CN1212018A - 使用了微生物的α－羟基酸的制备方法及新颖的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明是式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中,R表示氢原子、可带有取代基的C1～C6的烷基、可带有取代基的C2～C6的链烯基、可带有取代基的C1～C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基)表示的化合物的制备方法,其特征是,通过微生物的作用使α－羟基腈[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)水解,转变为α－羟基酸[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R与前述相同),较好是在氰化物的存在下,利用对α－羟基腈[Ⅰ]及/或α－羟基酸[Ⅱ]具有深度耐性和耐久性的微生物,使α－羟基酸[Ⅱ]在水性溶剂中生成蓄积,并加以收集。由于本发明通过对α－羟基腈[Ⅰ]及/或α－羟基酸[Ⅱ]具有浓度耐性和耐久性的微生物使α－羟基酸[Ⅱ]以高浓度蓄积,且能够反复使用菌体,所以,能够有效地制备α－羟基酸[Ⅱ]。此外,通过在反应体系中添加氰化物,就可更有效地制备α－羧基酸[Ⅱ]。
Description
技术领域
本发明涉及利用微生物水解α-羟基腈以制备α-羟基酸的方法。α-羟基酸中，乳酸对食品、酿造、工业很有用，2-羟基-4-甲基硫代丁酸作为家畜的饲料添加剂很有用。
背景技术
作为利用微生物由o-羟基腈[Ⅰ]制备α-羟基酸[Ⅱ]的方法，举例如下：
(1)利用芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、小球菌属和短杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸等的方法(日本专利公报昭58-15120号)；
(2)利用属于棒状杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法(日本专利公开公报昭61-56086号)；
(3)利用假单胞菌属、节孢子杆菌属、曲霉属、青霉菌属、旋孢霉属和镰刀菌属的微生物制备乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-羟基苯丙酸和扁桃酸的方法的方法(日本专利公开公报昭63-222696号)；
(4)利用节孢子杆菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、短杆菌属、旋孢霉属、棒状杆菌属、小球菌属、诺卡式菌属、青霉菌属、假单胞菌属、镰刀菌属的微生物制备2-羟基-3,3-二甲基-4-丁内酯的方法(日本专利公开公报昭64-10996号)；
(5)利用红球菌属、假单胞菌属、节孢子杆菌属和短杆菌属的微生物制备2-羟基异丁酸的方法(日本专利公开公报平4-40897号)；
(6)利用乳杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、诺卡式菌属、红球菌属和节孢子杆菌属的微生物制备α-羟基-4-甲基硫代丁酸的方法(日本专利公开公报平4-40898号)；
(7)利用产碱菌属、红球菌属和ゴルドナ(Goldona)属的微生物制备4-甲基硫代丁酸的方法(WO 96/09403号)；
(8)利用パントエア(Pantoea)属、小球菌属、无芽孢杆菌属等的微生物制备4-甲基硫代丁酸的方法(日本专利公开公报平8-173175号)等。
但是，这些制备α-羟基酸的方法不一定能够满足使目的产物以高浓度生成并蓄积的目的，例如，利用属于棒状杆菌属的微生物只能蓄积9.8重量％的乳酸(日本专利公开公报昭61-56086号)；利用属于假单胞菌属的微生物只能蓄积10重量％的乳酸(日本专利公开公报昭63-222696号)；利用属于节孢子杆菌属的微生物只能蓄积0.15重量％的乳酸(日本专利公开公报昭63-222696号)。此外，利用属于假单胞菌属的微生物只能蓄积0.8重量％的α-羟基异丁酸(日本专利公开公报昭63-222696号)；利用属于乳杆菌属的微生物只能蓄积188mM(2.8重量％)的α-羟基-4-甲基硫代丁酸(日本专利公开公报平4-40898号)；利用属于节孢子杆菌属的微生物只能蓄积55mM(0.8重量％)的α-羟基-4-甲基硫代丁酸(日本专利公开公报平4-40898号)；利用属于产碱菌属的微生物只能蓄积940mM(14重量％)的α-羟基-4-甲基硫代丁酸(WO96/09403号)。
造成生成物蓄积浓度较低的原因是α-羟基腈和水溶液中相应的醛或酮被部分解离为氢氰酸[化学综述(Chemical Reviews)第42卷，189页，1948年]，酶活性受到氢氰酸的抑制[农业生物化学(Agricaltural Biological Chemistry)第46卷，1165页，1982年]。而且，由于解离的醛的作用有可能使酶在短时间内失活，为了解决这个问题，提出了添加酸性亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的方法(日本专利公开公报平5-192189号)、添加亚磷酸离子或次磷酸离子的方法(日本专利公开公报平7-213296号)。但是，即使使用了上述添加物，也不能够提高α-羟基酸的生成蓄积浓度。
本领域的技术人员都知道，一般生成物的蓄积浓度较低时，制备该生成物的设备都较复杂，且规模较大。所以，工业上利用上述方法制备α-羟基酸时存在制备效率较低的问题。本发明的目的就是提供利用微生物，使α-羟基酸以高浓度蓄积，有效地制备α-羟基酸的方法。
发明的揭示
本发明者们对由通式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中，R表示氢原子、可带有取代基的C1～C6的烷基、可带有取代基的C2～C6的链烯基、可带有取代基的C1～C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基)表示的α-羟基腈[Ⅰ]生成通式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R如前所述)表示的α-羟基酸[Ⅱ]所用的微生物进行研究时，对不因高浓度的α-羟基腈[Ⅰ]或α-羟基酸[Ⅱ]的影响而活性降低、具有维持长时间活性的耐久性，且具有蓄积高浓度α-羟基酸[Ⅱ]能力的在工业上有效的微生物进行了探索。
其结果是，属于バリオボラクス(Variovorax)属和节孢子杆菌属(Arthrobacer)的微生物显现出所需的活性。此外，还发现如果在该反应体系中添加通式[Ⅲ]:Mm(CN)n(式中，M表示氢原子、铵或金属离子，m、n表示1～3的整数)表示的氰化物，就可改善酶活性，从而完成了本发明。
即，本发明是通过微生物的作用使α-羟基腈[Ⅰ]水解，转变为α-羟基酸[Ⅱ]的α-羟基酸[Ⅱ]的制备方法，其特征是，通过对α-羟基腈[Ⅰ]及/或α-羟基酸[Ⅱ]具有浓度耐性和耐久性的微生物，使α-羟基酸[Ⅱ]在水性溶剂中生成蓄积，并加以收集，采用该方法的同时还在该反应体系中添加氰化物。
以下，对本发明进行详细说明。
本发明所用的微生物只要是能够达到本发明的目的的对α-羟基腈或α-羟基酸具有浓度耐性，且具有维持长时间活性的耐久性的微生物即可，对其没有特别的限定。这些微生物包括バリオボラクスパラドキサス(Variovorax paradoxus)的IAM12374株和节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株(FERMP-15424)。这些微生物中，能够从东京大学分子细胞生物研究所(IAM)很容易地获得バリオボラクスパラドキサス(Variovorax paradoxus)IAM12374。节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104是本发明者们从自然界中新分离出来的，其保藏情况如下：
保藏编号：FERM BP-5829(从微工研菌寄第P-15424移交)
保藏日期：1996年2月6日国内保藏，1997年2月20日国际保藏
保藏单位地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号
保藏单位名称：国立生命科学和人体技术研究所
又，节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104的细菌学性质如下。
形态 多形性杆菌
革兰氏染色性 +
杆状-球状循环 +
芽胞 -
运动性 -
细胞壁的二氨基酸 赖氨酸
对氧的需求 好氧
氧化酶 -
过氧化氢酶 +
DNA的分解 +
明胶的液化 +
淀粉的分解 +
酪蛋白的分解 +
维生素的需求性 -
乙醇酰试验 -(乙酰型)
苯醌系 MK-9(H2)
细胞壁的糖组成
半乳糖 +
葡萄糖 +
以上的细菌学性质是以《贝基氏分类细菌学手册》(Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology(1986))为基础的检索结果，可确认NSSC104株是属于节孢子杆菌(Arthrobacter)属的菌株。该菌株以上述保藏编号被保藏在国立生命科学和人体技术研究所。
以下，对本发明的具体实施状态进行说明。
培养本发明所用的微生物可在包含酶诱导物，能够提供微生物同化的碳源、氮源、无机离子，如有必要还包含有机营养源的普通培养基中进行。作为酶诱导物可使用异丁腈等腈类化合物、ε-己内酰胺等环状酰胺化合物。作为碳源可使用葡萄糖等碳水化合物、乙醇等醇类、有机酸及其他适当的物质。作为氮源可使用氨基酸、硝酸盐、铵盐及其他适当的物质。作为无机离子可使用磷酸离子、钾离子、镁离子、硫酸离子、铁离子，如有必要还可使用其他适当的物质。作为有机营养源可使用维生素、氨基酸等及包含上述物质的玉米浸渍液、酵母提取物、细菌培养基用的胨、牛肉汁及其他适当的物质。培养可在需氧条件下，将pH、温度分别控制在6～9、25～37℃的适当范围内而进行。
通过本发明所用的微生物进行的水解反应是取用以上培养的菌体，如有必要，调制成固定化菌体、粗酶、固定化酶等菌体处理物，在水性溶剂中使其与α-羟基腈[Ⅰ]接触而进行的。固定化菌体或酶时适用的是载体结合法、遮盖法等常用的固定化技术。调制粗酶时适用的是用超声波、高压匀化器等将菌体粉碎后，利用硫铵盐析法、色谱法等常用酶精制技术。所用菌体是换算成干燥重量后浓度为0.01～10重量％的菌体，反应结束后，菌体通过过滤、离心分离或超过滤膜浓缩法被回收，可反复用于水解反应。作为水性溶剂，可使用水、缓冲液等盐类或包含有机溶剂的水溶液，它们可分成二相。
本发明所用的通式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的α-羟基腈[Ⅰ]中的R表示氢原子、可带有取代基的C1-C6的烷基、可带有取代基的C2～C6的链烯基、可带有取代基的C1～C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基。
具体包括氢原子，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等C1～C6的烷基，甲基硫代甲基、1-甲基硫代乙基、2-甲基硫代乙基、1-甲基硫代丙基、2-甲基硫代丙基、3-甲基硫代丙基、1-甲基硫代丁基、2-甲基硫代丁基、3-甲基硫代丁基、4-甲基硫代丁基、6-甲基硫己基、乙基硫代甲基、1-乙基硫代乙基、2-乙基硫代乙基、1-乙基硫代丙基、2-乙基硫代丙基、3-乙基硫代丙基、1-乙基硫代丁基、2-乙基硫代丁基、3-乙基硫代丁基、4-乙基硫代丁基、丙基硫代甲基、1-丙基硫代乙基、2-丙基硫代乙基、1-丙基硫代丙基、2-丙基硫代丙基、3-丙基硫代丙基、1-甲基硫代异丙基、1-乙基异丙基、1-丙基硫代丁基、2-丙基硫代乙基、3-丙基硫代丁基、4-丙基硫代丁基、丙基硫代甲基、1-丙基硫代乙基、2-丙基硫代乙基、1-异丙基硫代丙基、2-异丙基硫代丙基、3-异丙基硫代丙基、1-异丙基硫代丁基、2-异丙基硫代丁基、3-异丙基硫代丁基、4-异丙基硫代丁基等C1～C6烷基硫代C1～C6烷基，羟甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、1-羟丙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-羟丁基、1-羟基异丙基、2-羟丁基、3-羟丁基等羟基C1～C6烷基，羧甲基、2-羧乙基、1-羧乙基、3-羧丙基、2-羧丙基、1-羧丙基等羧基C1～C6烷基，氨基甲酰甲基、1-氨基甲酰乙基、2-氨基甲酰乙基、1-氨基甲酰丙基、2-氨基甲酰丙基、3-氨基甲酰丙基等氨基甲酰C1-C6烷基，巯基甲基、1-巯基乙基、2-巯基乙基、1-巯基丙基、2-巯基丙基、3-巯基丙基等巯基C1-C6烷基，胍基甲基、1-胍基乙基、2-胍基乙基、1-胍基丙基、2-胍基丙基、3-胍基丙基等胍基C1～C6烷基，可带有苄基、2-氯苄基、4-甲基苄基、4-甲氧基苄基、3-硝基苄基、4-羟苄基、α-甲基苄基、α,α-二甲基苄基等取代基的C1-C6芳烷基，可被3-吲哚基甲基、2-吲哚基甲基、2-(3-吲哚基)乙基、1-(3-吲哚基)乙基、2-吲哚基甲基、2-(2-吲哚基)乙基、1-(2-吲哚基)乙基、4-咪唑基甲基、2-咪唑基甲基、1-(4-咪唑基)乙基、2-(4-咪唑基)乙基等杂环基取代的C1～C6烷基，可带有乙烯基、丙烯基、异丙烯基、烯丙基、1-氯烯丙基、2-氯烯丙基、丁烯基等取代基的C2～C6链烯基，可带有甲氧基、乙氧基、丙氧基、三氟甲氧基等取代基的C1～C6烷氧基，可带有苯基、2-氯苯基、对甲苯基、3-硝基苯基、4-氰基苯基、α-萘基、β-萘基等取代基的芳基，可带有苯氧基、2-氯苯氧基、对甲苯氧基、3-硝基苯氧基、α-萘氧基、β-萘氧基等取代基的芳氧基，2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-氯-3-吡啶基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-呋喃基、3-呋喃基等包含至少一种选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子的3～7元杂环基。
更具体的α-羟基腈[Ⅰ]包括乳腈、苯乙醇腈、2-羟基-4-甲基硫代丁腈等。
上述α-羟基腈[Ⅰ]以0.1～50重量％的浓度进行反应，如有必要，可在反应过程中逐渐添加。利用适当的缓冲剂或酸和碱可将反应液的pH值保持在5～11之间。反应温度一般为4～50℃，较好的是保持在20～40℃。
本发明所用的通式[Ⅲ]表示的氰基化合物包括氢氰酸、氰化钠、氰化钾、氰化钙、氰化镁、氰化铊、氰化铵等。氰化物的浓度一般为0.4～1000mM，较好是在4～500mM的范围内，如有必要，可在反应过程中逐渐添加。
这样，在6小时～120小时添加的对应于α-羟基腈[Ⅰ]的α-羟基酸[Ⅱ]作为铵盐就以15重量％以上的高浓度蓄积。反应所用菌体的活性实质上没有降低，能够反复用于水解反应。
生成物能够通过浓缩、萃取等常用方法分离精制，如有必要，可通过酸性条件下的有机溶剂萃取、热分解等方法与氨分离，作为生成物的α-羟基酸[Ⅱ]包括乳酸、扁桃酸、2-羟基-4-甲基硫代丁酸等。
实施发明的最佳状态
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。
实施例1
将2ml包含0.3％肉汁、0.5％胨和0.5％食盐的培养基装入试管中，再将以下组成的20ml培养基装入容量为100ml的附有挡板的三角烧瓶中，分别在121℃灭菌15分钟。用接种环在2ml的试管中植入バリオボラクスパラドキサス(Variovorax paradoxus)的IAM12374株，于30℃振荡1晚培养后，取0.2ml植入到附有挡板的三角烧瓶中，于30℃振荡培养3天。离心分离该培养液，用生理盐水洗净所得菌体，换算成干燥重量，将1.0重量％的菌体悬浮在0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)中。然后，在其中添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，使其最终浓度变为160mM，于30℃缓慢地振荡，进行水解反应。添加结束后每12小时添加等量的2-羟基-4-甲基硫代丁腈，重复9次，反应总计进行120小时。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，用高速液相色谱法(柱子：TSKgel ODS-80TM，载体：乙腈/水/三氟乙酸=20/80/0.1)对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸的浓度进行定量的结果是，蓄积了25重量％的2-羟基-4甲基硫代丁酸铵盐。(收率为98％)。
酵母提取物 0.5％
甘油 0.5％
磷酸二氢钾 0.1％
磷酸氢二钾 0.1％
食盐 0.02％
硫酸镁七水合物 0.02％
ε-己内酰胺 0.5％
pH 7.2(用2N的氢氧化钠调整)
实施例2
将2ml包含0.3％肉汁、0.5％胨和0.5％食盐的培养基装入试管中，再将以下组成的20ml培养基装人容量为100ml的附有挡板的三角烧瓶中，分别在121℃灭菌15分钟。用接种环在2ml的试管中植入节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株，于30℃振荡1晚培养后，取0.2ml植入到附有挡板的三角烧瓶中，于30℃振荡培养5天。离心分离该培养液，用生理盐水洗净所得菌体，换算成干燥重量，将0.6重量％的菌体悬浮在0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)中。然后，在其中添加乳腈，使其最终浓度变为124mM，于30℃缓慢地振荡，进行水解反应。添加结束后每5小时添加等量的乳腈，重复20次，反应总计进行100小时。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，用高速液相色谱法(柱子：TSKgel ODS-80TM，载体：乙腈/水/三氟乙酸=5/95/0.1)对包含在离心后的上清液中的乳酸的浓度进行定量的结果是，蓄积了23重量％的乳酸铵盐。(收率为93％)。
玉米浸渍液 1.0％(另外灭菌)
蔗糖 1.0％(另外灭菌)
磷酸二氢钾 0.1％
磷酸氢二钾 0.1％
食盐 0.02％
硫酸镁七水合物 0.02％
硫酸亚铁 0.001％(另外灭菌)
ε-己内酰胺 0.5％
pH 7.2(用2N的氢氧化钠调整)
实施例3
与实施例2同样操作，将获得的节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株菌体换算成干燥重量，将4重量％的该菌体悬浮在0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)中。然后，在其中添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，使其最终浓度变为200mM，于30℃缓慢地振荡，进行水解反应。添加结束后每1小时添加等量的2-羟基-4-甲基硫代丁腈，重复7次，，然后每1.5小时添加1次，重复8次，反应总计进行19小时。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，与实施例1同样，用高速液相色谱法对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸的浓度进行定量的结果是，蓄积了49％2-羟基-4-甲基硫代丁酸铵盐(收率为96％)。
实施例4
与实施例2同样操作，将获得的节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株菌体换算成干燥重量，将3.2重量％的该菌体悬浮在蒸馏水中。然后，以相当于1g菌体干燥重量的0.46g/hr的添加速度连续添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，边用0.5M的氨水将pH值调整到7.4～7.6，边于30℃进行20小时的水解反应。反应结束后，离心分离该反应液，回收菌体。用40倍重量的蒸馏水洗涤回收的菌体3次后，再悬浮在与第1次等量的蒸馏水中，用于第2次反应。第2次反应、菌体回收和菌体洗涤都与第1次相同。反复进行10次这样的反应，与实施例1同样。对包含在每次离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸的浓度进行定量，其结果如下所示。
| 重复反应(第几次) | 2-羟基-4-甲基硫代丁酸铵盐的蓄积浓度(重量％) | 收率(％) |
| 1 | 36.1 | 96 |
| 3 | 36.3 | 97 |
| 5 | 36.4 | 97 |
| 7 | 36.4 | 97 |
| 10 | 36.0 | 96 |
实施例5
与实施例2同样操作，将获得的节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株菌体换算成干燥重量，将5重量％的该菌体悬浮在0.1M氰化钠水溶液中。然后，连续添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，用pH值控制器将pH值调整到7.4～7.6，于30℃进行10小时的水解反应。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，与实施例2同样，对包含在离心后的上清液中的乳酸浓度进行定量。作为比较，在不添加氰化钠的情况下同样操作。其结果如下。
| 乳酸铵盐的生成量(重量％) | |
| 不添加0.1M NaCN | 20.540.0 |
实施例6
与实施例2同样操作，将获得的节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株菌体换算成干燥重量，将5重量％的该菌体悬浮在0.1M氰化钾水溶液中。然后，连续添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，用pH值控制器将pH值调整到7.4～7.6，于30℃进行10小时的水解反应。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，与实施例1同样，对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸浓度进行定量。作为比较，在不添加氰化钾的情况下同样操作。其结果如下。
| 2-羟基-4-甲基硫代丁酸铵盐的生成量(重量％) | |
| 不添加0.1M KCN | 26.641.7 |
实施例7
与实施例2同样操作，将获得的节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株菌体换算成干燥重量，将5重量％的该菌体悬浮在40mM氰化氢水溶液中。然后，连续添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，用pH值控制器将pH值调整到7.4～7.6，于30℃进行10小时的水解反应。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，与实施例1同样，对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸浓度进行定量。作为比较，在不添加氰化氢的情况下同样操作。其结果如下。
| 2-羟基-4-甲基硫代丁酸铵盐的生成量(重量％) | |
| 不添加40mM HCN | 27.244.5 |
参考例
利用日本专利公开公报平4-40898号记载的培养方法和水解方法进行节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株的培养及其催化剂反应。
(1)培养基(单位：W/V)
甘油 2.0％
酵母提取物 0.3％
磷酸二氢钾 0.68％
磷酸氢二钠 0.71％
硫酸钠 0.28％
氯化镁 0.04％
氯化钙 0.004％
硫酸锰 4×10-4％
氯化铁 6×10-5％
硫酸亚铁 3×10-5％
琼脂 1.8％
α-氯丙腈 0.05％
pH 7.5
(2)培养条件
从斜面培养基中取1接种环的菌体，将其涂布在经过蒸汽灭菌的琼脂平面培养基中，在30℃的需氧条件下培养48小时。
(3)水解反应
从琼脂平面培养基取出菌体，通过离心分离用0.05M磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤菌体3次。将沉淀菌体再次悬浮在OD630为25的1.5ml同样的缓冲液中，在其中添加2-羟基-4-甲基硫代丁腈，使其最终浓度变为100mM，于25℃振荡20小时，进行反应。反应结束后，离心分离反应液，除去菌体，用高速液相色谱法(柱子：TSKgel ODS-80TM，载体：乙腈/水/三氟乙酸=20/80/0.1)对包含在离心后的上清液中的2-羟基-4-甲基硫代丁酸的浓度进行定量，2-羟基-4-甲基硫代丁酸的浓度为0.01mM。
日本专利公开公报平4-40898号记载了节孢子杆菌(Arthrobacter)的HR4株中通过上述培养方法和水解反应蓄积了55mM的2-羟基-4-甲基硫代丁酸。因此，节孢子杆菌(Arthrobacter)的NSSC104株与节孢子杆菌(Arthrobacter)的HR4株是截然不同的菌株。
发明的效果
本发明通过使用对α-羟基腈[Ⅰ]及/或α-羟基酸[Ⅱ]具有浓度耐性和活性耐性等长时间耐久性的微生物，使α-羟基酸[Ⅱ]高浓度蓄积，且可使菌体重复使用，所以能够有效地制备α-羟基酸[Ⅱ]。此外，通过在反应体系中添加氰化物，能够更有效地制备α-羟基酸[Ⅱ]。
产业上利用的可能性
如上所述，本发明是通过使用对α-羟基腈[Ⅰ]及/或α-羟基酸[Ⅱ]具有浓度耐性和活性耐性等长时间耐久性的微生物，在工业上由α-羟基腈[Ⅰ]有效制备α-羟基酸[Ⅱ]的方法。所以，在产业上具有很大意义。
Claims (15)
1．式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中，R表示氢原子、可带有取代基的C1～C6的烷基、可带有取代基的C2～C6的链烯基、可带有取代基的C1～C6的烷氧基、可带有取代基的芳基、可带有取代基的芳氧基或可带有取代基的杂环基)表示的化合物的制备方法，其特征在于，通过微生物的作用使式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)表示的化合物水解，转变为式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R与前述相同)表示的化合物，其中，利用对式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)表示的化合物及/或式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R与前述相同)表示的化合物具有浓度耐性和耐久性的微生物，使式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R与前述相同)表示的化合物在水性溶剂中生成蓄积，并加以收集。
2．如权利要求1所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，R表示氢原子、可带有取代基的C1～C6的烷基或可带有取代基的苯基。
3．如权利要求1或2所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，R表示氢原子、C1～C6的烷基硫代烷基、C1～C6的羟烷基或苯基。
4．如权利要求1所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的化合物为选自乳腈、苯乙醇腈或2-羟基-4-甲基硫代丁腈中的一种。
5．如权利要求1～4的任一项所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，对式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的化合物及/或式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物具有浓度耐性和耐久性的微生物属于バリオボラクス(Variovorax)属。
6．如权利要求1～4的任一项所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，对式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的化合物及/或式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物具有浓度耐性和耐久性的微生物属于节孢子杆菌(Arthrobacter)属。
7．如权利要求1～4或6的任一项所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，对式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的化合物及/或式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物具有浓度耐性和耐久性的微生物为节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104株。
8．NSSC104株，其特征在于，属于节孢子杆菌(Arthrobacter)属，对式[Ⅰ]:RCH(OH)CN表示的化合物及/或式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物具有浓度耐性和耐久性，具有将式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)表示的化合物转变为式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的能力。
9．式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征在于，通过微生物的作用水解式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)表示的化合物以制备式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH(式中的R与前述相同)表示的化合物时，该反应体系中存在通式[Ⅲ]:Mm(CN)n(式中，M表示氢原子、铵或金属离子，m、n表示1～3的整数)表示的氰化物。
10．如权利要求9所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，R表示氢原子、可带有取代基的C1～C6的烷基或可带有取代基的苯基。
11．如权利要求9或10所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，R表示氢原子、C1～C6的烷基硫代烷基、C1-C6的羟烷基或苯基。
12．如权利要求9所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，式[Ⅰ]:RCH(OH)CN(式中的R与前述相同)表示的化合物为选自乳腈、苯乙醇腈或2-羟基-4-甲基硫代丁腈中的一种。
13．如权利要求9所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，微生物属于バリオボラクス(Variovorax)属。
14．如权利要求9所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，微生物属于节孢子杆菌(Arthrobacter)属。
15．如权利要求9所述的式[Ⅱ]:RCH(OH)COOH表示的化合物的制备方法，其特征还在于，微生物为节孢子杆菌(Arthrobacter)NSSC104株。
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