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ES2640260T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión del Gen alas1 - Google Patents

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del Gen alas1 Download PDF

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ES2640260T3
ES2640260T3 ES13721433.4T ES13721433T ES2640260T3 ES 2640260 T3 ES2640260 T3 ES 2640260T3 ES 13721433 T ES13721433 T ES 13721433T ES 2640260 T3 ES2640260 T3 ES 2640260T3
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ES
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rnai
alas1
porphyria
cell
nucleotide
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Active
Application number
ES13721433.4T
Other languages
English (en)
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Brian Bettencourt
Kevin Fitzgerald
William Querbes
Makiko YASUDA
Robert J. Desnick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de ALAS1, donde el ARNbc comprende: (i). una hebra antisentido complementaria respecto a al menos los nucleótidos 871-889 de la SEQ ID NO: 1; (ii) una hebra sentido que comprende al menos nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1295; y (iii) un ligando que comprende uno o más derivados de tipo N-acetilgalactosamina (GalNAc).

Description

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del Gen alas1
La invención se define mediante las reivindicaciones. Esta se refiere a la inhibición específica de la expresión del gen ALAS1.
Las porfirias hereditarias constituyen una familia de trastornos provocados por la actividad deficiente de enzimas específicas en la vía biosintética del grupo hemo, que también se denomina en la presente vía de las porfirinas. La deficiencia de las enzimas de la vía de las porfirinas conlleva una producción insuficiente del grupo hemo y una acumulación de porfirinas y precursores de estas, que son tóxicos para los tejidos en concentraciones elevadas.
Entre las porfirias heredadas, la porfiria intermitente aguda (AIP, por sus siglas en inglés, p. ej., AIP dominante autosómica), la porfiria variegata (VP, por sus siglas en inglés, p. ej., VP dominante autosómica), coproporfiria hereditaria (coproporfiria o HCP, por sus siglas en inglés, p. ej., HCP dominante autosómica) y la porfiria por deficiencia de ácido 5’-aminolevulínico (también conocido como ácido δ-aminolevulínico o ALA) deshidratasa (ADP, por sus siglas en inglés, p. ej., ADP recesiva autosómica) se clasifican como porfirias hepáticas agudas y se manifiestan mediante ataques neurológicos agudos que pueden resultar mortales. Los ataques agudos se caracterizan por síntomas del sistema nervioso central, autonómico y periférico, que incluyen dolor abdominal intenso, hipertensión, taquicardias, estreñimiento, debilidad motriz, parálisis y convulsiones. Si no se tratan debidamente, pueden provocar tetraplegia, deficiencia respiratoria y defunción. Varios factores, que incluyen los fármacos que inducen el citocromo P450, la dieta y los cambios hormonales, pueden precipitar los ataques agudos mediante el incremento de la actividad de la ácido 5’-aminolevulínico-sintasa 1 hepática (ALAS1), que es la primera enzima, y a la vez la enzima limitante de la velocidad, de la vía biosintética del grupo hemo. En las porfirias agudas,
p. ej., AIP, VP, HCP y ADP, las deficiencias enzimáticas respectivas provocan la producción y la acumulación hepática de una o más sustancias (p. ej., porfirinas y/o precursores de porfirinas, p. ej., ALA y/o PBG) que pueden ser neurotóxicas y que pueden provocar la aparición de ataques agudos. Remítase, p. ej., a Balwani, M y Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
La terapia actual para los ataques neurológicos agudos consiste en la administración intravenosa de hemina (Panhematin®, Lundbeck o Normosang®, Orphan Europe), que proporciona el grupo hemo exógeno para la inhibición por retroalimentación negativa de ALAS1 y, por consiguiente, reduce la producción de ALA y PBG. La hemina se utiliza para el tratamiento durante un ataque agudo y para la prevención de ataques, particularmente en mujeres con porfirias agudas que experimentan ataques frecuentes con los cambios hormonales durante sus ciclos menstruales. Aunque generalmente los pacientes responden bien, su efecto es lento, normalmente lleva de dos a cuatro días o más normalizar las concentraciones de ALA y PBG en orina hasta niveles normales. Debido a que la hemina intravenosa se metaboliza rápidamente, normalmente son necesarias de tres a cuatro infusiones para tratar
o prevenir eficazmente un ataque agudo. Además, las infusiones repetidas pueden provocar una sobrecarga de hierro y flebitis, las cuales pueden dificultar el acceso venoso periférico. Aunque el trasplante de hígado ortotrófico es curativo, este procedimiento presenta una morbidez y una mortalidad significativas y la disponibilidad de donantes de hígado es limitada. Por consiguiente, se necesita una estrategia terapéutica alternativa que sea más eficaz, que actúe rápido y que sea segura. Sería particularmente favorable si un tratamiento de este tipo se pudiera suministrar mediante una administración subcutánea, ya que esto eliminaría la necesidad de infusiones y de una hospitalización prolongada.
La AIP, también denominada deficiencia de porfobilinógeno-desaminasa (PBGD) o deficiencia de hidroximetilbilanosintasa (HMBS), es la porfiria hepática aguda más común. Es un trastorno dominante autosómico provocado por mutaciones en el gen HMBS que dan como resultado una actividad reducida, p. ej., seminormal de la enzima. Previamente, se ha generado por recombinación homóloga un modelo en ratones de AIP que presenta ~30% de actividad HMBS de origen natural. Del mismo modo que los pacientes humanos, estos ratones incrementan la actividad ALAS1 hepática y acumulan grandes cantidades de ALA y PBG urinarias y en plasma cuando se les administran fármacos porfirinogénicos tales como el fenobarbital. Por lo tanto, sirven como un modelo excelente para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos novedosos para las porfirias hepáticas agudas.
Yin et al. (Science 318, 1786-1789 (2007)) describen Rev-erb, un hemosensor que coordina las vías metabólicas y circadianas. Schultz et al. (Silence 2, 3 (2011)) describen que los efectos secundarios dominan un cribado de iARN a gran escala para moduladores de la vía de TGF-[beta]. Estall et al. (PNAS 106, 22510-22515 (2009)) describen que PGC-1 regula de forma negativa la expresión hepática de FGF21. El documento WO 2007/131274 describe ácidos ribonucleicos interferentes cortos para tratar enfermedades alérgicas. El documento EP 1 752 536 describe un polinucleótido que provoca interferencia de ARN.
La presente invención se refiere a un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de ALAS1, donde el ARNbc comprende:
(i)
una hebra antisentido complementaria respecto a al menos los nucleótidos 871-889 de la SEQ ID NO:1;
(ii)
una hebra sentido que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1295; y
(iii) un ligando de uno o más derivados de tipo N-acetilgalactosamina (GalNAc).
La divulgación describe métodos y composiciones de ARNi para modular la expresión de un gen ALAS1. La expresión de un gen ALAS1 se reduce o inhibe utilizando un ARNi específico para ALAS1. Tal inhibición puede ser útil en el tratamiento de trastornos relacionados con la expresión de ALAS1 tales como las porfirias.
Por consiguiente, en la presente se describen composiciones y métodos que producen la escisión mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés) de transcritos de ARN del gen ALAS1, por ejemplo, en una célula o en un sujeto (p. ej., en un mamífero tal como un sujeto humano). También se describen composiciones y métodos para tratar un trastorno relacionado con la expresión de un gen ALAS1, tal como una porfiria, p. ej., anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA, por sus siglas en inglés), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss o ADP, por sus siglas en inglés), porfiria intermitente aguda (AIP, por sus siglas en inglés), porfiria eritropoyética congénita (CEP, por sus siglas en inglés), porfiria cutánea tardía (PCT), coproporfiria hereditaria (coproporfiria o HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoyética (EPP, por sus siglas en inglés) o eritroporfiria transitoria de la infancia. El trastorno puede ser una porfiria hepática aguda, p. ej., una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP), AIP, HCP o VP. El trastorno puede ser una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) o AIP.
En algunas realizaciones, la porfiria es una porfiria hepática, p. ej., una porfiria seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria dual.
Las expresiones "ARNi", "iARN", "agente de ARNi" o "agente de iARN", tal como se utilizan en la presente, se refieren a un agente que contiene ARN, tal como se define este término en la presente, y el cual media la escisión dirigida de un transcrito de ARN, p. ej., mediante una vía del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNi, tal como se describe en la presente, ejerce la inhibición de la expresión de ALAS1 en una célula o mamífero.
Los ARNi incluidos en las composiciones que se exponen en la presente engloban un ARNbc que tiene una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región, p. ej., una región con una longitud de 30 nucleótidos o inferior, generalmente de 19-24 nucleótidos, que es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen ALAS1 (p. ej., un gen ALAS1 humano o de ratón) (también denominado en la presente "ARNi específico para ALAS1"). Como alternativa o de forma combinada, los ARNi engloban un ARNbc que tiene una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región con una longitud de 30 nucleótidos o inferior, generalmente de 19-24 nucleótidos, que es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen ALAS1 (p. ej., una variante humana 1 o 2 de un gen ALAS1) (también denominado en la presente "ARNi específico para ALAS1").
El ARNi (p. ej., ARNbc) descrito en la presente puede comprender una hebra antisentido que tiene una región que es sustancialmente complementaria respecto a una región de un ALAS1 humano. El gen ALAS1 humano puede presentar la secuencia de NM_000688.4 (SEQ ID NO:1) o NM_000688.5 (SEQ ID NO:382).
Un ARNi puede englobar un ARNbc que tiene una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que es sustancialmente complementaria respecto a una porción de un ARNm de ALAS1 de acuerdo con cualquiera de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. El ARNi puede englobar un ARNbc que tiene una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región que es sustancialmente complementaria respecto a una porción de un ARNm de ALAS1, p. ej., un ARNm de ALAS1 humano (p. ej., un ARNm de ALAS1 humano como el que se proporciona en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:382).
Un ARNi para inhibir la expresión de un gen ALAS1 incluye al menos dos secuencias que son complementarias entre sí. El ARNi incluye una hebra sentido que tiene una primera secuencia y una hebra antisentido que tiene una segunda secuencia. La hebra antisentido incluye una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un ARNm que codifica un transcrito de ALAS1, y la región de complementariedad tiene una longitud de 30 nucleótidos o inferior, y de al menos 15 nucleótidos. Generalmente, el ARNi tiene una longitud de 19-24 nucleótidos.
El ARNi puede tener una longitud de 19-21 nucleótidos. El ARNi puede tener una longitud de 19-21 nucleótidos y se encuentra en una formulación lipídica, p. ej., una formulación de nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) (p. ej., una formulación LNP11).
El ARNi puede tener una longitud de 21-23 nucleótidos. El ARNi puede tener una longitud de 21-23 nucleótidos y se encuentra en forma de conjugado, p. ej., conjugado con uno o más derivados de tipo GalNAc según se describe en la presente.
El ARNi puede tener una longitud comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos o una longitud comprendida entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30 nucleótidos. Un ARNi que tenga ALAS1 como diana, cuando entra en contacto con una célula que expresa ALAS1, inhibe la expresión de un gen ALAS1 al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35% o al menos un 40% o más, tal como se evalúa utilizando un método como los que se describen en la presente. El ARNi que tiene ALAS1 como diana se puede formular en una partícula de ácido nucleico-lípido estable (SNALP, por sus siglas en inglés).
Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente incluye una primera secuencia de un ARNbc que se selecciona a partir del grupo constituido por las secuencias sentido de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15 y una segunda secuencia que se selecciona a partir del grupo constituido por las secuencias antisentido correspondientes de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15.
Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente incluye una primera secuencia de un ARNbc que se selecciona a partir del grupo constituido por las secuencias sentido de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20 y una segunda secuencia que se selecciona a partir del grupo constituido por las secuencias antisentido correspondientes de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20. Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente puede tener las secuencias sentido y/o antisentido seleccionadas entre las de AD-58882, AD-58878, AD58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD59122, AD-59106, AD-59126 y AD-59107 tal como se describe en la presente en los Ejemplos. El ARNi (p. ej., ARNbc) puede tener las secuencias sentido y/o antisentido seleccionadas entre las de AD-58882, AD-58878, AD58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 y AD-59129.
Las moléculas de ARNi que se exponen en la presente pueden incluir nucleótidos de origen natural o pueden incluir al menos un nucleótido modificado, que incluye, sin carácter limitante, un nucleótido con una modificación de tipo 2'O-metilo, un nucleótido con un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de tipo colesterilo. Como alternativa, el nucleótido modificado se puede seleccionar a partir del grupo constituido por: un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido que no sea básico, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-amino, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-alquilo, un nucleótido de tipo morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base que no sea natural. Una secuencia modificada de este tipo se puede basar, p. ej., en una primera secuencia de dicho ARNi seleccionada a partir del grupo constituido por las secuencias sentido de la Tabla 2 y una segunda secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por las secuencias antisentido correspondientes de la Tabla 2.
Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente puede comprender una hebra sentido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:342, SEQ ID NO:344, SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:356, SEQ ID NO:358, SEQ ID NO:362, SEQ ID NO:366, SEQ ID NO:376 y SEQ ID NO:380.
Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente puede comprender una hebra antisentido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:335, SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:345, SEQ ID NO:347, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:363, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:377 y SEQ ID NO:381.
Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente puede comprender una hebra sentido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:166, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:186 y SEQ ID NO:190. Un ARNi (p. ej., un ARNbc) que se expone en la presente puede comprender una hebra antisentido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo constituido por la SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:187 y SEQ ID NO:191.
Un ARNi según se describe en la presente puede tener como diana una variante de un transcrito de ARN de ALAS1 de origen natural y, en otra realización, el ARNi tienen como diana un transcrito mutado (p. ej., un ARN de ALAS1 portador de una variante alélica). Por ejemplo, un ARNi puede tener como diana una variante polimórfica tal como un polimorfismo de un único nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) de ALAS1. El ARNi puede tener como diana tanto un transcrito de ALAS1 mutado como uno de origen natural. El ARNi puede tener como diana una variante de un transcrito particular de ALAS1 (p. ej., la variante 1 de ALAS1 humano). El agente de ARNi puede tener como diana múltiples variantes del transcrito (p. ej., tanto la variante 1 como la variante 2 de ALAS1 humano).
Un ARNi puede tener como diana una región no codificante de un transcrito de ARN de ALAS1 tal como la región no traducida 5’ o 3’ de un transcrito.
Un ARNi según se describe en la presente se encuentra en forma de conjugado, p. ej., un conjugado con un carbohidrato, el cual puede actuar como un resto y/o ligando de direccionamiento, según se describe en la presente. El conjugado puede estar unido al extremo 3’ de la hebra sentido del ARNbc. El conjugado puede estar unido mediante un conector, p. ej., mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
El conjugado puede comprender uno o más derivados de tipo N-acetilgalactosamina (GalNAc). Tal conjugado también se denomina en la presente conjugado de tipo GalNAc. El conjugado puede dirigir el agente de iARN hacia una célula particular, p. ej., una célula hepática, p. ej., un hepatocito. Los derivados de tipo GalNAc se pueden unir mediante un conector, p. ej., un conector ramificado bivalente o trivalente. El conjugado puede ser
OH
HO O
HH
O
N
N O
HO AcHN
O OH
HO
O O
HH
N
NO
O
HO AcHN
O OO
OH
HO O O
HO
N
N O
HH
AcHN
O .
El agente de iARN puede estar unido al conjugado de tipo carbohidrato mediante un conector, p. ej., un conector como el que se muestra en la siguiente representación esquemática, donde X es O o S
X puede ser O. X puede ser S.
10 En algunas realizaciones, el agente de iARN se conjuga a L96 según se define en la Tabla 1 y se muestra a continuación
En un aspecto, se proporciona en la presente una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen ALAS1 en un organismo, generalmente un sujeto humano. La composición incluye normalmente uno o más de los
15 ARNi descritos en la presente y un portador o vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. La composición se puede utilizar para tratar una porfiria, p. ej., AIP.
Se describe un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de ALAS1, donde dicho ARNbc comprende una hebra sentido y una hebra antisentido con una longitud de 15-30 pares de bases y la hebra antisentido es complementaria respecto a al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o 382.
Se describe un ARNi bicatenario (ARNbc) que comprende una hebra sentido complementaria respecto a una hebra antisentido, donde dicha hebra antisentido comprende una región de complementariedad respecto a un transcrito de ARN de ALAS1, donde cada hebra tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos, donde dicho agente de iARN bicatenario se representa mediante la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na -(X X X)i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na -nq 3'
antisentido: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′ 5' (III) donde: i, j, k, y l son cada uno independientemente 0 o 1; p, p’, q y q′ son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na′ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos, los cuales están modificados o no modificados, o combinaciones de estos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb′ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos, los cuales están modificados o no modificados, o combinaciones de estos;
cada np, np′, nq y nq′ representa independientemente un nucleótido protuberante; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ y Z′Z′Z′ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos;
las modificaciones en Nb difieren de la modificación en Y y las modificaciones en Nb′ difieren de la modificación en Y′. La hebra sentido puede estar conjugada con al menos un ligando. Se describe que i es 1; j es 1; o tanto i como j son 1. Se describe que k es 1; l es 1; o tanto k como l son 1. Se describe que XXX es complementario respecto a X′X′X′, YYY es complementario respecto a Y′Y′Y′ y ZZZ es
complementario respecto a Z′Z′Z′. Se describe que el motivo Y′Y′Y′ se encuentra en las posiciones 11, 12 y 13 de la hebra antisentido del extremo 5'. Se describe que Y′ es 2′-O-metilo. Se describe que la región dúplex tiene una longitud de 15-30 pares de nucleótidos. Se describe que la región dúplex tiene una longitud de 17-23 pares de nucleótidos. Se describe que la región dúplex tiene una longitud de 19-21 pares de nucleótidos. Se describe que la región dúplex tiene una longitud de 21-23 pares de nucleótidos. Se describe que las modificaciones de los nucleótidos se seleccionan a partir del grupo constituido por LNA, HNA,
CeNA, 2-metoxietilo, 2-O-alquilo, 2-O-alilo, 2-C-alilo, 2-fluoro, 2-desoxi, 2’-hidroxilo y combinaciones de estas. Se describe que las modificaciones de los nucleótidos son 2-O-metilo, 2-fluoro o ambas. Se describe que el ligando comprende un carbohidrato. Se describe que el ligando está unido mediante un conector. Se describe que el conector es un conector ramificado bivalente o trivalente. Se describe que el ligando es
OH
HO O
HH
O
N
N O
HO AcHN
O OH
HO
O O
HH
N
NO
O
HO AcHN
O OO
OH
HO O O
HO
N
N O
HHAcHN O.
Se describe que el ligando y el conector son como se muestran en la Fórmula XXIV:
OH
HO O
HH HO
O
N
N O HO AcHN
O OH
OHO
ON O
H
HH HO
NO N N O
O AcHN
O OH
O OO
HO O
HO
O
N
N O AcHN
HH
O
Se describe que el ligando está unido al extremo 3’ de la hebra sentido.
El ARNbc puede tener (p. ej., comprender) una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 2 y 3. El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8 y 9. El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15. El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20. El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos que se describe en la Tabla 18. El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 14 y 15.
El ARNbc puede tener una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de secuencias proporcionadas en las Tablas 3 y 8.
En un aspecto adicional, un ARNi proporcionado en la presente es un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de ALAS1, donde dicho ARNbc comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, comprendiendo la hebra antisentido una región de complementariedad respecto a un transcrito de ARN de ALAS1, donde la hebra antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que no difieren en más de 3 nucleótidos de una de las secuencias antisentido enumeradas en cualquiera de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. Las secuencias sentido y antisentido se pueden seleccionar entre las de los dúplex AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 y AD-59107 según se describe en la presente en los Ejemplos. Las secuencias sentido y antisentido se pueden seleccionar entre las de los dúplex AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 y AD-59129. Las secuencias sentido y antisentido pueden ser las del dúplex AD-58632. Las secuencias sentido y antisentido se pueden seleccionar entre las de los dúplex AD-59453, AD-59395, AD-59477 y AD-59492. Las secuencias sentido y antisentido pueden ser las de un dúplex descrito en la presente que suprime la expresión del ARNm de ALAS1 al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o 90%, p. ej., según se evalúa utilizando un ensayo descrito en los Ejemplos que se proporcionan en la presente.
En algunas realizaciones, el ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado.
En algunas realizaciones, al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona a partir del grupo constituido por: un nucleótido con una modificación de tipo 2'-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de tipo colesterilo o un grupo de tipo bisdecilamida del ácido dodecanoico.
En algunas realizaciones, el nucleótido modificado se selecciona a partir del grupo constituido por: un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido que no sea básico, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-amino, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-alquilo, un nucleótido de tipo morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base que no sea natural.
Se describe que la región de complementariedad tiene una longitud de al menos 17 nucleótidos.
Se describe que la región de complementariedad tiene una longitud comprendida entre 19 y 21 nucleótidos.
Se describe que la región de complementariedad tiene una longitud de 19 nucleótidos.
Se describe que cada hebra tiene una longitud que no es superior a 30 nucleótidos.
Se describe que al menos una hebra comprende una protuberancia 3’ de al menos 1 nucleótido.
Se describe que al menos una hebra comprende una protuberancia 3’ de al menos 2 nucleótidos.
Se describe que un ARNbc descrito en la presente comprende además un ligando.
Se describe que el ligando es un ligando de tipo GalNAc.
Se describe que el ligando dirige el ARNbc hacia los hepatocitos.
Se describe que el ligando está conjugado con el extremo 3’ de la hebra sentido del ARNbc.
Se describe que la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de la Tabla 2 o la Tabla 3. Se describe que la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 o 15. Se describe que la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. Se describe que la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada entre las de AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 o AD-59107 tal como se describe en la presente en los Ejemplos. Se describe que la región de complementariedad está constituida por la secuencia antisentido del dúplex AD-58632. En algunas realizaciones, la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada entre las de AD-59453, AD-59395, AD-59477 y AD-59492. Se describe que la región de complementariedad está constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de un dúplex descrito en la presente que suprime la expresión del ARNm de ALAS1 al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o 90%, p. ej., según se evalúa utilizando un ensayo descrito en los Ejemplos que se proporcionan en la presente.
Se describe que el ARNbc comprende una hebra sentido constituida por una secuencia de hebra sentido seleccionada a partir de la Tabla 2 o la Tabla 3, y una hebra antisentido constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de la Tabla 2 o la Tabla 3.
Se describe que el ARNbc comprende una hebra sentido constituida por una secuencia de hebra sentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 o 15, y una hebra antisentido constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 o 15. En algunas realizaciones, el ARNbc comprende un par de secuencias sentido y antisentido correspondientes seleccionadas a partir de las de los dúplex descritos en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15.
Se describe que el ARNbc comprende una hebra sentido constituida por una secuencia de hebra sentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20, y una hebra antisentido constituida por una secuencia antisentido seleccionada a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. Se describe que el ARNbc comprende un par de secuencias sentido y antisentido correspondientes seleccionadas a partir de las de los dúplex descritos en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20.
En un aspecto, la invención proporciona una célula que contiene al menos uno de los ARNbc de la invención. La célula es generalmente una célula de mamífero tal como una célula humana. La célula puede ser una célula eritroide. La célula puede ser una célula hepática (p. ej., un hepatocito).
En un aspecto, se proporciona en la presente una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen ALAS1, comprendiendo la composición un ARNbc de la invención.
En relación con las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, el ARNi (p. ej., ARNbc) se puede administrar en una solución no tamponada. La solución no tamponada puede ser solución salina o agua.
En relación con las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, el ARNi (p. ej., ARNbc) se puede administrar con una solución tampón. La solución tapón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o
fosfato o cualquier combinación de estos. La solución tampón puede ser una solución salina tamponada con fosfato (PBS).
En relación con las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, el ARNi (p. ej., ARNbc) se puede dirigir hacia los hepatocitos.
En relación con las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, la composición se puede administrar por vía intravenosa.
En relación con las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, la composición se puede administrar por vía subcutánea.
Una composición farmacéutica puede comprender un ARNi (p. ej., ARNbc) descrito en la presente que comprende un ligando (p. ej., un ligando de tipo GalNAc) que dirige el ARNi (p. ej., ARNbc) hacia los hepatocitos.
Una composición farmacéutica puede comprender un ARNi (p. ej., ARNbc) descrito en la presente que comprende un ligando (p. ej., un ligando de tipo GalNAc) y la composición farmacéutica se administra por vía subcutánea. El ligando puede dirigir el ARNi (p. ej., ARNbc) hacia los hepatocitos.
Una composición farmacéutica, p. ej., una composición descrita en la presente, puede incluir una formulación lipídica. El agente de iARN puede ser una formulación LNP, p. ej., una formulación MC3. La formulación LNP puede dirigir el agente de iARN hacia una célula particular, p. ej., una célula hepática, p. ej., un hepatocito. La formulación lipídica puede ser una formulación LNP11. La composición se puede administrar por vía intravenosa.
La composición farmacéutica se puede formular para ser administrada de acuerdo con una pauta posológica descrita en la presente, p. ej., no más de una vez cada cuatro semanas, no más de una vez cada tres semanas, no más de una vez cada dos semanas o no más de una vez por semana. La administración de la composición farmacéutica se puede mantener durante un mes o más, p. ej., uno, dos, tres o seis meses, o un año o más.
Una composición que contiene un ARNi que se expone en la invención, es decir un ARNbc que tiene ALAS1 como diana, se puede administrar con un agente terapéutico que no sea un ARNi tal como un agente conocido por tratar una porfiria (p. ej., AIP) o un síntoma de una porfiria (p. ej., dolor). Una composición que contiene un ARNi que se expone en la invención, es decir un ARNbc que tiene AIP como diana, se puede administrar junto con un régimen terapéutico que no sea un ARNi tal como hemina o glucosa (p. ej., una infusión de glucosa (p. ej., glucosa IV)). Por ejemplo, un ARNi que se expone en la invención se puede administrar antes, después o de forma simultánea con glucosa, dextrosa o un tratamiento similar que sirva para restablecer el equilibrio energético (p. ej., nutrición parenteral total). Un ARNi que se expone en la invención también se puede administrar antes, después o de forma simultánea con la administración de un producto de tipo hemo (p. ej., hemina, arginato de hemo o albumina que contenga hemo) y opcionalmente también se puede administrar combinado con glucosa (p. ej., glucosa IV) o similares.
Normalmente, la glucosa administrada para el tratamiento de una porfiria se administra por vía intravenosa (IV). La administración de glucosa por vía intravenosa se denomina en la presente "glucosa IV". Sin embargo, también se contemplan opciones alternativas en las cuales la glucosa se administre por otros medios.
Un ARNi de ALAS1 se puede administrar a un paciente y a continuación se administra el agente o régimen terapéutico que no sea un ARNi (p. ej., glucosa y/o un producto de tipo hemo) al paciente (o viceversa). El ARNi de ALAS1 y el agente terapéutico o régimen terapéutico que no sea un ARNi se pueden administrar de forma simultánea.
En la presente se describe un método para inhibir la expresión de ALAS1 en una célula, comprendiendo el método:
(a)
introducir en la célula un ARNi (p. ej., un ARNbc) descrito en la presente y (b) mantener la célula del paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen ALAS1, de este modo se inhibe la expresión del gen ALAS1 en la célula.
En la presente se describe un método para reducir o inhibir la expresión de un gen ALAS1 en una célula (p. ej., una célula eritroide o una célula hepática tal como, p. ej., un hepatocito). El método incluye:
(a)
introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), donde el ARNbc incluye al menos dos secuencias que son complementarias entre sí. El ARNbc tiene una hebra sentido que tiene una primera secuencia y una hebra antisentido que tiene una segunda secuencia; la hebra antisentido tiene una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria respecto a al menos una parte de un ARNm que codifica ALAS1, y donde la región de complementariedad tiene una longitud de 30 nucleótidos o inferior, es decir, 15-30 nucleótidos, y generalmente tiene una longitud de 19-24 nucleótidos, y donde el ARNbc, cuando entra en contacto con una célula que expresa ALAS1, inhibe la expresión del gen ALAS1 al menos un 10%, p. ej., al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o más; y
(b) mantener la célula del paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen ALAS1, de este modo se reduce o inhibe la expresión de un gen ALAS1 en la célula.
En relación con los métodos anteriores para inhibir la expresión de ALAS1 en una célula, la célula se trata ex vivo, in vitro o in vivo. La célula puede ser un hepatocito.
La célula puede estar presente en un sujeto que necesita tratar, prevenir y/o gestionar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1.
El trastorno puede ser una porfiria. La porfiria puede ser una porfiria intermitente aguda o una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa.
En algunas realizaciones, la porfiria es una porfiria hepática, p. ej., una porfiria seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria dual.
La expresión de ALAS1 se puede inhibir al menos un 30%.
El ARNi (p. ej., ARNbc) puede presentar una CI50 comprendida en el intervalo de 0.01-1 nM.
La célula (p. ej., el hepatocito) puede ser una célula de mamífero (p. ej., una célula humana, de primate no humano
o de roedor).
La célula se puede tratar ex vivo, in vitro o in vivo (p. ej., la célula está presente en un sujeto (p. ej., un paciente que necesita tratar, prevenir y/o gestionar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1)).
El sujeto puede ser un mamífero (p. ej., un ser humano) que corre el riesgo de parecer una porfiria o al cual se le ha diagnosticado una porfiria, p. ej., anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss o ADP), porfiria intermitente aguda (AIP), porfiria eritropoyética congénita (CEP), porfiria cutánea tardía (PCT), coproporfiria hereditaria (coproporfiria o HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoyética (EPP) o eritroporfiria transitoria de la infancia. El trastorno puede ser una porfiria hepática aguda, p. ej., una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP), AIP, HCP o VP. El trastorno puede ser una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) o AIP.
En algunas realizaciones, la porfiria es una porfiria hepática, p. ej., una porfiria seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria dual.
El ARNbc introducido puede reducir o inhibir la expresión de un gen ALAS1 en la célula.
El ARNbc introducido puede reducir o inhibir la expresión de un gen ALAS1, o el nivel de una o más porfirinas o precursores de porfirinas (p. ej., ácido δ-aminolevulínico (ALA), porfopilinógeno (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinógeno I o III, coproporfirinógeno I o III, protoporfrinógeno IX y protoporfirina IX) o productos o metabolitos de porfirinas, al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o más en comparación con una referencia (p. ej., una célula no tratada o una célula tratada con un ARNbc de control que no actúe sobre la diana). Sin pretender vincularse a ninguna teoría, ALAS1 es la primera enzima de la vía de las porfirinas. Por lo tanto, es probable que la reducción de la expresión del gen ALAS1 reduzca el nivel de uno o más precursores de porfirinas, porfirinas o productos o metabolitos de porfirinas.
En otros aspectos, la divulgación proporciona métodos para tratar, prevenir o gestionar procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1 (p. ej., procesos patológicos en los que participan porfirinas, precursores de porfirinas o defectos en la vía de las porfirinas tales como, por ejemplo, las porfirias). El método puede incluir administrar a un sujeto, p. ej., un paciente que necesite tal tratamiento, prevención o gestión, una cantidad eficaz (p. ej., terapéutica o profilácticamente eficaz) de uno o más de los ARNi que se exponen en la presente.
En la presente se describe un método para tratar y/o prevenir un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 que comprende administrar a un sujeto que necesite tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNi (p. ej., un ARNbc) descrito en la presente o una composición que comprenda un ARNi (p. ej., un ARNbc) descrito en la presente.
En la presente se describe un método para tratar y/o prevenir una porfiria que comprende administrar a un sujeto que necesite tal tratamiento un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), donde dicho ARNbc comprende una hebra sentido y una hebra antisentido con una longitud de 15-30 pares de bases y la hebra antisentido es complementaria respecto a al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:382.
El sujeto (p. ej., el paciente) puede padecer una porfiria. El sujeto (p. ej., el paciente) puede correr el riesgo de desarrollar una porfiria. La administración del ARNi que tiene ALAS1 como diana puede aliviar o reducir la gravedad de al menos un síntoma de un trastorno relacionado con ALAS1 en el paciente.
El sujeto puede ser un mamífero (p. ej., un ser humano) que corre el riesgo de parecer o al cual se le ha diagnosticado un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1, p. ej., una porfiria, p. ej., anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss), porfiria intermitente aguda (AIP), porfiria eritropoyética congénita (CEP), porfiria cutánea tardía (PCT), coproporfiria hereditaria (coproporfiria o HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoyética (EPP) o eritroporfiria transitoria de la infancia. La porfiria puede ser una porfiria hepática aguda, p. ej., una porfiria debida a la deficiencia de ALAdeshidratasa (ADP), AIP, HCP o VP. El trastorno puede ser una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) o AIP.
El sujeto puede padecer o correr el riesgo de desarrollar una porfiria. La porfiria puede ser una porfiria hepática, p. ej., una porfiria seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. La porfiria puede ser una porfiria dual.
Una porfiria, un síntoma de porfiria, un pródromo o un ataque de porfiria puede ser inducido por la exposición a un factor precipitante, según se describe en la presente. El factor precipitante puede ser la exposición a un agente químico. El factor precipitante puede ser un fármaco, p. ej., un fármaco con receta o un fármaco sin receta. El factor precipitante puede ser el ciclo menstrual, p. ej., una fase particular del ciclo menstrual, p. ej., la fase luteínica.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra después de un ataque agudo de porfiria.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra durante un ataque agudo de porfiria.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra profilácticamente para prevenir un ataque agudo de porfiria.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se formula como una formulación LNP.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se encuentra en forma de un conjugado de tipo GalNAc.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se administra con una dosis de 0.05-50 mg/kg.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se administra con una concentración de 0.01 mg/kg-5 mg/kg de peso corporal del sujeto.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se formula como una formulación LNP y se administra con una dosis de 0.05-5 mg/kg.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) se encuentra en forma de un conjugado de tipo GalNAc y se administra con una dosis de 0.5-50 mg/kg.
Se describe que el método reduce el nivel de una porfirina o de un precursor de una porfirina en el sujeto.
Se describe que el nivel se reduce al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. En una realización, el nivel se reduce al menos un 30%.
Se describe que el precursor de porfirina es ácido δ-aminolevulínico (ALA) o porfopilinógeno (PBG).
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) presenta una CI50 comprendida en el intervalo de 0.01-1 nM.
Un método descrito en la presente
(i)
mejora un síntoma asociado con un trastorno relacionado con ALAS1 (p. ej., una porfiria),
(ii)
inhibe la expresión de ALAS1 en el sujeto,
(iii)
reduce el nivel de un precursor de porfirina (p. ej., ALA o PBG) o una porfirina en el sujeto,
(iv)
reduce la frecuencia de ataques agudos de síntomas asociados con una porfiria en el sujeto, o
(v)
reduce la incidencia de ataques agudos de síntomas asociados con una porfiria en el sujeto cuando el
Se describe que el método mejora el dolor y/o una neuropatía progresiva.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra de acuerdo con una pauta posológica.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra antes de un ataque agudo de porfiria o después de este. Se describe que el ARNi se administra antes de un ataque agudo de porfiria.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra durante un pródromo. Se describe que el pródromo se caracteriza por dolor abdominal, náusea, síntomas psicológicos (p. ej., ansiedad), inquietud y/o insomnio.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra durante una fase particular del ciclo menstrual, p. ej., durante la fase luteínica.
Se describe que el método mejora o previene ataques cíclicos de porfiria, p. ej., reduciendo la intensidad, duración o frecuencia de los ataques. Se describe que los ataques cíclicos se asocian con un factor precipitante. Se describe que el factor precipitante es el ciclo menstrual, p. ej., una fase particular del ciclo menstrual, p. ej., la fase luteínica.
Se describe que el sujeto presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG. Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., una porfiria hepática. Se describe que el sujeto no presenta síntomas. Se describe que el sujeto es portador de una alteración genética (p. ej., una mutación génica) asociada con una porfiria, según se describe en la presente.
Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria y sufre dolor (p. ej., dolor crónico, p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el sujeto no padece ataques agudos pero sufre dolor (p. ej., dolor crónico, p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el dolor es dolor abdominal.
Se describe que el sujeto (a) presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG y (b) sufre dolor (p. ej., dolor crónico, p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el dolor es dolor abdominal.
Se describe que el sujeto presenta un nivel en plasma y/o un nivel en orina de ALA y/o PBG que es elevado. Se describe que el nivel elevado de ALA y/o PBG viene acompañado de otros síntomas, p. ej., dolor (p. ej., dolor crónico, p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el dolor es dolor abdominal. Se describe que el sujeto no presenta síntomas. Se describe que el sujeto tiene una mutación genética asociada con una porfiria, p. ej., una mutación según se describe en la presente.
Se describe que el sujeto presenta un nivel (p. ej., un nivel en plasma o un nivel en orina) de un precursor de porfirina, p. ej., ALA y/o PBG, que es elevado, p. ej., el nivel es superior a un valor de referencia, o superior o igual a un valor de referencia. Se describe que el nivel es superior al valor de referencia. Se describe que el valor de referencia se encuentra dos desviaciones estándar por encima del nivel medio de una muestra de individuos sanos. Se describe que el valor de referencia es un límite de referencia superior.
Se describe que el sujeto presenta un nivel en plasma y/o un nivel en orina de ALA y/o PBG superior a, o superior o igual a, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces el valor del límite de referencia superior. La expresión "límite de referencia superior", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un nivel que representa el límite superior del intervalo de confianza del 95% para una muestra de referencia, p. ej., una muestra de individuos sanos o normales
(p. ej., de origen natural), p. ej., individuos que no son portadores de ninguna mutación genética asociada con una porfiria y/o individuos que no padecen ninguna porfiria. Se describe que el sujeto presenta un nivel en orina de ALA y/o PBG superior a 2-4 veces el valor del límite de referencia superior. Se describe que el sujeto presenta un nivel en orina de ALA y/o PBG superior a 4 veces el valor del límite de referencia superior.
Se describe que el valor de referencia para PBG en plasma es de 0.12 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en plasma superior a, o superior o igual a, 0.12 µmol/L, 0.24 µmol/L, 0.36 µmol/L, 0.48 µmol/L o 0.60 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en plasma superior a, o superior o igual a, 0.48 µmol/L.
Se describe que el valor de referencia para PBG en orina es de 1.2 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior a, o superior o igual a, 1.2 mmol/mol de creatinina, 2.4 mmol/mol de creatinina, 3.6 mmol/mol de creatinina, 4.8 mmol/mol de creatinina o 6.0 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior a, o superior o igual a, 4.8 mmol/mol de creatinina.
Se describe que el valor de referencia para ALA en plasma es de 0.12 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en plasma superior a, o superior o igual a, 0.12 µmol/L, 0.24 µmol/L, 0.36
µmol/L, 0.48 µmol/L o 0.60 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en plasma superior a, o superior o igual a, 0.48 µmol/L.
Se describe que el valor de referencia para ALA en orina es de 3.1 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en orina superior a, o superior o igual a, 3.1 mmol/mol de creatinina, 6.2 mmol/mol de creatinina, 9.3 mmol/mol de creatinina, 12.4 mmol/mol de creatinina o 15.5 mmol/mol de creatinina.
Se describe que el método reduce un nivel elevado de ALA y/o PBG. Se describe que el método reduce el dolor (p. ej., dolor crónico, p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el dolor es dolor abdominal. En algunas realizaciones, el dolor es dolor neuropático (p. ej., dolor asociado con la neuropatía progresiva de porfirias agudas). La reducción del dolor puede incluir, p. ej., la prevención del dolor, el retraso del inicio del dolor, la reducción de la frecuencia del dolor y/o la reducción de la intensidad del dolor.
Se describe que el método mejora o previene ataques agudos de porfiria, p. ej., reduciendo la intensidad, duración o frecuencia de los ataques.
Se describe que el método reduce o previene lesiones nerviosas.
Se describe que el método previene el deterioro (p. ej., previene el desarrollo de anomalías) de medidas clínicas o provoca una mejora de estas, p. ej., medidas clínicas de la función muscular y/o nerviosa, p. ej., EMG y/o velocidades de conducción nerviosa.
Se describe que el método es eficaz para reducir el nivel de ALA y/o PBG (p. ej., el nivel en plasma u orina de ALA y/o PBG). Se describe que el método es eficaz para producir una reducción predeterminada del nivel elevado de ALA y/o PBG.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción hasta un valor que es inferior o igual a un valor de referencia. Se describe que el valor de referencia es un límite de referencia superior. Se describe que el valor de referencia es el valor que corresponde a dos desviaciones estándar por encima del nivel medio de una muestra de referencia.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra repetidamente, p. ej., de acuerdo con una pauta posológica.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra profilácticamente a un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una porfiria. Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra profilácticamente empezando en la pubertad. Se describe que el sujeto es portador de una mutación genética asociada con una porfiria y/o presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG (p. ej., un nivel elevado en plasma u orina de ALA y/o PBG). Se describe que la mutación hace que el individuo sea susceptible de padecer un ataque agudo (p. ej., tras la exposición a un factor precipitante, p. ej., un fármaco, el seguimiento de un régimen u otro factor precipitante, p. ej., un factor precipitante como los que se describen en la presente). Se describe que la mutación se asocia con unos niveles elevados de una porfirina o un precursor de porfirina (p. ej., ALA y/o PBG). Se describe que la mutación se asocia con dolor crónico (p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva).
Se describe que la mutación es una mutación en el gen ALAS1. Se describe que la mutación es una mutación en el promotor del gen ALAS1 o en regiones en dirección 5' o dirección 3' del gen ALAS1. Se describe que la mutación es una mutación en factores de transcripción u otros genes que interaccionan con ALAS1. Se describe que la mutación es una mutación en un gen que codifica una enzima en la vía biosintética del grupo hemo.
Se describe que el ARNi (p. ej., ARNbc) o la composición que comprende el ARNi se administra por vía subcutánea. Se describe que el ARNi se encuentra en forma de un conjugado de tipo GalNAc. En algunas realizaciones, el ARNi
(p. ej., el ARNbc) se administra con una dosis de 0.5-50 mg/kg.
En la presente se describe un método para tratar a un sujeto con un nivel elevado de ALA y/o PBG, comprendiendo el método administrar al sujeto un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), donde dicho ARNbc comprende una hebra sentido y una hebra antisentido con una longitud de 15-30 pares de bases y la hebra antisentido es complementaria respecto a al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:382.
En la presente se describe un método para tratar a un sujeto con un nivel elevado de ALA y/o PBG, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNbc o una composición que comprenda un ARNbc, según se describe la presente.
Se describe que los métodos descritos en la presente son eficaces para reducir el nivel de ALA y/o PBG. Se describe que el nivel de ALA y/o PBG se reduce de modo tal que sea inferior a, o inferior o igual a, un valor de referencia, p. ej., un límite de referencia superior. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para reducir el
nivel de una porfirina o un precursor de porfirina en una célula (p. ej., una célula eritroide o una célula hepática tal como, p. ej., un hepatocito). Se describe que la célula se trata ex vivo, in vitro o in vivo (p. ej., la célula está presente en un sujeto (p. ej., un paciente que necesita tratar, prevenir y/o gestionar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1)). El método incluye poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de uno o más de los ARNi que tienen ALAS1 como diana, p. ej., uno o más de los ARNi descritos en la presente, de este modo se reduce el nivel de una porfirina o un precursor de porfirina en la célula; o se reduce el nivel de una porfirina o un precursor de porfirina en otras células, tejidos o fluidos del sujeto en el cual se encuentra localizada la célula; con relación al nivel antes de la puesta en contacto. Tales métodos se pueden utilizar para tratar (p. ej., mejorar la gravedad) de trastornos relacionados con la expresión de ALAS1, tales como las porfirias, p. ej., AIP o una porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa.
Se describe que el paso de puesta en contacto se realiza ex vivo, in vitro o in vivo. Por ejemplo, la célula puede estar presente en un sujeto, p. ej., un mamífero (p. ej., un ser humano) que corre el riesgo de padecer o al cual se le ha diagnosticado una porfiria. Se describe que la porfiria es una porfiria hepática aguda. Se describe que la porfiria es una porfiria hepática, p. ej., una porfiria seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética. Se describe que la porfiria es una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. Se describe que la porfiria es una porfiria dual.
Se describe un método para reducir el nivel de una porfirina o un precursor de porfirina (p. ej., ALA o PBG) en una célula, que comprende poner en contacto la célula con un ARNi (p. ej., un ARNbc), según se describe en la presente, en una cantidad eficaz para reducir el nivel de la porfirina o el precursor de porfirina en la célula. Se describe que la célula es un hepatocito. Se describe que la porfirina o el precursor de porfirina es ácido δaminolevulílico (ALA), porfopilinógeno (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinógeno I o III, coproporfirinógeno I o III, protoporfrinógeno IX o protoporfirina IX. Se describe que el precursor de porfirina es ALA o PBG.
Se describe que la célula es una célula eritroide. Se describe que adicional, la célula es una célula hepática (p. ej., un hepatocito).
Se describe un vector que codifica al menos una hebra de un ARNi (p. ej., un ARNbc) según se describe en la presente.
Se describe un vector que codifica al menos una hebra de un ARNbc, donde dicho ARNbc comprende una región de complementariedad respecto a al menos una parte de un ARNm que codifica ALAS1, donde dicho ARNbc tiene una longitud de 30 pares de bases o inferior y donde dicho ARNbc tiene como diana la escisión de dicho ARNm.
Se describe que la región de complementariedad tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos.
Se describe que la región de complementariedad tiene una longitud de 19-21 nucleótidos. En un aspecto, la invención proporciona un vector para inhibir la expresión de un gen ALAS1 en una célula. Se describe que el vector comprende un ARNi según se describe en la presente. Se describe que el vector incluye al menos una secuencia reguladora unida operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de un ARNi según se describe en la presente. Se describe que el vector comprende al menos una hebra de un ARNi de ALAS1.
Se describe una célula que comprende un vector según se describe en la presente. En la presente se describe una célula que contiene un vector para inhibir la expresión de un gen ALAS1 en una célula. El vector incluye una secuencia reguladora unida operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una hebra de uno de los ARNi que se describen en la presente. La célula puede ser una célula hepática (p. ej., un hepatocito). La célula puede ser una célula eritroide.
La invención se expone en las reivindicaciones.
La FIG. 1 representa la vía biosintética del grupo hemo.
La FIG. 2 resume ciertas porfirias asociadas con errores genéticos en el metabolismo del grupo hemo.
La FIG. 3 representa la variante 1 de un transcrito de la secuencia de ARNm de ALAS1 humano (Ref. Sec. NM_000688.4 (GI:40316942, registro con fecha de 19 de noviembre de 2011), SEQ ID NO: 1).
La FIG. 4 representa la variante 2 de un transcrito de la secuencia de ARNm de ALAS1 humano (Ref. Sec. NM_000688.5 (GI: 362999011, registro con fecha de 1 de abril de 2012), SEQ ID NO: 382).
La FIG. 5 muestra la dosis-respuesta del ARNip AD-53558 para la supresión del ARNm de ALAS1 de ratón (ALAS1r) con relación a un control de PBS. También se muestran los resultados para un control de luciferasa (LUC) AD-1955.
La FIG. 6 muestra la dosis-respuesta del ARNip AD-53558 para la supresión del ARNm de ALAS1 en ratas con relación a un control de PBS. También se muestran los resultados para un control de luciferasa (LUC) AD-1955.
La FIG. 7 muestra la durabilidad de la supresión del ARNm de ALAS1 de ratón (ALAS1r) por parte del ARNip AD53558 con relación a un control de PBS.
La FIG. 8 muestra las medias ± desviaciones estándar de los niveles de ALA en plasma (en µM) en el punto de referencia y después de un tratamiento con fenobarbital en los grupos experimentales (ARNip de ALAS1) y de control (ARNip de LUC).
La FIG. 9 muestra los niveles de ALA en plasma (en µM) de animales individuales en el punto de referencia y después del tratamiento con fenobarbital en animales que recibieron tratamiento con ARNip de ALAS1 y control (ARNip de LUC).
La FIG. 10 muestra las medias ± desviaciones estándar de los niveles de PBG en plasma (en µM) en el punto de referencia y después de un tratamiento con fenobarbital en animales que recibieron tratamiento con ARNip de ALAS1 y control (ARNip de LUC).
La FIG. 11 muestra los niveles de PBG en plasma (en µM) de animales individuales en el punto de referencia y después del tratamiento con fenobarbital en animales que recibieron tratamiento con ARNip de ALAS1 y control (ARNip de LUC).
La FIG. 12 muestra el nivel de ARNm de ALAS1r relativo en el hígado en el punto de referencia y después de un tratamiento con fenobarbial en animales experimentales representativos seleccionados (ARNip de ALAS1) y de control (PBS).
La FIG. 13 muestra los efectos de tres ARNip de ALAS1r conjugados con GalNAc sobre la expresión de ALAS1r (en comparación con un control de PBS) en tejido hepático de ratón.
La FIG. 14 muestra los niveles de ALA y PBG en plasma en función del tiempo después de la administración de fenobarbital y el tratamiento con ARNip de ALAS1 o ARNip de LUC como control.
La FIG. 15 muestra los efectos de un ARNip de ALAS1 conjugado con GalNAc sobre los niveles de ALA en plasma y PBG en plasma en el modelo de inducción con fenobarbital de AIP en ratón.
El ARNi dirige la degradación de ARNm específica según la secuencia mediante un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN). En la presente se describen ARNi y métodos para utilizarlos con el fin de inhibir la expresión de un gen ALAS1 en una célula o un mamífero, donde el ARNi tiene como diana un gen ALAS1. También se proporcionan composiciones y métodos para trastornos relacionados con la expresión de ALAS1 tales como las porfirias (p. ej., porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss o ADP), porfiria intermitente aguda, porfiria eritropoyética congénita, porfiria cutánea tardía, coproporfiria hereditaria (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoyética (EPP), anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA) y eritroporfiria transitoria de la infancia).
Las porfirias son trastornos heredados o adquiridos que pueden ser provocados por una actividad reducida o potenciada de enzimas específicas de la vía biosintética del grupo hemo, que también se denomina en la presente vía de las porfirinas (remítase a la FIG. 1). Las porfirinas son los precursores principales del grupo hemo. Las porfirinas y los precursores de porfirinas incluyen ácido δ-aminolevulínico (ALA), porfopilinógeno (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinógeno I o III, coproporfirinógeno I o III, protoporfrinógeno IX y protoporfirina IX. El grupo hemo es una parte esencial de la hemoglobina, mioglobina, catalasas, peroxidasas y citocromos, incluyendo estos últimos los citocromos hepáticos P450 y respiratorios. El grupo hemo se sintetiza en la mayoría de las células humanas o en todas ellas. Aproximadamente un 85% del grupo hemo se produce en células eritroides, principalmente para la hemoglobina. La mayor parte del grupo hemo remanente se produce en el hígado, un 80% del cual se utiliza para la síntesis de los citocromos. La deficiencia de enzimas específicas de la vía de las porfirinas conlleva una producción insuficiente del grupo hemo y también una acumulación de porfirinas y/o precursores de porfirinas, que son tóxicos para la función de células u órganos en concentraciones elevadas.
Las porfirias se pueden manifestar con complicaciones neurológicas ("agudas"), problemas de la piel ("cutáneos") o ambos. Las porfirias se pueden clasificar en función del sitio principal de la sobreproducción y acumulación de porfirinas o sus precursores. En las porfirias hepáticas, las porfirinas y los precursores de porfirinas se sobreproducen principalmente en el hígado, mientras que en las porfirias eritropoyéticas, las porfirinas se sobreproducen en las células eritroides en el hueso. Las porfirias agudas o hepáticas conllevan la disfunción del sistema nervioso y manifestaciones neurológicas que pueden afectar tanto al sistema nervioso central como al periférico, lo cual provoca síntomas tales como, por ejemplo, dolor (p. ej., dolor abdominal y/o dolor neuropático crónico), vómitos, neuropatía (p. ej., neuropatía aguda, neuropatía progresiva), debilidad muscular, convulsiones, problemas mentales (p. ej., alucinaciones, depresión-ansiedad, paranoia), arritmias cardíacas, taquicardia, estreñimiento y diarrea. Las porfirias cutáneas o eritropoyéticas afectan principalmente a la piel y provocan síntomas tales como fotosensibilidad, la cual puede ser dolorosa, ampollas, necrosis, picores, hinchazón y un mayor crecimiento del pelo en áreas tales como la frente. La infección posterior de las lesiones de la piel puede provocar la pérdida de tejidos y huesos, así como también cicatrices, desfiguración y pérdida de dedos (p. ej., de las manos y de
los pies). La mayoría de las porfirias están provocadas por mutaciones que codifican enzimas de la vía biosintética del grupo hemo. En la FIG. 2 se proporciona un resumen de las porfirias asociadas con errores genéticos en el metabolismo del grupo hemo.
No todas las porfirias son genéticas. Por ejemplo, los pacientes con una enfermedad hepática pueden desarrollar una porfiria como resultado de la disfunción hepática y se ha descrito una forma transitoria de eritroporfiria (eritroporfiria transitoria de la infancia) en la infancia (remítase a Crawford, R.I. et al., J Am Acad Dermatol. agosto de 1995; 33(2 Pt 2):333-6.) Los pacientes con PCT pueden adquirir una actividad deficiente de la uroporfirinógenodescarboxilasa (URO-D), debido a la formación de una enzima ORO-D con una actividad enzimática inferior a la normal (remítase a Phillips et al. Blood, 98:3179-3185, 2001).
La porfiria intermitente aguda (AIP) (también denominada deficiencia de porfobilinógeno (PBG)-desaminasa o deficiencia de hidroximetilbilano-sintasa (HMBS)) es el tipo más común de porfiria hepática aguda. Otros tipos de porfirias hepáticas agudas incluyen la coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP) y porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP). Las porfirias hepáticas agudas se describen, p. ej., en Balwani, M y Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
Normalmente, AIP es una enfermedad dominante autosómica que se caracteriza por una deficiencia de la enzima porfobilinógeno-desaminasa (PBG-desaminasa); esta enzima también se conoce como hidroximetilbilano-sintasa (HMB-sintasa o HMBS). La PBG-desaminasa es la tercera enzima de la vía biosintética del grupo hemo (remítase a la FIG. 1) y cataliza la condensación cabeza con cola de cuatro moléculas de porfobilinógeno para obtener el tetrapirrol lineal hidroximetilbilano (HMB). Como alternativa, se han descrito variantes de transcritos de corte y empalme que codifican diferentes isoformas de la PBG-desaminasa. Las mutaciones en el gen de la PBGdesaminasa se asocian con la AIP. Tales mutaciones pueden provocar una reducción de las cantidades de PBGdesaminasa y/o una reducción de la actividad de la PBG-desaminasa (los individuos afectados normalmente presentan una reducción de ~50% en la actividad de la PBG-desaminasa).
Existen al menos dos modelos diferentes de la patofisiología de AIP y otras porfirias hepáticas agudas (remítase, por ejemplo, a Lin CS-Y et al., Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). De acuerdo con un modelo, la reducción de la producción del grupo hemo como resultado de la deficiencia de la PBG-desaminasa provoca una deficiencia energética y degeneración axónica. De acuerdo con el otro modelo, actualmente más favorecido, la acumulación de precursores de porfirinas (p. ej., ALA y PBG) provoca neurotoxicidad.
Se ha establecido que la AIP presenta una prevalencia de incluso 1 en 10 000 en ciertas poblaciones (p. ej., en el norte de Suecia; remítase a Floderus Y et al. Clin Genet. 2002;62:288–97). Se estima que la prevalencia en la población general en los Estados Unidos y Europa, excluido el Reino Unido, es desde aproximadamente 1 en 10 000 hasta 1 en 20 000. La enfermedad clínica se manifiesta en sí únicamente en aproximadamente un 10-15% de los individuos que son portadores de las mutaciones que se sabe que están asociadas con la AIP. Sin embargo, la penetrancia es de incluso un 40% en individuos con ciertas mutaciones (p. ej., la mutación W198X). Normalmente, la AIP es latente antes de la pubertad. Los síntomas son más comunes en mujeres que en hombres. Probablemente la prevalencia de la enfermedad se subestima debido a su penetrancia incompleta y a los periodos prolongados de latencia. En los Estados Unidos, se estima que existen aproximadamente 2000 pacientes que han sufrido al menos un ataque. Se estima que existen aproximadamente 150 casos recurrentes activos en Francia, Suecia, el Reino Unido y Polonia; estos pacientes son principalmente mujeres jóvenes, con una edad media de 30. Remítase, p. ej., a Elder et al., J Inherit Metab Dis., publicado en línea el 1 de noviembre de 2012.
La AIP afecta, por ejemplo, al sistema nervioso central, autonómico, periférico y visceral. Los síntomas de la AIP son variables e incluyen síntomas gastrointestinales (p. ej., dolor abdominal intenso y poco localizado, náusea/vómitos, estreñimiento, diarrea, íleo), síntomas urinarios (disuria, retención/incontinencia urinaria u orina oscura), síntomas neurológicos (p. ej., neuropatía sensorial, neuropatía motriz (p. ej., que afecta a los nervios craneales y/o que provoca debilidad en los brazos o las piernas), convulsiones, dolor neuropático (p. ej., dolor asociado con una neuropatía progresiva, p. ej., dolor neuropático crónico), síntomas neuropsiquiátricos (p. ej., confusión mental, ansiedad, agitación, alucinación, histeria, delirio, apatía, depresión, fobias, psicosis, insomnio, somnolencia, coma), participación del sistema nervioso autonómico (que provoca, p. ej., síntomas cardiovasculares tales como taquicardia, hipertensión y/o arritmias, así como también otros síntomas tales como, p. ej., un incremento de los niveles de catecolamina en circulación, sudoración, inquietud y/o temblores), deshidratación y anomalías electrolíticas. Los síntomas más comunes son dolor abdominal y taquicardia. Además, los pacientes presentan frecuentemente dolor neuropático crónico y desarrollan una neuropatía progresiva. Los pacientes con ataques recurrentes a menudo presentan un pródromo. Se puede producir una parálisis permanente después de un ataque grave. La recuperación de ataques graves que no se tratan inmediatamente puede llevar semanas o meses. Un ataque agudo puede resultar mortal, p. ej., debido a la parálisis de músculos respiratorios o a un paro cardiovascular provocado por el desequilibrio de los electrolitos (remítase, p. ej., a Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 27 de septiembre de 2005 [actualizado el 1 de septiembre de 2011]. En: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR et al., editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle; 1993-(en lo sucesivo en la presente Thunell (1993)). Antes de la existencia de tratamientos con hemina, hasta un 20% de los pacientes con AIP fallecían a causa de la enfermedad.
En los individuos que son portadores de genes para la AIP, el riesgo de cáncer hepatocelular es mayor. En aquellos que padecen ataques recurrentes, el riesgo de cáncer hepatocelular es particularmente grave: después de la edad de 50, el riesgo es casi 100 veces mayor que en la población general.
Los ataques de porfiria aguda se pueden precipitar debido a factores endógenos o exógenos. Los mecanismos mediante los cuales tales factores inducen ataques pueden incluir, por ejemplo, un incremento de la demanda de las enzimas P450 hepáticas y/o una inducción de la actividad de ALAS1 en el hígado. Un incremento de la demanda de las enzimas P450 hepáticas provoca una reducción del grupo hemo hepático libre, de este modo se induce la síntesis de ALAS1 hepático.
Los factores precipitantes incluyen ayuno (u otras formas de ingesta calórica reducida o inadecuada, debido a dietas extremas, atletismo de fondo, etc.), estrés metabólico (p. ej., infecciones, cirugía, viajes aéreos internacionales y estrés psicológico), hormonas endógenas (p. ej., progesterona), fumar cigarrillos, agentes químicos exógenos liposolubles (que incluyen, p. ej., agentes químicos presentes en el humo del tabaco, ciertos fármacos recetados, disolventes orgánicos, biocidas, componentes de bebidas alcohólicas), factores endocrinos (p. ej., hormonas reproductivas (las mujeres pueden experimentar exacerbaciones durante el periodo premenstrual), estrógenos sintéticos, progesteronas, estimulantes de la ovulación y terapia de reemplazo hormonal). Remítase, por ejemplo, a Thunell (1993).
Se han contraindicado más de 1000 fármacos para las porfirias hepáticas agudas (p. ej., AIP, HCP, ADP y VP), que incluyen, por ejemplo, alcohol, barbitúricos, Carbamazepina, Carisoprodol, Clonazepam (dosis elevadas), Danazol, Diclofenac y posiblemente otros NSAID (siglas en inglés referentes a los antiinflamatorios no esteroideos), hongos Ergot, estrógenos, Eticlorvinol, Glutetimida, Griseofulvina, Mefenitoína, Meprobamato (también mebutamato y tibutamato), Metiprilón, Metodopramida, Fenitoína, Primidona, progesterona y progestinas sintéticas, Pirazinamida, Pirazolonas (aminopirina y antipirina), Rifampina, Succinimidas (etosuximida y metsuximida), antibiótidos de tipo sulfonamida y ácido valproico.
Los signos objetivo de la AIP incluyen un cambio de color de la orina durante un ataque agudo (la orina puede aparecer de color rojo o rojo parduzco) y un incremento de las concentraciones de PBG y ALA en la orina durante un ataque agudo. La evaluación genética molecular ha identificado mutaciones en el gen de la PBG-desaminasa (también conocida como HMBS) en más de un 98% de individuos afectados. Thunell (1993).
El diagnóstico diferencial de las porfirias puede implicar la determinación del tipo de porfiria midiendo niveles individuales de porfirinas o precursores de porfirinas (p. ej., ALA, PBG) en la orina, las heces y/o el plasma (p. ej., mediante cromatografía y fluorometría) durante un ataque. El diagnóstico de la AIP se puede confirmar estableciendo que la actividad de la PBG-desaminasa en eritrocitos corresponda a un 50% del nivel normal o menos. En pacientes y miembros familiares de riesgo se pueden llevar a cabo evaluaciones del ADN en busca de mutaciones. El diagnóstico de la AIP se confirma normalmente mediante una evaluación del ADN para identificar una mutación génica causal específica (p. ej., una mutación en HMBS).
Normalmente, el tratamiento de ataques agudos requiere hospitalización para controlar y tratar los síntomas agudos, que incluyen, p. ej., dolor abdominal, convulsiones, deshidratación/hiponatremia, náuseas/vómitos, taquicardia/hipertensión, retención urinaria/íleo. Por ejemplo, el dolor abdominal se puede tratar, p. ej., con analgésicos narcóticos, las convulsiones se pueden tratar con precauciones para las convulsiones y posiblemente medicamentos (aunque muchos de los medicamentos contra las convulsiones están contraindicados), las náuseas/vómitos se pueden tratar, p. ej., con fenotiazinas y la taquicardia/hipertensión se puede tratar, p. ej., con bloqueadores beta. El tratamiento puede incluir la retirada de medicamentos no seguros, la monitorización de la función respiratoria, así como también del estado neurológico y la fuerza muscular. Los ataques moderados (p. ej., los que no presentan paresia ni hiponatremia) se pueden tratar con al menos 300 g de glucosa al 10% intravenosa por día, aunque cada vez con más frecuencia se proporciona hemina inmediatamente. Los ataques graves se deberían tratar tan pronto como sea posible con hemina intravenosa (3-4 mg/kg diariamente durante 4-14 días) y con glucosa IV mientras se espera que la hemina IV haga efecto. Normalmente, los ataques se tratan con hemina IV durante 4 días y con glucosa IV mientras se espera a que se administre la hemina IV.
La hemina (Panhematin® o hemina para inyección, previamente conocida como hematina) es el único producto de tipo hemo aprobado para ser utilizado en los Estados Unidos y fue el primer fármaco aprobado según el Orphan Drug Act. Panhematin® es hemina obtenida a partir de glóbulos rojos procesados (PRBC, por sus siglas en inglés) y consiste en Protoporfirina IX que contiene un ión de hierro férrico (Hemo B) con un ligando de tipo cloruro. El grupo hemo actúa limitando la síntesis hepática y/o medular de la porfirina. El mecanismo exacto mediante el cual la hemina produce una mejora de los síntomas en pacientes con episodios agudos de las porfirias hepáticas no ha sido elucidado; sin embargo, es probable que su acción sea debida a la inhibición (por retroalimentación) de la ácido δaminolevulínico (ALA)-sintasa, la enzima que limita la velocidad de la vía biosintética de las porfirinas/del grupo hemo. Remítase a la etiqueta del producto Panhematin®, Lundbeck, Inc., octubre de 2010. La inhibición de la ALAsintasa debería provocar una reducción de la producción de ALA y PBG, así como también de las porfirinas y los intermedios de porfirinas.
Las desventajas de la hemina incluyen el retraso de su impacto sobre los síntomas clínicos y el hecho de que no es capaz de prevenir la recurrencia de los ataques. Las reacciones adversas asociadas con la administración de hemina pueden incluir tromboflebitis, anticoagulación, trombocitopenia, insuficiencia renal o sobrecarga de hierro, la cual es particularmente probable en pacientes que requieren múltiples programas de tratamiento con hemina para ataques recurrentes. Para prevenir la flebitis, se necesita una sonda venosa permanente de acceso en pacientes con ataques recurrentes. Los efectos secundarios que se registran de forma poco habitual incluyen fiebre, dolor, malestar, hemólisis, anafilaxis e insuficiencia circulatoria. Remítase a Anderson, K.E., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, en The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, editado por Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003) (en lo sucesivo en la presente Anderson).
Resulta difícil preparar el grupo hemo en una forma estable para la administración intravenosa. Este es insoluble a un pH neutro pero se puede preparar como el hidróxido de hemo a un pH de 8 o superior. Anderson. Panhematin es un preparado de hemina liofilizada. Cuando la hemina liofilizada se solubiliza para la administración intravenosa, se forman rápidamente productos de degradación; estos productos de degradación son los responsables de que se produzca un efecto anticoagulante transitorio y flebitis en el punto de la infusión. Anderson. La albúmina que contiene hemo y el arginato de hemo (Normosang, la versión europea de la hemina) son más estables y, potencialmente, pueden provocar menos tromboflebitis. Sin embargo, el uso del arginato de hemo no está aprobado en los Estados Unidos. Panhematin se puede estabilizar solubilizándolo para infusión en albúmina humana al 30% en lugar de en agua estéril; sin embargo, la albúmina añade efectos de expansión del volumen intravascular e incrementa el costo del tratamiento, así como también el riesgo de patógenos ya que se aísla a partir de sangre humana. Remítase, p. ej., a Anderson.
El tratamiento con éxito de un ataque agudo no evita ni retrasa su reaparición. Existe la duda de si la hemina en sí puede desencadenar ataques recurrentes debido a la inducción de la hemo-oxigenasa. A pesar de ello, en algunas áreas (especialmente Francia), se está tratando a mujeres jóvenes con múltiples ataques recurrentes con hemina semanalmente con el objetivo de alcanzar la profilaxis.
La experiencia limitada con trasplantes de hígado sugiere que, cuando tienen éxito, suponen un tratamiento eficaz para la AIP. Se han producido aproximadamente 12 trasplantes en pacientes humanos en Europa, con efectos curativos o variados. El trasplante de hígado puede restablecer la excreción normal de ALA y PBG y evitar los ataques agudos. Remítase, p. ej., a Dar, F.S. et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1):93-96 (2010). Además, si el hígado de un paciente con AIP se trasplanta en otro paciente ("trasplante dominó"), el paciente que recibe el trasplante puede desarrollar AIP.
Entre los efectos clínicos a largo plazo de las porfirias agudas, se encuentra el dolor neuropático crónico que puede ser el resultado de una neuropatía progresiva debida a los efectos neurotóxicos, p. ej., de niveles elevados de precursores de porfirinas (p. ej., ALA y/o PBG). Los pacientes pueden sufrir dolor neuropático antes de un ataque agudo o durante este. Los pacientes de edad más avanzada pueden experimentar un incremento del dolor neuropático con la edad, para el cual se recetan normalmente varios fármacos narcóticos. Se han registrado anomalías en el electromiograma y una reducción de los tiempos de conducción en pacientes con porfirias hepáticas agudas. Cabe destacar que ratones con AIP (deficiencia de PBG-desaminasa) no inducidos ni tratados desarrollan una neuropatía motriz progresiva que se ha demostrado que provoca la degeneración y la pérdida progresivas del axón del nervio de los cuádriceps debido a los niveles constitutivamente elevados de precursores de porfirinas (ALA y PBG), a la deficiencia del grupo hemo y/o porfirinas (Lindberg et al., J. Clin. Invest., 103(8): 1127–1134, 1999). En pacientes con porfiria aguda (p. ej., ADP, AIP, HCP o VP), los niveles de precursores de porfirinas (ALA y PBG) son a menudo elevados en pacientes sin síntomas y en pacientes con síntomas entre ataques. Por lo tanto, cabe esperar que la reducción de los precursores de porfirinas y el restablecimiento de la biosíntesis normal del grupo hemo mediante la reducción del nivel de actividad y/o expresión de ALAS1 evite y/o minimice el desarrollo de una neuropatía progresiva y crónica. Un tratamiento, p. ej., un tratamiento crónico (p. ej., un tratamiento periódico con ARNi según se describe en la presente, p. ej., un tratamiento de acuerdo con una pauta posológica según se describe en la presente, p. ej., un tratamiento semanal o cada dos semanas) puede reducir de forma continuada la expresión de ALAS1 en pacientes con porfiria aguda que presentan niveles elevados de precursores de porfirinas, porfirinas, productos de porfirinas o sus metabolitos. Tal tratamiento se puede proporcionar según convenga para prevenir o reducir la frecuencia o la gravedad de los síntomas de un paciente individual (p. ej., dolor y/o neuropatía) y/o para reducir el nivel de un precursor de porfirina, porfirina, producto o metabolito de porfirina.
Es necesario identificar agentes terapéuticos novedosos que se puedan utilizar para el tratamiento de las porfirias. Según se ha discutido anteriormente, los tratamientos existentes tales como la hemina presentan numerosas desventajas. Por ejemplo, el impacto de la hemina sobre los síntomas clínicos presenta un retraso, la hemina es cara y puede presentar efectos secundarios (p. ej., tromboflebitis, anticoagulación, trombocitopenia, sobrecarga de hierro, insuficiencia renal). Los agentes terapéuticos novedosos, tales como los que se describen en la presente, pueden resolver estas desventajas y atender las necesidades no cubiertas de los pacientes, por ejemplo, actuando más rápidamente, no induciendo flebitis, proporcionando la comodidad de una administración subcutánea, evitando con éxito ataques recurrentes, evitando o mejorando el dolor (p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía progresiva, y/o no provocando ciertos efectos adversos asociados con la hemina (p. ej., sobrecarga de hierro, incremento del riesgo de padecer un cáncer hepatocelular).
La presente descripción proporciona métodos y composiciones de ARNi para modular la expresión de un gen ALAS1. En ciertas realizaciones, la expresión de ALAS1 se reduce o inhibe utilizando un ARNi específico para ALAS1, de este modo se obtiene una reducción de la expresión de un gen ALAS1. La reducción de la expresión de un gen ALAS1 puede reducir el nivel de uno o más precursores de porfirinas, porfirinas, o productos o metabolitos de porfirinas. La reducción de la expresión de un gen ALAS1, así como también reducciones relacionadas del nivel de uno o más precursores de porfirinas y/o porfirinas, puede ser útil en el tratamiento de trastornos relacionados con la expresión de ALAS1, p. ej., las porfirias.
Los ARNi de las composiciones que se exponen en la presente incluyen una hebra de ARN (la hebra antisentido) que tiene una región con una longitud de 30 nucleótidos o inferior, es decir, una longitud de 15-30 nucleótidos, generalmente una longitud de 19-24 nucleótidos, donde dicha región es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen ALAS1 (también se denomina en la presente "ARNi específico para ALAS1"). El uso de un ARNi de este tipo permite la degradación dirigida de los ARNm de genes que participan en patologías asociadas con la expresión de ALAS1 en mamíferos, p. ej., porfirias tales como la porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss) o la porfiria intermitente aguda. Unas dosis muy bajas de ARNi específicos para ALAS1 pueden mediar de forma específica y eficaz la iARN, lo cual provoca una inhibición significativa de la expresión de un gen ALAS1. Los ARNi que tienen como diana ALAS1 pueden mediar de forma específica y eficaz la iARN, lo cual provoca una inhibición significativa de la expresión de un gen ALAS1, p. ej., en ensayos basados en células. De este modo, los métodos y las composiciones que incluyen estos ARNi son útiles para tratar procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1, tales como las porfirias (p. ej., anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss), porfiria intermitente aguda (AIP), porfiria eritropoyética congénita, porfiria cutánea tardía, coproporfiria hereditaria (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoyética (EPP) y eritroporfiria transitoria de la infancia).
La siguiente descripción describe cómo preparar y utilizar composiciones que contienen ARNi para inhibir la expresión de un gen ALAS1, así como también composiciones y métodos para tratar enfermedades y trastornos provocados o modulados por la expresión de este gen. Las realizaciones de las composiciones farmacéuticas que se exponen en la invención incluyen un ARNi que tiene una hebra antisentido que comprende una región con una longitud de 30 nucleótidos o inferior, generalmente una longitud de 19-24 nucleótidos, donde dicha región es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un transcrito de ARN de un gen ALAS1, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las realizaciones de composiciones que se exponen en la invención también incluyen un ARNi que tiene una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad con una longitud de 30 nucleótidos o inferior, generalmente una longitud de 19-24 nucleótidos, y que es sustancialmente complementaria respecto a al menos parte de un transcrito de ARN de un gen ALAS1.
Por consiguiente, en algunos aspectos, se describen composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi de ALAS1 y un portador farmacéuticamente aceptable, métodos para utilizar las composiciones con el fin de inhibir la expresión de un gen ALAS1 y métodos para utilizar las composiciones farmacéuticas con el fin de tratar trastornos relacionados con la expresión de ALAS1.
I. Definiciones
Para una mayor comodidad, a continuación se proporciona el significado de ciertos términos y expresiones que se utilizan en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. En el caso de que exista una discrepancia aparente entre el uso de un término en otras partes de esta memoria descriptiva y su definición proporcionada en esta sección, la definición de esta sección deberá prevalecer.
Las letras “G,” “C,” “A,” “T” y “U” se refieren en general, cada una de ellas, a un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, timidina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se sobreentenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, según se detalla adicionalmente más adelante, o a un resto de reemplazo alternativo. El experto es consciente de que los restos de guanina, citosina, adenina y uracilo se pueden reemplazar por otros restos sin alterar de forma sustancial las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprenda un nucleótido que contenga tal resto de reemplazo. Por ejemplo, sin carácter limitante, un nucleótido que comprenda inosina como su base podrá aparear sus bases con nucleótidos que contengan adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contengan uracilo, guanidina o adenina se podrán reemplazar en las secuencias de nucleótidos del ARNbc que se expone en la invención por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, los restos de adenina y citosina en cualquier posición del oligonucleótido se pueden reemplazar por restos de guanina y uracilo, respectivamente, para formar un apareamiento de bases Wobble G-U con el ARNm diana. Las secuencias que contienen tales restos de reemplazo son adecuadas para las composiciones y los métodos que se exponen en la invención.
El término “ALAS1” (también conocido como ALAS-1; δ-aminolevulinato-sintasa 1; δ-ALA-sintasa 1; ácido 5’aminolevulínico-sintasa 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; EC2.3.1.37; 5-aminolevulinato-sintasa, no específica, mitocondrial; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; proteína 4 inductora de migración; EC 2.3.1 ), tal como se utilizó en la presente, se refiere a una enzima mitocondrial codificada en el núcleo que es la primera enzima, y normalmente la enzima limitante de la velocidad, de la vía biosintética del grupo hemo en mamíferos. ALAS1 cataliza la condensación de la glicina con
succinil-CoA para formar el ácido δ-aminolevulínico (ALA). El gen ALAS1 humano se expresa de forma ubicua, se encuentra en el cromosoma 3p21.1 y normalmente codifica una secuencia de 640 aminoácidos. Por el contrario, el gen ALAS-2, que codifica una isozima, se expresa solamente en los eritrocitos, se encuentra en el cromosoma Xp11.21 y normalmente codifica una secuencia de 550 aminoácidos. La expresión "proteína ALAS1", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier variante proteica de ALAS1 de cualquier especie (p. ej., de un ser humano, ratón, primate no humano), así como también a cualesquiera mutantes y fragmentos de esta que conserven actividad de ALAS1. De forma similar, la expresión "transcrito de ALAS1" se refiere a cualquier variante de un transcrito de ALAS1 de cualquier especie (p. ej., de un ser humano, ratón, primate no humano). Se puede consultar un transcrito de ARNm de la variante 1 de ALAS1 humano en NM_000688.4 (FIG. 3; SEQ ID NO:1). Se puede consultar otra versión, un transcrito de ARNm de la variante 2 de ALAS1 humano, en NM_000688.5 (FIG. 4; SEQ ID NO:382). El nivel de la proteína ALAS1 codificada madura está regulado por el grupo hemo: unos niveles elevados del grupo hemo reducen la expresión de la enzima madura en las mitocondrias, mientras que unos niveles bajos del grupo hemo incrementan su expresión. Se han identificado múltiples variantes de corte y empalme alternativas que codifican la misma proteína.
Las expresiones "ARNi", "iARN", "agente de ARNi" o "agente de iARN", tal como se utilizan en la presente, se refieren a un agente que contiene ARN, tal como se define este término en la presente, y el cual media la escisión dirigida de un transcrito de ARN, p. ej., mediante una vía del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Un ARNi, tal como se describe en la presente, ejerce la inhibición de la expresión de ALAS1. La inhibición de la expresión de ALAS1 se puede evaluar basándose en la reducción del nivel del ARNm de ALAS1 o la reducción del nivel de la proteína ALAS1. La expresión "secuencia diana", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen ALAS1, incluido el ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario. La porción diana de la secuencia tendrá una longitud que sea al menos suficiente para que sirva como sustrato para la escisión dirigida por el ARNi en esa porción o cerca de ella. Por ejemplo, la secuencia diana tendrá una longitud generalmente de 9-36 nucleótidos, p. ej., una longitud de 15-30 nucleótidos, incluidos todos los subintervalos comprendidos entre estos valores. A modo de ejemplos no limitantes, la secuencia diana puede tener 15-30 nucleótidos, 15-26 nucleótidos, 15-23 nucleótidos, 15-22 nucleótidos, 15-21 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 15-19 nucleótidos, 15-18 nucleótidos, 15-17 nucleótidos, 18-30 nucleótidos, 18-26 nucleótidos, 18-23 nucleótidos, 18-22 nucleótidos, 18-21 nucleótidos, 18-20 nucleótidos, 19-30 nucleótidos, 19-26 nucleótidos, 19-23 nucleótidos, 19-22 nucleótidos, 19-21 nucleótidos, 19-20 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, 20-26 nucleótidos, 20-25 nucleótidos, 20-24 nucleótidos, 20-23 nucleótidos, 20-22 nucleótidos, 20-21 nucleótidos, 21-30 nucleótidos, 21-26 nucleótidos, 21-25 nucleótidos, 21-24 nucleótidos, 21-23 nucleótidos o 21-22 nucleótidos.
La expresión "hebra que comprende una secuencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos descrita por la secuencia a la cual se hace referencia utilizando la nomenclatura estándar de nucleótidos.
El término "complementariedad", tal como se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura de tipo dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprenda la segunda secuencia de nucleótidos, como sobreentenderá un experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM de pH 6.4, EDTA 1 mM, 50 oC o 70 oC durante 12-16 horas y a continuación un lavado. Se pueden aplicar otras condiciones tales como las condiciones fisiológicamente relevantes que se pueden encontrar dentro de un organismo. El experto será capaz de determinar el conjunto de condiciones que sean más adecuadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias complementarias dentro de un ARNi, p. ej., dentro de un ARNbc que se describe en la presente, incluyen el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de la longitud completa de una o ambas secuencias de nucleótidos. En la presente, se puede decir que tales secuencias son "totalmente complementarias" entre sí. Sin embargo, cuando en la presente se dice que la primera secuencia es "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias o pueden formar uno o dos, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2, pares de bases con apareamientos erróneos cuando se hibridan para un dúplex de hasta 30 pares de bases, a la vez que mantienen la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final, p. ej., la inhibición de la expresión génica mediante una vía de RISC. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos se diseñan para que formen, cuando se hibriden, una o más protuberancias de una hebra, tales protuberancias no se deberán considerar como apareamientos erróneos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, se puede decir que un ARNbc que comprenda un oligonucleótido con una longitud de 21 nucleótidos y otro oligonucleótido con una longitud de 23 nucleótidos, donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es totalmente complementaria respecto al oligonucleótido más corto, es "totalmente complementario" a los efectos descritos en la presente.
Las secuencias "complementarias", tal como se utilizan en la presente, también pueden incluir, o estar formadas totalmente por, pares de bases que no sean de Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos modificados y no naturales, siempre que se cumplan los requisitos anteriores respecto a su capacidad para hibridarse. Los pares de bases que no son de Watson-Crick incluyen, sin carácter limitante, el apareamiento de bases de Hoogstein o Wobble G:U.
Las expresiones "complementario/a", "totalmente complementario/a" y "sustancialmente complementario/a" en la presente se pueden utilizar con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un ARNbc, o entre la hebra antisentido de un agente de ARNi y una secuencia diana, como se comprenderá a partir del contexto de su uso.
Un polinucleótido que sea "sustancialmente complementario respecto a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm), tal como se utiliza en la presente, se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario respecto a una porción contigua del ARNm de interés (p. ej., un ARNm que codifica una proteína ALAS1). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario respecto a al menos una parte de un ARNm de ALAS1 si la secuencia es sustancialmente complementaria respecto a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica ALAS1. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario respecto a al menos una parte de un ARNm de ALAS1 si la secuencia es sustancialmente complementaria respecto a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica ALAS1.
La expresión "ARN bicatenario" o "ARNbc", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un ARNi que incluye una molécula de ARN o un complejo de moléculas con una región dúplex hibridada que comprende dos hebras de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, que se dirá que tienen orientaciones "sentido" y "antisentido" respecto al ARN diana. La región dúplex puede tener cualquier longitud que permita una degradación específica de un ARN diana deseado, p. ej., mediante una vía de RISC, pero normalmente tendrá una longitud comprendida en un intervalo de 9 a 36 pares de bases, p. ej., una longitud de 15-30 pares de bases. Considerando un dúplex entre 9 y 36 pares de bases, el dúplex puede tener cualquier longitud dentro de este intervalo, por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 pares de bases y cualquier subintervalo comprendido entre estos valores, que incluye, sin carácter limitante, 15-30 pares de bases, 15-26 pares de bases, 15-23 pares de bases, 15-22 pares de bases, 15-21 pares de bases, 15-20 pares de bases, 15-19 pares de bases, 15-18 pares de bases, 15-17 pares de bases, 18-30 pares de bases, 18-26 pares de bases, 18-23 pares de bases, 18-22 pares de bases, 18-21 pares de bases, 18-20 pares de bases, 19-30 pares de bases, 19-26 pares de bases, 19-23 pares de bases, 19-22 pares de bases, 19-21 pares de bases, 19-20 pares de bases, 20-30 pares de bases, 20-26 pares de bases, 20-25 pares de bases, 20-24 pares de bases, 20-23 pares de bases, 20-22 pares de bases, 20-21 pares de bases, 21-30 pares de bases, 21-26 pares de bases, 21-25 pares de bases, 21-24 pares de bases, 21-23 pares de bases o 21-22 pares de bases. Los ARNbc generados en la célula mediante el procesamiento con Dicer y enzimas similares tienen generalmente una longitud comprendida en el intervalo de 19-22 pares de bases. Una hebra de la región dúplex de un ADNbc comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria respecto a una región de un ARN diana. Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden ser de una única molécula de ARN que tenga al menos una región autocomplementaria o se pueden formar a partir de dos o más moléculas de ARN diferentes. Cuando la región dúplex se forma a partir de dos hebras de una única molécula, la molécula puede tener una región dúplex separada por una única cadena aislada de nucleótidos (que se denomina en la presente "bucle de horquilla") entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura de dúplex. El bucle de horquilla puede comprender al menos un nucleótido no apareado; el bucle de horquilla puede comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 23 o más nucleótidos no apareados. Cuando las dos hebras sustancialmente complementarias de un ARNbc comprenden moléculas de ARN diferentes, estas moléculas no tienen que estar necesariamente conectadas covalentemente, pero pueden estarlo. Cuando las dos hebras están conectadas covalentemente por medios que no sean un bucle de horquilla, la estructura conectora se denomina "conector". En la presente también se utiliza el término "ARNip" para referirse a un ARNbc según se ha descrito anteriormente.
El agente de ARNi puede ser un "ARNip monocatenario" que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm diana. Los agentes que son ARNi monocatenarios se unen a la endonucleasa de RISC Argonauta 2, que a continuación escinde el ARNm diana. Los ARNip monocatenarios contienen generalmente 15-30 nucleótidos y están modificados químicamente. El diseño y la evaluación de ARNip monocatenarios se describe en la Patente de EE. UU. N.o 8.101.348 y en Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, los contenidos completos de cada uno de los cuales se incorporan a la presente por referencia. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en la presente (p. ej., las secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20) se pueden utilizar como un ARNip monocatenario según se describe en la presente o se pueden modificar químicamente mediante los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894.
En otro aspecto, el agente de ARN es una "molécula de ARN antisentido monocatenaria". Una molécula de ARN antisentido monocatenaria es complementaria respecto a una secuencia dentro del ARNm diana. Las moléculas de ARN antisentido monocatenarias pueden inhibir la traducción de un modo estequiométrico apareando sus bases con el ARNm y obstruyendo físicamente la maquinaria de traducción, remítase a Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Como alternativa, las moléculas antisentido monocatenarias inhiben un ARNm diana hibridándose con la
diana y escindiendo la diana a través de un evento de escisión de tipo RNasaH. La molécula de ARN antisentido monocatenaria puede tener una longitud comprendida entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos y puede tener una secuencia que sea complementaria respecto a una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula de ARN antisentido monocatenaria puede comprender una secuencia que tenga al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en la presente, p. ej., las secuencias proporcionadas en cualquiera de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20.
El experto reconocerá que la expresión "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" engloba, no solo las moléculas de ARN tal como se expresan o encuentran en la naturaleza, sino también análogos y derivados de ARN que comprenden uno o más análogos o derivados de ribonucleótidos/ribonucleósidos según se describen en la presente o como se conocen en la técnica. En términos estrictos, un "ribonucleósido" incluye una base nucleosídica y un azúcar de tipo ribosa, y un "ribonucleótido" es un ribonucleósido con uno, dos o tres restos de tipo fosfato. Sin embargo, los términos "ribonucleósido" y "ribonucleótido" se pueden considerar equivalentes según se utilizan en la presente. El ARN se puede modificar en la estructura de la base nucleotídica o en la estructura del esqueleto ribosafosfato, p. ej., según se describe en la presente más adelante. Sin embargo, las moléculas que comprenden análogos o derivados de ribonucleósidos deben conservar la capacidad para formar un dúplex. A modo de ejemplos no limitantes, una molécula de ARN también puede incluir al menos un ribonucleósido modificado, que incluye, sin carácter limitante, un nucleósido con una modificación de tipo 2'-O-metilo, un nucleósido que comprende un grupo 5'fosforotioato, un nucleósido terminal unido a un derivado de tipo colesterilo o un grupo de tipo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleósido bloqueado, un nucleósido que no sea básico, un nucleósido con una modificación de tipo 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleósido con una modificación de tipo 2'-amino, un nucleósido con una modificación de tipo 2'-alquilo, un nucleósido de tipo morfolino, un nucleósido que comprende una base que no sea natural o un fosforamidato, o cualquier combinación de estos. Como alternativa, una molécula de ARN puede comprender al menos dos ribonucleósidos modificados, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o más, hasta la longitud completa de la molécula de ARNbc. Las modificaciones no tienen que ser necesariamente las mismas para cada uno de esta pluralidad de ribonucleósidos modificados en una molécula de ARN. En una realización, los ARN modificados contemplados para ser utilizados en los métodos y las composiciones que se describen en la presente son ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés) que tienen la capacidad de formar la estructura de dúplex requerida y que permiten o median la degradación específica de un ARN diana, p. ej., mediante una vía de RISC.
En un aspecto, un ribonucleósido modificado incluye un desoxiribonucleósido. En un caso de este tipo, un agente de ARNi puede comprender uno o más desoxinucleósidos, que incluyen, por ejemplo, una o más protuberancias de desoxinucleósidos, o uno o más desoxinucleósidos dentro de la porción bicatenaria del ARNbc. Sin embargo, resulta obvio de por sí que una molécula de ADN bicatenaria no se englobará bajo ninguna circunstancia en el término "ARNi".
En un aspecto, un agente de interferencia por ARN incluye un ARN monocatenario que interacciona con una secuencia de ARN diana para dirigir la escisión del ARN diana. Sin pretender vincularse a ninguna teoría, el ARN bicatenario largo que es introducido en células es fragmentado para obtener ARNip por una endonucleasa de Tipo III conocida como Dicer (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc para obtener ARN interferentes pequeños de 19-23 pares de bases con protuberancias 3' de dos bases características (Bernstein et al., (2001) Nature 409:363). A continuación, los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde una o más helicasas deshacen el dúplex de ARNip, lo cual permite que la hebra antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen et al., (2001) Cell 107:309). Tras la unión al ARNm diana adecuado, una o más endonucleasas del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación se refiere a un ARN monocatenario que propicia la formación de un complejo RISC para ejercer el silenciamiento del gen diana.
La expresión "protuberancia de nucleótidos", tal como se utiliza en la presente, se refiere a al menos un nucleótido no apareado que sobresale de la estructura del dúplex de un ARNi, p. ej., un ARNbc. Por ejemplo, cuando un extremo 3' de una hebra de un ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa, se produce una protuberancia de nucleótidos. Un ARNbc puede comprender una protuberancia de al menos un nucleótido; como alternativa, la protuberancia puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Una protuberancia de nucleótidos puede comprender o estar constituida por un análogo de nucleótido/nucleósido, que incluye un desoxinucleótido/nucleósido. La o las protuberancias se pueden encontrar en la hebra sentido, la hebra antisentido o cualquier combinación de estas. Además, el o los nucleótidos de una protuberancia pueden estar presentes en el extremo 5', el extremo 3' o ambos extremos de la hebra sentido o antisentido de un ARNbc.
La hebra antisentido de un ARNbc puede tener una protuberancia de 1-10 nucleótidos en el extremo 3' y/o el extremo 5'. La hebra sentido de un ARNbc puede tener una protuberancia de 1-10 nucleótidos en el extremo 3' y/o el extremo 5'. Uno o más de los nucleótidos de la protuberancia se pueden reemplazar por un nucleósido-tiofosfato.
Las expresiones "romo" o "de extremos romos", tal como se utilizan en la presente para hacer referencia a un ARNbc, se refieren a que no hay nucleótidos ni análogos de nucleótidos no apareados en un extremo terminal determinado de un ARNbc, es decir, no hay protuberancias de nucleótidos. Uno o ambos extremos de un ARNbc pueden ser romos. Cuando ambos extremos de un ARNbc son romos, se dice que el ARNbc es de extremos romos. Para que no haya lugar a dudas, un ARNbc "de extremos romos" es un ARNbc que es romo en ambos extremos, es decir, que no tiene protuberancia de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula. En la mayoría de los casos, una molécula de este tipo será bicatenaria en toda su longitud.
La expresión "hebra antisentido" o "hebra guía" se refiere a la hebra de un ARNi, p. ej., un ARNbc, que incluye una región que es sustancialmente complementaria respecto a una secuencia diana. La expresión "región de complementariedad", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la región de la hebra antisentido que es sustancialmente complementaria respecto a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, según se define en la presente. Cuando la región de complementariedad no es totalmente complementaria respecto a la secuencia diana, los apareamientos erróneos se pueden producir en las regiones internas o terminales de la molécula. En general, los apareamientos erróneos más tolerados se encuentran en las regiones terminales, p. ej., en los 5, 4, 3 o 2 nucleótidos de los extremos 5' y/o 3'.
La expresión "hebra sentido" o "hebra pasajera", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la hebra de un ARNi que incluye una región que es sustancialmente complementaria respecto a una región de la hebra antisentido, según se define este término en la presente.
El término "SNALP" (por sus siglas en inglés), tal como se utiliza en la presente, se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable. Una SNALP representa una vesícula de lípidos que recubre un interior acuoso reducido que comprende un ácido nucleico tal como un ARNi o un plásmido a partir del cual se transcribe un ARNi. Las SNALP se describen, p. ej., en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N.os 20060240093, 20070135372, y en la Solicitud Internacional N.o WO 2009082817.
La expresión "se introduce en una célula", cuando hace referencia a un ARNi, se refiere a que se facilita o se lleva a cabo su captación o absorción en la célula, según sobreentienden los expertos en la técnica. La absorción o captación de un ARNi se puede producir a través de procesos celulares activos o difusos sin ayuda, o mediante dispositivos o agentes auxiliares. El significado de este término no se limita a células in vitro; un ARNi también se puede "introducir en una célula", donde la célula sea parte de un organismo vivo. En un caso de este tipo, la introducción en la célula incluirá el suministro al organismo. Por ejemplo, para un suministro in vivo, el ARNi se pueden inyectar en un punto tisular o se puede administrar por vía sistémica. El suministro in vivo también se puede llevar a cabo mediante un sistema de suministro de β-glucano tal como los que se describen en las Patentes de EE. UU. N.os 5.032.401 y 5.607.677, y en la Publicación de EE. UU. N.o 2005/0281781. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tales como la electroporación y lipofección. Existen otras estrategias conocidas en la técnica o que se describen en la presente más adelante.
La expresión "modular la expresión de", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una "inhibición" al menos parcial o una "activación" parcial de la expresión de un gen ALAS1 en una célula tratada con una composición de ARNi según se describe en la presente en comparación con la expresión de ALAS1 en una célula de control. Una célula de control incluye una célula no tratada o una célula tratada con un ARNi de control que no actúe sobre la diana.
Las expresiones "activar", "potenciar", "aumentar la expresión de", "incrementar la expresión de" y similares, siempre que hagan referencia a un gen ALAS1, se refieren en la presente a la activación al menos parcial de la expresión de un gen ALAS1, que se manifiesta por un incremento de la cantidad de ARNm de ALAS1, el cual se puede aislar o detectar a partir de una primera célula o grupo de células en las cuales se transcriba un gen ALAS1 y que se han o hayan tratado de un modo tal que se incremente la expresión de un gen ALAS1, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no se han o hayan tratado de ese modo (células de control).
La expresión de un gen ALAS1 se puede activar al menos aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% mediante la administración de un ARNi según se describe en la presente. Un gen ALAS1 se puede activar al menos aproximadamente un 60%, 70% u 80% mediante la administración de un ARNi que se expone en la invención. La expresión de un gen ALAS1 se puede activar al menos aproximadamente un 85%, 90% o 95% o más mediante la administración de un ARNi según se describe en la presente. La expresión del gen ALAS1 se puede incrementar al menos 1 vez, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en células tratadas con un ARNi según se describe en la presente en comparación con la expresión en una célula no tratada. La activación de la expresión por parte de ARNbc pequeños se describe, por ejemplo, en Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42, y en US20070111963 y US2005226848.
Las expresiones "silenciar", "inhibir la expresión de", "reducir la expresión de", "suprimir la expresión de" y similares, siempre que hagan referencia a un gen ALAS1, se refieren en la presente a la supresión al menos parcial de la expresión de un gen ALAS1, según se evalúa, p. ej., en función de la expresión del ARNm de ALAS1, la expresión
de la proteína ALAS1 u otro parámetro relacionado funcionalmente con la expresión del gen ALAS1 (p. ej., las concentraciones de ALA o PBG en plasma u orina). Por ejemplo, la inhibición de la expresión de ALAS1 se puede manifestar por una reducción de la cantidad de ARNm de ALAS1 que se puede aislar o detectar a partir de una primera célula o grupo de células en las que se transcriba un gen ALAS1 y que se han o hayan tratado de un modo tal que se inhiba la expresión de un gen ALAS1, en comparación con un control. El control puede ser una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células, con la excepción de que la segunda célula o grupo de células no se han tratado del mismo modo (células de control). El grado de inhibición se expresa normalmente como un porcentaje de un nivel de control, p. ej.,
Como alternativa, el grado de inhibición se puede proporcionar en términos de una reducción de un parámetro que esté relacionado funcionalmente con la expresión del gen ALAS1, p. ej., la cantidad de proteína codificada por un gen ALAS1 o el nivel de una o más porfirinas. La reducción de un parámetro relacionado funcionalmente con la expresión del gen ALAS1 se puede expresar de forma similar como un porcentaje de un nivel de control. En principio, el silenciamiento de un gen ALAS1 se puede determinar en cualquier célula que exprese ALAS1, ya sea constitutivamente o mediante una modificación genómica, y mediante cualquier ensayo adecuado. Sin embargo, cuando se necesite una referencia para determinar si un ARNi determinado inhibe la expresión del gen ALAS1 en cierto grado y, por consiguiente, queda englobado en la presente invención, los ensayos proporcionados en los Ejemplos más adelante deberán servir como una referencia de este tipo.
Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión de un gen ALAS1 se suprime al menos aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% mediante la administración de un ARNi que se expone en la invención. Se describe que un gen ALAS1 se suprime al menos aproximadamente un 60%, 65%, 70%, 75% u 80% mediante la administración de un ARNi que se expone en la invención. Se describe que un gen ALAS1 se suprime al menos aproximadamente un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más mediante la administración de un ARNi según se describe en la presente.
Los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares, tal como se utilizan en la presente en el contexto de la expresión de ALAS1, se refieren al alivio o la reducción de procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1 (p. ej., procesos patológicos que implican porfirinas o defectos en la vía de las porfirinas tales como, por ejemplo, las porfirias). En el contexto de la presente invención, y siempre que se refieran a cualquiera de las diferentes condiciones mencionadas en la presente más adelante (además de los procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1), los términos "tratar", "tratamiento" y similares se refieren a prevenir, aliviar o reducir al menos un síntoma asociado con tal afección, o ralentizar o revertir la evolución o la evolución anticipada de tal afección. Por ejemplo, los métodos que se exponen en la presente, cuando se emplean para tratar una porfiria, pueden servir para reducir o prevenir uno o más síntomas asociados con la porfiria (p. ej., el dolor), para reducir la gravedad o frecuencia de los ataques asociados con la porfiria, para reducir la probabilidad de que se produzca un ataque de uno o más síntomas asociados con la porfiria tras la exposición a una condición precipitante, para reducir la duración de un ataque asociado con la porfiria y/o para reducir el riesgo de desarrollar afecciones asociadas con la porfiria (p. ej., un cáncer hepatocelular o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva)). De este modo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, se pretende que los términos "tratar", "tratamiento" y similares engloben la profilaxis, p. ej., la prevención de trastornos y/o síntomas de trastornos relacionados con la expresión de ALAS1.
El término "inferior", en el contexto de un síntoma o marcador de una enfermedad, se refiere a una reducción estadística o clínicamente significativa de dicho nivel. La reducción puede ser, por ejemplo, de al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o más y normalmente disminuye hasta un nivel que se acepta como perteneciente al intervalo normal para un individuo sin tal trastorno.
Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" y "cantidad profilácticamente eficaz", tal como se utilizan en la presente, se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, la prevención o la gestión de procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede ser determinada fácilmente por un médico común y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, el tipo de proceso patológico, el historial y la edad del paciente, la etapa del proceso patológico y la administración de otros agentes.
La expresión "composición farmacéutica", tal como se utiliza en la presente, comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNi y un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz" o simplemente "cantidad eficaz", tal como se utiliza en la presente, se refiere a aquella cantidad de un ARNi que es eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo esperado. Por ejemplo, en un método para tratar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 (p. ej., en un método para tratar una porfiria), una cantidad eficaz incluye una cantidad eficaz para reducir uno o más síntomas asociados con una porfiria, una cantidad eficaz para reducir la frecuencia de los ataques, una cantidad eficaz para reducir la probabilidad de que se produzca un ataque de uno o más síntomas asociados con
una porfiria tras la exposición a un factor precipitante, o una cantidad eficaz para reducir el riesgo de desarrollar afecciones asociadas con una porfiria (p. ej., una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva), un cáncer hepatocelular). Por ejemplo, si un tratamiento clínico determinado se considera eficaz cuando se produce una reducción de al menos un 10% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esta enfermedad o trastorno será la cantidad necesaria para ejercer una reducción de al menos un 10% en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNi que tenga ALAS1 como diana puede reducir los niveles de la proteína ALAS1 en cualquier cantidad medible, p. ej., al menos un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%.
La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, sin carácter limitante, solución salina, solución tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos. El término excluye específicamente el medio de cultivo celular. Para los fármacos que se administran por vía oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter limitante, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes desintegrantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el aparato gastrointestinal. Los agentes incluidos en las formulaciones farmacológicas se describen con más detalle en la presente posteriormente.
El término "aproximadamente", cuando hace referencia a un número o a un intervalo, se refiere a que el número o intervalo mencionado es una aproximación dentro de la variabilidad experimental (o dentro del error experimental estadístico) y, por lo tanto, el número o intervalo numérico puede variar, por ejemplo, entre un 1% y un 15% del número o intervalo numérico mencionado.
II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc)
En la presente se describen agentes de ARNi que inhiben la expresión de un gen ALAS1. El agente de ARNi puede incluir moléculas de ácido ribonucleico bicatenarias (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen ALAS1 en una célula o en un sujeto (p. ej., en un mamífero, p. ej., en un ser humano que padezca una porfiria), donde el ARNbc incluye una hebra antisentido que tiene una región de complementariedad que es complementaria respecto a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen ALAS1, y donde la región de complementariedad tiene una longitud de 30 nucleótidos o inferior, generalmente una longitud de 19-24 nucleótidos, y donde el ARNbc, cuando entra en contacto con una célula que expresa el gen ALAS1, inhibe la expresión del gen ALAS1 al menos un 10%, según se evalúa mediante, por ejemplo, un método basado en PCR o ADN ramificado (ADNr), o mediante un método basado en proteínas tal como la inmunotransferencia de Western. El agente de ARNi puede activar la expresión de un gen ALAS1 en una célula o mamífero. La expresión de un gen ALAS1 en un cultivo celular, tal como células COS, células HeLa, hepatocitos primarios, células HepG2, células cultivadas primarias, o en una muestra biológica procedente de un sujeto se puede evaluar midiendo los niveles de ARNm de ALAS1, por ejemplo, mediante un ensayo de ADNr o TaqMan, o midiendo los niveles de proteínas, por ejemplo, mediante un análisis de inmunofluorescencia, utilizando, por ejemplo, técnicas de citometría de flujo o inmunotransferencia de Western.
Un ARNbc incluye dos hebras de ARN que son suficientemente complementarias para hibridarse y formar una estructura de dúplex en las condiciones en las que se utilizará el ARNbc. Una hebra de un ARNbc (la hebra antisentido) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y en general totalmente complementaria, respecto a una secuencia diana, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen ALAS1. La otra hebra (la hebra sentido) incluye una región que es complementaria respecto a la hebra antisentido, de modo que las dos hebras se hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. En general, la estructura de dúplex tiene una longitud comprendida entre 15 y 30 pares de bases inclusive, más generalmente entre 18 y 25 inclusive, aún más generalmente entre 19 y 24 inclusive, y de la forma más general entre 19 y 21 inclusive. De forma similar, la región de complementariedad respecto a la secuencia diana tiene una longitud comprendida entre 15 y 30 nucleótidos inclusive, más generalmente entre 18 y 25 inclusive, aún más generalmente entre 19 y 24 inclusive, y de la forma más general entre 19 y 21 inclusive. El ARNbc puede tener una longitud comprendida entre 15 y 20 nucleótidos o una longitud comprendida entre 25 y 30 nucleótidos inclusive. Como reconocerá el experto, la región que actúa como diana de un ARN que actúa como diana para ser escindido formará parte en la mayoría de los casos de una molécula de ARN más larga, a menudo una molécula de ARNm. Cuando sea relevante, una "parte" de una diana de ARNm es una secuencia contigua de una diana de ARNm de longitud suficiente para que sea un sustrato para la escisión dirigida por iARN (es decir, la escisión a través de una vía de RISC). Los ARNbc que tienen dúplex de tan solo 9 pares de bases pueden mediar, en algunas circunstancias, la escisión del ARN dirigida por iARN. En la mayoría de los casos, una diana tendrá una longitud de al menos 15 nucleótidos, p. ej., una longitud de 15-30 nucleótidos.
Un experto en la técnica también reconocerá que la región dúplex es una porción funcional principal de un ARNbc, p. ej., una región dúplex de 9 a 36, p. ej., de 15-30 pares de bases. De este modo, siempre que se procese hasta
obtener un dúplex funcional de, p. ej., 15-30 pares de bases que tenga como diana un ARN deseado para escindirlo, una molécula de ARN o un complejo de moléculas de ARN que tengan una región dúplex con un tamaño superior a 30 pares de bases será un ARNbc. De este modo, un experto reconocerá que un miARN será entonces un ARNbc. Un ARNbc puede no ser un miARN de origen natural. Un agente de ARNi útil para actuar sobre la expresión de ALAS1 puede no generarse en la célula diana mediante la escisión de un ARNbc más largo.
Un ARNbc según se describe en la presente puede incluir además una o más protuberancias de nucleótidos monocatenarias. El ARNbc se puede sintetizar mediante métodos estándar conocidos en la técnica, según se describe adicionalmente más adelante, p. ej., mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado tal como los comercializados por, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Un gen de ALAS1 puede ser un gen de ALAS1 humano. El gen de ALAS1 puede ser un gen de ALAS1 de rata o ratón. La primera secuencia puede ser una hebra sentido de un ARNbc que incluye una secuencia sentido de la Tabla 2 o la Tabla 3, y la segunda secuencia es una hebra antisentido de un ARNbc que incluye una secuencia antisentido de la Tabla 2 o la Tabla 3. La primera secuencia puede ser una hebra sentido de un ARNbc que incluye una secuencia sentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 o 15, y la segunda secuencia es una hebra antisentido de un ARNbc que incluye una secuencia antisentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 o 15. La primera secuencia puede ser una hebra sentido de un ARNbc que incluye una secuencia sentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20, y la segunda secuencia puede ser una hebra antisentido de un ARNbc que incluye una secuencia antisentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. Se pueden determinar fácilmente agentes de ARNbc alternativos que tengan como diana secuencias distintas a las de los ARNbc descritos en la presente (p. ej., en la Tabla 2 o la Tabla 3), utilizando la secuencia diana y la secuencia de ALAS1 flanqueante.
En un aspecto, un ARNbc incluirá al menos secuencias de nucleótidos sentido y antisentido, donde la hebra sentido se selecciona a partir de los grupos de secuencias que se proporcionan en las Tablas 2 y 3, y la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido se selecciona a partir de las Tablas 2 y 3. En un aspecto adicional, un ARNbc incluirá al menos secuencias de nucleótidos sentido y antisentido, donde la hebra sentido se selecciona a partir de los grupos de secuencias que se proporcionan en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15, y la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido se selecciona a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 y 15. En un aspecto adicional, un ARNbc incluirá al menos secuencias de nucleótidos sentido y antisentido, donde la hebra sentido se selecciona a partir de los grupos de secuencias que se proporcionan en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20, y la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido se selecciona a partir de las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20. En estos aspectos, una de las dos secuencias es complementaria respecto a la otra de las dos secuencias, siendo una de las secuencias sustancialmente complementaria respecto a una secuencia de un ARNm generado mediante la expresión de un gen ALAS1. En este sentido, un ARNbc incluirá dos oligonucleótidos, donde un oligonucleótido se describe como la hebra sentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20, y el segundo oligonucleótido se describe como la hebra antisentido correspondiente de la hebra sentido de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20. Según se describe en otras partes de la presente y se sabe en la técnica, las secuencias complementarias de un ARNbc también pueden estar contenidas como regiones autocomplementarias de una única molécula de ácido nucleico, en lugar de estar en oligonucleótidos separados.
El experto es muy consciente de que los ARNbc que tienen una estructura de dúplex con una longitud comprendida entre 20 y 23, pero específicamente de 21, pares de bases se consideran particularmente eficaces a la hora de inducir la interferencia por ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han observado que estructuras de dúplex de ARN más largas o más cortas también pueden ser eficaces. En las realizaciones descritas anteriormente, debido a la naturaleza de las secuencias de oligonucleótido proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20, los ARNbc descritos en la presente pueden incluir al menos una hebra con una longitud de como mínimo 21 nucleótidos. Cabe esperar razonablemente que dúplex más cortos que tengan una de las secuencias de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20 menos solamente unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser similarmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por lo tanto, se contemplan ARNbc con una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de la Tabla 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 o 20 y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen ALAS1 en no más de un 5, 10, 15, 20, 25 o 30% de inhibición en comparación con un ARNbc que comprenda toda la secuencia.
Además, los ARN proporcionados en las Tablas 2 y 3, así como también los ARN proporcionados en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20, identifican un sitio en un transcrito de ALAS1 que es susceptible de sufrir una escisión mediada por RISC. En este sentido, la presente invención expone además ARNi que actúan dentro de una de estas secuencias. Según se utiliza en la presente, se dice que un ARNi actúa dentro de un sitio particular de un transcrito de ARN si el ARNi fomenta la escisión del transcrito en cualquier lugar dentro de ese sitio particular. Un ARNi de este tipo incluye generalmente al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20 acoplados a secuencias de nucleótidos adicionales procedentes de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen ALAS1.
Aunque una secuencia diana tiene generalmente una longitud de 15-30 nucleótidos, existe una gran variación en la idoneidad de secuencias particulares en este intervalo para dirigir la escisión de cualquier ARN diana determinado. Varios paquetes de software y las directrices que se exponen en la presente proporcionan una guía para la
identificación de secuencias diana óptimas para cualquier diana génica determinada, pero también se puede adoptar una estrategia empírica en la cual se coloca una "ventana" o "máscara" de un tamaño determinado (a modo de ejemplo no limitante, 21 nucleótidos) de forma literal o figurada (que incluye, p. ej., in silico) sobre la secuencia de ARN diana para identificar secuencias en el intervalo de tamaños que puedan servir como secuencias diana. Moviendo la "ventana" de la secuencia progresivamente un nucleótido hacia adelante o hacia atrás respecto a una localización de la secuencia diana inicial, se puede identificar la siguiente secuencia diana potencial, hasta que se identifica el conjunto completo de posibles secuencias para cualquier tamaño seleccionado de la diana determinada. Este proceso, acoplado con la síntesis y la evaluación sistemáticas de las secuencias identificadas (utilizando ensayos como los que se describen en la presente o se conocen en la técnica) para identificar las secuencias que presentan un comportamiento óptimo, permite identificar las secuencias de ARN que, cuando actúan como diana de un agente de ARNi, median la mejor inhibición de la expresión del gen diana. De este modo, aunque las secuencias identificadas, por ejemplo, en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20 representan secuencias diana eficaces, se contempla que se puede conseguir una optimización adicional de la eficacia de la inhibición "desplazando la ventana" progresivamente un nucleótido hacia adelante o hacia atrás en las secuencias determinadas para identificar secuencias con unas características de inhibición iguales o mejores.
Adicionalmente, se contempla que para cualquier secuencia identificada, p. ej., en las Tablas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 y 20, se puede conseguir una optimización adicional añadiendo o eliminando nucleótidos de forma sistemática para generar secuencias más largas o más cortas y evaluando estas secuencias y secuencias generadas desplazando una ventana del tamaño más largo o más corto hacia adelante o hacia atrás en el ARN diana a partir de ese punto. Nuevamente, el acoplamiento de esta estrategia para generar nuevas dianas candidato con la evaluación para determinar la eficacia de los ARNi basándose en estas secuencias diana en un ensayo de inhibición como los que se conocen en la técnica o como los que se describen en la presente puede proporcionar mejoras adicionales en la eficacia de la inhibición. Es más, tales secuencias optimizadas se pueden ajustar mediante, p. ej., la introducción de nucleótidos modificados como los que se describen en la presente o como los que se conocen en la técnica, la adición o la introducción de cambios en la protuberancia u otras modificaciones como las que se conocen en la técnica y/o se describen en la presente para optimizar adicionalmente la molécula (p. ej., incrementar la estabilidad en suero o la semivida en circulación, incrementar la estabilidad térmica, potenciar el suministro transmembranal, ejercer un direccionamiento hacia una localización o tipo celular particular, incrementar la interacción con las enzimas de la vía de silenciamiento, incrementar la liberación a partir de endosomas, etc.) como un inhibidor de la expresión.
Un ARNi según se describe en la presente puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. En una realización, un ARNi, tal como se describe en la presente, no contiene más de 3 apareamientos erróneos. Si la hebra antisentido del ARNi contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es preferible que el área de apareamiento erróneo no se encuentre localizada en el centro de la región de complementariedad. Si la hebra antisentido del ARNi contiene apareamientos erróneos con la secuencia diana, es preferible que el apareamiento erróneo esté restringido a encontrarse dentro de los últimos 5 nucleótidos considerados desde el extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una hebra de ARN de un agente de ARNi de 23 nucleótidos que sea complementaria respecto a una región de un gen ALAS1, la hebra de ARN generalmente no contendrá ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la presente o los métodos conocidos en la técnica se pueden utilizar para determinar si un ARNi que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz a la hora de inhibir la expresión de un gen ALAS1. La consideración de la eficacia de ARNi con apareamientos erróneos a la hora de inhibir la expresión de un gen ALAS1 es importante, especialmente si existe constancia de que la región de complementariedad particular de un gen ALAS1 presente una variación de la secuencia polimórfica dentro de la población.
Al menos un extremo de un ARNbc puede tener una protuberancia de nucleótidos monocatenaria de 1 a 4, generalmente 1 o 2, nucleótidos. Los ARNbc que tienen al menos una protuberancia de nucleótidos presentan, inesperadamente, unas propiedades inhibitorias superiores con relación a sus homólogos de extremos romos. El ARN de un ARNi, p. ej., un ARNbc, se puede modificar químicamente para mejorar su estabilidad u otras características beneficiosas. Los ácidos nucleicos que se exponen en la invención se pueden sintetizar y/o modificar mediante métodos muy establecidos en la técnica tales como los que se describen en “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE. UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, (a) modificaciones de los extremos, p. ej., modificaciones del extremo 5' (fosforilación, conjugación, uniones invertidas, etc.), modificaciones del extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, uniones invertidas, etc.) (b) modificaciones de las bases, p. ej., reemplazo por bases estabilizantes, bases desestabilizantes
o bases que se apareen con bases con un mayor repertorio de parejas, eliminación de bases (nucleótidos sin bases), o bases conjugadas, (c) modificaciones del azúcar (p. ej., en la posición 2' o en la posición 4') o reemplazo del azúcar, así como también (d) modificaciones del esqueleto, que incluyen la modificación o el reemplazo de las uniones de tipo fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARN útiles en esta invención incluyen, sin carácter limitante, ARN que contienen esqueletos modificados o uniones entre nucleósidos no naturales. Los ARN que tienen esqueletos modificados incluyen, entre otros, aquellos que no contienen un átomo de fósforo en el esqueleto. A los efectos de esta memoria descriptiva y según se los denomina en ocasiones en la técnica, los ARN modificados que no contienen un átomo de fósforo en su esqueleto entre los nucleósidos también se pueden
considerar oligonucleósidos. El ARN modificado puede contener un átomo de fósforo en su esqueleto entre los nucleósidos.
Los esqueletos de ARN modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilfosfonatos y fosfonatos con otros grupos alquilo que incluyen 3'alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos con uniones 3'-5' normales, análogos con uniones 2'-5' de estos y aquellos con polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están unidos del siguiente modo: 3'-5' con 5'-3' o 2'-5' con 5'-2'. También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de las uniones que contienen fósforo anteriores incluyen, sin carácter limitante, las Pat. de EE. UU. N.os 3.687.808, 4.469.863, 4.476.301, 5.023.243, 5.177.195, 5.188.897, 5.264.423, 5.276.019, 5.278.302, 5.286.717, 5.321.131, 5.399.676, 5.405.939, 5.453.496, 5.455.233, 5.466.677, 5.476.925, 5.519.126, 5.536.821, 5.541.316, 5.550.111, 5.563.253, 5.571.799, 5.587.361, 5.625.050, 6.028.188, 6.124.445, 6.160.109, 6.169.170, 6.172.209, 6.239.265, 6.277.603, 6.326.199, 6.346.614, 6.444.423, 6.531.590, 6.534.639, 6.608.035, 6.683.167, 6.858.715, 6.867.294, 6.878.805, 7.015.315, 7.041.816, 7.273.933, 7.321.029 y la Pat. de EE. UU. RE39464.
Los esqueletos de ARN modificados que no incluyen ningún átomo de fósforo en ellos tienen esqueletos que se forman mediante uniones entre nucleósidos de tipo alquilo o cicloalquilo de cadena corta, uniones entre nucleósidos de tipo alquilo o cicloalquilo y heteroátomos mixtas, o una o más uniones entre nucleósidos heteroaromáticas o heterocíclicas de cadena corta. Estos incluyen los que tienen uniones de tipo morfolino (formadas en parte a partir de la porción del azúcar de un nucleósido); esqueletos de tipo siloxano; esqueletos de tipo sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de tipo formacetilo y tioformacetilo; esqueletos de tipo metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alquenos; esqueletos de tipo sulfamato; esqueletos de tipo metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de tipo sulfonato y sulfonamida; esqueletos de tipo amida; y otros que tienen partes de componentes N, O, S y CH2 mixtas.
Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de los oligonucleótidos anteriores incluyen, sin carácter limitante, las Pat. de EE. UU. N.os 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.214.134, 5.216.141, 5.235.033, 5.64.562, 5.264.564, 5.405.938, 5.434.257, 5.466.677, 5.470.967, 5.489.677, 5.541.307, 5.561.225, 5.596.086, 5.602.240, 5.608.046, 5.610.289, 5.618.704, 5.623.070, 5.663.312, 5.633.360, 5.677.437 y 5.677.439.
En otros miméticos de ARN adecuados o contemplados para su uso en ARNi, tanto el azúcar como la unión entre nucleósidos, es decir, el esqueleto, de las unidades nucleotídicas se reemplazan por grupos novedosos. Las unidades de las bases se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de tipo ácido nucleico adecuado. Un compuesto oligomérico de este tipo, un mimético de ARN que se ha demostrado que presenta unas propiedades de hibridación excelentes, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de tipo PNA, el esqueleto del azúcar de un ARN se ha reemplazado por un esqueleto que contiene amidas, en particular un esqueleto de tipo aminoetilglicina. Las bases nucleotídicas se conservan y están unidas directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amídica del esqueleto. Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de compuestos de tipo PNA incluyen, sin carácter limitante, las Pat. de EE. UU. N.os 5.539.082, 5.714.331 y 5.719.262. Otras descripciones de compuestos de tipo PNA se pueden encontrar, por ejemplo, en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Se describen ARN con esqueletos de tipo fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos que contienen heteroátomos, y en particular --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[que se conoce como un esqueleto de tipo metilen(metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--y --N(CH3)--CH2--CH2--[donde el esqueleto de tipo fosfodiéster nativo se representa como --O--P--O--CH2--] de la Pat. de EE. UU. N.o 5.489.677 a la que se ha hecho referencia anteriormente y los esqueletos de tipo amida de la Pat. de EE. UU. N.o 5.602.240 a la que se ha hecho referencia anteriormente. En algunas realizaciones, los ARN que se exponen en la presente tienen las estructuras del esqueleto de tipo morfolino de la Pat. de EE. UU. N.o 5.036.506 a la que se ha hecho referencia anteriormente.
Los ARN modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, p. ej., ARNbc que se exponen en la presente pueden incluir uno de los siguientes grupos en la posición 2': OH; F; O-, S-o Nalquilo; O-, S-o N-alquenilo; O-, S-o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser un alquilo C1-C10, alquenilo y alquinilo C2-C10 sustituido o no sustituido. Las modificaciones adecuadas ilustrativas incluyen O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m están comprendidos entre 1 y aproximadamente 10. Los ARNbc pueden incluir uno de los siguientes grupos en la posición 2': alquilo inferior C1-C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo que escinde ARN, un grupo marcador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNi, y otros sustituyentes con propiedades similares. La modificación puede incluir un 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'
MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ilustrativa es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, según se describe en los ejemplos de la presente más adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (que también se conoce en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, que también se describe en los ejemplos de la presente más adelante.
Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones del ARN de un ARNi, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en ARNbc con uniones 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcares tales como restos de tipo ciclobutilo en lugar del azúcar de tipo pentofuranosilo. Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de tales estructuras de azúcares modificadas incluyen, sin carácter limitante, las Pat. de EE. UU. N.os 4.981.957, 5.118.800, 5.319.080, 5.359.044, 5.393.878, 5.446.137, 5.466.786, 5.514.785, 5.519.134, 5.567.811, 5.576.427, 5.591.722, 5.597.909, 5.610.300, 5.627.053, 5.639.873, 5.646.265, 5.658.873, 5.670.633 y 5.700.920.
Un ARNi también puede incluir sustituciones o modificaciones en la base nucleotídica (a la cual se hace referencia a menudo en la técnica simplemente como "base"). Las bases nucleotídicas "naturales" o "no modificadas", según se utilizan en la presente, incluyen las bases púricas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases nucleotídicas modificadas incluyen otras bases nucleotídicas naturales y sintéticas tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6metiladenina y 6-metilguanina y otros derivados alquílicos de la adenina y la guanina, 2-propiladenina y 2propilguanina y otros derivados alquílicos de la adenina y la guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5halouracilo y 5-halocitosina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, 6-azouracilo, 6-azocitosina y 6-azotimina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo-, 8-amino-, 8-tiol-, 8-tioalquil-, 8-hidroxil-adenina y -guanina y adeninas y guaninas con otros sustituyentes en la posición 8, 5-halo-, particularmente 5-bromo-, 5-trifluorometil-uracilo y citosina y uracilos y citosinas con otros sustituyentes en la posición 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras bases nucleotídicas incluyen las que se describen en la Pat. de EE. UU. N.o 3.687.808, las que se describen en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; las que se describen en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, las que se describen en Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 y las que se describen en Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas bases nucleotídicas son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos que se exponen en la invención. Estas incluyen pirimidinas sustituidas en la posición 5, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en la posición N-2, N-6 y 0-6, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de tipo 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico de 0.6 a 1.2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke,
S. T. y Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de las bases ilustrativas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones del azúcar de tipo 2'-O-metoxietilo.
Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de algunas de las bases nucleotídicas modificadas mencionadas anteriormente, así como también de otras bases nucleotídicas modificadas incluyen, sin carácter limitante, la Pat. de EE. UU. mencionada anteriormente N.o 3.687.808, así como también las Pat. de EE. UU. N.os 4.845.205, 5.130.30, 5.134.066, 5.175.273, 5.367.066, 5.432.272, 5.457.187, 5.459.255, 5.484.908, 5.502.177, 5.525.711, 5.552.540, 5.587.469, 5.594.121, 5.596.091, 5.614.617, 5.681.941, 6.015.886, 6.147.200, 6.166.197, 6.222.025, 6.235.887, 6.380.368, 6.528.640, 6.639.062, 6.617.438, 7.045.610, 7.427.672 y 7.495.088 y la Pat. de EE. UU. N.o 5.750.692.
El ARN de un ARNi también se puede modificar para que incluya uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en el cual el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Esta estructura "bloquea" de forma eficaz la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip incrementa la estabilidad del ARNip en suero y reduce los efectos laterales (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
Las Patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados incluyen, sin carácter limitante, las siguientes: Pat. de EE. UU. N.os 6.268.490, 6.670.461, 6.794.499, 6.998.484, 7.053.207, 7.084.125 y 7.399.845.
Las modificaciones potencialmente estabilizantes en los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hip-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hip-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hip-NHAc), timidin-2'-O-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hip-C6-amino), 2-docosanoiluridin3"-fosfato, base dT invertida (idT) y otras. La descripción de esta modificación se puede encontrar en la Publicación de PCT N.o WO 2011/005861.
Motivos del ARNi
Se describe que la secuencia de la hebra sentido se puede representar mediante la fórmula (I):
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3' (I) donde: i y j son cada uno independientemente 0 o 1; p y q son cada uno independientemente 0-6;
cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos
modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente; cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np y nq representa independientemente un nucleótido protuberante; donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y XXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres
nucleótidos consecutivos. Preferentemente, YYY son todos nucleótidos con la modificación 2’-F. Se describe que Na y/o Nb comprenden modificaciones de patrón alterno. Se describe que el motivo YYY se encuentra en el sitio de escisión de la hebra sentido o cerca de este. Por ejemplo,
cuando el agente de iARN tiene una región dúplex con una longitud de 17-23 nucleótidos, el motivo YYY se puede encontrar en el sitio de escisión o cerca de este (p. ej.: se puede encontrar en las posiciones 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 u 11, 12, 13) de la hebra sentido, empezando a contar a partir del primer nucleótido del extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el primer nucleótido apareado dentro de la región dúplex, a partir del extremo 5'.
Se describe que i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. Por consiguiente, la hebra sentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); o
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id). Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (Ib), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que
comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Ic), Nb representa una secuencia oligonucleotídica que
comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una
secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la hebra sentido se representa como la fórmula (Id), cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada Na puede representar independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 215 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de los grupos X, Y y Z puede ser igual o diferente de los demás. Se describe que i es 0 y j es 0, y la hebra sentido se puede representar mediante la fórmula: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia). Cuando la hebra sentido se representa mediante la fórmula (Ia), cada Na puede representar independientemente una
secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Se describe que la secuencia de la hebra antisentido del ARNi se puede representar mediante la fórmula (II): 5' nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′ 3' (II) donde:
k y l son cada uno independientemente 0 o 1; p' y q' son cada uno independientemente 0-6; cada Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos
modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados; cada np' y nq' representa independientemente un nucleótido protuberante; donde Nb' e Y' no tienen la misma modificación; y X′X′X′, Y′Y′Y′ y Z′Z′Z′ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres
nucleótidos consecutivos. Se describe que Na' y/o Nb' comprenden modificaciones de patrón alterno. El motivo Y′Y′Y′ se encuentra en el sitio de escisión de la hebra antisentido o cerca de este. Por ejemplo, cuando el
agente de iARN tiene una región dúplex con una longitud de 17-23 nucleótidos, el motivo Y′Y′Y se puede encontrar en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 o 13, 14, 15 de la hebra antisentido, empezando a contar a partir del primer nucleótido del extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el primer nucleótido apareado dentro de la región dúplex, a partir del extremo 5'. Preferentemente, el motivo Y′Y′Y′ se encuentra en las posiciones 11, 12, 13.
Se describe que el motivo Y′Y′Y′ consiste en que todos los nucleótidos presentan la modificación 2’-OMe. Se describe que k es 1 y l es 0, o k es 0 y l es 1, o tanto k como l son 1. Por consiguiente, la hebra antisentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas: 5' nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’ 3' (IIb);
5' nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’ 3' (IIc); o
5' nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’ 3' (IId).
Cuando la hebra antisentido se representa mediante la fórmula (IIb), Nb' representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (IIc), Nb' representa una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (IId), cada Nb' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferentemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Se describe que k es 0 y l es 0, y la hebra antisentido se puede representar mediante la fórmula:
5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 3' (Ia).
Cuando la hebra antisentido se representa como la fórmula (IIa), cada Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de los grupos X', Y' y Z' puede ser igual o diferente de los demás.
Cada nucleótido de la hebra sentido y la hebra antisentido se puede modificar independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietilo, 2’-O-metilo, 2’-O-alilo, 2’-C-alilo, 2’-hidroxilo o 2’-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la hebra sentido y la hebra antisentido se modifica independientemente con 2’-O-metilo o 2’-fluoro. Cada X, Y, Z, X′, Y′ y Z′, en particular, puede representar una modificación de tipo 2’-O-metilo o una modificación de tipo 2’-fluoro.
Se describe que la hebra sentido del agente de iARN puede contener un motivo YYY que se encuentre en las posiciones 9, 10 y 11 de la hebra cuando la región dúplex tiene 21 nt, empezando a contar a partir del primer nucleótido del extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el primer nucleótido apareado dentro de la
región dúplex, a partir del extremo 5'; e Y representa una modificación de tipo 2’-F. La hebra sentido puede contener adicionalmente un motivo XXX o motivos ZZZ como modificaciones laterales en el extremo opuesto de la región dúplex; y cada motivo XXX y ZZZ representa independientemente una modificación de tipo 2’-OMe o una modificación de tipo 2’-F.
Se describe que la hebra antisentido puede contener un motivo Y′Y′Y′ que se encuentre en las posiciones 11, 12, 13 de la hebra, empezando a contar a partir del primer nucleótido del extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el primer nucleótido apareado dentro de la región dúplex, a partir del extremo 5'; e Y' representa una modificación de tipo 2’-O-metilo. La hebra antisentido puede contener adicionalmente un motivo X′X′X′ o motivos Z′Z′Z′ como modificaciones laterales en el extremo opuesto de la región dúplex; y cada motivo X′X′X′ y Z′Z′Z′ representa independientemente una modificación de tipo 2’-OMe o una modificación de tipo 2’-F.
La hebra sentido representada mediante cualquiera de las fórmulas anteriores (Ia), (Ib), (Ic) y (Id) forma un dúplex con una hebra antisentido representada mediante cualquiera de las fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) y (IId), respectivamente.
Por consiguiente, los agentes de iARN que se pueden utilizar en los métodos descritos pueden comprender una hebra sentido y una hebra antisentido, teniendo cada hebra 14-30 nucleótidos, donde el dúplex de iARN está representado mediante la fórmula (III):
sentido: 5' np -Na-(X X X)i -Nb-Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3'
antisentido: 3' np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’ 5' (III)
donde:
i, j, k, y l son cada uno independientemente 0 o 1;
p, p’, q y q′ son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
donde
cada np’, np, nq’ y nq, cada uno de los cuales puede estar presente o no, representa independientemente un nucleótido protuberante; y
XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ y Z′Z′Z′ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
Se describe que i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. Se describe que k es 0 y l es 0; o k es 1 y l es 0; o k es 0 y l es 1; o tanto k como l son 0; o tanto k como l son 1.
Las combinaciones ilustrativas de la hebra sentido y la hebra antisentido para formar un dúplex de iARN incluyen las fórmulas siguientes:
5' np -Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3' np’-Na’-Y′Y′Y′ -Na’nq’ 5' (IIIa)
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq3'
3' np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’ 5' (IIIb)
5' np-Na-X X X -Nb -Y Y Y -Na-nq3'
3' np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’ 5' (IIIc)
5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb-Z Z Z -Na-nq3'
3' np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’ 5' (IIId)
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIa), cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIb), cada Nb representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de iARN se representa como la fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na, Na' representa independientemente una secuencia oligonucleotídica que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de los grupos Na, Na’, Nb y Nb’ comprende independientemente modificaciones de patrón alterno.
Cada uno de los grupos X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) puede ser igual o diferente de los demás.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y′. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y′ correspondientes; o los tres nucleótidos Y forman todos ellos pares de bases con los nucleótidos Y′ correspondientes.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z′. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z′ correspondientes; o los tres nucleótidos Z forman todos ellos pares de bases con los nucleótidos Z′ correspondientes.
Cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIc) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X′. Como alternativa, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X′ correspondientes; o los tres nucleótidos X forman todos ellos pares de bases con los nucleótidos X′ correspondientes.
Se describe que la modificación en el nucleótido Y es diferente de la modificación en el nucleótido Y’, la modificación en el nucleótido Z es diferente de la modificación en el nucleótido Z’ y/o la modificación en el nucleótido X es diferente de la modificación el nucleótido X’.
Se describe que cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2-O-metilo o 2-fluoro. Se describe que cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2-O-metilo o 2-fluoro, np′ > 0 y al menos un np′ está unido a un nucleótido contiguo mediante una unión de tipo fosforotioato. Se describe que cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2-O-metilo o 2fluoro, np′ > 0 y al menos un np′ está unido a un nucleótido contiguo mediante una unión de tipo fosforotioato, y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de tipo GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente. Se describe que cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIId), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2-O-metilo o 2-fluoro, np′ > 0 y al menos un np′ está unido a un nucleótido contiguo mediante una unión de tipo fosforotioato, la hebra sentido comprende al menos una unión de tipo fosforotioato y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de tipo GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
Se describe que cuando el agente de iARN se representa mediante la fórmula (IIIa), las modificaciones en Na son modificaciones de tipo 2-O-metilo o 2-fluoro, np′ > 0 y al menos un np′ está unido a un nucleótido contiguo mediante una unión de tipo fosforotioato, la hebra sentido comprende al menos una unión de tipo fosforotioato y la hebra sentido está conjugada con uno o más derivados de tipo GalNAc unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
Se describe que el agente de iARN es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), donde los dúplex están conectados mediante un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede tener como diana el mismo gen o dos genes diferentes, o cada uno de los dúplex puede tener como diana el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Se describe que el agente de iARN es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), donde los dúplex están conectados mediante un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede tener como diana el mismo gen o dos genes diferentes, o cada uno de los dúplex puede tener como diana el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Se describe que dos agentes de iARN representados mediante la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) están unidos el uno con el otro en el extremo 5’, y uno o ambos extremos 3’ están conjugados opcionalmente con un ligando. Cada uno de los agentes puede tener como diana el mismo gen o dos genes diferentes, o cada uno de los agentes puede tener como diana el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Conjugados de ARNi
Los agentes de ARNi descritos en la presente pueden adoptar la forma de conjugados. El conjugado se puede unir en cualquier posición adecuada de la molécula de ARNi, p. ej., en el extremo 3' o el extremo 5' de la hebra sentido o antisentido. Los conjugados se unen opcionalmente mediante un conector.
Se describe que un agente de ARNi descrito en la presente está unido químicamente a uno o más ligandos, restos o conjugados, los cuales pueden conferir una funcionalidad, p. ej., ejerciendo un efecto sobre (p. ej., potenciando) la actividad, la distribución celular o la captación celular del ARNi. Tales restos incluyen, sin carácter limitante, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), un tioéter, p. ej., beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), un fosfolípido, p. ej., dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-Ohexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), o un resto de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
Se describe que un ligando altera la distribución, la diana o la vida útil del agente de ARNi en el cual se incorpora. Se describe que un ligando proporciona una afinidad mejorada para una diana seleccionada, p. ej., una molécula, una célula o tipo celular, un compartimento, p. ej., un compartimento celular o de un órgano, un tejido, un órgano o una región del cuerpo en comparación, p. ej., con una especie que carezca del ligando. Los ligandos habituales no formarán parte del apareamiento del dúplex en un ácido nucleico que forme un dúplex.
Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural tal como una proteína (p. ej., albúmina de suero humano (HSA), una lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); un carbohidrato (p. ej., un dextrano, pululano, chitina, chitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) o un lípido. El ligando también puede ser una molécula sintética
o recombinante tal como un polímero sintético, p. ej., un ácido poliamínico sintético. Los ejemplos de ácidos poliamínicos incluyen un ácido poliamínico que es una polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido del ácido maleico, copolímero de poli(L-láctido-co-glicólido), copolímero de éter divinílico-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptidopoliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido con hélice α.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, p. ej., un agente de direccionamiento hacia una célula o tejido, p. ej., una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular especificado tal como una célula renal. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A surfactante, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, o un péptido RGD o un mimético de un péptido RGD.
Se describe que el ligando es un ligando de tipo GalNAc que comprende uno o más derivados de tipo Nacetilgalactosamina (GalNAc). En la sección titulada "Conjugados de carbohidratos" se proporciona una descripción adicional de los ligandos de tipo GalNAc.
Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes (p. ej., acridinas), agentes reticulantes (p. ej., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapfirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p. ej. EDTA), moléculas lipófilas, p. ej., colesterol, ácido cólico, ácido adamantanacético, ácido 1-pirenobutírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, un grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, un grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados de péptidos (p. ej., péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej., biotina), potenciadores del transporte/la absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (p. ej., imidazol, bisimidazol, histamina, agregados de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos de tetraazamacrociclos con Eu3+), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, p. ej., glicoproteínas, o péptidos, p. ej., macromoléculas con una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo que se una a un tipo celular especificado tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa multivalente o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de la cinasa MAP p38 o un activador de NF-κB.
El ligando puede ser una sustancia, p. ej., un fármaco, que puede incrementar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, p. ej., alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
Se describe que un ligando unido a un ARNi según se describe en la presente actúa como un modulador farmacocinético (modulador PK, por sus siglas en inglés). Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Existe constancia de que los oligonucleótidos que comprenden una serie de uniones de tipo fosforotioato también se unen a las proteínas del suero, por lo tanto, los oligonucleótidos cortos, p. ej., oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples uniones de tipo fosforotioato en el esqueleto también se pueden utilizar en la presente invención como ligandos (p. ej., como ligandos moduladores PK). Además, los aptámeros que se unen a los componentes del suero (p. ej., proteínas del suero) también son adecuados para ser utilizados como ligandos moduladores PK en las realizaciones descritas en la presente.
Los oligonucleótidos conjugados con ligandos de la invención se pueden sintetizar utilizando un oligonucleótido que contenga una funcionalidad reactiva como sustituyente, tal como la derivada de la unión de una molécula conectora en el oligonucleótido (que se describe más adelante). Este oligonucleótido reactivo se puede hacer reaccionar directamente con ligandos que se pueden adquirir de proveedores comerciales, ligandos que se sintetizan y que contienen un grupo protector cualquiera de entre una gama de grupos protectores, o ligandos que tienen un resto conector unido a ellos.
Los oligonucleótidos utilizados en los conjugados de la presente invención se pueden preparar de forma conveniente y rutinaria mediante la técnica bien establecida de síntesis en fase sólida. Existen varios proveedores que comercializan el equipo para realizar una síntesis de este tipo, los cuales incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Adicionalmente o de forma alternativa, se pueden emplear otros medios para este tipo de síntesis conocidos en la técnica. También existe constancia del uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.
En los oligonucleótidos conjugados con ligandos y los nucleósidos unidos específicamente a secuencias que contienen moléculas que son ligandos de la presente invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos se pueden acoplar en un sintetizador de ADN adecuado utilizando precursores de nucleótidos o nucleósidos estándar, o precursores de conjugados de nucleótidos o nucleósidos que ya contengan el resto conector, precursores de conjugados de nucleótidos-o nucleósidos-ligando que ya contengan la molécula de ligando, o bloques estructurales que no sean nucleósidos y que contengan el ligando.
Cuando se utilizan precursores de conjugados de nucleótidos que ya contienen un resto conector, normalmente se completa la síntesis de los nucleósidos unidos específicamente a secuencias y a continuación la molécula de ligando se hace reaccionar con el resto conector para formar el oligonucleótido conjugado con el ligando. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la presente invención se sintetizan con un sintetizador automatizado utilizando fosforamiditos derivados de conjugados de nucleósido-ligando, además de los fosforamiditos estándar y fosforamiditos no estándar que se pueden adquirir de proveedores comerciales y que se utilizan de forma rutinaria en la síntesis de oligonucleótidos.
Conjugados de lípidos
El ligando puede ser un lípido o una molécula basada en un lípido. Este lípido o esta molécula basada en un lípido se puede unir normalmente a una proteína del suero tal como la albúmina de suero humano (HSA). Un ligando de unión a HSA permite distribuir el conjugado en un tejido diana, p. ej., un tejido diana no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluidas las células parenquimales del hígado. También se pueden utilizar como ligandos otras moléculas que se puedan unir a HSA. Por ejemplo, se puede utilizar la neproxina o la aspirina. Un lípido o un ligando basado en un lípido puede (a) incrementar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) incrementar el direccionamiento o el transporte hacia una célula o membrana celular diana y/o (c) se puede utilizar para ajustar la unión a una proteína del suero, p. ej., HSA.
Un ligando basado en un lípido se puede utilizar para modular, p. ej., controlar (p. ej., inhibir) la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando basado en un lípido que se una a HSA con una unión más
fuerte presentará una menor probabilidad de ser dirigido hacia el riñón y, por consiguiente, presentará una menor probabilidad de ser expulsado del cuerpo. Un lípido o un ligando basado en un lípido que se una a HSA con una unión menos fuerte se puede utilizar para dirigir el conjugado hacia el riñón.
El ligando basado en un lípido puede unirse a HSA. Por ejemplo, el ligando se puede unir a HSA con una afinidad suficiente de manera que la distribución del conjugado en un tejido no renal se vea potenciada. Sin embargo, normalmente la afinidad no es tan fuerte como para que la unión ligando-HSA no se pueda revertir.
El ligando basado en un lípido puede unirse a HSA débilmente o no se une en absoluto, de manera que la distribución del conjugado en el riñón se vea potenciada. También se pueden utilizar otros restos que ejerzan un direccionamiento hacia las células renales, en lugar o además del ligando basado en un lípido.
En otro aspecto, el ligando es un resto, p. ej., una vitamina, que es absorbido por una célula diana, p. ej., una célula proliferante. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por la proliferación de células no deseadas, p. ej., células cancerosas, p. ej., de tipo maligno o no maligno. Las vitaminas ilustrativas incluyen la vitamina A, E y K. Otras vitaminas ilustrativas incluyen la vitamina B, p. ej., ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células cancerosas. También se incluyen HSA y lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Agentes de permeación celular
En otro aspecto, el ligando es un ligando de permeación celular tal como un ligando de permeación celular helicoidal. En una realización, el agente es anfifático. Un agente ilustrativo es un péptido tal como tat o antennopedia. Si el agente es un péptido, este puede ser un péptido modificado, que incluye un peptidomimético, invertómeros, conectores no peptídicos o pseudopeptídicos y el uso de aminoácidos D. El agente helicoidal es normalmente un agente de hélice α y puede tener una fase lipófila y lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en la presente como oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a la de un péptido natural. La unión de péptidos y peptidomiméticos a agentes de ARNi puede afectar a la distribución farmacocinética del ARNi, por ejemplo, potenciando el reconocimiento y la absorción celular. El resto peptídico o peptidomimético puede tener una longitud de aproximadamente 5-50 aminoácidos, p. ej., una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos.
Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, un péptido catiónico, un péptido anfifático o un péptido hidrófobo (p. ej., constituido principalmente por Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrimérico, un péptido de movimiento restringido o un péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS, por sus siglas en inglés). Un péptido que contiene una MTS hidrófoba a modo de ejemplo es RFGF, que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:3367). Un análogo de RFGF (p. ej., la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:3368)) que contenga una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de "suministro", el cual puede transportar moléculas polares grandes, incluidos péptidos, oligonucleótidos y proteínas, a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:3369)) y una proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) son capaces de actuar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede ser codificado por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una colección de presentación en pagos o una colección combinatoria de unamicroesfera-un-compuesto (OBOC, por sus siglas en inglés) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Normalmente, el péptido o peptidomimético unido a un agente de ARNbc mediante una unidad monomérica incorporada es un péptido de direccionamiento hacia una célula tal como el péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) o un mimético de RGD. Un resto peptídico puede tener una longitud comprendida entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden presentar una modificación estructural, por ejemplo, para incrementar la estabilidad o dirigir propiedades conformacionales. Se puede utilizar cualquiera de las modificaciones estructurales que se describen más adelante.
Un péptido RGD para su uso en las composiciones y métodos de la invención puede ser lineal o cíclico y puede estar modificado, p. ej., glicosilado o metilado, para facilitar el direccionamiento hacia uno o más tejidos específicos. Los péptidos y peptidomiméticos que contienen RGD pueden incluir aminoácidos D, así como también miméticos de RGD sintéticos. Además de RGD, se pueden utilizar otros restos que tengan como diana el ligando integrina. Los conjugados preferidos de este ligando tienen como diana PECAM-1 o VEGF.
Se puede utilizar un resto peptídico RGD para que actúe sobre un tipo celular particular, p. ej., una célula tumoral tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:513943, 2002). Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de ARNbc hacia tumores de varios tejidos diferentes, que incluyen el pulmón, el riñón, el bazo o el hígado (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Normalmente, el péptido RGD facilitará el direccionamiento de un agente de ARNi hacia el riñón. El péptido RGD puede ser lineal o cíclico y puede estar modificado, p. ej., glicosilado o metilado, para facilitar el
direccionamiento hacia tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glicosilado puede suministrar un agente de ARNi a una célula tumoral que exprese αVß3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
Un "péptido de permeación celular" es capaz de penetrar en una célula, p. ej., una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero tal como una célula humana. Un péptido de permeación en células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal de hélice α (p. ej., LL-37 o Ceropina P1), un péptido que contenga un enlace de tipo disulfuro (p. ej., α -defensina, β-defensina o bactenecina) o un péptido que contenga únicamente uno o dos aminoácidos dominantes (p. ej., PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfifático bipartito tal como MPG, el cual deriva del dominio del péptido de fusión de gp41 del VIH-1 y NLS del antígeno T grande SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
Conjugados de carbohidratos
En relación con las composiciones y los métodos de la invención, un oligonucleótido de tipo ARNi puede comprender además un carbohidrato. Los ARNi conjugados con carbohidratos son convenientes para el suministro in vivo de ácidos nucleicos, así como también para composiciones adecuadas para el uso terapéutico in vivo, según se describe en la presente. El término "carbohidrato", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que
o bien es un carbohidrato de por sí constituido por una o más unidades de monosacáridos que contienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte de este un resto de carbohidrato constituido por una o más unidades de monosacáridos, teniendo cada una de ellas al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los carbohidratos representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri-y oligosacáridos que contienen desde aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades de monosacáridos) y polisacáridos tales como almidones, glicógeno, celulosa y gomas de polisacáridos. Los monosacáridos específicos incluyen azúcares C5 y los azúcares anteriores (p. ej., C5, C6, C7 o C8); los di-y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o más unidades de monosacáridos (p. ej., C5, C6, C7 o C8).
Se describe que un conjugado de carbohidrato comprende un monosacárido. Se describe que el monosacárido es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). Los conjugados de tipo GalNAc se describen, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.o 8.106.022. Se describe que el conjugado de tipo GalNAc sirve como ligando que dirige el ARNi hacia células particulares. En algunas realizaciones, el conjugado de tipo GalNAc dirige el ARNi hacia células hepáticas, p. ej., actuando como un ligando para el receptor de la asialoglicoproteína de las células hepáticas (p. ej., los hepatocitos).
Se describe que el conjugado de carbohidrato comprende uno o más derivados de tipo GalNAc. Los derivados de tipo GalNAc se pueden unir mediante un conector, p. ej., un conector ramificado bivalente o trivalente. Se describe que el conjugado de tipo GalNAc está conjugado con el extremo 3’ de la hebra sentido. Se describe que el conjugado de tipo GalNAc está conjugado con el agente de ARNi (p. ej., con el extremo 3' de la hebra sentido) mediante un conector, p. ej., un conector según se describe en la presente.
Se describe que el conjugado de tipo GalNAc es
OH
HO O
HH
O NNO
HO AcHN
O OH
HO
O O
HH
O NNO
HO AcHN O OO
HO
OH
O
HO
O N N O
AcHN
O H H Fórmula II.
Se describe que el agente de iARN está unido al conjugado de carbohidrato mediante un conector, según se muestra en la siguiente representación esquemática, donde X es O o S
En algunas realizaciones, el agente de iARN se conjuga a L96 según se define en la Tabla 1 y se muestra a continuación
Un conjugado de carbohidrato para su uso en las composiciones y los métodos se puede seleccionar del grupo constituido por:
OH
HO O
HH
O N
N O
HO AcHN
O OH
HO
O O
HHO N
N
O
HO AcHN
O OO OH
HO O O
HO
N
N O AcHN
HH O Fórmula II,
HO HO O
HO HO O
O
O
O
N
HO HO H
O
HO HO
O
OO
OO
N HO HO H O O O
HO HO O
O
OO
N H Fórmula III,
OH
HO O
OHO O
O NHAc
OH
N O HO
OHO O
O NHAc Fórmula IV,
OH
HO O
HO O
O NHAc
O
OH
HO O
OHO
O
O NHAc Fórmula V,
OH
HO H
O
NHO O
NHAc OHO OH
O
NH NHAc O Fórmula VI, HO OH O
HO
O
HO O
O HO OH NHAc O
HO
O
O NHAc O
HO OH O
HO
O
NHAc Fórmula VII,
OBz
BzO
O
BzO BzO OBz
OAc
BzO
O
O
O
BzO
AcO BzO
O O
Fórmula VIII,
OHHO
OO
HO
NO
N AcHN H HO O
OH HO
OO HO
NOHO
NAcHN H O
OH
HO OO
O H O
N HO
NO AcHN H Fórmula IX,
OHHO
O O
O OO
N AcHN H
HO
OH HO
O O
O
O
OO
N AcHN H
HO
OO OH HO
O O
O
O
N OHO
AcHN H Fórmula X,
Fórmula XI,
PO3
O OH
O
HO HO HH
O
N
N O
PO3 O OH O
O
HO HO
O HH
O
N
N
O PO3 O OH O O O O
HO HO O
N
NO
HH
O Fórmula XII, 40
OHHO
O
HO O
N
ONHO AcHN H
O OH
HO O
O O
H HO
N
ONAcHN H O OH
HO H
O O O O
N
NHO AcHN H O Fórmula XIII,
OOOH
HO OHO
O
NH HO
N
O
H
O Fórmula XX,
HO OH OHOHO OOOH
HO OHO
O
NH HO
N
O
H
O Fórmula XXI,
OOOH
HO OHO
O
NH
HO O
N
H
O Fórmula XXII. Otro conjugado de carbohidrato representativo incluye, sin carácter limitante,
OHHO
O O
O O HO
O
N AcHN H
OH HO O
O
O O
O O
O HO
O N
N O O AcHN H
H
OO
XO OH HO OO
OY O
N
O HO N OHO NH
NAcHN H N
O OO
O
O
N
H
(Fórmula XXIII), donde uno de los grupos X o Y es un oligonucleótido y el otro es un hidrógeno.
Se describe que el conjugado de carbohidrato comprende además uno o más ligandos adicionales como los que se describen en la presente, tales como, sin carácter limitante, un modulador PK y/o un péptido de permeación celular.
Se describe que un ARNi de la invención está conjugado con un carbohidrato a través de un conector. Los ejemplos 5 no limitantes de conjugados de carbohidrato y ARNi con conectores de las composiciones y los métodos de la invención incluyen, sin carácter limitante,
OH
HO O
HH HO
O
N
N O HO AcHN
O OH
OHO
ON O
H O
HH
NN N OHO
O AcHN
O OH
O OO
HO O HO
O N
N O AcHN
HH
O (Fórmula XXIV), OH
HO
OO
HO
N
ONHO
XOAcHN H
O OH
O
Y O
HO
O
O HHO NN O NHO ON
H x y
AcHN
O
H O OH HO x = 1-30
O O O O
H y = 1-15 N N
HO AcHN H O (Fórmula XXV), OH
HO
OO
HO
N
ONHO AcHN H
XO OH
O
HO
Y
O
O O
O
O H N HO
H
H
N O N
N
ON N O OAcHN H O OH xOyOH
HO H
O O O
x = 1-30
O N
y = 1-15
N OHO
AcHN H 10 (Fórmula XXVI), OH
HO
OO
HO
N
ONHO
XOAcHN H O
Y
OOH HO
N
HOO NH
H
O
O
N SS AcHN
N OHO N yOxH OOOH HO
x = 0-30 O
OO
H
y = 1-15 O NHO N
O
AcHN H (Fórmula XXVII),
O OHHO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O
O N H N H H N O O O O O H N O H N O N H O H N O SS x z x = 0-30 y = 1-15 z = 1-20 O H N X N O O y O Y
(Fórmula XXVIII),
O OHHO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O
O N H N H H N O O O O O H N O H N O N H O H N O O x x = 1-30 y = 1-15 z = 1-20 O S S z O H N X N O O y O Y
(Fórmula XXIX) y
O OHHO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O O OH HO HO AcHN O
O N H N H H N O O O O O H N O H N O N H O H N O O x x = 1-30 y = 1-15 z = 1-20 O S S z O H N X N O O y O Y
(Fórmula XXX), donde uno de los grupos X o Y es un oligonucleótido y el otro es un hidrógeno.
Conectores
Se describe que el conjugado o ligando descrito en la presente se puede unir a un oligonucleótido de tipo ARNi con varios conectores que pueden ser escindibles o no escindibles.
El término "conector" o "grupo conector" se refiere a un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto, p. ej., une covalentemente dos partes de un compuesto. Los conectores comprenden normalmente un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH o una cadena de átomos tal como, sin carácter limitante, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenillheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilheterociclilalquinilo, alquenilheterociclilaquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilheteroarilo, donde uno o más metilenos se pueden interrumpir o terminar con O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido; donde R8 es hidrógeno, acilo, un resto alifático o un resto alifático sustituido. Se describe que el conector tiene aproximadamente 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 o 8-16 átomos.
Se describe que un ARNbc de la invención está conjugado con un conector ramificado bivalente o trivalente seleccionado a partir del grupo de estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (XXXI)–(XXXIV):
Fórmula XXXI Fórmula XXXII
5 Fórmula XXXIII Fórmula XXXIV
donde:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente en cada caso 0-20 y donde la unidad de repetición puede ser igual o diferente;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C, cada uno 10 independientemente en cada caso, están ausentes o son CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, CH2O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C, cada uno independientemente en cada caso, están ausentes o son alquileno, alquileno sustituido, donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados con uno o más O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C≡C o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C, cada uno independientemente en cada caso, están ausentes o O
15 son NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, O SS
SS
N
SS
N
H, , ,
o heterociclilo;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando, es decir, cada uno independientemente en cada caso representa un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o una cadena lateral aminoacídica. Los derivados de tipo GalNAc de conjugación trivalente
20 son particularmente útiles para ser utilizados con los agentes de iARN para inhibir la expresión de un gen diana, tales como los de fórmula (XXXV):
Fórmula XXXV
P5A-Q5A-R5A
T5A-L5A
5A
q P5B-Q5B-R5B
T5B-L5B
q5B
T5C-L5C
P5C-Q5C-R5C q5C
donde L5A, L5B y L5C representan un monosacárido tal como un derivado de tipo GalNAc.
Los ejemplos de grupos conectores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que se conjugan con derivados de tipo GalNAc incluyen, sin carácter limitante, las estructuras mencionadas anteriormente como fórmulas II, VII, XI, X y XIII.
Un grupo conector escindible es aquel que es suficientemente estable fuera de la célula pero que, al entrar en una célula diana, se escinde para liberar las dos partes que el conector mantenía unidas. En una realización preferida, el grupo conector escindible se escinde al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o más, o al menos aproximadamente 100 veces más rápido en una célula diana o en una primera condición de referencia (la cual se puede seleccionar, p. ej., para que imite o represente las condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o en una segunda condición de referencia (la cual se puede seleccionar, p. ej., para que imite o represente las condiciones que se encuentran en la sangre o el suero).
Los grupos conectores escindibles son sensibles a los agentes de escisión, p. ej., el pH, el potencial rédox o la presencia de moléculas que provocan degradación. En general, los agentes de escisión se encuentran o prevalecen en mayor grado en concentraciones o actividades más elevadas dentro de las células que en suero o sangre. Los ejemplos de tales agentes que provocan degradación incluyen: agentes rédox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad por un sustrato, los cuales incluyen, p. ej., enzimas oxidantes o reductoras
o agentes reductores tales como los mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo conector escindible rédox mediante una reducción; estearasas; endosomas o agentes que pueden crear un entorno ácido, p. ej., los que proporcionan un pH de cinco o inferior; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo conector escindible con ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas para un sustrato) y fosfatasas.
Un grupo conector escindible, tal como un enlace de tipo disulfuro, puede ser sensible al pH. El pH del suero humano es de 7.4, mientras que el pH intracelular medio es ligeramente inferior, está comprendido entre aproximadamente 7.1 y 7.3. Los endosomas tienen un pH más ácido, comprendido en el intervalo de 5.5 a 6.0, y los lisosomas tienen un pH todavía más ácido de aproximadamente 5.0. Algunos conectores tendrán un grupo conector escindible que se escinde a un pH preferido, liberando de este modo un lípido catiónico a partir del ligando en el interior de la célula o en el compartimento deseado de la célula.
Un conector puede incluir un grupo conector escindible que pueda ser escindido por una enzima particular. El tipo de grupo conector escindible incorporado en un conector puede depender de la célula que se tenga como diana. Por ejemplo, un ligando que tenga el hígado como diana se puede unir a un lípido catiónico a través de un conector que incluya un grupo éster. Las células hepáticas son ricas en estearasas y, por consiguiente, el conector se escindirá de una forma más eficaz en las células hepáticas que en los tipos celulares que no sean ricos en estearasas. Otros tipos celulares ricos en estearasas incluyen las células del pulmón, la corteza renal y los testículos.
Se pueden utilizar conectores que contengan enlaces peptídicos cuando se tengan como diana tipos celulares ricos en peptidasas tales como las células hepáticas y los sinoviocitos.
En general, la idoneidad de un grupo conector escindible candidato se puede evaluar estudiando la capacidad de un agente (o condición) de degradación para escindir el grupo conector candidato. También será deseable estudiar además el grupo conector escindible candidato con el fin de determinar su capacidad para resistir la escisión en sangre o cuando entre en contacto con otro tejido que no sea la diana. Por lo tanto, se puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona para que sea indicativa de la escisión en una célula diana y la segunda se selecciona para que sea indicativa de la escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, p. ej., en sangre o suero. Las evaluaciones se pueden llevar a cabo en sistemas exentos de células, en células, en cultivos celulares, en cultivos tisulares o de órganos, o en animales enteros. Puede resultar útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones de cultivo o exentas de células y confirmarlas mediante evaluaciones adicionales en animales enteros. En realizaciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre o el suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares).
Grupos conectores escindibles rédox
Se describe que un grupo conector escindible es un grupo conector escindible rédox que se escinde tras una reducción u oxidación. Un ejemplo de un grupo conector escindible de forma reductiva es un grupo conector de tipo disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo conector escindible candidato es un "grupo conector escindible de forma reductiva" adecuado o, por ejemplo, es adecuado para su uso con un resto de ARNi particular y un agente de direccionamiento particular, se pueden consultar los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, un candidato se puede evaluar mediante la incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor utilizando reactivos conocidos en la técnica que imitan la tasa de escisión que se observaría en una célula, p. ej. una célula diana. Los candidatos también se pueden evaluar en unas condiciones que se seleccionan para que imiten las condiciones en sangre o suero. Los compuestos candidatos se pueden escindir como máximo aproximadamente un 10% en sangre. Se describe que los compuestos candidatos útiles se degradan al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparación con la sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares). La tasa de escisión de los compuestos candidatos se puede determinar utilizando ensayos cinéticos enzimáticos estándar en condiciones seleccionadas para que imiten los medios intracelulares y comparándolos con unas condiciones seleccionadas para imitar los medios extracelulares.
Grupos conectores escindibles basados en fosfatos
Se describe que un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en un fosfato. Un grupo conector escindible basado en un fosfato es escindido por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en células son enzimas tales como las fosfatasas en células. Algunos ejemplos de grupos conectores basados en fosfatos son -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Las realizaciones preferidas son -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Se prefiere -O-P(O)(OH)-O-. Estos candidatos se pueden evaluar utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Grupos conectores escindibles con ácido
Se describe que un conector escindible comprende un grupo conector escindible con ácido. Un grupo conector escindible con ácido es un grupo conector que se escinde en condiciones ácidas. Se describe que los grupos conectores escindibles con ácido se escinden en un entorno ácido con un pH de aproximadamente 6.5 o inferior (p. ej., de aproximadamente 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 o inferior) o con agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los orgánulos de pH bajo específicos, tales como los endosomas y lisosomas, pueden proporcionar un entorno de escisión para los grupos conectores escindibles con ácido. Los ejemplos de grupos conectores escindibles con ácido incluyen, sin carácter limitante, hidrazonas, ésteres, y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles con ácido presentan la fórmula general -C=NN-, C(O)O o -OC(O). Una realización preferida se produce cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquilo terciario tal como dimetilpentilo o t-butilo. Estos candidatos se pueden evaluar utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Grupos conectores escindibles basados en ésteres
Se describe que un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en un éster. Un grupo conector escindible basado en un éster es escindido por enzimas tales como esterasas y amidasas en las células. Los ejemplos de grupos conectores escindibles basados en ésteres incluyen, sin carácter limitante, ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos conectores escindibles basados en ésteres presentan la fórmula general -C(O)O-o -OC(O)-. Estos candidatos se pueden evaluar utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Grupos conectores escindibles basados en péptidos
Se describe que un conector escindible comprende un grupo conector escindible basado en péptidos. Un grupo conector escindible basado en péptidos es escindido por enzimas tales como peptidasas y proteasas en las células. Los grupos conectores escindibles basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para proporcionar oligopéptidos (p. ej., dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos. Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida se puede formar entre cualquier alquileno, alquenileno o alquinileno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace de tipo amida formado entre aminoácidos para proporcionar péptidos y proteínas. El grupo escindible basado en un péptido se limita en general al enlace peptídico (es decir, el enlace de tipo amida) formado entre aminoácidos para proporcionar péptidos y proteínas y no incluye el grupo funcional amida entero. Los grupos conectores escindibles basados en péptidos presentan la fórmula general –NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-(SEQ ID NO: 13), donde RA y RB son los grupos R de
los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos se pueden evaluar utilizando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Las patentes de EE. UU. representativas que describen la preparación de conjugados de ARN incluyen, sin carácter limitante, las Pat. de EE. UU. N.os 4.828.979, 4.948.882, 5.218.105, 5.525.465, 5.541.313, 5.545.730, 5.552.538, 5.578.717, 5.580.731, 5.591.584, 5.109.124, 5.118.802, 5.138.045, 5.414.077, 5.486.603, 5.512.439, 5.578.718, 5.608.046, 4.587.044, 4.605.735, 4.667.025, 4.762.779, 4.789.737, 4.824.941, 4.835.263, 4.876.335, 4.904.582, 4.958.013, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.082.830, 5.112.963, 5.214.136, 5.245.022, 5.254.469, 5.258.506, 5.262.536, 5.272.250, 5.292.873, 5.317.098, 5.371.241, 5.391.723, 5.416.203, 5.451.463, 5.510.475, 5.512.667, 5.514.785, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.595.726, 5.597.696, 5.599.923, 5.599.928 y 5.688.941, 6.294.664, 6.320.017, 6.576.752, 6.783.931, 6.900.297, 7.037.646, 8.106.022.
No es necesario que todas las posiciones de un compuesto determinado se modifiquen de forma uniforme y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente se pueden incorporar en un único compuesto
o incluso en un único nucleósido dentro de un ARNi. La presente invención también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.
Los compuestos de ARNi "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de la presente invención, son compuestos de ARNi, p. ej., ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente diferentes, cada una de las cuales está constituida por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNi contienen normalmente al menos una región en la cual el ARN está modificado para conferir al ARNi una mayor resistencia a la degradación por parte de nucleasas, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión para el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNi puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, una RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la hebra de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Por consiguiente, la activación de una RNasa H provoca la escisión de la diana de ARN y de este modo potencia enormemente la eficacia de la inhibición de la expresión génica por parte del ARNi. Como consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con ARNi más cortos cuando se utilizan ARNbc quiméricos, en comparación con fosforotioato desoxi ARNbc que se hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, cuando proceda, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociados conocidas en la técnica.
En ciertos casos, el ARN de un ARNi se puede modificar con un grupo que no sea un ligando. Se han conjugado una serie de moléculas que no son ligandos a ARNi con el fin de potenciar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNi, y los procedimientos para llevar a cabo tales conjugaciones se pueden consultar en la bibliografía científica. Tales restos que no son ligandos han incluido restos lipídicos, tales como el colesterol (Kubo,
T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, p. ej., dihexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-Ohexadecil-rac-glicero-3H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto de octadecilamina o hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Las patentes de Estados Unidos representativas que describen la preparación de tales conjugados de ARN se han enumerado anteriormente. Los protocolos de conjugación habituales implican la síntesis de un ARN que contiene un aminoconector en una o más posiciones de la secuencia. A continuación, el grupo camino se hace reaccionar con la molécula que se ha de conjugar utilizando reactivos activantes o de acoplamiento adecuados. La reacción de conjugación se puede llevar a cabo o bien con el ARN todavía unido al soporte sólido o tras la escisión del ARN, en fase de solución. La purificación del conjugado de ARN mediante HPLC proporciona normalmente el conjugado puro.
Suministro de ARNi
El suministro de un ARNi a un sujeto que lo necesite se puede llevar a cabo de diferentes maneras. Se puede llevar a cabo un suministro in vivo directamente administrando una composición que comprenda un ARNi, p. ej. un ARNbc, a un sujeto. Como alternativa, el suministro se puede llevar a cabo de forma indirecta administrando uno o más vectores que codifiquen y dirijan la expresión del ARNi. Estas alternativas se exponen con más detalle a continuación.
Suministro directo
ARNi in vivo: (a) la estabilidad biológica de la molécula suministrada, (2) la prevención de efectos no específicos y
(3) la acumulación de la molécula suministrada en el tejido diana. Los efectos no específicos de un ARNi se pueden minimizar mediante una administración local, por ejemplo, mediante una inyección directa o un implante en un tejido (a modo de ejemplo no limitante, un tumor) o administrando el preparado por vía tópica. La administración local a un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a tejidos sistémicos que de otro modo podrían ser dañados por el agente o que podrían degradar el agente, y permite administrar una dosis total más baja de la molécula de ARNi. Varios estudios han mostrado una supresión con éxito de productos génicos cuando se administra un ARNi de forma local. Por ejemplo, se ha demostrado que el suministro intraocular de un ARNbc VEGF mediante una inyección intravítrea en monos cinomólogos (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24:132-138) e inyecciones subretinales en ratones (Reich, SJ., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previenen en ambos casos la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones reduce el volumen tumoral (Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther.11:267-274) y puede prolongar la supervivencia de ratones portadores de tumores (Kim, WJ. et al. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S. et al. (2007) Mol. Ther. 15:515-523). La interferencia por ARN también ha tenido éxito con el suministro local al SNC mediante inyección directa (Dorn, G. et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y. et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) y a los pulmones mediante una administración intranasal (Howard, KA. et al. (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Con el fin de administrar un ARNi por vía sistémica para el tratamiento de una enfermedad, el ARN se puede modificar o suministrar de forma alternativa utilizando un sistema de suministro farmacológico; ambos métodos actúan para prevenir la degradación rápida del ARNbc por parte de endo-y exonucleasas in vivo.
La modificación del ARN o el portador farmacéutico también puede permitir el direccionamiento de la composición de ARNi hacia el tejido diana y evitar efectos laterales no deseados. Las moléculas de ARNi se pueden modificar mediante una conjugación química con otros grupos, p. ej., un grupo que sea un lípido o un carbohidrato según se describe en la presente. Tales conjugados se pueden utilizar para dirigir el ARNi hacia células particulares, p. ej., células hepáticas, p. ej., hepatocitos. Por ejemplo, se pueden utilizar conjugados de tipo GalNAc o formulaciones lipídicas (p. ej., LNP) para dirigir el ARNi hacia células particulares, p. ej., células hepáticas, p. ej., hepatocitos.
Se pueden utilizar grupos lipófilos, tales como el colesterol, para potenciar la captación celular y evitar la degradación. Por ejemplo, se inyectó un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipófilo por vía sistémica en ratones y provocó la supresión del ARNm de apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J. et al. (2004) Nature 432:173-178). Se ha demostrado que la conjugación de un ARNi con un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media la regresión tumoral en un modelo de cáncer de próstata en ratón (McNamara, JO. et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). En una realización alternativa, el ARNi se puede suministrar utilizando sistemas de suministro farmacológico tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de suministro catiónico. Los sistemas de suministro catiónico de carga positiva facilitan la unión de una molécula de ARNi (cargada negativamente) y también potencian las interacciones en la membrana celular cargada negativamente para permitir una captación eficaz de un ARNi por parte de la célula. Los lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros o bien se pueden unir a un ARNi o pueden ser inducidos para que formen una vesícula o micela (remítase, p. ej., a Kim SH. et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107116), la cual encierra un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene adicionalmente la degradación del ARNi cuando se administra por vía sistémica. Un experto en la técnica estará familiarizado con los métodos para preparar y administrar complejos de ARNi catiónicos (remítase, p. ej., a Sorensen, DR. et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197205, los cuales se incorporan a la presente por referencia en su totalidad). Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de suministro farmacológico utilizados para el suministro sistémico de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR. et al. (2003), mencionado anteriormente; Verma, UN. et al. (2003), mencionado anteriormente), Oligofectamina, "partículas sólidas de ácido nucleico-lípido" (Zimmermann, TS. et al. (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY. et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME. et al. (2008) Pharm. Res. 16 de agosto, publicación electrónica previa a la impresa; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) y poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al. (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). Un ARNi puede formar un complejo con una ciclodextrina para la administración sistémica. Se pueden consultar métodos de administración y composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas en la Patente de EE. UU. N.o 7. 427.605.
ARNi codificados en vectores
En otro aspecto, un ARNi que tiene como diana el gen ALAS1 se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (remítase, p. ej., a Couture, A et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A. et al., Publicación de PCT Internacional N.o WO 00/22113, Conrad, Publicación de PCT Internacional N.o WO 00/22114 y Conrad, Pat. de EE. UU. N.o 6.054.299). La expresión puede ser transitoria (del orden de horas a semanas) o sostenida (de semanas a meses o más prolongada), dependiendo del constructo específico utilizado y del tejido o tipo celular diana. Estos transgenes se pueden introducir como un constructo lineal, un plásmido circular
o un vector vírico, el cual puede ser un vector integrador o no integrador. El transgén también se puede construir de modo que se permita que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
La hebra individual o las hebras de un ARNi se pueden transcribir a partir de un promotor en un vector de expresión. Cuando se han de expresar dos hebras separadas para generar, por ejemplo, un ARNbc, se pueden introducir conjuntamente dos vectores de expresión separados (p. ej., mediante transfección o infección) en una célula diana. Como alternativa, cada hebra individual de un ARNbc puede ser transcrita por promotores que estén ambos localizados en el mismo plásmido de expresión. Un ARNbc se puede expresar como una repetición invertida unida mediante una secuencia polinucleotídica conectora tal como la de un ARNbc presenta una estructura de tallo y bucle.
Un vector de expresión de ARNi es normalmente un plásmido de ADN o un vector vírico. Para producir constructos recombinantes para la expresión de un ARNi según se describe en la presente, se puede utilizar un vector de expresión compatible con células eucariotas, p. ej., con células de vertebrados. Los vectores de expresión para células eucariotas son de uso común en la técnica y se pueden adquirir a partir de una serie de proveedores comerciales. Normalmente, tales vectores contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. El suministro de vectores de expresión de ARNi puede ser sistémico, por ejemplo, mediante una administración intravenosa o intramuscular, mediante una administración que tenga como diana células explantadas procedentes del paciente seguida de su reintroducción en el paciente, o mediante cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Se puede transfectar un plásmido de expresión de ARNi en una célula diana como un complejo con un portador lipídico catiónico (p. ej., Oligofectamina) o un portador basado en un lípido que no sea catiónico (p. ej., Transit-TKOTM). En la invención también se contemplan múltiples transfecciones de lípidos para supresiones mediadas por ARNi que tienen como diana diferentes regiones de un ARN diana durante un periodo de una semana o más. La introducción con éxito de vectores en células huésped se puede monitorizar utilizando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalizar con un marcador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés). La transfección estable de células ex vivo se puede garantizar utilizando marcadores que proporcionen a la célula infectada resistencia a factores medioambientales específicos (p. ej., antibióticos y fármacos), por ejemplo, resistencia a la higromicina B.
Los sistemas de vectores víricos que se pueden utilizar con los métodos y las composiciones que se describen en la presente incluyen, sin carácter limitante (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, que incluyen, sin carácter limitante, vectores de lentivirus, virus de la leucemia de murinos de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la varicela tal como un orthopox, p. ej., vectores del virus vaccinia o de la varicela aviar, p. ej., la varicela del canario o la varicela de aves de corral; y (j) un adenovirus "gutless" o dependiente de cooperadores. Los virus de replicación deficiente también pueden ser beneficiosos. Los diferentes vectores se incorporarán o no al genoma de las células. Los constructos pueden incluir secuencias víricas para la transfección, cuando proceda. Como alternativa, el constructo se puede incorporar en vectores capaces de llevar a cabo una replicación episomal, p. ej., vectores EPV y EBV. Los constructos para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, p. ej., promotores, potenciadores, etc., para garantizar la expresión del ARNi en las células diana. A continuación se describen adicionalmente otros aspectos que se deben considerar para los vectores y los constructos.
Los vectores útiles para el suministro de un ARNi incluirán elementos reguladores (un promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNi en la célula o el tejido diana deseado. Los elementos reguladores se pueden seleccionar para que proporcionen una expresión constitutiva o regulada/inducible.
La expresión del ARNi se puede regular de forma exacta, por ejemplo, utilizando una secuencia reguladora inducible que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, p. ej., los niveles de glucosa en circulación u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tales sistemas de expresión inducible adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, la regulación por parte de ecdisona, por parte de un estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-β-D1-tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la técnica sería capaz de seleccionar la secuencia promotora/reguladora adecuada en función del uso deseado del transgén de ARNi.
Se pueden utilizar vectores víricos que contengan secuencias de ácido nucleico que codifiquen un ARNi. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retrovírico (remítase a Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma vírico y su integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un ARNi se clonan en uno o más vectores, lo cual facilita el suministro del ácido nucleico en un paciente. Se pueden consultar más detalles sobre los vectores retrovíricos, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retrovírico para suministrar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovíricos en la terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467
1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Los vectores lentivíricos contemplados para ser utilizados incluyen, por ejemplo, los vectores basados en el VIH que se describen en las Patentes de EE. UU. N.os 6.143.520, 5.665.557 y
5.981.276.
También se contemplan los adenovirus para su uso en el suministro de ARNi. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, p. ej., para suministrar genes a epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de forma natural los epitelios respiratorios, donde provocan una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y los músculos. Los adenovirus presentan la ventaja de que son capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan un artículo de revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Se pueden encontrar otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); la Publicación de PCT WO94/12649; y Wang et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010 se describe un vector de AV adecuado para expresar un ARNi que se expone en la invención, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector en células diana.
También se contempla el uso de virus adenoasociados (AAV) (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Pat. de EE. UU. N.o 5.436.146). En una realización, el ARNi se puede expresar como dos moléculas de ARN bicatenarias complementarias separadas a partir de un vector de AAV recombinante que tenga, por ejemplo, promotores de ARN de H1 o U6, o el promotor de citomegalovirus (CMV). Algunos vectores de AAV adecuados para expresar los ARNbc que se exponen en la invención, métodos para construir el vector de AV recombinante y métodos para suministrar los vectores en las células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. de EE. UU. N.o 5.252.479; Pat. de EE. UU. N.o 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional N.o WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional N.o WO 93/24641.
Otro vector vírico típico es un virus de la varicela tal como un virus vaccinia, por ejemplo, un virus vaccinia atenuado tal como el virus modificado Ankara (MVA) o NYVAC, un virus de la varicela aviar tal como la varicela de aves de corral o la varicela del canario.
El tropismo de los vectores víricos se puede modificar mediante el pseudotipado de vectores con proteínas de la envoltura u otros antígenos de superficie procedentes de otros virus, o mediante la sustitución de diferentes proteínas de la cápside vírica, según sea conveniente. Por ejemplo, los vectores lentivíricos pueden ser pseudotipados con proteínas de superficie procedentes de virus de la estomatitis vesicular (VSV), rabias, Ebola, Mokola y similares. Se pueden preparar vectores de AAV que tengan como diana diferentes células modificando genéticamente los vectores para que expresen diferentes serotipos de proteínas de la cápside; remítase, p. ej., a Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.
El preparado farmacéutico de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable o puede incluir una matriz de liberación lenta en la cual se encuentre embebido el vehículo de suministro génico. Como alternativa, cuando el vector de suministro génico completo se pueda producir intacto a partir de células recombinantes, p. ej., vectores retrovíricos, el preparado farmacéutico podrá incluir una o más células que produzcan el sistema de suministro génico.
III. Composiciones farmacéuticas que contienen ARNi
En una realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi, según se describe en la presente, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que contiene el ARNi es útil para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la expresión o la actividad de un gen ALAS1 (p. ej., un trastorno en el que participe la vía de las porfirinas). Tales composiciones farmacéuticas se formulan en función del modo de suministro. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular para una administración sistémica mediante un suministro parenteral, p. ej., mediante un suministro intravenoso (IV). Una composición proporcionada en la presente (p. ej., una formulación LNP) se puede formular para un suministro intravenoso. Una composición proporcionada en la presente (p. ej., una composición que comprende un conjugado de tipo GalNAc) se puede formular para un suministro subcutáneo.
Las composiciones farmacéuticas que se exponen en la presente se administran con una dosis suficiente para inhibir la expresión de un gen ALAS1. En general, una dosis adecuada de ARNi estará comprendida en el intervalo de 0.01 a 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, generalmente en el intervalo de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, se pueden administrar 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg,
1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg del ARNbc en cada dosis. La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día o el ARNi se puede administrar como dos, tres o más subdosis en intervalos adecuados a lo largo del día o incluso utilizando una infusión continua o un suministro a través de una formulación de liberación controlada. En este caso, la cantidad de ARNi contenida en cada subdosis
debe ser correspondientemente menor con el fin de obtener la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede componer para que se suministre durante varios días, p. ej., utilizando una formulación de liberación sostenida convencional que proporcione una liberación sostenida del ARNi durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son de uso común en la técnica y son particularmente útiles para suministrar agentes en un sitio particular, tal como se puede utilizar con los agentes de la presente invención. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiple correspondiente de la dosis diaria.
El efecto de una única dosis sobre los niveles de ALAS1 puede tener una duración prolongada, de manera que las dosis posteriores se administran en intervalos de no más de 3, 4 o 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas.
El experto apreciará que ciertos factores pueden ejercer un efecto sobre la dosis y el tiempo requerido para tratar de forma eficaz a un sujeto, que incluyen, sin carácter limitante, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis eficaces y las semividas in vivo para los ARNi individuales englobados en la invención se pueden realizar utilizando metodologías convencionales o en función de la evaluación in vivo utilizando un modelo animal adecuado, según se describe en otras partes de la presente.
Los avances en la genética del ratón han generado una serie de modelos de ratón para el estudio de varias enfermedades humanas tales como los procesos patológicos relacionados con la expresión de ALAS1 (p. ej., procesos patológicos en los que participan las porfirinas o los defectos en la vía de las porfirinas tales como, por ejemplo, las porfirias). Tales modelos se pueden utilizar para la evaluación in vivo del ARNi, así como también para determinar una dosis terapéuticamente eficaz y/o una pauta posológica eficaz.
Un modelo de ratón adecuado es, por ejemplo, un ratón que contenga un transgén que exprese ALAS1 humano. Se pueden utilizar ratones que contienen mutaciones activantes (p. ej., mutaciones que se asocian con porfirias hepáticas agudas en humanos) para determinar la dosis terapéuticamente eficaz y/o la duración de la administración del ARNip de ALAS1. La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos de ARNi que se exponen en la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y en función del área que se ha de tratar. La administración puede ser tópica (p. ej., mediante un parche transdérmico), pulmonar, p. ej., mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; la administración subdérmica, p. ej., mediante un dispositivo implantado; o intracraneal, p. ej., mediante administración intraparenquimal, intratecal o intraventricular.
El ARNi se puede suministrar de modo que tenga como diana un tejido particular tal como un tejido que produzca eritrocitos. Por ejemplo, el ARNi se puede suministrar a la médula ósea, el hígado (p. ej., los hepatocitos del hígado), los nódulos linfáticos, el bazo, los pulmones (p. ej., la pleura de los pulmones) o la columna vertebral. En una realización, el ARNi se suministra a la médula ósea.
Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden resultar necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases oleosas, acuosas o en polvo, espesantes y similares. También pueden resultar útiles condones recubiertos, guantes y similares. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi que se exponen en la invención se encuentran en una mezcla con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y surfactantes. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen los que son neutros (p. ej., dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearoilfosfatidilcolina) negativos (p. ej., dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (p. ej., dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA). Los ARNi que se exponen en la invención se pueden enapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos con ellos, en particular con liposomas catiónicos. Como alternativa, los ARNi pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, sin carácter limitante, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un éster de alquilo C1-20 (p. ej., isopropilmiristato IPM), monoglicérido, diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de estos. Las formulaciones tópicas se describen con detalle en la Patente de EE. UU. N.o 6.747.014.
Formulaciones de liposomas
Existen muchas estructuras de surfactantes organizadas, además de las microemulsiones, que han sido estudiadas y utilizadas para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como los liposomas, han despertado mucho interés debido a su especificidad y duración de la acción que ofrecen desde el punto de vista del suministro farmacológico. El término "liposoma", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.
Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que contienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición que se ha de suministrar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de que son capaces de fusionarse con la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse tan eficazmente con la pared celular, son captados por los macrófagos in vivo.
Con el fin de atravesar la piel de los mamíferos y mantenerse intactas, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno de ellos con un diámetro inferior a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por consiguiente, es deseable utilizar un liposoma que se pueda deformar en gran medida y que sea capaz de pasar a través de estos poros finos.
Otras ventajas de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos frente al metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Algunas consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial del lípido, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para transferir y suministrar principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana de los liposomas es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, los liposomas se empiezan a fusionar con las membranas celulares y, a medida que la fusión de los liposomas y la célula avanza, los contenidos de los liposomas se vierten en la célula, donde el agente activo puede actuar.
Las formulaciones de liposomas han sido el centro de investigaciones exhaustivas como el modo de suministro para muchos fármacos. Cada vez existen más evidencias de que, para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas en comparación con otras formulaciones. Tales ventajas incluyen una reducción de los efectos laterales relacionados con una absorción sistémica elevada del fármaco administrado, un incremento de la acumulación del fármaco administrado en la diana deseada y la capacidad de administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, en la piel.
Varios informes han detallado la capacidad de los liposomas para suministrar agentes, incluido el ADN de peso molecular elevado, en la piel. Se han administrado a la piel compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de peso molecular elevado. La mayoría de aplicaciones actuaron sobre la epidermis superior.
Los liposomas se clasifican en dos grandes clases. Los liposomas catiónicos son liposomas de carga positiva que interaccionan con las moléculas de ADN de carga negativa para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma de carga positiva se une a la superficie celular de carga negativa y se interioriza en un endosoma. Debido al pH ácido del interior del endosoma, los liposomas se fracturan y liberan sus contenidos en el interior del citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o de carga negativa, atrapan el ADN en lugar de complejarse con él. Debido a que tanto el ADN como el lípido tienen una carga similar, se produce una repulsión en lugar de la formación de un complejo. A pesar de ello, parte del ADN queda atrapado en el interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH han sido utilizados para suministrar ADN que codifica el gen de la timidina-cinasa a monocapas celulares en cultivo. Se detectó la expresión del gen exógeno en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición de liposomas incluye fosfolípidos distintos de la fosfatidilcolina de origen natural. Las composiciones de liposomas neutros se pueden formar, por ejemplo, a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC)
o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos se forman en general a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición de liposomas se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de un fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el suministro tópico de formulaciones farmacológicas de liposomas en la piel. La aplicación de liposomas que contenían interferón a la piel de conejillos de Índias dio como resultado una reducción de úlceras de herpes en la piel, mientras que el suministro de interferón por otros medios (p. ej., como una solución o como una emulsión) no fue eficaz (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional evaluó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación de liposomas en comparación con la administración del interferón utilizando un sistema acuoso, y llegó a la conclusión de que la formulación de liposomas era mejor que la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
También se han examinado sistemas de liposomas no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden un surfactante no iónico y colesterol. Se utilizaron formulaciones de liposomas no iónicos que comprendían NovasomeTM I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) y NovasomeTM II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter polioxietilen-10-estearílico) para suministrar ciclosporina A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas de liposomas no iónicos eran eficaces a la hora de facilitar la deposición de la ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados estéricamente", un término que, tal como se utiliza en la presente, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en los liposomas, proporcionan unos tiempos de vida en circulación mejorados en comparación con los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica del liposoma que forma las vesículas (A) comprende uno o más glicolípidos, tales como el monosialogangliósido GM1, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin pretender vincularse a ninguna teoría particular, se cree en la técnica que, al menos para los liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, la semivida en circulación mejorada de estos liposomas estabilizados estéricamente procede de una reducción de la captación en células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
En la técnica se conocen varios liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann.
N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) han descrito la capacidad del monosialogangliósido GM1, el sulfato de galactocerebrósido y el fosfatidilinositol para mejorar las semividas en sangre de los liposomas. Estos resultados fueron corroborados por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La Pat. de EE. UU. N.o
4.837.028 y WO 88/04924, ambas de Allen et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido GM1 o un éster de tipo sulfato de un galactocerebrósido. La Pat. de EE. UU. N.o 5.543.152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. En WO 97/13499 (Lim et al.) se describen liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina.
En la técnica se han descrito muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos y métodos para prepararlos. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) han descrito liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) descubrieron que un recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos proporcionaba unas semividas en sangre significativamente mejoradas. Sears (Pat. de EE. UU. N.os
4.426.330
y 4.534.899) ha descrito fosfolípidos sintéticos modificados mediante la unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (p. ej., PEG). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) han descrito experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivada con PEG o estearato de PEG presentan incrementos significativos de las semividas en circulación en sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron estas observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, p. ej., DSPE-PEG, formados a partir de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Se han descrito liposomas que tienen restos de PEG unidos covalentemente en su superficie externa en la Patente Europea N.o EP 0 445 131 B1 y en WO 90/04384 de Fisher. Woodle et al. (Pat. de EE. UU. N.os 5.013.556 y 5.356.633) y Martin et al. (Pat. de EE. UU. N.o 5.213.804 y Patente Europea N.o EP 0 496 813 B1) han descrito composiciones de liposomas que contienen un porcentaje molar de 1-20 de PE derivatizado con PEG y métodos para utilizarlas. En WO 91/05545 y la Pat. de EE. UU. N.o 5.225.212 (ambas de Martin et al.) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al.) se describen liposomas que comprenden una serie de conjugados de lípido-polímero diferentes. En WO 96/10391 (Choi et al.) se describen liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG. La Pat. de EE. UU. N.o
5.540.935
(Miyazaki et al.) y la Pat. de EE. UU. N.o 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG y que se pueden derivatizar adicionalmente con restos funcionales en sus superficies.
En la técnica se conocen varios liposomas que comprenden ácidos nucleicos. El documento WO 96/40062 de Thierry et al. describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de peso molecular elevado en liposomas. La Pat. de EE. UU. N.o 5.264.221 de Tagawa et al. describe liposomas unidos a proteínas y afirma que los contenidos de tales liposomas pueden incluir un ARNbc. La Pat. de EE. UU. N.o 5.665.710 de Rahman et al. describe ciertos métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. El documento WO 97/04787 de Love et al. describe liposomas que comprenden ARNbc que tienen como diana el gen raf.
Los transfersomas son otro tipo más de liposomas y son agregados lipídicos que se pueden deformar en gran medida, los cuales son candidatos atractivos para ser utilizados como vehículos de suministro farmacológico. Los transfersomas se pueden describir como gotículas lipídicas que se pueden deformar tanto que son capaces de penetrar fácilmente a través de poros que sean más pequeños que la gotícula. Los transfersomas se pueden adaptar al entorno en el cual se utilizan, p. ej., se pueden autooptimizar (se pueden adaptar a la forma de los poros en la piel), se pueden autoreparar, frecuentemente llegan a sus dianas sin sufrir fragmentación y a menudo se pueden autocargar. Para preparar transfersomas, es posible añadir activadores de los bordes superficiales, normalmente surfactantes, a la composición de liposomas estándar. Los transfersomas han sido utilizados para
suministrar albúmina de suero a la piel. Se ha demostrado que el suministro mediado por transfersomas de la albúmina de suero es tan eficaz como la inyección subcutánea de una solución que contenga albúmina de suero.
Los surfactantes se aplican de forma generalizada en formulaciones tales como emulsiones (incluidas las microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y puntuar las propiedades de los numerosos tipos diferentes de surfactantes, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB, por sus siglas en inglés). La naturaleza del grupo hidrófilo (que también se conoce como la "cabeza") proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes surfactantes utilizados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Si la molécula de surfactante no está ionizada, se clasifica como un surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos se aplican de forma generalizada en productos cosméticos y farmacéuticos, y se pueden utilizar en un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB están comprendidos entre 2 y aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y los éteres no iónicos, tales como los alcoholes grasos etoxilados, alcoholes propoxilados, polímeros en bloque etoxilados/propoxilados, también se incluyen en esta clase. Los surfactantes de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de surfactantes no iónicos.
Si la molécula de surfactante tiene una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acillactilatos, amidas acílicas de aminoácidos, ésteres del ácido sulfúrico tales como alquilsulfatos y alquilsulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, acilisotionatos, aciltauratos y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de surfactantes aniónicos son los alquilsulfatos y los jabones.
Si la molécula de surfactante tiene una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula de surfactante tiene la capacidad de tener tanto una carga positiva como negativa, el surfactante se clasifica como anfótero. Los surfactantes anfóteros incluyen derivados del ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, Nalquilbetaínas y fosfátidos.
El uso de surfactantes en productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones ha sido objeto de artículos de revisión (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, pág. 285).
Partículas de ácido nucleico-lípido
Un ARNbc de ALAS1 puede estar totalmente encapsulado en la formulación lipídica, p. ej., para formar una partícula de SPLP, pSPLP, SNALP u otra partícula de ácido nucleico-lípido. El término "SNALP", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido estable, incluida una SPLP. El término "SPLP", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende ADN plasmídico encapsulado dentro de una vesícula lipídica. Las SNALP y SPLP contienen normalmente un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula (p. ej., un conjugado de PEG-lípido). Las SNALP y SPLP son extremadamente útiles para las aplicaciones sistémicas, ya que exhiben unos tiempos de vida en circulación extendidos tras su inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios alejados (p. ej., sitios separados físicamente del sitio de administración). Las SPLP incluyen "pSPLP", las cuales incluyen un complejo de ácido nucleico-agente de condensación encapsulado, según se expone en la Publicación de PCT N.o WO 00/03683. Las partículas de la presente invención tienen normalmente un diámetro medio comprendido entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 150 nm, más habitualmente entre aproximadamente 60 nm y aproximadamente 130 nm, más habitualmente entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 110 nm, de la forma más habitual entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 90 nm y son sustancialmente atóxicas. Además, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención, son resistentes en solución acuosa a la degradación por parte de una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen, p. ej., en las Patentes de EE. UU. N.os 5.976.567, 5.981.501, 6.534.484, 6.586.410,
6.815.432 y la Publicación de PCT N.o WO 96/40964.
La proporción de lípido frente a fármaco (proporción de masa/masa) (p. ej., proporción de lípido frente a ARNbc) puede estar comprendida en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente
1:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1 o de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1.
El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,Ndiestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(I-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(I-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2
dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de tipo cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de tipo cloruro de 1,2-dilinoleoil-3trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) o 3-(N,Ndilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodiol (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,Ndimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de este, (3aR,5S,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) o una mezcla de estos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente un 20% mol a aproximadamente un 50% mol o aproximadamente un 40% mol del lípido total presente en la partícula.
Se puede utilizar el compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano para preparar nanopartículas de lípido-ARNip. La síntesis de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número 61/107.998, presentada el 23 de octubre de 2008.
La partícula de lípido-ARNip puede incluir un 40% de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% de DSPC: 40% de colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (porcentaje molar) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una proporción de ARNip/lípido de 0.027.
El lípido no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro, que incluye, sin carácter limitante, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-lcarboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18-1-trans-PE, 1-estearoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de estos. El lípido no catiónico puede constituir de aproximadamente un 5% mol a aproximadamente un 90% mol, aproximadamente un 10% mol o aproximadamente un 58% mol si se incluye colesterol, del lípido total presente en la partícula.
El conjugado de lípido que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido, que incluye, sin carácter limitante, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer) o una mezcla de estos. El conjugado de PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEGdilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) o un PEGdiesteariloxipropilo (C]8). El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede constituir desde un 0% mol hasta aproximadamente un 20% mol o aproximadamente un 2% mol del lípido total presente en la partícula.
La partícula de ácido nucleico-lípido puede incluir además colesterol con una concentración comprendida, p. ej., entre aproximadamente un 10% mol y aproximadamente un 60% mol o de aproximadamente un 48% mol del lípido total presente en la partícula.
El ARNi se puede formular en una nanopartícula lipídica (LNP).
LNP01
En una realización, se pueden utilizar el lipidoide ND98∙4HCl (PM 1487) (remítase a la Solicitud de Patente de EE. UU. N.o 12/056.230, presentada el 26/3/2008), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc (p. ej., partículas LNP01). Se pueden preparar soluciones patrón de cada uno de ellos en etanol como se indica a continuación: ND98, 133 mg/mL; colesterol, 25 mg/mL, PEG-ceramida C16, 100 mg/mL. A continuación, las soluciones patrón de ND98, colesterol y PEG-ceramida C16 se pueden combinar en una relación molar de, p. ej., 42:48:10. La solución lipídica combinada se puede mezclar con ARNbc acuoso (p. ej., en acetato de sodio de pH 5) de manera que la concentración final de etanol sea de aproximadamente un 35-45% y la concentración final de acetato de sodio sea de aproximadamente 100-300 mM. Normalmente, las nanopartículas de lípido-ARNbc se forman espontáneamente cuando se produce la mezcla. Dependiendo de la distribución de tamaños de partícula deseada, la mezcla de nanopartículas resultante se puede extruir a través de una membrana de policarbonato (p. ej., con un punto de corte de 100 nm) utilizando, por ejemplo, una extrusora de tambor térmico tal como la extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, se puede omitir el paso de extrusión. Se puede conseguir eliminar el etanol e intercambiar el tampón de forma simultánea mediante, por ejemplo, diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón se puede intercambiar, por ejemplo, con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH de aproximadamente 7, p. ej., un pH de aproximadamente 6.9, un pH de aproximadamente 7.0, un pH de aproximadamente 7.1, un pH de aproximadamente 7.2, un pH de aproximadamente 7.3 o un pH de aproximadamente 7.4.
H
O N O
H
H
N
N
NN N
N
H O
N O O N
HH
ND98 Isómero I
Fórmula 1 Las formulaciones de LNP01 se describen, p. ej., en la Publicación de Solicitud Internacional N.o WO 2008/042973. En la tabla a continuación se proporcionan formulaciones de lípido-ARNbc ilustrativas adicionales. Tabla 10: formulaciones lipídicas ilustrativas
Lípido catiónico
Conjugado de lípido catiónico/lípido no catiónico/colesterol/PEG-lípidoProporción de lípido:ARNip
SNAL P
l,2-Dilinoleniloxi-N,Ndimetilaminopropano (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA (57.1/7.1/34.4/1.4) lípido:ARNip ~ 7:1
S-XTC
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA 57.1/7.1/34.4/1.4 lípido:ARNip ~ 7:1
LNP0 5
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 lípido:ARNip ~ 6:1
LNP0 6
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 57.5/7.5/31.5/3.5 lípido:ARNip ~ 11:1
LNP0 7
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5 lípido:ARNip ~ 6:1
LNP0 8
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 60/7.5/31/1.5 lípido:ARNip ~ 11:1
LNP0 9
2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano (XTC) XTC/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP1 0
(3aR,5S,6aS)-N,N-dimetil-2,2di((9Z,12Z)-octadeca-9,12dienil)tetrahidro-3aHciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100) ALN100/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP1 1
4-(Dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3) MC-3/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP1 2
1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2hidroxidodecil)amino)etil)(2hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (C12-200) C12-200/DSPC/Colesterol/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP1 3
XTC XTC/DSPC/Col/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 33:1
LNP1 4
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG 40/15/40/5 lípido:ARNip 11:1
LNP1 5
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DSG/GalNAc-PEG-DSG 50/10/35/4.5/0.5 lípido:ARNip 11:1
LNP1 6
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 7:1
LNP1 7
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP1 8
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 12:1
LNP1 9
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG 50/10/35/5 lípido:ARNip 8:1
LNP2 0
MC3 MC3/DSPC/Col/PEG-DPG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
LNP2 1
C12-200 C12-200/DSPC/Col/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 7:1
LNP2 2
XTC XTC/DSPC/Col/PEG-DSG 50/10/38.5/1.5 lípido:ARNip 10:1
DSPC: diestearoilfosfatidilcolina
DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
PEG-DMG: PEG-didimiristoilglicerol (C14-PEG o PEG-C14) (PEG con un peso molecular medio de 2000)
PEG-DSG: PEG-diestirilglicerol (C18-PEG o PEG-C18) (PEG con un peso molecular medio de 2000)
5 PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con un peso molecular medio de 2000)
Se describen formulaciones que comprenden SNALP (l,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) en la Publicación Internacional N.o WO2009/127060, presentada el 15 de abril de 2009.
Se describen formulaciones que comprenden XTC, p. ej., en el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/148.366, presentado el 29 de enero de 2009; el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/156.851, presentado el 2 de marzo de
10 2009; el N.o de serie Provisional de EE. UU. presentado el 10 de junio de 2009; el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/228.373, presentado el 24 de julio de 2009; el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/239.686, presentado el 3 de septiembre de 2009, y la Solicitud Internacional N.o PCT/US2010/022614, presentada el 29 de enero de 2010.
Se describen formulaciones que comprenden MC3, p. ej., en el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/244.834, presentado el 22 de septiembre de 2009, el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/185.800, presentado el 10 de
15 junio de 2009, y la Solicitud Internacional N.o PCT/US10/28224, presentada el 10 de junio de 2010.
Se describen formulaciones que comprenden ALNY-100, p. ej., en la Solicitud de Patente Internacional número PCT/US09/63933, presentada el 10 de noviembre de 2009.
Se describen formulaciones que comprenden C12-200, p. ej., en el N.o de serie Provisional de EE. UU. 61/175.770, presentado el 5 de mayo de 2009, y la Solicitud Internacional N.o PCT/US10/33777, presentada el 5 de mayo de 2010.
Síntesis de lípidos catiónicos
Cualquiera de los compuestos, p. ej., lípidos catiónicos y similares, utilizados en las partículas de ácido nucleicolípido que se exponen en la invención se pueden preparar mediante técnicas conocidas de síntesis orgánica, que incluyen los métodos que se describen con más detalle en los Ejemplos. Todos los sustituyentes son como se definen a continuación, a menos que se indique de otro modo.
El término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, cíclico o no cíclico, de cadena lineal o ramificada, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Los alquilos saturados de cadena lineal representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos saturados ramificados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los alquilos cíclicos no saturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares.
El término "alquenilo" se refiere a un alquilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen los isómeros tanto cis como trans. Los alquenilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares.
El término "alquinilo" se refiere a cualquier alquilo o alquenilo, como se han definido anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un triple enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1 butinilo y similares.
El término "acilo" se refiere a cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo donde el átomo de carbono en el punto de unión se ha sustituido con un grupo oxo, según se define más adelante. Por ejemplo, -C(=O)alquilo, -C(=O)alquenilo y C(=O)alquinilo son grupos acilo.
El término "heterociclo" se refiere a un anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o bicíclico de 7 a 10 miembros, el cual está saturado, no saturado o es aromático, y el cual contiene 1 o 2 heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno y azufre, y donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternalizado, incluidos los anillos bicíclicos en los cuales cualquiera de los heterociclos anteriores está fusionado con un anillo de benceno. El heterociclo puede estar unido mediante cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen los heteroarilos, según se definen más adelante. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
Las expresiones "alquilo opcionalmente sustituido", "alquenilo opcionalmente sustituido", "alquinilo opcionalmente sustituido", "acilo opcionalmente sustituido" y "heterociclo opcionalmente sustituido" se refieren a que, cuando están sustituidos, al menos un átomo de hidrógeno se ha reemplazado por un sustituyente. En el caso de un sustituyente oxo (=O), se han reemplazado dos átomos de hidrógeno. En este sentido, los sustituyentes incluyen oxo, halógeno, heterociclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, –SOnRx y -SOnNRxRy, donde n es 0, 1 o 2, Rx y Ry son iguales o diferentes y son independientemente hidrógeno, alquilo o heterociclo, y cada uno de dichos sustituyentes alquilo y heterociclo puede estar sustituido adicionalmente con uno o más de los siguientes: oxo, halógeno, -OH, -CN, alquilo, -ORx, heterociclo, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy.
El término "halógeno" se refiere a fluoro, cloro, bromo y yodo.
En algunas realizaciones, los métodos que se exponen en la invención pueden requerir el uso de grupos protectores. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con la metodología de grupos protectores (remítase, por ejemplo, a Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, Ciudad de Nueva York, 1999). Resumiendo, los grupos protectores, en el contexto de esta invención, son cualquier grupo que reduzca
o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional. Se puede añadir un grupo protector a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante ciertas reacciones y a continuación se elimina para revelar el grupo funcional original. En algunas realizaciones, se utiliza un "grupo protector de alcoholes". Un "grupo protector de alcoholes" es cualquier grupo que reduzca o elimine la reactividad no deseada de un grupo funcional de tipo alcohol. Los grupos protectores se pueden añadir y eliminar utilizando técnicas de uso común en la materia.
Síntesis de la Fórmula A
En una realización, las partículas de ácido nucleico-lípido que se exponen en la invención se formulan utilizando un líquido catiónico de fórmula A:
donde R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, pudiendo estar cada uno de ellos
5 opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 se pueden considerar conjuntamente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el lípido catiónico es XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). En general, el lípido de fórmula A anterior se puede preparar mediante los siguientes Esquemas de reacción 1 o 2, donde todos los sustituyentes son como se han definido anteriormente, a menos que se indique de otro modo.
El lípido A, donde R1 y R2 son independientemente alquilo, alquenilo o alquinilo, pudiendo estar cada uno de ellos opcionalmente sustituido, y R3 y R4 son independientemente alquilo inferior o R3 y R4 se pueden considerar conjuntamente para formar un anillo heterocíclico opcionalmente sustituido, se puede preparar de acuerdo con el Esquema 1. La cetona 1 y el bromuro 2 se pueden adquirir o preparar de acuerdo con métodos conocidos por los
15 expertos en la técnica. La reacción de 1 y 2 proporciona el cetal 3. El tratamiento del cetal 3 con la amina 4 proporciona los lípidos de fórmula A. Los lípidos de fórmula A se pueden convertir en la correspondiente sal de amonio con una sal orgánica de fórmula 5, donde X es un contraión seleccionado entre halógeno, hidróxido, fosfato, sulfato o similares.
Esquema 2
Como alternativa, la cetona 1 que actúa como material de partida se puede preparar de acuerdo con el Esquema 2. El reactivo de Grignard 6 y el cianuro 7 se pueden adquirir o preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica. La reacción de 6 y 7 proporciona la cetona 1. La conversión de la cetona 1 en los lípidos
5 correspondientes de fórmula A se lleva a cabo como se ha descrito en el Esquema 1.
Síntesis de MC3
La preparación de DLin-M-C3-DMA (es decir, 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta6,9,28,31-tetraen-19-ilo) se llevó a cabo como se indica a continuación. Una solución de (6Z,9Z,28Z,31Z)heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0.53 g), clorhidrato del ácido 4-N,N-dimetilaminobutírico (0.51 g), 4-N,N10 dimetilaminopiridina (0.61 g) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0.53 g) en diclorometano (5 mL) se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La solución se lavó con ácido clorhídrico diluido y a continuación con bicarbonato de sodio acuoso diluido. Las fracciones orgánicas se secaron con sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se eliminó el disolvente en un rotavapor. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) utilizando un gradiente de elución de un 1-5% de metanol/diclorometano. Las fracciones que
15 contenían el producto purificado se combinaron y se eliminó el disolvente, para proporcionar un aceite incoloro (0.54 g).
Síntesis de ALNY-100
La síntesis del cetal 519 [ALNY-100] se llevó a cabo utilizando el siguiente esquema 3:
20 Síntesis de 515:
A una suspensión agitada de LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 mol) en 200 mL de THF anhidro en un matraz de fondo redondo de dos bocas (1 L), se añadió una solución de 514 (10 g, 0.04926 mol) en 70 mL de THF lentamente a 0 oC en atmósfera de nitrógeno. Tras completar la adición, la mezcla de reacción se calentó hasta temperatura ambiente y a continuación se calentó a reflujo durante 4 h. La evolución de la reacción se monitorizó mediante TLC. Después 25 de que se completara la reacción (mediante TLC), la mezcla se enfrió hasta 0 oC y se desactivó añadiendo cuidadosamente una solución saturada de Na2SO4. La mezcla de reacción se agitó durante 4 h a temperatura ambiente y se separó por filtración. El residuo se lavó bien con THF. El filtrado y los lavados se mezclaron, se diluyeron con 400 mL de dioxano y 26 mL de HCl conc. y se agitaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío para proporcionar la sal clorhídrica de 515 como un sólido blanco.
Rendimiento: 7.12 g. 1H-RMN (DMSO, 400MHz): δ = 9.34 (ancho, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
Síntesis de 516:
A una solución agitada del compuesto 515 en 100 mL de DCM anhidro en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 250 mL, se añadió NEt3 (37.2 mL, 0.2669 mol) y se enfrió hasta 0 oC en atmósfera de nitrógeno. Después de una adición lenta de N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (20 g, 0.08007 mol) en 50 mL de DCM anhidro, se permitió que la mezcla de reacción se calentara hasta temperatura ambiente. Después de que se completara la reacción (2-3 h mediante TLC), la mezcla se lavó sucesivamente con una solución de HCl 1 N (1 x 100 mL) y una solución saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL). A continuación, la fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro y se evaporó el disolvente para obtener un material crudo, el cual se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 516 como una masa pegajosa. Rendimiento: 11 g (89%). 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ = 7.36-7.27 (m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (a, 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 2.30-2.25 (m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
Síntesis de 517A y 517B:
El ciclopenteno 516 (5 g, 0.02164 mol) se disolvió en una solución de 220 mL de acetona y agua (10:1) en un matraz de fondo redondo de 500 mL de una boca y a esto se le añadió N-óxido de N-metilmorfolina (7.6 g, 0.06492 mol) y a continuación 4.2 mL de una solución al 7.6% de OsO4 (0.275 g, 0.00108 mol) en tert-butanol a temperatura ambiente. Después de que se completara la reacción (~ 3 h), la mezcla se desactivó con la adición de Na2SO3 sólido y la mezcla resultante se agitó durante 1.5 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (300 mL) y se lavó con agua (2 x 100 mL), a continuación con una solución saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL), agua (1 x 30 mL) y finalmente con salmuera (1x 50 mL). La fase orgánica se secó con Na2SO4 anhidro y se eliminó el disolvente al vacío. La purificación del material crudo mediante cromatografía en columna de gel de sílice proporcionó una mezcla de diastereómeros, los cuales se separaron mediante HPLC prep. Rendimiento: -6 g de crudo
517A -Pico 1 (sólido blanco), 5.13 g (96%). 1H-RMN (DMSO, 400 MHz): δ = 7.39-7.31 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 4.78
4.73 (m, 1H), 4.48-4.47 (d, 2H), 3.94-3.93 (m, 2H), 2.71 (s, 3H), 1.72-1.67 (m, 4H). LC-MS -[M+H]-266.3, [M+NH4+]-283.5 presente, HPLC-97.86%. Estereoquímica confirmada mediante rayos X.
Síntesis de 518:
Utilizando un procedimiento análogo al descrito para la síntesis del compuesto 505, se obtuvo el compuesto 518 (1.2 g, 41%) como un aceite incoloro. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ = 7.35-7.33 (m, 4H), 7.30-7.27 (m, 1H), 5.37-5.27 (m, 8H), 5.12 (s, 2H), 4.75 (m, 1H), 4.58-4.57 (m, 2H), 2.78-2.74 (m, 7H), 2.06-2.00 (m, 8H), 1.96-1.91 (m, 2H), 1.62 (m, 4H), 1.48 (m, 2H), 1.37-1.25 (m a, 36 H), 0.87 (m, 6H). HPLC-98.65%.
Procedimiento general para la síntesis del compuesto 519:
Una solución del compuesto 518 (1 eq) en hexano (15 mL) se añadió gota a gota a una solución enfriada con hielo de LAH en THF (1 M, 2 eq). Tras completar la adición, la mezcla se calentó a 40 oC durante 0.5 h y a continuación se enfrió de nuevo en un baño de hielo. La mezcla se hidrolizó cuidadosamente con Na2SO4 acuoso saturado, a continuación se filtró a través de celite y se redujo hasta obtener un aceite. La cromatografía en columna proporcionó 519 puro (1.3 g, 68%), que se obtuvo como un aceite incoloro. 13C RMN = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; MS por electronebulización (modo positivo): Peso molecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calc. 654.6, Experimental 654.6.
Las formulaciones preparadas mediante el método estándar o un método exento de extrusión se pueden caracterizar de maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones se caracterizan normalmente mediante una inspección visual. Deberían ser soluciones translúcidas blanquecinas exentas de agregados o sedimento. El tamaño de partícula y la distribución de tamaños de partícula de las nanopartículas lipídicas se pueden medir mediante dispersión de la luz utilizando, por ejemplo, un instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EE. UU.). Las partículas deberían de tener un tamaño de aproximadamente 20-300 nm, tal como de 40-100 nm. La distribución de tamaños de partícula debería ser unimodal. La concentración total de ARNbc en la formulación, así como también la fracción atrapada, se estima utilizando un ensayo de exclusión de tinte. Una muestra del ARNbc formulado se puede incubar con un tinte de unión a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes), en presencia o ausencia de un surfactante que altere la formulación, p. ej., Triton-X100 al 0.5%. El ARNbc total de la formulación se puede determinar mediante la señal procedente de la muestra que contiene el surfactante, en relación con una curva patrón. La fracción atrapada se determina restando el contenido de ARNbc "libre" (que se mide mediante la señal en ausencia de surfactante) del contenido de ARNbc total. El porcentaje de ARNbc atrapado es normalmente > 85%. Para una formulación SNALP, el tamaño de partícula es de al menos 30 nm, al menos 40 nm, al menos 50 nm, al menos 60 nm, al menos 70 nm, al menos 80 nm, al menos 90 nm, al menos 100 nm, al menos 110 nm y al menos 120 nm. En el intervalo adecuado es normalmente de aproximadamente al menos 50 nm a aproximadamente al menos 110 nm, de aproximadamente al menos 60 nm a aproximadamente al menos 100 nm o de aproximadamente al menos 80 nm a aproximadamente al menos 90 nm.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Puede ser deseable utilizar espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes dispersantes o aglutinantes. En algunas realizaciones, las formulaciones orales son aquellas en las que los ARNbc que se exponen en la invención se administran conjuntamente con uno o más agentes quelantes y surfactantes potenciadores de la penetración. Los surfactantes adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de estos, ácidos biliares y/o sales de estos. Los ácidos/sales biliares adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de estos (p. ej., de sodio). En algunas realizaciones, se utilizan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, sales/ácidos grasos combinados con sales/ácidos biliares. Una combinación ilustrativa es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen el éter polioxietilen-9-laurílico y el éter polioxietilen-20cetílico. Los ARNbc que se exponen en la invención se pueden suministrar por vía oral, en forma granular, que incluye partículas secas pulverizadas, o complejado para formar micro-o nanopartículas. Los agentes complejantes de ARNbc incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas con DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Los agentes complejantes adecuados incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (p. ej., p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-alúmina y DEAE-dextrano, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Se describen detalladamente formulaciones orales para ARNbc y su preparación en la Patente de EE. UU. 6.887.906, la Publicación de EE. UU.
N.o 20030027780 y la Patente de EE. UU. N.o 6.747.014.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimal (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles, las cuales también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, sin carácter limitante, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, sin carácter limitante, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de varios componentes que incluyen, sin carácter limitante, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas que se exponen en la presente invención, las cuales se pueden presentar convenientemente en una forma farmacéutica unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen el paso de asociar los principios activos con el o los portadores o el o los excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima los principios activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y a continuación, cuando proceda, dando forma al producto.
Las composiciones que se exponen en la presente invención se pueden formular en cualquiera de las muchas formas farmacéuticas posibles tales como, sin carácter limitante, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Formulaciones adicionales
Emulsiones
Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotículas con un diámetro normalmente superior a 0.1µm (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, pág. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones suelen ser sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles mezcladas de forma íntima y dispersadas una en la otra. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad agua en aceite (a/ac) o aceite en agua (ac/a). Cuando una fase acuosa se divide finalmente y se dispersa en forma de gotículas minúsculas en una masa de fase oleosa, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (a/ac). Como alternativa, cuando una fase oleosa se divide finalmente y se dispersa en forma de gotículas minúsculas en una masa de fase acuosa, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (ac/a). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y del fármaco activo, el cual puede estar presente como una solución tanto en la fase acuosa, la fase oleosa o por sí mismo como una fase separada. Cuando proceda, en las emulsiones también puede haber excipientes farmacéuticos presentes tales como emulsionantes, estabilizantes, tintes y antioxidantes. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que comprendan más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/a/ac) y de agua en aceite en agua (a/ac/a). Tales formulaciones complejas suelen proporcionar ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no proporcionan. Las emulsiones múltiples en las cuales gotículas de aceite individuales de una emulsión de ac/a encierran pequeñas gotículas de agua constituyen una emulsión de a/ac/a. De modo similar, un sistema de gotículas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporcionan una emulsión de ac/a/ac.
Las emulsiones se caracterizan por tener una estabilidad dinámica escasa o nula. A menudo, la fase dispersada o discontinua de la emulsión está bien dispersada en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de los medios de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de las cremas y bases de ungüentos de tipo emulsión. Otros medios para estabilizar emulsiones implican el uso de emulsionantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar a grandes rasgos en cuatro categorías: surfactantes sintéticos, emulsionantes de origen natural, bases de absorción y sólidos finamente dispersados (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los surfactantes sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, se aplican de forma generalizada en la formulación de emulsiones y han sido objeto de artículos de revisión en la bibliografía (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los surfactantes son normalmente anfifílicos y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La proporción de la naturaleza hidrófila frente a la hidrófoba del surfactante se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para clasificar y seleccionar surfactantes en la preparación de formulaciones. Los surfactantes se pueden clasificar en diferentes clases en función de la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes de origen natural utilizados en las formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas, por ejemplo, pueden empaparse de agua para formar emulsiones de a/ac a la vez que conservan sus consistencias semisólidas, por ejemplo, lanolina anhidra y vaselina hidrófila. También se han utilizado sólidos finamente divididos como emulsionantes satisfactorios, especialmente combinados con surfactantes y en preparados viscosos. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se expanden tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.
En las formulaciones de emulsiones también se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes, los cuales contribuyen a definir las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los coloides o hidrocoloides hidrófilos incluyen gomas de origen natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de la celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o expanden en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando películas interfaciales resistentes alrededor de las gotículas de la fase dispersadas e incrementando la viscosidad de la fase externa.
Debido a que las emulsiones suelen contener una serie de ingredientes, tales como carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfátidos, que pueden propiciar fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones suelen incorporar conservantes. Los conservantes utilizados habitualmente que se incluyen en las formulaciones de emulsiones incluyen parabeno metílico, parabeno propílico, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres del ácido p-hidroxibenzoico y ácido bórico. Habitualmente también se añaden antioxidantes a las formulaciones de emulsiones para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser atrapadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y singergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de las formulaciones de emulsiones por vía dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su elaboración han sido objeto de artículos de revisión en la bibliografía (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsiones para un suministro oral han sido utilizadas de forma generalizada debido a que su formulación resulta sencilla, así como también debido a su eficacia desde el punto de vista de la absorción y biodisponibilidad (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Los laxantes con una base de aceite mineral, las vitaminas solubles en aceites y los preparados nutritivos ricos en grasas se encuentran entre los materiales que se han administrado habitualmente por vía oral como emulsiones de ac/a.
En una realización de la presente invención, las composiciones de ARNi y los ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y un material anfífilo que es una solución líquida termodinámicamente estable y ópticamente isotrópica estable (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando en primer lugar un aceite en una solución acuosa de surfactante y a continuación añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol con una longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por consiguiente, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables e isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan normalmente mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, surfactante, cosurfactante y electrolito. El hecho de que la microemulsión sea del tipo agua en aceite (a/ac) o aceite en agua (ac/a) depende de las propiedades del aceite y el surfactante utilizados y de la estructura y la geometría del empaquetamiento de las cabezas polares y las colas hidrocarbonadas de las moléculas de surfactante (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
La estrategia fenomenológica que utiliza diagramas de fase se ha estudiado exhaustivamente y ha proporcionado un conocimiento comprensivo, para el experto en la técnica, sobre cómo formular las microemulsiones (remítase, p. ej., a Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de que solubilizan fármacos insolubles en agua en una formulación de partículas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los surfactantes utilizados en la preparación de microemulsiones incluyen, sin carácter limitante, surfactantes iónicos, surfactantes no iónicos, Brij 96, éteres oleílicos de polioxietileno, ésteres de poliglicerol y ácidos grasos, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o combinados con cosurfactantes. El cosurfactante, normalmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para incrementar la fluidez interfacial penetrando en la película surfactante y consecuentemente creando una película desordenada debido al espacio hueco generado entre las moléculas de surfactante. A pesar de ello, las microemulsiones se pueden preparar sin el uso de cosurfactantes y en la técnica se conocen sistemas de microemulsiones autoemulsionantes exentos de alcoholes. Normalmente, la fase acuosa es, sin carácter limitante, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados del etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, sin carácter limitante, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono-, di-y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos glicerílicos polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolixados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones tienen un interés particular desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Se ha postulado que las microemulsiones basadas en lípidos (tanto de ac/a como de a/ac) potencian la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluidos los péptidos (remítase, p. ej., a las Patentes de EE. UU. N.os 6.191.105, 7.063.860, 7.070.802, 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones ofrecen las ventajas de una solubilización mejorada del fármaco, una protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, una posible mejora de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el surfactante en la fluidez y permeabilidad de la membrana, la sencillez de su preparación, la sencillez de su administración oral en comparación con las formas farmacéuticas sólidas, una potencia clínica mejorada y una menor toxicidad (remítase, p. ej., a las Patentes de EE. UU. N.os 6.191.105, 7.063.860, 7.070.802, 7.157.099, Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo las microemulsiones se pueden formar espontáneamente cuando se combinan sus componentes a temperatura ambiente. Esto puede resultar particularmente conveniente cuando se formulan fármacos, péptidos o ARNi termolábiles. Las microemulsiones también han resultado ser eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas como farmacéuticas. Cabe esperar que las formulaciones y composiciones de microemulsiones de la presente invención propicien un incremento de la absorción sistémica de los ARNi y los ácidos nucleicos a partir del aparato gastrointestinal, así como también que mejoren la captación celular local de los ARNi y los ácidos nucleicos.
Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (malla 3), labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para mejorar la absorción de los ARNi y los ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración utilizados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como pertenecientes a una de las cinco categorías generales siguientes: surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y agentes no surfactantes ni quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases ha sido expuesta anteriormente.
Potenciadores de la penetración
Se pueden emplear varios potenciadores de la penetración para ejercer un suministro eficaz de los ácidos nucleicos, particularmente los ARNi, en la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, normalmente solo los fármacos lipófilos o solubles en lípidos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipófilos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que se ha de atravesar se trata con un potenciador de la penetración. Además de propiciar la difusión de los fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de los fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de entre cinco categorías generales, es decir, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y agentes no surfactantes ni quelantes (remítase, p. ej., a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de las clases mencionadas anteriormente de potenciadores de la penetración se describen a continuación con más detalle.
Surfactantes: En relación con la presente invención, los surfactantes (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, éter polioxietilen-9-laurílico y éter polioxietilen-20-cetílico (remítase, p. ej., a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92) y emulsiones perfluoroquímicas tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Los diferentes ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, sus ésteres de alquilo C1-20 (p. ej., metilo, isopropilo y t-butilo), y mono-y diglicéridos de estos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (remítase, p. ej., a Touitou, E. et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 133; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: La función fisiológica de la bilis incluye facilitar la dispersión y la absorción de lípidos y de vitaminas solubles en grasas (remítase, p. ej., a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,
9.a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Por lo tanto, la expresión "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes de origen natural de la bilis, así como también cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica farmacéuticamente aceptable, el colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y éter polioxietilen-9-laurílico (POE) (remítase, p. ej., a Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: Los agentes quelantes, cuando se utilizan en relación con la presente invención, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la solución mediante la formación de complejos con ellos, con el resultado de que se potencia la absorción de los ARNi a través de la mucosa. En lo que respecta a su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes presentan la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de la DNasa, ya que la mayoría de ADN-nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico bivalente para la catálisis y, por lo tanto, son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, sin carácter limitante, etilendiamintetraacetato de sodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (p. ej., salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acílicos del colágeno, derivados de tipo lauret-9 y N-aminoacilo de β-dicetonas (enaminas)(remítase, p. ej., a Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Agentes no surfactantes ni quelantes: Los compuestos potenciadores de la penetración no surfactantes ni quelantes, tal como se utilizan en la presente, se pueden definir como compuestos que presentan una actividad insignificante como agentes quelantes o como surfactantes pero que, a pesar de ello, potencian la absorción de los ARNi a través de la mucosa alimentaria (remítase, p. ej., a Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de tipo 1-alquil-y 1-alquenilazacicloalcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenac sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También se pueden añadir agentes que potencian la captación de ARNi a nivel celular a las composiciones farmacéuticas u otras composiciones de la invención. Por ejemplo, también existe constancia de que lípidos catiónicos, tales como la lipofectina (Junichi et al, Pat. de EE. UU. N.o 5.705.188), derivados catiónicos del glicerol y moléculas policatiónicas tales como la polilisina (Lollo et al., Solicitud de PCT WO 97/30731) potencian la captación celular de ARNbc. Los ejemplos de reactivos de transfección que se pueden adquirir de proveedores comerciales incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), el reactivo de transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), el reactivo de transfección liposomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), el reactivo de transfección liposomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza) o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), el reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), el reactivo de transfección TransFast™ (Promega; Madison, WI), el reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), el reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marsella, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), el reactivo de transfección TransPassª D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE. UU.), LyoVec™/LipoGen™ (Invivogen; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), el reactivo de transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.) o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE. UU.), entre otros.
Se pueden utilizar otros reactivos para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, que incluyen glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y mentona.
Portadores
Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. La expresión "compuesto portador" o "portador", tal como se utiliza en la presente, se puede referir a un ácido nucleico
o un análogo de este, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica de por sí) pero que es reconocido como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico con actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o propiciando su eliminación de la circulación. La administración conjunta de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de la última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico que se recupera en el hígado, el riñón u otros depósitos extracirculatorios, probablemente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc de tipo parcialmente fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se administra conjuntamente con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiocianoestilben-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Excipientes
A diferencia de un compuesto portador, un "excipiente" o "portador farmacéutico" es un agente de suspensión o un disolvente farmacéuticamente aceptable o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la vía de administración planeada, de modo que proporcione la masa, consistencia, etc. deseadas, cuando se combina con un ácido nucleico y los demás componentes de una composición farmacéutica determinada. Los portadores farmacéuticos habituales incluyen, sin carácter limitante, agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); rellenos (p. ej., lactosa u otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de sílice coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (p. ej., almidón, glicolato de almidón sódico, etc.) y agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato de sodio, etc.).
Para formular las composiciones de la presente invención, también se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con los ácidos nucleicos. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin carácter limitante, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de los ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes habituales tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas sólidas o líquidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes u otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con los ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin carácter limitante, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Otros componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, con sus niveles de uso establecidos en la técnica. De este modo, las composiciones pueden contener, por ejemplo, materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles a la hora de formular físicamente varias formas farmacéuticas de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, tales materiales, cuando se añaden, no deberían de interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, cuando proceda, mezclar con agentes auxiliares, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para ejercer un efecto sobre la presión osmótica, tampones, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares, los cuales no interaccionan de forma perjudicial con el o los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que se exponen en la invención incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes biológicos que actúan mediante un mecanismo que no es de iARN. Los ejemplos de tales agentes biológicos incluyen agentes que interfieren con una interacción de ALAS1 y al menos una pareja de unión a ALAS1.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la proporción de DL50/DE50. Es habitual encontrar compuestos que exhiben índices terapéuticos elevados.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y estudios con animales se pueden utilizar para formular una serie de dosis para uso en humanos. La dosis de las composiciones que se exponen en la invención se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la DE50 con una toxicidad baja o nula. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos que se exponen en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos con animales para conseguir un intervalo de concentraciones en circulación en plasma del compuesto o, cuando proceda, del producto polipeptídico de una secuencia diana (p. ej., para conseguir una reducción de la concentración del polipéptido) que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que proporciona una inhibición de los síntomas que es la mitad de la máxima) según se determina en un cultivo celular. Tal información se puede utilizar para determinar con más exactitud las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Además de su administración, según se ha discutido anteriormente, los ARNi que se exponen en la invención se pueden administrar combinados con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la expresión de ALAS1. En cualquier caso, el médico que lo administre puede ajustar la cantidad y los intervalos de tiempo para la administración del ARNi en función de los resultados observados utilizando medidas estándar de la eficacia que se conocen en la técnica o se describen en la presente.
Métodos para tratar enfermedades relacionadas con la expresión de un gen ALAS1
La divulgación se refiere en particular al uso de un ARNi que tiene ALAS1 como diana para inhibir la expresión de ALAS1 y/o tratar una enfermedad, trastorno o proceso patológico que se relacione con la expresión de ALAS1.
La expresión "un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1", un "trastorno relacionado con la expresión de ALAS1", un "proceso patológico relacionado con la expresión de ALAS1" o similares, tal como se utilizan en la presente, incluyen cualquier afección, trastorno o enfermedad en la cual se altera (p. ej., se incrementa) la expresión de ALAS1, se altera (p. ej., se incrementa) el nivel de una o más porfirinas, se altera el nivel o la actividad de una o más enzimas de la vía biosintética del grupo hemo (vía de las porfirinas) u otros mecanismos que produzcan cambios patológicos en la vía biosintética del grupo hemo. Por ejemplo, un ARNi que tenga un gen ALAS1 como diana, o una combinación de estos, se puede utilizar para el tratamiento de afecciones en las cuales los niveles de una porfirina o un precursor de una porfirina (p. ej., ALA o PBG) sean elevados (p. ej. ciertas porfirias) o afecciones en las que existan defectos en las enzimas de la vía biosintética del grupo hemo (p. ej., ciertas porfirias). Los trastornos relacionados con la expresión de ALAS1 incluyen, por ejemplo, anemia sideroblástica relacionada con X (XLSA), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (porfiria de Doss), porfiria intermitente aguda (AIP), porfiria eritropoyética congénita, porfiria cutánea tardía, coproporfiria hereditaria (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoyética (EPP) y eritroporfiria transitoria de la infancia.
Un "sujeto", tal como se utiliza en la presente, que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluye un ser humano o un animal no humano, p. ej., un mamífero. El mamífero puede ser, por ejemplo, un roedor (p. ej., una rata o un ratón) o un primate (p. ej., un mono). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
El sujeto puede padecer un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 (p. ej., se le ha diagnosticado una porfiria o ha sufrido uno o más síntomas de porfiria y es portador de una mutación asociada con la porfiria) o corre el riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 (p. ej., un sujeto con un historial familiar de porfiria o un sujeto que es portador de una mutación genética asociada con la porfiria).
Las clasificaciones de las porfirias, incluidas las porfirias hepáticas agudas, se describen, p. ej., en Balwani, M. y Desnick, R.J., Blood, 120(23), publicado en línea como un artículo de la primera edición de Blood, 12 de julio, 102; DOI 10.1182/blood-2086. Según describen Balwain y Desnick, la porfiria intermitente aguda, (AIP) la coproporfiria hereditaria (HCP) y la porfiria variegata (VP) son porfirias dominantes autosómicas y la porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) es recesiva autosómica. En raras ocasiones, AIP, HCP y VP aparecen como formas dominantes homozigóticas. Además, existe una forma recesiva homozigótica rara de la porfiria cutánea tardía (PCT), que es la única porfiria cutánea hepática, y también se conoce como porfiria hepatoeritropoyética. Las características clínicas y de laboratorio de estas porfirias se describen en la Tabla 11 a continuación.
Tabla 11: Porfirias hepáticas humanas: características clínicas y de laboratorio
Porfiria
Enzima deficiente Herencia Síntomas principales, NV CP o Actividad enzimática, % de la normal Porfirinas y/o precursores de porfirinas cuyo nivel se ha incrementado*
Eritrocitos Orina Heces
Porfirias hepáticas agudas
ADP
ALAdeshidratasa AR NV ~5 Znprotoporfirina ALA, coproporfirina III _
AIP
HMB-sintasa AD NV ~50 _ ALA, PBG, uroporfirina _
HCP
COPROoxidasa AD NV y CP ~50 _ ALA, PBG, coproporfirina III coproporfirina III
VP
PROTOoxidasa AD NV y CP ~50 _ ALA, PBG, coproporfirina III coproporfirina III, protoporfirina
Porfirias cutáneas hepáticas
PCT
UROdescarboxilasa Esporádica o AD CP <20 _ uroporfirina, 7carboxilatoporfirina uroporfirina, 7carboxilatoporfirina
AR se refiere a autosómica recesiva; AD, autosómica dominante; NV, neurovisceral; CP (por sus siglas en inglés), fotosensibilidad cutánea; y -, no procede.
*Incrementos que pueden ser importantes para el diagnóstico.
10 Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., una porfiria hepática, p. ej., AIP, HCP, VP, ADP o una porfiria hepatoeritropoyética.
Se describe que la porfiria es una porfiria hepática aguda, p. ej., una porfiria hepática aguda seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP) y porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP).
15 Se describe que la porfiria es una porfiria dual, p. ej., al menos dos porfirias. En algunas realizaciones, la porfiria dual comprende dos o más porfirias seleccionadas entre una porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP) y porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP).
Se describe que la porfiria es una porfiria hepática dominante homozigótica (p. ej., AIP, HCP o VP dominante homozigótica) o una porfiria hepatoeritropoyética. Se describe que la porfiria es AIP, HCP, VP o una porfiria 20 hepatoeritropoyética, o una combinación de estas (p. ej., una porfiria dual). Se describe que la AIP, HCP o VP es o bien dominante heterozigótica o dominante homozigótica.
Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., ADP y presenta un nivel elevado
(p. ej., un nivel elevado en orina) de ALA y/o coproporfirina III. Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., ADP y presenta un nivel elevado del eritrocito Zn-protoporfirina.
25 Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., AIP y presenta un nivel elevado
(p.
ej., un nivel elevado en orina) de ALA, PBG y/o uroporfirina.
Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., HCP y presenta un nivel elevado
(p.
ej., un nivel elevado en orina) de ALA, PBG, y/o coproporfirina III. Se describe que el sujeto padece o corre el
riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., HCP y presenta un nivel elevado (p. ej., un nivel elevado en las heces) de 30 coproporfirina III.
Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., VP y presenta un nivel elevado
(p.
ej., un nivel elevado en orina) de ALA, PBG, y/o coproporfirina III.
Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., HCP y presenta un nivel elevado
(p.
ej., un nivel elevado en las heces) de coproporfirina III y/o protoporfirina.
35 Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., PCT (p. ej., porfiria hepatoeritropoyética) y presenta un nivel elevado (p. ej., un nivel elevado en orina) de uroporfirina y/o 7carboxilatoporfirina. Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., PCT (p. ej., porfiria hepatoeritropoyética) y presenta un nivel elevado (p. ej., un nivel elevado en las heces) de uroporfirina y/o 7carboxilatoporfirina.
Una mutación asociada con la porfiria incluye cualquier mutación en un gen que codifique una enzima de la vía biosintética del grupo hemo (vía de las porfirinas) o un gen que altere la expresión de un gen de la vía biosintética del grupo hemo. Se describe que el sujeto es portador de una o más mutaciones en una enzima de la vía de las porfirinas (p. ej., una mutación en ALA-deshidratasa o PBG-desaminasa). Se describe que el sujeto padece una porfiria aguda (p. ej., AIP, porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa).
En algunos casos, los pacientes con una porfiria hepática aguda (p. ej., AIP) o pacientes que son portadores de mutaciones asociadas con una porfiria hepática aguda (p. ej., AIP) pero los cuales no presentan síntomas, tienen unos niveles elevados de ALA y/o PBG en comparación con individuos sanos. Remítase, p. ej., a Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. En tales casos, el nivel de ALA y/o PBG se puede incrementar incluso cuando el paciente no padece o nunca ha padecido un ataque. En algunos casos de este tipo, el paciente es por lo demás completamente asintomático. En algunos casos de este tipo, el paciente sufre dolor, p. ej., dolor neuropático, el cual puede ser un dolor crónico (p. ej., dolor neuropático crónico). En algunos casos, el paciente padece una neuropatía. En algunos casos, el paciente padece una neuropatía progresiva.
Se describe que el sujeto que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente tiene un nivel elevado de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG. Los niveles de una porfirina o un precursor de una porfirina se pueden evaluar utilizando métodos conocidos en la técnica o métodos que se describen en la presente. Por ejemplo, los métodos para evaluar los niveles de ALA y PBG en orina y en plasma, así como también los niveles de porfirinas en orina y en plasma, se describen en Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; y Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007, los contenidos completos de los cuales se incorporan a la presente en su totalidad.
Se describe que el sujeto es un modelo animal de una porfiria, p. ej., un modelo de ratón de una porfiria (p. ej., un ratón mutado según se describe en Lindberg et al. Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). Se describe que el sujeto es un ser humano, p. ej., un ser humano que padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, según se describe en la presente. Se describe que el sujeto no está sufriendo un ataque agudo de porfiria. Se describe que el sujeto nunca ha sufrido un ataque. Se describe que el paciente sufre dolor crónico. Se describe que el paciente presenta daños nerviosos. Se describe que el sujeto presenta cambios en el EMG y/o cambios en la velocidad de conducción nerviosa. En algunas realizaciones, el sujeto no presenta síntomas. Se describe que el sujeto corre el riesgo de desarrollar una porfiria (p. ej., es portador de una mutación génica asociada con una porfiria) y no presenta síntomas. Se describe que el sujeto ha sufrido previamente un ataque agudo pero no presenta síntomas en el momento del tratamiento.
Se describe que el sujeto corre el riesgo de desarrollar una porfiria y se trata profilácticamente para prevenir el desarrollo de la porfiria. Se describe que el sujeto presenta un nivel elevado de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG. En algunas realizaciones, el tratamiento profiláctico empieza en la pubertad. Se describe que el tratamiento reduce el nivel (p. ej., el nivel en plasma o el nivel en orina) de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG. Se describe que el tratamiento previene el desarrollo de un nivel elevado de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG. Se describe que el tratamiento previene el desarrollo, o reduce la frecuencia o la gravedad, de un síntoma asociado con una porfiria, p. ej., dolor o daños nerviosos.
Se describe que el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG, es elevado, p. ej., en una muestra de plasma u orina del sujeto. Se describe que el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG, en el sujeto se evalúa en función del nivel absoluto de la porfirina o el precursor de la porfirina, p. ej., ALA o PBG en una muestra del sujeto. Se describe que el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG, en el sujeto se evalúa en función del nivel relativo de la porfirina o el precursor de la porfirina, p. ej., ALA o PBG, en una muestra del sujeto. Se describe que el nivel relativo es relativo respecto al nivel de otra proteína
o compuesto, p. ej., el nivel de creatinina, en una muestra del sujeto. Se describe que la muestra es una muestra de orina. Se describe que la muestra es una muestra de plasma. Se describe que la muestra es una muestra de las heces.
Un nivel elevado de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG, se puede establecer, p. ej., mostrando que el sujeto presenta un nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG (p. ej., un nivel en plasma u orina de ALA y/o PBG) que sea superior, o superior o igual, a un valor de referencia. Un médico con experiencia en el tratamiento de porfirias sería capaz de determinar si el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina (p. ej., ALA y/o PBG) es elevado, p. ej., con el fin de diagnosticar una porfiria o para determinar si un sujeto corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., un sujeto puede estar predispuesto a sufrir un ataque agudo o una patología asociada con una porfiria tal como, p. ej., dolor crónico (p. ej., dolor neuropático) y una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva).
La expresión "valor de referencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un valor del sujeto cuando el sujeto no padece un estado patológico, o un valor de un sujeto normal o sano, o un valor de una muestra o población de referencia, p. ej., un grupo de sujetos normales o sanos (p. ej., un grupo de sujetos que no son portadores de ninguna mutación asociada con una porfiria y/o un grupo de sujetos que no padecen los síntomas asociados con una porfiria).
Se describe que el valor de referencia es un nivel previo a la enfermedad en el mismo individuo. En algunas realizaciones, el valor de referencia es un nivel en una muestra o población de referencia. Se describe que el valor de referencia es el valor medio o mediano en una muestra o población de referencia. Se describe que el valor de referencia es el valor que corresponde a dos desviaciones estándar por encima de la media en una muestra o población de referencia. Se describe que el valor de referencia es el valor que corresponde a 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 o 5 desviaciones estándar por encima de la media en una muestra o población de referencia.
Se describe que donde el sujeto presenta un nivel elevado de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG, el sujeto presenta un nivel de ALA y/o PBG que es al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% superior respecto a un valor de referencia. Se describe que el sujeto presenta un nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG, que es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces superior respecto a un valor de referencia.
Se describe que el valor de referencia es un límite de referencia superior. La expresión "límite de referencia superior", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un nivel que representa el límite superior del intervalo de confianza del 95% para una muestra o población de referencia, p. ej., un grupo de individuos sanos o normales (p. ej., de origen natural), p. ej., individuos que no son portadores de ninguna mutación genética asociada con una porfiria y/o individuos que no padecen ninguna porfiria. Por consiguiente, un límite de referencia inferior se refiere a un nivel que representa el límite inferior del mismo intervalo de confianza del 95%.
Cuando el sujeto presenta un nivel elevado, p. ej., un nivel en plasma o un nivel en orina, de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG, el nivel puede ser superior o igual a 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces el de un valor de referencia, p. ej., un valor de referencia superior. Se describe que el sujeto presenta un nivel en orina de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG que es superior a 4 veces el de un límite de referencia superior.
Se describe que el valor de referencia es un valor proporcionado en Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006 o Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Se describe que el valor de referencia es un valor proporcionado en la Tabla 1 de Sardh et al.
Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior o igual a 4.8 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior a, o superior o igual a, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 u 8 mmol/mol de creatinina.
Se describe que el valor de referencia para PBG en plasma es de 0.12 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en plasma superior a, o superior o igual a, 0.10 µmol/L, 0.12 µmol/L, 0.24 µmol/L, 0.36 µmol/L, 0.48 µmol/L o 0.60 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en plasma superior a, o superior o igual a, 0.48 µmol/L.
Se describe que el valor de referencia para PBG en orina es de 1.2 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior a, o superior o igual a, 1.0 mmol/mol de creatinina, 1.2 mmol/mol de creatinina, 2.4 mmol/mol de creatinina, 3.6 mmol/mol de creatinina, 4.8 mmol/mol de creatinina o 6.0 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de PBG en orina superior a, o superior o igual a, 4.8 mmol/mol de creatinina.
Se describe que el valor de referencia para ALA en plasma es de 0.12 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en plasma superior a, o superior o igual a, 0.10 µmol/L, 0.12 µmol/L, 0.24 µmol/L, 0.36 µmol/L, 0.48 µmol/L o 0.60 µmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en plasma superior a, o superior o igual a, 0.48 µmol/L.
Se describe que el valor de referencia para ALA en orina es de 3.1 mmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de ALA en orina superior a, o superior o igual a, 2.5 mmol/mol de creatinina, 3.1 mmol/mol de creatinina, 6.2 mmol/mol de creatinina, 9.3 mmol/mol de creatinina, 12.4 mmol/mol de creatinina o 15.5 mmol/mol de creatinina.
Se describe que el valor de referencia para la porfirina en plasma es de 10 nmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de porfirina en plasma superior a, o superior o igual a, 10 nmol/L. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de porfirina en plasma superior a, o superior o igual a 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nmol/L. El sujeto es un ser humano y presenta un nivel de porfirina en plasma superior a, o superior o igual a, 40 nmol/L. Se describe que el valor de referencia para la porfirina en orina es de 25 µmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de porfirina en orina superior a, o superior o igual a, 25 µmol/mol de creatinina. Se describe que el sujeto es un ser humano y presenta un nivel de porfirina en orina superior a, o superior o igual a, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 µmol/mol de creatinina.
Se describe que el sujeto presenta un nivel, p. ej., un nivel en plasma o un nivel en orina, de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA o PBG, que es superior al de un 99% de los individuos en una muestra de individuos sanos.
Se describe que el sujeto presenta un nivel, p. ej., un nivel en plasma o un nivel en orina, de ALA o PBG que es superior a dos desviaciones estándar por encima del nivel medio en una muestra de individuos sanos.
Se describe que el sujeto presenta un nivel de ALA en orina que es 1.6 o más veces el nivel medio en un sujeto normal (p. ej., un sujeto que no es portador de ninguna mutación asociada con una porfiria). Se describe que el sujeto presenta un nivel de ALA en plasma que es 2 o 3 veces el nivel medio en un sujeto normal. Se describe que el sujeto presenta un nivel de PBG en orina que es cuatro o más veces el nivel medio en un sujeto normal. Se describe que el sujeto presenta un nivel de PBG en plasma que es cuatro o más veces el nivel medio en un sujeto normal.
Se describe que el método es eficaz para reducir el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., ALA y/o PBG. Se describe que el método es eficaz para producir una reducción predeterminada en el nivel elevado de la porfirina o el precursor de la porfirina, p. ej., ALA o PBG. Se describe que la reducción predeterminada es una reducción de al menos un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%. Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que es eficaz para prevenir o mejorar los síntomas, p. ej., el dolor o ataques recurrentes.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que corresponde a 1, 2, 3 o más desviaciones estándar, donde la desviación estándar se determina en función de los valores de una muestra de referencia, p. ej., una muestra de referencia según se describe en la presente.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que modifica el nivel de la porfirina o el precursor de la porfirina hasta un nivel que es inferior a, o hasta un nivel que es inferior o igual a, un valor de referencia (p. ej., un valor de referencia según se describe en la presente).
Se describe que el sujeto que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos sufre dolor, p. ej., dolor crónico. Se describe que el sujeto padece o corre el riesgo de desarrollar una porfiria, p. ej., una porfiria hepática aguda, p. ej., AIP. Se describe que el método es eficaz para tratar el dolor, p. ej., mediante la reducción de la intensidad del dolor o curando el dolor. Se describe que el método es eficaz para reducir o prevenir daños nerviosos.
Se describe que el sujeto que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente
(a) presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG y (b) sufre dolor, p. ej., dolor crónico. En algunas realizaciones, el método es eficaz para reducir un nivel elevado de ALA y/o PBG y/o para tratar el dolor, p. ej., mediante la reducción de la intensidad del dolor o curando el dolor.
Se describe que el sujeto es un mamífero que sirve como modelo para un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1.
Se describe que el sujeto es un animal que sirve como modelo para una porfiria (p. ej., un animal modificado genéticamente con una o más mutaciones). Se describe que la porfiria es AIP y el sujeto es un modelo animal de AIP. Se describe que el sujeto es un ratón modificado genéticamente que es deficiente en porfobilinógenodesaminasa tal como, por ejemplo, el ratón descrito en Lindberg et al., Nature Genetics, 12:195-199, 1996, o el ratón R167Q homozigótico descrito en Yasuda, M., Yu, C. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D. y Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype (resumen de la presentación del 14 de octubre de 2011 en el Congreso American Society of Human Genetics; Programa N.o 1308F; al cual se accedió en línea el 4 de abril de 2012 en ichg2011.org/cgibin/showdetail.pl?absno=21167); estas dos referencias se incorporan a la presente en su totalidad. Se han generado varios modelos de activación para mutaciones que provocan AIP dominante homozigótica en seres humanos. Las mutaciones empleadas incluyen, p. ej., R167Q, R173Q y R173W en la PBG-desaminasa. Los casos homozigóticos viables incluyeron R167Q/R176Q y R167Q/R173Q, los cuales presentan niveles de ALA y PBG constitutivamente elevados análogos a los del genotipo en AIP dominante homozigótica en seres humanos; un modelo de ratón de AIP homozigótica variable de este tipo puede ser el sujeto.
Se describe que un sujeto que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente (p. ej., un paciente o sujeto humano) corre el riesgo de desarrollar, o se le ha diagnosticado, un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1, p. ej., una porfiria. Se describe que el sujeto es un sujeto que ha padecido uno o más ataques agudos de uno o más síntomas porfíricos. Se describe que el sujeto es un sujeto que ha padecido crónicamente uno o más síntomas de porfiria (p. ej., dolor, p. ej., dolor neuropático y/o una neuropatía, p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que el sujeto es portador de una alteración genética (p. ej., una mutación) según se describe en la presente, pero por lo demás no presenta síntomas. Se describe que el sujeto ha sido tratado previamente con un producto de tipo hemo (p. ej., hemina, arginato de hemo o albúmina que contiene hemo), según se describe en la presente.
Se describe que un sujeto (p. ej., un sujeto con una porfiria tal como, p. ej., AIP) que se ha de tratar de acuerdo con los métodos descritos en la presente ha experimentado recientemente o está experimentando actualmente un pródromo. Se describe que se administra al sujeto un tratamiento combinado, p. ej., un ARNi según se describe en la presente y uno o más tratamientos adicionales que se sabe que son eficaces contra la porfiria (p. ej., glucosa y/o un producto de tipo hemo tal como la hemina, según se describe en la presente) o sus síntomas asociados.
Se describe que un ARNi según se describe en la presente se administra combinado con glucosa o dextrosa. Por ejemplo, se puede proporcionar dextrosa al 10-20% en solución salina normal por vía intravenosa. Normalmente, cuando se administra glucosa, se administran al menos 300 g de glucosa al 10% por vía intravenosa diariamente. El ARNi (p. ej., un ARNi en una formulación LNP) también se puede administrar por vía intravenosa como parte de la misma infusión que se utiliza para administrar la glucosa o dextrosa, o como una infusión separada que se administra antes, después o de forma simultánea a la administración de la glucosa o dextrosa. Se describe que el ARNi se administra mediante una vía de administración diferente (p. ej., subcutáneamente). Se describe que el ARNi se administra combinado con nutrición parenteral total. El ARNi se puede administrar antes, después o de forma simultánea con la administración de nutrición parenteral total.
Se describe que el ARNi se administra combinado con un producto de tipo hemo (p. ej., hemina, arginato de hemo o albúmina que contiene hemo). Se describe que el ARNi se administra combinado con un producto de tipo hemo y glucosa, un producto de tipo hemo y dextrosa o un producto de tipo hemo y nutrición parenteral total.
Un "pródromo", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier síntoma que el sujeto individual haya experimentado previamente justo antes de desarrollar un ataque agudo. Los síntomas típicos de un pródromo incluyen, p. ej., dolor abdominal, náusea, cefaleas, síntomas psicológicos (p. ej., ansiedad), inquietud y/o insomnio. Se describe que el sujeto experimenta dolor (p. ej., dolor abdominal y/o una cefalea) durante el pródromo. Se describe que el sujeto experimenta náusea durante el pródromo. Se describe que el sujeto experimenta síntomas psicológicos (p. ej., ansiedad) durante el pródromo. Se describe que el sujeto se vuelve inquieto y/o padece insomnio durante el pródromo.
Un "ataque" agudo de porfiria implica el inicio de uno o más síntomas de porfiria, normalmente en un paciente que es portador de una mutación asociada con la porfiria (p. ej., una mutación en un gen que codifica una enzima de la vía de las porfirinas).
Se describe que la administración de un ARNi de ALAS1 provoca una reducción del nivel de una o más porfirinas o precursores de porfirinas, según se describe la presente (p. ej., ALA y/o PBG). La reducción se puede medir con relación a cualquier valor de referencia o control adecuado. Por ejemplo, la reducción del nivel de una o más porfirinas o precursores de porfirinas se puede establecer en un sujeto individual, p. ej., como una reducción de al menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o más en comparación con el nivel previo al tratamiento (p. ej., inmediatamente antes del tratamiento). La reducción del nivel de un precursor de una porfirina, una porfirina o un metabolito de una porfirina se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el nivel de PBG y/o ALA en orina o plasma se puede evaluar utilizando la prueba de Watson-Schwartz, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas. Remítase,
p. ej., a Thunell (1993).
Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir el nivel de ALA y/o PBG en el sujeto. El nivel de ALA o PBG en el sujeto se puede evaluar, p. ej., basándose en el nivel absoluto de ALA o PBG, o basándose en el nivel relativo de ALA o PBG (p. ej., relativo respecto al nivel de otra proteína o compuesto, p. ej., el nivel de creatinina) en una muestra del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de orina. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de plasma.
Se describe que un ARNi que tiene ALAS1 como diana se administra combinado con uno o más tratamientos adicionales, p. ej., otro tratamiento que se sabe que es eficaz para tratar la porfiria o síntomas de la porfirina. Por ejemplo, el otro tratamiento puede ser glucosa (p. ej., glucosa IV) o un producto de tipo hemo (p. ej., hemina, arginato de hemo o albúmina que contiene hemo). El o los tratamientos adicionales se pueden administrar antes, después o de forma simultánea con la administración del ARNi.
El ARNi y un agente terapéutico adicional se pueden administrar combinados en la misma composición, p. ej., por vía intravenosa, o el agente terapéutico adicional se puede administrar como parte de una composición separada o mediante otro método descrito en la presente.
Se describe que la administración de ARNi o la administración de ARNi combinado con uno o más tratamientos adicionales (p. ej., glucosa, dextrosa o similares) reduce la frecuencia de ataques agudos (p. ej., mediante la prevención de los ataques agudos de modo que ya no se produzcan, o mediante la reducción del número de ataques que se producen en un cierto periodo de tiempo, p. ej., se producen menos ataques por año). En algunas realizaciones, el ARNi se administra de acuerdo con una pauta posológica regular, p. ej., diariamente, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente.
Se describe que el ARNi se administra después de un ataque agudo de porfiria. En algunas realizaciones de este tipo, el ARNi se encuentra en una composición, p. ej., una composición que comprende una formulación lipídica, p. ej., una formulación LNP.
Se describe que el ARNi se administra durante un ataque agudo de porfiria. En algunas realizaciones de este tipo, el ARNi se encuentra en una composición, p. ej., una composición que comprende una formulación lipídica (p. ej., una formulación LNP) o una composición que comprende un conjugado de tipo GalNAc.
Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir la gravedad del ataque (p. ej., mejora uno o más signos o síntomas asociados con el ataque). Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir la duración de un ataque. Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para detener un ataque. Se describe que el ARNi se administra profilácticamente para prevenir un ataque agudo de porfiria. Se describe que el ARNi se encuentra en la forma de un conjugado de tipo GalNAc, p. ej., en una composición que comprende un conjugado de tipo GalNAc. Se describe que la administración profiláctica se lleva a cabo antes, durante o después de la exposición a un factor precipitante o la aparición de este. Se describe que el sujeto corre el riesgo de desarrollar una porfiria.
Se describe que el ARNip se administra durante un pródromo. Se describe que el pródromo se caracteriza por dolor
(p. ej., cefalea y/o dolor abdominal), náusea, síntomas psicológicos (p. ej., ansiedad), inquietud y/o insomnio.
Se describe que el ARNi se administra durante una fase particular del ciclo menstrual, p. ej., durante la fase luteínica.
Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para prevenir ataques (p. ej., ataques recurrentes que se asocian con un pródromo y/o con un factor precipitante, p. ej., con una fase particular del ciclo menstrual, p. ej., la fase luteínica). Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir la frecuencia de los ataques. En algunas realizaciones, la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir la gravedad del ataque (p. ej., mejora uno o más signos o síntomas asociados con el ataque). Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para reducir la duración de un ataque. Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para detener un ataque.
Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para prevenir o reducir la frecuencia o la intensidad del dolor, p. ej., el dolor neuropático.
Se describe que la administración de un ARNip de ALAS1 es eficaz para prevenir o reducir la frecuencia o la intensidad de una neuropatía.
Los efectos de la administración de un ARNip de ALAS1 se pueden establecer, por ejemplo, por comparación con un control adecuado. Por ejemplo, se puede establecer una reducción de la frecuencia de los ataques agudos, así como también una reducción del nivel de una o más porfirinas o precursores de porfirinas, por ejemplo, en un grupo de pacientes con AIP, como una reducción de la frecuencia en comparación con un grupo de control adecuado. Un grupo de control (p. ej., un grupo de individuos similares o el mismo grupo de individuos en un diseño cruzado) puede incluir, por ejemplo, una población no tratada, una población que ha sido tratada con un tratamiento convencional para la porfiria (p. ej., un tratamiento convencional para AIP puede incluir glucosa, hemina o ambas); una población que ha sido tratada con placebo o un ARNi sin diana, opcionalmente combinado con uno o más tratamientos convencionales para la porfiria (p. ej., glucosa, p. ej., glucosa IV) y similares.
Un sujeto "que corre el riesgo" de desarrollar una porfiria, tal como se utiliza en la presente, incluye un sujeto con un historial familiar de porfiria y/o un historial de uno o más síntomas porfíricos recurrentes o crónicos, y/o un sujeto que es portador de una alteración genética (p. ej., una mutación) en un gen que codifica una enzima de la vía biosintética del grupo hemo, y un sujeto que es portador de una alteración genética, p. ej., una mutación que se sabe que está asociada con la porfiria.
Se describe que la alteración, p. ej., la mutación hace que el individuo sea susceptible de padecer un ataque agudo
(p. ej., tras la exposición a un factor precipitante, p. ej., un fármaco, el seguimiento de un régimen u otro factor precipitante, p. ej., un factor precipitante como los que se describen en la presente). Se describe que la alteración, p. ej., la mutación, se asocia con unos niveles elevados de una porfirina o un precursor de una porfirina (p. ej., ALA y/o PBG). Se describe que la alteración, p. ej., la mutación, se asocia con dolor crónico (p. ej., dolor neuropático crónico) y/o una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva). Se describe que la alteración, p. ej., la mutación, se asocia con cambios en el EMG y/o en las velocidades de conducción nerviosa.
Se describe que la alteración es una mutación en el gen ALAS1. Se describe que la alteración es una mutación en el promotor del gen ALAS1 o en regiones en dirección 5' o dirección 3' del gen ALAS1. Se describe que la alteración es una mutación en factores de transcripción u otros genes que interaccionan con ALAS1. Se describe que la alteración es una alteración, p. ej., una mutación, en un gen que codifica una enzima en la vía biosintética del grupo hemo.
Se describe que el sujeto tiene una alteración genética según se describe en la presente (p. ej., una mutación genética que se sabe que está asociada con una porfiria). Se describe que el sujeto presenta un nivel elevado (p. ej., nivel en orina o plasma) de ALA y/o PBG. Se describe que el sujeto no presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG. Se describe que el sujeto tiene una alteración genética según se describe en la presente y presenta otros síntomas,
p. ej., dolor crónico, cambios en el EMG, cambios en la velocidad de conducción nerviosa y/u otros síntomas asociados con una porfiria. Se describe que el sujeto tiene una alteración genética pero no padece ataques agudos.
Se describe que el sujeto tiene una mutación asociada con AIP, HCP, VP o ADP.
Se describe que la porfiria es AIP. Se describe que el sujeto tiene una alteración, p. ej., al menos una mutación, en el gen de la PBG-desaminasa. En la técnica se conocen muchas mutaciones de la PBG-desaminasa, por ejemplo, según se describe en Hrdinka, M. et al. Physiological Research, 55 (Supl. 2):S119-136 (2006). Se describe que el sujeto es heterozigótico respecto a una mutación de la PBG-desaminasa. Se describe que el sujeto es homozigótico respecto a una mutación de la PBG-desaminasa. Un sujeto homozigótico puede ser portador de dos mutaciones idénticas o dos mutaciones diferentes en el gen de la PBG-desaminasa.
Se describe que la porfiria es HCP. Se describe que el sujeto tiene una alteración, p. ej., al menos una mutación, en el gen que codifica la enzima coproporfirinógeno III-oxidasa.
Se describe que la porfiria es VP. Se describe que el sujeto tiene una alteración, p. ej., al menos una mutación, en el gen que codifica la protoporfrinógeno-oxidasa.
Se describe que la porfiria es ADP, p. ej., ADP recesiva autosómica. Se describe que el sujeto tiene una alteración,
p. ej., al menos una mutación, en el gen que codifica la ALA-deshidratasa.
Los métodos de tratamiento que se proporcionan en la presente pueden servir para mejorar uno o más síntomas asociados con una porfiria, para reducir la frecuencia de los ataques asociados con la porfiria, para reducir la probabilidad de que se produzca un ataque de uno o más síntomas asociados con la porfiria tras la exposición a un factor precipitante o para reducir el riesgo de desarrollar afecciones asociadas con la porfiria (p. ej., una neuropatía
(p. ej., una neuropatía progresiva), un cáncer hepatocelular). Además, los métodos que se proporcionan en la presente pueden servir para reducir el nivel de uno o más precursores de porfirinas, porfirinas y/o productos o metabolitos relacionados con las porfirinas. El nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina se puede medir en cualquier muestra biológica tal como, p. ej., orina, sangre, heces, fluido cerebroespinal o una muestra tisular. La muestra puede estar presente dentro de un sujeto o se puede obtener o extraer a partir del sujeto. Se describe que la porfiria es AIP y se reduce el nivel de PBG y/o ALA. Se describe que el producto o metabolito de la porfirina es porfobilina, porfobilinógeno o uroporfirina. La reducción del nivel de un producto o metabolito de una porfirina se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el nivel de PBG y/o ALA en orina o plasma se puede evaluar utilizando la prueba de Watson-Schwartz, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas. Remítase, p. ej., a Thunell (1993).
Los métodos descritos en la presente también pueden servir para reducir niveles crónicamente elevados de precursores de porfirinas (p. ej. ALA y/o PBG) en sujetos que padecen una porfiria (p. ej., una porfiria hepática aguda, p. ej., AIP) o que corren el riesgo de desarrollar una porfiria. Los métodos para evaluar los niveles en plasma y orina (p. ej., niveles crónicamente elevados) de precursores de porfirinas incluyen, p. ej., HPLC-espectrometría de masas y cromatografía de intercambio iónico. Los niveles de precursores de porfirinas se pueden expresar como el nivel relativo respecto a otra proteína o compuesto, p. ej., la creatinina. Remítase, p. ej., a Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.
Un "factor precipitante", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un factor endógeno o exógeno que puede inducir un ataque agudo de uno o más síntomas asociados con una porfiria. Los factores precipitantes incluyen ayuno (u otras formas de ingesta calórica reducida o inadecuada, debido a dietas extremas, atletismo de fondo, etc.), estrés metabólico (p. ej., infecciones, cirugía, viajes aéreos internacionales y estrés psicológico), hormonas endógenas (p. ej., progesterona), fumar cigarrillos, agentes químicos exógenos liposolubles (que incluyen, p. ej., agentes químicos presentes en el humo del tabaco, ciertos fármacos recetados, disolventes orgánicos, biocidas, componentes de bebidas alcohólicas), factores endocrinos (p. ej., hormonas reproductivas (las mujeres pueden experimentar exacerbaciones durante el periodo premenstrual), estrógenos sintéticos, progesteronas, estimulantes de la ovulación y terapia de reemplazo hormonal). Remítase, por ejemplo, a Thunell (1993). Los factores precipitantes comunes incluyen fármacos que inducen el citocromo P450 y fenobarbital.
Los síntomas asociados con una porfiria pueden incluir dolor o calambres abdominales, cefaleas, efectos provocados por anomalías del sistema nervioso y sensibilidad a la luz, que provoca sarpullidos, ampollas y aparición de cicatrices en la piel (fotodermatitis). Se describe que la porfiria es AIP. Los síntomas de la AIP incluyen síntomas gastrointestinales (p. ej., dolor abdominal intenso y poco localizado, náusea/vómitos, estreñimiento, diarrea, íleo), síntomas urinarios (disuria, retención/incontinencia urinaria u orina oscura), síntomas neurológicos (p. ej., neuropatía sensorial, neuropatía motriz (p. ej., que afecta a los nervios craneales y/o que provoca debilidad en los brazos o las piernas), convulsiones, dolor neuropático, neuropatía progresiva, cefaleas, síntomas neuropsiquiátricos (p. ej., confusión mental, ansiedad, agitación, alucinación, histeria, delirio, apatía, depresión, fobias, psicosis, insomnio, somnolencia, coma), participación del sistema nervioso autonómico (que provoca, p. ej., síntomas cardiovasculares tales como taquicardia, hipertensión y/o arritmias, así como también otros síntomas tales como, p. ej., un incremento de los niveles de catecolamina en circulación, sudoración, inquietud y/o temblores), deshidratación y anomalías electrolíticas.
Se describe que se administra un ARNi que tiene ALAS1 como diana junto con (p. ej., antes, después o de forma simultánea) otro tratamiento que pueda servir para aliviar uno o más de los síntomas anteriores. Por ejemplo, el dolor abdominal se puede tratar, p. ej., con analgésicos narcóticos, las convulsiones se pueden tratar, p. ej., con medicamentos contra las convulsiones, las náuseas/vómitos se pueden tratar, p. ej., con fenotiazinas y la taquicardia/hipertensión se puede tratar, p. ej., con bloqueadores beta.
Se pretende que el término "reducir" (o "incrementar") se refiera a un cambio medible, p. ej., un cambio estadísticamente significativo. El cambio puede ser, por ejemplo, un cambio de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más (p. ej., reducción (o incremento) respecto a un valor de referencia, p. ej., una referencia en la que no se proporcione ARNi).
La divulgación se refiere además al uso de un ARNi o una composición farmacéutica de este, p. ej., para tratar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1, combinado con otros agentes farmacéuticos y/u otros métodos terapéuticos, p. ej., con agentes terapéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos tales como, por ejemplo, los que se emplean actualmente para tratar el trastorno. Se describe que el ARNi o la composición farmacéutica de este se puede administrar junto con un producto de tipo hemo (p. ej., hemina, arginato de hemo o albúmina que contiene hemo, según se describe en la presente) y/o junto con infusiones intravenosas de glucosa. En algunas realizaciones, el ARNi o la composición farmacéutica de este se utiliza profilácticamente, p. ej., para prevenir o mejorar los síntomas de un ataque anticipado de porfiria aguda. El uso profiláctico se puede hacer coincidir con la exposición o exposición anticipada del sujeto a un factor precipitante. Un factor precipitante, según se describe en la presente, puede ser cualquier factor endógeno o exógeno que se sepa que precipita un ataque agudo. Por ejemplo, la fase premenstrual es un factor precipitante endógeno y un fármaco que induce el citocromo P450 es un factor precipitante exógeno.
La cantidad eficaz para el tratamiento del trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 (p. ej., una porfiria tal como AIP) depende del tipo de trastorno que se ha de tratar, la gravedad de los síntomas, el sujeto que se esté tratando, el sexo, la edad, el estado de salud general del sujeto, la vía de administración, etc. Para cualquier caso dado, un experto en la técnica podrá determinar la "cantidad eficaz" adecuada utilizando experimentación rutinaria. La monitorización de la eficacia del tratamiento o la prevención se encuentra dentro de las competencias de un experto en la técnica y se lleva a cabo midiendo cualquiera de tales parámetros o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un ARNi que tiene ALAS1 como diana o una composición farmacéutica de este, la expresión "eficaz contra" un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1 indica que la administración de un modo clínicamente adecuado provoca un efecto beneficioso, p. ej., para un paciente individual
o para al menos una fracción de los pacientes, p. ej., una fracción estadísticamente significativa de los pacientes. Los efectos beneficiosos incluyen, p. ej., la prevención o la reducción de los síntomas u otros efectos. Por ejemplo, los efectos beneficiosos incluyen, p. ej., una mejora (p. ej., reducción de la gravedad o la frecuencia) de los síntomas, una reducción de la gravedad o la frecuencia de los ataques, un menor riesgo de desarrollar una enfermedad asociada (p. ej., una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva), cáncer hepatocelular), una capacidad mejorada para tolerar un factor precipitante, una mejora en la calidad de vida, una reducción de la expresión de ALAS1, una reducción del nivel (p. ej., el nivel en plasma u orina) de una porfirina o un precursor de una porfirina (p. ej., ALA y/o PBG) u otro efecto que sea reconocido en general como positivo por los doctores médicos familiares con el tratamiento del tipo particular de trastorno.
Un efecto del tratamiento o la prevención se pone de manifiesto cuando se produce una mejora, p. ej., una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado patológico, o porque no empeoran o no se desarrollan síntomas que de otro modo cabría anticipar. A modo de ejemplo, un cambio favorable de al menos un 10% en un parámetro medible de la enfermedad, p. ej., de al menos un 20%, 30%, 40%, 50% o más, puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco de ARNi determinado o una formulación de este fármaco también se puede juzgar utilizando un modelo animal experimental para la enfermedad determinada según se conoce en la técnica. Cuando se utiliza un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se pone de manifiesto cuando se observa una reducción estadísticamente significativa de un marcador (p. ej., ALA o PBG en plasma u orina) o síntoma.
Se puede administrar una cantidad terapéutica de ARNi a los pacientes. La cantidad terapéutica puede ser, p. ej., de 0.05-50 mg/kg. Por ejemplo, la cantidad terapéutica puede ser de 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0 o 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/kg de ARNbc.
Se describe que el ARNi se formula como una formulación lipídica, p. ej., una formulación LNP según se describe en la presente. Se describe que la cantidad terapéutica es de 0.05-5 mg/kg, p. ej., de 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6,
0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 o 5.0 mg/kg de ARNbc. Se describe que la formulación lipídica, p. ej., una formulación LNP, se administra por vía intravenosa.
Se describe que el ARNi se administra mediante una infusión intravenosa durante un periodo de tiempo tal como durante un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos.
Se describe que el ARNi se encuentra en forma de un conjugado de tipo GalNAc según se describe en la presente. Se describe que la cantidad terapéutica es de 0.5-50 mg, p. ej., de 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/kg de ARNbc. Se describe que el conjugado de tipo GalNAc se administra por vía subcutánea.
Se describe que la administración se repite, por ejemplo, de forma regular, tal como diariamente, cada dos semanas durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración cada dos semanas durante tres meses, la administración se puede repetir una vez al mes durante seis meses o un año o más.
Se describe que el agente de ARNi se administra en dos o más dosis. Se describe que el número o la cantidad de dosis posteriores depende de la obtención del efecto deseado, p. ej., la supresión de un gen ALAS, la reducción del nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina (p. ej., ALA y/o PBG), o la obtención de un efecto terapéutico o profiláctico, p. ej., la reducción o la prevención de uno o más síntomas asociados con una porfiria (p. ej., dolor, p. ej., dolor neuropático) y/o la prevención de ataques o la reducción de la frecuencia y/o la gravedad de los ataques asociados con una porfiria.
Se describe que el agente de ARNi se administra siguiendo un programa. Por ejemplo, el agente de ARNi se puede administrar una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana o cinco veces por semana. Se describe que el programa implica administraciones espaciadas de forma regular, p. ej., cada hora, cada cuatro horas, cada seis horas, cada ocho horas, cada doce horas, diariamente, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, semanalmente, una vez cada dos semanas o mensualmente. Se describe que el agente de ARNi se administra semanalmente o cada dos semanas para conseguir un efecto deseado, p. ej., para reducir el nivel de ALA y/o PBG, para reducir el dolor y/o para prevenir ataques agudos.
Se describe que el programa implica administraciones poco espaciadas seguidas por un periodo de tiempo más prolongado durante el cual no se administra el agente. Por ejemplo, el programa puede implicar un conjunto inicial de dosis que se administran en un periodo de tiempo relativamente corto (p. ej., aproximadamente cada 6 horas, aproximadamente cada 12 horas, aproximadamente cada 24 horas, aproximadamente cada 48 horas o aproximadamente cada 72 horas) seguido de un periodo de tiempo más prolongado (p. ej., aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas o aproximadamente 8 semanas) durante el cual no se administra el agente de ARNi. Se describe que el agente de ARNi se administra inicialmente cada hora y posteriormente se administra en un intervalo más prolongado (p. ej., diariamente, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente). Se describe que el agente de ARNi se administra inicialmente de forma diaria y posteriormente se administra en un intervalo más prolongado (p. ej., semanalmente, cada dos semanas o mensualmente). Se describe que el intervalo más prolongado aumenta con el tiempo o se determina en función de la obtención del efecto deseado. Se describe que el agente de ARNi se administra una vez al día durante un ataque agudo y a continuación se administran dosis semanalmente empezando en el octavo día de administración. Se describe que el agente de ARNi se administra una vez cada dos días durante una primera semana y a continuación se administran dosis semanalmente empezando en el octavo día de administración.
Se describe que el agente de ARNi se administra para prevenir o reducir la gravedad o la frecuencia de ataques recurrentes, p. ej., ataques cíclicos asociados con un factor precipitante. En algunas realizaciones, el factor precipitante es el ciclo menstrual. Se describe que el ARNi se administra de forma repetida, p. ej., en intervalos regulares para prevenir o reducir la gravedad o la frecuencia de ataques recurrentes, p. ej., ataques cíclicos asociados con un factor precipitante, p. ej., el ciclo menstrual, p. ej., una frase particular del ciclo menstrual, p. ej., la fase luteínica. En algunas realizaciones, el ARNi se administra durante una fase particular del ciclo menstrual o en función de los niveles hormonales del paciente que se esté tratando (p. ej., en función de los niveles hormonales que se asocian con una fase particular del ciclo menstrual). Se describe que el ARNi se administra en uno o más días particulares del ciclo menstrual, p. ej., en el día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o en el día 28 (o en un día posterior para sujetos que tienen un ciclo menstrual más prolongado). Se describe que el ARNi se administra durante la fase luteínica, p. ej., en uno o más días entre los días 14-28 del ciclo menstrual (o posteriormente en sujetos que tienen un ciclo menstrual de más de 28 días). Se describe que se evalúa la ovulación del sujeto (p. ej., utilizando una prueba en sangre u orina que detecta una hormona asociada con la ovulación, p. ej., LH) y el ARNi se administra en un intervalo predeterminado después de la ovulación. Se describe que el ARNi se administra inmediatamente después de la ovulación. En algunas realizaciones, el ARNi se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 días después de la ovulación. Cualquiera de estos programas se puede repetir opcionalmente durante una o más iteraciones. El número de iteraciones puede depender de la obtención del efecto deseado, p. ej., la supresión de un gen ALAS1 y/o la obtención de un efecto terapéutico o profiláctico, p. ej., reducir o prevenir uno o más síntomas asociados con una porfiria, para reducir la frecuencia de los ataques asociados con una porfiria.
Se describe que se administra una dosis inicial del agente de ARNi y se evalúa el nivel de ALA o PBG, p. ej., 1-48 horas, p. ej., 2, 4, 8, 12 o 24 horas después de la administración de la dosis inicial. Se describe que si el nivel de ALA y/o PBG se ha reducido (p. ej. hasta conseguir una reducción predeterminada, p. ej., una normalización) y/o si los síntomas asociados con una porfiria (p. ej., dolor) han mejorado (p. ej., de manera que el paciente no presente síntomas), no se administra ninguna dosis adicional, mientras que si el nivel de ALA y/o PBG no se ha reducido (p. ej., no ha alcanzado una reducción predeterminada, p. ej., no se ha normalizado), se administra una dosis adicional de ALA o PBG. Se describe que la dosis adicional se administra 12, 24, 36, 48, 60 o 72 horas después de la dosis inicial. Se describe que si la dosis inicial no es eficaz para reducir el nivel de ALA y/o PBG, la dosis adicional se modifica, p. ej., se incrementa para alcanzar una reducción deseada (p. ej., una reducción predeterminada, p. ej., una normalización) de los niveles de ALA o PBG.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción de al menos un 10%, 20%, 30%, 40% o 50%. Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que es eficaz para prevenir o mejorar los síntomas, p. ej., el dolor, síntomas prodrómicos o ataques recurrentes.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que corresponde a al menos 1, 2, 3 o más desviaciones estándar, donde la desviación estándar se determina en función de los valores de una muestra de referencia, p. ej., una muestra de referencia según se describe en la presente.
Se describe que la reducción predeterminada es una reducción que modifica el nivel de la porfirina o el precursor de la porfirina hasta un nivel que es inferior a, o hasta un nivel que es inferior o igual a, un valor de referencia (p. ej., un valor de referencia según se describe en la presente).
Una "normalización" de los niveles de ALA o PBG (o un nivel "normal" o "normalizado"), tal como se utiliza en la presente, se refiere a un nivel (p. ej., un nivel en orina y/o plasma) de ALA o PBG, o de ambos, que se encuentra dentro del intervalo esperado para un individuo sano, un individuo que no presenta síntomas (p. ej., un individuo que no experimenta dolor y/o no sufre ninguna neuropatía) o un individuo que no es portador de ninguna mutación asociada con una porfiria. Por ejemplo, se describe que un nivel normalizado se encuentra dentro de dos desviaciones estándar de la media normal. Se describe que un nivel normalizado se encuentra dentro de los límites de referencia normales, p. ej., dentro del intervalo de confianza del 95% para una muestra de control adecuada, p. ej., una muestra de individuos sanos o individuos que no son portadores de ninguna mutación génica asociada con una porfiria. Se describe que el nivel de ALA y/o PBG del sujeto (p. ej., el nivel de ALA y/o PBG en orina y/o plasma) se monitoriza por intervalos y se administra una dosis adicional del agente de ARNi cuando el nivel aumenta por encima del valor de referencia.
La administración del ARNi puede reducir los niveles proteicos o de ARNm de ALAS1, p. ej., en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80 % o al menos un 90% o más. La administración del ARNi puede reducir los niveles de productos asociados con la expresión del gen ALAS1, p. ej., los niveles de una o más porfirinas o precursores de porfirinas (p. ej., el nivel de ALA y/o PBG). La administración del agente de ARNi también puede inhibir o prevenir el aumento de los niveles proteicos o de ARNm de ALAS1 durante un ataque agudo de AIP.
Antes de la administración de una dosis completa del ARNi, se puede administrar a los pacientes una dosis más pequeña, tal como una dosis de infusión de un 5%, y monitorizar a los pacientes en busca de efectos adversos, tales como una reacción alérgica, o de una presión sanguínea o niveles lipídicos elevados. En otro ejemplo, se puede monitorizar al paciente en busca de efectos no deseados.
Métodos para modular la expresión de un gen ALAS1
En otro aspecto más, la divulgación proporciona un método para modular (p. ej., inhibir o activar) la expresión de un gen ALAS1, p. ej., en una célula o en un sujeto. Se describe que la célula se encuentra ex vivo, in vitro o in vivo. Se describe que la célula es una célula eritroide o un hepatocito. Se describe que la célula se encuentra en un sujeto (p. ej., un mamífero tal como, por ejemplo, un ser humano). Se describe que el sujeto (p. ej., el ser humano) corre el riesgo de padecer o ha sido diagnosticado con una enfermedad relacionada con la expresión de ALAS1, según se describe en la presente.
Se describe que el método incluye poner en contacto la célula con un ARNi según se describe en la presente, en una cantidad eficaz para reducir la expresión de un gen ALAS1 en la célula. La expresión "poner en contacto", tal como se utiliza en la presente, incluye poner en contacto directamente una célula, así como también poner en contacto indirectamente una célula. Por ejemplo, una célula de un sujeto (p. ej., una célula eritroide o una célula hepática tal como un hepatocito) se puede poner en contacto cuando se administra una composición que comprende un ARNi (p. ej., por vía intravenosa o por vía subcutánea) al sujeto.
La expresión de un gen ALAS1 se puede evaluar en función del nivel de expresión de un ARNm de ALAS1, una proteína de ALAS1 o el nivel de un parámetro relacionado funcionalmente con el nivel de expresión de un gen ALAS1 (p. ej., el nivel de una porfirina o la incidencia o gravedad de un síntoma relacionado con una porfiria). Se describe que la expresión de ALAS1 se mide al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95%. Se describe que el ARNi presenta una CI50 comprendida en el intervalo de 0.001-0.01 nM, 0.001-0.10 nM, 0.001-1.0 nM, 0.001-10 nM, 0.01-0.05 nM, 0.01-0.50 nM, 0.02-0.60 nM, 0.01-1.0 nM, 0.01-1.5 nM, 0.01-10 nM. El valor de CI50 se puede normalizar respecto a un valor de control adecuado, p. ej., la CI50 de un ARNi que no tenga diana.
Se describe que el método incluye introducir en la célula un ARNi según se describe en la presente y mantener la célula durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen ALAS1, de este modo se inhibe la expresión del gen ALAS1 en la célula.
Se describe que el método incluye administrar una composición descrita en la presente, p. ej., una composición que comprende un ARNi que tiene ALAS1 como diana, al mamífero de modo que la expresión del gen ALAS1 diana se reduzca, por ejemplo, durante un periodo prolongado, p. ej., al menos dos, tres, cuatro días o más, p. ej., una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas o más. En algunas realizaciones, la reducción de la expresión de ALAS1 se detecta en un periodo de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas o 24 horas desde la primera administración.
Se describe que el método incluye administrar una composición según se describe en la presente a un mamífero de modo que la expresión del gen ALAS1 se incremente, p. ej., al menos un 10% en comparación con un animal no tratado. Se describe que la activación de ALAS1 tiene lugar durante un periodo prolongado, p. ej., al menos dos, tres, cuatro días o más, p. ej., una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas o más. Sin pretender vincularse a ninguna teoría, un ARNi puede activar la expresión de ALAS1 estabilizando el transcrito de ARNm de ALAS1, interaccionando con un promotor en el genoma y/o inhibiendo un inhibidor de la expresión de ALAS1.
Los ARNi útiles para los métodos y las composiciones que se exponen en la divulgación tienen específicamente como diana ARN (primarios o procesados) de un gen ALAS1. Las composiciones y los métodos para inhibir la expresión de un gen ALAS1 utilizando ARNi se pueden preparar y aplicar según se describe en otras partes de la presente.
Se describe que el método incluye administrar una composición que contiene un ARNi, donde el ARNi incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria respecto a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen ALAS1 del mamífero que se ha de tratar. Cuando el organismo que se ha de tratar es un mamífero tal como un ser humano, la composición se puede administrar mediante cualquier medio conocido en la técnica, que incluye, sin carácter limitante, la vía oral, intraperitoneal o parenteral, incluida la administración intracraneal (p. ej., intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, a través de las vías respiratorias (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluida la bucal y sublingual).
Se describe que las composiciones se administran mediante una infusión o inyección intravenosa. En algunas realizaciones de este tipo, las composiciones comprenden un ARNip formulado en un líquido (p. ej., una formulación LNP tal como una formulación LNP11) para una infusión intravenosa. En realizaciones particulares, tales composiciones se pueden utilizar para tratar ataques agudos de porfiria y/o para la profilaxis (p. ej., para reducir la gravedad o la frecuencia de los ataques).
Se describe que las composiciones se administran por vía subcutánea. En algunas realizaciones de este tipo, las composiciones comprenden un ARNi conjugado con un ligando de tipo GalNAc. Se describe que tales composiciones se pueden utilizar para tratar ataques agudos de porfiria o para la profilaxis (p. ej., para reducir la gravedad o la frecuencia de los ataques).
Métodos para reducir el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para reducir el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina, p. ej., en una célula o en un sujeto.
Se describe que la célula se encuentra ex vivo, in vitro o in vivo. Se describe que la célula es una célula eritroide o un hepatocito. Se describe que la célula es un hepatocito. En algunas realizaciones, la célula se encuentra en un sujeto (p. ej., un mamífero tal como, por ejemplo, un ser humano).
Se describe que el sujeto (p. ej., el ser humano) corre el riesgo de padecer o ha sido diagnosticado con una porfiria, según se describe en la presente. Se describe que el método es eficaz para tratar una porfiria según se describe en la presente (p. ej., mejorando uno o más síntomas asociados con una porfiria, reduciendo la frecuencia de los ataques asociados con una porfiria, reduciendo la probabilidad de que se produzca un ataque de uno o más síntomas asociados con una porfiria tras la exposición a un factor precipitante o reduciendo el riesgo de desarrollar afecciones asociadas con una porfiria (p. ej., una neuropatía (p. ej., una neuropatía progresiva), un cáncer hepatocelular). Se describe que el método incluye poner en contacto la célula con un ARNi, según se describe en la presente, en una cantidad suficiente para reducir el nivel de la porfirina o del precursor de la porfirina (p. ej., ALA o PBG) en la célula, o en otra célula o grupo de células relacionadas, o en el sujeto. La expresión "poner en contacto", tal como se utiliza en la presente, incluye poner en contacto directamente una célula, así como también poner en contacto indirectamente una célula. Por ejemplo, una célula de un sujeto (p. ej., una célula eritroide o una célula hepática tal como un hepatocito) se puede poner en contacto cuando se administra una composición que comprende un ARNi (p. ej., por vía intravenosa o por vía subcutánea) al sujeto. La expresión "otra célula o grupo de células relacionadas", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquier célula o grupo de células en las que el nivel de la porfirina o el precursor de la porfirina se reduce como resultado de la puesta en contacto. Por ejemplo, la célula puede formar parte de un tejido presente en un sujeto (p. ej., una célula hepática presente en un sujeto) y el hecho de poner en contacto la célula del sujeto (p. ej., poner en contacto una o más células hepáticas presentes en un sujeto) con el ARNi puede provocar una reducción del nivel de la porfirina o del precursor de la porfirina en otra célula o grupo de células relacionadas (p. ej., células nerviosas del sujeto) o en un tejido o fluido del sujeto (p. ej., en la orina, sangre, plasma o fluido cerebroespinal del sujeto).
Se describe que la porfirina o el precursor de porfirina se selecciona del grupo constituido por ácido δaminolevulínico (ALA), porfopilinógeno (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinógeno III, coproporfirinógeno III, protoporfrinógeno IX y protoporfirina IX. En algunas realizaciones, el precursor de porfirina es ALA. Se describe que el precursor de porfirina es PBG. En algunas realizaciones, el método reduce el nivel de ALA y PBG. El nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina se puede medir según se describe en la presente y se conoce en la técnica.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que interpreta habitualmente un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Síntesis de ARNip
Origen de los reactivos
Cuando en la presente no se proporcione específicamente el origen de un reactivo, tal reactivo se podrá obtener a partir de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con una calidad/pureza estándar para su aplicación en biología molecular.
Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador AKTAoligopilot. Para la síntesis de los oligonucleótidos, se utilizaron soportes sólidos de vidrio con poros controlados que se pueden adquirir de proveedores comerciales (dT-CPG, 500 Ǻ, Prime Synthesis) y fosforamiditos de ARN con grupos protectores estándar, 5’-O-dimetoxitritil-N6benzoil-2’-t-butildimetilsililadenosin-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito, 5’-O-dimetoxitritil-N4-acetil-2’-tbutildimetilsililcitidin-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito, 5’-O-dimetoxitritil-N2-isobutil-2’-tbutildimetilsililguanosin-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito y 5’-O-dimetoxitritil-2’-t-butildimetilsililuridin-3’-ON,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito (Pierce Nucleic Acids Technologies). Los fosforamiditos con la sustitución 2’-F, 5’-O-dimetoxitritil-N4-acetil-2’-flurocitidin-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito y 5’-O-dimetoxitritil-2’flurouridin-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidito, se adquieren de Promega. Todos los fosforamiditos se utilizan con una concentración de 0.2 M en acetonitrilo (CH3CN) excepto para la guanosina, que se utiliza con una concentración de 0.2 M en THF al 10%/ACN (v/v). Se utiliza un tiempo de acoplamiento/reciclaje de 16 minutos. El activador es 5-etiltiotetrazol (0.75 M, American International Chemicals); para la oxidación de PO se utiliza yodo/agua/piridina y para la oxidación de PS se utiliza PADS (2%) en 2,6-lutidina/ACN (1:1 v/v).
Las hebras conjugadas con el ligando 3' se sintetizan utilizando un soporte sólido que contiene el ligando correspondiente. Por ejemplo, la introducción de una unidad de colesterol en la secuencia se lleva a cabo partiendo de un fosforamidito de hidroxiprolinol-colesterol. El colesterol se une a trans-4-hidroxiprolinol mediante un conector de tipo 6-aminohexanoato para obtener un resto de hidroxiprolinol-colesterol. Los ARNi marcados con Cy-3 y Cy-5.5 (fluoróforo) en el extremo 5' se sintetizan a partir del fosforamidito Quasar-570 (Cy-3) correspondiente, que se adquiere de Biosearch Technologies. La conjugación de los ligandos en el extremo 5' y/o en una posición interna se consigue utilizando bloques estructurales de fosforamidito-ligando protegidos adecuadamente. Un acoplamiento prolongado de 15 min de una solución de fosforamidito 0.1 M en CH3CN anhidro en presencia del activador 5(etiltio)-1H-tetrazol a un oligonucleótido unido a un soporte sólido. La oxidación del fosfito entre nucleótidos para obtener el fosfato se lleva a cabo utilizando yodo-agua estándar según se ha descrito (1) o mediante el tratamiento con hidroperóxido de tert-butilo/acetonitrilo/agua (10: 87: 3) con un tiempo de espera para la oxidación de 10 min para el oligonucleótido conjugado. El fosforotioato se introduce mediante la oxidación del fosfito para obtener el fosforotioato utilizando un reactivo de transferencia de azufre tal como DDTT (se adquiere de AM Chemicals), PADS y/o el reactivo de Beaucage. El fosforamidito de colesterol se sintetiza dentro de la empresa y se utiliza con una concentración de 0.1 M en diclorometano. El tiempo de acoplamiento para el fosforamidito de colesterol es de 16 minutos.
Desprotección I (desprotección de bases nucleotídicas)
Tras completar la síntesis, el soporte se transfiere a una botella de vidrio de 100 mL (VWR). El oligonucleótido se escinde del soporte con la desprotección simultánea de la base y los grupos fosfato utilizando 80 mL de una mezcla de amoniaco en etanol [amoniaco: etanol (3:1)] durante 6.5 h a 55 oC. La botella se enfría brevemente en hielo y a
5 continuación la mezcla de amoniaco en etanol se filtra en una nueva botella de 250 mL. El CPG se lava con 2 x 40 mL porciones de etanol/agua (1:1 v/v). A continuación, el volumen de la mezcla se reduce hasta ~ 30 mL en un rotavapor. A continuación, la mezcla se congela en nieve carbónica y se seca al vacío en un aparato SpeedVac.
Desprotección II (eliminación del grupo 2’-TBDMS)
El residuo seco se vuelve a suspender en 26 mL de trietilamina, trihidrofluoruro de trietilamina (TEA•3HF) o piridina
10 HF y DMSO (3:4:6) y se calienta a 60 oC durante 90 minutos para eliminar los grupos tert-butildimetilsililo (TBDMS) de la posición 2’. A continuación, la reacción se desactiva con 50 mL de acetato de sodio 20 mM y el pH se ajusta hasta 6.5. El oligonucleótido se conserva en un congelador hasta su purificación.
Análisis
Los oligonucleótidos se analizan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) antes de su purificación y 15 la selección del tampón y la columna depende de la naturaleza de la secuencia y/o del ligando conjugado.
Purificación por HPLC
Los oligonucleótidos conjugados con ligandos se purifican mediante HPLC preparativa de fase inversa. Los oligonucleótidos no conjugados se purifican mediante HPLC de intercambio aniónico o en una columna de gel TSK empaquetada dentro de la empresa. Los tampones son fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en CH3CN al 10% (tampón
20 A) y fosfato de sodio 20 mM (pH 8.5) en CH3CN al 10%, NaBr 1 M (tampón B). Las fracciones que contienen los oligonucleótidos de longitud completa se agrupan, se eliminan las sales y se liofilizan. Aproximadamente 0.15 DO de los oligonucleótidos, una vez que se han eliminado las sales, se diluyen en agua hasta obtener 150 µL y a continuación se pipetean en viales especiales para el análisis de CGE y LC/MS. A continuación, los compuestos se analizan mediante LC-ESMS y CGE.
25 Preparación de los ARNip
Para la preparación general de los ARNip, se calientan cantidades equimolares de la hebra sentido y antisentido en 1xPBS a 95 °C durante 5 min y se enfrían lentamente hasta temperatura ambiente. La integridad del dúplex se confirma mediante análisis de HPLC.
Más adelante se representan las secuencias de los ácidos nucleicos utilizando la nomenclatura estándar y, 30 específicamente, las abreviaciones de la Tabla 1.
Tabla 1: Abreviaciones de los monómeros nucleotídicos que se utilizan en la representación de las secuencias de los ácidos nucleicos. Se sobreentenderá que estos monómeros, cuando estén presentes en un oligonucleótido, estarán unidos mutuamente mediante enlaces 5'-3'-fosfodiéster.
Abreviación
Nucleótido(s)
A
Adenosin-3’-fosfato
Ab
beta-L-adenosin-3'-fosfato
Abs
beta-L-adenosin-3'-fosforotioato
Af
2’-fluoroadenosin-3’-fosfato
Afs
2’-fluoroadenosin-3’-fosforotioato
As
adenosin-3’-fosforotioato
C
citidin-3’-fosfato
Cb
beta-L-citidin-3'-fosfato
Cbs
beta-L-citidin-3'-fosforotioato
Cf
2’-fluorocitidin-3’-fosfato
Cfs
2’-fluorocitidin-3’-fosforotioato
(Chd)
2'-O-hexadecilcitidin-3'-fosfato
(Chds)
2'-O-hexadecilcitidin-3'-fosforotioato
Cs
citidin-3’-fosforotioato
G
guanosin-3’-fosfato
Gb
beta-L-guanosin-3'-fosfato
Gbs
beta-L-guanosin-3'-fosforotioato
Gf
2’-fluoroguanosin-3’-fosfato
Gfs
2’-fluoroguanosin-3’-fosforotioato
Gs
guanosin-3’-fosforotioato
T
5’-metiluridin-3’-fosfato
Tb
beta-L-timidin-3'-fosfato
Tbs
beta-L-timidin-3'-fosforotioato
Tf
2’-fluoro-5-metiluridin-3’-fosfato
Tfs
2’-fluoro-5-metiluridin-3’-fosforotioato
Ts
5-metiluridin-3’-fosforotioato
U
uridin-3’-fosfato
Ub
beta-L-uridin-3'-fosfato
Ubs
beta-L-uridin-3'-fosforotioato
Uf
2’-fluorouridin-3’-fosfato
Ufs
2’-fluorouridin -3’-fosforotioato
(Uhd)
2'-O-hexadeciluridin-3'-fosfato
(Uhds)
2'-O-hexadeciluridin-3'-fosforotioato
Us
uridin-3’-fosforotioato
N
cualquier nucleótido (G, A, C, T o U)
a
2'-O-metiladenosin-3’-fosfato
as
2'-O-metiladenosin-3’-fosforotioato
c
2'-O-metilcitidin-3’-fosfato
cs
2'-O-metilcitidin-3’-fosforotioato
g
2'-O-metilguanosin-3’-fosfato
gs
2'-O-metilguanosin-3’-fosforotioato
t
2’-O-metil-5-metiluridin-3’-fosfato
ts
2’-O-metil-5-metiluridin-3’-fosforotioato
u
2'-O-metiluridin-3’-fosfato
us
2'-O-metiluridin-3’-fosforotioato
dA
2'-desoxiadenosin-3'-fosfato
dAs
2'-desoxiadenosin-3'-fosforotioato
dC
2'-desoxicitidin-3'-fosfato
dCs
2'-desoxicitidin-3'-fosforotioato
dG
2'-desoxiguanosin-3'-fosfato
dGs
2'-desoxiguanosin-3'-fosforotioato
dT
2'-desoxitimidina
dTs
2'-desoxitimidin-3'-fosforotioato
dU
2'-desoxiuridina
s
conector de tipo fosforotioato
L961
N-[tris(GalNAc-alquil)amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol Hyp(GalNAc-quilo)3
(Aeo)
2’-O-metoxietiladenosin-3’-fosfato
(Aeos)
2’-O-metoxietiladenosin-3’-fosforotioato
(Geo)
2’-O-metoxietilguanosin-3’-fosfato
(Geos)
2’-O-metoxietilguanosin-3’-fosforotioato
(Teo)
2’-O-metoxietil-5-metiluridin-3’-fosfato
(Teos)
2’-O-metoxietil-5-metiluridin-3’-fosforotioato
(m5Ceo)
2’-O-metoxietil-5-metilcitidin-3’-fosfato
(m5Ceos)
2’-O-metoxietil-5-metilcitidin-3’-fosforotioato
1La estructura química de L96 es la siguiente:
Ejemplo 2. Diseño y síntesis de ARNip de ALAS1 Métodos experimentales
Bioinformática
Transcritos
Se llevó a cabo un diseño de ARNip para identificar ARNip que tuvieran como diana transcritos de ALAS1 humanos, de rhesus (Macaca mulatta), ratón y rata registrados en la base de datos de genes del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). El diseño utilizó los siguientes transcritos de la colección de RefSeq del NCBI: Humano -NM_000688.4 (remítase a la FIG.3), NM_199166.1; de rhesus -XM_001090440.2, XM_001090675.2; de ratón -NM_020559.2; de rata -NM_024484.2. Debido a la elevada divergencia de las secuencias de primate/roedor, los dúplex de ARNip se diseñaron en varios lotes separados, que incluyeron, sin carácter limitante, lotes que contenían dúplex que coincidían con transcritos humanos y de rhesus únicamente; transcritos humanos, de rhesus, ratón y rata únicamente; y transcritos de ratón y rata únicamente. La mayoría de los dúplex de ARNip se diseñaron de modo que compartieran una identidad del 100% con el transcrito humano enumerado y los transcritos de otras especies considerados en cada lote de diseño (anterior). En algunos casos (remítase a la Tabla 8), se permitieron apareamientos erróneos entre el dúplex y la diana de ARNm en la primera posición antisentido (la última posición sentido) cuando el par de bases complementario de la hebra antisentido:ARNm diana era un par GC o CG. En estos casos, los dúplex se designaron con pares UA o AU en el primer par antisentido:último par sentido. De este modo, los dúplex conservaron la complementariedad pero tenían apareamientos erróneos respecto a la diana (U:C, U:G,
A:C o A:G). Dieciocho de estos dúplex de "intercambio de UA" fueron designados como parte del conjunto humano/rhesus/ratón/rata (remítase a los dúplex en la Tabla 8 con las marcas “C19U”, “G19U”, “C19A” o “G19A” en la columna de la Posición).
Diseño, especificidad y predicción de la eficacia de los ARNip
Se pronosticó la especificidad prevista para todos los nonadecámeros posibles a partir de cada secuencia. A continuación, se seleccionaron los nonadecámeros candidatos que carecían de repeticiones de más de 7 nucleótidos. Estos 1510 ARNip candidatos humanos/de rhesus, 114 humanos/de rhesus/ratón/rata, y 717 de ratón/rata se utilizaron en búsquedas exhaustivas frente a transcriptomas adecuados (definidos como el conjunto de registros NM_ y XM_ dentro de los conjuntos de Refseq del NCBI para humanos, rhesus, perros, ratones o ratas) utilizando un algoritmo exhaustivo de "fuerza bruta" implementado en el script Python ‘BruteForce.py’. A continuación, el script analizó las alineaciones de transcrito-oligo para generar una puntuación basada en la posición y el número de apareamientos erróneos entre el ARNip y cualquier transcrito "alejado de la diana" potencial. La puntuación alejada de la diana se pondera para enfatizar las diferencias en la región "semilla" de los ARNip, en las posiciones 2-9 partiendo del extremo 5' de la molécula. A cada par de oligo-transcrito de la búsqueda de fuerza bruta se le otorgó una puntuación de apareamientos erróneos sumando las puntuaciones de apareamientos erróneos individuales; los apareamientos erróneos en las posiciones 2-9 se contaron como 2.8, los apareamientos erróneos en las posiciones de los sitios de escisión 10-11 se contaron como 1.2 y los apareamientos erróneos en la región 1219 se contaron como 1.0. Se realizó una predicción alejada de la diana adicional comparando la frecuencia de los heptámeros y octómeros derivados de 3 hexámeros diferentes derivados de la región semilla de cada oligo. Los hexámeros de las posiciones 2-7 con relación al inicio 5' se utilizan para crear 2 heptámeros y un octómero. Hemos creado el "heptámero 1" añadiendo una A 3' al hexámero; hemos creado el heptámero 2 añadiendo una A 5' al hexámero; hemos creado el octómero añadiendo una A a ambos extremos 5' y 3' del hexámero. Se precalculó la frecuencia de los octómeros y heptámeros en 3'UTRome humana, de rhesus, ratón o rata (que se define como la subsecuencia del transcriptoma de la base de datos de Refseq del NCBI en la que el extremo de la región codificante, la "CDS", está claramente definido). La frecuencia de los octómeros se normalizó respecto a la frecuencia de los heptámeros utilizando el valor mediano de la gama de frecuencias de los octómeros. A continuación, se calculó una puntuación "mirSeedScore" calculando la suma de ((3 X recuento de octómeros normalizado) + (2 X recuento del heptámero 2) + (1 X recuento del heptámero 1)).
Ambas hebras de ARNip fueron asignadas a una categoría de especificidad de acuerdo con las puntuaciones calculadas: una puntuación por encima de 3 se califica como altamente específica, igual a 3 como específica y entre
2.2 y 2.8 como moderadamente específica. Realizamos la clasificación según la especificidad de la hebra antisentido. A continuación, seleccionamos dúplex cuyos oligos antisentido carecían de GC en la primera posición, carecían de G en las posiciones 13 y 14 y tenían 3 o más Us o As en la región semilla (características de dúplex con una eficacia prevista elevada).
Se diseñaron dúplex conjugados con GalNAc candidatos, con una longitud de 21 y 23 nucleótidos para las hebras sentido y antisentido, respectivamente, extendiendo nonadecámeros antisentido 4 nucleótidos adicionales en la dirección 3' (conservando una complementariedad perfecta con el transcrito diana). Se especificó la hebra sentido como el complemento inverso de los primeros 21 nucleótidos del tricosámero antisentido. Se seleccionaron los dúplex que conservaron apareamientos perfectos para todos los transcritos de las especies seleccionadas en los 23 nucleótidos.
Selección de las secuencias de ARNip de ratón/rata derivados de 40 hebras sentido y 40 hebras antisentido y se utilizaron para formar los dúplex. Se sintetizaron oligos henicosaméricos/tricosaméricos humanos/de rhesus derivados de un total de 45 hebras sentido y 45 hebras antisentido para proporcionar 45 dúplex conjugados con GalNAc.
Las secuencias de las hebras sentido y antisentido de los dúplex modificados se muestran en la Tabla 2 y las secuencias de las hebras sentido y antisentido de los dúplex no modificados se muestran en la Tabla 3.
Síntesis de secuencias de ALAS1
Se sintetizaron secuencias de ALAS1 en un sintetizador MerMade 192 a escala de 1 o 0.2 µmol. Se prepararon hebras individuales con modificaciones de tipo 2’O-metilo para realizar un cribado in vitro utilizando reactivos de transfección. Se prepararon conjugados 3’ GalNAc con secuencias que contenían modificaciones de tipo 2’F y 2’-Ometilo en la hebra sentido en los diseños henicosaméricos/tricosaméricos para la captación libre en células. Para todas las secuencias henicosaméricas de la lista, se aplicó una química "endolight" según se detalla a continuación.
○
Todas las pirimidinas (citosina y uridina) de la hebra sentido contenían bases con modificaciones de tipo 2’O-metilo (C con modificación 2’-O-metilo y U con modificación 2’-O).
○
En la hebra antisentido, las pirimidinas adyacentes (hacia la posición 5') a un ribonucleósido A se reemplazaron por sus correspondientes nucleósidos con modificaciones 2-O-metilo.
○
Se introdujo una extensión de dos bases dTsdT en el extremo 3’ de ambas secuencias sentido y antisentido.
○
El archivo de las secuencias se convirtió en un archivo de texto con el fin de que fuera compatible para cargarlo en el programa informático de síntesis MerMade 192.
Para las hebras sentido conjugadas con GalNAc y las secuencias antisentido complementarias, se introdujeron nucleósidos con modificaciones 2'F y con otras modificaciones combinados con ribo con nucleósidos de modificaciones 2'O-metilo. La síntesis se llevó a cabo en un soporte CPG modificado con GalNAc para la hebra sentido y CPG modificado con un soporte universal para la secuencia antisentido.
Síntesis, escisión y desprotección:
La síntesis de las secuencias de ALAS1 fue una síntesis de oligonucleótidos en soporte sólido basada en la química de los fosforamiditos. Para las secuencias "endolight" henicosaméricas, se utilizó desoxitimidina-CPG como soporte sólido, mientras que para los conjugados de GalNAc, se utilizó un soporte sólido de GalNAc para la hebra sentido y CPG universal para la hebra antisentido.
La síntesis de las secuencias anteriores se llevó a cabo a escala de 1 o 0.2 µm en placas de 96 pocillos. Las soluciones de los amiditos se prepararon con una concentración de 0.1 M y se utilizó etiltiotetrazol (0.6 M en acetonitrilo) como activador.
Las secuencias sintetizadas se escindieron y desprotegieron en placas de 96 pocillos, utilizando metilamina en el primer paso y un reactivo de fluoruro en el segundo paso. Para las secuencias que contenían GalNAc y nucleósidos con modificaciones 2'F, se modificaron las condiciones de desprotección. Después de la escisión y desprotección de las secuencias, se provocó su precipitación utilizando una mezcla de acetona:etanol (80:20) y el pellet se suspendió de nuevo en un tampón de acetato de sodio 0.2 M. Las muestras de cada secuencia se analizaron mediante LC-MS para confirmar su identidad y mediante UV para cuantificarlas, y un conjunto de muestras seleccionadas se analizó mediante cromatografía de intercambio iónico para determinar su pureza.
Purificación y eliminación de las sales:
Se provocó la precipitación de las secuencias de ALAS1 y estas se purificaron en un sistema purificador AKTA utilizando una columna Sephadex. El ALAS1ess se llevó a cabo a temperatura ambiente. La inyección y la recolección de las muestras se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos (pocillos con una profundidad de 1.8 mL). En el eluyente se recolectó un único pico correspondiente a la secuencia de longitud completa. Las secuencias de ALAS1, una vez eliminadas las sales, se analizaron para determinar su concentración (mediante una medición de UV a A260) y pureza (mediante HPLC de intercambio iónico). A continuación, las hebras individuales complementarias se combinaron con una relación estequiométrica 1:1 para formar los dúplex de ARNip.
Tabla 2: Secuencias de los dúplex y de las hebras individuales modificadas de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Posición en el transcrito NM_ 000688.4 Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
2
3 522-540 AD-55078.2 cuccGGccAGuGAGAAAGAdTsdT UCUUUCUcACUGGCCGGAGdTsdT
4
5 669-687 AD-55084.2 uGGcAGcAcAGAuGAAucAdTsdT UGAUUcAUCUGUGCUGCcAdTsdT
6
7 790-808 AD-55090.2 cAGuGuGGuuAGuGuGAAAdTsdT UUUcAcACuAACcAcACUGdTsdT
8
9 853-871 AD-55096.2 cAucAuGcAAAAGcAAAGAdTsdT UCUUUGCUUUUGcAUGAUGdTsdT
10
11 876-894 AD-55102.2 AAAGAGuGucucAucuucudTsdT AGAAGAUGAGAcACUCUUUdTsdT
12
13 877-895 AD-55106.2 AAGAGuGucucAucuucuudTsdT AAGAAGAUGAGAcACUCUUdTsdT
14
15 914-932 AD-55111.2 ucuGuuuccAcuuuucAGudTsdT ACUGAAAAGUGGAAAcAGAdTsdT
16
17 923-941 AD-55073.2 AcuuuucAGuAuGAucGuudTsdT AACGAUcAuACUGAAAAGUdTsdT
18
19 926-944 AD-55079.2 uuucAGuAuGAucGuuucudTsdT AGAAACGAUcAuACUGAAAdTsdT
20
21 927-945 AD-55085.2 uucAGuAuGAucGuuucuudTsdT AAGAAACGAUcAuACUGAAdTsdT
22
23 928-946 AD-55091.2 ucAGuAuGAucGuuucuuudTsdT AAAGAAACGAUcAuACUGAdTsdT
24
25 932-950 AD-55097.2 uAuGAucGuuucuuuGAGAdTsdT UCUcAAAGAAACGAUcAuAdTsdT
26
27 973-991 AD-55103.2 uGAccAcAccuAucGAGuudTsdT AACUCGAuAGGUGUGGUcAdTsdT
28
29 975-993 AD-55107.2 AccAcAccuAucGAGuuuudTsdT AAAACUCGAuAGGUGUGGUdTsdT
30
31 1029-1047 AD-55112.2 uGGcAGAuGAcuAuucAGAdTsdT UCUGAAuAGUcAUCUGCcAdTsdT
32
33 1077-1095 AD-55074.2 ucuGGuGcAGuAAuGAcuAdTsdT uAGUcAUuACUGcACcAGAdTsdT
34
35 1124-1142 AD-55080.2 uGuGGGGcAGuuAuGGAcAdTsdT UGUCcAuAACUGCCCcAcAdTsdT
36
37 1137-1155 AD-55086.2 uGGAcAcuuuGAAAcAAcAdTsdT UGUUGUUUcAAAGUGUCcAdTsdT
38
39 1182-1200 AD-55098.2 AuAuuucuGGAAcuAGuAAdTsdT UuACuAGUUCcAGAAAuAUdTsdT
40
41 1184-1202 AD-55104.2 AuuucuGGAAcuAGuAAAudTsdT AUUuACuAGUUCcAGAAAUdTsdT
42
43 1185-1203 AD-55108.2 uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsdT AAUUuACuAGUUCcAGAAAdTsdT
44
45 1188-1206 AD-55113.2 cuGGAAcuAGuAAAuuccAdTsdT UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTsdT
46
47 1325-1343 AD-55075.2 uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsdT AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsdT
48
49 1364-1382 AD-55081.2 AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsdT UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTsdT
50
51 1382-1400 AD-55087.2 AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsdT UGuACUUUGGcACUCGGCUdTsdT
52
53 1478-1496 AD-55093.2 uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsdT UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTsdT
54
55 1531-1549 AD-55099.2 uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsdT AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsdT
56
57 1631-1649 AD-53573.3 GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT
58
59 1637-1655 AD-55109.2 ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsdT AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTsdT
60
61 1706-1724 AD-55114.2 AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsdT UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTsdT
62
63 1962-1980 AD-55076.2 AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsdT AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsdT
64
65 1967-1985 AD-55082.2 uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTsdT UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsdT
66
67 1977-1995 AD-55088.2 uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsdT AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTsdT
68
69 2189-2207 AD-55094.2 uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTsdT UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsdT
70
71 2227-2245 AD-55100.2 AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTsdT uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsdT
72
73 2313-2331 AD-55105.2 ucuucAGAGuuGucuuuAudTsdT AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsdT
74
75 2317-2335 AD-55110.2 cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsdT AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsdT
76
77 2319-2337 AD-55115.2 GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTsdT UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT
78
79 2320-2338 AD-55077.2 AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsdT UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsdT
80
81 2344-2362 AD-55083.2 uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsdT AGAUuAAAAUUuAAuAuAAdTsdT
82
83 2352-2370 AD-55089.2 AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsdT UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTsdT
84
85 2353-2371 AD-55095.2 AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsdT UUUuACuAuAGAUuAAAAUdTsdT
86
87 2376-2394 AD-55101.2 AGuccuGGAAAuAAAuucudTsdT AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTsdT
88
89 358-376 AD-53511.1 cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTsdT
90
91 789-807 AD-53512.1 ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTsdT UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT
92
93 1076-1094 AD-53513.1 GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsdT AGUcAUuACUGcACcAGACdTsdT
94
95 1253-1271 AD-53514.1 GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTsdT
96
97 1544-1562 AD-53515.1 GAGuuuGGAGcAAucAccudTsdT AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTsdT
98
99 2228-2246 AD-53516.1 GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTsdT AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsdT
100
101 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT
102
103 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT
104
105 866-884 AD-53518.1 cAAAGAccAGAAAGAGuGudTsdT AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTsdT
106
107 1080-1098 AD-53519.1 GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsdT AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsdT
108
109 1258-1276 AD-53520.1 cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT AAAGcACGAGGAAAAcAAGdTsdT
110
111 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAucGGGAuGGAGucAdTsdT UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsdT
112
113 2230-2248 AD-53522.1 cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsdT AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsdT
114
115 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT
116
117 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT
118
119 885-903 AD-53524.1 cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTsdT
120
121 1127-1145 AD-53525.1 GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTsdT AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsdT
122
123 1315-1333 AD-53526.1 GAuGccAGGcuGuGAGAuudTsdT AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsdT
124
125 1870-1888 AD-53527.1 GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTsdT AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsdT
126
127 2286-2304 AD-53528.1 ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTsdT
128
129 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT
130
131 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT
132
133 915-933 AD-53530.1 cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTsdT
134
135 1138-1156 AD-53531.1 GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsdT AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTsdT
136
137 1324-1342 AD-53532.1 cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsdT AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsdT
138
139 1927-1945 AD-53533.1 cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsdT AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsdT
140
141 2312-2330 AD-53534.1 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT
142
143 646-664 AD-53535.1 cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTsdT
144
145 922-940 AD-53536.1 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT
146
147 1163-1181 AD-53537.1 GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTsdT UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsdT
148
149 1347-1365 AD-53538.1 GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTsdT
150
151 1964-1982 AD-53539.1 GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTsdT UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsdT
152
153 2321-2339 AD-53540.1 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT
154
155 671-689 AD-53541.1 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT
156
157 924-942 AD-53542.1 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT
158
159 1164-1182 AD-53543.1 GGGcAGGuGGuAcuAGAAAdTsdT UUUCuAGuACcACCUGCCCdTsdT
160
161 1460-1478 AD-53544.1 GuccccAAGAuuGuGGcAudTsdT AUGCcAcAAUCUUGGGGACdTsdT
162
163 1976-1994 AD-53545.1 cuAAuGAGcAGAcAuAAcAdTsdT UGUuAUGUCUGCUcAUuAGdTsdT
164
165 786-804 AD-53546.1 GccccAGuGuGGuuAGuGudTsdT AcACuAACcAcACUGGGGCdTsdT
166
167 935-953 AD-53547.1 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT
168
169 1165-1183 AD-53548.1 GGcAGGuGGuAcuAGAAAudTsdT AUUUCuAGuACcACCUGCCdTsdT
170
171 1530-1548 AD-53549.1 GuGAuGuGGcccAuGAGuudTsdT AACUcAUGGGCcAcAUcACdTsdT
172
173 2003-2021 AD-53550.1 cAAGcAAucAAuuAcccuAdTsdT uAGGGuAAUUGAUUGCUUGdTsdT
174
175 788-806 AD-53551.1 cccAGuGuGGuuAGuGuGAdTsdT UcAcACuAACcAcACUGGGdTsdT
176
177 974-992 AD-53552.1 GAccAcAccuAucGAGuuudTsdT AAACUCGAuAGGUGUGGUCdTsdT
178
179 1191-1209 AD-53553.1 GAAcuAGuAAAuuccAuGudTsdT AcAUGGAAUUuACuAGUUCdTsdT
180
181 1541-1559 AD-53554.1 cAuGAGuuuGGAGcAAucAdTsdT UGAUUGCUCcAAACUcAUGdTsdT
182
183 2075-2093 AD-53555.1 ccccAGAuGAuGAAcuAcudTsdT AGuAGUUcAUcAUCUGGGGdTsdT
184
185 360-378 AD-53561.1 GcccAuucuuAucccGAGudTsdT ACUCGGGAuAAGAAUGGGCdTsdT
186
187 1356-1374 AD-53567.1 ccuccAuGAuccAAGGGAudTsdT AUCCCUUGGAUcAUGGAGGdTsdT
188
189 1631-1649 AD-53573.1 GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT
190
191 1634-1652 AD-53579.1 AuGccAAAAAuGGAcAucAdTsdT UGAUGUCcAUUUUUGGcAUdTsdT
Tabla 3: Secuencias de los dúplex y de las hebras individuales no modificadas de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido )
SEQ ID NO: (antisentido) Posición en el transcrito NM_ 000688.4 Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
192
193 522-540 AD-55078.2 CUCCGGCCAGUGAGAAAGA UCUUUCUCACUGGCCGGAG
194
195 669-687 AD-55084.2 UGGCAGCACAGAUGAAUCA UGAUUCAUCUGUGCUGCCA
196
197 790-808 AD-55090.2 CAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUG
198
199 853-871 AD-55096.2 CAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUG
200
201 876-894 AD-55102.2 AAAGAGUGUCUCAUCUUCU AGAAGAUGAGACACUCUUU
202
203 877-895 AD-55106.2 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU
204
205 914-932 AD-55111.2 UCUGUUUCCACUUUUCAGU ACUGAAAAGUGGAAACAGA
206
207 923-941 AD-55073.2 ACUUUUCAGUAUGAUCGUU AACGAUCAUACUGAAAAGU
208
209 926-944 AD-55079.2 UUUCAGUAUGAUCGUUUCU AGAAACGAUCAUACUGAAA
210
211 927-945 AD-55085.2 UUCAGUAUGAUCGUUUCUU AAGAAACGAUCAUACUGAA
212
213 928-946 AD-55091.2 UCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGA
214
215 932-950 AD-55097.2 UAUGAUCGUUUCUUUGAGA UCUCAAAGAAACGAUCAUA
216
217 973-991 AD-55103.2 UGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCA
218
219 975-993 AD-55107.2 ACCACACCUAUCGAGUUUU AAAACUCGAUAGGUGUGGU
220
221 1029-1047 AD-55112.2 UGGCAGAUGACUAUUCAGA UCUGAAUAGUCAUCUGCCA
222
223 1077-1095 AD-55074.2 UCUGGUGCAGUAAUGACUA UAGUCAUUACUGCACCAGA
224
225 1124-1142 AD-55080.2 UGUGGGGCAGUUAUGGACA UGUCCAUAACUGCCCCACA
226
227 1137-1155 AD-55086.2 UGGACACUUUGAAACAACA UGUUGUUUCAAAGUGUCCA
228
229 1182-1200 AD-55098.2 AUAUUUCUGGAACUAGUAA UUACUAGUUCCAGAAAUAU
230
231 1184-1202 AD-55104.2 AUUUCUGGAACUAGUAAAU AUUUACUAGUUCCAGAAAU
232
233 1185-1203 AD-55108.2 UUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAA
234
235 1188-1206 AD-55113.2 CUGGAACUAGUAAAUUCCA UGGAAUUUACUAGUUCCAG
236
237 1325-1343 AD-55075.2 UGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACA
238
239 1364-1382 AD-55081.2 AUCCAAGGGAUUCGAAACA UGUUUCGAAUCCCUUGGAU
240
241 1382-1400 AD-55087.2 AGCCGAGUGCCAAAGUACA UGUACUUUGGCACUCGGCU
242
243 1478-1496 AD-55093.2 UUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAA
244
245 1531-1549 AD-55099.2 UGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCA
246
247 1631-1649 AD-53573.3 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
248
249 1637-1655 AD-55109.2 CCAAAAAUGGACAUCAUUU AAAUGAUGUCCAUUUUUGG
250
251 1706-1724 AD-55114.2 ACGAGUUCUCUGAUUGACA UGUCAAUCAGAGAACUCGU
252
253 1962-1980 AD-55076.2 AAGUCUGUGAUGAACUAAU AUUAGUUCAUCACAGACUU
254
255 1967-1985 AD-55082.2 UGUGAUGAACUAAUGAGCA UGCUCAUUAGUUCAUCACA
256
257 1977-1995 AD-55088.2 UAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUA
258
259 2189-2207 AD-55094.2 UUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAA
260
261 2227-2245 AD-55100.2 AGGCUUGAGCAAGUUGGUA UACCAACUUGCUCAAGCCU
262
263 2313-2331 AD-55105.2 UCUUCAGAGUUGUCUUUAU AUAAAGACAACUCUGAAGA
264
265 2317-2335 AD-55110.2 CAGAGUUGUCUUUAUAUGU ACAUAUAAAGACAACUCUG
266
267 2319-2337 AD-55115.2 GAGUUGUCUUUAUAUGUGA UCACAUAUAAAGACAACUC
268
269 2320-2338 AD-55077.2 AGUUGUCUUUAUAUGUGAA UUCACAUAUAAAGACAACU
270
271 2344-2362 AD-55083.2 UUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAA
272
273 2352-2370 AD-55089.2 AAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUU
274
275 2353-2371 AD-55095.2 AUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAU
276
277 2376-2394 AD-55101.2 AGUCCUGGAAAUAAAUUCU AGAAUUUAUUUCCAGGACU
278
279 358-376 AD-53511.1 CUGCCCAUUCUUAUCCCGA UCGGGAUAAGAAUGGGCAG
280
281 789-807 AD-53512.1 CCAGUGUGGUUAGUGUGAA UUCACACUAACCACACUGG
282
283 1076-1094 AD-53513.1 GUCUGGUGCAGUAAUGACU AGUCAUUACUGCACCAGAC
284
285 1253-1271 AD-53514.1 GCACUCUUGUUUUCCUCGU ACGAGGAAAACAAGAGUGC
286
287 1544-1562 AD-53515.1 GAGUUUGGAGCAAUCACCU AGGUGAUUGCUCCAAACUC
288
289 2228-2246 AD-53516.1 GGCUUGAGCAAGUUGGUAU AUACCAACUUGCUCAAGCC
290
291 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AGAACAACAGAGAUUUGCC
292
293 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AGAACAACAGAGAUUUGCC
294
295 866-884 AD-53518.1 CAAAGACCAGAAAGAGUGU ACACUCUUUCUGGUCUUUG
296
297 1080-1098 AD-53519.1 GGUGCAGUAAUGACUACCU AGGUAGUCAUUACUGCACC
298
299 1258-1276 AD-53520.1 CUUGUUUUCCUCGUGCUUU AAAGCACGAGGAAAACAAG
300
301 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAUCGGGAUGGAGUCA UGACUCCAUCCCGAUCCCC
302
303 2230-2248 AD-53522.1 CUUGAGCAAGUUGGUAUCU AGAUACCAACUUGCUCAAG
304
305 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG
306
307 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG
308
309 885-903 AD-53524.1 CUCAUCUUCUUCAAGAUAA UUAUCUUGAAGAAGAUGAG
310
311 1127-1145 AD-53525.1 GGGGCAGUUAUGGACACUU AAGUGUCCAUAACUGCCCC
312
313 1315-1333 AD-53526.1 GAUGCCAGGCUGUGAGAUU AAUCUCACAGCCUGGCAUC
314
315 1870-1888 AD-53527.1 GAGACAGAUGCUAAUGGAU AUCCAUUAGCAUCUGUCUC
316
317 2286-2304 AD-53528.1 CCCCAGGCCAUUAUCAUAU AUAUGAUAAUGGCCUGGGG
318
319 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCUG
320
321 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCUG
322
323 915-933 AD-53530.1 CUGUUUCCACUUUUCAGUA UACUGAAAAGUGGAAACAG
324
325 1138-1156 AD-53531.1 GGACACUUUGAAACAACAU AUGUUGUUUCAAAGUGUCC
326
327 1324-1342 AD-53532.1 CUGUGAGAUUUACUCUGAU AUCAGAGUAAAUCUCACAG
328
329 1927-1945 AD-53533.1 CCCUGUGCGGGUUGCAGAU AUCUGCAACCCGCACAGGG
330
331 2312-2330 AD-53534.1 GUCUUCAGAGUUGUCUUUA UAAAGACAACUCUGAAGAC
332
333 646-664 AD-53535.1 CACUGCAAGCAAAUGCCCU AGGGCAUUUGCUUGCAGUG
334
335 922-940 AD-53536.1 CACUUUUCAGUAUGAUCGU ACGAUCAUACUGAAAAGUG
336
337 1163-1181 AD-53537.1 GGGGCAGGUGGUACUAGAA UUCUAGUACCACCUGCCCC
338
339 1347-1365 AD-53538.1 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
340
341 1964-1982 AD-53539.1 GUCUGUGAUGAACUAAUGA UCAUUAGUUCAUCACAGAC
342
343 2321-2339 AD-53540.1 GUUGUCUUUAUAUGUGAAU AUUCACAUAUAAAGACAAC
344
345 671-689 AD-53541.1 GCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGC
346
347 924-942 AD-53542.1 CUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAG
348
349 1164-1182 AD-53543.1 GGGCAGGUGGUACUAGAAA UUUCUAGUACCACCUGCCC
350
351 1460-1478 AD-53544.1 GUCCCCAAGAUUGUGGCAU AUGCCACAAUCUUGGGGAC
352
353 1976-1994 AD-53545.1 CUAAUGAGCAGACAUAACA UGUUAUGUCUGCUCAUUAG
354
355 786-804 AD-53546.1 GCCCCAGUGUGGUUAGUGU ACACUAACCACACUGGGGC
356
357 935-953 AD-53547.1 GAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUC
358
359 1165-1183 AD-53548.1 GGCAGGUGGUACUAGAAAU AUUUCUAGUACCACCUGCC
360
361 1530-1548 AD-53549.1 GUGAUGUGGCCCAUGAGUU AACUCAUGGGCCACAUCAC
362
363 2003-2021 AD-53550.1 CAAGCAAUCAAUUACCCUA UAGGGUAAUUGAUUGCUUG
364
365 788-806 AD-53551.1 CCCAGUGUGGUUAGUGUGA UCACACUAACCACACUGGG
366
367 974-992 AD-53552.1 GACCACACCUAUCGAGUUU AAACUCGAUAGGUGUGGUC
368
369 1191-1209 AD-53553.1 GAACUAGUAAAUUCCAUGU ACAUGGAAUUUACUAGUUC
370
371 1541-1559 AD-53554.1 CAUGAGUUUGGAGCAAUCA UGAUUGCUCCAAACUCAUG
372
373 2075-2093 AD-53555.1 CCCCAGAUGAUGAACUACU AGUAGUUCAUCAUCUGGGG
374
375 360-378 AD-53561.1 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
376
377 1356-1374 AD-53567.1 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
378
379 1631-1649 AD-53573.1 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
380
381 1634-1652 AD-53579.1 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
Ejemplo 3. Cribado in vitro de los dúplex de ARNip de ALAS1 para determinar la actividad de desactivación de ALAS1
Los dúplex de ARNip de ALAS1 se cribaron con el fin de determinar su capacidad para desactivar la expresión de ALAS1 in vitro.
5 Cribado in vitro
Cultivos celulares y transfecciones
Se cultivaron células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) hasta casi llegar a la confluencia a 37 °C en una atmósfera de un 5% de CO2 en MEM (ATCC) suplementada con un 10% de FBS, antes de liberarlas de la placa mediante tripsinización. La transfección se llevó a cabo añadiendo 14.8 µl de Opti-MEM más 0.2 µl de Lipofectamine RNAiMax 10 por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA, n.o de catálogo 13778-150) a 5 µl de los dúplex de ARNip por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se añadieron 80 µl de medio de cultivo completo que contenían ~2 x 104 células Hep3B a la mezcla de ARNip. Las células se incubaron durante 24 o 120 horas antes de la purificación del ARN. Se llevaron a cabo experimentos de dosis individuales para una concentración final del dúplex de 10 nM y 0.1n M y se llevaron a cabo experimentos de dosis-respuesta para
15 una concentración final del dúplex de 10, 1.67, 0.27, 0.046, 0.0077, 0.0013, 0.00021 y 0.00004 nM.
Aislamiento de ARN total utilizando el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, componente n.o: 61012)
Las células se recolectaron y lisaron en 150 µl de tampón de lisis/unión, a continuación se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm utilizando un instrumento Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado fue la misma a lo 20 largo de todo el proceso). Se añadieron diez microlitros de microesferas magnéticas y 80 µl de mezcla de tampón de lisis/unión a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Las microesferas magnéticas se capturaron utilizando un soporte magnético y se retiró el sobrenadante sin que se alteraran las microesferas. Después de retirar el sobrenadante, las células lisadas se añadieron a las microesferas remanentes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las microesferas magnéticas se lavaron 2 veces con 150 µl 5 de tampón de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las microesferas se capturaron nuevamente y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 µl de tampón de lavado B, se capturaron y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 µl de tampón de elución, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Se permitió que las microesferas se secaran durante 2 minutos. Después del secado, se añadieron 50 µl de tampón de elución y se mezclaron durante 5 minutos a 70 °C. Las microesferas se capturaron
10 con un imán durante 5 minutos. Se retiraron 40 µl de sobrenadante y se añadieron a otra placa de 96 pocillos.
Síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.o de catálogo 4368813)
Una mezcla patrón de 2 µl de 10X tampón, 0.8 µl de 25X dNTPs, 2 µl de cebadores aleatorios, 1 µl de transcriptasa inversa, 1 µl de inhibidor de RNasa y 3.2 µl de H2O por reacción se añadió a 10 µl de ARN total. Se generó ADNc
15 utilizando un ciclador térmico Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) mediante los pasos siguientes: 25 oC 10 min, 37 oC 120 min, 85 oC 5 s y se mantiene a 4 oC.
PCR a tiempo real
Se añadieron 2 µl de ADNc a una mezcla patrón que contenía 0.5 µl de una sonda TaqMan de GAPDH (Applied Biosystems, n.o de catálogo 4326317E), 0.5 µl de una sonda TaqMan de ALAS1 (Applied Biosystems, n.o de
20 catálogo Hs00167441_m1) y 5 µl de una mezcla patrón para una sonda Lightcycler 480 (Roche, n.o de catálogo 04887301001) por pocillo en una placa de 384 pocillos (Roche, n.o de catálogo 04887301001). Se llevó a cabo una PCR a tiempo real en un sistema de PCR a tiempo real Roche LC480 (Roche) utilizando el ensayo de ΔΔCt(RQ). Cada dúplex se evaluó en dos transfecciones independientes con dos réplicas biológicas para cada uno de ellos, y cada transfección se evaluó por duplicado, a menos que se indique de otro modo en las tablas de resumen.
25 Para calcular el factor de cambio relativo, los datos a tiempo real se analizaron utilizando el método de ΔΔCt y se normalizaron respecto a los ensayos realizados con células transfectadas con AD-1955 10 nM o células transfectadas con vector vacío. Los valores de CI50 se calcularon utilizando un modelo de ajuste de 4 parámetros empleando XLFit y se normalizaron respecto a células transfectadas con AD-1955 o células vírgenes para el mismo intervalo de dosis, o respecto a su propia dosis más baja.
30 Desactivación in vitro de la expresión de ALAS1 endógeno mediante los dúplex de ARNip de ALAS1
La Tabla 4 ilustra la desactivación de ALAS1 en células Hep3B mediante los dúplex de ARNip modificados para ALAS1 (remítase a la Tabla 2). El silenciamiento se expresa como la fracción de mensaje de ARN remanente respecto al ARNip AD-1955 que actúa como control negativo (luciferasa). Los datos se generaron según se ha descrito anteriormente tras la transfección de una concentración 10 nM o 0.1 nM de cada ARNip. La qPCR se llevó a
35 cabo utilizando la sonda TaqMan de ALAS1 Hs00167441_m1.
Tabla 4: Expresión de ALAS1 en células Hep3B tras la transfección con ARNip de ALAS1
ID del dúplex
10 nM, media 0.1 nM, media 10 nM, desv. est. 0.1 nM, desv. est.
AD-55078.2
0.7 0.87 0.001 0.089
AD-55084.2
0.08 0.3 0 0.04
AD-55090.2
0.06 0.08 0.002 0.003
AD-55096.2
0.61 0.92 0.171 0.34
AD-55102.2
0.63 0.62 0.005 0.069
AD-55106.2
0.07 0.08 0.004 0.027
AD-55111.2
0.06 0.23 0.013 0.062
AD-55073.2
0.21 0.4 0.018 0.061
AD-55079.2
0.17 0.43 0.033 0.089
AD-55085.2
0.13 0.21 0.011 0.019
AD-55091.2
0.27 0.55 0.033 0.009
AD-55097.2
0.31 0.38 0.051 0.059
AD-55103.2
0.05 0.11 0.017 0.006
AD-55107.2
0.12 0.24 0.007 0.008
AD-55112.2
0.15 0.2 0.036 0.025
AD-55074.2
0.16 0.45 0.008 0.002
AD-55080.2
0.79 0.99 0.095 0.304
AD-55086.2
0.09 0.22 0.005 0.035
AD-55098.2
0.25 0.51 0.03 0.07
AD-55104.2
0.06 0.1 0.017 0.001
AD-55108.2
0.47 0.65 0.03 0.015
AD-55113.2
0.38 0.62 0.068 0.039
AD-55075.2
0.12 0.28 0.007 0.051
AD-55081.2
0.21 0.51 0.036 0.066
AD-55087.2
0.1 0.19 0.017 0.02
AD-55093.2
0.24 0.56 0.029 0.053
AD-55099.2
0.05 0.18 0.001 0.038
AD-53573.3
0.67 1.07 0.16 0.153
AD-55109.2
0.07 0.23 0.006 0.052
AD-55114.2
0.08 0.16 0.004 0.017
AD-55076.2
0.05 0.14 0.007 0.035
AD-55082.2
0.08 0.3 0.019 0.016
AD-55088.2
0.06 0.12 0.008 0.02
AD-55094.2
0.06 0.18 0.005 0.023
AD-55100.2
0.45 0.83 0.02 0.05
AD-55105.2
0.02 0.05 0.005 0.004
AD-55110.2
0.15 0.19 0.031 0.016
AD-55115.2
0.35 0.58 0.045 0.052
AD-55077.2
0.14 0.14 0.006 0.019
AD-55083.2
0.56 0.98 0.24 0.188
AD-55089.2
0.62 0.79 0.036 0.094
AD-55095.2
0.59 0.92 0.12 0.079
AD-55101.2
0.71 0.97 0.074 0.097
AD-1955
1.00 1.01 0.03 0.04
AD-53511.1
0.84 1.08 0.028 0.0515
AD-53512.1
0.15 0.65 0.062 0.023
AD-53513.1
0.34 0.86 0.055 0.011
AD-53514.1
0.12 0.61 0.003 0.008
AD-53515.1
0.25 0.66 0.005 0.004
AD-53516.1
1.05 1.02 0.032 0.011
AD-53517.1
0.145 0.725 0.025 0.0155
AD-53518.1
0.72 0.85 0.045 0.028
AD-53519.1
0.18 0.66 0.061 0.004
AD-53520.1
0.18 0.9 0.041 0.001
AD-53521.1
0.97 1.07 0.01 0.003
AD-53522.1
0.87 1.1 0.065 0.112
AD-53523.1
0.48 0.96 0.0305 0.0255
AD-53524.1
0.11 0.66 0.02 0.006
AD-53525.1
0.71 1.03 0.016 0.01
AD-53526.1
0.23 0.85 0.075 0.01
AD-53527.1
0.25 0.83 0.015 0.017
AD-53528.1
0.44 0.93 0.037 0.006
AD-53529.1
0.185 0.73 0.015 0.014
AD-53530.1
0.1 0.62 0.02 0.003
AD-53531.1
0.48 0.93 0.019 0.045
AD-53532.1
0.06 0.17 0 0.003
AD-53533.1
0.36 0.93 0.025 0.034
AD-53534.1
0.1 0.36 0.014 0.012
AD-53535.1
0.58 1.05 0.036 0.071
AD-53536.1
0.12 0.45 0.009 0.026
AD-53537.1
0.73 0.96 0.101 0.015
AD-53538.1
0.74 1.07 0 0.046
AD-53539.1
0.52 0.97 0.057 0.032
AD-53540.1
0.1 0.47 0.017 0.012
AD-53541.1
0.11 0.29 0.026 0.015
AD-53542.1
0.08 0.23 0.008 0.006
AD-53543.1
0.62 1.01 0.027 0.014
AD-53544.1
0.8 1.04 0.002 0.001
AD-53545.1
0.17 0.73 0.007 0.007
AD-53546.1
0.27 0.93 0.058 0.019
AD-53547.1
0.12 0.28 0.008 0.01
AD-53548.1
0.1 0.34 0.022 0.002
AD-53549.1
0.8 1.04 0.011 0.026
AD-53550.1
0.05 0.54 0.02 0.003
AD-53551.1
0.96 1.16 0.029 0.044
AD-53552.1
0.13 0.5 0.002 0.009
AD-53553.1
0.92 1.1 0.027 0.02
AD-53554.1
0.76 0.67 0.005 0.004
AD-53555.1
0.11 0.53 0.009 0.007
AD-53561.1
0.72 0.94 0.014 0.001
AD-53567.1
0.16 0.66 0.019 0.003
AD-53573.1
1.06 1.10 0.019 0.037
AD-53579.1
0.19 0.76 0.036 0.019
Valores de CI50 de los dúplex de ARNip de ALAS1 seleccionados en un cribado in vitro
La Tabla 5 ilustra los valores de CI50 de los dúplex de ARNip de ALAS1 seleccionados determinados a partir de la
desactivación de ALAS1 expresado de forma endógena en la línea celular Hep3B, mediante dúplex de ARNip
modificados para ALAS1 (remítase a la Tabla 2). Los datos se generaron como se ha descrito anteriormente, 24 o
120 horas después de la transfección de cada dúplex de ARNip. El silenciamiento de ALAS1 se expresa como la
5 fracción de mensaje de ARNm remanente respecto al ARNip AD-1955, un ARNip que no actúa sobre la diana y que
se utiliza como control negativo. Los datos de experimentos de transfección replicados se utilizaron para ajustar una
única línea con el fin de determinar la CI50. Varios dúplex (p. ej., AD-53541.1, AD-53542.1 y AD-53547.1)
presentaron una CI50 de tan solo aproximadamente 0.03 nM a las 24 horas. Numerosos dúplex presentaron una
CI50 inferior a 0.1 nM (p. ej., AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD10 53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) a las 24 horas y algunos de estos también presentaron una CI50 inferior a 0.1
nM (p. ej., AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) a las 120 horas.
Tabla 5: Valores de CI50 de los dúplex de ARNip de ALAS1 normalizados respecto a AD-1955
CI50 (nM)
ID DEL DÚPLEX
24 h 120 h
AD-53534.1
0.045 0.076
AD-53536.1
0.049 0.105
AD-53540.1
0.054 0.077
AD-53541.1
0.032 0.062
AD-53542.1
0.028 0.093
AD-53547.1
0.03 0.062
AD-53548.1
0.044 0.101
AD-53550.1
0.085 0.152
AD-53552.1
0.077 0.063
AD-53567.1
0.219 0.357
AD-53579.1
0.217 0.566
Ejemplo 4. Silenciamiento in vivo utilizando un ARNip de ALAS1 de ratón/rata formulado como un LNP
En la Tabla 6 a continuación se muestran las secuencias del dúplex modificado AD-53558. 15 Tabla 6: Secuencias del dúplex de ARNip de ALAS1 AD-53558.4
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Posición de inicio en el transcrito de NM_ 020559.2 Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
383
384 1184 AD-53558 cuGuGAAAuuuAcucuGAudTsdT AUcAGAGuAAAUUUcAcAGdTsdT
Este dúplex se formuló como una formulación LNP11 (remítase a la Tabla 10 mostrada anteriormente). El ARNip AD-53558 formulado en LNP se evaluó in vivo en ratones (N = 25 animales; 5 animales por grupo) y ratas (N = 20 animales; 4 animales por grupo) y se confirmó que silenciaba el ARNm de ALAS1 in vivo. Los resultados se muestran en la FIG. 5 y la FIG. 6.
20 La FIG. 5 muestra que el ARNip presentó un efecto de dosis-respuesta en ratones. La expresión de ARNm de ALAS1 de ratón (ALAS1r) se redujo aproximadamente un 78% cuando el ARNip se administró con una dosis de 1 mg/kg; el ARNm de ALAS1 de ratón se redujo aproximadamente un 60% cuando el ARNip se administró con una dosis de 0.3 mg/kg; y el ARNm de ALAS1 de ratón se redujo aproximadamente un 49% cuando el ARNip se administró con una dosis de 0.1 mg/kg. Estas reducciones se expresan respecto a un control de PBS. También se
25 empleó un control de LUC AD-1955, según se muestra en la FIG. 5.
De modo similar, la FIG. 6 muestra que el ARNip presentó un efecto de dosis-respuesta en ratas. La expresión de ARN de ALAS1 se redujo aproximadamente un 70% cuando el ARNip se administró con una dosis de 1 mg/kg; el ARNm de ALAS1 se redujo aproximadamente un 62% cuando el ARNip se administró con una dosis de 0.3 mg/kg; y el ARNm de ALAS1 se redujo aproximadamente un 34% cuando el ARNip se administró con una dosis de 0.1 mg/kg.
También se evaluó la durabilidad del silenciamiento en ratones (N = 15; 3 animales por punto de evaluación). Los resultados se muestran en la FIG. 7, la cual muestra que AD-53558 suprimió el ARNm de ALAS1r aproximadamente un 80% durante al menos 9 días. Una supresión de al menos aproximadamente un 50% perduró durante al menos 14 días.
5 Ejemplo 5. Eficacia del ARNip de ALAS1 en un modelo animal de AIP
Se investigaron los efectos de la formulación LNP11 de AD-53558 (un ARNip de ALAS1 de ratón/rata descrito en el ejemplo previo) en un modelo de ratón de AIP. La desactivación de PBGD no es viable (-/-, 0% de actividad). Existen ratones heterozigóticos con desactivación de PBGD (+/-, ~50% de actividad), pero no se dispone de su fenotipo bioquímico completo y, por lo tanto, no reproducen el fenotipo humano de la enfermedad. Por lo tanto, se ha 10 desarrollado un modelo de ratón de AIP que es un caso heterozigótico compuesto con alelos T1/T2, que incluye la disrupción del promotor de T1 (+/-) y la alteración del sitio de corte y empalme de T2 (-/-). Se ha observado que estos ratones presentan una actividad de PBGD residual hepática que es aproximadamente un 30% del nivel de origen natural o presentan niveles de ALA y PBG en plasma de referencia ligeramente elevados o normales. Se ha observado que los ratones parecen normales en estadios iniciales de su vida y se vuelven ligeramente más lentos y 15 atáxicos con la edad. Se ha descrito que, cuando los ratones tienen una edad de seis meses, desarrollan una coordinación motriz y un rendimiento muscular deteriorados, así como también una degeneración axonal cuando se someten a un examen patológico. La investigación de la patología del modelo de ratón ha mostrado degeneración axonal, así como coordinación motriz y rendimiento muscular deteriorados en ratones de edad más avanzada. Se ha observado que ALA y PBG en plasma y orina aumentan notablemente con la administración i.p. en serie de
20 fenobarbital (remítase a Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 y Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Los ratones se rescataron mediante la expresión mediada por AAV de PBGD en el hígado (Yasuda et al. (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 y Unzu et al. (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).
El día 1, se administró a los ratones 1 mg/kg de ARNip de ALAS1 (n = 5) o el control AD-1955 de LUC (n = 3) mediante inyección i.v. Se suministraron tres inyecciones de fenobarbital (1 inyección por día en los días 2, 3 y 4)
25 para inducir ALAS1 hepático y los precursores de porfirinas, ALA y PBG. Se tomaron muestras de orina durante la noche y de plasma en el día 5 y se midieron los niveles de metabolitos mediante LC-MS. Los niveles de metabolitos se midieron en plasma mediante LC-MS y también se midieron en la orina. Se midieron los niveles de referencia de los metabolitos antes del primer tratamiento el día 1. Los resultados se muestran en las FIG. 8-12 y en las Tablas 12 y 13.
30 La FIG. 8 y la FIG. 9 muestran los niveles de ALA en plasma en µM. Los niveles de ALA de referencia fueron bajos (n = 4) y el tratamiento con fenobarbital indujo incrementos significativos en los niveles de ALA en plasma en los animales tratados con ARNip de LUC como control (n = 3). El tratamiento con ARNip de ALAS1 inhibió la inducción de ALA en plasma (n = 5), según se muestra en la FIG. 8. El ARNip de ALAS1 fue uniformemente eficaz a la hora de bloquear la inducción de ALA en plasma en cada uno de los animales individuales estudiados (remítase a la FIG. 9).
35 Estos resultados indican que el tratamiento con ARNip de ALAS1 fue eficaz a la hora de prevenir los incrementos de ALA en plasma asociados con los ataques agudos inducidos por fenobarbital en este modelo animal de AIP.
La FIG. 10 y la FIG. 11 muestran los niveles de PBG en plasma en µM. Los niveles de PBG de referencia fueron bajos (n = 4) y el tratamiento con fenobarbital indujo incrementos significativos en los niveles de PBG en plasma en los animales tratados con ARNip de LUC como control (n = 3). El tratamiento con ARNip de ALAS1 inhibió la
40 inducción de PBG en plasma (n = 5), según se muestra en la FIG. 10. El ARNip de ALAS1 fue uniformemente eficaz a la hora de bloquear la inducción de PBG en plasma en cada uno de los animales individuales estudiados (remítase a la FIG. 11). Estos resultados indican que el tratamiento con ARNip de ALAS1 fue eficaz a la hora de prevenir los incrementos de PBG en plasma asociados con los ataques agudos inducidos por fenobarbital en este modelo animal de AIP.
45 Las Tablas 12 y 13 muestran los niveles de ALA y PBG en orina en el punto de referencia y después del tratamiento con fenobarbital en animales tratados con ARNip de LUC (n = 2), control (CTR, que se refiere a un animal tratado con tampón de PBS, n = 1) y ARNip de ALAS1 (n = 5).
Tabla 12: Datos en orina de animales individuales que muestran la prevención de un ataque agudo inducido
ID del ratón
ALA (microM /L) PBG (microM /L) Creatinina (mg/dL) ALA (micro M/mg de creatinina) PBG (micro M/mg de creatinina) ARNip PB
Ha-17-4-6
29.7 7.9 Referencia -
Ha-19-5-4/2
15.7 5.1 Referencia -
Ha-20-39-4/3
28.6 6.7 Referencia -
Ha-20-38-4
21.4 4.7 Referencia -
Ha-21-33-4
934.92 483.71 0.4205 222.33 115.03 Luc +
Ha-21-36-9
944.08 563.53 0.5055 186.76 111.48 Luc +
Ha-21-18-8
32.88 8.69 0.133 24.72 6.53 ALAS1; +
1 mg/kg
Ha-21-33-7
83.07 23.28 0.426 19.50 5.46 ALAS1; 1 mg/kg +
Ha-21-34-5
59.15 18.41 0.263 22.49 7.00 ALAS1; 1 mg/kg +
PB se refiere a fenobarbital. Un signo “+” indica que se administró fenobarbital. Tabla 13: Datos medios en orina
ALA medio (microM/mg de creatinina)
PBG medio (microM/mg de creatinina)
23.8
6.1, referencia de AIP
204.55
113.26, ARNip de Luc
22.24
6.33, ARNip de ALAS1
El tratamiento con fenobarbital indujo incrementos marcados (incrementos de ~25-30 veces) de ALA en orina (~9 veces por encima de los niveles de referencia) y PBG en orina (~19 veces por encima de los niveles de referencia)
5 en los ratones tratados con ARNip de LUC, el control, mientras que tales incrementos no se observaron en los animales tratados con ARNip de ALAS1. Por lo tanto, el ARNip de ALAS1 bloqueó los incrementos inducidos por fenobarbital de ALA y PBG en orina. Estos resultados son coherentes con las medidas en plasma y muestran que el tratamiento con ARNip de ALAS1 fue eficaz a la hora de prevenir los incrementos de metabolitos en orina (ALA y PBG) asociados con los ataques agudos inducidos por fenobarbital en este modelo animal de AIP.
10 En otros experimentos (FIG. 12), se observó que el tratamiento con fenobarbital indujo grandes incrementos (~25 veces) en la expresión de ARNm de ALAS1 en el hígado del modelo de ratón. La administración de ARNip de ALAS1 bloqueó completamente esta inducción de ARNm de ALAS1. Estos resultados proporcionan más pruebas de que el ARNip de ALAS1 es eficaz en un modelo animal de AIP.
En conjunto, los resultados proporcionados en este Ejemplo muestran que el ARNip de ALAS1 fue eficaz a la hora
15 de tratar ataques agudos en un modelo animal de la porfiria hepática aguda AIP. Las medidas de múltiples parámetros respaldan esta conclusión, incluidos los niveles de ALA en plasma, los niveles de PBG en plasma, los niveles de ALA en orina, los niveles de PBG en orina y los niveles de expresión de ARNm de ALAS1 en el hígado.
Ejemplo 6. Silenciamiento in vivo utilizando ARNip de ALAS1 de ratón conjugado con GalNAc
Los experimentos descritos en este ejemplo investigaron la eficacia in vivo de tres ARNip conjugados con GalNAc 20 (remítase a la Tabla 7). Estos ARNip se diseñaron y produjeron con métodos tales como los descritos en el Ejemplo
2.
Tabla 7: Secuencias de AD-57929
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Posición de la sec. sentido en el transcrito NM_ 020559.2 Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’) Posición de la sec. antisenti do en el transcrito NM_ 020559.2
385
386 775-795 AD-56211 AfaGfuCfuGfuUfUfCfcAfc UfuUfuCfaAfL96 uUfgAfaAfaGfuGfgaaAf cAfgAfcUfusUfsg 773-795
387
388 2168-2188 AD-56173 AfcAfuAfgUfaGfCfCfaGfa AfuUfgUfcUfL96 aGfaCfaAfuUfcUfggcUf aCfuAfuGfusGfsg 21662188
389
390 775-795 AD-57929 AfsasGfuCfuGfuUfUfCfcA fcUfuUfuCfaAfL96 usUfsgAfaAfaGfuGfgaa AfcAfgAfcUfususg 773-795
Los ratones (n = 40; n = 4 por cada condición experimental) se dividieron en grupos que recibieron PBS o dosis de 3 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg de ARNip administradas por vía subcutánea. Se determinó el nivel de ARNm de
25 ALAS1r/GAPDHr, respecto al control de PBS, en células hepáticas 72 horas después de la administración. Los resultados se muestran en la FIG. 13. No se observó un efecto de dosis-respuesta claro para los ARNip AD-56211 y AD-56173. Por el contrario, el ARNip de ALAS1 AD-57929 presentó un efecto de dosis-respuesta para la inhibición de la expresión de ALAS1r. Estos resultados demuestran que un conjugado de GalNAc de ALAS1 fue eficaz a la hora de inhibir la expresión de ARNm de ALAS1 in vivo y presentó un efecto de dosis-respuesta.
30 Ejemplo 7. ARNip humanos
Se diseñaron y se produjeron ARNip humanos adicionales según se ha descrito en el Ejemplo 2. Se seleccionaron los 45 ARNip mejores en función de su eficacia prevista. En la Tabla 8 se proporcionan las secuencias de estos 45 ARNip.
Tabla 8: Secuencias sentido y antisentido de ARNip de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Posición en transcrito NM_ 000688.4 el Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
391
392 1635-1657 CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC
393
394 2352-2374 UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU
395
396 1324-1346 GGCUGUGAGAUUUACUCUGAU AUCAGAGUAAAUCUCACAGCCUG
397
398 1637-1659 UGCCAAAAAUGGACAUCAUUU AAAUGAUGUCCAUUUUUGGCAUG
399
400 1363-1385 AUGAUCCAAGGGAUUCGAAAC GUUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGG
401
402 925-947 ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG
403
404 790-812 CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUGGGGC
405
406 1531-1553 UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCACACA
407
408 2189-2211 AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC
409
410 929-951 UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA
411
412 872-894 GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU
413
414 706-728 UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA
415
416 1362-1384 CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA
417
418 1634-1656 UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU
419
420 1325-1347 GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU
421
422 2208-2230 AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC
423
424 2344-2366 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA
425
426 924-946 CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA
427
428 873-895 ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU
429
430 759-781 GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC
431
432 871-893 AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU
433
434 1183-1205 AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC
435
436 2229-2251 AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA
437
438 671-693 UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG
439
440 2187-2209 GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG
441
442 913-935 AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG
443
444 1977-1999 ACUAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC
445
446 1174-1196 GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC
447
448 1810-1832 AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC
449
450 892-914 CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU
451
452 877-899 GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG
453
454 935-957 AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC
455
456 1975-1997 GAACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU
457
458 1478-1500 CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC
459
460 2366-2388 UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA
461
462 853-875 GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU
463
464 1966-1988 GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU
465
466 928-950 UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG
467
468 1186-1208 AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU
469
470 1189-1211 UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA
471
472 973-995 AAUGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU
473
474 983-1005 CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG
475
476 1185-1207 UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU
477
478 2353-2375 AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA
479
480 875-897 CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU
481
482 360-378 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
483
484 428-446 CAAAACUGCCCCAAGAUGA UCAUCUUGGGGCAGUUUUG
485
486 873-891 CAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUG
487
488 874-892 AGAAAGAGUGUCUCAUCUU AAGAUGAGACACUCUUUCU
489
490 877-895 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU
491
492 1295-1313 CUCUUCACCCUGGCUAAGA UCUUAGCCAGGGUGAAGAG
493
494 1296-1314 UCUUCACCCUGGCUAAGAU AUCUUAGCCAGGGUGAAGA
495
496 1299-1317 UCACCCUGGCUAAGAUGAU AUCAUCUUAGCCAGGGUGA
497
498 1347-1365 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
499
500 1355-1373 GCCUCCAUGAUCCAAGGGA UCCCUUGGAUCAUGGAGGC
501
502 1356-1374 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
503
504 1357-1375 CUCCAUGAUCCAAGGGAUU AAUCCCUUGGAUCAUGGAG
505
506 1631-1649 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
507
508 1634-1652 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
509
510 1635-1653 UGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCA
511
512 1791-1809 CCCUGGAGUCUGUGCGGAU AUCCGCACAGACUCCAGGG
513
514 1794-1812 UGGAGUCUGUGCGGAUCCU AGGAUCCGCACAGACUCCA
515
516 1921-1939 CAUCAUCCCUGUGCGGGUU AACCCGCACAGGGAUGAUG
517
518 359-377 UGCCCAUUCUUAUCCCGAA UUCGGGAUAAGAAUGGGCA
519
520 362-380 CCAUUCUUAUCCCGAGUCA UGACUCGGGAUAAGAAUGG
521
522 363-381 CAUUCUUAUCCCGAGUCCA UGGACUCGGGAUAAGAAUG
523
524 434-452 UGCCCCAAGAUGAUGGAAU AUUCCAUCAUCUUGGGGCA
525
526 872-890 CCAGAAAGAGUGUCUCAUA UAUGAGACACUCUUUCUGG
527
528 875-893 GAAAGAGUGUCUCAUCUUA UAAGAUGAGACACUCUUUC
529
530 1112-1130 CACCCACGGGUGUGUGGGA UCCCACACACCCGUGGGUG
531
532 1113-1131 ACCCACGGGUGUGUGGGGA UCCCCACACACCCGUGGGU
533
534 1297-1315 CUUCACCCUGGCUAAGAUA UAUCUUAGCCAGGGUGAAG
535
536 1300-1318 CACCCUGGCUAAGAUGAUA UAUCAUCUUAGCCAGGGUG
537
538 1301-1319 ACCCUGGCUAAGAUGAUGA UCAUCAUCUUAGCCAGGGU
539
540 1348-1366 GAACCAUGCCUCCAUGAUA UAUCAUGGAGGCAUGGUUC
541
542 1481-1499 GAAACUGUCCAUUCAAUGA UCAUUGAAUGGACAGUUUC
543
544 1786-1804 UGGAGCCCUGGAGUCUGUA UACAGACUCCAGGGCUCCA
545
546 1795-1813 GGAGUCUGUGCGGAUCCUA UAGGAUCCGCACAGACUCC
547
548 1919-1937 CACAUCAUCCCUGUGCGGA UCCGCACAGGGAUGAUGUG
549
550 1922-1940 AUCAUCCCUGUGCGGGUUA UAACCCGCACAGGGAUGAU
Ejemplo 8. ARNip humanos
Se generaron ARNip humanos nonadecaméricos adicionales. En la Tabla 9 se proporcionan las secuencias de estos ARNip. Estos ARNip se pueden evaluar para determinar su eficacia utilizando métodos descritos en la presente y/o métodos conocidos en la técnica.
Tabla 9: Secuencias sentido y antisentido de ARNip de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Posición en el transcrito NM_ 000688.4 Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
553
554 4-22 UAUAUUAAGGCGCCGGCGA UCGCCGGCGCCUUAAUAUA
555
556 5-23 AUAUUAAGGCGCCGGCGAU AUCGCCGGCGCCUUAAUAU
557
558 6-24 UAUUAAGGCGCCGGCGAUC GAUCGCCGGCGCCUUAAUA
559
560 7-25 AUUAAGGCGCCGGCGAUCG CGAUCGCCGGCGCCUUAAU
561
562 8-26 UUAAGGCGCCGGCGAUCGC GCGAUCGCCGGCGCCUUAA
563
564 9-27 UAAGGCGCCGGCGAUCGCG CGCGAUCGCCGGCGCCUUA
565
566 10-28 AAGGCGCCGGCGAUCGCGG CCGCGAUCGCCGGCGCCUU
567
568 11-29 AGGCGCCGGCGAUCGCGGC GCCGCGAUCGCCGGCGCCU
569
570 12-30 GGCGCCGGCGAUCGCGGCC GGCCGCGAUCGCCGGCGCC
571
572 13-31 GCGCCGGCGAUCGCGGCCU AGGCCGCGAUCGCCGGCGC
573
574 14-32 CGCCGGCGAUCGCGGCCUG CAGGCCGCGAUCGCCGGCG
575
576 81-99 CUUGAGUGCCCGCCUCCUU AAGGAGGCGGGCACUCAAG
577
578 82-100 UUGAGUGCCCGCCUCCUUC GAAGGAGGCGGGCACUCAA
579
580 83-101 UGAGUGCCCGCCUCCUUCG CGAAGGAGGCGGGCACUCA
581
582 84-102 GAGUGCCCGCCUCCUUCGC GCGAAGGAGGCGGGCACUC
583
584 85-103 AGUGCCCGCCUCCUUCGCC GGCGAAGGAGGCGGGCACU
585
586 86-104 GUGCCCGCCUCCUUCGCCG CGGCGAAGGAGGCGGGCAC
587
588 87-105 UGCCCGCCUCCUUCGCCGC GCGGCGAAGGAGGCGGGCA
589
590 88-106 GCCCGCCUCCUUCGCCGCC GGCGGCGAAGGAGGCGGGC
591
592 89-107 CCCGCCUCCUUCGCCGCCG CGGCGGCGAAGGAGGCGGG
593
594 90-108 CCGCCUCCUUCGCCGCCGC GCGGCGGCGAAGGAGGCGG
595
596 91-109 CGCCUCCUUCGCCGCCGCC GGCGGCGGCGAAGGAGGCG
597
598 92-110 GCCUCCUUCGCCGCCGCCU AGGCGGCGGCGAAGGAGGC
599
600 93-111 CCUCCUUCGCCGCCGCCUC GAGGCGGCGGCGAAGGAGG
601
602 356-374 CGCUGCCCAUUCUUAUCCC GGGAUAAGAAUGGGCAGCG
603
604 357-375 GCUGCCCAUUCUUAUCCCG CGGGAUAAGAAUGGGCAGC
605
606 359-377 UGCCCAUUCUUAUCCCGAG CUCGGGAUAAGAAUGGGCA
607
608 361-379 CCCAUUCUUAUCCCGAGUC GACUCGGGAUAAGAAUGGG
609
610 362-380 CCAUUCUUAUCCCGAGUCC GGACUCGGGAUAAGAAUGG
611
612 363-381 CAUUCUUAUCCCGAGUCCC GGGACUCGGGAUAAGAAUG
613
614 364-382 AUUCUUAUCCCGAGUCCCC GGGGACUCGGGAUAAGAAU
615
616 365-383 UUCUUAUCCCGAGUCCCCC GGGGGACUCGGGAUAAGAA
617
618 366-384 UCUUAUCCCGAGUCCCCCA UGGGGGACUCGGGAUAAGA
619
620 367-385 CUUAUCCCGAGUCCCCCAG CUGGGGGACUCGGGAUAAG
621
622 368-386 UUAUCCCGAGUCCCCCAGG CCUGGGGGACUCGGGAUAA
623
624 369-387 UAUCCCGAGUCCCCCAGGC GCCUGGGGGACUCGGGAUA
625
626 370-388 AUCCCGAGUCCCCCAGGCC GGCCUGGGGGACUCGGGAU
627
628 371-389 UCCCGAGUCCCCCAGGCCU AGGCCUGGGGGACUCGGGA
629
630 372-390 CCCGAGUCCCCCAGGCCUU AAGGCCUGGGGGACUCGGG
631
632 373-391 CCGAGUCCCCCAGGCCUUU AAAGGCCUGGGGGACUCGG
633
634 374-392 CGAGUCCCCCAGGCCUUUC GAAAGGCCUGGGGGACUCG
635
636 375-393 GAGUCCCCCAGGCCUUUCU AGAAAGGCCUGGGGGACUC
637
638 376-394 AGUCCCCCAGGCCUUUCUG CAGAAAGGCCUGGGGGACU
639
640 377-395 GUCCCCCAGGCCUUUCUGC GCAGAAAGGCCUGGGGGAC
641
642 378-396 UCCCCCAGGCCUUUCUGCA UGCAGAAAGGCCUGGGGGA
643
644 379-397 CCCCCAGGCCUUUCUGCAG CUGCAGAAAGGCCUGGGGG
645
646 380-398 CCCCAGGCCUUUCUGCAGA UCUGCAGAAAGGCCUGGGG
647
648 381-399 CCCAGGCCUUUCUGCAGAA UUCUGCAGAAAGGCCUGGG
649
650 382-400 CCAGGCCUUUCUGCAGAAA UUUCUGCAGAAAGGCCUGG
651
652 383-401 CAGGCCUUUCUGCAGAAAG CUUUCUGCAGAAAGGCCUG
653
654 384-402 AGGCCUUUCUGCAGAAAGC GCUUUCUGCAGAAAGGCCU
655
656 385-403 GGCCUUUCUGCAGAAAGCA UGCUUUCUGCAGAAAGGCC
657
658 386-404 GCCUUUCUGCAGAAAGCAG CUGCUUUCUGCAGAAAGGC
659
660 387-405 CCUUUCUGCAGAAAGCAGG CCUGCUUUCUGCAGAAAGG
661
662 388-406 CUUUCUGCAGAAAGCAGGC GCCUGCUUUCUGCAGAAAG
663
664 389-407 UUUCUGCAGAAAGCAGGCA UGCCUGCUUUCUGCAGAAA
665
666 390-408 UUCUGCAGAAAGCAGGCAA UUGCCUGCUUUCUGCAGAA
667
668 391-409 UCUGCAGAAAGCAGGCAAA UUUGCCUGCUUUCUGCAGA
669
670 392-410 CUGCAGAAAGCAGGCAAAU AUUUGCCUGCUUUCUGCAG
671
672 393-411 UGCAGAAAGCAGGCAAAUC GAUUUGCCUGCUUUCUGCA
673
674 394-412 GCAGAAAGCAGGCAAAUCU AGAUUUGCCUGCUUUCUGC
675
676 395-413 CAGAAAGCAGGCAAAUCUC GAGAUUUGCCUGCUUUCUG
677
678 396-414 AGAAAGCAGGCAAAUCUCU AGAGAUUUGCCUGCUUUCU
679
680 397-415 GAAAGCAGGCAAAUCUCUG CAGAGAUUUGCCUGCUUUC
681
682 398-416 AAAGCAGGCAAAUCUCUGU ACAGAGAUUUGCCUGCUUU
683
684 399-417 AAGCAGGCAAAUCUCUGUU AACAGAGAUUUGCCUGCUU
685
686 400-418 AGCAGGCAAAUCUCUGUUG CAACAGAGAUUUGCCUGCU
687
688 401-419 GCAGGCAAAUCUCUGUUGU ACAACAGAGAUUUGCCUGC
689
690 402-420 CAGGCAAAUCUCUGUUGUU AACAACAGAGAUUUGCCUG
691
692 403-421 AGGCAAAUCUCUGUUGUUC GAACAACAGAGAUUUGCCU
693
694 405-423 GCAAAUCUCUGUUGUUCUA UAGAACAACAGAGAUUUGC
695
696 406-424 CAAAUCUCUGUUGUUCUAU AUAGAACAACAGAGAUUUG
697
698 407-425 AAAUCUCUGUUGUUCUAUG CAUAGAACAACAGAGAUUU
699
700 408-426 AAUCUCUGUUGUUCUAUGC GCAUAGAACAACAGAGAUU
701
702 409-427 AUCUCUGUUGUUCUAUGCC GGCAUAGAACAACAGAGAU
703
704 410-428 UCUCUGUUGUUCUAUGCCC GGGCAUAGAACAACAGAGA
705
706 411-429 CUCUGUUGUUCUAUGCCCA UGGGCAUAGAACAACAGAG
707
708 412-430 UCUGUUGUUCUAUGCCCAA UUGGGCAUAGAACAACAGA
709
710 413-431 CUGUUGUUCUAUGCCCAAA UUUGGGCAUAGAACAACAG
711
712 414-432 UGUUGUUCUAUGCCCAAAA UUUUGGGCAUAGAACAACA
713
714 415-433 GUUGUUCUAUGCCCAAAAC GUUUUGGGCAUAGAACAAC
715
716 416-434 UUGUUCUAUGCCCAAAACU AGUUUUGGGCAUAGAACAA
717
718 417-435 UGUUCUAUGCCCAAAACUG CAGUUUUGGGCAUAGAACA
719
720 418-436 GUUCUAUGCCCAAAACUGC GCAGUUUUGGGCAUAGAAC
721
722 419-437 UUCUAUGCCCAAAACUGCC GGCAGUUUUGGGCAUAGAA
723
724 420-438 UCUAUGCCCAAAACUGCCC GGGCAGUUUUGGGCAUAGA
725
726 421-439 CUAUGCCCAAAACUGCCCC GGGGCAGUUUUGGGCAUAG
727
728 422-440 UAUGCCCAAAACUGCCCCA UGGGGCAGUUUUGGGCAUA
729
730 423-441 AUGCCCAAAACUGCCCCAA UUGGGGCAGUUUUGGGCAU
731
732 424-442 UGCCCAAAACUGCCCCAAG CUUGGGGCAGUUUUGGGCA
733
734 425-443 GCCCAAAACUGCCCCAAGA UCUUGGGGCAGUUUUGGGC
735
736 426-444 CCCAAAACUGCCCCAAGAU AUCUUGGGGCAGUUUUGGG
737
738 427-445 CCAAAACUGCCCCAAGAUG CAUCUUGGGGCAGUUUUGG
739
740 429-447 AAAACUGCCCCAAGAUGAU AUCAUCUUGGGGCAGUUUU
741
742 430-448 AAACUGCCCCAAGAUGAUG CAUCAUCUUGGGGCAGUUU
743
744 431-449 AACUGCCCCAAGAUGAUGG CCAUCAUCUUGGGGCAGUU
745
746 432-450 ACUGCCCCAAGAUGAUGGA UCCAUCAUCUUGGGGCAGU
747
748 433-451 CUGCCCCAAGAUGAUGGAA UUCCAUCAUCUUGGGGCAG
749
750 434-452 UGCCCCAAGAUGAUGGAAG CUUCCAUCAUCUUGGGGCA
751
752 435-453 GCCCCAAGAUGAUGGAAGU ACUUCCAUCAUCUUGGGGC
753
754 437-455 CCCAAGAUGAUGGAAGUUG CAACUUCCAUCAUCUUGGG
755
756 438-456 CCAAGAUGAUGGAAGUUGG CCAACUUCCAUCAUCUUGG
757
758 439-457 CAAGAUGAUGGAAGUUGGG CCCAACUUCCAUCAUCUUG
759
760 440-458 AAGAUGAUGGAAGUUGGGG CCCCAACUUCCAUCAUCUU
761
762 441-459 AGAUGAUGGAAGUUGGGGC GCCCCAACUUCCAUCAUCU
763
764 442-460 GAUGAUGGAAGUUGGGGCC GGCCCCAACUUCCAUCAUC
765
766 443-461 AUGAUGGAAGUUGGGGCCA UGGCCCCAACUUCCAUCAU
767
768 444-462 UGAUGGAAGUUGGGGCCAA UUGGCCCCAACUUCCAUCA
769
770 445-463 GAUGGAAGUUGGGGCCAAG CUUGGCCCCAACUUCCAUC
771
772 446-464 AUGGAAGUUGGGGCCAAGC GCUUGGCCCCAACUUCCAU
773
774 447-465 UGGAAGUUGGGGCCAAGCC GGCUUGGCCCCAACUUCCA
775
776 448-466 GGAAGUUGGGGCCAAGCCA UGGCUUGGCCCCAACUUCC
777
778 449-467 GAAGUUGGGGCCAAGCCAG CUGGCUUGGCCCCAACUUC
779
780 450-468 AAGUUGGGGCCAAGCCAGC GCUGGCUUGGCCCCAACUU
781
782 451-469 AGUUGGGGCCAAGCCAGCC GGCUGGCUUGGCCCCAACU
783
784 452-470 GUUGGGGCCAAGCCAGCCC GGGCUGGCUUGGCCCCAAC
785
786 453-471 UUGGGGCCAAGCCAGCCCC GGGGCUGGCUUGGCCCCAA
787
788 454-472 UGGGGCCAAGCCAGCCCCU AGGGGCUGGCUUGGCCCCA
789
790 455-473 GGGGCCAAGCCAGCCCCUC GAGGGGCUGGCUUGGCCCC
791
792 456-474 GGGCCAAGCCAGCCCCUCG CGAGGGGCUGGCUUGGCCC
793
794 457-475 GGCCAAGCCAGCCCCUCGG CCGAGGGGCUGGCUUGGCC
795
796 458-476 GCCAAGCCAGCCCCUCGGG CCCGAGGGGCUGGCUUGGC
797
798 459-477 CCAAGCCAGCCCCUCGGGC GCCCGAGGGGCUGGCUUGG
799
800 460-478 CAAGCCAGCCCCUCGGGCA UGCCCGAGGGGCUGGCUUG
801
802 461-479 AAGCCAGCCCCUCGGGCAU AUGCCCGAGGGGCUGGCUU
803
804 462-480 AGCCAGCCCCUCGGGCAUU AAUGCCCGAGGGGCUGGCU
805
806 463-481 GCCAGCCCCUCGGGCAUUG CAAUGCCCGAGGGGCUGGC
807
808 464-482 CCAGCCCCUCGGGCAUUGU ACAAUGCCCGAGGGGCUGG
809
810 465-483 CAGCCCCUCGGGCAUUGUC GACAAUGCCCGAGGGGCUG
811
812 466-484 AGCCCCUCGGGCAUUGUCC GGACAAUGCCCGAGGGGCU
813
814 467-485 GCCCCUCGGGCAUUGUCCA UGGACAAUGCCCGAGGGGC
815
816 468-486 CCCCUCGGGCAUUGUCCAC GUGGACAAUGCCCGAGGGG
817
818 469-487 CCCUCGGGCAUUGUCCACU AGUGGACAAUGCCCGAGGG
819
820 470-488 CCUCGGGCAUUGUCCACUG CAGUGGACAAUGCCCGAGG
821
822 471-489 CUCGGGCAUUGUCCACUGC GCAGUGGACAAUGCCCGAG
823
824 472-490 UCGGGCAUUGUCCACUGCA UGCAGUGGACAAUGCCCGA
825
826 473-491 CGGGCAUUGUCCACUGCAG CUGCAGUGGACAAUGCCCG
827
828 474-492 GGGCAUUGUCCACUGCAGC GCUGCAGUGGACAAUGCCC
829
830 475-493 GGCAUUGUCCACUGCAGCA UGCUGCAGUGGACAAUGCC
831
832 476-494 GCAUUGUCCACUGCAGCAG CUGCUGCAGUGGACAAUGC
833
834 477-495 CAUUGUCCACUGCAGCAGU ACUGCUGCAGUGGACAAUG
835
836 478-496 AUUGUCCACUGCAGCAGUA UACUGCUGCAGUGGACAAU
837
838 479-497 UUGUCCACUGCAGCAGUAC GUACUGCUGCAGUGGACAA
839
840 480-498 UGUCCACUGCAGCAGUACA UGUACUGCUGCAGUGGACA
841
842 481-499 GUCCACUGCAGCAGUACAC GUGUACUGCUGCAGUGGAC
843
844 482-500 UCCACUGCAGCAGUACACU AGUGUACUGCUGCAGUGGA
845
846 483-501 CCACUGCAGCAGUACACUA UAGUGUACUGCUGCAGUGG
847
848 484-502 CACUGCAGCAGUACACUAC GUAGUGUACUGCUGCAGUG
849
850 485-503 ACUGCAGCAGUACACUACC GGUAGUGUACUGCUGCAGU
851
852 486-504 CUGCAGCAGUACACUACCA UGGUAGUGUACUGCUGCAG
853
854 487-505 UGCAGCAGUACACUACCAA UUGGUAGUGUACUGCUGCA
855
856 488-506 GCAGCAGUACACUACCAAC GUUGGUAGUGUACUGCUGC
857
858 490-508 AGCAGUACACUACCAACAG CUGUUGGUAGUGUACUGCU
859
860 491-509 GCAGUACACUACCAACAGA UCUGUUGGUAGUGUACUGC
861
862 492-510 CAGUACACUACCAACAGAU AUCUGUUGGUAGUGUACUG
863
864 493-511 AGUACACUACCAACAGAUC GAUCUGUUGGUAGUGUACU
865
866 494-512 GUACACUACCAACAGAUCA UGAUCUGUUGGUAGUGUAC
867
868 495-513 UACACUACCAACAGAUCAA UUGAUCUGUUGGUAGUGUA
869
870 496-514 ACACUACCAACAGAUCAAA UUUGAUCUGUUGGUAGUGU
871
872 497-515 CACUACCAACAGAUCAAAG CUUUGAUCUGUUGGUAGUG
873
874 498-516 ACUACCAACAGAUCAAAGA UCUUUGAUCUGUUGGUAGU
875
876 499-517 CUACCAACAGAUCAAAGAA UUCUUUGAUCUGUUGGUAG
877
878 500-518 UACCAACAGAUCAAAGAAA UUUCUUUGAUCUGUUGGUA
879
880 501-519 ACCAACAGAUCAAAGAAAC GUUUCUUUGAUCUGUUGGU
881
882 502-520 CCAACAGAUCAAAGAAACC GGUUUCUUUGAUCUGUUGG
883
884 523-541 UCCGGCCAGUGAGAAAGAC GUCUUUCUCACUGGCCGGA
885
886 524-542 CCGGCCAGUGAGAAAGACA UGUCUUUCUCACUGGCCGG
887
888 525-543 CGGCCAGUGAGAAAGACAA UUGUCUUUCUCACUGGCCG
889
890 526-544 GGCCAGUGAGAAAGACAAA UUUGUCUUUCUCACUGGCC
891
892 527-545 GCCAGUGAGAAAGACAAAA UUUUGUCUUUCUCACUGGC
893
894 528-546 CCAGUGAGAAAGACAAAAC GUUUUGUCUUUCUCACUGG
895
896 529-547 CAGUGAGAAAGACAAAACU AGUUUUGUCUUUCUCACUG
897
898 530-548 AGUGAGAAAGACAAAACUG CAGUUUUGUCUUUCUCACU
899
900 531-549 GUGAGAAAGACAAAACUGC GCAGUUUUGUCUUUCUCAC
901
902 570-588 CUCCUGAUGGAUCCCAGCA UGCUGGGAUCCAUCAGGAG
903
904 571-589 UCCUGAUGGAUCCCAGCAG CUGCUGGGAUCCAUCAGGA
905
906 572-590 CCUGAUGGAUCCCAGCAGA UCUGCUGGGAUCCAUCAGG
907
908 573-591 CUGAUGGAUCCCAGCAGAG CUCUGCUGGGAUCCAUCAG
909
910 574-592 UGAUGGAUCCCAGCAGAGU ACUCUGCUGGGAUCCAUCA
911
912 575-593 GAUGGAUCCCAGCAGAGUC GACUCUGCUGGGAUCCAUC
913
914 576-594 AUGGAUCCCAGCAGAGUCC GGACUCUGCUGGGAUCCAU
915
916 577-595 UGGAUCCCAGCAGAGUCCA UGGACUCUGCUGGGAUCCA
917
918 578-596 GGAUCCCAGCAGAGUCCAG CUGGACUCUGCUGGGAUCC
919
920 579-597 GAUCCCAGCAGAGUCCAGA UCUGGACUCUGCUGGGAUC
921
922 580-598 AUCCCAGCAGAGUCCAGAU AUCUGGACUCUGCUGGGAU
923
924 581-599 UCCCAGCAGAGUCCAGAUG CAUCUGGACUCUGCUGGGA
925
926 582-600 CCCAGCAGAGUCCAGAUGG CCAUCUGGACUCUGCUGGG
927
928 583-601 CCAGCAGAGUCCAGAUGGC GCCAUCUGGACUCUGCUGG
929
930 584-602 CAGCAGAGUCCAGAUGGCA UGCCAUCUGGACUCUGCUG
931
932 585-603 AGCAGAGUCCAGAUGGCAC GUGCCAUCUGGACUCUGCU
933
934 586-604 GCAGAGUCCAGAUGGCACA UGUGCCAUCUGGACUCUGC
935
936 587-605 CAGAGUCCAGAUGGCACAC GUGUGCCAUCUGGACUCUG
937
938 588-606 AGAGUCCAGAUGGCACACA UGUGUGCCAUCUGGACUCU
939
940 589-607 GAGUCCAGAUGGCACACAG CUGUGUGCCAUCUGGACUC
941
942 590-608 AGUCCAGAUGGCACACAGC GCUGUGUGCCAUCUGGACU
943
944 591-609 GUCCAGAUGGCACACAGCU AGCUGUGUGCCAUCUGGAC
945
946 592-610 UCCAGAUGGCACACAGCUU AAGCUGUGUGCCAUCUGGA
947
948 593-611 CCAGAUGGCACACAGCUUC GAAGCUGUGUGCCAUCUGG
949
950 594-612 CAGAUGGCACACAGCUUCC GGAAGCUGUGUGCCAUCUG
951
952 595-613 AGAUGGCACACAGCUUCCG CGGAAGCUGUGUGCCAUCU
953
954 596-614 GAUGGCACACAGCUUCCGU ACGGAAGCUGUGUGCCAUC
955
956 597-615 AUGGCACACAGCUUCCGUC GACGGAAGCUGUGUGCCAU
957
958 598-616 UGGCACACAGCUUCCGUCU AGACGGAAGCUGUGUGCCA
959
960 599-617 GGCACACAGCUUCCGUCUG CAGACGGAAGCUGUGUGCC
961
962 600-618 GCACACAGCUUCCGUCUGG CCAGACGGAAGCUGUGUGC
963
964 601-619 CACACAGCUUCCGUCUGGA UCCAGACGGAAGCUGUGUG
965
966 602-620 ACACAGCUUCCGUCUGGAC GUCCAGACGGAAGCUGUGU
967
968 603-621 CACAGCUUCCGUCUGGACA UGUCCAGACGGAAGCUGUG
969
970 604-622 ACAGCUUCCGUCUGGACAC GUGUCCAGACGGAAGCUGU
971
972 605-623 CAGCUUCCGUCUGGACACC GGUGUCCAGACGGAAGCUG
973
974 606-624 AGCUUCCGUCUGGACACCC GGGUGUCCAGACGGAAGCU
975
976 607-625 GCUUCCGUCUGGACACCCC GGGGUGUCCAGACGGAAGC
977
978 608-626 CUUCCGUCUGGACACCCCU AGGGGUGUCCAGACGGAAG
979
980 609-627 UUCCGUCUGGACACCCCUU AAGGGGUGUCCAGACGGAA
981
982 610-628 UCCGUCUGGACACCCCUUG CAAGGGGUGUCCAGACGGA
983
984 611-629 CCGUCUGGACACCCCUUGC GCAAGGGGUGUCCAGACGG
985
986 612-630 CGUCUGGACACCCCUUGCC GGCAAGGGGUGUCCAGACG
987
988 613-631 GUCUGGACACCCCUUGCCU AGGCAAGGGGUGUCCAGAC
989
990 614-632 UCUGGACACCCCUUGCCUG CAGGCAAGGGGUGUCCAGA
991
992 615-633 CUGGACACCCCUUGCCUGC GCAGGCAAGGGGUGUCCAG
993
994 616-634 UGGACACCCCUUGCCUGCC GGCAGGCAAGGGGUGUCCA
995
996 617-635 GGACACCCCUUGCCUGCCA UGGCAGGCAAGGGGUGUCC
997
998 618-636 GACACCCCUUGCCUGCCAC GUGGCAGGCAAGGGGUGUC
999
1000 619-637 ACACCCCUUGCCUGCCACA UGUGGCAGGCAAGGGGUGU
1001
1002 620-638 CACCCCUUGCCUGCCACAA UUGUGGCAGGCAAGGGGUG
1003
1004 621-639 ACCCCUUGCCUGCCACAAG CUUGUGGCAGGCAAGGGGU
1005
1006 622-640 CCCCUUGCCUGCCACAAGC GCUUGUGGCAGGCAAGGGG
1007
1008 623-641 CCCUUGCCUGCCACAAGCC GGCUUGUGGCAGGCAAGGG
1009
1010 624-642 CCUUGCCUGCCACAAGCCA UGGCUUGUGGCAGGCAAGG
1011
1012 625-643 CUUGCCUGCCACAAGCCAG CUGGCUUGUGGCAGGCAAG
1013
1014 626-644 UUGCCUGCCACAAGCCAGG CCUGGCUUGUGGCAGGCAA
1015
1016 627-645 UGCCUGCCACAAGCCAGGG CCCUGGCUUGUGGCAGGCA
1017
1018 628-646 GCCUGCCACAAGCCAGGGC GCCCUGGCUUGUGGCAGGC
1019
1020 629-647 CCUGCCACAAGCCAGGGCA UGCCCUGGCUUGUGGCAGG
1021
1022 630-648 CUGCCACAAGCCAGGGCAC GUGCCCUGGCUUGUGGCAG
1023
1024 631-649 UGCCACAAGCCAGGGCACU AGUGCCCUGGCUUGUGGCA
1025
1026 632-650 GCCACAAGCCAGGGCACUG CAGUGCCCUGGCUUGUGGC
1027
1028 633-651 CCACAAGCCAGGGCACUGC GCAGUGCCCUGGCUUGUGG
1029
1030 634-652 CACAAGCCAGGGCACUGCA UGCAGUGCCCUGGCUUGUG
1031
1032 635-653 ACAAGCCAGGGCACUGCAA UUGCAGUGCCCUGGCUUGU
1033
1034 636-654 CAAGCCAGGGCACUGCAAG CUUGCAGUGCCCUGGCUUG
1035
1036 637-655 AAGCCAGGGCACUGCAAGC GCUUGCAGUGCCCUGGCUU
1037
1038 638-656 AGCCAGGGCACUGCAAGCA UGCUUGCAGUGCCCUGGCU
1039
1040 639-657 GCCAGGGCACUGCAAGCAA UUGCUUGCAGUGCCCUGGC
1041
1042 640-658 CCAGGGCACUGCAAGCAAA UUUGCUUGCAGUGCCCUGG
1043
1044 641-659 CAGGGCACUGCAAGCAAAU AUUUGCUUGCAGUGCCCUG
1045
1046 642-660 AGGGCACUGCAAGCAAAUG CAUUUGCUUGCAGUGCCCU
1047
1048 643-661 GGGCACUGCAAGCAAAUGC GCAUUUGCUUGCAGUGCCC
1049
1050 644-662 GGCACUGCAAGCAAAUGCC GGCAUUUGCUUGCAGUGCC
1051
1052 645-663 GCACUGCAAGCAAAUGCCC GGGCAUUUGCUUGCAGUGC
1053
1054 647-665 ACUGCAAGCAAAUGCCCUU AAGGGCAUUUGCUUGCAGU
1055
1056 648-666 CUGCAAGCAAAUGCCCUUU AAAGGGCAUUUGCUUGCAG
1057
1058 649-667 UGCAAGCAAAUGCCCUUUC GAAAGGGCAUUUGCUUGCA
1059
1060 650-668 GCAAGCAAAUGCCCUUUCC GGAAAGGGCAUUUGCUUGC
1061
1062 651-669 CAAGCAAAUGCCCUUUCCU AGGAAAGGGCAUUUGCUUG
1063
1064 652-670 AAGCAAAUGCCCUUUCCUG CAGGAAAGGGCAUUUGCUU
1065
1066 653-671 AGCAAAUGCCCUUUCCUGG CCAGGAAAGGGCAUUUGCU
1067
1068 654-672 GCAAAUGCCCUUUCCUGGC GCCAGGAAAGGGCAUUUGC
1069
1070 655-673 CAAAUGCCCUUUCCUGGCA UGCCAGGAAAGGGCAUUUG
1071
1072 656-674 AAAUGCCCUUUCCUGGCAG CUGCCAGGAAAGGGCAUUU
1073
1074 657-675 AAUGCCCUUUCCUGGCAGC GCUGCCAGGAAAGGGCAUU
1075
1076 658-676 AUGCCCUUUCCUGGCAGCA UGCUGCCAGGAAAGGGCAU
1077
1078 659-677 UGCCCUUUCCUGGCAGCAC GUGCUGCCAGGAAAGGGCA
1079
1080 660-678 GCCCUUUCCUGGCAGCACA UGUGCUGCCAGGAAAGGGC
1081
1082 661-679 CCCUUUCCUGGCAGCACAG CUGUGCUGCCAGGAAAGGG
1083
1084 662-680 CCUUUCCUGGCAGCACAGA UCUGUGCUGCCAGGAAAGG
1085
1086 663-681 CUUUCCUGGCAGCACAGAU AUCUGUGCUGCCAGGAAAG
1087
1088 664-682 UUUCCUGGCAGCACAGAUG CAUCUGUGCUGCCAGGAAA
1089
1090 665-683 UUCCUGGCAGCACAGAUGA UCAUCUGUGCUGCCAGGAA
1091
1092 666-684 UCCUGGCAGCACAGAUGAA UUCAUCUGUGCUGCCAGGA
1093
1094 667-685 CCUGGCAGCACAGAUGAAU AUUCAUCUGUGCUGCCAGG
1095
1096 668-686 CUGGCAGCACAGAUGAAUC GAUUCAUCUGUGCUGCCAG
1097
1098 670-688 GGCAGCACAGAUGAAUCAG CUGAUUCAUCUGUGCUGCC
1099
1100 672-690 CAGCACAGAUGAAUCAGAG CUCUGAUUCAUCUGUGCUG
1101
1102 692-710 GGCAGCAGUGUCUUCUGCA UGCAGAAGACACUGCUGCC
1103
1104 693-711 GCAGCAGUGUCUUCUGCAA UUGCAGAAGACACUGCUGC
1105
1106 694-712 CAGCAGUGUCUUCUGCAAA UUUGCAGAAGACACUGCUG
1107
1108 695-713 AGCAGUGUCUUCUGCAAAG CUUUGCAGAAGACACUGCU
1109
1110 696-714 GCAGUGUCUUCUGCAAAGC GCUUUGCAGAAGACACUGC
1111
1112 697-715 CAGUGUCUUCUGCAAAGCC GGCUUUGCAGAAGACACUG
1113
1114 698-716 AGUGUCUUCUGCAAAGCCA UGGCUUUGCAGAAGACACU
1115
1116 699-717 GUGUCUUCUGCAAAGCCAG CUGGCUUUGCAGAAGACAC
1117
1118 700-718 UGUCUUCUGCAAAGCCAGU ACUGGCUUUGCAGAAGACA
1119
1120 701-719 GUCUUCUGCAAAGCCAGUC GACUGGCUUUGCAGAAGAC
1121
1122 702-720 UCUUCUGCAAAGCCAGUCU AGACUGGCUUUGCAGAAGA
1123
1124 703-721 CUUCUGCAAAGCCAGUCUU AAGACUGGCUUUGCAGAAG
1125
1126 704-722 UUCUGCAAAGCCAGUCUUG CAAGACUGGCUUUGCAGAA
1127
1128 705-723 UCUGCAAAGCCAGUCUUGA UCAAGACUGGCUUUGCAGA
1129
1130 706-724 CUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAG
1131
1132 707-725 UGCAAAGCCAGUCUUGAGC GCUCAAGACUGGCUUUGCA
1133
1134 708-726 GCAAAGCCAGUCUUGAGCU AGCUCAAGACUGGCUUUGC
1135
1136 709-727 CAAAGCCAGUCUUGAGCUU AAGCUCAAGACUGGCUUUG
1137
1138 710-728 AAAGCCAGUCUUGAGCUUC GAAGCUCAAGACUGGCUUU
1139
1140 711-729 AAGCCAGUCUUGAGCUUCA UGAAGCUCAAGACUGGCUU
1141
1142 712-730 AGCCAGUCUUGAGCUUCAG CUGAAGCUCAAGACUGGCU
1143
1144 713-731 GCCAGUCUUGAGCUUCAGG CCUGAAGCUCAAGACUGGC
1145
1146 714-732 CCAGUCUUGAGCUUCAGGA UCCUGAAGCUCAAGACUGG
1147
1148 715-733 CAGUCUUGAGCUUCAGGAG CUCCUGAAGCUCAAGACUG
1149
1150 716-734 AGUCUUGAGCUUCAGGAGG CCUCCUGAAGCUCAAGACU
1151
1152 717-735 GUCUUGAGCUUCAGGAGGA UCCUCCUGAAGCUCAAGAC
1153
1154 718-736 UCUUGAGCUUCAGGAGGAU AUCCUCCUGAAGCUCAAGA
1155
1156 719-737 CUUGAGCUUCAGGAGGAUG CAUCCUCCUGAAGCUCAAG
1157
1158 720-738 UUGAGCUUCAGGAGGAUGU ACAUCCUCCUGAAGCUCAA
1159
1160 721-739 UGAGCUUCAGGAGGAUGUG CACAUCCUCCUGAAGCUCA
1161
1162 722-740 GAGCUUCAGGAGGAUGUGC GCACAUCCUCCUGAAGCUC
1163
1164 723-741 AGCUUCAGGAGGAUGUGCA UGCACAUCCUCCUGAAGCU
1165
1166 724-742 GCUUCAGGAGGAUGUGCAG CUGCACAUCCUCCUGAAGC
1167
1168 725-743 CUUCAGGAGGAUGUGCAGG CCUGCACAUCCUCCUGAAG
1169
1170 726-744 UUCAGGAGGAUGUGCAGGA UCCUGCACAUCCUCCUGAA
1171
1172 727-745 UCAGGAGGAUGUGCAGGAA UUCCUGCACAUCCUCCUGA
1173
1174 728-746 CAGGAGGAUGUGCAGGAAA UUUCCUGCACAUCCUCCUG
1175
1176 729-747 AGGAGGAUGUGCAGGAAAU AUUUCCUGCACAUCCUCCU
1177
1178 730-748 GGAGGAUGUGCAGGAAAUG CAUUUCCUGCACAUCCUCC
1179
1180 731-749 GAGGAUGUGCAGGAAAUGA UCAUUUCCUGCACAUCCUC
1181
1182 732-750 AGGAUGUGCAGGAAAUGAA UUCAUUUCCUGCACAUCCU
1183
1184 733-751 GGAUGUGCAGGAAAUGAAU AUUCAUUUCCUGCACAUCC
1185
1186 734-752 GAUGUGCAGGAAAUGAAUG CAUUCAUUUCCUGCACAUC
1187
1188 735-753 AUGUGCAGGAAAUGAAUGC GCAUUCAUUUCCUGCACAU
1189
1190 755-773 GUGAGGAAAGAGGUUGCUG CAGCAACCUCUUUCCUCAC
1191
1192 756-774 UGAGGAAAGAGGUUGCUGA UCAGCAACCUCUUUCCUCA
1193
1194 757-775 GAGGAAAGAGGUUGCUGAA UUCAGCAACCUCUUUCCUC
1195
1196 758-776 AGGAAAGAGGUUGCUGAAA UUUCAGCAACCUCUUUCCU
1197
1198 759-777 GGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCC
1199
1200 760-778 GAAAGAGGUUGCUGAAACC GGUUUCAGCAACCUCUUUC
1201
1202 761-779 AAAGAGGUUGCUGAAACCU AGGUUUCAGCAACCUCUUU
1203
1204 762-780 AAGAGGUUGCUGAAACCUC GAGGUUUCAGCAACCUCUU
1205
1206 763-781 AGAGGUUGCUGAAACCUCA UGAGGUUUCAGCAACCUCU
1207
1208 764-782 GAGGUUGCUGAAACCUCAG CUGAGGUUUCAGCAACCUC
1209
1210 765-783 AGGUUGCUGAAACCUCAGC GCUGAGGUUUCAGCAACCU
1211
1212 766-784 GGUUGCUGAAACCUCAGCA UGCUGAGGUUUCAGCAACC
1213
1214 787-805 CCCCAGUGUGGUUAGUGUG CACACUAACCACACUGGGG
1215
1216 791-809 AGUGUGGUUAGUGUGAAAA UUUUCACACUAACCACACU
1217
1218 792-810 GUGUGGUUAGUGUGAAAAC GUUUUCACACUAACCACAC
1219
1220 812-830 GAUGGAGGGGAUCCCAGUG CACUGGGAUCCCCUCCAUC
1221
1222 813-831 AUGGAGGGGAUCCCAGUGG CCACUGGGAUCCCCUCCAU
1223
1224 833-851 CUGCUGAAGAACUUCCAGG CCUGGAAGUUCUUCAGCAG
1225
1226 834-852 UGCUGAAGAACUUCCAGGA UCCUGGAAGUUCUUCAGCA
1227
1228 835-853 GCUGAAGAACUUCCAGGAC GUCCUGGAAGUUCUUCAGC
1229
1230 836-854 CUGAAGAACUUCCAGGACA UGUCCUGGAAGUUCUUCAG
1231
1232 837-855 UGAAGAACUUCCAGGACAU AUGUCCUGGAAGUUCUUCA
1233
1234 838-856 GAAGAACUUCCAGGACAUC GAUGUCCUGGAAGUUCUUC
1235
1236 839-857 AAGAACUUCCAGGACAUCA UGAUGUCCUGGAAGUUCUU
1237
1238 840-858 AGAACUUCCAGGACAUCAU AUGAUGUCCUGGAAGUUCU
1239
1240 841-859 GAACUUCCAGGACAUCAUG CAUGAUGUCCUGGAAGUUC
1241
1242 842-860 AACUUCCAGGACAUCAUGC GCAUGAUGUCCUGGAAGUU
1243
1244 843-861 ACUUCCAGGACAUCAUGCA UGCAUGAUGUCCUGGAAGU
1245
1246 844-862 CUUCCAGGACAUCAUGCAA UUGCAUGAUGUCCUGGAAG
1247
1248 845-863 UUCCAGGACAUCAUGCAAA UUUGCAUGAUGUCCUGGAA
1249
1250 846-864 UCCAGGACAUCAUGCAAAA UUUUGCAUGAUGUCCUGGA
1251
1252 847-865 CCAGGACAUCAUGCAAAAG CUUUUGCAUGAUGUCCUGG
1253
1254 848-866 CAGGACAUCAUGCAAAAGC GCUUUUGCAUGAUGUCCUG
1255
1256 849-867 AGGACAUCAUGCAAAAGCA UGCUUUUGCAUGAUGUCCU
1257
1258 850-868 GGACAUCAUGCAAAAGCAA UUGCUUUUGCAUGAUGUCC
1259
1260 851-869 GACAUCAUGCAAAAGCAAA UUUGCUUUUGCAUGAUGUC
1261
1262 852-870 ACAUCAUGCAAAAGCAAAG CUUUGCUUUUGCAUGAUGU
1263
1264 854-872 AUCAUGCAAAAGCAAAGAC GUCUUUGCUUUUGCAUGAU
1265
1266 855-873 UCAUGCAAAAGCAAAGACC GGUCUUUGCUUUUGCAUGA
1267
1268 856-874 CAUGCAAAAGCAAAGACCA UGGUCUUUGCUUUUGCAUG
1269
1270 857-875 AUGCAAAAGCAAAGACCAG CUGGUCUUUGCUUUUGCAU
1271
1272 858-876 UGCAAAAGCAAAGACCAGA UCUGGUCUUUGCUUUUGCA
1273
1274 859-877 GCAAAAGCAAAGACCAGAA UUCUGGUCUUUGCUUUUGC
1275
1276 860-878 CAAAAGCAAAGACCAGAAA UUUCUGGUCUUUGCUUUUG
1277
1278 861-879 AAAAGCAAAGACCAGAAAG CUUUCUGGUCUUUGCUUUU
1279
1280 862-880 AAAGCAAAGACCAGAAAGA UCUUUCUGGUCUUUGCUUU
1281
1282 863-881 AAGCAAAGACCAGAAAGAG CUCUUUCUGGUCUUUGCUU
1283
1284 864-882 AGCAAAGACCAGAAAGAGU ACUCUUUCUGGUCUUUGCU
1285
1286 865-883 GCAAAGACCAGAAAGAGUG CACUCUUUCUGGUCUUUGC
1287
1288 867-885 AAAGACCAGAAAGAGUGUC GACACUCUUUCUGGUCUUU
1289
1290 868-886 AAGACCAGAAAGAGUGUCU AGACACUCUUUCUGGUCUU
1291
1292 869-887 AGACCAGAAAGAGUGUCUC GAGACACUCUUUCUGGUCU
1293
1294 870-888 GACCAGAAAGAGUGUCUCA UGAGACACUCUUUCUGGUC
1295
1296 871-889 ACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGU
1297
1298 872-890 CCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGG
1299
1300 875-893 GAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUC
1301
1302 878-896 AGAGUGUCUCAUCUUCUUC GAAGAAGAUGAGACACUCU
1303
1304 879-897 GAGUGUCUCAUCUUCUUCA UGAAGAAGAUGAGACACUC
1305
1306 880-898 AGUGUCUCAUCUUCUUCAA UUGAAGAAGAUGAGACACU
1307
1308 881-899 GUGUCUCAUCUUCUUCAAG CUUGAAGAAGAUGAGACAC
1309
1310 882-900 UGUCUCAUCUUCUUCAAGA UCUUGAAGAAGAUGAGACA
1311
1312 883-901 GUCUCAUCUUCUUCAAGAU AUCUUGAAGAAGAUGAGAC
1313
1314 884-902 UCUCAUCUUCUUCAAGAUA UAUCUUGAAGAAGAUGAGA
1315
1316 886-904 UCAUCUUCUUCAAGAUAAC GUUAUCUUGAAGAAGAUGA
1317
1318 887-905 CAUCUUCUUCAAGAUAACU AGUUAUCUUGAAGAAGAUG
1319
1320 888-906 AUCUUCUUCAAGAUAACUU AAGUUAUCUUGAAGAAGAU
1321
1322 889-907 UCUUCUUCAAGAUAACUUG CAAGUUAUCUUGAAGAAGA
1323
1324 890-908 CUUCUUCAAGAUAACUUGC GCAAGUUAUCUUGAAGAAG
1325
1326 891-909 UUCUUCAAGAUAACUUGCC GGCAAGUUAUCUUGAAGAA
1327
1328 892-910 UCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGA
1329
1330 893-911 CUUCAAGAUAACUUGCCAA UUGGCAAGUUAUCUUGAAG
1331
1332 894-912 UUCAAGAUAACUUGCCAAA UUUGGCAAGUUAUCUUGAA
1333
1334 895-913 UCAAGAUAACUUGCCAAAA UUUUGGCAAGUUAUCUUGA
1335
1336 896-914 CAAGAUAACUUGCCAAAAU AUUUUGGCAAGUUAUCUUG
1337
1338 897-915 AAGAUAACUUGCCAAAAUC GAUUUUGGCAAGUUAUCUU
1339
1340 898-916 AGAUAACUUGCCAAAAUCU AGAUUUUGGCAAGUUAUCU
1341
1342 899-917 GAUAACUUGCCAAAAUCUG CAGAUUUUGGCAAGUUAUC
1343
1344 900-918 AUAACUUGCCAAAAUCUGU ACAGAUUUUGGCAAGUUAU
1345
1346 901-919 UAACUUGCCAAAAUCUGUU AACAGAUUUUGGCAAGUUA
1347
1348 902-920 AACUUGCCAAAAUCUGUUU AAACAGAUUUUGGCAAGUU
1349
1350 903-921 ACUUGCCAAAAUCUGUUUC GAAACAGAUUUUGGCAAGU
1351
1352 904-922 CUUGCCAAAAUCUGUUUCC GGAAACAGAUUUUGGCAAG
1353
1354 905-923 UUGCCAAAAUCUGUUUCCA UGGAAACAGAUUUUGGCAA
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1356 906-924 UGCCAAAAUCUGUUUCCAC GUGGAAACAGAUUUUGGCA
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1358 907-925 GCCAAAAUCUGUUUCCACU AGUGGAAACAGAUUUUGGC
1359
1360 908-926 CCAAAAUCUGUUUCCACUU AAGUGGAAACAGAUUUUGG
1361
1362 909-927 CAAAAUCUGUUUCCACUUU AAAGUGGAAACAGAUUUUG
1363
1364 910-928 AAAAUCUGUUUCCACUUUU AAAAGUGGAAACAGAUUUU
1365
1366 911-929 AAAUCUGUUUCCACUUUUC GAAAAGUGGAAACAGAUUU
1367
1368 912-930 AAUCUGUUUCCACUUUUCA UGAAAAGUGGAAACAGAUU
1369
1370 913-931 AUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAU
1371
1372 916-934 UGUUUCCACUUUUCAGUAU AUACUGAAAAGUGGAAACA
1373
1374 917-935 GUUUCCACUUUUCAGUAUG CAUACUGAAAAGUGGAAAC
1375
1376 918-936 UUUCCACUUUUCAGUAUGA UCAUACUGAAAAGUGGAAA
1377
1378 919-937 UUCCACUUUUCAGUAUGAU AUCAUACUGAAAAGUGGAA
1379
1380 920-938 UCCACUUUUCAGUAUGAUC GAUCAUACUGAAAAGUGGA
1381
1382 921-939 CCACUUUUCAGUAUGAUCG CGAUCAUACUGAAAAGUGG
1383
1384 925-943 UUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAA
1385
1386 929-947 CAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUG
1387
1388 930-948 AGUAUGAUCGUUUCUUUGA UCAAAGAAACGAUCAUACU
1389
1390 931-949 GUAUGAUCGUUUCUUUGAG CUCAAAGAAACGAUCAUAC
1391
1392 933-951 AUGAUCGUUUCUUUGAGAA UUCUCAAAGAAACGAUCAU
1393
1394 934-952 UGAUCGUUUCUUUGAGAAA UUUCUCAAAGAAACGAUCA
1395
1396 936-954 AUCGUUUCUUUGAGAAAAA UUUUUCUCAAAGAAACGAU
1397
1398 937-955 UCGUUUCUUUGAGAAAAAA UUUUUUCUCAAAGAAACGA
1399
1400 938-956 CGUUUCUUUGAGAAAAAAA UUUUUUUCUCAAAGAAACG
1401
1402 939-957 GUUUCUUUGAGAAAAAAAU AUUUUUUUCUCAAAGAAAC
1403
1404 940-958 UUUCUUUGAGAAAAAAAUU AAUUUUUUUCUCAAAGAAA
1405
1406 941-959 UUCUUUGAGAAAAAAAUUG CAAUUUUUUUCUCAAAGAA
1407
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1409
1410 943-961 CUUUGAGAAAAAAAUUGAU AUCAAUUUUUUUCUCAAAG
1411
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1415
1416 946-964 UGAGAAAAAAAUUGAUGAG CUCAUCAAUUUUUUUCUCA
1417
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1419
1420 948-966 AGAAAAAAAUUGAUGAGAA UUCUCAUCAAUUUUUUUCU
1421
1422 949-967 GAAAAAAAUUGAUGAGAAA UUUCUCAUCAAUUUUUUUC
1423
1424 950-968 AAAAAAAUUGAUGAGAAAA UUUUCUCAUCAAUUUUUUU
1425
1426 951-969 AAAAAAUUGAUGAGAAAAA UUUUUCUCAUCAAUUUUUU
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1428 952-970 AAAAAUUGAUGAGAAAAAG CUUUUUCUCAUCAAUUUUU
1429
1430 953-971 AAAAUUGAUGAGAAAAAGA UCUUUUUCUCAUCAAUUUU
1431
1432 954-972 AAAUUGAUGAGAAAAAGAA UUCUUUUUCUCAUCAAUUU
1433
1434 955-973 AAUUGAUGAGAAAAAGAAU AUUCUUUUUCUCAUCAAUU
1435
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1443
1444 960-978 AUGAGAAAAAGAAUGACCA UGGUCAUUCUUUUUCUCAU
1445
1446 961-979 UGAGAAAAAGAAUGACCAC GUGGUCAUUCUUUUUCUCA
1447
1448 962-980 GAGAAAAAGAAUGACCACA UGUGGUCAUUCUUUUUCUC
1449
1450 963-981 AGAAAAAGAAUGACCACAC GUGUGGUCAUUCUUUUUCU
1451
1452 964-982 GAAAAAGAAUGACCACACC GGUGUGGUCAUUCUUUUUC
1453
1454 965-983 AAAAAGAAUGACCACACCU AGGUGUGGUCAUUCUUUUU
1455
1456 966-984 AAAAGAAUGACCACACCUA UAGGUGUGGUCAUUCUUUU
1457
1458 967-985 AAAGAAUGACCACACCUAU AUAGGUGUGGUCAUUCUUU
1459
1460 968-986 AAGAAUGACCACACCUAUC GAUAGGUGUGGUCAUUCUU
1461
1462 969-987 AGAAUGACCACACCUAUCG CGAUAGGUGUGGUCAUUCU
1463
1464 970-988 GAAUGACCACACCUAUCGA UCGAUAGGUGUGGUCAUUC
1465
1466 971-989 AAUGACCACACCUAUCGAG CUCGAUAGGUGUGGUCAUU
1467
1468 972-990 AUGACCACACCUAUCGAGU ACUCGAUAGGUGUGGUCAU
1469
1470 976-994 CCACACCUAUCGAGUUUUU AAAAACUCGAUAGGUGUGG
1471
1472 977-995 CACACCUAUCGAGUUUUUA UAAAAACUCGAUAGGUGUG
1473
1474 978-996 ACACCUAUCGAGUUUUUAA UUAAAAACUCGAUAGGUGU
1475
1476 979-997 CACCUAUCGAGUUUUUAAA UUUAAAAACUCGAUAGGUG
1477
1478 980-998 ACCUAUCGAGUUUUUAAAA UUUUAAAAACUCGAUAGGU
1479
1480 981-999 CCUAUCGAGUUUUUAAAAC GUUUUAAAAACUCGAUAGG
1481
1482 982-1000 CUAUCGAGUUUUUAAAACU AGUUUUAAAAACUCGAUAG
1483
1484 983-1001 UAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUA
1485
1486 984-1002 AUCGAGUUUUUAAAACUGU ACAGUUUUAAAAACUCGAU
1487
1488 985-1003 UCGAGUUUUUAAAACUGUG CACAGUUUUAAAAACUCGA
1489
1490 986-1004 CGAGUUUUUAAAACUGUGA UCACAGUUUUAAAAACUCG
1491
1492 987-1005 GAGUUUUUAAAACUGUGAA UUCACAGUUUUAAAAACUC
1493
1494 988-1006 AGUUUUUAAAACUGUGAAC GUUCACAGUUUUAAAAACU
1495
1496 989-1007 GUUUUUAAAACUGUGAACC GGUUCACAGUUUUAAAAAC
1497
1498 990-1008 UUUUUAAAACUGUGAACCG CGGUUCACAGUUUUAAAAA
1499
1500 991-1009 UUUUAAAACUGUGAACCGG CCGGUUCACAGUUUUAAAA
1501
1502 992-1010 UUUAAAACUGUGAACCGGC GCCGGUUCACAGUUUUAAA
1503
1504 993-1011 UUAAAACUGUGAACCGGCG CGCCGGUUCACAGUUUUAA
1505
1506 994-1012 UAAAACUGUGAACCGGCGA UCGCCGGUUCACAGUUUUA
1507
1508 995-1013 AAAACUGUGAACCGGCGAG CUCGCCGGUUCACAGUUUU
1509
1510 996-1014 AAACUGUGAACCGGCGAGC GCUCGCCGGUUCACAGUUU
1511
1512 997-1015 AACUGUGAACCGGCGAGCA UGCUCGCCGGUUCACAGUU
1513
1514 998-1016 ACUGUGAACCGGCGAGCAC GUGCUCGCCGGUUCACAGU
1515
1516 999-1017 CUGUGAACCGGCGAGCACA UGUGCUCGCCGGUUCACAG
1517
1518 1000-1018 UGUGAACCGGCGAGCACAC GUGUGCUCGCCGGUUCACA
1519
1520 1001-1019 GUGAACCGGCGAGCACACA UGUGUGCUCGCCGGUUCAC
1521
1522 1002-1020 UGAACCGGCGAGCACACAU AUGUGUGCUCGCCGGUUCA
1523
1524 1003-1021 GAACCGGCGAGCACACAUC GAUGUGUGCUCGCCGGUUC
1525
1526 1004-1022 AACCGGCGAGCACACAUCU AGAUGUGUGCUCGCCGGUU
1527
1528 1005-1023 ACCGGCGAGCACACAUCUU AAGAUGUGUGCUCGCCGGU
1529
1530 1006-1024 CCGGCGAGCACACAUCUUC GAAGAUGUGUGCUCGCCGG
1531
1532 1007-1025 CGGCGAGCACACAUCUUCC GGAAGAUGUGUGCUCGCCG
1533
1534 1008-1026 GGCGAGCACACAUCUUCCC GGGAAGAUGUGUGCUCGCC
1535
1536 1028-1046 AUGGCAGAUGACUAUUCAG CUGAAUAGUCAUCUGCCAU
1537
1538 1030-1048 GGCAGAUGACUAUUCAGAC GUCUGAAUAGUCAUCUGCC
1539
1540 1031-1049 GCAGAUGACUAUUCAGACU AGUCUGAAUAGUCAUCUGC
1541
1542 1032-1050 CAGAUGACUAUUCAGACUC GAGUCUGAAUAGUCAUCUG
1543
1544 1033-1051 AGAUGACUAUUCAGACUCC GGAGUCUGAAUAGUCAUCU
1545
1546 1034-1052 GAUGACUAUUCAGACUCCC GGGAGUCUGAAUAGUCAUC
1547
1548 1035-1053 AUGACUAUUCAGACUCCCU AGGGAGUCUGAAUAGUCAU
1549
1550 1036-1054 UGACUAUUCAGACUCCCUC GAGGGAGUCUGAAUAGUCA
1551
1552 1037-1055 GACUAUUCAGACUCCCUCA UGAGGGAGUCUGAAUAGUC
1553
1554 1038-1056 ACUAUUCAGACUCCCUCAU AUGAGGGAGUCUGAAUAGU
1555
1556 1039-1057 CUAUUCAGACUCCCUCAUC GAUGAGGGAGUCUGAAUAG
1557
1558 1040-1058 UAUUCAGACUCCCUCAUCA UGAUGAGGGAGUCUGAAUA
1559
1560 1041-1059 AUUCAGACUCCCUCAUCAC GUGAUGAGGGAGUCUGAAU
1561
1562 1042-1060 UUCAGACUCCCUCAUCACC GGUGAUGAGGGAGUCUGAA
1563
1564 1043-1061 UCAGACUCCCUCAUCACCA UGGUGAUGAGGGAGUCUGA
1565
1566 1044-1062 CAGACUCCCUCAUCACCAA UUGGUGAUGAGGGAGUCUG
1567
1568 1045-1063 AGACUCCCUCAUCACCAAA UUUGGUGAUGAGGGAGUCU
1569
1570 1046-1064 GACUCCCUCAUCACCAAAA UUUUGGUGAUGAGGGAGUC
1571
1572 1047-1065 ACUCCCUCAUCACCAAAAA UUUUUGGUGAUGAGGGAGU
1573
1574 1048-1066 CUCCCUCAUCACCAAAAAG CUUUUUGGUGAUGAGGGAG
1575
1576 1049-1067 UCCCUCAUCACCAAAAAGC GCUUUUUGGUGAUGAGGGA
1577
1578 1050-1068 CCCUCAUCACCAAAAAGCA UGCUUUUUGGUGAUGAGGG
1579
1580 1070-1088 GUGUCAGUCUGGUGCAGUA UACUGCACCAGACUGACAC
1581
1582 1071-1089 UGUCAGUCUGGUGCAGUAA UUACUGCACCAGACUGACA
1583
1584 1072-1090 GUCAGUCUGGUGCAGUAAU AUUACUGCACCAGACUGAC
1585
1586 1073-1091 UCAGUCUGGUGCAGUAAUG CAUUACUGCACCAGACUGA
1587
1588 1074-1092 CAGUCUGGUGCAGUAAUGA UCAUUACUGCACCAGACUG
1589
1590 1075-1093 AGUCUGGUGCAGUAAUGAC GUCAUUACUGCACCAGACU
1591
1592 1078-1096 CUGGUGCAGUAAUGACUAC GUAGUCAUUACUGCACCAG
1593
1594 1079-1097 UGGUGCAGUAAUGACUACC GGUAGUCAUUACUGCACCA
1595
1596 1081-1099 GUGCAGUAAUGACUACCUA UAGGUAGUCAUUACUGCAC
1597
1598 1082-1100 UGCAGUAAUGACUACCUAG CUAGGUAGUCAUUACUGCA
1599
1600 1083-1101 GCAGUAAUGACUACCUAGG CCUAGGUAGUCAUUACUGC
1601
1602 1084-1102 CAGUAAUGACUACCUAGGA UCCUAGGUAGUCAUUACUG
1603
1604 1085-1103 AGUAAUGACUACCUAGGAA UUCCUAGGUAGUCAUUACU
1605
1606 1086-1104 GUAAUGACUACCUAGGAAU AUUCCUAGGUAGUCAUUAC
1607
1608 1087-1105 UAAUGACUACCUAGGAAUG CAUUCCUAGGUAGUCAUUA
1609
1610 1088-1106 AAUGACUACCUAGGAAUGA UCAUUCCUAGGUAGUCAUU
1611
1612 1089-1107 AUGACUACCUAGGAAUGAG CUCAUUCCUAGGUAGUCAU
1613
1614 1090-1108 UGACUACCUAGGAAUGAGU ACUCAUUCCUAGGUAGUCA
1615
1616 1091-1109 GACUACCUAGGAAUGAGUC GACUCAUUCCUAGGUAGUC
1617
1618 1092-1110 ACUACCUAGGAAUGAGUCG CGACUCAUUCCUAGGUAGU
1619
1620 1093-1111 CUACCUAGGAAUGAGUCGC GCGACUCAUUCCUAGGUAG
1621
1622 1094-1112 UACCUAGGAAUGAGUCGCC GGCGACUCAUUCCUAGGUA
1623
1624 1095-1113 ACCUAGGAAUGAGUCGCCA UGGCGACUCAUUCCUAGGU
1625
1626 1096-1114 CCUAGGAAUGAGUCGCCAC GUGGCGACUCAUUCCUAGG
1627
1628 1097-1115 CUAGGAAUGAGUCGCCACC GGUGGCGACUCAUUCCUAG
1629
1630 1098-1116 UAGGAAUGAGUCGCCACCC GGGUGGCGACUCAUUCCUA
1631
1632 1099-1117 AGGAAUGAGUCGCCACCCA UGGGUGGCGACUCAUUCCU
1633
1634 1100-1118 GGAAUGAGUCGCCACCCAC GUGGGUGGCGACUCAUUCC
1635
1636 1101-1119 GAAUGAGUCGCCACCCACG CGUGGGUGGCGACUCAUUC
1637
1638 1102-1120 AAUGAGUCGCCACCCACGG CCGUGGGUGGCGACUCAUU
1639
1640 1103-1121 AUGAGUCGCCACCCACGGG CCCGUGGGUGGCGACUCAU
1641
1642 1104-1122 UGAGUCGCCACCCACGGGU ACCCGUGGGUGGCGACUCA
1643
1644 1105-1123 GAGUCGCCACCCACGGGUG CACCCGUGGGUGGCGACUC
1645
1646 1106-1124 AGUCGCCACCCACGGGUGU ACACCCGUGGGUGGCGACU
1647
1648 1107-1125 GUCGCCACCCACGGGUGUG CACACCCGUGGGUGGCGAC
1649
1650 1108-1126 UCGCCACCCACGGGUGUGU ACACACCCGUGGGUGGCGA
1651
1652 1109-1127 CGCCACCCACGGGUGUGUG CACACACCCGUGGGUGGCG
1653
1654 1110-1128 GCCACCCACGGGUGUGUGG CCACACACCCGUGGGUGGC
1655
1656 1111-1129 CCACCCACGGGUGUGUGGG CCCACACACCCGUGGGUGG
1657
1658 1112-1130 CACCCACGGGUGUGUGGGG CCCCACACACCCGUGGGUG
1659
1660 1113-1131 ACCCACGGGUGUGUGGGGC GCCCCACACACCCGUGGGU
1661
1662 1114-1132 CCCACGGGUGUGUGGGGCA UGCCCCACACACCCGUGGG
1663
1664 1115-1133 CCACGGGUGUGUGGGGCAG CUGCCCCACACACCCGUGG
1665
1666 1116-1134 CACGGGUGUGUGGGGCAGU ACUGCCCCACACACCCGUG
1667
1668 1117-1135 ACGGGUGUGUGGGGCAGUU AACUGCCCCACACACCCGU
1669
1670 1118-1136 CGGGUGUGUGGGGCAGUUA UAACUGCCCCACACACCCG
1671
1672 1119-1137 GGGUGUGUGGGGCAGUUAU AUAACUGCCCCACACACCC
1673
1674 1120-1138 GGUGUGUGGGGCAGUUAUG CAUAACUGCCCCACACACC
1675
1676 1121-1139 GUGUGUGGGGCAGUUAUGG CCAUAACUGCCCCACACAC
1677
1678 1122-1140 UGUGUGGGGCAGUUAUGGA UCCAUAACUGCCCCACACA
1679
1680 1123-1141 GUGUGGGGCAGUUAUGGAC GUCCAUAACUGCCCCACAC
1681
1682 1125-1143 GUGGGGCAGUUAUGGACAC GUGUCCAUAACUGCCCCAC
1683
1684 1126-1144 UGGGGCAGUUAUGGACACU AGUGUCCAUAACUGCCCCA
1685
1686 1128-1146 GGGCAGUUAUGGACACUUU AAAGUGUCCAUAACUGCCC
1687
1688 1129-1147 GGCAGUUAUGGACACUUUG CAAAGUGUCCAUAACUGCC
1689
1690 1130-1148 GCAGUUAUGGACACUUUGA UCAAAGUGUCCAUAACUGC
1691
1692 1131-1149 CAGUUAUGGACACUUUGAA UUCAAAGUGUCCAUAACUG
1693
1694 1132-1150 AGUUAUGGACACUUUGAAA UUUCAAAGUGUCCAUAACU
1695
1696 1133-1151 GUUAUGGACACUUUGAAAC GUUUCAAAGUGUCCAUAAC
1697
1698 1134-1152 UUAUGGACACUUUGAAACA UGUUUCAAAGUGUCCAUAA
1699
1700 1135-1153 UAUGGACACUUUGAAACAA UUGUUUCAAAGUGUCCAUA
1701
1702 1136-1154 AUGGACACUUUGAAACAAC GUUGUUUCAAAGUGUCCAU
1703
1704 1139-1157 GACACUUUGAAACAACAUG CAUGUUGUUUCAAAGUGUC
1705
1706 1140-1158 ACACUUUGAAACAACAUGG CCAUGUUGUUUCAAAGUGU
1707
1708 1141-1159 CACUUUGAAACAACAUGGU ACCAUGUUGUUUCAAAGUG
1709
1710 1142-1160 ACUUUGAAACAACAUGGUG CACCAUGUUGUUUCAAAGU
1711
1712 1143-1161 CUUUGAAACAACAUGGUGC GCACCAUGUUGUUUCAAAG
1713
1714 1144-1162 UUUGAAACAACAUGGUGCU AGCACCAUGUUGUUUCAAA
1715
1716 1145-1163 UUGAAACAACAUGGUGCUG CAGCACCAUGUUGUUUCAA
1717
1718 1146-1164 UGAAACAACAUGGUGCUGG CCAGCACCAUGUUGUUUCA
1719
1720 1147-1165 GAAACAACAUGGUGCUGGG CCCAGCACCAUGUUGUUUC
1721
1722 1148-1166 AAACAACAUGGUGCUGGGG CCCCAGCACCAUGUUGUUU
1723
1724 1149-1167 AACAACAUGGUGCUGGGGC GCCCCAGCACCAUGUUGUU
1725
1726 1150-1168 ACAACAUGGUGCUGGGGCA UGCCCCAGCACCAUGUUGU
1727
1728 1151-1169 CAACAUGGUGCUGGGGCAG CUGCCCCAGCACCAUGUUG
1729
1730 1152-1170 AACAUGGUGCUGGGGCAGG CCUGCCCCAGCACCAUGUU
1731
1732 1153-1171 ACAUGGUGCUGGGGCAGGU ACCUGCCCCAGCACCAUGU
1733
1734 1154-1172 CAUGGUGCUGGGGCAGGUG CACCUGCCCCAGCACCAUG
1735
1736 1155-1173 AUGGUGCUGGGGCAGGUGG CCACCUGCCCCAGCACCAU
1737
1738 1156-1174 UGGUGCUGGGGCAGGUGGU ACCACCUGCCCCAGCACCA
1739
1740 1157-1175 GGUGCUGGGGCAGGUGGUA UACCACCUGCCCCAGCACC
1741
1742 1158-1176 GUGCUGGGGCAGGUGGUAC GUACCACCUGCCCCAGCAC
1743
1744 1159-1177 UGCUGGGGCAGGUGGUACU AGUACCACCUGCCCCAGCA
1745
1746 1160-1178 GCUGGGGCAGGUGGUACUA UAGUACCACCUGCCCCAGC
1747
1748 1161-1179 CUGGGGCAGGUGGUACUAG CUAGUACCACCUGCCCCAG
1749
1750 1162-1180 UGGGGCAGGUGGUACUAGA UCUAGUACCACCUGCCCCA
1751
1752 1166-1184 GCAGGUGGUACUAGAAAUA UAUUUCUAGUACCACCUGC
1753
1754 1167-1185 CAGGUGGUACUAGAAAUAU AUAUUUCUAGUACCACCUG
1755
1756 1168-1186 AGGUGGUACUAGAAAUAUU AAUAUUUCUAGUACCACCU
1757
1758 1169-1187 GGUGGUACUAGAAAUAUUU AAAUAUUUCUAGUACCACC
1759
1760 1170-1188 GUGGUACUAGAAAUAUUUC GAAAUAUUUCUAGUACCAC
1761
1762 1171-1189 UGGUACUAGAAAUAUUUCU AGAAAUAUUUCUAGUACCA
1763
1764 1172-1190 GGUACUAGAAAUAUUUCUG CAGAAAUAUUUCUAGUACC
1765
1766 1173-1191 GUACUAGAAAUAUUUCUGG CCAGAAAUAUUUCUAGUAC
1767
1768 1174-1192 UACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUA
1769
1770 1175-1193 ACUAGAAAUAUUUCUGGAA UUCCAGAAAUAUUUCUAGU
1771
1772 1176-1194 CUAGAAAUAUUUCUGGAAC GUUCCAGAAAUAUUUCUAG
1773
1774 1177-1195 UAGAAAUAUUUCUGGAACU AGUUCCAGAAAUAUUUCUA
1775
1776 1178-1196 AGAAAUAUUUCUGGAACUA UAGUUCCAGAAAUAUUUCU
1777
1778 1179-1197 GAAAUAUUUCUGGAACUAG CUAGUUCCAGAAAUAUUUC
1779
1780 1180-1198 AAAUAUUUCUGGAACUAGU ACUAGUUCCAGAAAUAUUU
1781
1782 1181-1199 AAUAUUUCUGGAACUAGUA UACUAGUUCCAGAAAUAUU
1783
1784 1183-1201 UAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUA
1785
1786 1186-1204 UUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAA
1787
1788 1187-1205 UCUGGAACUAGUAAAUUCC GGAAUUUACUAGUUCCAGA
1789
1790 1189-1207 UGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCA
1791
1792 1190-1208 GGAACUAGUAAAUUCCAUG CAUGGAAUUUACUAGUUCC
1793
1794 1192-1210 AACUAGUAAAUUCCAUGUG CACAUGGAAUUUACUAGUU
1795
1796 1193-1211 ACUAGUAAAUUCCAUGUGG CCACAUGGAAUUUACUAGU
1797
1798 1194-1212 CUAGUAAAUUCCAUGUGGA UCCACAUGGAAUUUACUAG
1799
1800 1195-1213 UAGUAAAUUCCAUGUGGAC GUCCACAUGGAAUUUACUA
1801
1802 1196-1214 AGUAAAUUCCAUGUGGACU AGUCCACAUGGAAUUUACU
1803
1804 1197-1215 GUAAAUUCCAUGUGGACUU AAGUCCACAUGGAAUUUAC
1805
1806 1198-1216 UAAAUUCCAUGUGGACUUA UAAGUCCACAUGGAAUUUA
1807
1808 1199-1217 AAAUUCCAUGUGGACUUAG CUAAGUCCACAUGGAAUUU
1809
1810 1200-1218 AAUUCCAUGUGGACUUAGA UCUAAGUCCACAUGGAAUU
1811
1812 1201-1219 AUUCCAUGUGGACUUAGAG CUCUAAGUCCACAUGGAAU
1813
1814 1202-1220 UUCCAUGUGGACUUAGAGC GCUCUAAGUCCACAUGGAA
1815
1816 1222-1240 GGAGCUGGCAGACCUCCAU AUGGAGGUCUGCCAGCUCC
1817
1818 1223-1241 GAGCUGGCAGACCUCCAUG CAUGGAGGUCUGCCAGCUC
1819
1820 1224-1242 AGCUGGCAGACCUCCAUGG CCAUGGAGGUCUGCCAGCU
1821
1822 1225-1243 GCUGGCAGACCUCCAUGGG CCCAUGGAGGUCUGCCAGC
1823
1824 1226-1244 CUGGCAGACCUCCAUGGGA UCCCAUGGAGGUCUGCCAG
1825
1826 1227-1245 UGGCAGACCUCCAUGGGAA UUCCCAUGGAGGUCUGCCA
1827
1828 1228-1246 GGCAGACCUCCAUGGGAAA UUUCCCAUGGAGGUCUGCC
1829
1830 1229-1247 GCAGACCUCCAUGGGAAAG CUUUCCCAUGGAGGUCUGC
1831
1832 1230-1248 CAGACCUCCAUGGGAAAGA UCUUUCCCAUGGAGGUCUG
1833
1834 1231-1249 AGACCUCCAUGGGAAAGAU AUCUUUCCCAUGGAGGUCU
1835
1836 1232-1250 GACCUCCAUGGGAAAGAUG CAUCUUUCCCAUGGAGGUC
1837
1838 1233-1251 ACCUCCAUGGGAAAGAUGC GCAUCUUUCCCAUGGAGGU
1839
1840 1254-1272 CACUCUUGUUUUCCUCGUG CACGAGGAAAACAAGAGUG
1841
1842 1255-1273 ACUCUUGUUUUCCUCGUGC GCACGAGGAAAACAAGAGU
1843
1844 1256-1274 CUCUUGUUUUCCUCGUGCU AGCACGAGGAAAACAAGAG
1845
1846 1257-1275 UCUUGUUUUCCUCGUGCUU AAGCACGAGGAAAACAAGA
1847
1848 1259-1277 UUGUUUUCCUCGUGCUUUG CAAAGCACGAGGAAAACAA
1849
1850 1260-1278 UGUUUUCCUCGUGCUUUGU ACAAAGCACGAGGAAAACA
1851
1852 1261-1279 GUUUUCCUCGUGCUUUGUG CACAAAGCACGAGGAAAAC
1853
1854 1262-1280 UUUUCCUCGUGCUUUGUGG CCACAAAGCACGAGGAAAA
1855
1856 1263-1281 UUUCCUCGUGCUUUGUGGC GCCACAAAGCACGAGGAAA
1857
1858 1264-1282 UUCCUCGUGCUUUGUGGCC GGCCACAAAGCACGAGGAA
1859
1860 1265-1283 UCCUCGUGCUUUGUGGCCA UGGCCACAAAGCACGAGGA
1861
1862 1266-1284 CCUCGUGCUUUGUGGCCAA UUGGCCACAAAGCACGAGG
1863
1864 1267-1285 CUCGUGCUUUGUGGCCAAU AUUGGCCACAAAGCACGAG
1865
1866 1268-1286 UCGUGCUUUGUGGCCAAUG CAUUGGCCACAAAGCACGA
1867
1868 1269-1287 CGUGCUUUGUGGCCAAUGA UCAUUGGCCACAAAGCACG
1869
1870 1270-1288 GUGCUUUGUGGCCAAUGAC GUCAUUGGCCACAAAGCAC
1871
1872 1271-1289 UGCUUUGUGGCCAAUGACU AGUCAUUGGCCACAAAGCA
1873
1874 1272-1290 GCUUUGUGGCCAAUGACUC GAGUCAUUGGCCACAAAGC
1875
1876 1273-1291 CUUUGUGGCCAAUGACUCA UGAGUCAUUGGCCACAAAG
1877
1878 1274-1292 UUUGUGGCCAAUGACUCAA UUGAGUCAUUGGCCACAAA
1879
1880 1275-1293 UUGUGGCCAAUGACUCAAC GUUGAGUCAUUGGCCACAA
1881
1882 1276-1294 UGUGGCCAAUGACUCAACC GGUUGAGUCAUUGGCCACA
1883
1884 1277-1295 GUGGCCAAUGACUCAACCC GGGUUGAGUCAUUGGCCAC
1885
1886 1278-1296 UGGCCAAUGACUCAACCCU AGGGUUGAGUCAUUGGCCA
1887
1888 1279-1297 GGCCAAUGACUCAACCCUC GAGGGUUGAGUCAUUGGCC
1889
1890 1280-1298 GCCAAUGACUCAACCCUCU AGAGGGUUGAGUCAUUGGC
1891
1892 1281-1299 CCAAUGACUCAACCCUCUU AAGAGGGUUGAGUCAUUGG
1893
1894 1282-1300 CAAUGACUCAACCCUCUUC GAAGAGGGUUGAGUCAUUG
1895
1896 1283-1301 AAUGACUCAACCCUCUUCA UGAAGAGGGUUGAGUCAUU
1897
1898 1284-1302 AUGACUCAACCCUCUUCAC GUGAAGAGGGUUGAGUCAU
1899
1900 1285-1303 UGACUCAACCCUCUUCACC GGUGAAGAGGGUUGAGUCA
1901
1902 1286-1304 GACUCAACCCUCUUCACCC GGGUGAAGAGGGUUGAGUC
1903
1904 1287-1305 ACUCAACCCUCUUCACCCU AGGGUGAAGAGGGUUGAGU
1905
1906 1288-1306 CUCAACCCUCUUCACCCUG CAGGGUGAAGAGGGUUGAG
1907
1908 1289-1307 UCAACCCUCUUCACCCUGG CCAGGGUGAAGAGGGUUGA
1909
1910 1290-1308 CAACCCUCUUCACCCUGGC GCCAGGGUGAAGAGGGUUG
1911
1912 1291-1309 AACCCUCUUCACCCUGGCU AGCCAGGGUGAAGAGGGUU
1913
1914 1292-1310 ACCCUCUUCACCCUGGCUA UAGCCAGGGUGAAGAGGGU
1915
1916 1293-1311 CCCUCUUCACCCUGGCUAA UUAGCCAGGGUGAAGAGGG
1917
1918 1294-1312 CCUCUUCACCCUGGCUAAG CUUAGCCAGGGUGAAGAGG
1919
1920 1297-1315 CUUCACCCUGGCUAAGAUG CAUCUUAGCCAGGGUGAAG
1921
1922 1298-1316 UUCACCCUGGCUAAGAUGA UCAUCUUAGCCAGGGUGAA
1923
1924 1300-1318 CACCCUGGCUAAGAUGAUG CAUCAUCUUAGCCAGGGUG
1925
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1927
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1929
1930 1303-1321 CCUGGCUAAGAUGAUGCCA UGGCAUCAUCUUAGCCAGG
1931
1932 1304-1322 CUGGCUAAGAUGAUGCCAG CUGGCAUCAUCUUAGCCAG
1933
1934 1305-1323 UGGCUAAGAUGAUGCCAGG CCUGGCAUCAUCUUAGCCA
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1936 1306-1324 GGCUAAGAUGAUGCCAGGC GCCUGGCAUCAUCUUAGCC
1937
1938 1307-1325 GCUAAGAUGAUGCCAGGCU AGCCUGGCAUCAUCUUAGC
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1940 1308-1326 CUAAGAUGAUGCCAGGCUG CAGCCUGGCAUCAUCUUAG
1941
1942 1309-1327 UAAGAUGAUGCCAGGCUGU ACAGCCUGGCAUCAUCUUA
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1944 1310-1328 AAGAUGAUGCCAGGCUGUG CACAGCCUGGCAUCAUCUU
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1946 1311-1329 AGAUGAUGCCAGGCUGUGA UCACAGCCUGGCAUCAUCU
1947
1948 1312-1330 GAUGAUGCCAGGCUGUGAG CUCACAGCCUGGCAUCAUC
1949
1950 1313-1331 AUGAUGCCAGGCUGUGAGA UCUCACAGCCUGGCAUCAU
1951
1952 1314-1332 UGAUGCCAGGCUGUGAGAU AUCUCACAGCCUGGCAUCA
1953
1954 1316-1334 AUGCCAGGCUGUGAGAUUU AAAUCUCACAGCCUGGCAU
1955
1956 1317-1335 UGCCAGGCUGUGAGAUUUA UAAAUCUCACAGCCUGGCA
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1960 1319-1337 CCAGGCUGUGAGAUUUACU AGUAAAUCUCACAGCCUGG
1961
1962 1320-1338 CAGGCUGUGAGAUUUACUC GAGUAAAUCUCACAGCCUG
1963
1964 1321-1339 AGGCUGUGAGAUUUACUCU AGAGUAAAUCUCACAGCCU
1965
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1972 1327-1345 UGAGAUUUACUCUGAUUCU AGAAUCAGAGUAAAUCUCA
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1976 1329-1347 AGAUUUACUCUGAUUCUGG CCAGAAUCAGAGUAAAUCU
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1981
1982 1332-1350 UUUACUCUGAUUCUGGGAA UUCCCAGAAUCAGAGUAAA
1983
1984 1333-1351 UUACUCUGAUUCUGGGAAC GUUCCCAGAAUCAGAGUAA
1985
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1987
1988 1335-1353 ACUCUGAUUCUGGGAACCA UGGUUCCCAGAAUCAGAGU
1989
1990 1336-1354 CUCUGAUUCUGGGAACCAU AUGGUUCCCAGAAUCAGAG
1991
1992 1337-1355 UCUGAUUCUGGGAACCAUG CAUGGUUCCCAGAAUCAGA
1993
1994 1338-1356 CUGAUUCUGGGAACCAUGC GCAUGGUUCCCAGAAUCAG
1995
1996 1339-1357 UGAUUCUGGGAACCAUGCC GGCAUGGUUCCCAGAAUCA
1997
1998 1340-1358 GAUUCUGGGAACCAUGCCU AGGCAUGGUUCCCAGAAUC
1999
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2001
2002 1342-1360 UUCUGGGAACCAUGCCUCC GGAGGCAUGGUUCCCAGAA
2003
2004 1343-1361 UCUGGGAACCAUGCCUCCA UGGAGGCAUGGUUCCCAGA
2005
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2007
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2009
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2011
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2013
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2021
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2051
2052 1372-1390 GAUUCGAAACAGCCGAGUG CACUCGGCUGUUUCGAAUC
2053
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2059
2060 1376-1394 CGAAACAGCCGAGUGCCAA UUGGCACUCGGCUGUUUCG
2061
2062 1377-1395 GAAACAGCCGAGUGCCAAA UUUGGCACUCGGCUGUUUC
2063
2064 1378-1396 AAACAGCCGAGUGCCAAAG CUUUGGCACUCGGCUGUUU
2065
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2067
2068 1380-1398 ACAGCCGAGUGCCAAAGUA UACUUUGGCACUCGGCUGU
2069
2070 1381-1399 CAGCCGAGUGCCAAAGUAC GUACUUUGGCACUCGGCUG
2071
2072 1383-1401 GCCGAGUGCCAAAGUACAU AUGUACUUUGGCACUCGGC
2073
2074 1384-1402 CCGAGUGCCAAAGUACAUC GAUGUACUUUGGCACUCGG
2075
2076 1385-1403 CGAGUGCCAAAGUACAUCU AGAUGUACUUUGGCACUCG
2077
2078 1386-1404 GAGUGCCAAAGUACAUCUU AAGAUGUACUUUGGCACUC
2079
2080 1387-1405 AGUGCCAAAGUACAUCUUC GAAGAUGUACUUUGGCACU
2081
2082 1388-1406 GUGCCAAAGUACAUCUUCC GGAAGAUGUACUUUGGCAC
2083
2084 1389-1407 UGCCAAAGUACAUCUUCCG CGGAAGAUGUACUUUGGCA
2085
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2087
2088 1391-1409 CCAAAGUACAUCUUCCGCC GGCGGAAGAUGUACUUUGG
2089
2090 1392-1410 CAAAGUACAUCUUCCGCCA UGGCGGAAGAUGUACUUUG
2091
2092 1393-1411 AAAGUACAUCUUCCGCCAC GUGGCGGAAGAUGUACUUU
2093
2094 1394-1412 AAGUACAUCUUCCGCCACA UGUGGCGGAAGAUGUACUU
2095
2096 1395-1413 AGUACAUCUUCCGCCACAA UUGUGGCGGAAGAUGUACU
2097
2098 1396-1414 GUACAUCUUCCGCCACAAU AUUGUGGCGGAAGAUGUAC
2099
2100 1397-1415 UACAUCUUCCGCCACAAUG CAUUGUGGCGGAAGAUGUA
2101
2102 1398-1416 ACAUCUUCCGCCACAAUGA UCAUUGUGGCGGAAGAUGU
2103
2104 1399-1417 CAUCUUCCGCCACAAUGAU AUCAUUGUGGCGGAAGAUG
2105
2106 1400-1418 AUCUUCCGCCACAAUGAUG CAUCAUUGUGGCGGAAGAU
2107
2108 1401-1419 UCUUCCGCCACAAUGAUGU ACAUCAUUGUGGCGGAAGA
2109
2110 1402-1420 CUUCCGCCACAAUGAUGUC GACAUCAUUGUGGCGGAAG
2111
2112 1403-1421 UUCCGCCACAAUGAUGUCA UGACAUCAUUGUGGCGGAA
2113
2114 1404-1422 UCCGCCACAAUGAUGUCAG CUGACAUCAUUGUGGCGGA
2115
2116 1405-1423 CCGCCACAAUGAUGUCAGC GCUGACAUCAUUGUGGCGG
2117
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2119
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2121
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2123
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2125
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2127
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2129
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2131
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2133
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2135
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2137
2138 1435-1453 ACUGCUGCAAAGAUCUGAC GUCAGAUCUUUGCAGCAGU
2139
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2141
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2143
2144 1457-1475 UCAGUCCCCAAGAUUGUGG CCACAAUCUUGGGGACUGA
2145
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2147
2148 1459-1477 AGUCCCCAAGAUUGUGGCA UGCCACAAUCUUGGGGACU
2149
2150 1461-1479 UCCCCAAGAUUGUGGCAUU AAUGCCACAAUCUUGGGGA
2151
2152 1462-1480 CCCCAAGAUUGUGGCAUUU AAAUGCCACAAUCUUGGGG
2153
2154 1463-1481 CCCAAGAUUGUGGCAUUUG CAAAUGCCACAAUCUUGGG
2155
2156 1464-1482 CCAAGAUUGUGGCAUUUGA UCAAAUGCCACAAUCUUGG
2157
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2165
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2167
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2169
2170 1471-1489 UGUGGCAUUUGAAACUGUC GACAGUUUCAAAUGCCACA
2171
2172 1472-1490 GUGGCAUUUGAAACUGUCC GGACAGUUUCAAAUGCCAC
2173
2174 1473-1491 UGGCAUUUGAAACUGUCCA UGGACAGUUUCAAAUGCCA
2175
2176 1474-1492 GGCAUUUGAAACUGUCCAU AUGGACAGUUUCAAAUGCC
2177
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2179
2180 1476-1494 CAUUUGAAACUGUCCAUUC GAAUGGACAGUUUCAAAUG
2181
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2183
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2185
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2187
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2189
2190 1482-1500 AAACUGUCCAUUCAAUGGA UCCAUUGAAUGGACAGUUU
2191
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2197
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2199
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2201
2202 1488-1506 UCCAUUCAAUGGAUGGGGC GCCCCAUCCAUUGAAUGGA
2203
2204 1508-1526 GUGUGCCCACUGGAAGAGC GCUCUUCCAGUGGGCACAC
2205
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2207
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2209
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2211
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2213
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2215
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2217
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2221
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2223
2224 1518-1536 UGGAAGAGCUGUGUGAUGU ACAUCACACAGCUCUUCCA
2225
2226 1519-1537 GGAAGAGCUGUGUGAUGUG CACAUCACACAGCUCUUCC
2227
2228 1520-1538 GAAGAGCUGUGUGAUGUGG CCACAUCACACAGCUCUUC
2229
2230 1521-1539 AAGAGCUGUGUGAUGUGGC GCCACAUCACACAGCUCUU
2231
2232 1522-1540 AGAGCUGUGUGAUGUGGCC GGCCACAUCACACAGCUCU
2233
2234 1523-1541 GAGCUGUGUGAUGUGGCCC GGGCCACAUCACACAGCUC
2235
2236 1524-1542 AGCUGUGUGAUGUGGCCCA UGGGCCACAUCACACAGCU
2237
2238 1525-1543 GCUGUGUGAUGUGGCCCAU AUGGGCCACAUCACACAGC
2239
2240 1526-1544 CUGUGUGAUGUGGCCCAUG CAUGGGCCACAUCACACAG
2241
2242 1527-1545 UGUGUGAUGUGGCCCAUGA UCAUGGGCCACAUCACACA
2243
2244 1528-1546 GUGUGAUGUGGCCCAUGAG CUCAUGGGCCACAUCACAC
2245
2246 1529-1547 UGUGAUGUGGCCCAUGAGU ACUCAUGGGCCACAUCACA
2247
2248 1532-1550 GAUGUGGCCCAUGAGUUUG CAAACUCAUGGGCCACAUC
2249
2250 1533-1551 AUGUGGCCCAUGAGUUUGG CCAAACUCAUGGGCCACAU
2251
2252 1534-1552 UGUGGCCCAUGAGUUUGGA UCCAAACUCAUGGGCCACA
2253
2254 1535-1553 GUGGCCCAUGAGUUUGGAG CUCCAAACUCAUGGGCCAC
2255
2256 1536-1554 UGGCCCAUGAGUUUGGAGC GCUCCAAACUCAUGGGCCA
2257
2258 1537-1555 GGCCCAUGAGUUUGGAGCA UGCUCCAAACUCAUGGGCC
2259
2260 1538-1556 GCCCAUGAGUUUGGAGCAA UUGCUCCAAACUCAUGGGC
2261
2262 1539-1557 CCCAUGAGUUUGGAGCAAU AUUGCUCCAAACUCAUGGG
2263
2264 1540-1558 CCAUGAGUUUGGAGCAAUC GAUUGCUCCAAACUCAUGG
2265
2266 1542-1560 AUGAGUUUGGAGCAAUCAC GUGAUUGCUCCAAACUCAU
2267
2268 1543-1561 UGAGUUUGGAGCAAUCACC GGUGAUUGCUCCAAACUCA
2269
2270 1545-1563 AGUUUGGAGCAAUCACCUU AAGGUGAUUGCUCCAAACU
2271
2272 1546-1564 GUUUGGAGCAAUCACCUUC GAAGGUGAUUGCUCCAAAC
2273
2274 1547-1565 UUUGGAGCAAUCACCUUCG CGAAGGUGAUUGCUCCAAA
2275
2276 1548-1566 UUGGAGCAAUCACCUUCGU ACGAAGGUGAUUGCUCCAA
2277
2278 1549-1567 UGGAGCAAUCACCUUCGUG CACGAAGGUGAUUGCUCCA
2279
2280 1550-1568 GGAGCAAUCACCUUCGUGG CCACGAAGGUGAUUGCUCC
2281
2282 1551-1569 GAGCAAUCACCUUCGUGGA UCCACGAAGGUGAUUGCUC
2283
2284 1552-1570 AGCAAUCACCUUCGUGGAU AUCCACGAAGGUGAUUGCU
2285
2286 1553-1571 GCAAUCACCUUCGUGGAUG CAUCCACGAAGGUGAUUGC
2287
2288 1554-1572 CAAUCACCUUCGUGGAUGA UCAUCCACGAAGGUGAUUG
2289
2290 1555-1573 AAUCACCUUCGUGGAUGAG CUCAUCCACGAAGGUGAUU
2291
2292 1556-1574 AUCACCUUCGUGGAUGAGG CCUCAUCCACGAAGGUGAU
2293
2294 1557-1575 UCACCUUCGUGGAUGAGGU ACCUCAUCCACGAAGGUGA
2295
2296 1558-1576 CACCUUCGUGGAUGAGGUC GACCUCAUCCACGAAGGUG
2297
2298 1559-1577 ACCUUCGUGGAUGAGGUCC GGACCUCAUCCACGAAGGU
2299
2300 1560-1578 CCUUCGUGGAUGAGGUCCA UGGACCUCAUCCACGAAGG
2301
2302 1561-1579 CUUCGUGGAUGAGGUCCAC GUGGACCUCAUCCACGAAG
2303
2304 1562-1580 UUCGUGGAUGAGGUCCACG CGUGGACCUCAUCCACGAA
2305
2306 1563-1581 UCGUGGAUGAGGUCCACGC GCGUGGACCUCAUCCACGA
2307
2308 1564-1582 CGUGGAUGAGGUCCACGCA UGCGUGGACCUCAUCCACG
2309
2310 1565-1583 GUGGAUGAGGUCCACGCAG CUGCGUGGACCUCAUCCAC
2311
2312 1566-1584 UGGAUGAGGUCCACGCAGU ACUGCGUGGACCUCAUCCA
2313
2314 1567-1585 GGAUGAGGUCCACGCAGUG CACUGCGUGGACCUCAUCC
2315
2316 1568-1586 GAUGAGGUCCACGCAGUGG CCACUGCGUGGACCUCAUC
2317
2318 1569-1587 AUGAGGUCCACGCAGUGGG CCCACUGCGUGGACCUCAU
2319
2320 1570-1588 UGAGGUCCACGCAGUGGGG CCCCACUGCGUGGACCUCA
2321
2322 1571-1589 GAGGUCCACGCAGUGGGGC GCCCCACUGCGUGGACCUC
2323
2324 1572-1590 AGGUCCACGCAGUGGGGCU AGCCCCACUGCGUGGACCU
2325
2326 1595-1613 GGGGCUCGAGGCGGAGGGA UCCCUCCGCCUCGAGCCCC
2327
2328 1596-1614 GGGCUCGAGGCGGAGGGAU AUCCCUCCGCCUCGAGCCC
2329
2330 1597-1615 GGCUCGAGGCGGAGGGAUU AAUCCCUCCGCCUCGAGCC
2331
2332 1598-1616 GCUCGAGGCGGAGGGAUUG CAAUCCCUCCGCCUCGAGC
2333
2334 1599-1617 CUCGAGGCGGAGGGAUUGG CCAAUCCCUCCGCCUCGAG
2335
2336 1600-1618 UCGAGGCGGAGGGAUUGGG CCCAAUCCCUCCGCCUCGA
2337
2338 1601-1619 CGAGGCGGAGGGAUUGGGG CCCCAAUCCCUCCGCCUCG
2339
2340 1602-1620 GAGGCGGAGGGAUUGGGGA UCCCCAAUCCCUCCGCCUC
2341
2342 1603-1621 AGGCGGAGGGAUUGGGGAU AUCCCCAAUCCCUCCGCCU
2343
2344 1604-1622 GGCGGAGGGAUUGGGGAUC GAUCCCCAAUCCCUCCGCC
2345
2346 1605-1623 GCGGAGGGAUUGGGGAUCG CGAUCCCCAAUCCCUCCGC
2347
2348 1606-1624 CGGAGGGAUUGGGGAUCGG CCGAUCCCCAAUCCCUCCG
2349
2350 1607-1625 GGAGGGAUUGGGGAUCGGG CCCGAUCCCCAAUCCCUCC
2351
2352 1608-1626 GAGGGAUUGGGGAUCGGGA UCCCGAUCCCCAAUCCCUC
2353
2354 1609-1627 AGGGAUUGGGGAUCGGGAU AUCCCGAUCCCCAAUCCCU
2355
2356 1610-1628 GGGAUUGGGGAUCGGGAUG CAUCCCGAUCCCCAAUCCC
2357
2358 1611-1629 GGAUUGGGGAUCGGGAUGG CCAUCCCGAUCCCCAAUCC
2359
2360 1612-1630 GAUUGGGGAUCGGGAUGGA UCCAUCCCGAUCCCCAAUC
2361
2362 1613-1631 AUUGGGGAUCGGGAUGGAG CUCCAUCCCGAUCCCCAAU
2363
2364 1614-1632 UUGGGGAUCGGGAUGGAGU ACUCCAUCCCGAUCCCCAA
2365
2366 1615-1633 UGGGGAUCGGGAUGGAGUC GACUCCAUCCCGAUCCCCA
2367
2368 1617-1635 GGGAUCGGGAUGGAGUCAU AUGACUCCAUCCCGAUCCC
2369
2370 1618-1636 GGAUCGGGAUGGAGUCAUG CAUGACUCCAUCCCGAUCC
2371
2372 1619-1637 GAUCGGGAUGGAGUCAUGC GCAUGACUCCAUCCCGAUC
2373
2374 1620-1638 AUCGGGAUGGAGUCAUGCC GGCAUGACUCCAUCCCGAU
2375
2376 1621-1639 UCGGGAUGGAGUCAUGCCA UGGCAUGACUCCAUCCCGA
2377
2378 1622-1640 CGGGAUGGAGUCAUGCCAA UUGGCAUGACUCCAUCCCG
2379
2380 1623-1641 GGGAUGGAGUCAUGCCAAA UUUGGCAUGACUCCAUCCC
2381
2382 1624-1642 GGAUGGAGUCAUGCCAAAA UUUUGGCAUGACUCCAUCC
2383
2384 1625-1643 GAUGGAGUCAUGCCAAAAA UUUUUGGCAUGACUCCAUC
2385
2386 1626-1644 AUGGAGUCAUGCCAAAAAU AUUUUUGGCAUGACUCCAU
2387
2388 1627-1645 UGGAGUCAUGCCAAAAAUG CAUUUUUGGCAUGACUCCA
2389
2390 1628-1646 GGAGUCAUGCCAAAAAUGG CCAUUUUUGGCAUGACUCC
2391
2392 1629-1647 GAGUCAUGCCAAAAAUGGA UCCAUUUUUGGCAUGACUC
2393
2394 1630-1648 AGUCAUGCCAAAAAUGGAC GUCCAUUUUUGGCAUGACU
2395
2396 1632-1650 UCAUGCCAAAAAUGGACAU AUGUCCAUUUUUGGCAUGA
2397
2398 1633-1651 CAUGCCAAAAAUGGACAUC GAUGUCCAUUUUUGGCAUG
2399
2400 1636-1654 GCCAAAAAUGGACAUCAUU AAUGAUGUCCAUUUUUGGC
2401
2402 1638-1656 CAAAAAUGGACAUCAUUUC GAAAUGAUGUCCAUUUUUG
2403
2404 1639-1657 AAAAAUGGACAUCAUUUCU AGAAAUGAUGUCCAUUUUU
2405
2406 1640-1658 AAAAUGGACAUCAUUUCUG CAGAAAUGAUGUCCAUUUU
2407
2408 1641-1659 AAAUGGACAUCAUUUCUGG CCAGAAAUGAUGUCCAUUU
2409
2410 1642-1660 AAUGGACAUCAUUUCUGGA UCCAGAAAUGAUGUCCAUU
2411
2412 1643-1661 AUGGACAUCAUUUCUGGAA UUCCAGAAAUGAUGUCCAU
2413
2414 1644-1662 UGGACAUCAUUUCUGGAAC GUUCCAGAAAUGAUGUCCA
2415
2416 1645-1663 GGACAUCAUUUCUGGAACA UGUUCCAGAAAUGAUGUCC
2417
2418 1646-1664 GACAUCAUUUCUGGAACAC GUGUUCCAGAAAUGAUGUC
2419
2420 1647-1665 ACAUCAUUUCUGGAACACU AGUGUUCCAGAAAUGAUGU
2421
2422 1648-1666 CAUCAUUUCUGGAACACUU AAGUGUUCCAGAAAUGAUG
2423
2424 1649-1667 AUCAUUUCUGGAACACUUG CAAGUGUUCCAGAAAUGAU
2425
2426 1650-1668 UCAUUUCUGGAACACUUGG CCAAGUGUUCCAGAAAUGA
2427
2428 1651-1669 CAUUUCUGGAACACUUGGC GCCAAGUGUUCCAGAAAUG
2429
2430 1652-1670 AUUUCUGGAACACUUGGCA UGCCAAGUGUUCCAGAAAU
2431
2432 1653-1671 UUUCUGGAACACUUGGCAA UUGCCAAGUGUUCCAGAAA
2433
2434 1654-1672 UUCUGGAACACUUGGCAAA UUUGCCAAGUGUUCCAGAA
2435
2436 1655-1673 UCUGGAACACUUGGCAAAG CUUUGCCAAGUGUUCCAGA
2437
2438 1656-1674 CUGGAACACUUGGCAAAGC GCUUUGCCAAGUGUUCCAG
2439
2440 1657-1675 UGGAACACUUGGCAAAGCC GGCUUUGCCAAGUGUUCCA
2441
2442 1658-1676 GGAACACUUGGCAAAGCCU AGGCUUUGCCAAGUGUUCC
2443
2444 1659-1677 GAACACUUGGCAAAGCCUU AAGGCUUUGCCAAGUGUUC
2445
2446 1660-1678 AACACUUGGCAAAGCCUUU AAAGGCUUUGCCAAGUGUU
2447
2448 1661-1679 ACACUUGGCAAAGCCUUUG CAAAGGCUUUGCCAAGUGU
2449
2450 1662-1680 CACUUGGCAAAGCCUUUGG CCAAAGGCUUUGCCAAGUG
2451
2452 1682-1700 UGUGUUGGAGGGUACAUCG CGAUGUACCCUCCAACACA
2453
2454 1683-1701 GUGUUGGAGGGUACAUCGC GCGAUGUACCCUCCAACAC
2455
2456 1684-1702 UGUUGGAGGGUACAUCGCC GGCGAUGUACCCUCCAACA
2457
2458 1685-1703 GUUGGAGGGUACAUCGCCA UGGCGAUGUACCCUCCAAC
2459
2460 1686-1704 UUGGAGGGUACAUCGCCAG CUGGCGAUGUACCCUCCAA
2461
2462 1687-1705 UGGAGGGUACAUCGCCAGC GCUGGCGAUGUACCCUCCA
2463
2464 1688-1706 GGAGGGUACAUCGCCAGCA UGCUGGCGAUGUACCCUCC
2465
2466 1689-1707 GAGGGUACAUCGCCAGCAC GUGCUGGCGAUGUACCCUC
2467
2468 1690-1708 AGGGUACAUCGCCAGCACG CGUGCUGGCGAUGUACCCU
2469
2470 1691-1709 GGGUACAUCGCCAGCACGA UCGUGCUGGCGAUGUACCC
2471
2472 1692-1710 GGUACAUCGCCAGCACGAG CUCGUGCUGGCGAUGUACC
2473
2474 1693-1711 GUACAUCGCCAGCACGAGU ACUCGUGCUGGCGAUGUAC
2475
2476 1694-1712 UACAUCGCCAGCACGAGUU AACUCGUGCUGGCGAUGUA
2477
2478 1695-1713 ACAUCGCCAGCACGAGUUC GAACUCGUGCUGGCGAUGU
2479
2480 1696-1714 CAUCGCCAGCACGAGUUCU AGAACUCGUGCUGGCGAUG
2481
2482 1697-1715 AUCGCCAGCACGAGUUCUC GAGAACUCGUGCUGGCGAU
2483
2484 1698-1716 UCGCCAGCACGAGUUCUCU AGAGAACUCGUGCUGGCGA
2485
2486 1699-1717 CGCCAGCACGAGUUCUCUG CAGAGAACUCGUGCUGGCG
2487
2488 1700-1718 GCCAGCACGAGUUCUCUGA UCAGAGAACUCGUGCUGGC
2489
2490 1701-1719 CCAGCACGAGUUCUCUGAU AUCAGAGAACUCGUGCUGG
2491
2492 1702-1720 CAGCACGAGUUCUCUGAUU AAUCAGAGAACUCGUGCUG
2493
2494 1703-1721 AGCACGAGUUCUCUGAUUG CAAUCAGAGAACUCGUGCU
2495
2496 1704-1722 GCACGAGUUCUCUGAUUGA UCAAUCAGAGAACUCGUGC
2497
2498 1705-1723 CACGAGUUCUCUGAUUGAC GUCAAUCAGAGAACUCGUG
2499
2500 1707-1725 CGAGUUCUCUGAUUGACAC GUGUCAAUCAGAGAACUCG
2501
2502 1727-1745 GUACGGUCCUAUGCUGCUG CAGCAGCAUAGGACCGUAC
2503
2504 1728-1746 UACGGUCCUAUGCUGCUGG CCAGCAGCAUAGGACCGUA
2505
2506 1729-1747 ACGGUCCUAUGCUGCUGGC GCCAGCAGCAUAGGACCGU
2507
2508 1730-1748 CGGUCCUAUGCUGCUGGCU AGCCAGCAGCAUAGGACCG
2509
2510 1731-1749 GGUCCUAUGCUGCUGGCUU AAGCCAGCAGCAUAGGACC
2511
2512 1732-1750 GUCCUAUGCUGCUGGCUUC GAAGCCAGCAGCAUAGGAC
2513
2514 1733-1751 UCCUAUGCUGCUGGCUUCA UGAAGCCAGCAGCAUAGGA
2515
2516 1734-1752 CCUAUGCUGCUGGCUUCAU AUGAAGCCAGCAGCAUAGG
2517
2518 1735-1753 CUAUGCUGCUGGCUUCAUC GAUGAAGCCAGCAGCAUAG
2519
2520 1736-1754 UAUGCUGCUGGCUUCAUCU AGAUGAAGCCAGCAGCAUA
2521
2522 1737-1755 AUGCUGCUGGCUUCAUCUU AAGAUGAAGCCAGCAGCAU
2523
2524 1738-1756 UGCUGCUGGCUUCAUCUUC GAAGAUGAAGCCAGCAGCA
2525
2526 1739-1757 GCUGCUGGCUUCAUCUUCA UGAAGAUGAAGCCAGCAGC
2527
2528 1740-1758 CUGCUGGCUUCAUCUUCAC GUGAAGAUGAAGCCAGCAG
2529
2530 1741-1759 UGCUGGCUUCAUCUUCACC GGUGAAGAUGAAGCCAGCA
2531
2532 1742-1760 GCUGGCUUCAUCUUCACCA UGGUGAAGAUGAAGCCAGC
2533
2534 1743-1761 CUGGCUUCAUCUUCACCAC GUGGUGAAGAUGAAGCCAG
2535
2536 1744-1762 UGGCUUCAUCUUCACCACC GGUGGUGAAGAUGAAGCCA
2537
2538 1745-1763 GGCUUCAUCUUCACCACCU AGGUGGUGAAGAUGAAGCC
2539
2540 1746-1764 GCUUCAUCUUCACCACCUC GAGGUGGUGAAGAUGAAGC
2541
2542 1747-1765 CUUCAUCUUCACCACCUCU AGAGGUGGUGAAGAUGAAG
2543
2544 1748-1766 UUCAUCUUCACCACCUCUC GAGAGGUGGUGAAGAUGAA
2545
2546 1749-1767 UCAUCUUCACCACCUCUCU AGAGAGGUGGUGAAGAUGA
2547
2548 1750-1768 CAUCUUCACCACCUCUCUG CAGAGAGGUGGUGAAGAUG
2549
2550 1751-1769 AUCUUCACCACCUCUCUGC GCAGAGAGGUGGUGAAGAU
2551
2552 1752-1770 UCUUCACCACCUCUCUGCC GGCAGAGAGGUGGUGAAGA
2553
2554 1753-1771 CUUCACCACCUCUCUGCCA UGGCAGAGAGGUGGUGAAG
2555
2556 1754-1772 UUCACCACCUCUCUGCCAC GUGGCAGAGAGGUGGUGAA
2557
2558 1755-1773 UCACCACCUCUCUGCCACC GGUGGCAGAGAGGUGGUGA
2559
2560 1756-1774 CACCACCUCUCUGCCACCC GGGUGGCAGAGAGGUGGUG
2561
2562 1757-1775 ACCACCUCUCUGCCACCCA UGGGUGGCAGAGAGGUGGU
2563
2564 1758-1776 CCACCUCUCUGCCACCCAU AUGGGUGGCAGAGAGGUGG
2565
2566 1759-1777 CACCUCUCUGCCACCCAUG CAUGGGUGGCAGAGAGGUG
2567
2568 1760-1778 ACCUCUCUGCCACCCAUGC GCAUGGGUGGCAGAGAGGU
2569
2570 1761-1779 CCUCUCUGCCACCCAUGCU AGCAUGGGUGGCAGAGAGG
2571
2572 1762-1780 CUCUCUGCCACCCAUGCUG CAGCAUGGGUGGCAGAGAG
2573
2574 1763-1781 UCUCUGCCACCCAUGCUGC GCAGCAUGGGUGGCAGAGA
2575
2576 1764-1782 CUCUGCCACCCAUGCUGCU AGCAGCAUGGGUGGCAGAG
2577
2578 1765-1783 UCUGCCACCCAUGCUGCUG CAGCAGCAUGGGUGGCAGA
2579
2580 1766-1784 CUGCCACCCAUGCUGCUGG CCAGCAGCAUGGGUGGCAG
2581
2582 1767-1785 UGCCACCCAUGCUGCUGGC GCCAGCAGCAUGGGUGGCA
2583
2584 1768-1786 GCCACCCAUGCUGCUGGCU AGCCAGCAGCAUGGGUGGC
2585
2586 1769-1787 CCACCCAUGCUGCUGGCUG CAGCCAGCAGCAUGGGUGG
2587
2588 1770-1788 CACCCAUGCUGCUGGCUGG CCAGCCAGCAGCAUGGGUG
2589
2590 1771-1789 ACCCAUGCUGCUGGCUGGA UCCAGCCAGCAGCAUGGGU
2591
2592 1772-1790 CCCAUGCUGCUGGCUGGAG CUCCAGCCAGCAGCAUGGG
2593
2594 1773-1791 CCAUGCUGCUGGCUGGAGC GCUCCAGCCAGCAGCAUGG
2595
2596 1774-1792 CAUGCUGCUGGCUGGAGCC GGCUCCAGCCAGCAGCAUG
2597
2598 1775-1793 AUGCUGCUGGCUGGAGCCC GGGCUCCAGCCAGCAGCAU
2599
2600 1776-1794 UGCUGCUGGCUGGAGCCCU AGGGCUCCAGCCAGCAGCA
2601
2602 1777-1795 GCUGCUGGCUGGAGCCCUG CAGGGCUCCAGCCAGCAGC
2603
2604 1778-1796 CUGCUGGCUGGAGCCCUGG CCAGGGCUCCAGCCAGCAG
2605
2606 1779-1797 UGCUGGCUGGAGCCCUGGA UCCAGGGCUCCAGCCAGCA
2607
2608 1780-1798 GCUGGCUGGAGCCCUGGAG CUCCAGGGCUCCAGCCAGC
2609
2610 1781-1799 CUGGCUGGAGCCCUGGAGU ACUCCAGGGCUCCAGCCAG
2611
2612 1782-1800 UGGCUGGAGCCCUGGAGUC GACUCCAGGGCUCCAGCCA
2613
2614 1783-1801 GGCUGGAGCCCUGGAGUCU AGACUCCAGGGCUCCAGCC
2615
2616 1784-1802 GCUGGAGCCCUGGAGUCUG CAGACUCCAGGGCUCCAGC
2617
2618 1785-1803 CUGGAGCCCUGGAGUCUGU ACAGACUCCAGGGCUCCAG
2619
2620 1786-1804 UGGAGCCCUGGAGUCUGUG CACAGACUCCAGGGCUCCA
2621
2622 1787-1805 GGAGCCCUGGAGUCUGUGC GCACAGACUCCAGGGCUCC
2623
2624 1788-1806 GAGCCCUGGAGUCUGUGCG CGCACAGACUCCAGGGCUC
2625
2626 1789-1807 AGCCCUGGAGUCUGUGCGG CCGCACAGACUCCAGGGCU
2627
2628 1790-1808 GCCCUGGAGUCUGUGCGGA UCCGCACAGACUCCAGGGC
2629
2630 1792-1810 CCUGGAGUCUGUGCGGAUC GAUCCGCACAGACUCCAGG
2631
2632 1793-1811 CUGGAGUCUGUGCGGAUCC GGAUCCGCACAGACUCCAG
2633
2634 1795-1813 GGAGUCUGUGCGGAUCCUG CAGGAUCCGCACAGACUCC
2635
2636 1796-1814 GAGUCUGUGCGGAUCCUGA UCAGGAUCCGCACAGACUC
2637
2638 1797-1815 AGUCUGUGCGGAUCCUGAA UUCAGGAUCCGCACAGACU
2639
2640 1798-1816 GUCUGUGCGGAUCCUGAAG CUUCAGGAUCCGCACAGAC
2641
2642 1799-1817 UCUGUGCGGAUCCUGAAGA UCUUCAGGAUCCGCACAGA
2643
2644 1800-1818 CUGUGCGGAUCCUGAAGAG CUCUUCAGGAUCCGCACAG
2645
2646 1801-1819 UGUGCGGAUCCUGAAGAGC GCUCUUCAGGAUCCGCACA
2647
2648 1802-1820 GUGCGGAUCCUGAAGAGCG CGCUCUUCAGGAUCCGCAC
2649
2650 1803-1821 UGCGGAUCCUGAAGAGCGC GCGCUCUUCAGGAUCCGCA
2651
2652 1804-1822 GCGGAUCCUGAAGAGCGCU AGCGCUCUUCAGGAUCCGC
2653
2654 1805-1823 CGGAUCCUGAAGAGCGCUG CAGCGCUCUUCAGGAUCCG
2655
2656 1806-1824 GGAUCCUGAAGAGCGCUGA UCAGCGCUCUUCAGGAUCC
2657
2658 1807-1825 GAUCCUGAAGAGCGCUGAG CUCAGCGCUCUUCAGGAUC
2659
2660 1808-1826 AUCCUGAAGAGCGCUGAGG CCUCAGCGCUCUUCAGGAU
2661
2662 1809-1827 UCCUGAAGAGCGCUGAGGG CCCUCAGCGCUCUUCAGGA
2663
2664 1810-1828 CCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGG
2665
2666 1811-1829 CUGAAGAGCGCUGAGGGAC GUCCCUCAGCGCUCUUCAG
2667
2668 1812-1830 UGAAGAGCGCUGAGGGACG CGUCCCUCAGCGCUCUUCA
2669
2670 1813-1831 GAAGAGCGCUGAGGGACGG CCGUCCCUCAGCGCUCUUC
2671
2672 1814-1832 AAGAGCGCUGAGGGACGGG CCCGUCCCUCAGCGCUCUU
2673
2674 1815-1833 AGAGCGCUGAGGGACGGGU ACCCGUCCCUCAGCGCUCU
2675
2676 1816-1834 GAGCGCUGAGGGACGGGUG CACCCGUCCCUCAGCGCUC
2677
2678 1817-1835 AGCGCUGAGGGACGGGUGC GCACCCGUCCCUCAGCGCU
2679
2680 1818-1836 GCGCUGAGGGACGGGUGCU AGCACCCGUCCCUCAGCGC
2681
2682 1819-1837 CGCUGAGGGACGGGUGCUU AAGCACCCGUCCCUCAGCG
2683
2684 1820-1838 GCUGAGGGACGGGUGCUUC GAAGCACCCGUCCCUCAGC
2685
2686 1821-1839 CUGAGGGACGGGUGCUUCG CGAAGCACCCGUCCCUCAG
2687
2688 1822-1840 UGAGGGACGGGUGCUUCGC GCGAAGCACCCGUCCCUCA
2689
2690 1823-1841 GAGGGACGGGUGCUUCGCC GGCGAAGCACCCGUCCCUC
2691
2692 1824-1842 AGGGACGGGUGCUUCGCCG CGGCGAAGCACCCGUCCCU
2693
2694 1825-1843 GGGACGGGUGCUUCGCCGC GCGGCGAAGCACCCGUCCC
2695
2696 1826-1844 GGACGGGUGCUUCGCCGCC GGCGGCGAAGCACCCGUCC
2697
2698 1827-1845 GACGGGUGCUUCGCCGCCA UGGCGGCGAAGCACCCGUC
2699
2700 1828-1846 ACGGGUGCUUCGCCGCCAG CUGGCGGCGAAGCACCCGU
2701
2702 1829-1847 CGGGUGCUUCGCCGCCAGC GCUGGCGGCGAAGCACCCG
2703
2704 1830-1848 GGGUGCUUCGCCGCCAGCA UGCUGGCGGCGAAGCACCC
2705
2706 1831-1849 GGUGCUUCGCCGCCAGCAC GUGCUGGCGGCGAAGCACC
2707
2708 1832-1850 GUGCUUCGCCGCCAGCACC GGUGCUGGCGGCGAAGCAC
2709
2710 1833-1851 UGCUUCGCCGCCAGCACCA UGGUGCUGGCGGCGAAGCA
2711
2712 1834-1852 GCUUCGCCGCCAGCACCAG CUGGUGCUGGCGGCGAAGC
2713
2714 1835-1853 CUUCGCCGCCAGCACCAGC GCUGGUGCUGGCGGCGAAG
2715
2716 1836-1854 UUCGCCGCCAGCACCAGCG CGCUGGUGCUGGCGGCGAA
2717
2718 1837-1855 UCGCCGCCAGCACCAGCGC GCGCUGGUGCUGGCGGCGA
2719
2720 1838-1856 CGCCGCCAGCACCAGCGCA UGCGCUGGUGCUGGCGGCG
2721
2722 1839-1857 GCCGCCAGCACCAGCGCAA UUGCGCUGGUGCUGGCGGC
2723
2724 1840-1858 CCGCCAGCACCAGCGCAAC GUUGCGCUGGUGCUGGCGG
2725
2726 1841-1859 CGCCAGCACCAGCGCAACG CGUUGCGCUGGUGCUGGCG
2727
2728 1842-1860 GCCAGCACCAGCGCAACGU ACGUUGCGCUGGUGCUGGC
2729
2730 1865-1883 CUCAUGAGACAGAUGCUAA UUAGCAUCUGUCUCAUGAG
2731
2732 1866-1884 UCAUGAGACAGAUGCUAAU AUUAGCAUCUGUCUCAUGA
2733
2734 1867-1885 CAUGAGACAGAUGCUAAUG CAUUAGCAUCUGUCUCAUG
2735
2736 1868-1886 AUGAGACAGAUGCUAAUGG CCAUUAGCAUCUGUCUCAU
2737
2738 1869-1887 UGAGACAGAUGCUAAUGGA UCCAUUAGCAUCUGUCUCA
2739
2740 1871-1889 AGACAGAUGCUAAUGGAUG CAUCCAUUAGCAUCUGUCU
2741
2742 1872-1890 GACAGAUGCUAAUGGAUGC GCAUCCAUUAGCAUCUGUC
2743
2744 1873-1891 ACAGAUGCUAAUGGAUGCC GGCAUCCAUUAGCAUCUGU
2745
2746 1874-1892 CAGAUGCUAAUGGAUGCCG CGGCAUCCAUUAGCAUCUG
2747
2748 1875-1893 AGAUGCUAAUGGAUGCCGG CCGGCAUCCAUUAGCAUCU
2749
2750 1876-1894 GAUGCUAAUGGAUGCCGGC GCCGGCAUCCAUUAGCAUC
2751
2752 1877-1895 AUGCUAAUGGAUGCCGGCC GGCCGGCAUCCAUUAGCAU
2753
2754 1878-1896 UGCUAAUGGAUGCCGGCCU AGGCCGGCAUCCAUUAGCA
2755
2756 1879-1897 GCUAAUGGAUGCCGGCCUC GAGGCCGGCAUCCAUUAGC
2757
2758 1880-1898 CUAAUGGAUGCCGGCCUCC GGAGGCCGGCAUCCAUUAG
2759
2760 1881-1899 UAAUGGAUGCCGGCCUCCC GGGAGGCCGGCAUCCAUUA
2761
2762 1882-1900 AAUGGAUGCCGGCCUCCCU AGGGAGGCCGGCAUCCAUU
2763
2764 1883-1901 AUGGAUGCCGGCCUCCCUG CAGGGAGGCCGGCAUCCAU
2765
2766 1884-1902 UGGAUGCCGGCCUCCCUGU ACAGGGAGGCCGGCAUCCA
2767
2768 1885-1903 GGAUGCCGGCCUCCCUGUU AACAGGGAGGCCGGCAUCC
2769
2770 1886-1904 GAUGCCGGCCUCCCUGUUG CAACAGGGAGGCCGGCAUC
2771
2772 1887-1905 AUGCCGGCCUCCCUGUUGU ACAACAGGGAGGCCGGCAU
2773
2774 1888-1906 UGCCGGCCUCCCUGUUGUC GACAACAGGGAGGCCGGCA
2775
2776 1889-1907 GCCGGCCUCCCUGUUGUCC GGACAACAGGGAGGCCGGC
2777
2778 1890-1908 CCGGCCUCCCUGUUGUCCA UGGACAACAGGGAGGCCGG
2779
2780 1891-1909 CGGCCUCCCUGUUGUCCAC GUGGACAACAGGGAGGCCG
2781
2782 1892-1910 GGCCUCCCUGUUGUCCACU AGUGGACAACAGGGAGGCC
2783
2784 1893-1911 GCCUCCCUGUUGUCCACUG CAGUGGACAACAGGGAGGC
2785
2786 1894-1912 CCUCCCUGUUGUCCACUGC GCAGUGGACAACAGGGAGG
2787
2788 1895-1913 CUCCCUGUUGUCCACUGCC GGCAGUGGACAACAGGGAG
2789
2790 1896-1914 UCCCUGUUGUCCACUGCCC GGGCAGUGGACAACAGGGA
2791
2792 1897-1915 CCCUGUUGUCCACUGCCCC GGGGCAGUGGACAACAGGG
2793
2794 1898-1916 CCUGUUGUCCACUGCCCCA UGGGGCAGUGGACAACAGG
2795
2796 1899-1917 CUGUUGUCCACUGCCCCAG CUGGGGCAGUGGACAACAG
2797
2798 1900-1918 UGUUGUCCACUGCCCCAGC GCUGGGGCAGUGGACAACA
2799
2800 1901-1919 GUUGUCCACUGCCCCAGCC GGCUGGGGCAGUGGACAAC
2801
2802 1902-1920 UUGUCCACUGCCCCAGCCA UGGCUGGGGCAGUGGACAA
2803
2804 1903-1921 UGUCCACUGCCCCAGCCAC GUGGCUGGGGCAGUGGACA
2805
2806 1904-1922 GUCCACUGCCCCAGCCACA UGUGGCUGGGGCAGUGGAC
2807
2808 1905-1923 UCCACUGCCCCAGCCACAU AUGUGGCUGGGGCAGUGGA
2809
2810 1906-1924 CCACUGCCCCAGCCACAUC GAUGUGGCUGGGGCAGUGG
2811
2812 1907-1925 CACUGCCCCAGCCACAUCA UGAUGUGGCUGGGGCAGUG
2813
2814 1908-1926 ACUGCCCCAGCCACAUCAU AUGAUGUGGCUGGGGCAGU
2815
2816 1909-1927 CUGCCCCAGCCACAUCAUC GAUGAUGUGGCUGGGGCAG
2817
2818 1910-1928 UGCCCCAGCCACAUCAUCC GGAUGAUGUGGCUGGGGCA
2819
2820 1911-1929 GCCCCAGCCACAUCAUCCC GGGAUGAUGUGGCUGGGGC
2821
2822 1912-1930 CCCCAGCCACAUCAUCCCU AGGGAUGAUGUGGCUGGGG
2823
2824 1913-1931 CCCAGCCACAUCAUCCCUG CAGGGAUGAUGUGGCUGGG
2825
2826 1914-1932 CCAGCCACAUCAUCCCUGU ACAGGGAUGAUGUGGCUGG
2827
2828 1915-1933 CAGCCACAUCAUCCCUGUG CACAGGGAUGAUGUGGCUG
2829
2830 1916-1934 AGCCACAUCAUCCCUGUGC GCACAGGGAUGAUGUGGCU
2831
2832 1917-1935 GCCACAUCAUCCCUGUGCG CGCACAGGGAUGAUGUGGC
2833
2834 1918-1936 CCACAUCAUCCCUGUGCGG CCGCACAGGGAUGAUGUGG
2835
2836 1919-1937 CACAUCAUCCCUGUGCGGG CCCGCACAGGGAUGAUGUG
2837
2838 1920-1938 ACAUCAUCCCUGUGCGGGU ACCCGCACAGGGAUGAUGU
2839
2840 1922-1940 AUCAUCCCUGUGCGGGUUG CAACCCGCACAGGGAUGAU
2841
2842 1923-1941 UCAUCCCUGUGCGGGUUGC GCAACCCGCACAGGGAUGA
2843
2844 1924-1942 CAUCCCUGUGCGGGUUGCA UGCAACCCGCACAGGGAUG
2845
2846 1925-1943 AUCCCUGUGCGGGUUGCAG CUGCAACCCGCACAGGGAU
2847
2848 1926-1944 UCCCUGUGCGGGUUGCAGA UCUGCAACCCGCACAGGGA
2849
2850 1928-1946 CCUGUGCGGGUUGCAGAUG CAUCUGCAACCCGCACAGG
2851
2852 1929-1947 CUGUGCGGGUUGCAGAUGC GCAUCUGCAACCCGCACAG
2853
2854 1930-1948 UGUGCGGGUUGCAGAUGCU AGCAUCUGCAACCCGCACA
2855
2856 1931-1949 GUGCGGGUUGCAGAUGCUG CAGCAUCUGCAACCCGCAC
2857
2858 1932-1950 UGCGGGUUGCAGAUGCUGC GCAGCAUCUGCAACCCGCA
2859
2860 1933-1951 GCGGGUUGCAGAUGCUGCU AGCAGCAUCUGCAACCCGC
2861
2862 1934-1952 CGGGUUGCAGAUGCUGCUA UAGCAGCAUCUGCAACCCG
2863
2864 1935-1953 GGGUUGCAGAUGCUGCUAA UUAGCAGCAUCUGCAACCC
2865
2866 1936-1954 GGUUGCAGAUGCUGCUAAA UUUAGCAGCAUCUGCAACC
2867
2868 1937-1955 GUUGCAGAUGCUGCUAAAA UUUUAGCAGCAUCUGCAAC
2869
2870 1938-1956 UUGCAGAUGCUGCUAAAAA UUUUUAGCAGCAUCUGCAA
2871
2872 1939-1957 UGCAGAUGCUGCUAAAAAC GUUUUUAGCAGCAUCUGCA
2873
2874 1940-1958 GCAGAUGCUGCUAAAAACA UGUUUUUAGCAGCAUCUGC
2875
2876 1941-1959 CAGAUGCUGCUAAAAACAC GUGUUUUUAGCAGCAUCUG
2877
2878 1961-1979 GAAGUCUGUGAUGAACUAA UUAGUUCAUCACAGACUUC
2879
2880 1963-1981 AGUCUGUGAUGAACUAAUG CAUUAGUUCAUCACAGACU
2881
2882 1965-1983 UCUGUGAUGAACUAAUGAG CUCAUUAGUUCAUCACAGA
2883
2884 1966-1984 CUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAG
2885
2886 1968-1986 GUGAUGAACUAAUGAGCAG CUGCUCAUUAGUUCAUCAC
2887
2888 1969-1987 UGAUGAACUAAUGAGCAGA UCUGCUCAUUAGUUCAUCA
2889
2890 1970-1988 GAUGAACUAAUGAGCAGAC GUCUGCUCAUUAGUUCAUC
2891
2892 1971-1989 AUGAACUAAUGAGCAGACA UGUCUGCUCAUUAGUUCAU
2893
2894 1972-1990 UGAACUAAUGAGCAGACAU AUGUCUGCUCAUUAGUUCA
2895
2896 1973-1991 GAACUAAUGAGCAGACAUA UAUGUCUGCUCAUUAGUUC
2897
2898 1974-1992 AACUAAUGAGCAGACAUAA UUAUGUCUGCUCAUUAGUU
2899
2900 1975-1993 ACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGU
2901
2902 1978-1996 AAUGAGCAGACAUAACAUC GAUGUUAUGUCUGCUCAUU
2903
2904 1979-1997 AUGAGCAGACAUAACAUCU AGAUGUUAUGUCUGCUCAU
2905
2906 1980-1998 UGAGCAGACAUAACAUCUA UAGAUGUUAUGUCUGCUCA
2907
2908 2000-2018 GUGCAAGCAAUCAAUUACC GGUAAUUGAUUGCUUGCAC
2909
2910 2001-2019 UGCAAGCAAUCAAUUACCC GGGUAAUUGAUUGCUUGCA
2911
2912 2002-2020 GCAAGCAAUCAAUUACCCU AGGGUAAUUGAUUGCUUGC
2913
2914 2004-2022 AAGCAAUCAAUUACCCUAC GUAGGGUAAUUGAUUGCUU
2915
2916 2024-2042 GUGCCCCGGGGAGAAGAGC GCUCUUCUCCCCGGGGCAC
2917
2918 2025-2043 UGCCCCGGGGAGAAGAGCU AGCUCUUCUCCCCGGGGCA
2919
2920 2026-2044 GCCCCGGGGAGAAGAGCUC GAGCUCUUCUCCCCGGGGC
2921
2922 2027-2045 CCCCGGGGAGAAGAGCUCC GGAGCUCUUCUCCCCGGGG
2923
2924 2028-2046 CCCGGGGAGAAGAGCUCCU AGGAGCUCUUCUCCCCGGG
2925
2926 2029-2047 CCGGGGAGAAGAGCUCCUA UAGGAGCUCUUCUCCCCGG
2927
2928 2030-2048 CGGGGAGAAGAGCUCCUAC GUAGGAGCUCUUCUCCCCG
2929
2930 2031-2049 GGGGAGAAGAGCUCCUACG CGUAGGAGCUCUUCUCCCC
2931
2932 2032-2050 GGGAGAAGAGCUCCUACGG CCGUAGGAGCUCUUCUCCC
2933
2934 2033-2051 GGAGAAGAGCUCCUACGGA UCCGUAGGAGCUCUUCUCC
2935
2936 2034-2052 GAGAAGAGCUCCUACGGAU AUCCGUAGGAGCUCUUCUC
2937
2938 2060-2078 ACCCCUCACCACACACCCC GGGGUGUGUGGUGAGGGGU
2939
2940 2061-2079 CCCCUCACCACACACCCCA UGGGGUGUGUGGUGAGGGG
2941
2942 2062-2080 CCCUCACCACACACCCCAG CUGGGGUGUGUGGUGAGGG
2943
2944 2063-2081 CCUCACCACACACCCCAGA UCUGGGGUGUGUGGUGAGG
2945
2946 2064-2082 CUCACCACACACCCCAGAU AUCUGGGGUGUGUGGUGAG
2947
2948 2065-2083 UCACCACACACCCCAGAUG CAUCUGGGGUGUGUGGUGA
2949
2950 2066-2084 CACCACACACCCCAGAUGA UCAUCUGGGGUGUGUGGUG
2951
2952 2067-2085 ACCACACACCCCAGAUGAU AUCAUCUGGGGUGUGUGGU
2953
2954 2068-2086 CCACACACCCCAGAUGAUG CAUCAUCUGGGGUGUGUGG
2955
2956 2069-2087 CACACACCCCAGAUGAUGA UCAUCAUCUGGGGUGUGUG
2957
2958 2070-2088 ACACACCCCAGAUGAUGAA UUCAUCAUCUGGGGUGUGU
2959
2960 2071-2089 CACACCCCAGAUGAUGAAC GUUCAUCAUCUGGGGUGUG
2961
2962 2072-2090 ACACCCCAGAUGAUGAACU AGUUCAUCAUCUGGGGUGU
2963
2964 2073-2091 CACCCCAGAUGAUGAACUA UAGUUCAUCAUCUGGGGUG
2965
2966 2074-2092 ACCCCAGAUGAUGAACUAC GUAGUUCAUCAUCUGGGGU
2967
2968 2076-2094 CCCAGAUGAUGAACUACUU AAGUAGUUCAUCAUCUGGG
2969
2970 2077-2095 CCAGAUGAUGAACUACUUC GAAGUAGUUCAUCAUCUGG
2971
2972 2078-2096 CAGAUGAUGAACUACUUCC GGAAGUAGUUCAUCAUCUG
2973
2974 2079-2097 AGAUGAUGAACUACUUCCU AGGAAGUAGUUCAUCAUCU
2975
2976 2080-2098 GAUGAUGAACUACUUCCUU AAGGAAGUAGUUCAUCAUC
2977
2978 2081-2099 AUGAUGAACUACUUCCUUG CAAGGAAGUAGUUCAUCAU
2979
2980 2082-2100 UGAUGAACUACUUCCUUGA UCAAGGAAGUAGUUCAUCA
2981
2982 2083-2101 GAUGAACUACUUCCUUGAG CUCAAGGAAGUAGUUCAUC
2983
2984 2084-2102 AUGAACUACUUCCUUGAGA UCUCAAGGAAGUAGUUCAU
2985
2986 2085-2103 UGAACUACUUCCUUGAGAA UUCUCAAGGAAGUAGUUCA
2987
2988 2086-2104 GAACUACUUCCUUGAGAAU AUUCUCAAGGAAGUAGUUC
2989
2990 2087-2105 AACUACUUCCUUGAGAAUC GAUUCUCAAGGAAGUAGUU
2991
2992 2088-2106 ACUACUUCCUUGAGAAUCU AGAUUCUCAAGGAAGUAGU
2993
2994 2089-2107 CUACUUCCUUGAGAAUCUG CAGAUUCUCAAGGAAGUAG
2995
2996 2090-2108 UACUUCCUUGAGAAUCUGC GCAGAUUCUCAAGGAAGUA
2997
2998 2091-2109 ACUUCCUUGAGAAUCUGCU AGCAGAUUCUCAAGGAAGU
2999
3000 2117-2135 UGGAAGCAAGUGGGGCUGG CCAGCCCCACUUGCUUCCA
3001
3002 2118-2136 GGAAGCAAGUGGGGCUGGA UCCAGCCCCACUUGCUUCC
3003
3004 2119-2137 GAAGCAAGUGGGGCUGGAA UUCCAGCCCCACUUGCUUC
3005
3006 2120-2138 AAGCAAGUGGGGCUGGAAC GUUCCAGCCCCACUUGCUU
3007
3008 2121-2139 AGCAAGUGGGGCUGGAACU AGUUCCAGCCCCACUUGCU
3009
3010 2122-2140 GCAAGUGGGGCUGGAACUG CAGUUCCAGCCCCACUUGC
3011
3012 2123-2141 CAAGUGGGGCUGGAACUGA UCAGUUCCAGCCCCACUUG
3013
3014 2124-2142 AAGUGGGGCUGGAACUGAA UUCAGUUCCAGCCCCACUU
3015
3016 2125-2143 AGUGGGGCUGGAACUGAAG CUUCAGUUCCAGCCCCACU
3017
3018 2126-2144 GUGGGGCUGGAACUGAAGC GCUUCAGUUCCAGCCCCAC
3019
3020 2127-2145 UGGGGCUGGAACUGAAGCC GGCUUCAGUUCCAGCCCCA
3021
3022 2147-2165 CAUUCCUCAGCUGAGUGCA UGCACUCAGCUGAGGAAUG
3023
3024 2148-2166 AUUCCUCAGCUGAGUGCAA UUGCACUCAGCUGAGGAAU
3025
3026 2149-2167 UUCCUCAGCUGAGUGCAAC GUUGCACUCAGCUGAGGAA
3027
3028 2150-2168 UCCUCAGCUGAGUGCAACU AGUUGCACUCAGCUGAGGA
3029
3030 2151-2169 CCUCAGCUGAGUGCAACUU AAGUUGCACUCAGCUGAGG
3031
3032 2152-2170 CUCAGCUGAGUGCAACUUC GAAGUUGCACUCAGCUGAG
3033
3034 2153-2171 UCAGCUGAGUGCAACUUCU AGAAGUUGCACUCAGCUGA
3035
3036 2154-2172 CAGCUGAGUGCAACUUCUG CAGAAGUUGCACUCAGCUG
3037
3038 2155-2173 AGCUGAGUGCAACUUCUGC GCAGAAGUUGCACUCAGCU
3039
3040 2156-2174 GCUGAGUGCAACUUCUGCA UGCAGAAGUUGCACUCAGC
3041
3042 2157-2175 CUGAGUGCAACUUCUGCAG CUGCAGAAGUUGCACUCAG
3043
3044 2158-2176 UGAGUGCAACUUCUGCAGG CCUGCAGAAGUUGCACUCA
3045
3046 2159-2177 GAGUGCAACUUCUGCAGGA UCCUGCAGAAGUUGCACUC
3047
3048 2160-2178 AGUGCAACUUCUGCAGGAG CUCCUGCAGAAGUUGCACU
3049
3050 2161-2179 GUGCAACUUCUGCAGGAGG CCUCCUGCAGAAGUUGCAC
3051
3052 2162-2180 UGCAACUUCUGCAGGAGGC GCCUCCUGCAGAAGUUGCA
3053
3054 2163-2181 GCAACUUCUGCAGGAGGCC GGCCUCCUGCAGAAGUUGC
3055
3056 2164-2182 CAACUUCUGCAGGAGGCCA UGGCCUCCUGCAGAAGUUG
3057
3058 2165-2183 AACUUCUGCAGGAGGCCAC GUGGCCUCCUGCAGAAGUU
3059
3060 2166-2184 ACUUCUGCAGGAGGCCACU AGUGGCCUCCUGCAGAAGU
3061
3062 2167-2185 CUUCUGCAGGAGGCCACUG CAGUGGCCUCCUGCAGAAG
3063
3064 2168-2186 UUCUGCAGGAGGCCACUGC GCAGUGGCCUCCUGCAGAA
3065
3066 2169-2187 UCUGCAGGAGGCCACUGCA UGCAGUGGCCUCCUGCAGA
3067
3068 2170-2188 CUGCAGGAGGCCACUGCAU AUGCAGUGGCCUCCUGCAG
3069
3070 2171-2189 UGCAGGAGGCCACUGCAUU AAUGCAGUGGCCUCCUGCA
3071
3072 2172-2190 GCAGGAGGCCACUGCAUUU AAAUGCAGUGGCCUCCUGC
3073
3074 2173-2191 CAGGAGGCCACUGCAUUUU AAAAUGCAGUGGCCUCCUG
3075
3076 2174-2192 AGGAGGCCACUGCAUUUUG CAAAAUGCAGUGGCCUCCU
3077
3078 2175-2193 GGAGGCCACUGCAUUUUGA UCAAAAUGCAGUGGCCUCC
3079
3080 2176-2194 GAGGCCACUGCAUUUUGAA UUCAAAAUGCAGUGGCCUC
3081
3082 2177-2195 AGGCCACUGCAUUUUGAAG CUUCAAAAUGCAGUGGCCU
3083
3084 2178-2196 GGCCACUGCAUUUUGAAGU ACUUCAAAAUGCAGUGGCC
3085
3086 2179-2197 GCCACUGCAUUUUGAAGUG CACUUCAAAAUGCAGUGGC
3087
3088 2180-2198 CCACUGCAUUUUGAAGUGA UCACUUCAAAAUGCAGUGG
3089
3090 2181-2199 CACUGCAUUUUGAAGUGAU AUCACUUCAAAAUGCAGUG
3091
3092 2182-2200 ACUGCAUUUUGAAGUGAUG CAUCACUUCAAAAUGCAGU
3093
3094 2183-2201 CUGCAUUUUGAAGUGAUGA UCAUCACUUCAAAAUGCAG
3095
3096 2184-2202 UGCAUUUUGAAGUGAUGAG CUCAUCACUUCAAAAUGCA
3097
3098 2185-2203 GCAUUUUGAAGUGAUGAGU ACUCAUCACUUCAAAAUGC
3099
3100 2186-2204 CAUUUUGAAGUGAUGAGUG CACUCAUCACUUCAAAAUG
3101
3102 2187-2205 AUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAU
3103
3104 2188-2206 UUUUGAAGUGAUGAGUGAA UUCACUCAUCACUUCAAAA
3105
3106 2190-2208 UUGAAGUGAUGAGUGAAAG CUUUCACUCAUCACUUCAA
3107
3108 2191-2209 UGAAGUGAUGAGUGAAAGA UCUUUCACUCAUCACUUCA
3109
3110 2192-2210 GAAGUGAUGAGUGAAAGAG CUCUUUCACUCAUCACUUC
3111
3112 2193-2211 AAGUGAUGAGUGAAAGAGA UCUCUUUCACUCAUCACUU
3113
3114 2194-2212 AGUGAUGAGUGAAAGAGAG CUCUCUUUCACUCAUCACU
3115
3116 2195-2213 GUGAUGAGUGAAAGAGAGA UCUCUCUUUCACUCAUCAC
3117
3118 2196-2214 UGAUGAGUGAAAGAGAGAA UUCUCUCUUUCACUCAUCA
3119
3120 2197-2215 GAUGAGUGAAAGAGAGAAG CUUCUCUCUUUCACUCAUC
3121
3122 2198-2216 AUGAGUGAAAGAGAGAAGU ACUUCUCUCUUUCACUCAU
3123
3124 2199-2217 UGAGUGAAAGAGAGAAGUC GACUUCUCUCUUUCACUCA
3125
3126 2200-2218 GAGUGAAAGAGAGAAGUCC GGACUUCUCUCUUUCACUC
3127
3128 2201-2219 AGUGAAAGAGAGAAGUCCU AGGACUUCUCUCUUUCACU
3129
3130 2202-2220 GUGAAAGAGAGAAGUCCUA UAGGACUUCUCUCUUUCAC
3131
3132 2203-2221 UGAAAGAGAGAAGUCCUAU AUAGGACUUCUCUCUUUCA
3133
3134 2204-2222 GAAAGAGAGAAGUCCUAUU AAUAGGACUUCUCUCUUUC
3135
3136 2205-2223 AAAGAGAGAAGUCCUAUUU AAAUAGGACUUCUCUCUUU
3137
3138 2206-2224 AAGAGAGAAGUCCUAUUUC GAAAUAGGACUUCUCUCUU
3139
3140 2207-2225 AGAGAGAAGUCCUAUUUCU AGAAAUAGGACUUCUCUCU
3141
3142 2208-2226 GAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUC
3143
3144 2209-2227 AGAGAAGUCCUAUUUCUCA UGAGAAAUAGGACUUCUCU
3145
3146 2210-2228 GAGAAGUCCUAUUUCUCAG CUGAGAAAUAGGACUUCUC
3147
3148 2211-2229 AGAAGUCCUAUUUCUCAGG CCUGAGAAAUAGGACUUCU
3149
3150 2212-2230 GAAGUCCUAUUUCUCAGGC GCCUGAGAAAUAGGACUUC
3151
3152 2213-2231 AAGUCCUAUUUCUCAGGCU AGCCUGAGAAAUAGGACUU
3153
3154 2214-2232 AGUCCUAUUUCUCAGGCUU AAGCCUGAGAAAUAGGACU
3155
3156 2215-2233 GUCCUAUUUCUCAGGCUUG CAAGCCUGAGAAAUAGGAC
3157
3158 2216-2234 UCCUAUUUCUCAGGCUUGA UCAAGCCUGAGAAAUAGGA
3159
3160 2217-2235 CCUAUUUCUCAGGCUUGAG CUCAAGCCUGAGAAAUAGG
3161
3162 2218-2236 CUAUUUCUCAGGCUUGAGC GCUCAAGCCUGAGAAAUAG
3163
3164 2219-2237 UAUUUCUCAGGCUUGAGCA UGCUCAAGCCUGAGAAAUA
3165
3166 2220-2238 AUUUCUCAGGCUUGAGCAA UUGCUCAAGCCUGAGAAAU
3167
3168 2221-2239 UUUCUCAGGCUUGAGCAAG CUUGCUCAAGCCUGAGAAA
3169
3170 2222-2240 UUCUCAGGCUUGAGCAAGU ACUUGCUCAAGCCUGAGAA
3171
3172 2223-2241 UCUCAGGCUUGAGCAAGUU AACUUGCUCAAGCCUGAGA
3173
3174 2224-2242 CUCAGGCUUGAGCAAGUUG CAACUUGCUCAAGCCUGAG
3175
3176 2225-2243 UCAGGCUUGAGCAAGUUGG CCAACUUGCUCAAGCCUGA
3177
3178 2226-2244 CAGGCUUGAGCAAGUUGGU ACCAACUUGCUCAAGCCUG
3179
3180 2229-2247 GCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGC
3181
3182 2231-2249 UUGAGCAAGUUGGUAUCUG CAGAUACCAACUUGCUCAA
3183
3184 2232-2250 UGAGCAAGUUGGUAUCUGC GCAGAUACCAACUUGCUCA
3185
3186 2233-2251 GAGCAAGUUGGUAUCUGCU AGCAGAUACCAACUUGCUC
3187
3188 2234-2252 AGCAAGUUGGUAUCUGCUC GAGCAGAUACCAACUUGCU
3189
3190 2235-2253 GCAAGUUGGUAUCUGCUCA UGAGCAGAUACCAACUUGC
3191
3192 2236-2254 CAAGUUGGUAUCUGCUCAG CUGAGCAGAUACCAACUUG
3193
3194 2237-2255 AAGUUGGUAUCUGCUCAGG CCUGAGCAGAUACCAACUU
3195
3196 2238-2256 AGUUGGUAUCUGCUCAGGC GCCUGAGCAGAUACCAACU
3197
3198 2239-2257 GUUGGUAUCUGCUCAGGCC GGCCUGAGCAGAUACCAAC
3199
3200 2240-2258 UUGGUAUCUGCUCAGGCCU AGGCCUGAGCAGAUACCAA
3201
3202 2241-2259 UGGUAUCUGCUCAGGCCUG CAGGCCUGAGCAGAUACCA
3203
3204 2242-2260 GGUAUCUGCUCAGGCCUGA UCAGGCCUGAGCAGAUACC
3205
3206 2243-2261 GUAUCUGCUCAGGCCUGAG CUCAGGCCUGAGCAGAUAC
3207
3208 2244-2262 UAUCUGCUCAGGCCUGAGC GCUCAGGCCUGAGCAGAUA
3209
3210 2245-2263 AUCUGCUCAGGCCUGAGCA UGCUCAGGCCUGAGCAGAU
3211
3212 2246-2264 UCUGCUCAGGCCUGAGCAU AUGCUCAGGCCUGAGCAGA
3213
3214 2247-2265 CUGCUCAGGCCUGAGCAUG CAUGCUCAGGCCUGAGCAG
3215
3216 2248-2266 UGCUCAGGCCUGAGCAUGA UCAUGCUCAGGCCUGAGCA
3217
3218 2249-2267 GCUCAGGCCUGAGCAUGAC GUCAUGCUCAGGCCUGAGC
3219
3220 2250-2268 CUCAGGCCUGAGCAUGACC GGUCAUGCUCAGGCCUGAG
3221
3222 2251-2269 UCAGGCCUGAGCAUGACCU AGGUCAUGCUCAGGCCUGA
3223
3224 2252-2270 CAGGCCUGAGCAUGACCUC GAGGUCAUGCUCAGGCCUG
3225
3226 2253-2271 AGGCCUGAGCAUGACCUCA UGAGGUCAUGCUCAGGCCU
3227
3228 2279-2297 CACUUAACCCCAGGCCAUU AAUGGCCUGGGGUUAAGUG
3229
3230 2280-2298 ACUUAACCCCAGGCCAUUA UAAUGGCCUGGGGUUAAGU
3231
3232 2281-2299 CUUAACCCCAGGCCAUUAU AUAAUGGCCUGGGGUUAAG
3233
3234 2282-2300 UUAACCCCAGGCCAUUAUC GAUAAUGGCCUGGGGUUAA
3235
3236 2283-2301 UAACCCCAGGCCAUUAUCA UGAUAAUGGCCUGGGGUUA
3237
3238 2284-2302 AACCCCAGGCCAUUAUCAU AUGAUAAUGGCCUGGGGUU
3239
3240 2285-2303 ACCCCAGGCCAUUAUCAUA UAUGAUAAUGGCCUGGGGU
3241
3242 2287-2305 CCCAGGCCAUUAUCAUAUC GAUAUGAUAAUGGCCUGGG
3243
3244 2288-2306 CCAGGCCAUUAUCAUAUCC GGAUAUGAUAAUGGCCUGG
3245
3246 2289-2307 CAGGCCAUUAUCAUAUCCA UGGAUAUGAUAAUGGCCUG
3247
3248 2290-2308 AGGCCAUUAUCAUAUCCAG CUGGAUAUGAUAAUGGCCU
3249
3250 2291-2309 GGCCAUUAUCAUAUCCAGA UCUGGAUAUGAUAAUGGCC
3251
3252 2292-2310 GCCAUUAUCAUAUCCAGAU AUCUGGAUAUGAUAAUGGC
3253
3254 2314-2332 CUUCAGAGUUGUCUUUAUA UAUAAAGACAACUCUGAAG
3255
3256 2315-2333 UUCAGAGUUGUCUUUAUAU AUAUAAAGACAACUCUGAA
3257
3258 2316-2334 UCAGAGUUGUCUUUAUAUG CAUAUAAAGACAACUCUGA
3259
3260 2318-2336 AGAGUUGUCUUUAUAUGUG CACAUAUAAAGACAACUCU
3261
3262 2322-2340 UUGUCUUUAUAUGUGAAUU AAUUCACAUAUAAAGACAA
3263
3264 2323-2341 UGUCUUUAUAUGUGAAUUA UAAUUCACAUAUAAAGACA
3265
3266 2324-2342 GUCUUUAUAUGUGAAUUAA UUAAUUCACAUAUAAAGAC
3267
3268 2325-2343 UCUUUAUAUGUGAAUUAAG CUUAAUUCACAUAUAAAGA
3269
3270 2326-2344 CUUUAUAUGUGAAUUAAGU ACUUAAUUCACAUAUAAAG
3271
3272 2327-2345 UUUAUAUGUGAAUUAAGUU AACUUAAUUCACAUAUAAA
3273
3274 2328-2346 UUAUAUGUGAAUUAAGUUA UAACUUAAUUCACAUAUAA
3275
3276 2329-2347 UAUAUGUGAAUUAAGUUAU AUAACUUAAUUCACAUAUA
3277
3278 2330-2348 AUAUGUGAAUUAAGUUAUA UAUAACUUAAUUCACAUAU
3279
3280 2331-2349 UAUGUGAAUUAAGUUAUAU AUAUAACUUAAUUCACAUA
3281
3282 2332-2350 AUGUGAAUUAAGUUAUAUU AAUAUAACUUAAUUCACAU
3283
3284 2333-2351 UGUGAAUUAAGUUAUAUUA UAAUAUAACUUAAUUCACA
3285
3286 2334-2352 GUGAAUUAAGUUAUAUUAA UUAAUAUAACUUAAUUCAC
3287
3288 2335-2353 UGAAUUAAGUUAUAUUAAA UUUAAUAUAACUUAAUUCA
3289
3290 2336-2354 GAAUUAAGUUAUAUUAAAU AUUUAAUAUAACUUAAUUC
3291
3292 2337-2355 AAUUAAGUUAUAUUAAAUU AAUUUAAUAUAACUUAAUU
3293
3294 2338-2356 AUUAAGUUAUAUUAAAUUU AAAUUUAAUAUAACUUAAU
3295
3296 2339-2357 UUAAGUUAUAUUAAAUUUU AAAAUUUAAUAUAACUUAA
3297
3298 2340-2358 UAAGUUAUAUUAAAUUUUA UAAAAUUUAAUAUAACUUA
3299
3300 2341-2359 AAGUUAUAUUAAAUUUUAA UUAAAAUUUAAUAUAACUU
3301
3302 2342-2360 AGUUAUAUUAAAUUUUAAU AUUAAAAUUUAAUAUAACU
3303
3304 2343-2361 GUUAUAUUAAAUUUUAAUC GAUUAAAAUUUAAUAUAAC
3305
3306 2345-2363 UAUAUUAAAUUUUAAUCUA UAGAUUAAAAUUUAAUAUA
3307
3308 2346-2364 AUAUUAAAUUUUAAUCUAU AUAGAUUAAAAUUUAAUAU
3309
3310 2347-2365 UAUUAAAUUUUAAUCUAUA UAUAGAUUAAAAUUUAAUA
3311
3312 2348-2366 AUUAAAUUUUAAUCUAUAG CUAUAGAUUAAAAUUUAAU
3313
3314 2349-2367 UUAAAUUUUAAUCUAUAGU ACUAUAGAUUAAAAUUUAA
3315
3316 2350-2368 UAAAUUUUAAUCUAUAGUA UACUAUAGAUUAAAAUUUA
3317
3318 2351-2369 AAAUUUUAAUCUAUAGUAA UUACUAUAGAUUAAAAUUU
3319
3320 2354-2372 UUUUAAUCUAUAGUAAAAA UUUUUACUAUAGAUUAAAA
3321
3322 2355-2373 UUUAAUCUAUAGUAAAAAC GUUUUUACUAUAGAUUAAA
3323
3324 2356-2374 UUAAUCUAUAGUAAAAACA UGUUUUUACUAUAGAUUAA
3325
3326 2357-2375 UAAUCUAUAGUAAAAACAU AUGUUUUUACUAUAGAUUA
3327
3328 2358-2376 AAUCUAUAGUAAAAACAUA UAUGUUUUUACUAUAGAUU
3329
3330 2359-2377 AUCUAUAGUAAAAACAUAG CUAUGUUUUUACUAUAGAU
3331
3332 2360-2378 UCUAUAGUAAAAACAUAGU ACUAUGUUUUUACUAUAGA
3333
3334 2361-2379 CUAUAGUAAAAACAUAGUC GACUAUGUUUUUACUAUAG
3335
3336 2362-2380 UAUAGUAAAAACAUAGUCC GGACUAUGUUUUUACUAUA
3337
3338 2363-2381 AUAGUAAAAACAUAGUCCU AGGACUAUGUUUUUACUAU
3339
3340 2364-2382 UAGUAAAAACAUAGUCCUG CAGGACUAUGUUUUUACUA
3341
3342 2365-2383 AGUAAAAACAUAGUCCUGG CCAGGACUAUGUUUUUACU
3343
3344 2366-2384 GUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUAC
3345
3346 2367-2385 UAAAAACAUAGUCCUGGAA UUCCAGGACUAUGUUUUUA
3347
3348 2368-2386 AAAAACAUAGUCCUGGAAA UUUCCAGGACUAUGUUUUU
3349
3350 2369-2387 AAAACAUAGUCCUGGAAAU AUUUCCAGGACUAUGUUUU
3351
3352 2370-2388 AAACAUAGUCCUGGAAAUA UAUUUCCAGGACUAUGUUU
3353
3354 2371-2389 AACAUAGUCCUGGAAAUAA UUAUUUCCAGGACUAUGUU
3355
3356 2372-2390 ACAUAGUCCUGGAAAUAAA UUUAUUUCCAGGACUAUGU
3357
3358 2373-2391 CAUAGUCCUGGAAAUAAAU AUUUAUUUCCAGGACUAUG
3359
3360 2374-2392 AUAGUCCUGGAAAUAAAUU AAUUUAUUUCCAGGACUAU
3361
3362 2375-2393 UAGUCCUGGAAAUAAAUUC GAAUUUAUUUCCAGGACUA
3363
3364 2377-2395 GUCCUGGAAAUAAAUUCUU AAGAAUUUAUUUCCAGGAC
3365
3366 2378-2396 UCCUGGAAAUAAAUUCUUG CAAGAAUUUAUUUCCAGGA
Ejemplo 9. Supresión de precursores de porfirinas utilizando ARNip de ALAS1 en un paradigma de tratamiento agudo
ejemplo, cuando un paciente humano con porfiria padece un ataque agudo. La administración del ARNip de la formulación LNP11 AD-53558 con una dosis de 1 mg/kg 12 horas después de la última dosis de fenobarbital redujo rápidamente los niveles de ALA y PBG en plasma de ratón, mientras que en los animales tratados con control de Luc los niveles siguieron subiendo (FIG. 14). Estos resultados indican que el ARNip de ALAS es eficaz a la hora de tratar un ataque agudo. El ARNip de ALAS1 fue eficaz a la hora de reducir y prevenir incrementos adicionales de los niveles de ALA y PBG.
Ejemplo 10. ARNip que tienen ALAS1 como diana
Se diseñaron y produjeron secuencias de ARNip modificadas y no modificadas adicionales que tenían como diana el ARNip de ALAS1, según se ha descrito en el Ejemplo 2. Se evaluó la actividad in vitro de los dúplex modificados según se describe a continuación.
Métodos
Transfección mediada por lípidos
Para Hep3B, PMH y hepatocitos de Cynomolgus primarios, la transfección se llevó a cabo añadiendo 14.8 µl de Opti-MEM más 0.2 µl de Lipofectamine RNAiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA., número de catálogo 13778150) a 5 µl de cada dúplex de ARNip en un pocillo individual en una placa de 96 pocillos. A continuación, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 80 µl de medio de cultivo completo sin antibiótico que contenían el número adecuado de células a la mezcla de ARNip. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN.
Se llevaron a cabo experimentos de dosis única con una concentración final del dúplex de 1 µM, 500 nM, 20 nM, 10 nM y 0.2 nM para GalNAc modificado.
Transfección de captación libre
Hepatocitos de Cynomolgus primarios conservados criológicamente (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) se descongelaron a 37 °C en un baño de agua inmediatamente antes de su uso y se suspendieron de nuevo con una concentración de 0.26x106 células/ml en medio InVitroGRO CP (para placas) (Celsis In Vitro Technologies, número de catálogo Z99029). Durante las transfecciones, las células se colocaron en una placa de colágeno de 96 pocillos BD BioCoat (BD, 356407) con una concentración de 25 000 células por pocillo y se incubaron a 37 °C en una atmósfera de un 5% de CO2. Se realizaron experimentos de captación libre añadiendo 10 µl de dúplex de ARNip en PBS por pocillo en una placa de 96 pocillos (96p). A continuación, se añadieron 90 µl de medio de cultivo completo que contenía el número adecuado de células para el tipo celular al ARNip. Las células se incubaron durante 24 horas antes de la purificación del ARN. Se llevaron a cabo experimentos de dosis única con una concentración final del dúplex de 1 µM, 500 nM, 20 nM y 10 nM.
Aislamiento de ARN total utilizando el kit de aislamiento de ARNm DYNABEADS (Invitrogen, componente n.o: 61012)
Las células se recolectaron y lisaron en 150 µl de tampón de lisis/unión, a continuación se mezclaron durante 5 minutos a 850 rpm utilizando un instrumento Eppendorf Thermomixer (la velocidad de mezclado fue la misma a lo largo de todo el proceso). Se añadieron diez microlitros de microesferas magnéticas y 80 µl de mezcla de tampón de lisis/unión a una placa de fondo redondo y se mezclaron durante 1 minuto. Las microesferas magnéticas se capturaron utilizando un soporte magnético y se retiró el sobrenadante sin que se alteraran las microesferas. Después de retirar el sobrenadante, las células lisadas se añadieron a las microesferas remanentes y se mezclaron durante 5 minutos. Después de retirar el sobrenadante, las microesferas magnéticas se lavaron 2 veces con 150µl de tampón de lavado A y se mezclaron durante 1 minuto. Las microesferas se capturaron de nuevo y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 µl de tampón de lavado B, se capturaron y se retiró el sobrenadante. A continuación, las microesferas se lavaron con 150 µl de tampón de elución, se capturaron y se retiró el sobrenadante. Finalmente, se permitió que las microesferas se secaran durante 2 minutos. Después del secado, se añadieron 50 µl de tampón de elución y se mezclaron durante 5 minutos a 70 °C. Las microesferas se capturaron con un imán durante 5 minutos. Se retiraron 45 µl de sobrenadante y se añadieron a otra placa de 96 pocillos.
Síntesis de ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, n.o de catálogo 4368813)
Se preparó una mezcla patrón de 2 µl de 10X tampón, 0.8 µl de 25X dNTPs, 2 µl de cebadores aleatorios, 1 µl de transcriptasa inversa, 1 µl de inhibidor de RNasa y 3.2 µl de H2O por reacción. Se mezclaron volúmenes iguales de mezcla patrón y ARN para obtener un volumen final de 12 µl para las muestras cribadas in vitro o 20 µl para las muestras cribadas in vivo. El ADNc se generó utilizando un ciclador térmico Bio-Rad C-1000 o S-1000 (Hercules, CA) mediante los pasos siguientes: 25 oC durante 10 minutos, 37 oC durante 120 minutos, 85 oC durante 5 segundos y se mantiene a 4 oC.
PCR a tiempo real
Se añadieron 2 µl de ADNc a una mezcla patrón que contenía 2 µl de H2O, 0.5 µl de una sonda TaqMan de GAPDH (Life Technologies, número de catálogo 4326317E para células Hep3B, número de catálogo 352339E para hepatocitos de ratón primarios o una sonda adaptada para hepatocitos primarios de cinomólogo), 0.5 µl de una 5 sonda TaqMan C5 (Life Technologies, número de catálogo Hs00167441_m1 para células Hep3B o Mm00457879_m1 para hepatocitos de ratón primarios o una sonda adaptada para hepatocitos primarios de cinomólogo) y 5 µl de una mezcla patrón para una sonda Lightcycler 480 (Roche, número de catálogo 04887301001) por pocillo en una placa de 384 pocillos (384 p) (Roche, número de catálogo 04887301001). Se llevó a cabo una PCR a tiempo real en un sistema de PCR a tiempo real Roche LC480 (Roche) utilizando el ensayo ΔΔCt(RQ). Para
10 el cribado in vitro, cada dúplex se evaluó con dos réplicas biológicas, a menos que se indique de otro modo, y cada PCR a tiempo real se llevó a cabo en réplicas técnicas por duplicado. Para el cribado in vivo, cada dúplex se evaluó en uno o más experimentos (3 ratones por grupo) y cada PCR a tiempo real se llevó a cabo en réplicas técnicas por duplicado.
Para calcular el factor de cambio relativo en los niveles de ARNm de ALAS1, los datos a tiempo real se analizaron
15 utilizando el método de ΔΔCt y se normalizaron respecto a los ensayos realizados con células transfectadas con AD1955 10 nM o células transfectadas con vector vacío. Los valores de CI50 se calcularon utilizando un modelo de ajuste de 4 parámetros empleando XLFit y se normalizaron respecto a células transfectadas con AD-1955 para el mismo intervalo de dosis o respecto a su propia dosis más baja.
Las secuencias sentido y antisentido de AD-1955 son:
20 SENTIDO: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO:3682)
ANTISENTIDO: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO:3683).
Las secuencias de los dúplex y de las hebras individuales de los ARNip modificados y no modificados se proporcionan en la Tabla 14 y la Tabla 15, respectivamente.

Tabla 14: Secuencias de los dúplex y de las hebras individuales modificadas de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’) Sitios diana de la secuencia antisentido en NM_ 000688.4
3371
3372 AD58848 CfsasUfgCfcAfaAfAfAfuGfgAfcAfuCfa UfL96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgCfa UfgsAfsc 1635-1657
3373
3374 AD58849 AfsusUfuUfgAfaGfUfGfaUfgAfgUfgAf aAfL96 usUfsuCfaCfuCfaUfcacUfuCfaAfa AfusGfsc 2189-2211
3375
3376 AD58850 AfsgsUfuAfuAfuUfAfAfaUfuUfuAfaUfc UfL96 asGfsaUfuAfaAfaUfuuaAfuAfuAfa CfusUfsa 2344-2366
3377
3378 AD58851 GfscsAfuUfuUfgAfAfGfuGfaUfgAfgUf gAfL96 usCfsaCfuCfaUfcAfcuuCfaAfaAfu GfcsAfsg 2187-2209
3379
3380 AD58852 GfsasAfcUfaAfuGfAfGfcAfgAfcAfuAfa CfL96 gsUfsuAfuGfuCfuGfcucAfuUfaGfu UfcsAfsu 1975-1997
3381
3382 AD58853 AfsasUfgAfcCfaCfAfCfcUfaUfcGfaGf uUfL96 asAfscUfcGfaUfaGfgugUfgGfuCfa UfusCfsu 973-995
3383
3384 AD58854 UfsasAfaUfuUfuAfAfUfcUfaUfaGfuAf aAfL96 usUfsuAfcUfaUfaGfauuAfaAfaUfu UfasAfsu 2352-2374
3385
3386 AD58855 UfsusCfaGfuAfuGfAfUfcGfuUfuCfuUf uGfL96 csAfsaAfgAfaAfcGfaucAfuAfcUfgA fasAfsa 929-951
3387
3388 AD58856 CfsasCfuUfuUfcAfGfUfaUfgAfuCfgUf uUfL96 asAfsaCfgAfuCfaUfacuGfaAfaAfg UfgsGfsa 924-946
3389
3390 AD58857 AfsasAfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCf aGfL96 csUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfu UfusUfsg 913-935
3391
3392 AD58858 CfsasUfuUfgAfaAfCfUfgUfcCfaUfuCf aAfL96 usUfsgAfaUfgGfaCfaguUfuCfaAfa UfgsCfsc 1478-1500
3393
3394 AD58859 CfscsUfaUfcGfaGfUfUfuUfuAfaAfaCf uGfL96 csAfsgUfuUfuAfaAfaacUfcGfaUfa GfgsUfsg 983-1005
3395
3396 AD58861 GfsasCfcAfgAfaAfGfAfgUfgUfcUfcAf uCfL96 gsAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfuGfg UfcsUfsu 872-894
3397
3398 AD58862 AfscsCfaGfaAfaGfAfGfuGfuCfuCfaUf cUfL96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcUfg GfusCfsu 873-895
3399
3400 AD58863 AfscsUfaAfuGfaGfCfAfgAfcAfuAfaCf aUfL96 asUfsgUfuAfuGfuCfugcUfcAfuUfa GfusUfsc 1977-1999
3401
3402 AD58864 UfsasGfuAfaAfaAfCfAfuAfgUfcCfuGf gAfL96 usCfscAfgGfaCfuAfuguUfuUfuAfc UfasUfsa 2366-2388
3403
3404 AD58865 UfsasUfuUfcUfgGfAfAfcUfaGfuAfaAf uUfL96 asAfsuUfuAfcUfaGfuucCfaGfaAfa UfasUfsu 1185-1207
3405
3406 AD58867 UfsusCfuGfcAfaAfGfCfcAfgUfcUfuGf aGfL96 csUfscAfaGfaCfuGfgcuUfuGfcAfg AfasGfsa 706-728
3407
3408 AD58868 GfsasGfgAfaAfgAfGfGfuUfgCfuGfaAf aCfL96 gsUfsuUfcAfgCfaAfccuCfuUfuCfcU fcsAfsc 759-781
3409
3410 AD58869 GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCfuGf gAfL96 usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfa CfcsAfsc 1174-1196
3411
3412 AD58870 GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfaAf gAfL96 usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfg UfcsCfsu 853-875
3413
3414 AD58871 AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUfaAf aAfL96 usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfu UfusAfsa 2353-2375
3415
3416 AD58873 CfsasUfgAfuCfcAfAfGfgGfaUfuCfgAf aAfL96 usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfa UfgsGfsa 1362-1384
3417
3418 AD58874 AfsgsAfcCfaGfaAfAfGfaGfuGfuCfuCf aUfL96 asUfsgAfgAfcAfcUfcuuUfcUfgGfuC fusUfsu 871-893
3419
3420 AD58875 AfsusCfcUfgAfaGfAfGfcGfcUfgAfgGf gAfL96 usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfg AfusCfsc 1810-1832
3421
3422 AD58876 GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUfgAf gCfL96 gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgA fcsUfsu 1966-1988
3423
3424 AD58877 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUf uCfL96 gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcU fgsGfsu 875-897
3425
3426 AD58878 AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGfuUf uCfL96 gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfa GfusGfsg 925-947
3427
3428 AD58879 UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfaUf cAfL96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfu GfasCfsu 1634-1656
3429
3430 AD58880 AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGfuAf aAfL96 usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfa UfusUfsc 1183-1205
3431
3432 AD58881 CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUfgCf cAfL96 usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfa AfgsAfsu 892-914
3433
3434 AD58882 UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUfcUf uUfL96 asAfsaGfaAfaCfgAfucaUfaCfuGfa AfasAfsg 928-950
3435
3436 AD58883 CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUfgAf aAfL96 usUfsuCfaCfaCfuAfaccAfcAfcUfgG fgsGfsc 790-812
3437
3438 AD58884 GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUfgAf uUfL96 asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfa GfcsCfsu 1325-1347
3439
3440 AD58885 AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGfuAf uCfL96 gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcC fusGfsa 2229-2251
3441
3442 AD58886 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCf uUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfu UfcsUfsg 877-899
3443
3444 AD58887 AfsusUfuCfuGfgAfAfCfuAfgUfaAfaUf uCfL96 gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfa AfusAfsu 1186-1208
3445
3446 AD58888 UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAfgUf uUfL96 asAfsaCfuCfaUfgGfgccAfcAfuCfa CfasCfsa 1531-1553
3447
3448 AD58889 AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUfuCf uCfL96 gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcU fusUfsc 2208-2230
3449
3450 AD58890 UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfcAf gAfL96 usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfc CfasGfsg 671-693
3451
3452 AD58891 AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGfaAf aAfL96 usUfsuUfcUfcAfaAfgaaAfcGfaUfcA fusAfsc 935-957
3453
3454 AD58892 UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUfcCf aUfL96 asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfa GfasAfsa 1189-1211
3455
3456 AD59095 GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfgUf L96 asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgs c 360-382
3457
3458 AD59096 GfsgsAfaCfcAfuGfCfCfuCfcAfuGfaUf L96 asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscs c 1347-1369
3459
3460 AD59097 UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCfcUf L96 asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfcscsa 1794-1816
3461
3462 AD59098 CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfgAf L96 usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsus g 1112-1134
3463
3464 AD59099 GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCfuAf L96 usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc 1795-1817
3465
3466 AD59100 CfsasAfaAfcUfgCfCfCfcAfaGfaUfgAf L96 usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfusus g 428-450
3467
3468 AD59101 GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfgAf L96 usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgs c 1355-1377
3469
3470 AD59102 CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfuUf L96 asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg 1921-1943
3471
3472 AD59103 AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGfgAf L96 usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu 1113-1135
3473
3474 AD59104 CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfgAf L96 usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsus g 1919-1941
3475
3476 AD59105 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUf L96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg 873-895
3477
3478 AD59106 CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfaUf L96 asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgs g 1356-1378
3479
3480 AD59107 UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfaAf L96 usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscs a 359-381
3481
3482 AD59108 CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfuAf L96 usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasas g 1297-1319
3483
3484 AD59109 AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfuAf L96 usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsas u 1922-1944
3485
3486 AD59110 AfsgsAfaAfgAfgUfGfUfcUfcAfuCfuUf L96 asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscs u 874-896
3487
3488 AD59111 CfsusCfcAfuGfaUfCfCfaAfgGfgAfuUf L96 asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsas g 1357-1379
3489
3490 AD59112 CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfcAfL 96 usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgs g 362-384
3491
3492 AD59113 CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfuAf L96 usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg 1300-1322
3493
3494 AD59114 UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUfgAf L96 usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa 1923-1945
3495
3496 AD59115 AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu 877-899
3497
3498 AD59116 GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfcAf L96 usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsas c 1631-1653
3499
3500 AD59117 CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfcAf L96 usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasus g 363-385
3501
3502 AD59118 AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfgAf L96 usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgs u 1301-1323
3503
3504 AD59119 CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfgAf L96 usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsas g 1295-1317
3505
3506 AD59120 AfsusGfcCfaAfaAfAfUfgGfaCfaUfcAf L96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsas u 1634-1656
3507
3508 AD59121 UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfaUf L96 asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscs a 434-456
3509
3510 AD59122 GfsasAfcCfaUfgCfCfUfcCfaUfgAfuAf L96 usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfusus c 1348-1370
3511
3512 AD59123 UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfaUf L96 asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa 1296-1318
3513
3514 AD59124 UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfaUf L96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscs a 1635-1657
3515
3516 AD59125 CfscsAfgAfaAfgAfGfUfgUfcUfcAfuAfL 96 usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgs g 872-894
3517
3518 AD59126 GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfgAf L96 usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfusus c 1481-1503
3519
3520 AD59127 UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfaUf L96 asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgs a 1299-1321
3521
3522 AD59128 CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfaUf L96 asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgs g 1791-1813
3523
3524 AD59129 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuAf L96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc 875-897
3525
3526 AD59130 UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGfuAf L96 usAfscAfgAfcUfcCfaggGfcUfcscsa 1786-1808

Tabla 15: Secuencias de los dúplex y de las hebras individuales no modificadas de ALAS1 humano
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’) Sitios diana de la secuencia antisentid o en NM_ 000688.4
3684
3527 AD-58848 CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC 16351657
3528
3529 AD-58849 AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC 21892211
3530
3531 AD-58850 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA 23442366
3532
3533 AD-58851 GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG 21872209
3534
3535 AD-58852 GAACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU 19751997
3536
3537 AD-58853 AAUGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU 973-995
3538
3539 AD-58854 UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU 23522374
3540
3541 AD-58855 UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA 929-951
3542
3543 AD-58856 CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA 924-946
3544
3545 AD-58857 AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG 913-935
3546
3547 AD-58858 CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC 14781500
3548
3549 AD-58859 CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG 983-1005
3550
3551 AD-58861 GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU 872-894
3552
3553 AD-58862 ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU 873-895
3554
3555 AD-58863 ACUAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC 19771999
3556
3557 AD-58864 UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA 23662388
3558
3559 AD-58865 UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU 11851207
3560
3561 AD-58867 UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA 706-728
3562
3563 AD-58868 GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC 759-781
3564
3565 AD-58869 GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC 11741196
3566
3567 AD-58870 GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU 853-875
3568
3569 AD-58871 AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA 23532375
3570
3571 AD-58873 CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA 13621384
3572
3573 AD-58874 AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU 871-893
3574
3575 AD-58875 AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC 18101832
3576
3577 AD-58876 GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU 19661988
3578
3579 AD-58877 CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU 875-897
3580
3581 AD-58878 ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG 925-947
3582
3583 AD-58879 UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU 16341656
3584
3585 AD-58880 AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC 11831205
3586
3587 AD-58881 CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU 892-914
3588
3589 AD-58882 UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG 928-950
3590
3591 AD-58883 CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUGGGGC 790-812
3592
3593 AD-58884 GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU 13251347
3594
3595 AD-58885 AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA 22292251
3596
3597 AD-58886 GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG 877-899
3598
3599 AD-58887 AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU 11861208
3600
3601 AD-58888 UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCACACA 15311553
3602
3603 AD-58889 AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC 22082230
3604
3605 AD-58890 UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG 671-693
3606
3607 AD-58891 AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC 935-957
3608
3609 AD-58892 UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA 11891211
3610
3611 AD-59095 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC 360-382
3612
3613 AD-59096 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC 13471369
3614
3615 AD-59097 UGGAGUCUGUGCGGAUCCU AGGAUCCGCACAGACUCCA 17941816
3616
3617 AD-59098 CACCCACGGGUGUGUGGGA UCCCACACACCCGUGGGUG 11121134
3618
3619 AD-59099 GGAGUCUGUGCGGAUCCUA UAGGAUCCGCACAGACUCC 17951817
3620
3621 AD-59100 CAAAACUGCCCCAAGAUGA UCAUCUUGGGGCAGUUUUG 428-450
3622
3623 AD-59101 GCCUCCAUGAUCCAAGGGA UCCCUUGGAUCAUGGAGGC 13551377
3624
3625 AD-59102 CAUCAUCCCUGUGCGGGUU AACCCGCACAGGGAUGAUG 19211943
3626
3627 AD-59103 ACCCACGGGUGUGUGGGGA UCCCCACACACCCGUGGGU 11131135
3628
3629 AD-59104 CACAUCAUCCCUGUGCGGA UCCGCACAGGGAUGAUGUG 19191941
3630
3631 AD-59105 CAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUG 873-895
3632
3633 AD-59106 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG 13561378
3634
3635 AD-59107 UGCCCAUUCUUAUCCCGAA UUCGGGAUAAGAAUGGGCA 359-381
3636
3637 AD-59108 CUUCACCCUGGCUAAGAUA UAUCUUAGCCAGGGUGAAG 12971319
3638
3639 AD-59109 AUCAUCCCUGUGCGGGUUA UAACCCGCACAGGGAUGAU 19221944
3640
3641 AD-59110 AGAAAGAGUGUCUCAUCUU AAGAUGAGACACUCUUUCU 874-896
3642
3643 AD-59111 CUCCAUGAUCCAAGGGAUU AAUCCCUUGGAUCAUGGAG 13571379
3644
3645 AD-59112 CCAUUCUUAUCCCGAGUCA UGACUCGGGAUAAGAAUGG 362-384
3646
3647 AD-59113 CACCCUGGCUAAGAUGAUA UAUCAUCUUAGCCAGGGUG 13001322
3648
3649 AD-59114 UCAUCCCUGUGCGGGUUGA UCAACCCGCACAGGGAUGA 19231945
3650
3651 AD-59115 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU 877-899
3652
3653 AD-59116 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 16311653
3654
3655 AD-59117 CAUUCUUAUCCCGAGUCCA UGGACUCGGGAUAAGAAUG 363-385
3656
3657 AD-59118 ACCCUGGCUAAGAUGAUGA UCAUCAUCUUAGCCAGGGU 13011323
3658
3659 AD-59119 CUCUUCACCCUGGCUAAGA UCUUAGCCAGGGUGAAGAG 12951317
3660
3661 AD-59120 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU 16341656
3662
3663 AD-59121 UGCCCCAAGAUGAUGGAAU AUUCCAUCAUCUUGGGGCA 434-456
3664
3665 AD-59122 GAACCAUGCCUCCAUGAUA UAUCAUGGAGGCAUGGUUC 13481370
3666
3667 AD-59123 UCUUCACCCUGGCUAAGAU AUCUUAGCCAGGGUGAAGA 12961318
3668
3669 AD-59124 UGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCA 16351657
3670
3671 AD-59125 CCAGAAAGAGUGUCUCAUA UAUGAGACACUCUUUCUGG 872-894
3672
3673 AD-59126 GAAACUGUCCAUUCAAUGA UCAUUGAAUGGACAGUUUC 14811503
3674
3675 AD-59127 UCACCCUGGCUAAGAUGAU AUCAUCUUAGCCAGGGUGA 12991321
3676
3677 AD-59128 CCCUGGAGUCUGUGCGGAU AUCCGCACAGACUCCAGGG 17911813
3678
3679 AD-59129 GAAAGAGUGUCUCAUCUUA UAAGAUGAGACACUCUUUC 875-897
3680
3681 AD-59130 UGGAGCCCUGGAGUCUGUA UACAGACUCCAGGGCUCCA 17861808
En la Tabla 16 se proporcionan los resultados de los ensayos in vitro. La Tabla 16 también indica las especies diana de cada uno de los ARNip.

Tabla 16: Resultados de los ensayos funcionales
Captación libre en cino.
Transfección en cino. Transfección en Hep3b
ID del dúplex
Especies diana Tipo 1 µM, media 500 nM 20 nM, media 10 nM 20 nM, media 0.2 nM, media 10 nM, media 0.1 nM, media
AD-58848
Ratón/Rata/Rh/H 21/23 131.6 176.0 104.4 128.0 43.5 44.8 25.3 76.8
AD-58849
H/Rh 21/23 91.9 88.1 92.2 105.0 29.4 35.4 11.5 47.1
AD-58850
H/Rh 21/23 79.4 103.4 80.0 111.2 NA 62.2 31.3 72.0
AD-58851
H/Rh 21/23 99.7 74.7 94.8 104.7 NA 40.7 8.6 81.3
AD-58852
H/Rh 21/23 108.1 91.8 103.3 111.9 101.1 128.8 43.4 129.0
AD-58853
H/Rh 21/23 74.8 67.7 84.2 93.5 24.7 52.9 14.1 61.2
AD-58854
H/Rh 21/23 145.9 124.1 106.6 115.3 119.0 83.9 85.0 84.0
AD-58855
H/Rh 21/23 81.5 97.9 92.7 101.8 39.5 40.3 15.3 67.6
AD-58856
H/Rh 21/23 74.1 90.6 84.6 82.6 22.4 30.7 8.7 33.3
AD-58857
H/Rh 21/23 64.7 91.4 62.3 87.1 22.0 31.6 9.8 106.3
AD-58858
H/Rh 21/23 67.4 91.7 68.6 98.3 27.9 40.3 17.4 44.8
AD-58859
H/Rh 21/23 71.2 77.2 92.4 90.1 19.1 34.3 13.1 39.7
AD-58861
H/Rh 21/23 104.6 107.2 102.0 100.6 25.9 35.1 18.0 69.8
AD-58862
H/Rh 21/23 66.8 77.0 68.7 88.5 20.3 31.1 24.2 49.9
AD-58863
H/Rh 21/23 70.8 66.8 76.8 98.5 21.5 29.7 8.7 54.9
AD-58864
H/Rh 21/23 76.2 85.6 83.7 100.8 60.4 61.0 56.4 87.3
AD-58865
H/Rh 21/23 67.9 77.9 95.9 98.4 21.3 38.6 15.5 81.4
AD-58867
H/Rh 21/23 95.9 93.3 107.0 97.5 32.3 42.7 16.6 79.8
AD-58868
H/Rh 21/23 95.2 92.1 116.2 94.7 54.6 69.2 61.5 105.9
AD-58869
H/Rh 21/23 65.0 78.2 75.8 88.2 17.4 25.0 13.0 63.9
AD-58870
H/Rh 21/23 69.4 92.3 81.0 88.1 29.2 43.8 33.7 79.1
AD-58871
H/Rh 21/23 61.2 77.3 88.2 77.0 71.2 73.2 36.7 110.3
AD-58873
H/Rh 21/23 95.2 100.9 83.3 94.6 54.2 52.8 36.6 73.3
AD-58874
H/Rh 21/23 75.8 76.8 63.8 85.3 22.3 31.2 15.0 38.2
AD-58875
H/Rh 21/23 80.7 88.7 78.6 97.9 48.6 73.6 61.2 90.6
AD-58876
H/Rh 21/23 90.8 93.1 82.5 100.2 41.1 56.9 21.2 58.7
AD-58877
H/Rh 21/23 68.3 85.1 51.2 78.7 18.5 46.6 11.9 27.4
AD-58878
H/Rh 21/23 78.3 68.3 81.2 91.2 24.1 23.4 6.2 37.1
AD-58879
H/Rh 21/23 87.9 94.1 79.7 95.4 32.0 47.8 15.7 82.5
AD-58880
H/Rh 21/23 74.9 72.2 88.9 88.1 20.1 27.5 14.0 60.7
AD-58881
H/Rh 21/23 85.9 76.8 78.8 118.0 22.2 36.7 27.6 71.6
AD-58882
H/Rh 21/23 54.1 53.4 60.3 85.8 14.6 27.2 8.2 23.8
AD-58883
H/Rh 21/23 80.4 69.9 75.7 80.3 31.8 25.8 12.3 63.0
AD-58884
H/Rh 21/23 57.7 55.3 64.8 78.2 20.0 30.0 11.8 68.9
AD-58885
H/Rh 21/23 101.8 91.8 104.1 101.5 85.9 71.9 61.8 71.2
AD-58886
Ratón/Rata/Rh/H 21/23 47.1 58.0 36.3 93.3 16.0 26.6 9.2 32.0
AD-58887
H/Rh 21/23 73.6 98.7 82.6 95.2 28.5 33.5 12.8 65.2
AD-58888
H/Rh 21/23 90.2 69.9 69.4 85.6 46.9 45.0 16.6 72.0
AD-58889
H/Rh 21/23 83.6 98.6 82.4 92.2 36.5 40.3 31.6 99.4
AD-58890
H/Rh 21/23 69.5 95.4 84.2 88.2 50.8 45.6 21.7 92.9
AD-58891
H/Rh 21/23 62.8 75.7 75.4 109.2 23.6 34.3 15.6 55.8
AD-58892
H/Rh 21/23 60.2 92.9 89.8 92.9 22.8 43.3 20.2 75.6
AD-59095
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 88.9 NA 132.8 NA 48.3 97.4 54.3 99.0
AD-59096
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 95.5 NA 90.5 NA 105.7 138.6 131.4 120.7
AD-59097
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 92.5 NA 84.2 NA 75.0 NA 94.7 108.5
AD-59098
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 84.0 NA 87.7 NA 109.3 NA 130.0 87.3
AD-59099
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 89.7 NA 90.0 NA 77.8 85.4 46.8 74.9
AD-59100
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 84.8 NA 144.3 NA 70.6 108.1 91.5 117.6
AD-59101
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 79.0 NA 103.8 NA 89.8 102.9 124.2 107.0
AD-59102
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 85.9 NA 100.6 NA 72.2 68.5 87.9 95.1
AD-59103
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 86.0 NA 91.1 NA 93.0 81.3 130.0 96.0
AD-59104
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 92.6 NA 96.9 NA 94.9 91.4 124.4 83.1
AD-59105
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 48.9 NA 101.7 NA 18.4 48.9 17.0 34.7
AD-59106
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 63.2 NA 76.7 NA 28.5 40.7 28.6 46.4
AD-59107
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 71.4 NA 68.7 NA 37.1 45.3 26.8 63.6
AD-59108
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 70.7 NA 85.1 NA 89.9 84.8 139.2 101.7
AD-59109
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 86.1 NA 83.4 NA 84.9 96.2 131.7 86.7
AD-59110
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 70.8 NA 119.7 NA 38.5 60.4 67.4 80.3
AD-59111
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 66.1 NA 76.5 NA 52.2 61.0 69.7 87.6
AD-59112
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 71.2 NA 80.2 NA 91.2 83.4 127.4 89.0
AD-59113
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 67.0 NA 77.8 NA 49.1 59.0 66.8 91.4
AD-59114
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 81.7 NA 79.3 NA 96.3 88.0 129.6 72.4
AD-59115
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 40.4 NA 69.6 NA 19.6 35.7 9.3 16.9
AD-59116
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 72.2 NA 78.3 NA 53.5 77.8 70.1 107.8
AD-59117
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 70.7 NA 75.6 NA 75.8 74.9 129.0 103.5
AD-59118
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 68.8 NA 75.9 NA 81.4 82.1 114.1 89.7
AD-59119
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 64.9 NA 86.5 NA 85.1 125.1 122.8 124.8
AD-59120
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 63.5 NA 75.1 NA 29.9 52.0 16.1 54.1
AD-59121
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 67.6 NA 72.0 NA 88.8 77.4 108.0 103.1
AD-59122
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 60.2 NA 62.3 NA 25.1 45.3 16.2 54.8
AD-59123
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 68.6 NA 108.2 NA 59.2 84.6 80.0 97.7
AD-59124
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 47.5 NA 56.5 NA 23.9 40.0 9.8 18.9
AD-59125
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 45.4 NA 47.2 NA 15.2 40.7 14.7 15.1
AD-59126
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 64.3 NA 74.6 NA 51.6 57.1 35.5 54.4
AD-59127
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 103.4 NA 105.8 NA 94.0 156.4 135.9 113.7
AD-59128
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 102.4 NA 81.4 NA 66.3 89.3 60.2 74.9
AD-59129
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 41.3 NA 38.8 NA 17.9 41.4 8.6 12.6
AD-59130
Ratón/Rata/Rh/H nonadecámero 58.3 NA 80.8 NA 94.9 78.3 106.7 88.0

Tabla 17: Valores de CI50 de dúplex de ARNip de ALAS1 seleccionados
La Tabla 17 ilustra los valores de CI50 de dúplex de ARNip de ALAS1 seleccionados. Los valores de CI50 se determinaron a partir de la desactivación de ALAS1 expresado de forma endógena en la línea celular Hep3B, 24 horas después de la transfección de cada dúplex de ARNip modificado para ALAS1 (remítase a la Tabla 14). Al menos siete dúplex, que incluyeron AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 y AD-59129,
5 presentaron uniformemente valores de CI50 inferiores a 0.1 nm, lo cual indica que estos dúplex fueron particularmente eficaces a la hora de suprimir la expresión de ALAS1.
ID del dúplex
CI50 para 384 p (nM) CI50 para 96 p (nM)
AD-58882
0.008 0.014
AD-58878
0.040 0.031
AD-58886
0.037 0.033
AD-58877
0.031 0.034
AD-59115
0.093 0.052
AD-58856
0.061 0.066
AD-59129
0.085 0.071
AD-59124
0.572 0.078
AD-58874
0.140 0.102
AD-59125
0.118 0.115
AD-59105
0.511 0.144
AD-59120
180.592 0.498
AD-59122
36.646 0.646
AD-59106
7.906 0.847
AD-59126
n/a 1.014
AD-59107
n/a 1.971

Ejemplo 11. Actividad de ALAS1-GalNAc en un modelo de ratón de inducción de AIP con fenobarbital
Se utilizó el modelo de ratón de AIP para investigar el efecto de un ARNip que era un conjugado de ALAS1-GalNAc. El ARNip tenía la secuencia del dúplex AD-58632 (remítase a la Tabla 20).

Tabla 20: Secuencias del dúplex de ARNip de ALAS1 AD-58632
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Sitios diana de la secuencia antisentido Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’)
4149
4150 877-899 AD58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc UfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfc UfuUfcsusg
El día 1, los ratones con AIP o bien no se trataron (referencia) o se les inyectó por vía subcutánea solución salina o 5 el conjugado de ALAS1-GalNAc con una dosis de 20 mg/kg. Los días 2, 3 y 4, los ratones no se trataron (referencia)
o se trataron con inyecciones IP de fenobarbital. El día 5, se tomaron muestras de plasma y se midieron los niveles de ALA y PBG utilizando un ensayo de LC-MS. Como se muestra en la FIG. 15, el conjugado de ALAS1-GalNAc mitigó la producción de ALA y PBG en plasma aproximadamente un 84 y 80%, respectivamente. Estos resultados indican que el tratamiento con un conjugado de ALAS1-GalNAc fue eficaz a la hora de prevenir los incrementos de
10 ALA y PBG en plasma asociados con los ataques agudos inducidos por fenobarbital en este modelo animal de AIP.
Se diseñaron y produjeron secuencias de ARNip modificadas que tenían como diana el ARNip de ALAS1, según se ha descrito en el Ejemplo 2. Las secuencias se proporcionan en la Tabla 18. Se evaluó la actividad in vitro de los dúplex modificados según se describe a continuación.
15 Tabla 18: Secuencias de los dúplex y de las hebras individuales modificadas de ALAS1 humano

Ejemplo 12. Otros ARNip que tienen ALAS1 como diana e inhiben la expresión de ALAS1
SEQ ID NO: (sentido)
SEQ ID NO: (antisentido) Nombre del dúplex Secuencia sentido (5’-3’) Secuencia antisentido (5’-3’) Sitios diana de la secuencia antisentido en NM_ 000688.4
3685
3686 AD-59453 CAGGCAAAUCUCUGUUGUUdTdT AACAACAGAGAUUUGCCUGdTdT 402-420
3687
3688 AD-59395 GAAAAAAAUUGAUGAGAAAdTdT UUUCUCAUCAAUUUUUUUCdTdT 949-967
3689
3690 AD-59477 GGAAAGAUGCCGCACUCUUdTdT AAGAGUGCGGCAUCUUUCCdTdT 1242-1260
3691
3692 AD-59492 UGUCUCAUCUUCUUCAAGAdTdT UCUUGAAGAAGAUGAGACAdTdT 882-900
3693
3694 AD-59361 ACAUCUACGUGCAAGCAAUdTdT AUUGCUUGCACGUAGAUGUdTdT 1992-2010
3695
3696 AD-59462 UUCUCUGAUUGACACCGUAdTdT UACGGUGUCAAUCAGAGAAdTdT 1711-1729
3697
3698 AD-59433 GCUGCUGGCUUCAUCUUCAdTdT UGAAGAUGAAGCCAGCAGCdTdT 1739-1757
3699
3700 AD-59424 AGCGCAACGUCAAACUCAUdTdT AUGAGUUUGACGUUGCGCUdTdT 1851-1869
3701
3702 AD-59414 UAUUUCUGGAACUAGUAAAdTdT UUUACUAGUUCCAGAAAUAdTdT 1183-1201
3703
3704 AD-59539 GGUUGUGUUGGAGGGUACAdTdT UGUACCCUCCAACACAACCdTdT 1679-1697
3705
3706 AD-59400 GUGUCAGUCUGGUGCAGUAdTdT UACUGCACCAGACUGACACdTdT 1070-1088
3707
3708 AD-59551 CUUUGUGGCCAAUGACUCAdTdT UGAGUCAUUGGCCACAAAGdTdT 1273-1291
3709
3710 AD-59482 AGAUGCUGCUAAAAACACAdTdT UGUGUUUUUAGCAGCAUCUdTdT 1942-1960
3711
3712 AD-59448 GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdTdT UCCAUUUUUGGCAUGACUCdTdT 1629-1647
3713
3714 AD-59392 CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdTdT CUCUUCAGGAUCCGCACAGdTdT 1800-1818
3715
3716 AD-59469 CACUUUGAAACAACAUGGUdTdT ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdTdT 1141-1159
3717
3718 AD-59431 AAGUGAUGAGUGAAAGAGAdTdT UCUCUUUCACUCAUCACUUdTdT 2193-2211
3719
3720 AD-59423 AUCUGCUAGUCACAUGGAAdTdT UUCCAUGUGACUAGCAGAUdTdT 2103-2121
3721
3722 AD-59517 UGGGGCAGGUGGUACUAGAdTdT UCUAGUACCACCUGCCCCAdTdT 1162-1180
3723
3724 AD-59578 GCAGAUGACUAUUCAGACUdTdT AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdTdT 1031-1049
3725
3726 AD-59495 GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdTdT CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdTdT 2143-2161
3727
3728 AD-59432 GUAUGAUCGUUUCUUUGAGdTdT CUCAAAGAAACGAUCAUACdTdT 931-949
3729
3730 AD-59382 UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdTdT UCUGAAGACCAUCUGGAUAdTdT 2302-2320
3731
3732 AD-59472 UAGUGUGAAAACCGAUGGAdTdT UCCAUCGGUUUUCACACUAdTdT 799-817
3733
3734 AD-59459 UCCCCAUGGCAGAUGACUAdTdT UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdTdT 1023-1041
3735
3736 AD-59413 CCACUGCAGCAGUACACUAdTdT UAGUGUACUGCUGCAGUGGdTdT 483-501
3737
3738 AD-59478 CUGUGAACCGGCGAGCACAdTdT UGUGCUCGCCGGUUCACAGdTdT 999-1017
3739
3740 AD-59376 GGUCCUAUGCUGCUGGCUUdTdT AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTdT 1731-1749
3741
3742 AD-59556 AGCCUUUGGUUGUGUUGGAdTdT UCCAACACAACCAAAGGCUdTdT 1672-1690
3743
3744 AD-59399 AAUUCCAUGUGGACUUAGAdTdT UCUAAGUCCACAUGGAAUUdTdT 1200-1218
3745
3746 AD-59474 CCAGGGCACUGCAAGCAAAdTdT UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdTdT 640-658
3747
3748 AD-53542 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT 924-942
3749
3750 AD-59480 GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdTdT ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdTdT 682-700
3751
3752 AD-59549 GCAAAGAUCUGACCCCUCAdTdT UGAGGGGUCAGAUCUUUGCdTdT 1441-1459
3753
3754 AD-59515 GGAGAAGAGCUCCUACGGAdTdT UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdTdT 2033-2051
3755
3756 AD-59427 CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdTdT GAUUGCUCCAAACUCAUGGdTdT 1540-1558
3757
3758 AD-59390 CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdTdT AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdTdT 943-961
3759
3760 AD-59511 UGAGCAGACAUAACAUCUAdTdT UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdTdT 1980-1998
3761
3762 AD-59532 CGUGCAAGCAAUCAAUUACdTdT GUAAUUGAUUGCUUGCACGdTdT 1999-2017
3763
3764 AD-59562 AAAGCAAAGACCAGAAAGAdTdT UCUUUCUGGUCUUUGCUUUdTdT 862-880
3765
3766 AD-59513 GGAUGUGCAGGAAAUGAAUdTdT AUUCAUUUCCUGCACAUCCdTdT 733-751
3767
3768 AD-59362 CAGCAUACUUCCUGAACAUdTdT AUGUUCAGGAAGUAUGCUGdTdT 321-339
3769
3770 AD-53541 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT 671-689
3771
3772 AD-59490 UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdTdT UUGGGCAUAGAACAACAGAdTdT 412-430
3773
3774 AD-59422 UGAGACAGAUGCUAAUGGAdTdT UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdTdT 1869-1887
3775
3776 AD-59467 GCCAAUGACUCAACCCUCUdTdT AGAGGGUUGAGUCAUUGGCdTdT 1280-1298
3777
3778 AD-59579 GAGUGCAACUUCUGCAGGAdTdT UCCUGCAGAAGUUGCACUCdTdT 2159-2177
3779
3780 AD-59426 GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdTdT UAGGACUUCUCUCUUUCACdTdT 2202-2220
3781
3782 AD-59363 UAACUUGCCAAAAUCUGUUdTdT AACAGAUUUUGGCAAGUUAdTdT 901-919
3783
3784 AD-59436 AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdTdT UGAAGCUCAAGACUGGCUUdTdT 711-729
3785
3786 AD-53536 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT 922-940
3787
3788 AD-59491 GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdTdT UUGCAGAAGACACUGCUGCdTdT 693-711
3789
3790 AD-59500 UCCUGAACAUGGAGAGUGUdTdT ACACUCUCCAUGUUCAGGAdTdT 330-348
3791
3792 AD-59394 AUUUCUGGAACACUUGGCAdTdT UGCCAAGUGUUCCAGAAAUdTdT 1652-1670
3793
3794 AD-59441 CAGUACACUACCAACAGAUdTdT AUCUGUUGGUAGUGUACUGdTdT 492-510
3795
3796 AD-59365 GCAUGACCUCAAUUAUUUCdTdT GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdTdT 2261-2279
3797
3798 AD-59411 AGAACUGCUGCAAAGAUCUdTdT AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdTdT 1432-1450
3799
3800 AD-59544 CACCCCAGAUGAUGAACUAdTdT UAGUUCAUCAUCUGGGGUGdTdT 2073-2091
3801
3802 AD-59428 GAUCCAAGGGAUUCGAAACdTdT GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdTdT 1363-1381
3803
3804 AD-59471 CUCAUCACCAAAAAGCAAGdTdT CUUGCUUUUUGGUGAUGAGdTdT 1052-1070
3805
3806 AD-59518 ACAACAUGGUGCUGGGGCAdTdT UGCCCCAGCACCAUGUUGUdTdT 1150-1168
3807
3808 AD-53547 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT 935-953
3809
3810 AD-59573 CAGCACGAGUUCUCUGAUUdTdT AAUCAGAGAACUCGUGCUGdTdT 1702-1720
3811
3812 AD-59473 AAUGAUGUCAGCCACCUCAdTdT UGAGGUGGCUGACAUCAUUdTdT 1412-1430
3813
3814 AD-59412 AGUUAUGGACACUUUGAAAdTdT UUUCAAAGUGUCCAUAACUdTdT 1132-1150
3815
3816 AD-59522 GAUGAUGAACUACUUCCUUdTdT AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdTdT 2080-2098
3817
3818 AD-59502 GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdTdT CACGGCAUUCAUUUCCUGCdTdT 739-757
3819
3820 AD-59499 UCUUCAAGAUAACUUGCCAdTdT UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdTdT 892-910
3821
3822 AD-59520 CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdTdT ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdTdT 811-829
3823
3824 AD-59581 CCAAAAAGCAAGUGUCAGUdTdT ACUGACACUUGCUUUUUGGdTdT 1059-1077
3825
3826 AD-59461 GAUUGGGGAUCGGGAUGGAdTdT UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTdT 1612-1630
3827
3828 AD-59370 CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdTdT AUCCGCACAGACUCCAGGGdTdT 1791-1809
3829
3830 AD-53540 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT 2321-2339
3831
3832 AD-59574 CGGGCAUUGUCCACUGCAGdTdT CUGCAGUGGACAAUGCCCGdTdT 473-491
3833
3834 AD-59375 UAUUCAGACUCCCUCAUCAdTdT UGAUGAGGGAGUCUGAAUAdTdT 1040-1058
3835
3836 AD-59387 CACUGCAUUUUGAAGUGAUdTdT AUCACUUCAAAAUGCAGUGdTdT 2181-2199
3837
3838 AD-59397 CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdTdT GAUGAGACACUCUUUCUGGdTdT 872-890
3839
3840 AD-59396 AGGCGGAGGGAUUGGGGAUdTdT AUCCCCAAUCCCUCCGCCUdTdT 1603-1621
3841
3842 AD-59393 AGACCUCCAUGGGAAAGAUdTdT AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdTdT 1231-1249
3843
3844 AD-59483 GCAGGAGGCCACUGCAUUUdTdT AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdTdT 2172-2190
3845
3846 AD-59430 AUCUGUUUCCACUUUUCAGdTdT CUGAAAAGUGGAAACAGAUdTdT 913-931
3847
3848 AD-59463 AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdTdT UGAGAAAUAGGACUUCUCUdTdT 2209-2227
3849
3850 AD-53534 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT 2312-2330
3851
3852 AD-59514 GGCUGGAACUGAAGCCUCAdTdT UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdTdT 2130-2148
3853
3854 AD-59575 GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdTdT AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdTdT 2292-2310
3855
3856 AD-59364 AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdTdT AACCACACUGGGGCCUGCUdTdT 781-799
3857
3858 AD-59402 UCAGCUGAGUGCAACUUCUdTdT AGAAGUUGCACUCAGCUGAdTdT 2153-2171
3859
3860 AD-59479 GAGCACACAUCUUCCCCAUdTdT AUGGGGAAGAUGUGUGCUCdTdT 1011-1029
3861
3862 AD-59481 ACUUCCAGGACAUCAUGCAdTdT UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdTdT 843-861
3863
3864 AD-59530 CCUAUCGAGUUUUUAAAACdTdT GUUUUAAAAACUCGAUAGGdTdT 981-999
3865
3866 AD-59582 CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdTdT UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdTdT 2092-2110
3867
3868 AD-59506 ACCAACAGAUCAAAGAAACdTdT GUUUCUUUGAUCUGUUGGUdTdT 501-519
3869
3870 AD-59567 UAACCCCAGGCCAUUAUCAdTdT UGAUAAUGGCCUGGGGUUAdTdT 2283-2301
3871
3872 AD-59485 CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdTdT UUGGAUCAUGGAGGCAUGGdTdT 1351-1369
3873
3874 AD-59525 UGAUGAACUAAUGAGCAGAdTdT UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdTdT 1969-1987
3875
3876 AD-59566 CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdTdT UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdTdT 1810-1828
3877
3878 AD-59580 AACACUUGGCAAAGCCUUUdTdT AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdTdT 1660-1678
3879
3880 AD-59512 UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdTdT UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdTdT 391-409
3881
3882 AD-59475 CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdTdT UGGACAACAGGGAGGCCGGdTdT 1890-1908
3883
3884 AD-59438 CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdTdT AACCCGCACAGGGAUGAUGdTdT 1921-1939
3885
3886 AD-59442 UGUGCGGGUUGCAGAUGCUdTdT AGCAUCUGCAACCCGCACAdTdT 1930-1948
3887
3888 AD-59516 GGAAAGAGGUUGCUGAAACdTdT GUUUCAGCAACCUCUUUCCdTdT 759-777
3889
3890 AD-59429 AGGUCCACGCAGUGGGGCUdTdT AGCCCCACUGCGUGGACCUdTdT 1572-1590
3891
3892 AD-59510 UGCCGUGAGGAAAGAGGUUdTdT AACCUCUUUCCUCACGGCAdTdT 751-769
3893
3894 AD-59457 GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdTdT GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdTdT 1879-1897
3895
3896 AD-59434 GAAGCAAGUGGGGCUGGAAdTdT UUCCAGCCCCACUUGCUUCdTdT 2119-2137
3897
3898 AD-59454 CAUCUUCCGCCACAAUGAUdTdT AUCAUUGUGGCGGAAGAUGdTdT 1399-1417
3899
3900 AD-59468 AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdTdT UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdTdT 2220-2238
3901
3902 AD-59565 CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTdT AAGGCCUGGGGGACUCGGGdTdT 372-390
3903
3904 AD-59416 CAAGCAAAUGCCCUUUCCUdTdT AGGAAAGGGCAUUUGCUUGdTdT 651-669
3905
3906 AD-59420 CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTdT AAUCUUGGGGACUGAGGGGdTdT 1453-1471
3907
3908 AD-59552 CUACGGUGCCCCGGGGAGAdTdT UCUCCCCGGGGCACCGUAGdTdT 2019-2037
3909
3910 AD-59558 AAAACUGCCCCAAGAUGAUdTdT AUCAUCUUGGGGCAGUUUUdTdT 429-447
3911
3912 AD-59404 ACAAAACUGCUAAGGCCAAdTdT UUGGCCUUAGCAGUUUUGUdTdT 540-558
3913
3914 AD-59455 GAUUCUGGGAACCAUGCCUdTdT AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdTdT 1340-1358
3915
3916 AD-59496 CCAGAUGGCACACAGCUUCdTdT GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdTdT 593-611
3917
3918 AD-59446 AGGGAUUCGAAACAGCCGAdTdT UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdTdT 1369-1387
3919
3920 AD-59435 CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdTdT UGCGCUGAGGACUGCAGAGdTdT 109-127
3921
3922 AD-59419 CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdTdT AGGACUGCAGAGGCGGCGGdTdT 102-120
3923
3924 AD-59533 CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdTdT ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTdT 1781-1799
3925
3926 AD-59366 GACAUCAUGCAAAAGCAAAdTdT UUUGCUUUUGCAUGAUGUCdTdT 851-869
3927
3928 AD-59521 GCUUGAGCAAGUUGGUAUCdTdT GAUACCAACUUGCUCAAGCdTdT 2229-2247
3929
3930 AD-59563 CAGGCUGUGAGAUUUACUCdTdT GAGUAAAUCUCACAGCCUGdTdT 1320-1338
3931
3932 AD-59534 AGAGCUGUGUGAUGUGGCCdTdT GGCCACAUCACACAGCUCUdTdT 1522-1540
3933
3934 AD-59407 GGAGCUGGCAGACCUCCAUdTdT AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdTdT 1222-1240
3935
3936 AD-59445 AUCCCAGUGGACUGCUGAAdTdT UUCAGCAGUCCACUGGGAUdTdT 822-840
3937
3938 AD-59546 GUCAAACUCAUGAGACAGAdTdT UCUGUCUCAUGAGUUUGACdTdT 1859-1877
3939
3940 AD-59456 CUUUCCUGGCAGCACAGAUdTdT AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdTdT 663-681
3941
3942 AD-59503 CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdTdT UUUCUCACUGGCCGGAGGGdTdT 520-538
3943
3944 AD-59536 CUACCUAGGAAUGAGUCGCdTdT GCGACUCAUUCCUAGGUAGdTdT 1093-1111
3945
3946 AD-59385 CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdTdT CAAAUGCCACAAUCUUGGGdTdT 1463-1481
3947
3948 AD-59367 GAGCAAUCACCUUCGUGGAdTdT UCCACGAAGGUGAUUGCUCdTdT 1551-1569
3949
3950 AD-59458 UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdTdT CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdTdT 359-377
3951
3952 AD-59381 AAGGCCAAGGUCCAACAGAdTdT UCUGUUGGACCUUGGCCUUdTdT 551-569
3953
3954 AD-59538 CACACAGCUUCCGUCUGGAdTdT UCCAGACGGAAGCUGUGUGdTdT 601-619
3955
3956 AD-59421 UUAUGGGGCUCGAGGCGGAdTdT UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTdT 1591-1609
3957
3958 AD-59388 UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdTdT ACUGGCUUUGCAGAAGACAdTdT 700-718
3959
3960 AD-59444 AGGCCUGAGCAUGACCUCAdTdT UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdTdT 2253-2271
3961
3962 AD-59528 AUGUGAAUUAAGUUAUAUUdTdT AAUAUAACUUAAUUCACAUdTdT 2332-2350
3963
3964 AD-59498 ACUGCUGAAGAACUUCCAGdTdT CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdTdT 832-850
3965
3966 AD-59497 UGAGAAAGACAAAACUGCUdTdT AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdTdT 532-550
3967
3968 AD-59384 UCAGCCACCUCAGAGAACUdTdT AGUUCUCUGAGGUGGCUGAdTdT 1419-1437
3969
3970 AD-59452 GGCAACGAGCGUUUCGUUUdTdT AAACGAAACGCUCGUUGCCdTdT 51-69
3971
3972 AD-59379 CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdTdT UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdTdT 572-590
3973
3974 AD-59529 UGUGCCCACUGGAAGAGCUdTdT AGCUCUUCCAGUGGGCACAdTdT 1509-1527
3975
3976 AD-59389 CCACAGGAGCCAGCAUACUdTdT AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdTdT 311-329
3977
3978 AD-59585 GUGGUACUAGAAAUAUUUCdTdT GAAAUAUUUCUAGUACCACdTdT 1170-1188
3979
3980 AD-59570 UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdTdT AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdTdT 351-369
3981
3982 AD-59415 CCGCCAGCACCAGCGCAACdTdT GUUGCGCUGGUGCUGGCGGdTdT 1840-1858
3983
3984 AD-59505 CGCUGAGGGACGGGUGCUUdTdT AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTdT 1819-1837
3985
3986 AD-59557 UGGACUUCUCGACUUGAGUdTdT ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdTdT 69-87
3987
3988 AD-59548 AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTdT UGGCCGGAGGGGUUUCUUUdTdT 512-530
3989
3990 AD-59487 UUGACACCGUACGGUCCUAdTdT UAGGACCGUACGGUGUCAAdTdT 1719-1737
3991
3992 AD-59550 CCCUCUUCACCCUGGCUAAdTdT UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdTdT 1293-1311
3993
3994 AD-59572 CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdTdT CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdTdT 379-397
3995
3996 AD-59554 AUGCCCAAAACUGCCCCAAdTdT UUGGGGCAGUUUUGGGCAUdTdT 423-441
3997
3998 AD-59437 CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdTdT AAGGAGGCGGGCACUCAAGdTdT 81-99
3999
4000 AD-59584 GGGUACAUCGCCAGCACGAdTdT UCGUGCUGGCGAUGUACCCdTdT 1691-1709
4001
4002 AD-59373 GUGUGGGGCAGUUAUGGACdTdT GUCCAUAACUGCCCCACACdTdT 1123-1141
4003
4004 AD-59545 ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdTdT UUUAUUUCCAGGACUAUGUdTdT 2372-2390
4005
4006 AD-59547 AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdTdT AUCUGGACUCUGCUGGGAUdTdT 580-598
4007
4008 AD-59470 CUAGAUUCUUUCCACAGGAdTdT UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdTdT 300-318
4009
4010 AD-59417 UUGUUUUCCUCGUGCUUUGdTdT CAAAGCACGAGGAAAACAAdTdT 1259-1277
4011
4012 AD-59535 CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTdT GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdTdT 93-111
4013
4014 AD-59507 UGAGGCUGCUCCCGGACAAdTdT UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdTdT 31-49
4015
4016 AD-59519 CCAACAGACUCCUGAUGGAdTdT UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdTdT 562-580
4017
4018 AD-59391 UCACAUGGAAGCAAGUGGGdTdT CCCACUUGCUUCCAUGUGAdTdT 2112-2130
4019
4020 AD-59537 CAUUCAAUGGAUGGGGCGGdTdT CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTdT 1490-1508
4021
4022 AD-59450 AGGAAUGAGUCGCCACCCAdTdT UGGGUGGCGACUCAUUCCUdTdT 1099-1117
4023
4024 AD-59449 UGGACUUAGAGCGGGAGCUdTdT AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTdT 1209-1227
4025
4026 AD-59418 CUAAAAACACAGAAGUCUGdTdT CAGACUUCUGUGUUUUUAGdTdT 1950-1968
4027
4028 AD-59561 CCCUCACCACACACCCCAGdTdT CUGGGGUGUGUGGUGAGGGdTdT 2062-2080
4029
4030 AD-59460 AAUCCUUGCUUCAGGGACUdTdT AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdTdT 171-189
4031
4032 AD-59409 UUGUGGCAUUUGAAACUGUdTdT ACAGUUUCAAAUGCCACAAdTdT 1470-1488
4033
4034 AD-59476 UCAAUUACCCUACGGUGCCdTdT GGCACCGUAGGGUAAUUGAdTdT 2010-2028
4035
4036 AD-59406 CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTdT UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdTdT 460-478
4037
4038 AD-59569 GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdTdT AUCCAGGCAGGGAAGACUCdTdT 259-277
4039
4040 AD-59451 UGGAGAGUGUUGUUCGCCGdTdT CGGCGAACAACACUCUCCAdTdT 339-357
4041
4042 AD-59553 ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTdT CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdTdT 621-639
4043
4044 AD-59372 CUGGAUGGAUGAGUGGCUUdTdT AAGCCACUCAUCCAUCCAGdTdT 272-290
4045
4046 AD-59377 CAAGAUGAUGGAAGUUGGGdTdT CCCAACUUCCAUCAUCUUGdTdT 439-457
4047
4048 AD-59531 UUUCGUUUGGACUUCUCGAdTdT UCGAGAAGUCCAAACGAAAdTdT 62-80
4049
4050 AD-59560 UCAUCUUCACCACCUCUCUdTdT AGAGAGGUGGUGAAGAUGAdTdT 1749-1767
4051
4052 AD-59489 UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdTdT CAGCGGGAAGAACUGGGCAdTdT 132-150
4053
4054 AD-59540 AAAAAUGGACAUCAUUUCUdTdT AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdTdT 1639-1657
4055
4056 AD-59378 CUUGAGCUUCAGGAGGAUGdTdT CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdTdT 719-737
4057
4058 AD-59403 CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTdT AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdTdT 1761-1779
4059
4060 AD-59493 AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdTdT UCUUAGGGAUCCUGACUUUdTdT 242-260
4061
4062 AD-59374 CGACCACGGAGGAAUCCUUdTdT AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdTdT 159-177
4063
4064 AD-59380 UUCCGUCUGGACACCCCUUdTdT AAGGGGUGUCCAGACGGAAdTdT 609-627
4065
4066 AD-59576 CCACCCAUGCUGCUGGCUGdTdT CAGCCAGCAGCAUGGGUGGdTdT 1769-1787
4067
4068 AD-59425 UGAGAAAAAGAAUGACCACdTdT GUGGUCAUUCUUUUUCUCAdTdT 961-979
4069
4070 AD-59509 UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdTdT ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdTdT 1309-1327
4071
4072 AD-59488 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUdTdT AUUAAAAUUUAAUAUAACUdTdT 2342-2360
4073
4074 AD-59486 UCUUCCCGCUGUGGGGACAdTdT UGUCCCCACAGCGGGAAGAdTdT 140-158
4075
4076 AD-59465 UGCCACAAGCCAGGGCACUdTdT AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdTdT 631-649
4077
4078 AD-59484 AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdTdT AACUGGGCAUAACUGCGCUdTdT 122-140
4079
4080 AD-59368 GGACCAGGAGAAAGUCAGGdTdT CCUGACUUUCUCCUGGUCCdTdT 232-250
4081
4082 AD-59464 UGUCCACUGCCCCAGCCACdTdT GUGGCUGGGGCAGUGGACAdTdT 1903-1921
4083
4084 AD-59386 AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdTdT AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdTdT 22-40
4085
4086 AD-59439 GGGGAUGUGGGGACCAGGAdTdT UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTdT 222-240
4087
4088 AD-59440 CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdTdT AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdTdT 2380-2398
4089
4090 AD-59542 UUGAAACUGUCCAUUCAAUdTdT AUUGAAUGGACAGUUUCAAdTdT 1479-1497
4091
4092 AD-59559 GUGGGGACACGACCACGGAdTdT UCCGUGGUCGUGUCCCCACdTdT 150-168
4093
4094 AD-59586 CGCAGUGGGGCUUUAUGGGdTdT CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTdT 1579-1597
4095
4096 AD-59408 UUGUCUUUAUAUGUGAAUUdTdT AAUUCACAUAUAAAGACAAdTdT 2322-2340
4097
4098 AD-59568 UCACCCUGGCUAAGAUGAUdTdT AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdTdT 1299-1317
4099
4100 AD-59398 GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdTdT CUCAGGCCUGAGCAGAUACdTdT 2243-2261
4101
4102 AD-59508 AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdTdT UGGAGAAGAAGCCACUCAUdTdT 280-298
4103
4104 AD-59523 GAAGUUGGGGCCAAGCCAGdTdT CUGGCUUGGCCCCAACUUCdTdT 449-467
4105
4106 AD-59410 UCAGGGACUCGGGACCCUGdTdT CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdTdT 181-199
4107
4108 AD-59541 UCCUACGGAUUGCCCCCACdTdT GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdTdT 2043-2061
4109
4110 AD-59524 UUACUCUGAUUCUGGGAACdTdT GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdTdT 1333-1351
4111
4112 AD-59501 AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdTdT AGGGAAGACUCUUAGGGAUdTdT 251-269
4113
4114 AD-59383 UGCCAAAGUACAUCUUCCGdTdT CGGAAGAUGUACUUUGGCAdTdT 1389-1407
4115
4116 AD-59577 UCCUCGGGUUUAGGGGAUGdTdT CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTdT 210-228
4117
4118 AD-59447 UGCUGAAACCUCAGCAGGCdTdT GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdTdT 769-787
4119
4120 AD-59555 CCACCCACGGGUGUGUGGGdTdT CCCACACACCCGUGGGUGGdTdT 1111-1129
4121
4122 AD-59405 UGGUGCAGUAAUGACUACCdTdT GGUAGUCAUUACUGCACCAdTdT 1079-1097
4123
4124 AD-59371 UUCUCCACCUAGAUUCUUUdTdT AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdTdT 292-310
4125
4126 AD-59443 UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdTdT CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdTdT 9-27
4127
4128 AD-59401 UGGAACUAGUAAAUUCCAUdTdT AUGGAAUUUACUAGUUCCAdTdT 1189-1207
4129
4130 AD-59494 GGACCCUGCUGGACCCCUUdTdT AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdTdT 192-210
4131
4132 AD-59504 UCAAUUAUUUCACUUAACCdTdT GGUUAAGUGAAAUAAUUGAdTdT 2269-2287
4133
4134 AD-59369 CCCGGACAAGGGCAACGAGdTdT CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdTdT 41-59
4135
4136 AD-59571 UUUUAAAACUGUGAACCGGdTdT CCGGUUCACAGUUUUAAAAdTdT 991-1009
4137
4138 AD-59527 GUGCUUCGCCGCCAGCACCdTdT GGUGCUGGCGGCGAAGCACdTdT 1832-1850
4139
4140 AD-59466 UGGACCCCUUCCUCGGGUUdTdT AACCCGAGGAAGGGGUCCAdTdT 201-219
4141
4142 AD-59526 CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdTdT CCGGCGCCUUAAUAUACAGdTdT 1-19
4143
4144 AD-59543 UUGCCCCCACCCCUCACCAdTdT UGGUGAGGGGUGGGGGCAAdTdT 2052-2070
4145
4146 AD-59564 AUGGGGCGGUGUGCCCACUdTdT AGUGGGCACACCGCCCCAUdTdT 1500-1518
4147
4148 AD-59583 CUAUAGUAAAAACAUAGUCdTdT GACUAUGUUUUUACUAUAGdTdT 2361-2379
La actividad in vitro de los ARNip para suprimir el ARNm de ALAS1 se evaluó en un cribado de dosis única en células Hep3B que se habían transfectado utilizando Lipofectamine2000 como reactivo de transfección. Los experimentos de dosis única se llevaron a cabo con una concentración del dúplex 10 nM y se analizaron mediante un ensayo de ADN ramificado (ADNr). Los resultados se muestran en la Tabla 19 y se expresan como el porcentaje de ARNm remanente.
Tabla 19: Supresión del ARNm de ALAS1 evaluada mediante un ensayo de ADNr
Dúplex
% de ARNm remanente Desv. est.
AD-59453
11.2 1.5
AD-59395
12.7 1.1
AD-59477
14.5 2.0
AD-59492
14.8 2.1
AD-59361
15.1 4.9
AD-59462
15.4 2.6
AD-59433
15.8 2.7
AD-59424
16.0 1.7
AD-59414
16.1 1.3
AD-59539
16.2 2.6
AD-59400
16.2 1.8
AD-59551
16.3 2.3
AD-59482
16.6 2.1
AD-59448
16.6 3.7
AD-59392
16.9 3.5
AD-59469
16.9 2.2
AD-59431
17.0 2.0
AD-59423
17.1 3.8
AD-59517
17.2 1.5
AD-59578
17.3 3.1
AD-59495
17.7 3.7
AD-59432
17.7 2.8
AD-59382
17.9 3.2
AD-59472
18.6 3.5
AD-59459
18.7 3.8
AD-59413
18.8 2.4
AD-59478
18.9 3.0
AD-59376
18.9 3.2
AD-59556
18.9 2.4
AD-59399
19.0 4.1
AD-59474
19.4 1.6
AD-53542
19.4 1.7
AD-59480
19.6 1.6
AD-59549
19.7 2.1
AD-59515
19.8 4.4
AD-59427
19.9 3.2
AD-59390
19.9 3.4
AD-59511
19.9 2.2
AD-59532
20.0 2.4
AD-59562
20.2 2.6
AD-59513
20.3 3.9
AD-59362
20.6 2.5
AD-53541
20.6 2.2
AD-59490
20.7 2.3
AD-59422
20.8 4.5
AD-59467
21.2 2.3
AD-59579
21.2 3.3
AD-59426
21.7 2.3
AD-59363
21.7 2.7
AD-59436
21.7 2.7
AD-53536
21.9 1.5
AD-59491
21.9 2.6
AD-59500
22.2 2.8
AD-59394
22.3 10.1
AD-59441
22.3 2.6
AD-59365
22.4 4.2
AD-59411
22.5 2.9
AD-59544
22.5 2.1
AD-59428
22.7 4.7
AD-59471
22.9 5.0
AD-59518
22.9 2.3
AD-53547
22.9 1.5
AD-59573
23.0 4.2
AD-59473
23.2 1.8
AD-59412
23.4 2.5
AD-59522
23.4 3.3
AD-59502
23.6 2.7
AD-59499
23.6 1.6
AD-59520
23.8 3.8
AD-59581
23.9 6.0
AD-59461
24.3 4.2
AD-59370
24.3 5.6
AD-53540
24.4 2.1
AD-59574
24.5 2.0
AD-59375
24.6 2.3
AD-59387
24.8 7.2
AD-59397
24.9 9.6
AD-59396
25.0 10.2
AD-59393
25.3 11.6
AD-59483
25.4 3.8
AD-59430
25.5 1.8
AD-59463
25.6 4.8
AD-53534
25.9 3.1
AD-59514
26.2 5.7
AD-59575
26.2 3.2
AD-59364
26.2 4.5
AD-59402
26.3 3.1
AD-59479
26.3 2.5
AD-59481
26.4 2.2
AD-59530
26.4 4.4
AD-59582
26.6 3.9
AD-59506
27.0 4.1
AD-59567
27.3 1.1
AD-59485
27.7 4.7
AD-59525
28.3 3.1
AD-59566
28.5 0.6
AD-59580
28.7 7.1
AD-59512
29.5 2.5
AD-59475
29.6 4.2
AD-59438
29.6 3.3
AD-59442
29.9 2.8
AD-59516
30.4 3.8
AD-59429
30.8 4.3
AD-59510
31.3 1.9
AD-59457
31.4 1.2
AD-59434
31.6 3.5
AD-59454
32.0 1.9
AD-59468
32.2 3.2
AD-59565
32.4 1.5
AD-59416
32.7 1.7
AD-59420
33.2 3.1
AD-59552
33.2 2.2
AD-59558
33.8 3.8
AD-59404
34.0 5.4
AD-59455
34.8 1.3
AD-59496
34.9 5.2
AD-59446
35.5 1.7
AD-59435
35.9 1.2
AD-59419
36.0 1.4
AD-59533
36.7 3.7
AD-59366
36.7 6.0
AD-59521
36.9 4.3
AD-59563
36.9 4.1
AD-59534
36.9 3.3
AD-59407
37.1 4.7
AD-59445
37.2 3.2
AD-59546
37.9 4.9
AD-59456
38.3 4.0
AD-59503
38.8 5.0
AD-59536
39.8 4.2
AD-59385
39.9 13.7
AD-59367
40.0 3.6
AD-59458
40.0 3.4
AD-59381
40.3 9.9
AD-59538
40.8 4.9
AD-59421
40.9 6.4
AD-59388
41.0 9.1
AD-59444
41.1 2.7
AD-59528
41.9 3.3
AD-59498
42.2 3.3
AD-59497
42.4 4.9
AD-59384
42.7 17.6
AD-59452
42.7 3.1
AD-59379
43.6 2.6
AD-59529
43.8 4.8
AD-59389
44.1 6.4
AD-59585
44.3 3.2
AD-59570
45.1 4.0
AD-59415
46.6 2.3
AD-59505
47.5 6.2
AD-59557
48.1 4.4
AD-59548
49.9 4.0
AD-59487
50.7 3.2
AD-59550
50.8 5.8
AD-59572
51.1 4.0
AD-59554
51.3 6.0
AD-59437
52.2 4.8
AD-59584
54.9 2.7
AD-59373
55.3 20.1
AD-59545
55.4 3.4
AD-59547
55.9 4.7
AD-59470
56.0 2.7
AD-59417
56.4 7.7
AD-59535
57.6 5.1
AD-59507
58.8 4.7
AD-59519
59.1 5.6
AD-59391
60.1 12.5
AD-59537
60.6 9.1
AD-59450
60.7 7.2
AD-59449
61.6 6.8
AD-59418
61.8 8.4
AD-59561
62.2 7.2
AD-59460
62.8 4.7
AD-59409
64.4 9.0
AD-59476
65.2 5.6
AD-59406
65.6 3.5
AD-59569
66.7 7.6
AD-59451
66.9 2.9
AD-59553
67.2 8.8
AD-59372
67.3 25.6
AD-59377
68.7 5.1
AD-59531
68.7 9.0
AD-59560
68.7 12.7
AD-59489
69.6 8.9
AD-59540
70.1 10.1
AD-59378
70.6 14.1
AD-59403
71.4 3.3
AD-59493
72.3 3.5
AD-59374
75.9 5.1
AD-59380
76.4 11.1
AD-59576
77.5 16.2
AD-59425
77.9 10.6
AD-59509
78.0 3.2
AD-59488
78.6 7.1
AD-59486
79.4 5.0
AD-59465
79.5 5.1
AD-59484
79.8 3.2
AD-59368
80.0 11.9
AD-59464
80.2 9.3
AD-59386
80.6 33.2
AD-59439
80.9 4.0
AD-59440
82.2 1.9
AD-59542
83.3 10.6
AD-59559
83.7 9.1
AD-59586
83.8 11.5
AD-59408
86.3 2.8
AD-59568
86.8 4.2
AD-59398
87.4 24.9
AD-59508
87.5 2.5
AD-59523
87.6 11.8
AD-59410
88.8 8.3
AD-59541
88.9 10.8
AD-59524
89.5 12.1
AD-59501
89.9 5.1
AD-59383
90.8 27.4
AD-59577
91.1 2.3
AD-59447
91.3 12.9
AD-59555
91.7 3.4
AD-59405
92.5 5.7
AD-59371
93.5 31.7
AD-59443
93.8 9.0
AD-59401
94.5 7.1
AD-59494
95.1 9.1
AD-59504
96.8 11.7
AD-59369
96.8 4.8
AD-59571
97.4 7.0
AD-59527
98.6 7.8
AD-59466
99.7 14.0
AD-59526
102.9 4.6
AD-59543
103.7 3.0
AD-59564
103.7 12.1
AD-59583
112.4 13.2
Los doscientos treinta y dos dúplex que se evaluaron suprimieron el ARNm de ALAS1 en diferentes grados en este ensayo de dosis única. De acuerdo con este ensayo, al menos cuatro de los dúplex (AD-59453, AD-59395, AD-59477 y AD-59492) suprimieron el ARNm de ALAS1 un 85% o más, 39 de los dúplex suprimieron el ARNm de ALAS1 un 80% o más, 101 de los dúplex suprimieron el ARNm de ALAS1 un 70% o más y 152 de los dúplex suprimieron el ARNm de ALAS1 un 50% o más. Por el contrario, algunos dúplex no mostraron ninguna supresión apreciable en este ensayo.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de ALAS1, donde el ARNbc comprende:
    (i). una hebra antisentido complementaria respecto a al menos los nucleótidos 871-889 de la SEQ ID NO: 1;
    5 (ii) una hebra sentido que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1295; y
    (iii) un ligando que comprende uno o más derivados de tipo N-acetilgalactosamina (GalNAc).
  2. 2. El ARNbc de la reivindicación 1, donde dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado, donde al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona a partir del grupo constituido por: un nucleótido con una modificación de tipo 2'-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal unido
    10 a un derivado de tipo colesterilo o un grupo de tipo bisdecilamida del ácido dodecanoico, un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido con una modificación de tipo 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido que no sea básico, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-amino, un nucleótido con una modificación de tipo 2’-alquilo, un nucleótido de tipo morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base que no sea natural.
    15 3. El ARNbc de la reivindicación 1 o 2, donde la estructura del derivado de tipo GalNAc es como la que se muestra a continuación y está unida al extremo 3’ de la hebra sentido del ARNbc
    20 4. El ARNbc de la reivindicación 1, 2 o 3, donde la hebra antisentido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1296.
  3. 5.
    El ARNbc de la reivindicación 4, donde la hebra sentido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1295.
  4. 6.
    El ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una región dúplex con una longitud de 15 a 30 pares de bases.
    25 7. El ARNbc de la reivindicación 6, donde dicha región dúplex tiene una longitud de 19 a 23 pares de bases.
  5. 8.
    El ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde cada hebra tiene una longitud que no es superior a 30 nucleótidos.
  6. 9.
    Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen ALAS1, comprendiendo la composición el
    ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde dicha composición se administra preferentemente por vía 30 intravenosa o subcutánea.
  7. 10. Un método para inhibir la expresión de ALAS1 en una célula, comprendiendo el método:
    (a)
    introducir en la célula el ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y
    (b)
    mantener la célula del paso (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen ALAS1, de este modo se inhibe la expresión del gen ALAS1 en la célula,
    35 donde se excluye cualquier método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  8. 11.
    Un método para reducir el nivel de una porfirina o un precursor de una porfirina en una célula, que comprende poner en contacto la célula con el ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en una cantidad eficaz para reducir el nivel de la porfirina o el precursor de la porfirina en la célula, donde se excluye cualquier método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
  9. 12.
    Un ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o una composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en un método para tratar un trastorno relacionado con la expresión de ALAS1, donde se ha de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho ARNbc o dicha composición a un sujeto que necesite dicho
    5 tratamiento.
  10. 13. El ARNbc para su uso de la reivindicación 12, donde
    (a)
    el sujeto corre el riesgo de desarrollar, o se le ha diagnosticado, una porfiria;
    (b)
    dicho método
    (i) mejora un síntoma asociado con un trastorno relacionado con ALAS1 (p. ej., una porfiria), 10 (ii) inhibe la expresión de ALAS1 en el sujeto,
    (iii) reduce el nivel de un precursor de porfirina o una porfirina en el sujeto,
    (iv)
    reduce la frecuencia de ataques agudos de síntomas asociados con una porfiria en el sujeto, o
    (v)
    reduce la incidencia de ataques agudos de síntomas asociados con una porfiria en el sujeto cuando el sujeto se expone a un factor precipitante;
    15 (c) la porfiria es una porfiria hepática seleccionada entre porfiria intermitente aguda (AIP), coproporfiria hereditaria (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria debida a la deficiencia de ALA-deshidratasa (ADP) y porfiria hepatoeritropoyética;
    (d) el ARNbc se ha de administrar antes, durante o después de un ataque agudo de porfiria;
    (e) el ARNbc se ha de administrar durante un pródromo, donde preferentemente el pródromo se caracteriza 20 por dolor, náusea, síntomas psicológicos, inquietud o insomnio; o
    (f) el sujeto presenta un nivel elevado de ALA y/o PBG.
  11. 14. Una célula in vitro o ex vivo que comprende el ARNbc de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
    FIG. 1 FIG. 2A FIG. 2B FIG. 3A FIG. 3B FIG. 4A FIG. 4B FIG. 5 FIG. 6 FIG. 7
    FIG. 9
    152 FIG. 10
    FIG. 11
    FIG. 12 FIG. 13 FIG. 14 FIG. 15
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