480及GSK-533；抗EV71抗體。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為用於治療或預防小核糖核酸病毒科病毒感染之疫苗，包括(但不限於) EV71疫苗、TAK-021及基於EV-D68腺病毒載體之疫苗。
用於呼吸道感染之組合療法
許多肺病毒科及小核糖核酸病毒科病毒感染為呼吸道感染。因此，用於治療呼吸道症狀及感染後遺症之額外活性治療劑可與本文所提供之
式 I化合物組合使用。該等額外藥劑較佳經口投與或藉由直接吸入投與。舉例而言，與
式 I化合物組合用於治療病毒性呼吸道感染的額外治療劑包括(但不限於)支氣管擴張劑及皮質類固醇。
糖皮質素
在1950年作為哮喘療法首次引入(Carryer, Journal of Allergy, 21, 282-287, 1950)的糖皮質素對於此疾病而言一直為最強效且始終有效的療法，但其作用機制尚不完全清楚(Morris, J. Allergy Clin. Immunol., 75 (1 Pt) 1-13, 1985)。令人遺憾地，口服糖皮質素療法會引起深遠的非所需副作用，諸如軀幹性肥胖、高血壓、青光眼、葡萄糖不耐、白內障形成加速、骨礦物質流失及心理影響，其皆限制口服糖皮質素療法用作長期治療劑(Goodman及Gilman, 第10版, 2001)。針對全身性副作用之解決方案係將類固醇藥物直接遞送至炎症部位。已研發出吸入型皮質類固醇(Inhaled corticosteroids；ICS)來減輕口服類固醇之嚴重不良作用。可與
式 I化合物組合使用的皮質類固醇之非限制性實例為地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸鈉、氟米龍(fluorometholone)、乙酸氟米龍、氯替潑諾(loteprednol)、依碳氯替潑諾(loteprednol etabonate)、氫化可的松(hydrocortisone)、潑尼松龍(prednisolone)、氟氫可的松(fludrocortisone)、曲安西龍(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、倍他米松(betamethasone)、丙酸倍氯米松(beclomethasone diproprionate)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、氟輕松(fluocinolone)、乙酸氟輕松(fluocinolone acetonide)、氟尼縮松(flunisolide)、氟可丁-21-丁酯(fluocortin-21-butylate)、氟米松(flumethasone)、特戊酸氟米松(flumetasone pivalate)、布地奈德(budesonide)、丙酸鹵倍他松(halobetasol propionate)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、氟替卡松(fluticasone)、AZD-7594、環索奈德(ciclesonide)；或其醫藥學上可接受之鹽。
抗發炎劑
經由抗發炎級聯機制起作用的其他抗發炎劑亦適用作與
式 I化合物組合用於治療病毒性呼吸道感染的額外治療劑。應用「抗發炎信號轉導調節劑」(在本文中稱為AISTM)，如磷酸二酯酶抑制劑(例如，PDE-4、PDE-5或PDE-7特異性抑制劑)、轉錄因子抑制劑(例如，經由IKK抑制阻斷NFκB)或激酶抑制劑(例如，阻斷P38 MAP、JNK、PI3K、EGFR或Syk)，係一種切斷炎症的邏輯方法，因為此等小分子靶向有限數目個共同細胞內路徑(作為抗發炎治療性干預之關鍵點的彼等信號轉導路徑) (綜述參見P.J. Barnes, 2006)。此等非限制性額外治療劑包括：5-(2,4-二氟-苯氧基)-1-異丁基-1H-吲唑-6-甲酸(2-二甲基胺基-乙基)-醯胺(P38 Map激酶抑制劑ARRY-797)；3-環丙基甲氧基-N-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-4-二氟甲氧基-苯甲醯胺(PDE-4抑制劑羅氟司特(Roflumilast))；4-[2-(3-環戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-苯基-乙基]-吡啶(PDE-4抑制劑CDP-840)；N-(3,5-二氯-4-吡啶基)-4-(二氟甲氧基)-8-[(甲基磺醯基)胺基]-1-二苯并呋喃甲醯胺(PDE-4抑制劑奧利司特(Oglemilast))；N-(3,5-二氯-吡啶-4-基)-2-[1-(4-氟苯甲基)-5-羥基-1H-吲哚-3-基]-2-側氧基-乙醯胺(PDE-4抑制劑AWD 12-281)；8-甲氧基-2-三氟甲基-喹啉-5-甲酸(3,5-二氯-1-氧基-吡啶-4-基)-醯胺(PDE-4抑制劑Sch 351591)；4-[5-(4-氟苯基)-2-(4-甲亞磺醯基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-吡啶(P38抑制劑SB-203850)；4-[4-(4-氟-苯基)-1-(3-苯基-丙基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基]-丁-3-炔-1-醇(P38抑制劑RWJ-67657)；4-氰基-4-(3-環戊氧基-4-甲氧基-苯基)-環己烷甲酸2-二乙基胺基-乙酯(西洛司特(Cilomilast)之2-二乙基-乙酯前藥，PDE-4抑制劑)；(3-氯-4-氟苯基)-[7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺(吉非替尼(Gefitinib)，EGFR抑制劑)；及4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基胺基)-苯基]-苯甲醯胺(伊馬替尼(Imatinib)，EGFR抑制劑)。
β2- 腎上腺素受體促效劑支氣管擴張劑
包含吸入型β2-腎上腺素受體促效劑支氣管擴張劑(諸如福莫特羅(formoterol)、沙丁胺醇(albuterol)或沙美特羅(salmeterol))與
式 I化合物之組合亦為適用於治療呼吸道病毒感染之適合(但非限制性)組合。
吸入型β2-腎上腺素受體促效劑支氣管擴張劑(諸如福莫特羅或沙美特羅)與ICS之組合亦用於治療支氣管收縮及發炎(分別為Symbicort®及Advair®)。包含此等ICS及β2-腎上腺素受體促效劑組合以及
式 I化合物之組合亦為適用於治療呼吸道病毒感染之適合(但非限制性)組合。
β 2腎上腺素受體促效劑之其他實例為貝多拉君(bedoradrine)、維蘭特羅(vilanterol)、茚達特羅(indacaterol)、奧達特羅(olodaterol)、妥洛特羅(tulobuterol)、福莫特羅、阿貝特羅(abediterol)、沙丁胺醇、阿福特羅(arformoterol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、非諾特羅(fenoterol)及TD-5471。
抗膽鹼劑
對於治療或預防肺部支氣管收縮，抗膽鹼劑具有潛在效用，且因此適用作與
式 I化合物組合用於治療病毒性呼吸道感染之額外治療劑。此等抗膽鹼劑包括(但不限於)蕈毒鹼受體(尤其M3亞型)之拮抗劑，其在人類中展現出控制COPD之膽鹼能基調(cholinergic tone)的治療功效(Witek, 1999)；1-{4-羥基-1-[3,3,3-參-(4-氟-苯基)-丙醯基]-吡咯啶-2-羰基}-吡咯啶-2-甲酸(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-醯胺；3-[3-(2-二乙基胺基-乙醯氧基)-2-苯基-丙醯氧基]-8-異丙基-8-甲基-8-氮鎓-雙環[3.2.1]辛烷(異丙托銨-N,N-二乙基甘胺酸酯(Ipratropium-N,N-diethylglycinate))；1-環己基-3,4-二氫-1H-異喹啉-2-甲酸1-氮雜-雙環[2.2.2]辛-3-基酯(索利那新(Solifenacin))；2-羥甲基-4-甲亞磺醯基-2-苯基-丁酸1-氮雜-雙環[2.2.2]辛-3-基酯(瑞伐托酯(Revatropate))；2-{1-[2-(2,3-二氫-苯并呋喃-5-基)-乙基]-吡咯啶-3-基}-2,2-二苯基-乙醯胺(達非那新(Darifenacin))；4-氮雜環庚烷-1-基-2,2-二苯基-丁醯胺(甲碘布卓(Buzepide))；7-[3-(2-二乙基胺基-乙醯氧基)-2-苯基-丙醯氧基]-9-乙基-9-甲基-3-氧雜-9-氮鎓-三環[3.3.1.02,4]壬烷(氧托銨-N,N-二乙基甘胺酸酯(Oxitropium-N,N-diethylglycinate))；7-[2-(2-二乙基胺基-乙醯氧基)-2,2-二-噻吩-2-基-乙醯氧基]-9,9-二甲基-3-氧雜-9-氮鎓-三環[3.3.1.02,4]壬烷(噻托銨-N,N-二乙基甘胺酸酯(Tiotropium-N,N-dimethylglycinate))；二甲基胺基-乙酸2-(3-二異丙基胺基-1-苯基-丙基)-4-甲基-苯酯(托特羅定-N,N-二甲基甘胺酸酯(Tolterodine-N,N-dimethylglycinate))；3-[4,4-雙-(4-氟-苯基)-2-側氧基-咪唑啶-1-基]-1-甲基-1-(2-側氧基-2-吡啶-2-基-乙基)-吡咯啶鎓；1-[1-(3-氟-苯甲基)-哌啶-4-基]-4,4-雙-(4-氟-苯基)-咪唑啶-2-酮；1-環辛基-3-(3-甲氧基-1-氮雜-雙環[2.2.2]辛-3-基)-1-苯基-丙-2-炔-1-醇；3-[2-(2-二乙基胺基-乙醯氧基)-2,2-二-噻吩-2-基-乙醯氧基]-1-(3-苯氧基-丙基)-1-氮鎓-雙環[2.2.2]辛烷(阿地溴銨-N,N-二乙基甘胺酸酯(Aclidinium-N,N-diethylglycinate))；或(2-二乙基胺基-乙醯氧基)-二-噻吩-2-基-乙酸1-甲基-1-(2-苯氧基-乙基)-哌啶-4-基酯；瑞芬那新(revefenacin)、格隆溴銨(glycopyrronium bromide)、蕪地溴銨(umeclidinium bromide)、噻托溴銨(tiotropium bromide)、阿地溴銨(aclidinium bromide)、苯環喹溴銨(bencycloquidium bromide)。
黏液溶解劑
式 I化合物及本文所提供之組合物亦可與黏液溶解劑組合以治療呼吸道感染之感染及症狀兩者。黏液溶解劑之非限制性實例為胺溴素(ambroxol)。類似地，
式 I化合物可與祛痰劑組合以治療呼吸道感染之感染及症狀兩者。除痰劑之非限制性實例為愈創甘油醚(guaifenesin)。
霧化的高滲鹽水用於改善患有肺病之患者體內小氣道之即時及長期清理(Kuzik,
J. Pediatrics2007, 266)。因此，尤其當肺病毒科病毒感染併發有細支氣管炎時，
式 I化合物亦可與霧化的高滲鹽水組合。
式 I化合物與高滲鹽水之組合亦可包含上文所論述之額外藥劑中之任一者。在一個實施例中，使用霧化的約3%高滲鹽水。
用於治療 COPD 之組合療法
本文所提供之化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合使用。對於治療COPD之呼吸道惡化，其他活性治療劑包括具有抗COPD活性的其他活性治療劑。此等其他活性治療劑之非限制性實例包括抗IL5抗體，諸如苯拉組單抗(benralizumab)、美泊珠單抗(mepolizumab)；二肽基肽酶I (DPP1)抑制劑，諸如AZD-7986 (INS-1007)；DNA回旋酶抑制劑/拓樸異構酶IV抑制劑，諸如鹽酸環丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride)；MDR相關蛋白4/磷酸二酯酶(PDE) 3及4抑制劑，諸如RPL-554；CFTR刺激劑，諸如艾伐卡托(ivacaftor)、QBW-251；MMP-9/MMP-12抑制劑，諸如RBx-10017609；腺苷A1受體拮抗劑，諸如PBF-680；GATA 3轉錄因子抑制劑，諸如SB-010；蕈毒鹼受體調節劑/菸鹼性乙醯膽鹼受體促效劑，諸如ASM-024；MARCKS蛋白抑制劑，諸如BIO-11006；kit酪胺酸激酶/PDGF抑制劑，諸如馬賽替尼(masitinib)；磷酸二酯酶(PDE) 4抑制劑，諸如羅氟司特(roflumilast)、CHF-6001；磷酸肌醇-3激酶δ抑制劑，諸如奈米利塞(nemiralisib)；5-脂肪加氧酶抑制劑，諸如TA-270；蕈毒鹼受體拮抗劑/β 2腎上腺素受體促效劑，諸如琥珀酸巴芬特羅(batefenterol succinate)、AZD-887、異丙托溴銨(ipratropium bromide)；TRN-157；彈性蛋白酶抑制劑，諸如厄多司坦(erdosteine)；金屬蛋白酶-12抑制劑，諸如FP-025；介白素18配體抑制劑，諸如他德介白素α (tadekinig alfa)；骨骼肌肌鈣蛋白活化劑，諸如CK-2127107；p38 MAP激酶抑制劑，諸如阿庫馬莫德(acumapimod)；IL-17受體調節劑，諸如CNTO-6785；CXCR2趨化激素拮抗劑，諸如達尼立辛(danirixin)；白血球彈性蛋白酶抑制劑，諸如POL-6014；環氧化物水解酶抑制劑，諸如GSK-2256294；HNE抑制劑，諸如CHF-6333；VIP促效劑，諸如阿肽地爾(aviptadil)；磷酸肌醇-3激酶δ/γ抑制劑，諸如RV-1729；補體C3抑制劑，諸如APL-1；及G蛋白偶聯受體-44拮抗劑，諸如AM-211。
活性治療劑之其他非限制性實例亦包括布地奈德、阿地普塞(adipocell)、一氧化氮、PUR-1800、YLP-001、LT-4001、阿奇黴素(azithromycin)、伽木奈克(gamunex)、QBKPN、丙酮酸鈉、MUL-1867、甘露糖醇、MV-130、MEDI-3506、BI-443651、VR-096、OPK-0018、TEV-48107、多索茶鹼(doxofylline)、TEV-46017、OligoG-COPD-5/20、Stempeucel®、ZP-051、離胺酸乙醯水楊酸。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為具有抗COPD活性的疫苗，包括(但不限於) MV-130及GSK-2838497A。
用於治療登革熱之組合療法
本文所提供之化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合使用。對於治療黃病毒科病毒感染，其他活性治療劑較佳具有抗黃病毒科病毒感染，尤其登革熱感染之活性。此等其他活性治療劑之非限制性實例為宿主細胞因子調節劑，諸如GBV-006；芬維A胺(fenretinide) ABX-220、BRM-211；α-葡萄糖苷酶1抑制劑，諸如西戈斯韋(celgosivir)；血小板活化因子受體(PAFR)拮抗劑，諸如莫地帕泛(modipafant)；鈣黏蛋白-5/因子Ia調節劑，諸如FX-06；NS4B抑制劑，諸如JNJ-8359；病毒RNA剪接調節劑，諸如ABX-202；NS5聚合酶抑制劑；NS3蛋白酶抑制劑；及TLR調節劑。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為用於治療或預防登革熱之疫苗，包括(但不限於) TetraVax-DV、Dengvaxia ®、DPIV-001、TAK-003、減毒活登革熱疫苗、四價登革熱疫苗、四價DNA疫苗、rDEN2δ30-7169及DENV-1 PIV。
用於治療伊波拉之組合療法
本文所提供之化合物及組合物亦與其他活性治療劑組合使用。對於治療絲狀病毒科病毒感染，其他活性治療劑較佳具有抗絲狀病毒科病毒感染，尤其馬堡病毒(Marburg virus)、伊波拉病毒及奎瓦病毒(Cueva virus)感染之活性。此等其他活性治療劑之非限制性實例為：利巴韋林、帕利珠單抗、莫維珠單抗、RSV-IGIV (RespiGam
®)、MEDI-557、A-60444、MDT-637、BMS-433771、胺碘酮(amiodarone)、屈奈達隆(dronedarone)、維拉帕米(verapamil)、伊波拉康復者血漿(Ebola Convalescent Plasma；ECP)、TKM-100201、BCX4430 ((2S,3S,4R,5R)-2-(4-胺基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)-5-(羥甲基)吡咯啶-3,4-二醇)、TKM-Ebola、T-705單磷酸酯、T-705二磷酸酯、T-705三磷酸酯、FGI-106 (1-N,7-N-雙[3-(二甲基胺基)丙基]-3,9-二甲基喹啉并[8,7-h]喹啉酮-1,7-二胺)、rNAPc2、OS-2966、布林西多福韋(brincidofovir)、瑞德西韋(remdesivir)；RNA聚合酶抑制劑，諸如加利司韋(galidesivir)、法維拉韋(favipiravir) (亦被稱作T-705或Avigan)、JK-05；宿主細胞因子調節劑，諸如GMV-006；鈣黏蛋白-5/因子Ia調節劑，諸如FX-06；及用於治療伊波拉之抗體，諸如REGN-3470-3471-3479及ZMapp。
具有抗伊波拉活性的其他非限制性活性治療劑包括α-葡萄糖苷酶1抑制劑、組織蛋白酶B抑制劑、CD29拮抗劑、樹突狀ICAM-3撰取非整合素1抑制劑、雌激素受體拮抗劑、因子VII拮抗劑HLA II類抗原調節劑、宿主細胞因子調節劑、干擾素α配體、中性α葡萄糖苷酶AB抑制劑、尼曼-匹克C1蛋白(niemann-Pick C1 protein)抑制劑、核蛋白抑制劑、聚合酶輔因子VP35抑制劑、絲胺酸蛋白酶抑制劑、組織因子抑制劑、TLR-3促效劑、病毒套膜醣蛋白抑制劑及伊波拉病毒進入抑制劑(NPC1抑制劑)。
在一些實施例中，其他活性治療劑可為用於治療或預防伊波拉之疫苗，包括(但不限於) VRC-EBOADC076-00-VP、基於腺病毒之伊波拉疫苗、rVSV-EBOV、rVSVN4CT1-EBOVGP、MVA-BN Filo + Ad26-ZEBOV方案、INO-4212、VRC-EBODNA023-00-VP、VRC-EBOADC069-00-VP、GamEvac-combi疫苗、SRC VB載體、HPIV3/EboGP疫苗、MVA-EBOZ、伊波拉重組醣蛋白疫苗、基於Vaxart腺病毒載體5之伊波拉疫苗、FiloVax疫苗、GOVX-E301及GOVX-E302。
本文所提供之化合物及組合物亦可與胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物(PMO)組合使用，該等胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物係經設計以藉由與特定RNA序列形成鹼基對雙螺旋體而干擾轉譯過程的合成反義寡核苷酸類似物。PMO之實例包括(但不限於) AVI-7287、AVI-7288、AVI-7537、AVI-7539、AVI-6002及AVI-6003。
本文所提供之化合物及組合物亦意欲與向患有絲狀病毒科病毒感染之患者提供之一般護理一起使用，包括非經腸流體(包括右旋糖鹽水及林格氏乳酸鹽)及營養物、抗生素(包括甲硝噠唑(metronidazole)及頭孢菌素抗生素，諸如頭孢曲松(ceftriaxone)及頭孢呋辛(cefuroxime))及/或抗真菌預防物、發熱及止痛藥、抗嘔劑(諸如甲氧氯普胺(metoclopramide))及/或止瀉劑、維生素及礦物質補充劑(包括維生素K及硫酸鋅)、抗發炎劑(諸如布洛芬(ibuprofen))、疼痛藥物及用於患者群體中之其他常見疾病的藥物，諸如抗瘧疾劑(包括蒿甲醚及青蒿琥酯-苯芴醇組合療法)、傷寒(包括喹啉酮抗生素(諸如環丙沙星)、巨環內酯抗生素(諸如阿奇黴素)、頭孢菌素抗生素(諸如頭孢曲松)或胺基青黴素(諸如胺苄西林(ampicillin)))或志賀桿菌病(shigellosis)。
VII. 治療病毒感染之方法
本發明提供使用
式 I化合物治療各種疾病之方法，該等疾病諸如呼吸道融合性病毒(RSV)、HRV、hMPV、伊波拉、茲卡、西尼羅、登革熱、HCV及HBV。
肺病毒科
在一些實施例中，本發明提供治療肺病毒科感染之方法，其包含向感染肺病毒科病毒之個體(例如，人類)投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。肺病毒科病毒包括(但不限於)呼吸道融合性病毒(RSV)及其他肺病毒科病毒。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要人類之肺病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。肺病毒科病毒包括(但不限於)呼吸道融合性病毒及人類間質肺炎病毒。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為呼吸道融合性病毒感染。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為人類間質肺炎病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療有需要人類之肺病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療人類之肺病毒科病毒感染的藥劑。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為呼吸道融合性病毒感染。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為人類間質肺炎病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供用於治療有需要人類之肺病毒科病毒感染的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為呼吸道融合性病毒感染。在一些實施例中，肺病毒科病毒感染為人類間質肺炎病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供用於治療RSV感染之方法，其包含向感染呼吸道融合性病毒之個體(例如人類)投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。通常，個體患有慢性呼吸道融合性病毒感染，但治療急性感染RSV之人係在本發明之範疇內。
在一些實施例中，提供一種抑制RSV複製之方法，其包含向個體(例如人類)投與本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本發明提供一種降低與RSV感染相關之病毒負荷的方法，其中該方法包含向感染RSV之個體(例如人類)投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該治療有效量足以降低個體中之RSV病毒負荷。
如本文更充分描述，本發明化合物可與一或多種額外治療劑一起向感染RSV之個體(例如人類)投與。額外治療劑可與本發明化合物同時或在投與本發明化合物之前或之後向經感染個體(例如人類)投與。
在一些實施例中，提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療或預防RSV感染。在一些實施例中，提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於製造供治療或預防RSV感染的藥劑。
如本文更充分描述，本發明化合物可與一或多種額外治療劑一起向感染RSV之個體(例如人類)投與。此外，在一些實施例中，當用於治療或預防RSV時，本發明化合物可與一或多種(例如一種、兩種、三種、四種或多於四種)選自由以下組成之群的額外治療劑一起投與：RSV組合藥物、RSV疫苗、RSV DNA聚合酶抑制劑、免疫調節劑、鐸樣受體(TLR)調節劑、干擾素α受體配體、玻尿酸酶抑制劑、呼吸道融合性表面抗原抑制劑、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (ipi4)抑制劑、親環蛋白抑制劑、RSV病毒進入抑制劑、靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸、短干擾RNA (siRNA)及ddRNAi、核酸內切酶調節劑、核糖核苷酸還原酶抑制劑、RSV E抗原抑制劑、共價閉合環狀DNA (cccDNA)抑制劑、法尼醇X受體(farnesoid X receptor)促效劑、RSV抗體、CCR2趨化激素拮抗劑、胸腺素促效劑、細胞介素、核蛋白調節劑、視黃酸誘導性基因1刺激劑、NOD2刺激劑、磷脂酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)路徑抑制劑、PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑、重組胸腺素α-1、布魯頓氏酪胺酸激酶(bruton's tyrosine kinase；BTK)抑制劑、KDM抑制劑、RSV複製抑制劑、精胺酸酶抑制劑及其他RSV藥物。
小核糖核酸病毒科
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。小核糖核酸病毒科病毒為引起異質感染群之腸病毒，該等感染包括疱疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、普通感冒樣症候群(人類鼻病毒感染)、無麻痹性脊髓灰白質炎樣症候群、流行性肋肌痛(一般在流行病中出現的急性、發熱性、感染性疾病)、手足口症候群、兒童及成人胰臟炎及嚴重心肌炎。在一些實施例中，小核糖核酸病毒科病毒感染為人類鼻病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療人類之小核糖核酸病毒科病毒感染的藥劑。在一些實施例中，小核糖核酸病毒科病毒感染為人類鼻病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療有需要人類之小核糖核酸病毒科病毒感染。在一些實施例中，小核糖核酸病毒科病毒感染為人類鼻病毒感染。
黃病毒科
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要人類之黃病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。代表性黃病毒科病毒包括(但不限於)登革熱病毒、黃熱病病毒、西尼羅病毒、茲卡病毒、日本腦炎病毒、C型肝炎病毒(HCV)及B型肝炎病毒(HBV)。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為登革熱病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為黃熱病病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為西尼羅病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為茲卡病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為日本腦炎病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為C型肝炎病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為B型肝炎病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療有需要人類之黃病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療人類之黃病毒科病毒感染的藥劑。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為登革熱病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為黃熱病病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為西尼羅病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為茲卡病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為C型肝炎病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為B型肝炎病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療有需要人類之黃病毒科病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為登革熱病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為黃熱病病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為西尼羅病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為茲卡病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為C型肝炎病毒感染。在一些實施例中，黃病毒科病毒感染為B型肝炎病毒感染。
絲狀病毒科
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要人類之絲狀病毒科病毒感染的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。代表性絲狀病毒科病毒包括(但不限於)伊波拉病毒及馬堡病毒。在一些實施例中，絲狀病毒科病毒感染為伊波拉病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療有需要人類之絲狀病毒科病毒感染的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療人類之絲狀病毒科病毒感染的藥劑。在一些實施例中，絲狀病毒科病毒感染為伊波拉病毒感染。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療有需要人類之絲狀病毒科病毒感染。在一些實施例中，絲狀病毒科病毒感染為伊波拉病毒感染。
VIII. 治療或預防由病毒感染引起的呼吸道病況之惡化的方法
式 I化合物亦可用於治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化。
在一些實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供一種治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的方法，該方法包含向該人類投與治療有效量的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為哮喘。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒、腸病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供一種用於製造供治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑之方法，其特徵在於使用本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該呼吸道病況為哮喘。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒、腸病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供一種本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造供治療或預防人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化的藥劑，其中該呼吸道病況為哮喘。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒、腸病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化，其中該呼吸道病況為慢性阻塞性肺病。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒或間質肺炎病毒引起。
在一些實施例中，本發明提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療或預防有需要人類因病毒感染所引起的呼吸道病況之惡化，其中該呼吸道病況為哮喘。在一些實施例中，病毒感染係由呼吸道融合性病毒、鼻病毒、腸病毒或間質肺炎病毒引起。
IX. 實例 縮寫 .
使用某些縮寫及頭字語描述實驗細節。儘管大部分縮寫及頭字語為熟習此項技術者理解，但下表含有許多此等縮寫及頭字語之清單。
表 1.縮寫及字首語之列表。
| 縮寫 | 意義 |
| Ac | 乙酸鹽 |
| ACN | 乙腈 |
| DMSO | 二甲亞碸 |
| DMF | 二甲基甲醯胺 |
| Et | 乙基 |
| EtOAc | 乙酸乙酯 |
| HPLC | 高效液相層析 |
| LC | 液相層析 |
| MCPBA | 間氯過苯甲酸 |
| Me | 甲基 |
| m/z | 質荷比 |
| MS或ms | 質譜 |
| Ph | 苯基 |
| RT | 室溫 |
| TBAF | 氟化四丁銨 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| THF | 四氫呋喃 |
| TMSCl | 氯化三甲基矽烷 |
| t R | 滯留時間 |
| δ | 參考殘餘非氘化溶劑峰之百萬分率 |
化合物及中間物可經歷製備型HPLC (Phenomenex Gemini 10μ C18 110Å AXIA 250 × 21.2 mm管柱，30-70%乙腈/水梯度含0.1% TFA)。一些化合物在此製備型HPLC製程之後以TFA鹽獲得。
A. 中間物 中間物 1 .
向反應器1中填充3-O-苯基-4-(羥甲基)-1,2-O-亞異丙基-α-D-呋喃核糖(125 g，402 mmol，1.0當量)。填充THF (625 mL，5體積)，接著苯甲基溴(106 mL，2.2當量)。將夾套設定為0℃。以保持T
int＜10℃的方式填充NaHMDS (40 wt%於THF中，450 mL，2.2當量)。在完成添加之後，將夾套設定為15℃且攪拌60 min。藉由TLC 20%乙酸乙酯/80%己烷且用鉬酸鈰銨(CAM)染色來監測反應。將夾套設定為5℃。將乙酸(70 mL，2.5當量)溶解於水(1 L，8體積)中。以保持T
int＜15℃的方式將水溶液填充至反應中且使得各相分開。將下部水層排放至反應器2中。將反應器1的內容物濃縮約50%。將MTBE (1.25 L，10體積)填充至反應器2中。攪拌15 min且使得各層分開。排放下部水層且丟棄。將反應器2的內容物填充至反應器1中。將14%鹽水溶液(1 L，8體積)填充至反應器1中。攪拌15 min且排放下部水層。將有機物濃縮約50%。共蒸發內容物與甲醇(3×8體積)。將
中間物 1濃縮至約4體積且按原樣用於下一步驟。
中間物 2.
向含有粗
中間物 1(197 g，402 mmol，1當量)之反應器1中填充甲醇(1 L，5體積)、含4 M HCl之二㗁烷(120 mL，1.2當量)及濃硫酸(1.1 mL，0.05當量)。在環境溫度下攪拌2 h。藉由TLC 30%乙酸乙酯70%己烷及CAM染色檢測反應。緩慢填充5 M KOH溶液至pH ＞7 (100 mL，1.25當量)。將反應混合物濃縮至約2體積。填充乙酸乙酯(1 L，5體積)。填充水(1 L，5體積)。攪拌15 min。將下部水層排放至反應器2中。將乙酸乙酯(1 L，5體積)填充至反應器2中且攪拌15 min。排放下部水層且丟棄。將剩餘反應器2的內容物填充至反應器1中。將反應器1的內容物濃縮至約3體積。將MTBE (400 mL，2體積)填充至反應器1中。填充硫酸鈉(400 g，2 S)且攪拌15 min。濾出固體且用MTBE (200 mL，1體積)洗滌濾餅。將有機物填充至反應器1中。濃縮至約3體積。填充THF (400 mL，2體積)且濃縮至約3體積。填充THF (400 mL，2體積)且濃縮至越3體積，得到
中間物 2。於30%乙酸乙酯70%己烷中R
f為約0.1及0.4。
中間物 3.
向含有粗
中間物 2(186 g，402 mmol)之反應器1中填充THF (1 L，5體積)及苯甲基溴(60 mL，1.25當量)。將夾套設定為5℃。以保持T
int＜20℃的方式填充NaHMDS 40 wt% (245 mL，1.25當量)。將夾套設定為15℃且攪拌60 min。藉由TLC 30%乙酸乙酯70%己烷及CAM染色監測反應進程。將夾套設定為0℃。將乙酸(46 mL，2當量)溶解於水(1 L，5體積)中。以保持T
int＜15℃的方式將水溶液填充至反應器1中。將夾套設定為15℃且攪拌15 min。使得各相分開且將下部水層排放至反應器2中。將MTBE (1 L，5體積)填充至反應器2中且攪拌15 min。將反應器1濃縮約50%。在反應器2中使得各相分開且排放下部水層且丟棄。將反應器2的內容物填充至反應器1中。填充14%鹽水溶液(1 L，5體積)。攪拌15 min。排放下部水層且丟棄。將粗
中間物 3濃縮至約1體積，在30%乙酸乙酯70%己烷中R
f為約0.8，且按原樣用於下一步驟。
中間物 4.
向夾套設定為20℃的含有
中間物 3(222 g，401mmol)之反應器1中填充水(222 mL，1體積)。以保持T
int＜30℃的方式填充TFA (667 mL，3體積)。在20℃下攪拌24 h。藉由TLC 30%乙酸乙酯70%己烷及CAM染色監測。將反應器1的內容物濃縮至約2體積(移除550 mL溶劑)。填充MTBE (1.5 L，7體積)。將夾套設定為10℃。以保持T
int＜25℃的方式填充5 M NaOH至pH＞6 (600 mL，7.5體積)。以排氣降至最低的方式填充5 wt% NaHCO
3(1.1 L，5體積)。攪拌15 min。排放下部水層且丟棄。填充14%鹽水溶液(1.1 L，5體積)。攪拌15 min。排放下部水層且丟棄。將MTBE層濃縮至約4.5體積且按原樣用於下一步驟。
中間物 4於30%乙酸乙酯70%己烷中R
f為約0.5。
中間物 5.
向含有粗
中間物 4(216 g，401 mmol)之MTBE 4.5體積的設定為-5℃的反應器1中填充TEMPO (0.6 g，0.01當量)及KBr (4.53 g，0.1當量)。將K
2HPO
4*3 H
2O (87g，1當量)溶解於水(1.5體積)中。填充至反應器中。以保持T
int＜10℃ (約50 min)的方式填充8.25%漂白劑溶液(425 mL，1.35當量)。將夾套設定為5℃且攪拌1h。藉由TLC 30%乙酸乙酯70%己烷及CAM染色監測反應。將硫代硫酸鈉(30 g，0.5當量)溶解於水(310 mL，1.5體積)中。以保持T
int＜15℃的方式填充至反應器1中。將夾套設定為15℃。攪拌15 min。使用KI帶材測試漂白劑之消耗。排放下部水層且丟棄。填充1
S硫酸鈉且攪拌15 min。濾出固體且用MTBE 1體積洗滌濾餅。濃縮成油狀物且藉由矽膠層析使用25
S矽膠0%至50%乙酸乙酯/己烷純化45 min，得到(3R,4S)-3,4-雙(苯甲氧基)-5,5-雙((苯甲氧基)甲基)二氫呋喃-2(3H)-酮(
中間物 5)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-
d 6) δ 7.40 - 7.24 (m, 18H), 7.24 - 7.19 (m, 2H), 4.87 - 4.74 (m, 2H), 4.74 - 4.68 (m, 2H), 4.61 - 4.39 (m, 6H), 3.83 - 3.66 (m, 4H)。
中間物 6.
向反應器1中填充
中間物 7(50.83 g，195.5 mmol，1.11當量)，接著填充THF (5體積)。將反應器1夾套設定為0℃。向反應器2中填充
中間物 5(94.84 g，176.1 mmol，1.0當量)、THF (5體積)及含0.6 M LaCl
3*2LiCl之THF (290 mL，170 mmol，1當量)。在環境溫度下攪拌反應器2 30 min。以保持T
int＜5℃的方式向反應器1中填充TMS-Cl (25.1 mL，197.2 mmol，1.12當量)。攪拌15 min。將反應器1夾套設定為-10℃，以保持T
int＜0℃的方式填充含2.0 M PhMgCl之THF (185 mL，370 mmol，2.1當量)。攪拌15 min。將反應器1及2夾套設定為-20℃。以保持T
int＜-15℃的方式向反應器1中填充含2.0 M iPrMgCl之THF (100 mL，199 mmol，1.13當量)。在-15℃下攪拌15 min。以保持T
int＜-15℃的方式將反應器1之內容物轉移至反應器2中。在-15℃下攪拌60 min。以保持T
int＜20℃的方式將含乙酸(66 mL，1145 mmol，6.5當量)之水(5體積)填充至反應器2中。將反應器2夾套設定為20℃。攪拌15 min。分離各層。向反應器2中填充乙酸異丙酯(4體積)及水(3體積)。攪拌5 min。分離各層且用0.5 M HCl (2體積)洗滌有機物。分離各層且用2×5體積之10 wt% KHCO
3(水溶液)洗滌有機物。用14%鹽水溶液(5體積)洗滌有機物。分離各層且經由硫酸鈉乾燥有機物。濾出固體且濃縮液體，得到進入下一步驟的
中間物 6。
UPLC/MS t
R= 3.759及3.825 min, MS
m/z= 673.33 [M+1]；
UPLC/MS系統：Waters Acquity H Class
管柱：Waters Acquity BEH 1.7 µM C18 2.1 × 50 mm
溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。
梯度：2% ACN 0-0.5min。2% ACN - 98% ACN 0.5min - 3.0min。98% ACN 3min - 4min。98% ACN - 2% ACN 4min至4.5min。2% ACN 4.5min - 5min。
流速：0.5mL/min
質量範圍：100-1200
中間物 6 之替代合成。
向反應器1中填充
中間物7
(5.90 g，22.7 mmol，1.11當量)，接著填充THF (5體積)。將反應器1夾套設定為0℃。向反應器2中填充無水NdCl
3(5.1 g，20.4 mmol，1當量)、TBACl (6.1 g，22.1 mmol，1.08當量)及THF (10體積)。將反應器2夾套設定為90℃。蒸餾約50%之THF以共沸乾燥內容物。將
中間物 5(11 g，20.4 mmol，1.0當量)填充至反應器2中且在環境溫度下攪拌30 min。以保持T
int＜5℃的方式向反應器1中填充TMS-Cl (2.9 mL，22.9 mmol，1.12當量)。攪拌15 min。將反應器1夾套設定為-10℃，以保持T
int＜0℃的方式填充含2.0 M PhMgCl之THF (22.2 mL，44.3 mmol，2.1當量)。攪拌15 min。將反應器1及2夾套設定為-20℃。以保持T
int＜-15℃的方式向反應器1中填充含2.0 M iPrMgCl之THF (11.5 mL，199 mmol，1.13當量)。在-15℃下攪拌15 min。以保持T
int＜-15℃的方式將反應器1之內容物轉移至反應器2中。在-15℃下攪拌60 min。以保持T
int＜20℃的方式將含乙酸(66 mL，1145 mmol，6.5當量)之水(5體積)填充至反應器2中。將反應器2夾套設定為20℃。攪拌15 min。分離各層。向反應器2中填充乙酸異丙酯(4體積)及水(3體積)。攪拌5 min。分離各層且用0.5 M HCl (2體積)洗滌有機物。分離各層且用2×5體積之10wt% KHCO
3(水溶液)洗滌有機物。用14%鹽水溶液(5體積)洗滌有機物。分離各層且經由硫酸鈉乾燥有機物。濾出固體且濃縮液體，得到進入下一步驟的
中間物 6。
UPLC/MS t
R= 3.759及3.825 min, MS
m/z= 673.33 [M+1]
UPLC/MS系統：Waters Acquity H Class
管柱：Waters Acquity BEH 1.7 µM C18 2.1 × 50 mm
溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。
梯度：2% ACN 0-0.5min。2% ACN - 98% ACN 0.5min - 3.0min。98% ACN 3min - 4min。98% ACN - 2% ACN 4min至4.5min。2% ACN 4.5min - 5min。
流速：0.5mL/min
質量範圍：100-1200
中間物 8.
向反應器中填充含
中間物 6(約118 g，176 mmol)之DCM (10體積)。將夾套設定為-20℃。填充三乙基矽烷(73 mL，456 mmol，2.6當量)。以保持T
int＜-15℃的方式填充含三氟化硼46.5質量%之二乙醚(72 mL，263.1 mmol，1.5當量)。攪拌30 min。將夾套設定為0℃。以保持T
int＜20℃的方式填充5 M NaOH (175 mL，877 mmol，5當量)。將夾套設定為20℃。填充水(10體積)。分離各層。濃縮有機物層。用乙酸乙酯(2×5體積)反萃取水層。合併有機物且用14%鹽水(8體積)洗滌。經由硫酸鈉乾燥有機物，過濾且濃縮。藉由矽膠層析50-100%乙酸乙酯/己烷分離
中間物 8。
1H NMR (400 MHz, DMSO-
d 6) δ 7.83 (s, 1H), 7.71 (brs, 2H), 7.37 - 7.14 (m, 20H), 6.83 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.61 (d,
J= 4.4 Hz, 1H), 5.47 (d,
J= 7.0 Hz, 1H), 4.68 (d,
J= 11.6 Hz, 1H), 4.61 - 4.43 (m, 8H), 4.34 (d,
J= 4.8 Hz, 1H), 3.81 - 3.64 (m, 3H), 3.62 (d,
J= 10.0 Hz, 1H)。
UPLC/MS t
R= 3.919 min, MS
m/z= 657.32 [M+1]
UPLC/MS系統：Waters Acquity H Class
管柱：Waters Acquity BEH 1.7 µM C18 2.1 × 50 mm
溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。
梯度：2% ACN 0-0.5min。2% ACN - 98% ACN 0.5min - 3.0min。98% ACN 3min - 4min。98% ACN - 2% ACN 4min至4.5min。2% ACN 4.5min - 5min。
流速：0.5mL/min
質量範圍：100-1200
中間物 9.
向氮吹掃之圓底燒瓶中填充
中間物 8(21.7 g，33 mmol，1當量)。填充THF (3體積)、2,2-二甲氧基丙烷(3體積)及pTsOH (6.6 g，34.6 mmol，1.05當量)。在乾冰浴中冷卻。填充10% Pd/C。排空且回填氫氣3次。在環境溫度及壓力下攪拌。用飽和NaHCO
3(水溶液)淬滅至pH＞7。濾出催化劑且用甲醇(2.5體積)洗滌濾餅。分配於乙酸乙酯(10體積)與鹽水(10體積)之間。分離各層且經由硫酸鈉乾燥有機物。過濾固體且濃縮，得到進入下一步驟的
中間物 9 。UPLC/MS t
R= 2.580 min, MS
m/z= 477.14 [M+1]
UPLC/MS系統：Waters Acquity H Class
管柱：Waters Acquity BEH 1.7 µM C18 2.1 × 50 mm
溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。
梯度：2% ACN 0-0.5min。2% ACN - 98% ACN 0.5min - 3.0min。98% ACN 3min - 4min。98% ACN - 2% ACN 4min至4.5min。2% ACN 4.5min - 5min。
流速：0.5 mL/min
質量範圍：100-1200
中間物 10.
向圓底燒瓶中填充
中間物 9(12.3 g，32.7 mmol，1當量)、THF (10體積)及二碳酸二三級丁酯(14.4 g，65.4 mmol，2.0當量)。逐份填充DMAP (10.1 g，81.7 mmol，2.5當量)以使排氣及放熱降至最低。攪拌60 min以產生單Boc及雙Boc之混合物。將反應物濃縮約50%。填充MTBE (10體積)及2.0 M HCl (3.5體積)。分離各層。用乙酸乙酯(10體積)反萃取水溶液。合併有機物且用飽和NaHCO
3(水溶液)洗滌。濃縮有機物。將甲醇(10體積)填充至粗混合物中，接著填充KOH (3.67 g，2.0當量)。攪拌直至雙Boc轉化成單Boc。濃縮反應物。用乙酸乙酯(10體積)及水(10體積)分配。分離各層且濃縮。將甲醇(8體積)填充至粗物質中，接著填充pTsOH (6.5 g，34.2 mmol，1.05當量)。在環境溫度下攪拌。用5.25% NaHCO
3(水溶液) (80 mL，52 mmol，1.5當量)淬滅。濃縮約25%且攪拌隔夜。濾出固體且用MTBE (8體積)洗滌濾餅。在真空烘箱中乾燥，得到
中間物 10。
1H NMR (400 MHz, DMSO-
d 6) δ 10.45 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.19 (d,
J= 4.3 Hz, 1H), 6.95 (d,
J= 4.7 Hz, 1H), 5.35 (d,
J= 5.2 Hz, 1H), 5.06 (t,
J= 5.7 Hz, 1H), 4.79-4.74 (m, 2H), 4.45 (t,
J= 5.8 Hz, 1H), 3.73 - 3.46 (m, 3H), 3.40 - 3.30 (m, 1H), 1.50 (s, 12H), 1.27 (s, 3H)。
UPLC/MS t
R= 2.767 min, MS
m/z= 437.17 [M+1]
UPLC/MS系統：Waters Acquity H Class
管柱：Waters Acquity BEH 1.7 µM C18 2.1 × 50 mm
溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。
梯度：2% ACN 0-0.5min。2% ACN - 98% ACN 0.5min - 3.0min。98% ACN 3min - 4min。98% ACN - 2% ACN 4 min至4.5min。2% ACN 4.5min - 5min。
流速：0.5 mL/min
質量範圍：100-1200
中間物11. (3R,4R,5R)-2-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-3,4-雙(苯甲氧基)-5-((苯甲氧基)甲基)四氫呋喃-2-醇
根據WO2015/069939製備產物。舉例而言，WO2015/069939之第43至45頁提供一種製備此化合物(識別為WO2015/069939中之化合物1d)之製程。替代地，如以下製備該產物。
向配備有後彎頂置式攪拌器、熱電偶及N
2起泡器之圓柱形反應器中填充NdCl
3(60.00 g，239 mol，1.00當量)、n-Bu
4NCl (71.51 g，239 mmol，1.0當量)及THF (900 g)。在環境壓力下在N
2襯墊下使用90℃夾套溫度將所得混合物濃縮至約450 mL。填充THF (500 g)且重複蒸餾(兩次)。將混合物冷卻至22℃且填充
中間物 12((3R,4R,5R)-3,4-雙(苯甲氧基)-5-((苯甲氧基)甲基)二氫呋喃-2(3H)-酮) (100.02 g，239 mmol，1.00當量)。30 min之後，將混合物冷卻至-20℃且保持。將碘吡咯并三𠯤
中間物 7(68.52 g，264 mmol，1.10當量)及THF (601 g)合併於單獨的反應燒瓶中且冷卻至0℃。緩慢添加TMSCl (28.64 g，264 mmol，1.10當量)且約30 min之後，將混合物冷卻至10℃。緩慢添加PhMgCl (2.0 M於THF中，270.00 g，5.18 mmol，2.17 當量)且攪拌混合物約30 min且冷卻至-20℃。緩慢添加i-PrMgCl (2.0 M於THF中，131.13 g，269 mmol，1.13當量)。約2 h之後，經由套管將格林納反應混合物轉移至內酯/NdCl
3/n Bu
4NCl/THF混合物中且在約20℃下攪拌混合物。約16 h之後，添加乙酸(100 g)於水(440 g)中之溶液且使混合物升溫至22℃。添加
i PrOAc (331 g)且分離各層。有機層用10% KHCO
3(水溶液) (2×500 g)及10% NaCl (水溶液) (500 g)洗滌。將有機層濃縮至約450 mL且填充
i PrOAc (870 g)。有機混合物用水(2 ×500 g)洗滌且濃縮至約450 mL。填充
i PrOAc (435 g)且將混合物濃縮至約450 mL。過濾混合物且用129 g
i PrOAc向前沖洗殘餘物。將濾液濃縮至約250 mL且填充MTBE (549 g)且將混合物調節至22℃。填充晶種(0.15 g)，接著填充正庚烷(230 mL)且將混合物冷卻至0℃。藉由過濾分離固體且用MTBE/正庚烷混合物(113 g/30 g)向前沖洗。所得固體在35℃下真空乾燥，得到
中間物 11(79%產率及99.92% LC純度)。
中間物13. (3aS,4R,6S,6aS)-6-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-4-(((三級丁基二甲基矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-甲腈
根據WO2015/069939製備產物。舉例而言，WO2015/069939之第127至138頁提供一種製備此化合物(識別為WO2015/069939中之化合物14k)之製程。
替代地，
中間物 10如上文所描述來製備且接著如WO2015/069939中所描述轉化成
中間物 13(WO2015/069939中之化合物14f轉化成WO2015/069939中之化合物14k，如WO2015/069939之第133至138頁中所描述)。
替代地，
中間物 11如上文所描述來製備且接著如中所描述轉化成
中間物 13(WO2015/069939中之化合物1d轉化成WO2015/069939中之化合物14k，如WO2015/069939之第45至46頁及第127至138頁所描述)。
中間物14. (3aS,4R,6S,6aS)-6-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-4-(羥甲基)-2,2-二甲基四氫呋喃并[3,4-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-甲腈
採用含
中間物 13(8.41 g，18.87 mmol)之THF (100 mL)。在環境溫度下一次性添加含1.0 M TBAF之THF (28.31 mL，28.31 mmol)。在環境溫度下攪拌10 min。藉由LCMS判定反應完成。反應混合物用水淬滅且減壓移除有機物。將粗產物分配於EtOAc與水之間。分離各層且用EtOAc洗滌水層。合併有機相，且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且減壓移除溶劑。粗產物藉由矽膠層析(120 g管柱，0-10% CH
3OH/CH
2Cl
2)純化，得到產物。LC/MS：t
R=0.76 min，MS
m/z= 332.14[M+1]；LC系統：Thermo Accela 1250 UHPLC。MS系統：Thermo LCQ Fleet；管柱：Kinetex 2.6µ XB-C18 100A, 50 × 3.00 mm。溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水。梯度：0 min-2.4 min 2-100% CAN，2.4 min-2.80 min 100% CAN，2.8 min-2.85 min 100%-2% CAN，2.85 min-3.0 min 2% ACN，1.8 mL/min。
1H NMR (400 MHz, DMSO-
d 6) δ 7.87-7.80 (m, 3H), 6.85 (d, J = 4.5Hz, 1H), 6.82 (d, J = 4.5Hz, 1H), 5.74 (t,
J= 5.8 Hz, 1H), 5.52 (d,
J= 4.2 Hz, 1H), 5.24 (dd,
J= 6.8, 4.2 Hz, 1H), 4.92 (d,
J= 6.8 Hz, 1H), 3.65 (dd,
J= 6.1, 1.7 Hz, 2H), 1.61 (s, 3H), 1.33 (s, 3H)。
中間物15. 2-胺基丙酸(S)-環己酯鹽酸鹽
向L-丙胺酸(5 g，56.12 mmol)及環己醇(56 g，561 mmol)之混合物中添加TMSCl (20 mL)。所得混合物在約70℃下攪拌約15 h，且在約80℃下真空濃縮，與甲苯共蒸發，溶解於己烷中，且在約室溫下攪拌，在此期間沈澱出固體。藉由過濾收集固體，且濾餅用含5% EtOAc之己烷洗滌若干次，且高真空乾燥約15 h，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.76 (s, 3H), 4.85 (tt,
J= 8.7, 3.8 Hz, 1H), 4.17 (p,
J= 6.5 Hz, 1H), 1.84 (dd, J = 9.9, 5.5 Hz, 2H), 1.70 (d,
J= 7.3 Hz, 5H), 1.57 - 1.42 (m, 3H), 1.32 (m, 3H)。
中間物16. 2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(2S)-環己酯
將
中間物 15(3.4 g，16.37 mmol)溶解於亞甲基氯(45 mL)中，冷卻至-78℃，且快速添加二氯磷酸苯酯(2.45 mL，16.37 mmol)。在-78℃下經60 min添加三乙胺(4.54 mL，32.74 mmol)，且接著一次性添加4-硝基苯酚(2277 mg，16.37 mmol)。在-78℃下經60 min添加三乙胺(2.27 mL，16.37 mmol)。在-78℃下攪拌所得混合物2 h，用亞甲基氯(100 mL)稀釋，用水洗滌兩次並用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，且真空濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析(0至20% EtOAc/己烷)純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 氯仿-
d) δ 8.22 (m, 2H), 7.46 - 7.30 (m, 4H), 7.29 - 7.09 (m, 3H), 4.76 (m, 1H), 4.20 - 4.02 (m, 1H), 3.92 (m, 1H), 1.87 - 1.64 (m, 4H), 1.54 (m, 2H), 1.46 - 1.18 (m, 7H)。
31P NMR (162 MHz, 氯仿-
d) δ -2.94, -3.00。MS
m/z= 449 (M+H)
+。
B. 化合物實例1.製備2-(((((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(2S)-環己酯(式Ia)
在室溫下向
中間物 14(99 mg，0.30 mmol)、
中間物 16(201 mg，0.45 mmol)及MgCl
2(43 mg，0.45 mmol)於DMF (4 mL)中之混合物中逐滴添加
N,N-二異丙基乙胺(0.13 mL，0.75 mmol)。所得混合物在室溫下攪拌15 h且藉由製備型HPLC (Phenominex Synergi 4u Hydro-RR 80Å 150 × 30 mm管柱，10-100%乙腈/水梯度)純化，得到中間物，將其溶解於ACN (3 mL)中且添加濃HCl (0.1 mL)。將所得混合物在50℃下攪拌2 h，冷卻，且藉由製備型HPLC (Phenominex Synergi 4u Hydro-RR 80Å 150 × 30 mm管柱，10-80%乙腈/水梯度)純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 7.80 (s, 0.5H), 7.78 (s, 0.5H), 7.42 - 7.05 (m, 5H), 6.84 (m, 1H), 6.73 (m, 1H), 5.50 (m, 1H), 4.64 (m, 2H), 4.57 - 4.25 (m, 3H), 3.86 (m, 1H), 1.91 - 1.61 (m, 4H), 1.61 - 1.09 (m, 9H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-d4) δ 3.3。MS
m/z= 601 (M+H)
+。
分離非對映異構體。經由對掌性製備型HPLC (Chiralpak IA，150 × 4.6 mm，70%庚烷30%乙醇)純化產物。
實例2.製備((R)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸環己酯(式Ib)
實例1之第一溶離非對映異構體：
1H NMR (400 MHz, 甲醇-
d 4) δ 7.78 (s, 1H), 7.34 - 7.23 (m, 2H), 7.19 - 7.10 (m, 3H), 6.85 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.73 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 5.51 (d,
J= 5.0 Hz, 1H), 4.69 (td,
J= 8.8, 4.2 Hz, 1H), 4.62 (t,
J= 5.3 Hz, 1H), 4.53 - 4.44 (m, 2H), 4.36 (dd,
J= 10.9, 5.2 Hz, 1H), 3.86 (dq,
J= 9.4, 7.1 Hz, 1H), 1.85 - 1.62 (m, 4H), 1.58 - 1.20 (m, 9H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-
d 4) δ 3.31。
實例3.製備((S)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸環己酯(式I)
實例1之第二溶離非對映異構體：
1H NMR (400 MHz, 甲醇-
d 4) δ 7.80 (s, 1H), 7.37 - 7.27 (m, 2H), 7.26 - 7.13 (m, 3H), 6.84 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.73 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 5.49 (d,
J= 5.0 Hz, 1H), 4.71 - 4.56 (m, 2H), 4.46 (d,
J= 5.6 Hz, 1H), 4.45 - 4.30 (m, 2H), 3.97 - 3.77 (m, 1H), 1.80 - 1.61 (m, 4H), 1.55 - 1.21 (m, 9H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-
d 4) δ 3.31。
實例 4.合成((((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸異丙酯(化合物
3)。
根據WO2015/069939製備(2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-3,4-二羥基-2-(羥基甲基)四氫呋喃-2-甲腈。舉例而言，WO2015/069939之第43至54頁提供一種用於製備化合物(在WO2015/069939中標識為化合物1)之製程。
將(2R,3S,4R 5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-3,4-二羥基-2-(羥基甲基)四氫呋喃-2-甲腈(0.149 g，0.512 mmol)溶解於無水THF且濃縮。將所得殘餘物置放於高真空下1.5小時。隨後將殘餘物溶解於NMP (4 mL)中，且接著添加THF (1 mL)。將此溶液在冰浴中冷卻且添加三級BuMgCl於THF (0.767 mL，0.767 mmol)中之1 M溶液，致使形成白色沈澱物。5分鐘之後，移除冷浴，對混合物進行超音波處理以分散沈澱物固體，且將反應物在室溫下攪拌10分鐘。添加中間物((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸異丙酯(0.251 g，0.614 mmol；WO2011123668)於THF (0.9 mL)中之溶液。將反應物在室溫下攪拌且藉由LC/MS監測進展。1小時45分鐘之後，將反應物在冰浴中冷卻且藉由添加冰AcOH (0.25 mL)來淬滅。移除冰浴，且在室溫下持續攪拌5分鐘。藉由蒸發移除揮發物且藉由HPLC自殘餘物分離產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-
d 4, 帶有星號(*)之化學位移表示存在的第二異構體上的相關質子之位移) δ 7.81 (s, 0.41H), 7.79* (s, 0.59H), 7.36 - 7.12 (m, 5H), 6.85 (m, 1H), 6.74 (m, 1H), 5.50 (m, 1H), 4.97 - 4.85 (m, 1H), 4.63 (m, 1H), 4.54 - 4.32 (m, 3H), 3.85 (m, 1H), 1.25 (d,
J= 7.1 Hz, 2H), 1.20* (d,
J= 6.3 Hz, 4H), 1.16 (t,
J= 6.3 Hz, 3H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-
d 4) δ 3.30 (s)。MS
m/z= 561.03 [M+1]。
實例 5.合成2-(((S)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(S)-異丙酯(化合物
4)。
如實例4中所描述來製備(2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-3,4-二羥基-2-(羥基甲基)四氫呋喃-2-甲腈。
如Cho等人,J. Med. Chem. 2014, 57, 1812-1825中所描述來製備((S)-(4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸異丙酯。
將(2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-3,4-二羥基-2-(羥基甲基)四氫呋喃-2-甲腈(50 mg，0.172 mmol)及((S)-(4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸異丙酯(84 mg，0.206 mmol)混合於無水N,N-二甲基甲醯胺(2 mL)中。一次性添加氯化鎂(36 mg，0.378 mmol)。在50℃下加熱反應混合物。添加N,N-二異丙基乙胺(75 μL，0.43 mmol)，且在50℃下攪拌反應物4.5小時。反應混合物經冷卻，用乙酸乙酯(30 mL)稀釋且用5%檸檬酸水溶液(10 mL)且接著鹽水(10 mL)洗滌。有機層經由無水硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。粗殘餘物經由SiO
2管柱層析(4 g SiO
2Combiflash HP Gold管柱，0-2-5%甲醇/二氯甲烷)純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-
d 4) δ 7.79 (s, 1H), 7.36 - 7.25 (m, 2H), 7.25 - 7.12 (m, 3H), 6.84 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.73 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 5.49 (d,
J= 5.1 Hz, 1H), 4.91 - 4.84 (m, 1H), 4.62 (dd,
J= 5.6, 5.0 Hz, 1H), 4.47 (d,
J= 5.6 Hz, 1H), 4.45 - 4.30 (m, 2H), 3.85 (dq,
J= 10.0, 7.1 Hz, 1H), 1.25 (d,
J= 7.2 Hz, 3H), 1.15 (t,
J= 6.4 Hz, 6H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-
d 4) δ 3.31。MS
m/z= 561.0 [M+1], 559.0 [M-1]。
實例 6.合成2-(((((2R,3S, 4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(2S)-戊-3-基酯(化合物
5)。
2- 胺基丙酸 (S)- 戊 -3- 基 酯鹽酸鹽。向L-丙胺酸酯(5 g，56.12 mmol)及及3-羥基戊烷(50 mL)之混合物中添加TMSCl (20 mL)。將所得混合物在70℃下攪拌15 h，且在80℃下在旋轉式蒸發器中濃縮。所得固體用5%EtOAc/己烷濕磨，過濾，且用5%EtOAc/己烷洗滌若干次，且在高真空下乾燥隔夜，得到中間物。
1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.79 (s, 3H), 4.83 (p,
J= 6.2 Hz, 1H), 4.19 (p,
J= 6.5 Hz, 1H), 1.72 (d,
J= 7.2 Hz, 3H), 1.67 - 1.52 (m, 4H), 0.88 (td,
J= 7.5, 1.7 Hz, 6H)。
2-(((4- 硝基苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 (2S)- 戊 -3- 基 酯 。將2-胺基丙酸(S)-戊-3-基酯鹽酸鹽(1.00 g，5.11 mmol)懸浮於亞甲基氯(15 mL)中，冷卻至-78℃，且快速添加二氯磷酸苯酯(0.76 mL，5.11 mmol)。在-78℃下經30 min添加三乙胺(1.42 mL，10.22 mmol)，且在-78℃下攪拌所得混合物30 min。接著在-78℃下一次性添加4-硝基苯酚(711 mg，5.11 mmol)且經30 min添加三乙胺(0.71 mL，5.11 mmol)。在-78℃下攪拌混合物30 min，用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，且真空濃縮。殘餘物藉由矽膠管柱層析(0至20% EtOAc/己烷) 純化，得到2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(2S)-戊-3-基酯。
1H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.22 (m, 2H), 7.46 - 7.30 (m, 4H), 7.31 - 7.14 (m, 3H), 4.78 (m, 1H), 4.27 - 4.04 (m, 1H), 3.98 - 3.77 (m, 1H), 1.72 - 1.45 (m, 4H), 1.42 (m, 3H), 0.84 (m, 6H)。
31P NMR (162 MHz, 氯仿-d) δ -2.99 , -3.06。MS
m/z= 437 (M+H)
+。
2-(((((2R,3S,4R,5S)-5-(4- 胺基吡咯并 [2,1-f][1,2,4] 三 𠯤 -7- 基 )-2- 氰基 -3,4- 二羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 (2S)- 戊 -3- 基 酯。在室溫下向
中間物 14(66 mg，0.30 mmol)、2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸(2S)-戊-3-基酯(170 mg， 0.39 mmol)及MgCl
2(28 mg，0.30 mmol)於DMF (3 mL)中之混合物中逐滴添加
N,N-二異丙基乙胺(0.087 mL，0.50 mmol)。將所得混合物在60℃下攪拌15 h，且藉由HPLC (0至100% ACN/水)純化，得到中間物，將該中間物溶解於ACN (3 mL)中且添加濃HCl (0.1 mL)。將所得混合物在50℃下攪拌2 h，且藉由製備型HPLC (Phenominex Synergi 4u Hydro-RR 80Å 150 × 30 mm管柱，5-100%乙腈/水梯度)純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 7.79 (m , 1H), 7.36 - 7.07 (m, 5H), 6.84 (m, 1H), 6.73 (m, 1H), 5.50 (m, 1H), 4.76 - 4.59 (m, 2H), 4.54 - 4.40 (m, 2H), 4.34 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 1.63 - 1.42 (m, 4H), 1.27 (m, 3H), 0.91 - 0.75 (m, 6H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-d4) δ 3.37, 3.29。MS
m/z= 589 (M+H)
+。
實例 7.合成((S)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)丙胺酸2-乙基丁酯(化合物
6)。
如WO 2016/069825中所描述來製備((S)-(4-硝基苯氧基)(苯氧基)(磷醯基)-L-丙胺酸2-乙基丁酯。
在室溫下向
中間物 14(700 mg，2.113 mmol)、((S)-(4-硝基苯氧基)(苯氧基)(磷醯基)-L-丙胺酸2-乙基丁酯(998 mg，2.218 mmol)及氯化鎂(302 mg，3.169 mmol)之混合物中添加四氫呋喃(8.5 mL)，接著添加
N,N-二異丙基乙胺(0.92 mL，5.282 mmol)。在50℃下攪拌所得混合物3 h。隨後在減壓下濃縮反應混合物，且獲得之殘餘物用飽和氯化鈉溶液及二氯甲烷稀釋。分離各層，且有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗殘餘物經由SiO
2管柱層析法(80g SiO
2Combiflash HP金管柱，100%二氯甲烷-14%甲醇/二氯甲烷作為溶離劑)純化。將獲得之純材料溶解於無水乙腈(10 mL)中且在冰浴中冷卻，接著逐滴添加濃鹽酸(4 mL，48 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物1 h。1 h之後，使反應混合物在冰浴中冷卻，且用水稀釋。用3N氫氧化鈉中和溶液，且用二氯甲烷萃取。分離有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。獲得之殘餘物藉由SiO
2管柱層析法(40g SiO
2Combiflash HP金管柱，100%二氯甲烷-20%甲醇/二氯甲烷)來純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 7.80 (s, 1H), 7.38 - 7.29 (m, 2H), 7.27 - 7.13 (m, 3H), 6.84 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.61 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.49 - 4.29 (m, 3H), 4.04 - 3.82 (m, 3H), 1.43 (dq, J = 12.5, 6.1 Hz, 1H), 1.37 - 1.23 (m, 7H), 0.84 (td, J = 7.5, 1.1 Hz, 6H)。
31P NMR (162 MHz, 乙腈-d3) δ 2.73。MS
m/z= 603 [M+1]。
實例 8.合成((R)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸2-乙基丁酯(化合物
7)。
藉由對WO 2015/069939之實例34之
Sp及
Rp非對映異構體之解析來製備此化合物。WO 2015/069939之實例34經由對掌性製備型SFC(Chiralpak AD-H，30%乙醇等濃度)純化，得到呈WO 2015/069939之實例34之第一溶離非對映異構體形式的化合物
7：
1H NMR (400 MHz, 甲醇-
d 4 ) δ 7.78 (s, 1H), 7.32 - 7.24 (m, 2H), 7.19 - 7.10 (m, 3H), 6.84 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.72 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 5.51 (d,
J= 5.0 Hz, 1H), 4.63 (t,
J= 5.3 Hz, 1H), 4.54 - 4.43 (m, 2H), 4.36 (m, 1H), 4.07 - 3.84 (m, 3H), 1.53 - 1.42 (m, 1H), 1.38 - 1.24 (m, 7H), 0.86 (t,
J= 7.5 Hz, 6H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-
d 4) δ 3.26 (s)。HPLC: t
R= 5.068 min；HPLC系統：Agilent 1290 II；管柱：Phenomenex Kinetex C18, 2.6u 110A, 100 × 4.6 mm；溶劑：A：含0.1% TFA之水，B：含0.1% TFA之乙腈；梯度：經歷8.5 min，以1.5 mL/min自2 - 98% B梯度。
實例 9.合成((S)-(((2R,3S,4R,5S)-5-(4-胺基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三𠯤-7-基)-2-氰基-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸乙酯(化合物
8)。
((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸乙酯
在-78℃下向L-丙胺酸乙酯-HCl (631 mg，2.465 mmol)於DCM (15 mL)中之溶液中一次性添加二氯磷酸苯酯(0.368 mL，2.465 mmol)，且在-78℃下經5 min逐滴添加三乙胺(0.68 mL，4.93 mmol)。在移除乾冰浴之後攪拌所得混合物30 min，且接著將其冷卻至-78℃。在-78℃下一次性添加五氟苯酚(454 mg，2.465 mmol)且經5 min添加三乙胺(0.34 mL，2.465 mmol)。在移除乾冰浴之後攪拌所得混合物1 h，接著用DCM稀釋，用鹽水洗滌，真空濃縮，且所得殘餘物藉由矽膠管柱層析(0至60% EtOAc/己烷)純化，得到非對映異構混合物，向其中添加二異丙基醚(4 mL)。對懸浮液進行超音波處理且過濾。濾餅之
1H NMR顯示其為3:1比率之混合物。將二異丙基醚(5 mL)添加至濾餅中，且將懸浮液在70℃下加熱至澄清溶液。在移除加熱浴之後，開始形成針狀晶體，且在10 min之後，過濾混合物，且濾餅經高真空乾燥30 min，得到Sp異構體。
非對映異構混合物 ： 1H NMR (400 MHz, 氯仿-
d) δ 7.43 - 7.30 (m, 2H), 7.32 - 7.17 (m, 3H), 4.29 - 4.11 (m, 3H), 3.94 (m, 1H), 1.52 - 1.42 (m, 3H), 1.28 (q,
J= 7.0 Hz, 3H)。
S p 異構體： 1H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 7.50 - 7.36 (m, 2H), 7.32 - 7.21 (m, 3H), 4.75 (t,
J= 11.5 Hz, 1H), 4.17 - 3.98 (m, 3H), 1.37 (dd,
J= 7.1, 1.1 Hz, 3H), 1.22 (t,
J= 7.1 Hz, 3H)。
31P NMR (162 MHz, 乙腈-d3) δ -0.51。
19F NMR (376 MHz, 乙腈-d3) δ -155.48 - -155.76 (m), -162.73 (td,
J= 21.3, 3.7 Hz), -165.02 - -165.84 (m)。LCMS
m/z= 440.5 (M-乙基+H), t
R= 1.57 min；LC系統：Thermo Accela 1250 UHPLC；MS系統：Thermo LCQ Fleet；管柱：Phenomenex Kinetex 2.6µ XB-C18 100A, 50 × 3.0 mm；溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水；梯度：0 min-1.8 min 2-100%乙腈；1.8 min-1.85 min 100%-2% 乙腈；1.85 min-2.00 min 2% CAN，1800µl/min。
向
中間物 14(150 mg，0.45 mmol)、((S)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基)-L-丙胺酸乙酯(298 mg，0.68 mmol)及MgCl
2(65 mg，0.68 mmol)於THF (6 mL)中之混合物中逐滴添加
N,N-二異丙基乙胺(0.20 mL，1.13 mmol)。將所得混合物在50℃下攪拌2h，冷卻，用EtOAc (150 mL)稀釋，用鹽水(50 mL ×2)洗滌，乾燥，真空濃縮，再溶解於乙腈(6 mL)中，且在冰浴中添加濃HCL (0.3 mL)。將所得混合物在冰浴中攪拌1 h且在室溫下攪拌1 h，用飽和NaHCO
3(2 mL)處理，藉由HPLC (Phenomenex Gemini-NX 10µ C18 110Å 250×30 mm管柱，5-70%乙腈/水梯度，運行25 min)純化，得到產物。
1H NMR (400 MHz, 甲醇-d4) δ 7.80 (s, 1H), 7.31 (d,
J= 7.7 Hz, 2H), 7.25 - 7.14 (m, 3H), 6.84 (d,
J= 4.5 Hz, 1H), 6.73 (d,
J= 4.6 Hz, 1H), 5.49 (d,
J= 5.1 Hz, 1H), 4.62 (t,
J= 5.3 Hz, 1H), 4.46 (d,
J= 5.6 Hz, 1H), 4.40 (dd,
J= 10.9, 6.2 Hz, 1H), 4.33 (dd,
J= 10.9, 5.4 Hz, 1H), 4.11 - 3.98 (m, 2H), 3.87 (dd,
J= 9.9, 7.1 Hz, 1H), 1.25 (dd,
J= 7.1, 1.0 Hz, 3H), 1.16 (t,
J= 7.1 Hz, 3H)。
31P NMR (162 MHz, 甲醇-d4) δ 3.26。LCMS: MS
m/z= 547.12 [M+1]; t
R= 0.76 min; LC系統：Thermo Accela 1250 UHPLC；MS系統：Thermo LCQ Fleet；管柱：Phenomenex Kinetex 2.6µ XB-C18 100A, 50 × 3.0 mm；溶劑：含0.1%甲酸之乙腈、含0.1%甲酸之水；梯度：0 min-1.8 min 2-100%乙腈；1.8 min-1.85 min 100%-2%乙腈；1.85 min-2.00 min 2% CAN，1800µl/min。HPLC: t
R= 4.03 min; HPLC系統：Agilent 1290 II；管柱：Phenomenex Kinetex C18, 2.6u 110A, 100 × 4.6 mm；溶劑：A：含0.1% TFA之水，B：含0.1% TFA之乙腈；梯度：經8.5 min，以1.5 mL/min，自2 - 98% B梯度。
C. 生物實例實例10. DENV Pol IC
50
在DENV2-NS5聚合酶分析中，將具有序列5'-(UCAG)20(UCCAAG)14(UCAG)20-3' (SEQ ID NO: 1)之244個核苷酸二級無結構雜聚RNA (sshRNA)用作具有5'-CUG-3'引子之模板。將化合物從200 nM開始進行的六個兩倍稀釋液及無抑制劑對照物接種於96孔盤中。室溫下，將100 nM DENV2 NS5在含有40 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM NaCl、3 mM DTT、0.2單位/微升RNasin加RNase抑制劑、200 ng/µL sshRNA、20 μM CUG及2 mM MgCl
2之反應混合物中預培育5分鐘。將酶混合物添加至化合物稀釋液中，且藉由添加含有20 µM三種天然NTP加上2 μM含有1:100 α-33P-NTP之類似物:鹼基配對競爭性天然NTP的混合物來起始反應。在30℃下90分鐘之後，將5 µL反應混合物點樣於DE81陰離子交換紙上。過濾紙用Na
2HPO
4(125 mM，pH 9)洗滌三次，持續5分鐘，用水及乙醇沖洗，隨後風乾且暴露於磷光成像儀。合成RNA使用Typhoon Trio成像儀及Image Quant TL軟體定量，且使用GraphPad Prism 5.0藉由線性回歸計算反應速率。使用劑量-反應(可變斜率)方程式(四參數對數方程式)，藉由非線性回歸分析在Prism中計算IC
50值：Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogIC
50-X)*HillSlope))。
實例11. RSV RNP製備
根據Mason等人修改之方法(Mason, S., Lawetz, C., Gaudette, Y., Do, F., Scouten, E., Lagace, L., Simoneau, B.及Liuzzi, M. (2004) Polyadenylation-dependent screening assay for respiratory syncytial virus RNA transcriptase activity and identification of an inhibitor. Nucleic Acids Research, 32, 4758-4767)製備RSV核糖核蛋白(RNP)複合物。以7.1 × 10
4個細胞/平方公分之密度將HEp-2細胞接種於MEM + 10%胎牛血清(FBS)中，且使其在37℃ (5% CO
2)下附著隔夜。在附著之後，在35 mL MEM + 2% FBS中用RSV A2 (MOI=5)感染細胞。感染後20小時，用補充有2 μg/mL放線菌素D之MEM + 2% FBS更換培養基，且返回37℃持續一小時。細胞隨後用PBS洗滌一次且用35 mL PBS + 250 μg/mL溶血卵磷脂處理一分鐘，其後抽吸所有液體。藉由將細胞刮削至1.2 mL緩衝液A [50 mM TRIS乙酸鹽(pH 8.0)、100 mM乙酸鉀、1 mM DTT及2 μg/mL放線菌素D]中收集細胞，且藉由重複通過18號針頭(10次)使細胞溶解。將細胞溶解物在冰中置放10分鐘，且隨後在4℃下以2400 g離心10分鐘。移除上清液(S1)，且藉由重複通過18號針頭(10次)使沈澱物(pellet) (P1)在600 μL補充有1% Triton X-100之緩衝液B [10 mM TRIS乙酸鹽(pH 8.0)、10 mM乙酸鉀及1.5 mM MgCl
2]中破碎。將再懸浮的沈澱物在冰中置放10分鐘，且隨後在4℃下以2400 g離心10分鐘。移除上清液(S2)，且使沈澱物(P2)在600 μL補充有0.5%去氧膽酸鹽及0.1% Tween 40之緩衝液B中破碎。將再懸浮的沈澱物在冰中置放10分鐘，且隨後在4℃下以2400 g離心10分鐘。收集含有富集的RSV RNP複合物之上清液(S3)溶離份，且藉由280 nm下之UV吸光度測定蛋白質濃度。將等分的RSV RNP S3溶離份儲存在-80℃下。
實例12. RSV RNP分析
轉錄反應含有含25 μg粗RSV RNP複合物之30 μL反應緩衝液[50 mM TRIS乙酸鹽(pH 8.0)、120 mM乙酸鉀、5%丙三醇、4.5 mM MgCl
2、3 mM DTT、2 mM乙二醇-雙(2-胺基乙醚)-四乙酸(EGTA)、50 μg/mL BSA、2.5 U RNasin (Promega)、ATP、GTP、UTP、CTP及1.5 uCi [α-32P] NTP (3000 Ci/mmol)]。選擇在轉錄分析中使用之放射性標記核苷酸以匹配針對RSV RNP轉錄之抑制進行評估的核苷酸類似物。冷的競爭性NTP以二分之一其Km之最終濃度添加(ATP = 20 μM、GTP = 12.5 μM、UTP = 6 μM且CTP = 2 μM)。三種其餘核苷酸以100 μM之最終濃度添加。
為了判定核苷酸類似物是否抑制RSV RNP轉錄，使用6步連續稀釋以5倍增量添加化合物。在30℃下培育90分鐘之後，用350 μL Qiagen RLT溶解緩衝液停止RNP反應，且使用Qiagen RNeasy 96套組純化RNA。純化後的RNA在RNA樣品加樣緩衝液(Sigma)中在65℃下變性10分鐘，且在含有2 M甲醛之1.2%瓊脂糖/MOPS凝膠上進行。將瓊脂糖凝膠乾燥並暴露於Storm磷光成像儀螢幕，且使用Storm磷光成像儀(GE Healthcare)顯影。藉由兩次重複實驗之非線性回歸分析計算將總放射性標記轉錄物減少50%之化合物濃度(IC
50)。
實例 13.DENV-2 moDC EC50
人類單核球衍生之樹突狀細胞(moDC)係衍生自在含有GM-CSF及IL-4之人類Mo-DC分化培養基(Miltenyi Biotec)中培養的CD14+單核球(AllCells)。在第7天，藉由機械破碎收集moDC，洗滌，且將其懸浮於無血清RPMI中。在37℃下在輕緩攪拌下，moDC在無血清RPMI中用Vero衍生之登革熱2型新幾內亞病毒株(New Guinea strain；NGC)以MOI = 0.1感染兩小時。洗滌細胞，且將其再懸浮於含10%血清之RPMI (Gibco，補充有丙酮酸鈉、NEAA、青黴素-鏈黴素)中。一式三份地將10^5個細胞接種於96孔盤中，其中化合物以分級劑量分配(Hewlett-Packard D300數位分配器)。所有孔均相對於0.25% DMSO正規化。在48小時時，將細胞用1× PBS洗滌且移除所有上清液。使用RNEasy 96盤(Qiagen)提取總RNA，且使用總RNA使用XLT cDNA 5×超混合液(QuantaBio)產生第一股cDNA。cDNA用作對DENV2病毒及GAPDH基因表現具有特異性之Taqman qPCR雙螺旋反應中之模板。使用Prism Graphpad軟體測定EC
50值，相對於陽性對照及無化合物陰性對照孔正規化。
實例14. DENV-2 Huh-7 EC
50
Huh7 (人類肝癌7)細胞維持於含有10% FCS之DMEM完全培養基中。在分析當天，將細胞胰蛋白酶化(0.1%胰蛋白酶-EDTA)，洗滌，且在37℃下在輕緩攪拌下，在無血清DMEM中用登革熱血清型2新幾內亞C (NGC)病毒株以MOI = 0.1感染2小時。2小時後，將細胞用無血清培養基洗滌，且懸浮於含有10% FCS之DMEM (Gibco，補充有丙酮酸鈉、NEAA、青黴素-鏈黴素)中。一式三份地將10^5個細胞接種於96孔盤中，其中化合物以分級劑量分配(Hewlett-Packard D300數位分配器)。所有孔均相對於0.25% DMSO正規化。在48小時時，將細胞用1× PBS洗滌且移除所有上清液。使用RNEasy 96盤(Qiagen)提取總RNA，且使用總RNA使用XLT cDNA 5×超混合液(QuantaBio)產生第一股cDNA。cDNA用作對DENV2病毒及GAPDH基因表現具有特異性之Taqman qPCR雙螺旋反應中之模板。使用Prism Graphpad軟體測定EC
50值，相對於陽性對照及無化合物陰性對照孔正規化。
實例 15.DENV-2 Huh-7 Rep EC
50
以8化合物劑量反應形式(4次重複實驗)或40化合物劑量反應形式(3次重複實驗)，將化合物以每孔200 nl聲學轉移在384孔盤(Greiner，目錄號781091)中。對於所有測試盤，除0%抑制的僅DMSO陰性對照孔外，亦包括巴拉匹韋(Balapiravir)、GS-5734及NITD008作為陽性抑制對照。添加化合物之後，根據標準細胞培養程序收集含有DENV2複製子構築體之Huh-7細胞，並且在由cDMEM構成且不含慶大黴素(genticin)的細胞培養基中調整至1.25E5個細胞/毫升之濃度。隨後將40 μL細胞儲備液添加至各孔，達到5,000個細胞/孔之最終細胞密度。細胞及化合物混合物在37℃/5% CO
2下培育48小時。在收集細胞之前，EnduRen活細胞基質(Promega，目錄號E6481)藉由將3.4 mg懸浮於100 μL DMSO中以產生60 mM儲備溶液來進行準備。隨後將儲備溶液1:200稀釋於預溫熱之cDMEM中，且將10 μL此稀釋溶液添加至384孔盤之各孔中。盤隨後以500 rpm短暫離心，且在盤震盪器上置放2 min。混合後，將盤在7℃/5% CO
2下培育1.5小時，之後在Envision光度計上量測發光。針對各測試濃度，相對於0%及100%抑制對照計算複製子信號之抑制百分比，且藉由4參數非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為化合物抑制複製子信號達50%之有效濃度。
實例16. RSV HEp-2 EC
50
在HEp-2細胞中使用感染性細胞病變細胞保護分析來測定針對RSV之抗病毒活性。在此分析中，抑制病毒感染及/或複製之化合物產生對抗病毒誘導之細胞殺滅的細胞保護作用，其可使用細胞活力試劑定量。此處使用之技術為公開文獻(Chapman等人, Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51(9):3346-53)中所描述方法之新穎修改。
HEp-2細胞獲自ATCC (Manassas，VI)，且維持於補充有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之MEM培養基中。細胞一週傳代兩次，且保持在近匯合階段。在化合物測試之前滴定RSV病毒株A2 (Advanced Biotechnologies，Columbia，MD)之市售儲備液，以測定在HEp-2細胞中產生所需細胞病變效應的病毒儲備液之適當稀釋。
對於抗病毒測試，HEp-2細胞在大細胞培養燒瓶中生長至接近匯合，但並未完全匯合。以8或40樣品/盤標準化劑量反應形式，在384孔化合物稀釋盤中將待測試化合物預稀釋於DMSO中。在盤中製備各測試化合物之3倍連續遞增稀釋液，且經由聲學轉移設備(Echo，Labcyte)以每孔100 nL將測試樣品轉移至細胞培養物分析384孔盤中。將各化合物稀釋液以單一或一式四份樣品之形式轉移至乾分析盤中，其經儲存直至準備好進行分析。陽性及陰性對照相對地置放在盤之豎直區塊(1行)之末端上。
隨後，使用先前藉由用50,000/mL密度之細胞滴定所測定的病毒儲備液之適當稀釋液製備感染性混合物，且經由自動化(uFlow，Biotek)以20微升/孔添加至具有化合物之測試盤中。各盤包括陰性及陽性對照(各16個複本)以分別產生0%及100%病毒抑制標準。在感染RSV之後，將測試盤在37℃細胞培養培育箱中培育4天。在培育之後，將細胞活力試劑Cell TiterGlo (Promega，Madison，WI)添加至簡單培育之分析盤中，且量測(Envision，Perkin Elmer)所有分析盤中之發光讀數。根據剩餘細胞活力之水準測定RSV誘導之細胞病變效應(抑制百分比)。針對各測試濃度，相對於0%及100%抑制對照計算此等數值，且藉由非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為抑制RSV誘導之細胞病變效應達50%之濃度。各種強效抗RSV工具化合物用作抗病毒活性之陽性對照。
實例17. RSV NHBE EC
50
正常人類支氣管上皮(NHBE)細胞購自Lonza (Walkersville，MD，目錄號CC-2540)，且在支氣管上皮生長培養基(BEGM) (Lonza，Walkersville，MD，目錄號CC-3170)中培養。使細胞每週傳代1至2次以維持＜80%匯合。在培養物中6次傳代之後丟棄NHBE細胞。
為了進行RSV A2抗病毒分析，將BEGM中之NHBE細胞以7,500個細胞/孔之密度接種於96孔盤中，且使其在37℃下附著隔夜。附著之後，移除100 μL細胞培養基，且使用Hewlett-Packard D300數位分配器添加3倍連續稀釋之化合物。將最終DMSO濃度正規化至0.05%。在添加化合物之後，在BEGM中藉由添加100 μL效價為每毫升1 × 10
4.5個組織培養感染劑量之RSV A2來感染NHBE細胞，且隨後在37℃下培育4天。隨後使NHBE細胞平衡至25℃，且藉由移除100 μL培養基並添加100 μL Cell-Titer Glo活力試劑來測定細胞活力。將混合物在25℃下培育10分鐘，且在Envision發光盤讀取器上定量發光信號。
實例 18.RSV HAE EC
50
HAE細胞在空氣-液體界面處培養，且具有暴露於空氣之頂側以及與培養基接觸之底側。在實驗之前，將HAE自其基於瓊脂之裝運包裝中移出，且在1 ml HAE分析培養基(AIR-100-MM，Mattek Corp)中適應37℃/5% CO
2隔夜。藉由用400 μL PBS洗滌頂表面兩次(利用直接移液方法或使各跨孔通過含有PBS之槽)以移除黏液層來準備HAE用於感染。將頂部腔室排出PBS且輕緩地輕拍至吸收材料上以儘可能移除PBS。洗滌之後，將細胞轉移至含有4倍連續稀釋之化合物的新鮮HAE維持培養基，遞送至細胞單層之底側，且在37℃下在5% CO
2中，在HAE分析培養基中用100 μL RSV A病毒株A2 1000×儲備液(ABI，Columbia，MD，目錄號10-124-000)之1:600稀釋液在頂側感染3小時。移除病毒接種物且使用先前所描述之任一方法用PBS洗滌細胞之頂表面3次。隨後在37℃下在化合物存在下培養細胞3天。在培育之後，使用MagMAX-96病毒RNA分離套組(Applied Biosystems，Foster City，CA，目錄號AM1836)自HAE細胞提取總RNA，且藉由即時PCR定量細胞內RSV RNA。將大約25 ng純化RNA添加至PCR反應混合物中，該PCR反應混合物含有0.9 μM RSV N正向及RSV N反向引子、0.2 μM RSV N探針及1× Taqman RNA至Ct 1步套組(Applied Biosystems，Foster City，CA，目錄號4392938)。使用Taqman GAPDH對照引子組(Applied Biosystems，Foster City，CA，目錄號402869)正規化RNA含量。用於RSV A2 HAE抗病毒分析中之即時PCR引子及探針：RSV N正向CATCCAGCAAATACACCATCCA (SEQ ID NO: 2)、RSV N反向TTCTGCACATCATAATTAGGAGTATCAA (SEQ ID NO: 3)、RSV N探針FAM-CGGAGCACAGGAGAT-BHQ (SEQ ID NO: 4)。
實例 19.HRV16 HeLa EC
50
在給與化合物及感染前一天，將在含有10%熱滅活FBS及1%青黴素/鏈黴素之完全DMEM培養基中培養的H1-HeLa細胞以3000個細胞/孔接種於96孔盤中。重複三次量測各化合物之抗病毒活性。在即將感染前使用HP300數位分配器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)將化合物之3倍連續稀釋液直接添加至細胞培養物中。將盤轉移至BSL-2容器中，且將預先藉由滴定法測定且在細胞培養基中製備的病毒儲備液之適當稀釋液添加至含有細胞及連續稀釋化合物之測試盤中。各盤包括6個受感染未處理細胞孔及6個未感染細胞孔，其分別充當0%及100%病毒抑制對照。在感染之後，在設置為33℃/5% CO
2之組織培養培育箱中培育測試盤96 h。培育後，將H1-HeLa細胞自培育中移除，且使其平衡至25℃。藉由移除100 μL培養基並添加100 μL Cell-Titer Glo活力試劑來測定細胞活力。將混合物在震盪器上在25℃下培育10分鐘，且在Envision發光盤讀取器上定量發光信號。針對各測試濃度，相對於0%及100%抑制對照計算病毒感染抑制百分比，且藉由4參數非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為化合物抑制細胞病變效應達50%之有效濃度。
實例 20.HRV1A HeLa EC
50
在給與化合物及感染前一天，將在含有10%熱滅活FBS及1%青黴素/鏈黴素之完全RPMI 1640培養基中培養的H1-HeLa細胞以5000個細胞/孔接種於96孔盤中。重複三次量測各化合物之抗病毒活性。在即將感染前使用HP300數位分配器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)將化合物之3倍連續稀釋液直接添加至細胞培養物中。將盤轉移至BSL-2容器中，且將100 μL HRV1a病毒儲備液之1/4000稀釋液添加至含有細胞及連續稀釋化合物之各孔中。各盤包括6個受感染未處理細胞孔及6個含有5 μM蘆平曲韋(Rupintrivir)之細胞孔，其分別充當0%及100%病毒抑制對照。在感染之後，在設置為37℃/5% CO
2之組織培養培育箱中培育測試盤96 h。培育後，將H1-HeLa細胞自培育中移除，且使其平衡至25℃。藉由移除100 μL培養基並添加100 μL Cell-Titer Glo活力試劑來測定細胞活力。將混合物在震盪器上在25℃下培育10分鐘，且在Envision發光盤讀取器上定量發光信號。針對各測試濃度，相對於0%及100%抑制對照計算病毒感染抑制百分比，且藉由4參數非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為化合物抑制細胞病變效應達50%之有效濃度。
實例 21.HRV14 HeLa EC
50
在給與化合物及感染前一天，將在含有10%熱滅活FBS及1%青黴素/鏈黴素之完全RPMI 1640培養基中培養的H1-HeLa細胞以5000個細胞/孔接種於96孔盤中。重複三次量測各化合物之抗病毒活性。在即將感染前使用HP300數位分配器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)將化合物之3倍連續稀釋液直接添加至細胞培養物中。將盤轉移至BSL-2容器中，且將100 μL HRV14病毒儲備液之1/4000稀釋液添加至含有細胞及連續稀釋化合物之各孔中。各盤包括6個受感染未處理細胞孔及6個含有5 μM蘆平曲韋之細胞孔，其分別充當0%及100%病毒抑制對照。在感染之後，在設置為37℃/5% CO
2之組織培養培育箱中培育測試盤96 h。培育後，將H1-HeLa細胞自培育中移除，且使其平衡至25℃。藉由移除100 μL培養基並添加100 μL Cell-Titer Glo活力試劑來測定細胞活力。將混合物在震盪器上在25℃下培育10分鐘，且在Envision發光盤讀取器上定量發光信號。針對各測試濃度，相對於0%及100%抑制對照計算病毒感染抑制百分比，且藉由4參數非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為化合物抑制細胞病變效應達50%之有效濃度。
實例 22.HRVc15及HRVc25 HeLa EC
50
首先，製備HRV複製子RNA。在37℃下，在最終體積25 µL之NEB緩衝液-3中用2 µL MluI酶使5 µg DNA模板(HRVc15或HRVc25)線性化3小時。培育後，線性化之DNA經由PCR純化管柱純化，且使用以下條件進行後續活體外轉錄：10 µL RiboMAX Express T7 2×緩衝液、1-8 µL直鏈DNA模板(1 µg)、0-7 µL無核酸酶之水、2 µL酶混合物T7 express。20 µL之最終體積經混合且在37℃下培育30 min。培育後，添加1 µL RQ1無RNase之DNase，且將混合物在37℃下培育15 min。所得RNA隨後用MegaClear套組(Gibco Life Technologies目錄號11835-030)純化，且在95℃下用50 µL溶離緩衝液溶離兩次。在轉染前一天，將在含有10%熱滅活FBS及1%青黴素/鏈黴素之完全RPMI 1640培養基中培養的H1-HeLa細胞以2E6個細胞/燒瓶之濃度接種至T-225燒瓶中，且在37℃/5% CO
2下培育隔夜。在轉染當天，根據標準細胞培養方案使細胞胰蛋白酶化，且用PBS洗滌兩次。洗滌後，使細胞以1E7個細胞/毫升之濃度再懸浮於PBS中，且將懸浮液儲存於濕冰上。使用電穿孔將複製子RNA引入至H1-HeLa細胞中。將分別含有10 µg複製子c15或1 µg c25複製子RNA之10 µL最終體積吸移至4 mm電穿孔杯中。藉由輕輕旋轉來混合H1-HeLa細胞儲備液，且將0.5 mL預先製備的細胞儲備液轉移至含有複製子RNA之電穿孔杯中。搖動合併之溶液以混合。混合後，立即使用以下設置對細胞進行電穿孔：900 V、25 μF、無窮大電阻、1脈衝。將電穿孔杯在冰上放置10 min。培育10 min後，每電穿孔添加19 mL環境溫度的含有10%熱滅活FBS之無酚紅且無抗生素之RPMI 1640。每孔150 µL經電穿孔細胞懸浮液(4E4個細胞)接種至96孔透明底部白色細胞培養盤中，且在25℃下培育30 min。使用HP300數位分配器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)將化合物之3倍連續稀釋液直接添加至細胞培養物中，且重複三次測試。添加化合物之後，將盤在33℃下培育48小時。隨後藉由Renilla-Glo螢光素酶分析系統來量測複製子活性。在信號定量之前，將盤自培育箱移除，且在自各孔移除50 μL之後使其平衡至25℃。根據製造商之方案，製備Renilla-Glo基質緩衝液之1:100稀釋液，且將100 μL Renill-Glo螢光素酶混合物添加至各孔。隨後將盤在輕緩攪拌下在25℃下培育20 min，且使用EnVision螢光素酶定量讀取器用0.1秒偵測設置測定螢光素酶信號。針對各測試濃度，相對於實驗中所包括之0%及100%抑制對照計算複製子抑制之抑制百分比，且藉由4參數非線性回歸測定各化合物之EC
50值作為化合物抑制螢光素酶信號達50%之有效濃度。
實例 23. HCV Rep 1B及2A EC
50及CC
50
在384孔盤中以十個步驟之1:3稀釋連續稀釋化合物。所有連續稀釋均在同一384孔盤內每化合物重複四次地進行。添加100 μM之HCV蛋白酶抑制劑ITMN-191作為100% HCV複製抑制之對照，同時包括10 mM之嘌呤黴素作為100%細胞毒性之對照。利用Biotek μFlow工作站向黑色聚苯乙烯384孔盤(Greiner Bio-one，Monroe，NC)之各孔中添加90 μL含有2000個懸浮HCV複製子細胞之細胞培養基(不含遺傳黴素(Geneticin))。對於化合物轉移至細胞培養盤中，將0.4 μL來自化合物連續稀釋盤之化合物溶液轉移至Biomek FX工作站上之細胞培養盤中。最終分析孔中之DMSO濃度為0.44%。將盤在37℃以及5% CO
2及85%濕度下培育3天。HCV複製子分析為多重分析，能夠評估來自同一孔之細胞毒性及抗複製子活性兩者。首先進行CC
50分析。抽吸384孔細胞培養盤中之培養基，且使用Biotek ELX405盤洗滌器各用100 μL PBS洗滌孔四次。利用Biotek μFlow工作站將50 μL體積的於1 × PBS中的含有400 nM鈣黃綠素AM (Anaspec，Fremont，CA)之溶液添加至盤之各孔中。將盤在室溫下培育30 min，之後用Perkin-Elmer Envision盤讀取器量測螢光信號(激發490 nm，發射520 nm)。在與CC
50分析相同的孔中進行EC
50分析。用Biotek ELX405盤洗滌器抽吸384孔細胞培養盤中之鈣黃綠素-PBS溶液。利用Biotek μFlow工作站將20 μL體積的Dual-Glo螢光素酶緩衝液(Promega，Madison，WI)添加至盤之各孔中。將盤在室溫下培育10 min。利用Biotek μFlow工作站將20 μL體積的含有Dual-Glo Stop & Glo基質(Promega，Madison，WI)與Dual-Glo Stop & Glo緩衝液(Promega，Madison，WI)之1:100混合物的溶液添加至盤之各孔中。隨後將盤在室溫下培育10 min，之後用Perkin-Elmer Envision盤讀取器量測發光信號。
實例24.人類粒線體RNA聚合酶(POLRMT)之抑制
所有反應混合物含有50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)、0.2 mg/ml BSA、2 mM DTT、0.05 mg/ml活化魚精子DNA、10 mM MgCl2、1.3 µCi [α-
33P]dTTP (3,000 Ci/mmol)及各自2 µM的dATP、dGTP及TTP。在酶濃度([E])與活性之線性範圍內選擇最優酶濃度，且選擇反應時間以確保消耗10%之基質。在37℃下進行所有反應。在含有10 mM HEPES (pH 7.5)、20 mM NaCl、10 mM DTT、0.1 mg/ml BSA及10 mM MgCl
2之緩衝液中，使用藉由含有POLRMT輕鏈啟動子區及線粒體轉錄因子A (mtTFA) (100 nM)及mt-TFB2 (20 nM)之20 nM模板質粒(pUC18-LSP)預培育的20 nM POLRMT來評估線粒體RNA聚合酶(POLRMT)之抑制。反應經加熱至32℃且藉由添加各自2.5 µM的四種天然NTP及1.5 µCi之[
33P]GTP起始。在32℃下培育30 min之後，在處理用於定量之前，將反應物點樣於DE81紙上。
實例25.藉由人類粒線體RNA聚合酶(POLRMT)之單核苷酸併入
將MTCN緩衝液(50 mM MES、25 mM Tris-HCl、25 mM CAPS及50 mM NaCl，pH 7.5)、200 nM5'-
32P-R12/D18、10 mM MgCl
2、1 mM DTT及376 nM POLRMT之混合物在30℃下預培育1 min。藉由添加500 μM (最終)天然NTP或NTP類似物開始反應。在選擇時間點，移除反應混合物且用含有100 mM EDTA、80%甲醯胺及溴酚藍之凝膠負載緩衝液淬滅，且在65℃下加熱5 min。在20%聚丙烯醯胺凝膠(8 M脲)上運行樣品，且使用Typhoon Trio成像儀及Image Quant TL軟體(GE Healthcare，Piscataway，NJ)定量產物形成。藉由使用單指數方程式[R13] = A(1-e
-kt )擬合產物形成來計算線粒體RNA聚合酶之單核苷酸速率，其中[R13]表示形成之細長產物的量(以nM為單位)，
t表示反應時間，k表示觀測的速率且A表示指數之振幅。
表 2. 式 I化合物針對RSV及HRV之活性。
所有值以nM為單位。
表 3. 式 I化合物針對登革熱病毒之活性。
所有值以nM為單位。
表 4. 式 I化合物針對HCV之活性。
所有值以nM為單位。
表 5. 式 I化合物及化合物
1及
2之比較性RSV效能。
所有值以nM為單位。
表 6. 式 I化合物及化合物
1及
2之比較性HRV效能。
所有值以nM為單位。
表 7. 式 I化合物及化合物
1及
2之比較性登革熱及HCV效能。
所有值以nM為單位。
| RSV HEp-2 EC 50 | RSV NHBE EC 50 | RSV HAE EC 50 | HRV16 HeLa EC 50 | HRV1A HeLa EC 50 | HRV14 HeLa EC 50 | HRV15 Rep EC 50 | HRV25 Rep EC 50 |
| 88 | 124 | 23 | 227 | 8 | 78 | 9 | 7 |
| DENV Huh7 EC 50 | DENV Huh7 REP EC 50 | DENV moDC EC 50 |
| 1633 | 2937 | ＞6194 |
| HCV Rep 1B EC 50 | HCV Rep 2A EC 50 |
| 793 | 1268 |
| 化合物 | RSV Hep2-384 EC 50 | RSV NHBE EC 50 | RSV HAE EC 50 |
| 式 I | 88 | 124 | 23 |
| 1 | 352 | 549 | -- |
| 2 | 69 | 75 | 186 |
| 化合物 | HRV16 HeLa EC 50 | HRV1A HeLa EC 50 | HRV14 HeLa EC 50 | HRV15 Rep EC 50 | HRV25 Rep EC 50 |
| 式 I | 227 | 8 | 78 | 9 | 7 |
| 1 | 959 | 409 | 1000 | -- | -- |
| 2 | 164 | 97 | 171 | 21 | -- |
| 化合物 | DENV huh7 Rep EC 50 | HCV Rep 1B EC 50 | HCV Rep 2A EC 50 |
| 式 I | 2937 | 793 | 1268 |
| 1 | 73429 | -- | -- |
| 2 | 5535 | 2776 | 1826 |
如表5-7中所見，在RSV抗病毒分析(Hep-2及NHBE)中，
式 I化合物相對於化合物
1更強效(各別地更強效約4.0及4.4)。相對於化合物
1，
式 I化合物針對HRV亦更強效(在HRV16 HeLa、HRV1A HeLa及HRV14 HeLa分析中) (各別地更強效約4.2、51.1及12.8倍)。同樣地，相比於化合物
1，
式 I化合物針對登革熱(在Denv huh7 Rep分析中)更強效(約25.0倍更強效)。
類似地，在HAE分析中，
式 I化合物亦展現出相對於化合物2的更高抗RSV活性(Mirabelli, C.等人，J. Antimicrob. Chemother. 2018, 73, 1823-1829) (約8.1倍更強效)。在多個HRV抗病毒分析中(在HRV1A HeLa、HRV14 HeLa及HRV15 Rep分析中)，相比於化合物
2，
式 I化合物亦更強效(在HRV1A HeLa分析中約12.1倍更強效，在HRV14 HeLa分析中約2.2倍更強效，且在HRV15 Rep分析中約2.3倍更強效)。另外，
式 I化合物在登革熱抗病毒分析中亦更強效(在DENV huh7 Rep分析中約1.9倍更強效)。同樣地，在HCV抗病毒分析中，
式 I化合物相對於化合物
2更強效(在HCV Rep 1B中約3.5倍及在HCV Rep 2A中約1.4倍)。
實例 26. 式 I化合物相比於結構上相關之化合物
3至
5之RSV效能。
此外，
式 I化合物之特徵在於酯基(以下結構中藉由*指示之位置)處之環己基。
式 I
根據上文所描述之分析量測
式 I化合物及化合物
3至
5(下文所展示之結構)之效能。化合物
3至
5之結構類似於
式 I化合物，不同之處在於其在分支鏈酯(以下結構中藉由*指示之位置)處不具有環狀環。此等實驗之結果概述於下表8中。
表 8. 式 I化合物及化合物
3至
5之RSV比較效能。
所有值以nM為單位。
| 化合物 | RSV Hep-2 EC 50 | RSV NHBE EC 50 | HRV16 HeLa EC 50 | HRV1A HeLa EC 50 | HRV14 HeLa EC 50 |
| 式 I | 88 | 124 | 227 | 8 | 78 |
| 3 | 463 | 1150 | 1418 | 735 | 1807 |
| 4 | 342 | 879 | 965 | - | - |
| 5 | 1744 | 1239 | 3128 | 1625 (n=1) | 3431 (n=1) |
如上表8中所見，在RSV及HRV抗病毒分析中，
式 I化合物相對於化合物
3更強效(在RSV Hep-2分析中約5倍，在RSV NHBE分析中約9.3倍，在HRV16 HeLa分析中約6.2倍，在HRV1A HeLa分析中約91.9倍，且在HRV14 HeLa分析中約23.2倍)，相對於化合物
4(在RSV Hep-2分析中約3.9倍，在RSV NHBE分析中約7.1倍，且在HRV16 Hela分析中約4.3倍)，及相對於化合物
5(在RSV Hep-2分析中約19.8倍，在RSV NHBE分析中約10.0倍，在HRV16 HeLa分析中約13.8倍，在HRV1A HeLa分析中約203.1倍，且在HRV14 HeLa分析中約44.0倍)，上述化合物
3至
5中之每一者在分支鏈酯處不具有環狀環己基。因此，與酯基處具有分支鏈烷基但不具有環己基之化合物
3至
5相比，
式 I化合物展現出改良之性質。
實例 27. 式 I化合物相比於
式 Ia化合物、
式 Ib化合物及化合物
2、
6 、 7及
8之效能。
根據上文所描述之分析量測
式 I化合物以及結構上相關之
式 Ia化合物及式
Ib化合物及化合物
2、
6、
7及
8之效能。
式 I a化合物、式
Ib化合物、化合物
6、
7及
8之結構如下展示且結果概述於下表9中。
表 9 . 式 I化合物、
式 Ia化合物、
式 Ib化合物及化合物
2、
6 、 7及
8之RSV及HRV比較效能。
所有值以nM為單位。
| 式 Ia | 式 Ib |
| 化合物 | P 立體化學 | RSV HEp-2 EC 50 | RSV NHBE EC 50 | RSV HAE EC 50 | HRV16 HeLa EC 50 | HRVc15 Rep EC 50 |
| 式 Ia | 混合物 | 96 | 76 | 510 | ||
| 式 I | S | 88 | 124 | 23 | 227 | 9 |
| 式 Ib | R | 2735 | 630 | 654 | ||
| 2 | 混合物 | 69 | 75 | 186 | 164 | 21 |
| 6 | S | 26 | 127 | 110 | 135 | 17 |
| 7 | R | 124 | 91 | 183 | ||
| 8 | S | 91 | 932 | 678 |
上表
9中之EC
50資料顯示在RSV及HRV兩者分析中，P處具有
S立體化學之
式 I化合物相比於P處具有
R立體異構中心之
式 Ib化合物顯著更強效。特定言之，在RSV HEp-2分析中，
式 I化合物相比於
式 Ib化合物更強效31.1倍，且在RSV NHBE分析中為5.1更強效。同樣地，在HRV16 HeLa分析中，
式 I化合物相比於
式 Ib化合物更強效2.9倍。
相比之下，僅P處之立體化學不同的化合物
6及
7(在P處，化合物
6具有
S立體化學且化合物
7具有
R立體化學)之效能不具有如同
式 I化合物與
式 Ib化合物之差異。在RSV HEp-2分析中，化合物
6僅比化合物
7強效4.8倍且在HRV16 HeLa分析中強效1.4倍。在RSV NHBE分析中，化合物
6之效能僅為化合物
7之0.7倍。
實例 28 .HEp-2及MT-4細胞毒性分析
以與先前針對其他細胞類型所描述類似的方式，使用細胞活力試劑在未感染細胞中測定
式 I化合物及化合物
1、
2及
6之細胞毒性(Cihlar等人, Antimicrob Agents Chemother. 2008, 52(2):655-65。)。將HEp-2 (1.5 × 103個細胞/孔)及MT-4 (2 × 103個細胞/孔)細胞接種於384孔盤中，且用含有介於15 nM至100,000 nM範圍內之3倍連續稀釋化合物的適當培養基培育。細胞在37℃下培養4至5天。培育之後，使細胞平衡至25℃，且藉由添加Cell-Titer Glo活力試劑來測定細胞活力。將混合物培育10 min，且使用Envision盤讀取器定量發光信號。未處理細胞及以2 μM嘌呤黴素(Sigma，St. Louis，MO)處理之細胞分別充當100%及0%細胞活力對照。針對各所測試化合物濃度，相對於0%及100%對照計算細胞活力百分比，且藉由非線性回歸測定CC
50值作為降低細胞活力達50%之化合物濃度。
實例 29.
NHBE及SAEC細胞毒性分析
正常人類支氣管上皮(NHBE)細胞購自Lonza (Walkersville，MD，目錄號CC-2540)，且在支氣管上皮生長培養基(BEGM) (Lonza，Walkersville，MD，目錄號CC-3170)中培養。根據製造商之方案使細胞每週傳代1至2次以維護＜80%匯合。在培養物中5次傳代之後丟棄NHBE細胞。
人類小氣道上皮細胞(SAEC)係購自Lonza(Walkersville，MD，目錄號CC-2547)且在補充的小氣道上皮細胞生長培養基(SAGM) (lonza，Walkersville，MD，目錄號CC-3118)中培養。根據製造商之方案使細胞每週傳代1至2次以維護＜80%匯合。在培養物中5次傳代之後丟棄SAEC細胞。
為測定
式 I化合物及化合物
1 、 2及
6之50%細胞毒性濃度(CC
50)，將NHBE或SAEC細胞以10,000個細胞/孔之密度接種於透明底部黑色壁96孔盤中之200µL BEGM或SAGM中，且將其在37℃下附著隔夜。附著之後，使用Hewlett-Packard D300數位分配器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)重複三次添加3倍連續稀釋之化合物。將最終DMSO濃度正規化至1.0%。添加化合物之後，將NHBE或SAEC細胞在37℃下培育5天。隨後使NHBE或SAEC細胞平衡至25℃，且藉由移除100 μL培養基並添加100 μL Cell-Titer Glo活力試劑(Promega，Madison，WI)來測定細胞活力。將混合物在25℃下培育10分鐘，且在Envision發光盤讀取器(PerkinElmer，Waltham，MA)上定量發光信號。藉由減去背景發光信號正規化至1.0%僅DMSO對照孔來測定活力百分比值。
實例 30. PHH細胞毒性分析
在96孔盤中以50或100 µM之濃度開始一式兩份地製備
式 I化合物及化合物
1 、 2及
6之三倍連續稀釋液。新鮮人類肝細胞以具有Matrigel覆層之96孔盤形式購自BioIVT (Baltimore，Maryland，目錄號F/M91565)或具有Geltrex覆層之96孔盤形式購自Invitrogen (Durham，North Carolina，目錄號HMFY96)。供體概況限於4-65歲且極少飲酒。在用化合物處理之前，在37℃下，在具有90%濕氣之5% CO
2培育箱中，將PHH細胞回收於供應商提供之添加有補充劑之完全培養基中4至24小時。每天更換連續稀釋之化合物及完全培養基(130微升/孔)持續5天，最終DMSO量等於0.5%。在第5天，自分析盤移除培養基且藉由向各孔添加100 µL Cell-Titer Glo活力試劑(Promega，Madison，WI，目錄號G7573)來測定細胞活力。在室溫下培育5至10分鐘之後，在Victor發光盤讀取器(Perkin-Elmer，Waltham，MA)上定量發光信號。
實例 31. PRPT細胞毒性分析
使用以下方案實施關於
式 I化合物及化合物
1 、 2及
6之PRPT細胞毒性分析。
冷凍保存之人類原代腎近端小管上皮細胞(PRPTEC)係獲自LifeLine Cell Technology (Frederick，MD，目錄號FC-0013)且自人類腎臟組織分離。將來自冷凍保存小瓶之細胞培養於T75燒瓶中之RenaLife完全培養基(LifeLine，Frederick，MD，目錄號LL-0025)中3至4天，隨後在90%匯合之後將細胞接種至分析盤。PRPTEC細胞以5×103個細胞/孔之密度接種於膠原蛋白塗佈之96孔盤中，最終體積為160毫升/孔。在第二天，直接使用HP D300分配器(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)，以低於化合物儲備液濃度200倍之濃度開始且在DMSO恆定量等於0.5%下一式兩份地1:3倍稀釋的程式將化合物添加至細胞盤中。培育5天之後，移除培養基，藉由添加100毫升/孔之CellTiter Glo活力試劑(Promega，Madison，WI，目錄號G7573)量測細胞活力，且在發光盤讀取器(Perkin-Elmer，Waltham，MA)上定量發光信號。
實例 32. GALHEPG2細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試
式 I化合物及化合物
1 、 2及
6在半乳糖調適之HepG2細胞(人類肝癌細胞株)中之細胞毒性。
將細胞在培養基(DMEM (11966)、10% FBS、1% NEAA、0.2%半乳糖、1%丙酮酸酯、1% Glutamax、1% PSG)中稀釋至16.6K個細胞/毫升且以90微升/孔接種至384孔聚-D-離胺酸塗佈之分析盤中，且置放於37℃及5% CO2下之培育箱中。將化合物一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中進行連續稀釋(1:3)。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。細胞接種之後24小時，使用384通道移液器自化合物盤中轉移0.4uL至分析盤中。將分析盤返回至培育箱。5天之後，在添加20uL Cell Titer Glo之前，用80微升/孔之PBS洗滌分析盤。在Envision盤讀取器上讀取分析盤。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
實例 33. GALPC3細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試化合物在半乳糖調適之PC3細胞(人類前列腺癌細胞株)中之細胞毒性。將細胞在培養基(DMEM (11966)、10% FBS、1% NEAA、0.2%半乳糖、1%丙酮酸酯、1% Glutamax、1% PSG)中稀釋至16.6K個細胞/毫升且以90微升/孔接種至384孔聚-D-離胺酸塗佈之分析盤中，且置放於37℃及5% CO
2下之培育箱中。將化合物一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中進行連續稀釋(1:3)。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。細胞接種之後24小時，使用384通道移液器自化合物盤中轉移0.4 uL至分析盤中。將分析盤返回至培育箱。5天之後，在添加20 μL Cell Titer Glo之前，用80微升/孔之PBS洗滌分析盤。在Envision盤讀取器上讀取分析盤。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
實例 34. Huh-7細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試化合物在Huh7細胞(肝癌細胞株)中之細胞毒性。將細胞在培養基(DMEM (15-018-CM)、10% FBS、1% NEAA、1% PSG)中稀釋至16.6K個細胞/毫升且以90微升/孔接種至384孔聚-D-離胺酸塗佈之分析盤中，且置放於37℃及5% CO
2下之培育箱中。將化合物一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中進行連續稀釋(1:3)。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。細胞接種之後24小時，使用384通道移液器自化合物盤中轉移0.4 μL至分析盤中。將分析盤返回至培育箱。5天之後，在添加20 μL Cell Titer Glo之前，用80微升/孔之PBS洗滌分析盤。在Envision盤讀取器上讀取分析盤。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
實例 35. MRC5細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試化合物在MRC5細胞(人類胚胎肺纖維母細胞細胞株)中之細胞毒性。將細胞在培養基(MEM (10-010-CM)、10% FBS、1% PSG)中稀釋至16.6K個細胞/毫升且以90微升/孔接種至384孔聚-D-離胺酸塗佈之分析盤中，且置放於37℃及5% CO
2下之培育箱中。將化合物一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中進行連續稀釋(1:3)。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。細胞接種之後24小時，使用384通道移液器自化合物盤中轉移0.4 μL至分析盤中。將分析盤返回至培育箱。5天之後，在添加20uL Cell Titer Glo之前，用80微升/孔之PBS洗滌分析盤。在Envision盤讀取器上讀取分析盤。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
實例 36.NRVM新生大鼠心肌細胞細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試化合物針對新採集之新生大鼠心肌細胞(NRVM)之細胞毒性。將細胞在培養基(DMEM + 10% FBS+ 1% PSG +1% NEAA)中稀釋至25,000個細胞/毫升，以90微升/孔接種於384孔細胞分析盤中，且在添加化合物之前在37℃及5%CO
2下培育隔夜。藉由一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中連續稀釋(1:3)來製備化合物。經由Biocel (Agilent Technologies)將400奈升/孔之化合物轉移至細胞分析盤中。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。5天之後，藉由Biotek盤洗滌器用100微升/孔PBS洗滌盤1次，且將20 uL Cell Titer Glo添加至各孔中。將盤培育10 min且在EnVision讀取器(Perkin Elmer)上讀取盤。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
實例 37. PBMC細胞毒性分析
以高通量384孔分析形式測試化合物在冷凍保存之人類PBMC中之細胞毒性。將化合物一式四份地在384孔盤中之100% DMSO中進行連續稀釋(1:3)。使用聲波分配器將310 nL之化合物轉移至分析盤中。包括DMSO及2mM嘌呤黴素分別作為陰性對照及陽性對照。將細胞在培養基(RPMI + 10% FBS+ 1% PSG +10mM Hepes + 1%丙酮酸酯+ 0.1% BMe)中稀釋至72K個細胞/毫升，且在以70微升/孔接種至預點樣分析盤之前，使其在37℃及5%CO
2下之培育箱中靜止4小時。5天之後，將25 uL Cell Titer Glo添加至分析盤中。CC
50值定義為產生50%生長抑制之化合物濃度，如發光信號中所量測。使用產生S形曲線擬合之單位點劑量-反應模型在Accord (在線工具)中計算CC
50值。
表 10. 式 I化合物及化合物
1 、 2、
6及
8之比較細胞毒性
所有值以nM為單位。
| 化合物 | CC 50 HEp-2 | CC 50 MT4 | CC 50 NHBE | CC 50 SAEC | CC 50 GALHEPG2 | CC 50 GALPC3 | CC 50 HUH7 | CC 50 MRC5 | CC 50 NRVM | CC 50 PBMC | CC 50 PHH | CC 50 PRPT | |
| 式 I | ＞100000 | 56212.2 | ＞40088.3 | 122900 | ＞88888.9 | ＞44444.4 | ＞88888.9 | ＞44444.4 | 27728.8 | ＞31555.2 | 21170.5 | ＞84410.1 | |
| 1 | ＞91486.2 | 52373.7 | ＞50000 | - | ＞44444.4 | - | ＞44444.4 | ＞44444.4 | ＞44444.4 | 18171.6 | - | - | |
| 2 | ＞95436.2 | ＞43709.5 | 29105.2 | 28300 | ＞44444.4 | - | ＞44444.4 | ＞44444.4 | ＞44444.4 | 4648.39 | - | 23799.4 | |
| 6 | ＞94960.5 | 38830.1 | 24378 | 27200 | ＞88888.9 | ＞83510.8 | 17193.7 | ＞88351.4 | 8094.81 | 4790.88 | 14057.3 | 42263.7 | |
| 8 | ＞100000 | 28291.4 |
上表指示出相比於化合物
1 、 2、
6及
8，
式 I化合物在多個細胞株(NHBE、SAEC、Huh-7、NRVM、PBMC、PHH及PRPT)中展現出更佳的繼發性細胞毒性概況。
實例 38. 血漿穩定性分析
針對血漿穩定性，化合物在37℃下以2 μM培育在食蟹獼猴或人類血漿中，持續至多4 h。在適宜時間點，來自培育之等分試樣藉由添加9體積之補充有內部標準物之100%乙腈來淬滅。最後一次收集之後，將樣品以3000g離心30 min，且將上清液轉移至含有等體積之水的新盤中以藉由與三重四極子質譜分析偶合之液相層析(LC-MS/MS)進行分析。資料(分析物與內部標準物之峰面積比率)以半對數標度繪製且使用指數擬合進行擬合。在假設一級動力學之情況下測定半衰期(T
1/2)。
實例 39 .S9溶離份之穩定性分析
針對S9穩定性，化合物在37℃下以2 μM培育在存在NADPH及UDPGA (第I階段及第II階段輔因子，Sigma-Aldrich)之食蟹獼猴或人類肝臟S9溶離份中，持續至多90 min。在添加化合物之後的適宜時間點，樣品用9體積之含有內部標準物、50%乙腈及25%甲醇之水溶液來淬滅。樣品盤以3000g離心30 min，且藉由LC-MS/MS分析10 μL之所得溶液。資料(分析物與內部標準物之峰面積比率)以半對數標度繪製且使用指數擬合進行擬合。在假設一級動力學之情況下測定半衰期(T
1/2)。
表 11. 式 I化合物相比於化合物
1、
2、
6、
7及
8之穩定性(HepS9及血漿)
| 化合物 | 人類 HepS9 t 1/2(min) | 食蟹獼猴 HepS9 t 1/2(min) | 人類血漿 t 1/2(min) | 食蟹獼猴血漿 t 1/2(min) |
| 式 I | 31 | 26 | 483 | 444 |
| 1 | 12 | - | 667 | - |
| 8 | 2 | - | 361 | - |
| 2 | 12 | 3 | 152 | 289 |
| 6 | 7 | 2 | 131 | 257 |
| 7 | 6 | 2 | 233 | 178 |
上表中之資料顯示相比於化合物
2、
6及
7，
式 I化合物具有更高的半衰期(人類及食蟹獼猴hepS9以及人類及食蟹獼猴血漿)。
實例 40. 熱力學溶解性分析
在室溫下在磷酸鹽緩衝鹽水溶液(pH 7.4)及10 mM鹽酸(pH 2.0)中測定化合物之熱力學溶解性。使用過量的固體化合物以使化合物之水性樣品達至飽和。將試管置於設定為1000 rpm之攪拌器上且在持續攪拌下保持四天。攪拌之後，確認所有試管中存在過量的固體。試管在10,000 rpm下離心5分鐘以移除過量的固體，且將上清液轉移至新的小瓶中。濃度分析藉由UPLC測定且針對內部標準物進行定量。
表 12. 式 I化合物及化合物
5及
6之熱力學溶解性。
| 化合物 | pH 2 溶解性 (µg/mL) | pH 7 溶解性 (µg/mL) |
| 式 I | 4115 | 131 |
| 2 | 3720 | 18 |
| 6 | 3793 | 16 |
如上表中所見，相比於化合物
2及
6，
式 I化合物在pH 2及7下均具有更高的溶解性。
實例 41. NHBE活體外胞內三磷酸酯形成
使用以下方案量測針對
式 I化合物及化合物
6之活體外胞內三磷酸酯形成。正常的人類支氣管呼吸道上皮細胞(NHBE) (25萬個細胞/孔)用10 µM之化合物連續地培育26小時。在選擇時間點(2、4、6及26 h)，自孔中移除胞外培養基，且將細胞用2 mL冰冷的0.9%標準生理鹽水洗滌兩次且萃取至0.5 mL含有100 nM 2-氯-腺苷-5'-三磷酸酯(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)作為內部標準物的冰冷70%甲醇中。樣品在-20℃下儲存隔夜以便於核苷酸萃取，以15,000×g離心15分鐘，且接著將上清液轉移至乾淨的試管中以在MiVac Duo濃縮器(Genevac，Gardiner，NY)中乾燥。乾燥樣品隨後在含有3 mM甲酸銨(pH 5.0)及10 mM二甲基己胺(DMHA)/水的移動相A中復原以藉由LC-MS/MS分析。此等實驗之結果展示於圖1中。
實例 42.PBMC活體外胞內三磷酸酯形成分析
使用以下方案量測針對
式 I化合物及化合物
2及
6之活體外胞內三磷酸酯形成。新分離之PBMC來源於健康供體，且在開始實驗之前，將其懸浮於培養基(含有L-麩醯胺之RPMI 1164)中達至5百萬個細胞/毫升。將PBMC之10 mL等分試樣轉移至50 mL鬆開頂蓋之錐形管中，且添加化合物達至最終濃度為2 µM。隨後將1 mL等分試樣轉移至每樣品之24孔盤之各孔中。PBMC-化合物混合物在37℃/5% CO
2下在輕微攪拌下培育2小時。培育之後，將PBMC在5000 RPM下自旋3 min，且抽取上清液而不干擾細胞沈澱。針對進行立即分析之樣品，將樣品再懸浮於預先冷卻之1×Tris緩衝生理鹽水中且轉移至1.5 mL含有0.5 mL之nyosil M25的錐形管中。隨後將樣品/油等分試樣在13,000 RPM下自旋1min。離心之後，從試管中抽取所有培養基而不干擾油層。將水添加於油層頂部上且重複自旋/抽取過程，接著進行額外水洗滌。在第二洗滌步驟之後，移除所有油及水，且將細胞沈澱速凍於乾冰上且儲存於-80℃下直至進一步處理。不進行立即分析之樣品用無血清培養基洗滌2次，將其再懸浮於1 mL培養基中，且在37℃/5% CO
2下培育，直至藉由前述方案對其進行處理。各PBMC樣品用500 µL乾冰冷萃取緩衝液(70%甲醇，含有0.5 µM氯-腺苷三磷酸酯作為內部標準物)處理。將上述溶液渦旋5分鐘，隨後以20,000×
g離心20分鐘。將上清液轉移至乾淨的1.5 mL埃彭道夫瓶(eppendorf vial)中且負載於離心蒸發器上。乾燥後，將樣品用80 µL之移動相A復原，以20,000×
g離心20分鐘，且將上清液轉移至HPLC注射小瓶中用於分析。將10 μL等分試樣注射至Sciex 6500 LC/MS/MS系統中。基於每樣品之皮莫耳(pmol)化合物構建PBMC之標準校準曲線。隨後將各樣品之值除以樣品中細胞之總數目，得到每一百萬細胞之皮莫耳。隨後使用0.2皮升/細胞之胞內體積推導微莫耳濃度。此等實驗之結果展示於圖2中。
如圖1及2中所見，相比於化合物
2及/或
6，
式 I化合物在NHBE中展現出相等或更佳的活體外胞內NTP (核苷酸三磷酸酯)形成，但在PBMC中展現出更低的活體外胞內NTP形成。此表明相比於化合物
2及/或
6，相對於PBMC，
式 I化合物在NHBE(目標細胞類型)中經歷更具選擇性的代謝。
實例 43. 動物藥物動力學分析
使用以下方案實施針對
式 I化合物及
6之動物PK研究。使用重量約3至6 kg之動物進行所述研究之生活部分。測試物品以12%卡布迪索(captisol)於水中之水溶液pH 3形式以10 mg/kg之體重藉由恆定速率的輸注向雄性食蟹獼猴靜脈內給予30分鐘。在投藥後0.25、0.5、1、1.5、2、4、8及24小時收集血漿樣品且在投藥後2及24小時收集PBMC樣品。
將血液樣品(大約1 mL)收集至預冷藏之含有K
2EDTA的收集管中且在4℃下離心以分離血漿。對於PBMC收集，在室溫下將大約8 mL血液樣品收集至含有肝素鈉之CPT真空管中用於分離。在每次最終收集時，對動物進行麻醉且在動物存活的同時獲取肺臟。移除之後緊接著將收集之肺臟急速冷凍於液氮中。
藉由添加最終濃度為75%的含有5-碘代殺結核菌素作為內部標準物之乙腈來對藥物動力學研究之血漿樣品進行蛋白質沈澱。使用含有0.2%甲酸之移動相及以250 μL/min之流速經7 min自2%至100%乙腈之線性梯度在4 μm 150×2 mm Synergi Max-RP管柱(Phenomenex，Torrance，CA)上分離血漿樣品中之分析物。空白血漿中製得的八點標準曲線涵蓋5.1至5000 nM之濃度且顯示出超過0.99之R2值的的線性度。在各樣品組開始及結束時分析血漿中之120及3,000 nM之單獨製備之質量對照樣品以確保準確性及精確度在20%內。
各PBMC樣品用500 µL含有67 mM乙二胺四乙酸(EDTA)/70%甲醇，及0.5 µM氯-腺苷三磷酸酯作為內部標準物的萃取緩衝液進行處理。將萃取緩衝液在乾冰上冷卻。將上述溶液渦旋5分鐘，隨後以20,000×g離心20分鐘。將上清液轉移至乾淨的1.5 mL埃彭道夫瓶中且負載於離心蒸發器上。乾燥後，將樣品用80 µL之1 mM磷酸銨緩衝液(pH =7)復原，以20,000×
g離心20分鐘，且將上清液轉移至HPLC注射小瓶中用於分析。將10 µL等分試樣注射至API 5000 LC/MS/MS系統中。為計算代謝物之胞內濃度，使用總DNA計數方法(Benech,等人. Peripheral Blood Mononuclear Cell Counting Using a DNA-detection-based Method. 2004年7月1日; 330 (1): 172-4)測定各樣品中之細胞總數目。基於每樣品之皮莫耳化合物構建PBMC之標準校準曲線。隨後將各樣品之值除以樣品中細胞之總數目，得到每一百萬細胞之皮莫耳。隨後使用0.2皮升/細胞之胞內體積推導微莫耳濃度。
肺樣品藉由切割成小塊且分配至預稱重之保持於乾冰上的15 mL錐形管中來製備。將冰冷萃取緩衝液(0.1% KOH及67 mM乙二胺四乙酸/70%甲醇，含有0.5 µM氯-腺苷三磷酸酯作為內部標準物，約2 mL)添加至約0.5 g之各肺樣品中。使用具有一次性的硬性組織均質器探針之Omni-Tip TH
TM(Omni International)對混合物進行迅速均質化。藉由使用0.2µm96孔聚丙烯過濾盤(Varian Captiva
TM)過濾均質物之等分試樣。將濾液蒸發至乾且在LC-MS/MS分析之前用等體積之1 mM磷酸銨緩衝液(pH =7)復原。
核苷三磷酸酯定量使用離子配對的核苷酸偵測LC-MS/MS方法。藉由2.5 μm 2.0×50 mm Luna C18管柱(Phenomenex，Torrance，CA)使用含有3 mM磷酸銨(pH 5)及10 mM二甲基己胺(DMH)之離子配對緩衝液以及以160 μL/min之流速經11 min自10%至50%乙腈的多階段線性梯度來分離分析物。空白血漿中製得的七點標準曲線涵蓋24.0至17.500 nM之濃度且顯示超過0.99之R
2值的的線性度。
此等實驗之結果展示於圖3及下表中。
表 13.以10 mg/kg向雄性食蟹獼猴靜脈內輸注
式 I化合物及化合物
630分鐘之後的肺及PBMC三磷酸酯濃度均值(均值，n=2)。
| 輸注之化合物 | 組織 | 2 h | 24 h |
| 式 I | 肺(nmol/g組織) | 2.88 | 2.01 |
| 式 I | PBMC (µM) | 61.3 | 27.1 |
| 6 | 肺(nmol/g組織) | 2.25 | 1.29 |
| 6 | PBMC (µM) | 169 | 22.4 |
如所見，
式 I化合物在食蟹獼猴PK研究中展現出更高的肺NTP濃度及更低的PBMC NTP濃度。此指示與化合物
6相比，相對於PBMC，
式 I化合物在肺組織中經歷更具選擇性的代謝。
儘管出於清楚理解之目的已藉助於說明及實例相當詳細地描述前述發明，但熟習此項技術者應瞭解，可在所附申請專利範圍之範疇內實踐某些改變及修改。此外，本文中所提供之各參考文獻係以全文引用之方式併入本文中，其併入程度如同各參考文獻單獨以引用的方式併入之程度相同。當本申請案與本文所提供之參考文獻之間存在衝突時，應以本申請案為準。
圖 1.展示具有
式 I化合物及化合物
6之三個供體中的NHBE活體外胞內三磷酸酯形成之量測值。
圖 2.展示具有
式 I化合物及化合物
2及化合物
6之PBMC中的活體外胞內三磷酸酯形成之量測值。
圖 3.展示
式 I化合物及化合物
6之食蟹獼猴藥物動力學資料。
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ucagucaguc agucagucag ucagucaguc agucagucag ucagucaguc agucagucag 60
ucagucaguc agucagucag uccaagucca aguccaaguc caaguccaag uccaagucca 120
aguccaaguc caaguccaag uccaagucca aguccaaguc caagucaguc agucagucag 180
ucagucaguc agucagucag ucagucaguc agucagucag ucagucaguc agucagucag 240
ucag 244
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catccagcaa atacaccatc ca 22
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ttctgcacat cataattagg agtatcaa 28
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cggagcacag gagat 15
Claims (4)
- 一種製造式I-11之化合物的方法：
，與 (ii)式I-12之化合物：
在存在NdCl3及氯化四丁基銨之情況下反應；其中R為羥 基保護基。
- 如請求項1之方法，其中R為苯甲基。
- 如請求項1之方法，其中R為矽基保護基。
- 如請求項3之方法，其中R為三級丁基二甲基矽基(tert-butyldimethylsilyl；TBS)。
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