ES2285728T3

ES2285728T3 - Procedimiento para la preparacion de alfa hidroxiacidos empleando un microorganismo, y un nuevo microorganismo.

Info

Publication number: ES2285728T3
Application number: ES97903619T
Authority: ES
Inventors: Yoichi Odawara Research Center KOBAYASHI; Ken Odawara Research Center WATABE; Mahito Odawara Research Center OHIRA; Koichi Odawara Research Center HAYAKAWA
Original assignee: Nippon Soda Co Ltd
Current assignee: Nippon Soda Co Ltd
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2017-02-27
Also published as: DE69737696D1; RU2205220C2; DE69737696T2; AU1811997A; WO1997032030A1; JP4235985B2; EP0974669A4; CN1212018A; EP0974669B1; EP0974669A1; CN1086738C

Abstract

Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH en donde R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido, o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido, caracterizado porque los compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, se producen y acumulan en un disolvente acuoso en presencia de un microorganismo que tiene tanto una resistencia a la concentración como unas propiedades de durabilidad respecto a los compuestos representados por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido más arriba, y/o los compuestos representados por la fórmula general [II]:RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, en el procedimiento para convertir un compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido más arriba, en los compuestos representados por la fórmula general [II]:RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, utilizando una reacción hidrolítica proporcionada por la actividad enzimática del microorganismo, siendo dicho microorganismo el Variovorax paradoxus o el Arthrobacter cepa NSSC 104, depositada en FERM como BP-5829.

Description

Procedimiento para la preparación de \alpha-hidroxiácidos empleando un microorganismo, y un nuevo microorganismo.

La presente invención se refiere a un método para la producción de compuestos \alpha-hidroxiácidos de acuerdo con la reivindicación 1, el Arthrobacter cepa NSSC 104 de acuerdo con la reivindicación 7, así como un método para la producción de compuestos de acuerdo con la reclamación 8.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un \alpha-hidroxiácido basado en la hidrólisis de un hidroxinitrilo empleando microorganismos y nuevos microorganismos. Entre los \alpha-hidroxiácidos, el ácido láctico es de utilidad para los alimentos, la fermentación y otros usos industriales, mientras que el ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico es de utilidad como aditivo alimentario para el ganado.

En el pasado, se han aplicado los siguientes métodos como método para la preparación de un \alpha-hidroxiácido [II] empleando el \alpha-hidroxinitrilo [I] como material de partida y mediante el empleo de microorganismos.

(1) Un método para la preparación de ácido láctico, ácido glicólico, etc., empleando un microorganismo tal como el Bacillus spp. como el Bacterizium spp, Micrococcus spp. y Brevibacterium spp., los cuales se describen en la patente japonesa publicación nº Sho 58-15120.

(2) Un método para la preparación de ácido láctico, ácido glicólico y ácido 2-hidroxibutírico, empleando un microorganismo perteneciente a Corynebacterium spp., el cual se describe en la patente japonesa abierta nº Sho 61-56086.

(3) Un método para la preparación de ácido láctico, ácido 2-hidroxiisobutírico, ácido 2-hidroxi-2-hidroxifenil propiónico y ácido mandélico, empleando un microorganismo tal como el Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Cocryoboros spp., y Fusarius spp., los cuales están descritos en la patente japonesa abierta nº Sho 63-222696.

(4) Un método para la preparación de la 2-hidroxi-3,3-dimetil-4-butirolactona empleando un microorganismo tal como Arthrobacter spp., Aspergillus spp., Bacillus spp., Bacterizium spp., Brevibacterium ssp., Cocryoboros spp., Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Nocardia ssp., Penicillium spp., Pseudomonas spp., y Fusarium spp., los cuales están descritos en la patente japonesa abierta Sho 64-10996.

(5) Un método para la preparación del ácido 2-hidroxiisobutírico, empleando un microorganismo tal como Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Arthrobacter spp. y Brevibacterium spp., los cual están descritos en la patente japonesa abierta nº Hei 4-40897.

(6) Un método para la preparación del ácido \alpha-hidroxi-4-metiltiobutírico empleando un microorganismo tal como Caseobater spp., Pseudomonas spp., Alcaligenes spp., Corynebacterium spp., Brevibacterium spp., Nocardia spp., Rhodococcus spp., y Arthrobacter spp., los cuales están descritos en la patente japonesa abierta nº Hei 4-40898.

(7) Un método para la preparación del ácido 4-metiltiobutírico empleando un microorganismo tal como Alcaligenes spp., Rhodococcus spp., y Goldona spp. los cuales están descritos en la patente WO 96/09403.

(8) Un método para la preparación del ácido \alpha-hidroxi-4-metiltiobutírico empleando un microorganismo tal como Pantoea spp., Micrococcus spp., y Bacterizium spp., los cuales están descritos en la patente japonesa abierta nº Hei 8-173175.

Sin embargo, los métodos para la preparación de un \alpha-hidroxiácido como se ha mencionado más arriba no son siempre satisfactorios puesto que no pueden producir y acumular la substancia deseada con una alta concentración. Por ejemplo, en el caso del ácido láctico, solamente se obtiene una acumulación del 9,8% en peso del mismo cuando se emplea el Corynebacterium spp. como microorganismo (patente japonesa abierta nº Sho 61-56086), solamente una acumulación del 10% en peso del mismo cuando se emplea el Pseudomonas spp. (patente japonesa abierta nº Sho 63-222696) y solamente el 0,15% en peso de acumulación del mismo cuando se emplea el Arthrobacter spp. (patente japonesa abierta nº Sho 63-222696). Mientras la acumulación del ácido \alpha-hidroxibutírico empleando el Pseudomonas spp. es de 0,8% en peso (patente japonesa abierta nº Sho 63-222696), la cantidad acumulada de \alpha-hidroxi-4-metiltiobutírico es de 188 mM (2,8% en peso) empleando el Caseobater spp. (patente japonesa abierta nº Hei 4-40898), 55 mM (0,8% en peso) empleando el Arthrobacter spp. (patente japonesa abierta nº Hei 40898) y 940 mm (14% en peso) empleando el Alcaligenes spp. (patente WO 96/09403), respectivamente.

Como una razón para la baja concentración de acumulación de dichos productos como se describe más arriba, se considera que alguna actividad enzimática en relación con los mismos podría estar inhibida en presencia de ácido ciánico (Agricultural Biological Chemistry ("Química Biológica de Agricultura")), vol. 46, página 1165, 1982) el cual se genera en la disociación parcial del \alpha-hidroxinitrilo en agua juntamente con el correspondiente aldehido o cetona (Chemical Reviews ("Revisiones Químicas")), vol. 42, página 189, 1948). Además, también se ha indicado la posibilidad de que la enzima relacionada se inactive en un plazo corto de tiempo con el aldehido disociado. Como una solución para prevenir dicha inactivación de la enzima, han sido propuestos, un método para añadir o bien iones de sulfito ácido o iones ditionito (patente japonesa abierta nº Hei 5-192189), y un método para añadir o bien iones fosfito o iones hipofosfito (patente japonesa abierta nº Hei 7-213296). Sin embargo, la concentración del \alpha-hidroxiácido producido y acumulado no es tan alta incluso empleando los aditivos que se han descrito más arriba.

En Chemical Abstracts ("Resúmenes Químicos"), vol. 125 nº 13, 23 de Septiembre 1996 (1996-09-23), Columbus, Ohio, US; resumen nº 165839, Matsuyama, Akikazu, se describe la fabricación microbiana del ácido alfa-hidroxi-4-metiltiobutírico.

En Chemical Abstracts ("Resúmenes Químicos"), vol. 126 nº 17, 28 de abril 1997 (1997-04-28), Columbus, Ohio, US; resumen nº 224356, Nakamura, Tetsuji, se describe la fabricación microbiana del ácido glicólico.

En Chemical Abstracts ("Resúmenes Químicos"), vol. 116 nº 23, 8 de junio 1992 (1992-06-08), Columbus, Ohio, US; resumen nº 233932, Endo, Ryuichi, se describe la fabricación fermentativa del ácido alfa-hidroxiisobutírico.

En Chemical Abstracts ("Resúmenes Químicos"), vol. 105 nº 7, 18 de agosto 1986 (1986-08-18), Columbus, Ohio, US; resumen nº 59481, Kawakami, Kyoshi et al., se describe la producción microbiana de alfa hidroxiácidos y sus sales.

La patente WO 96/09403 se refiere a un nuevo método para la hidrólisis enzimática del 4-metilistiobutironitrilo en ácido 4-metiltiobutírico racémico empleando una nitrilasa de Alcaligenes faecalis, Rhodococcus sp. HT 29-7 ó Gordona terreae.

La patente EP 610 049 se refiere a un procedimiento biológico para producir predominantemente un ácido \alpha-hidroxi-carboxílico ópticamente activo, con un grupo fenilo, directa-mente de un \alpha-hidroxinitrilo racémico o una mezcla de un aldehido correspondiente al nitrilo y ácido prúsico como un substrato, el cual comprende la reacción de un microorganismo perteneciente al género Rhodococcus, Alcaligenes, Brevibacterium o Pseudomonas con el substrato en un medio acuoso neutro a básico. Un deseado ácido \alpha-hidroxicarboxílico ópticamente activo que tiene un grupo fenilo, puede obtenerse cuantitativamente con una alta pureza óptica.

En Database Biosis, resumen nº PREV19768047262 & Yagi & Minoda, Agriculture and Biol. Chem. vol. 43, 1979, p. 571-576 se describe la producción de ácido láctico a partir del 1,2-propanodiol mediante cultivo en potes y células en reposo de Arthrobacter oxydans.

En general, cuando la concentración acumulada de un producto permanece baja, es bien conocido por lo expertos en la técnica, que la instalación para dicha fabricación tiende a ser compleja y grande. Por lo tanto, ha sido difícil desde el punto de vista de la eficiencia, obtener el \alpha-hidroxiácido a escala industrial de acuerdo con los métodos descritos más arriba. La presente invención tiene por objeto proporcionar un método para acumular \alpha-hidroxiácido a un nivel de alta concentración empleando microorganismos, y producir eficientemente dicho \alpha-hidroxiácido.

El método para la producción de los compuestos \alpha-hidróxiácidos se define en la reivindicación 1, el Arthrobacter NSSC 104 se define en la reivindicación 7, y el método para la producción de compuestos se define en la reivindicación 8.

Los inventores de la presente invención han hecho estudios de selección con el fin de descubrir microorganismos industrialmente ventajosos que conviertan enzimáticamente los \alpha-hidroxinitrilos representados por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN (en donde R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido, o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido), en \alpha-hidroxiácidos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH (en donde R es como se ha definido más arriba), la cual actividad de conversión es resistente al efecto supresor del \alpha-hidroxinitrilo [I] ó del \alpha-hidroxiácido [II], y tiene durabilidad para mantener dicha actividad conversora durante un largo tiempo, y capacidad para acumular el \alpha-hidroxiácido [II] con un alto nivel de concentración.

Como resultado, los inventores han descubierto recientemente la deseada actividad como se ha descrito más arriba, en microorganismos que pertenecen a Variovorax spp. y Arthrobacter spp.. Además han descubierto que la actividad enzimática descrita más arriba puede mejorarse añadiendo al sistema de reacción un compuesto cianuro representado por la fórmula general [III]; M_{m}(CN)_{n} (en donde M representa un átomo de hidrógeno, amonio o un ión metálico, y m y n representan un número entero 1, 2 ó 3), para lograr la presente invención.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un \alpha-hidroxiácido [II] caracterizado porque el \alpha-hidroxiácido [II] se produce, se acumula y se recoge en un disolvente orgánico en presencia de microorganismos que tienen tanto una resistencia a la concentración como una propiedad de durabilidad para el \alpha-hidroxinitrilo [I] y/o el \alpha-hidroxiácido [II] en el procedimiento para la preparación del \alpha-hidroxiácido [II], en donde el \alpha-hidroxinitrilo [I] se hidroliza mediante las reacciones microbianas con lo cual se convierte en \alpha-hidroxiácido [II], y a dicho sistema de reacción se añade además un compuesto cianuro.

La presente invención se describe con más detalle a continuación:

Como organismo para emplear en la presente invención puede aplicarse uno cualquiera con la limitación particular de que pueda mantener su resistencia a la concentración, bien sea de los \alpha-hidroxinitrilos ó de los \alpha-hidroxiácidos en la extensión requerida para lograr el objetivo de la presente invención y tenga una durabilidad para mantener la actividad enzimática durante largo tiempo. Como ejemplos para dichos microorganismos, pueden citarse el Variovorax paradoxus cepa IAM 12374 y el Arthrobacter cepa NSSC 104 (FERM P-15424). El Variovorax paradoxus cepa IAM 12374, se obtiene fácilmente del Institute for Molecular Cell Biology ("Instituto de Biología molecular de la célula"), de la Universidad de Tokio (IAM). Mientras, el Arthrobacter cepa NSSC 1004 ha sido recientemente aislado de la naturaleza por los inventores de la presente invención y ha sido depositado con los siguientes detalles:

Depósito nº FERM BP-5829 (transferido de Microorganismos Bikouken, depósito nº P-15424).

Fecha del depósito: el depósito nacional ha sido efectuado el 6 de Febrero de 1996, y el depósito internacional ha sido efectuado el 20 de Febrero de 1997.

Lugar del depósito: nº 1-3, Higashi 1-chome. Tsukubashi, Ibaragi, Japón.

Organización para el depósito: Institute for Biotechnology and Industrial Technology ("Instituto para Biotecnología y Tecnología Industrial"), Industrial Technology Academy ("Academia de Tecnología Industrial"), Ministry of Trade and Industries ("Ministerio de Comercio e Industria").

Las características del Arthrobacter cepa NSSC 104 son las siguientes:

: Forma: bacilo polimorfo

: Característica Gram: positiva

: Ciclo de cocos en barras: positivo

: Formación de esporas: negativo

: Movilidad: negativa

: Diaminoácidos en la pared celular: lisina

: Necesidad de oxígeno: aeróbico

: Formación de oxidasa: negativa

: Formación de catalasa: positiva

: Descomposición del ADN: positiva

: Liquefacción de la gelatina: positiva

: Descomposición del almidón: positiva

: Descomposición de la caseína: positiva

: Necesidad de vitaminas: negativa

: Prueba del glicolilo: negativa (tipo acetilo)

: Tipo de quinona: MK-9 (H2)

	Composición del azúcar de la pared celular:	galactosa +
		glucosa +

Después de referirnos a las características micro-biológicas de la cepa NSSC 104 de acuerdo con el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática (1986), la cepa se identificó como una cepa bacteriana perteneciente a Arthrobacter spp.. La cepa ha sido depositada con el nº de depósito mencionado más arriba en el Institute for Biotechnology and Industrial Technology ("Instituto de Biotecnología y Tecnología Industrial"), Industrial Technology Academy ("Academia de Tecnología Industrial"), Ministry of Trade and Industries ("Ministerio de Comercio e Industria").

A continuación se describen diversas versiones para efectuar la presente invención.

El cultivo de los microorganismos empleados en la presente invención se efectúa en un medio ordinario en donde están contenidos la substancia de inducción de la enzima, la fuente de carbono utilizable por los microorganismos, la fuente de nitrógeno, los iones inorgánicos y los nutrientes orgánicos. Como ejemplos para la substancia de inducción de la enzima empleada en la presente invención, se dan los compuestos de nitrilo incluyendo el isobutironitrilo y similares y los compuestos de amida cíclicos incluyendo la caprolactama y similares. Como fuente de carbono, se emplean los hidratos de carbono incluyendo la glucosa y similares, los alcoholes incluyendo el etanol y similares, ácidos orgánicos, etc., si son necesarios. Como fuente de nitrógeno, se emplean los aminoácidos, nitratos, sales de amonio y similares. Como iones inorgánicos, se emplean iones fosfato, iones potasio, iones magnesio, iones sulfato, iones férricos y similares, según sea necesario. Como nutrientes orgánicos, se emplean las vitaminas, aminoácidos, etc., y extracto de germen de maíz conteniendo los mismos, extractos de levadura, polipeptona, extractos de caldo y similares, si es necesario. El cultivo se efectúa manteniendo adecuadamente las condiciones del medio, el pH en un margen de 6 a 9, la temperatura en un margen de 25 a 37ºC y en condiciones aeróbicas.

La reacción de hidrólisis causada por los microorganismos de acuerdo con la presente invención se efectúa recogiendo las células del microorganismo cultivado como se ha descrito más arriba, preparando las células de los microorganismos procesados, tales como células inmovilizadas, enzimas crudas y enzimas inmovilizadas, y poniendo en contacto los microorganismos obtenidos, con el \alpha-hidroxinitrilo [I] en un disolvente acuoso. Cuando se inmovilizan las células de los microorganismos o enzimas, puede aplicarse un método normal de inmovilización tal como el método de unión a un portador y el método de entrapping ("inclusión"). Cuando se preparan enzimas crudas, pueden aplicarse los métodos de purificación de enzimas normalmente empleados, tales como el salificado con sulfato de amonio y la cromatografía, después de la trituración de las células de los microorganismos empleando ultrasonidos, un homogeneizador a alta presión o similares. Las células de los microorganismos se emplean para la reacción de hidrólisis a una dosis de 0,01 - 10% en peso sobre la base del peso seco, y las células pueden emplearse repetidamente recuperándolas por algún medio de filtración, centrifugación y un método de concentración por membrana de ultrafiltración después de completar la reacción. Como disolvente acuoso puede emplearse o bien agua, o bien una solución acuosa que contenga minerales, tal como un tampón y un disolvente orgánico, y dicha solución acuosa puede separarse en dos capas.

El símbolo R contenido en el \alpha-hidroxinitrilo representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, representa en la presente invención un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido.

Más específicamente, R puede ser un átomo de hidrógeno, un alquilo de 1 a 6 átomos de hidrógeno, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo y hexilo,

un alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como metiltiometilo, 1-metiltioetilo, 2-metiltioetilo, 1-metiltiopropilo, 2-metiltiopropilo, 3-metiltiopropilo, 1-metiltiobutilo, 2-metiltiobutilo, 3-metiltiobutilo, 4-metiltiobutilo, 6-metiltiohexilo, etiltiometilo, 1-etiltioetilo, 2-etiltioetilo, 1-etiltiopropilo, 2-etiltiopropilo, 3-etiltiopropilo, 1-etiltiobutilo, 2-etiltiobutilo, 3-etiltiobutilo, 4-etiltiobutilo, propiltiometilo, 1-propiltioetilo, 2-propiltioetilo, 1-propil-tiopropilo, 2-propiltiopropilo, 3-propiltiopropilo, 1-metiltio-isopropilo, 1-etilisopropilo, 1-propiltiobuti1o, 2-propiltiobutilo, 3-propiltiobutilo, 4-propiltiobutilo, propiltiometilo, 1-propiltioetilo, 2-propiltioetilo, 1-isopropiltiopropilo, 2-isopropiltiopropilo, 3-isopropiltiopropilo, 1-isopropiltiobutilo, 2-isopropiltiobutilo, 3-isopropiltiobutilo y 4-isopropiltiobutilo.

un hidroxialquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como el hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 1-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 1-hidroxibutilo, 1-hidroxiisopropilo, 2-hidroxibutilo y 3-hidroxibutilo,

un carboxialquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como carboximetilo, 2-carboxietilo, 1-carboxietilo, 3-carboxipropilo, 2-carboxipropilo y 1-carboxipropilo.

un carbamoilo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como carbamoilmetilo, 1-carbamoiletilo, 2-carbamoiletilo, 1-carbamoilpropilo, 2-carbamoilpropilo y 3-carbamoilpropilo,

un mercaptoalquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como mercaptometilo, 1-mercaptoetilo, 2-mercaptoetilo, 1-mercaptopropilo, 2-mercaptopropilo y 3-mercaptopropilo,

un carbamidino alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como el carbamidinometilo, 1-carbamidinoetilo, 2-carbamidinoetilo, 1-carbamidinopropilo, 2-carbamidinopropilo y 3-carbamidinopropilo,

un aralquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, tal como bencilo, 2-clorobencilo, 4-metilbencilo, 4-metoxibencilo, 3-nitrobencilo, 4-hidroxibencilo, \alpha-metilbencilo y \alpha,\alpha-dimetilbencilo,

un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con un anillo heterocíclico, tal como 3-indolilmetilo, 2-indolilmetilo, 2-(3-indolil)etilo, 1-(3-indolil)etilo, 2-indolilmetilo, 2-(2-indolil)etilo, 1-(2-indolil)etilo, 4-imidazolilmetilo, 2-imidazolilmetilo, 1-(4-imidazolil)etilo y 2-(4-imidazolil)etilo.

un alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido tal como vinilo, propenilo, isopropenilo, alilo, 1-cloroalilo, 2-cloroalilo y crotilo,

un alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, tal como metoxilo, etoxilo, propoxilo y trifluormetoxilo,

un arilo opcionalmente substituido, tal como fenilo, 2-clorofenilo, p-tolilo, 3-nitrofenilo, 4-cianofenilo, \alpha-naftilo y \beta-naftilo,

un ariloxilo opcionalmente substituido, tal como feniloxilo, 2-clorofeniloxilo, p-toliloxilo, 3-nitrofeniloxilo, \alpha-naftiloxilo y \beta-naftiloxilo, ó,

un grupo heterocíclico de 3-7 miembros que contiene por lo menos un átomo seleccionado del grupo formado por un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno y un átomo de azufre como heteroátomo, tal como el 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-cloro-3-piridilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-furilo y 3-furilo.

Como ejemplos más específicos para el \alpha-hidroxinitrilo [I] pueden citarse el lactonitrilo, mandelonitrilo, 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo y similares.

El \alpha-hidroxinitrilo [I] se emplea en la reacción a una concentración de 0,1-50% en peso y puede añadirse además durante el proceso de reacción cuando es necesario. El pH de la solución de reacción debe mantenerse en el margen de 5 a 11 empleando o bien tampones apropiados o bien ácido y álcali. La reacción se efectúa de preferencia a una temperatura de 4 a 50ºC, con más preferencia, de 20 a 40ºC.

Como ejemplos de compuestos cianuro empleados en la presente invención y representados por la fórmula general [III], pueden citarse el cianuro de hidrógeno, cianuro de sodio, cianuro de potasio, cianuro de calcio, cianuro de magnesio, cianuro de torio, cianuro de amonio y similares. Los compuestos de cianuro se emplean normalmente en la reacción a una concentración de 0,4 a 1000 mM, de preferencia, de 4 a 500 mM y puede añadirse además durante la reacción cuando sea necesario.

En consecuencia, un \alpha-hidroxiácido [II] correspondiente a un \alpha-hidroxinitrilo [I] el cual se añade durante un tiempo de 6 a 120 horas se acumula como sal de amonio del mismo a una concentración de 15% en peso o más. Las células de microorganismo empleado en la reacción pueden emplearse repetidamente para la reacción de hidrólisis sin una pérdida substancial de actividad enzimática.

El producto obtenido puede aislarse y purificarse de acuerdo con el método empleado habitualmente, como p. ej., la concentración y la extracción, y el producto puede separarse del amonio por medio de una extracción con un disolvente orgánico, descomposición térmica o similar, si es necesario. Como ejemplos para el producto, a saber, el \alpha-hidroxiácido representado por la fórmula [II], pueden citarse el ácido láctico, ácido mandélico, ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, y similares.

Mejor modalidad para efectuar la invención

La presente invención se aclara en detalle, haciendo referencia a los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

Una cantidad de medio de 2 ml conteniendo 0,3% de caldo, 0,5% de peptona y 0,5% de cloruro de sodio, se colocó en un tubo de ensayo, y un segundo medio en una cantidad de 20 ml conteniendo una composición como se menciona más adelante, se colocó en un matraz de 100 ml de forma triangular con deflectores, a continuación se esterilizaron ambos medios durante 15 minutos a 121ºC respectivamente. La cantidad de un asa de la cepa IAM 12374 de Variovorax paradoxus se inoculó en el tubo de ensayo conteniendo 2 ml de medio y la cepa se cultivó agitando continuamente durante toda la noche a 30ºC, a continuación se transfirieron 0,2 ml del medio al matraz en forma de triángulo con deflectores. El medio transferido se cultivó a continuación a 30ºC durante 3 días. El medio cultivado se sometió a continuación a un proceso de centrifugado, y las células del microorganismo obtenidas se lavaron con solución salina. Las células del microorganismo se suspendieron a continuación en solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5) para preparar una solución 0,1% en peso sobre la base del peso en seco. A continuación se añadió el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la solución de tampón de fosfato para preparar una solución 160 mM del mismo como concentración final y la reacción de hidrólisis de la solución tuvo lugar a 30ºC agitando suavemente. Después de la adición, se añadió la misma cantidad de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo durante 9 veces a la solución tampón con intervalos de 12 horas para efectuar la reacción con una duración total de 120 horas. Una vez terminada la reacción, la solución de reacción se sometió a un proceso de centrifugado para eliminar las células de los microorganismos, y se determinó la concentración del ácido 2-hidroxi-4-metiltio-butírico contenido en el sobrenadante, empleando una cromatografía líquida de alta resolución (columna: TSK gel ODS-80TM. Portador: acetonitrilo/agua/ácido trifluoracético = 20/80/0,1). Con ello se confirmó la acumulación de 2-hidroxi-4-metiltiobutirato de amonio a un nivel de 25% en peso. El rendimiento fue del 98%.

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Extracto de levadura	0,5%
Glicerina	0,5%
Fosfato monopotásico	0,1%
Fosfato dipotásico	0,1%
NaCl	0,02
Sulfato de magnesio 7 hidrato	0,02%
\varepsilon-caprolactama	0,5%
pH (ajustado con hidróxido de sodio 2N)	7,2

Ejemplo 2

Una cantidad de medio de 2 ml, conteniendo 0,3% de caldo, 0,5% de peptona y 0,5% de cloruro de sodio, se colocó en un tubo de ensayo, y el segundo medio en una cantidad de 20 ml conteniendo una composición como se menciona más adelante, se colocó en un matraz de 100 ml de forma triangular con deflectores, a continuación se esterilizaron ambos medios durante 15 minutos a 121ºC respectivamente. La cantidad de un asa de la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp., se inoculó en el tubo de ensayo conteniendo 2 ml de medio, y la cepa se cultivó en condiciones de agitación contínua durante toda la noche a 30ºC, a continuación se transfirieron 0,2 ml del medio al matraz de forma triangular con un deflector. El medio transferido se cultivó a continuación a 30ºC en condiciones de agitación contínua durante 5 días. El medio cultivado se sometió a continuación a un proceso de centrifugado, y las células del microorganismo obtenidas se lavaron con solución salina. Las células del microorganismo se suspendieron a continuación en solución tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5) para obtener una solución 0,6% en peso sobre la base del peso en seco. A continuación se añadió el lactonitrilo a la solución tampón de fosfato para obtener con ello una solución tampón 124 mM como concentración final y la solución tampón se sometió luego a la reacción de hidrólisis de la solución la cual tuvo lugar a 30ºC agitando suavemente. Después de la adición, se añadió la misma cantidad de lactonitrilo durante 20 veces a la solución de tampón con intervalos de 5 horas para efectuar la reacción con una duración total de 100 horas. Una vez terminada la reacción, la solución de reacción se sometió a un proceso de centrifugado para eliminar las células de los microorganismos, y se determinó la concentración de ácido láctico contenido en el sobrenadante, empleando una cromatografía líquida de alta resolución (columna: TSK gel ODS-80TM. Portador: acetonitrilo/agua/ácido trifluoracético = 5/95/0,1). Con ello se determinó la acumulación de la sal lactato de amonio encontrándose un nivel del 23% en peso. El rendimiento fue del 93%.

Extracto de germen de maíz
(esterilizado separadamente)	1,0%
Sacarosa (ester. separadamente)	1,0%
Fosfato monopotásico	0,1%
Fosfato dipotásico	0,1%
NaCl	0,02
Sulfato de magnesio. 7 H_{2}O	0,02%
Sulfato ferroso (esteril. separadamente)	0,001%
\varepsilon-caprolactama	0,5%
pH (ajustado con hidróxido de sodio 2N)	7,2

Ejemplo 3

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2, se suspendió la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp. en solución de tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,5) para obtener una solución al 4% en peso del mismo sobre la base del peso seco. A continuación se añadió el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la solución de tampón para obtener un solución 200 mM del mismo como concentración final y la solución de tampón se sometió a la reacción de hidrólisis a 30ºC agitando suavemente. Después de la adición, se añadió repetidamente la misma cantidad de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la solución hidrolizada durante 7 veces con intervalos de 1 hora y posteriormente se añadió 8 veces con un intervalo de 1,5 horas para someter la solución a la reacción durante un total de 19 horas. Una vez terminada la reacción, se centrifugó la solución de reacción para eliminar las células de los microorganismos, y se determinó la concentración de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico contenido en el sobrenadante, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1. Con ello se determinó la acumulación de 2-hidroxi-4-metiltiobutirato de amonio encontrándose un nivel del 49% en peso. El rendimiento fue del 96%.

Ejemplo 4

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2, se suspendió la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp. en agua destilada para obtener una solución al 3,2% en peso del mismo sobre la base del peso seco. A continuación se añadió continuamente el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la suspensión a una velocidad de 0,46 g/hora por 1 g de células de microorganismo sobre la base del peso en seco. A continuación se sometió la suspensión a la reacción de hidrólisis a 30ºC durante 20 horas ajustando el pH con solución acuosa 0,5 M de amonio a un valor de 7,4-7,6. Una vez terminada la reacción, se centrifugó la suspensión de reacción para eliminar las células del microorganismo. Las células del microorganismo se lavaron a continuación 3 veces empleando una cantidad 40 veces mayor en peso de agua destilada, y las células lavadas se suspendieron de nuevo en agua destilada en la misma cantidad empleada para el primer lavado y se emplearon para la segunda reacción. De acuerdo con el mismo procedimiento para el primer lavado se efectuó toda la segunda reacción, la recuperación de las células del microorganismo y el lavado de las células del microorganismo. Después de repetir 10 veces dicho proceso de reacción como se ha descrito más arriba, se determinó la concentración de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico contenido en el sobrenadante para cada repetición, de acuerdo con el método como se ha descrito en el ejemplo 1. Los resultados están mostrados en la siguiente
tabla:

1

Ejemplo 5

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2, se suspendió la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp. en solución acuosa 0,1 M de cianuro de sodio para obtener una solución al 5% en peso del mismo sobre la base del peso en seco. A continuación se añadió continuamente el lactonitrilo a la solución y a continuación se sometió a la reacción de hidrólisis a 30ºC durante 10 horas ajustando el pH empleando un controlador de pH, a un valor de 7,4-7,6. Una vez terminada la reacción, la solución de la reacción se centrifugó para eliminar las células del microorganismo y se determinó la concentración de ácido láctico contenido en el sobrenadante, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2. Otra reacción en la que se omitió la adición de cianuro de sodio fue también comprobada con fines comparativos. Los resultados figuran en la tabla siguiente:

2

Ejemplo 6

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2, se suspendió la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp. en solución acuosa 0,1 M de cianuro de potasio para obtener una solución al 5% en peso del mismo, sobre la base del peso en seco. A continuación se añadió continuamente el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la solución y a continuación se sometió a la reacción de hidrólisis a 30ºC durante 10 horas ajustando entretanto el pH empleando un controlador de pH, a un valor de 7,4-7,6. Una vez terminada la reacción, se centrifugó la solución de reacción para eliminar las células del microorganismo y se determinó la concentración de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico contenido en el sobrenadante, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se efectuó otra reacción en la que se omitió la adición de cianuro de potasio y fue también comprobada con fines comparativos. Los resultados figuran en la tabla siguiente:

3

Ejemplo 7

De acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 2, se suspendió la cepa NSSC 104 de Arthrobacter spp. en solución acuosa 40 mM de cianuro de hidrógeno para obtener una solución al 5% en peso del mismo, sobre la base del peso en seco. A continuación se añadió continuamente el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo a la solución y a continuación se sometió a la reacción de hidrólisis a 30ºC durante 10 horas ajustando entretanto el pH empleando un controlador de pH, a un valor de 7,4-7,6. Una vez terminada la reacción, se centrifugó la solución de reacción para eliminar las células del microorganismo y se determinó la concentración del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico contenido en el sobrenadante, de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se efectuó otra reacción en la que se omitió la adición de cianuro de hidrógeno, y fue también comprobada con fines comparativos. Los resultados figuran en la tabla siguiente:

4

Ejemplo comparativo

El cultivo y la reacción catalítica de la cepa NSSC 104 de Arthrobacter se efectuó de acuerdo con el método de cultivo y el método de hidrólisis descritos en la patente japonesa, abierta, nº Hei 4-40898.

(1) Medio (unidad: peso/volumen)

Glicerina	2%
Extracto de levadura	0,3%
Fosfato monopotásico	0,68%
Fosfato dipotásico	0,71%
Sulfato de sodio	0,28%
Cloruro de magnesio	0,04%
Cloruro de calcio	0,004%
Sulfato de manganeso	0,0004%
Cloruro ferroso	0,00006%
Sulfato de zinc	0,00005%
Agar	1,8%
\alpha-cloropropionitrilo	0,05%
pH	7,5

(2) Condiciones de cultivo

Se extrajo del medio la cantidad de un asa de células del microorganismo y se inoculó a una placa de medio agar, y a continuación se cultivó a 30ºC durante 48 horas en condiciones aeróbicas.

\newpage

(3) Reacción de hidrólisis

Las células del microorganismo se recogieron del medio de la placa de agar y a continuación se lavaron 3 veces con tampón de fosfato 0,05 M (pH 7,5) mediante centrifugación.

Las células precipitadas se resuspendieron en tampón de fosfato 0,05 M en una cantidad de 1,5 ml para ajustar a un valor OD de 630 a 25, se añadieron con 100 mM de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo para su concentración final y a continuación se dejó que se produjera la reacción a 256ºC durante 20 horas en condiciones de agitación. Una vez terminada la reacción, se centrifugó la solución de reacción para eliminar las células del microorganismo, y se determinó la concentración del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico contenido en el sobrenadante, empleando una cromatografía líquida de alta resolución (columna; TSK gel ODS-80TM. Soporte: acetonitrilo/agua/ácido trifluoracético = 20/80/0,1). La concentración del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico fue de 0,01 mM.

En la patente japonesa abierta, nº Hei 4-40898, se describe que la cepa HR4 de Arthrobacter logró la acumulación del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico con un nivel de 5 mM de acuerdo con el método de cultivo y el método de hidrólisis descritos más arriba. Por lo tanto, está claramente indicado que el Arthrobacter cepa NSSC 104 es obviamente diferente a las especies de la cepa HRA de Arthrobacter.

Efecto ventajoso de la invención

De acuerdo con la presente invención, la producción de \alpha-hidroxiácido [II] puede lograrse de una manera eficiente mediante la utilización de una reacción enzimática de microorganismos que pueden ser empleados repetidamente, los cuales tienen tanto una resistencia a la concentración como propiedades de durabilidad frente al \alpha-hidroxinitrilo [I] y/o al \alpha-hidroxiácido [II] y permiten la acumulación del \alpha-hidroxiácido [II] a un nivel de alta concentración. Además, si se añade un compuesto de cianuro al sistema de reacción, la producción del \alpha-hidroxiácido [II] puede lograrse de una manera todavía más eficiente.

Utilización industrial de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un \alpha-hidroxiácido [II] empleando un \alpha-hidroxinitrilo como material de partida en una escala industrial, utilizando una reacción enzimática con microorganismos, los cuales tienen tanto una resistencia a la concentración como unas propiedades de durabilidad respecto al \alpha-hidroxinitrilo [I] y/o al \alpha-hidroxiácido [II], lo cual le confiere una gran importancia en la industria afín.

Claims

1. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH en donde R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido, o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido, caracterizado porque los compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, se producen y acumulan en un disolvente acuoso en presencia de un microorganismo que tiene tanto una resistencia a la concentración como unas propiedades de durabilidad respecto a los compuestos representados por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido más arriba, y/o los compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, en el procedimiento para convertir un compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido más arriba, en los compuestos representados por la fórmula general [II]:RCH(OH)COOH, en donde R es como se ha definido más arriba, utilizando una reacción hidrolítica proporcionada por la actividad enzimática del microorganismo, siendo dicho microorganismo el Variovorax paradoxus o el Arthrobacter cepa NSSC 104, depositada en FERM como BP-5829.

2. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, o un fenilo opcionalmente substituido.

3. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquiltio alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo de 1 a 6 átomos de carbono o fenilo.

4. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, se selecciona del grupo formado por el lactonitrilo, mandelonitrilo y 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

5. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el microorganismo es el Variovorax paradoxus.

6. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el microorganismo es el Arthrobacter cepa NSSC 104, FERM BP-5829.

7. Arthrobacter cepa NSSC 104, FERM BP-5829, el cual pertenece a Arthrobacter spp., caracterizado porque tiene una resistencia a la concentración y unas propiedades de durabilidad respecto a los compuestos representados por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido, o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido y/o compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en la cual R es como se ha definido en la reivindicación 1, y es capaz de convertir un compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN en un compuesto representado por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH.

8. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en la cual R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, un grupo arilo opcionalmente substituido, un grupo ariloxilo opcionalmente substituido, o un grupo heterocíclico opcionalmente substituido, caracterizado porque en el método para la producción de los compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, en la cual R es como se ha definido en la reivindicación 1, basado en la hidrólisis de un compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido más arriba, mediante la utilización de la actividad enzimática de un microorganismo que es el Variovorax paradoxus o el Arthrobacter cepa NSSC 104, FERM BP-5829, la reacción se efectúa en presencia de un compuesto cianuro representado por la fórmula general [III]: M_{m}(CN)_{n}, en la cual M representa un átomo de hidrógeno amonio o un ión metálico, y m y n representan independientemente entre sí, el número entero 1, 2 ó 3.

9. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque R es hidrógeno, un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente substituido, o un fenilo opcionalmente substituido.

10. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque R es hidrógeno, un grupo alquiltioalquilo de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo de 1 a 6 átomos de carbono, o fenilo.

11. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto representado por la fórmula general [I]: RCH(OH)CN, en la cual R es como se ha definido en la reivindicación 1, se selecciona del grupo formado por lactonitrilo, mandelonitrilo y 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

12. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el microorganismo es el Variovorax paradoxus.

13. Un método para la producción de compuestos representados por la fórmula general [II]: RCH(OH)COOH, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el microorganismo es el Arthrobacter cepa NSSC 104, FERM BP-5829.