JPH1042886A

JPH1042886A - 微生物によるβ−アラニンの製造法

Info

Publication number: JPH1042886A
Application number: JP8200397A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Oikawa; 利洋及川; Yasuko Matsuba; 松葉　　泰子; Akio Sakaguchi; 昭夫坂口; Nobuhiro Fukuhara; 信裕福原
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 1998-02-17

Abstract

(57)【要約】【課題】 β−アラニンを製造する際の触媒として有用
なニトリル加水分解活性を有する微生物を見いだす。【解決手段】微生物がアルカリゲネス・ｓｐ（Ａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）ＯＭＴ−ＭＹ１４（生命
研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５６９４）またはアミノバ
クター・アミノボランス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒａ
ｍｉｎｏｂｒａｎｃｅ）ＡＴＣＣ２３３１４に属し、３
−アミノプロピオニトリルを加水分解する活性を有する
微生物の培養液、菌体、菌体処理物及び菌体抽出物等
を、３−アミノプロピオニトリルに作用させるβ−アラ
ニンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の作用によ
り３−アミノプロピオニトリルを加水分解しβ−アラニ
ンを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、β−アラニンの製造法としてはア
クリロニトリルにアンモニアを作用させ３−アミノプロ
ピオニトリルを合成した後、苛性ソーダ等のアルカリを
用いて加水分解しβ−アラニンを得る方法がある。この
ような化学合成法による製造法は、多量の塩を副生し、
その除去のためプロセスが煩雑になる。また、３−アミ
ノプロピオニトリルを合成する際に副生するイミノジプ
ロピオニトリルや未反応のアクリロニトリルをも加水分
解するため、それら不純物の除去のためさらにプロセス
が煩雑になるなどの問題点がある。

【０００３】一方、ニトリル化合物を加水分解する活性
を有する微生物を用いて、３−アミノプロピオニトリル
を加水分解し、β−アラニンを合成する方法が知られて
いる（特公昭５８−１５１２０号公報、特公昭６３−３
５９９号公報、特公平３−６２３９１号公報）。しかし
ながらいずれの方法も十分な活性を有しているとはいい
がたく、またアクリロニトリルをはじめとしてさまざま
なニトリル化合物に作用することが知られており、基質
特異性の点においても問題点があり、工業的に満足のい
くものではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、パン
トテン酸原料、医農薬原料、緩衝剤として有用なβ−ア
ラニンを製造する際の触媒として有用なニトリル加水分
解活性を有する微生物を見いだすことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】このような状況のもと
で、本発明者らは、３−アミノプロピオニトリルにたい
し特異的に作用し高い活性を有するニトリル加水分解酵
素を自然界に求め、土壌、活性汚泥等より鋭意探索を行
ったところアルカリゲネス属に属する細菌及びアミノバ
クター属に属する細菌に、高い３−アミノプロピオニト
リル加水分解活性を有しかつ特異的に作用するニトリル
加水分解酵素を見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明の第一はアルカリゲネス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属またはアミノバクター（Ａｍ
ｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、３−アミノプロピオニ
トリルを特異的に加水分解する活性を有する微生物の培
養液、菌体、菌体処理物及び菌体抽出物等を、３−アミ
ノプロピオニトリルに作用させることを特徴とするβ−
アラニンの製造法であり、第二の発明はアルカリゲネス
属に属する微生物がアルカリゲネス・ｓｐ（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓｓｐ．）ＯＭＴ−ＭＹ１４（生命研寄託
番号ＦＥＲＭＰ−１５６９４）である前記のβ−アラ
ニンの製造法であり、第三の発明はアミノバクター属に
属する微生物がアミノバクター・アミノボランス（Ａｍ
ｉｎｏｂａｃｔｅｒａｍｉｎｏｂｒａｎｃｅ）ＡＴＣ
Ｃ２３３１４である前記のβ−アラニンの製造法であ
る。

【０００７】本発明に用いられる微生物の具体例として
は、アルカリゲネス・ｓｐ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｓｐ．）ＯＭＴ−ＭＹ１４（生命研寄託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１５６９４）、アミノバクター・アミノボランス
（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒａｍｉｎｏｂｏｒａｎｃ
ｅ）ＡＴＣＣ２３３１４を挙げることができる。

【０００８】アミノバクター・アミノボランス（Ａｍｉ
ｎｏｂａｃｔｅｒａｍｉｎｏｂｏｒａｎｃｅ）ＡＴＣ
Ｃ２３３１４に関しては、アメリカン・タイプカルチャ
ー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手できる。

【０００９】以下にアルカリゲネス・ｓｐ（Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓｓｐ．）ＯＭＴ−ＭＹ１４（生命研寄託
番号ＦＥＲＭＰ−１５６９４）の菌学的性質を示す。

【００１０】ＯＭＴ−ＭＹ１４（微工研寄託番号ＦＥＲ
ＭＰ−１５６９４）（ａ）形態（１）小桿状０．６〜０．８μ×１．２〜２．０
μ （２）多形性なし（３）運動性あり（４）胞子なし（５）グラム染色陰性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養において、コロニーは円形、光
沢あり、半透明、淡黄白色（ｃ）生理学性質（１）ＯＦテストアルカリ化（２）オキシダーゼテスト＋（３）カタラーゼテスト＋（４）硝酸塩還元 − （５）インドール生産 − （６）ブドウ糖発酵性 − （７）アルギニンジヒドロラーゼ活性（嫌気下） − （８）ウレアーゼ活性（嫌気下） − （９）エスクリン加水分解性 − （１０）ゼラチン加水分解性 − （１１）β−ガラクトシダーゼ活性 − （１２）ブドウ糖資化 − （１３）アラビノース資化 − （１４）マンノース資化 − （１５）マンニット資化 − （１６）Ｎ−アセチルグルコサミン資化 − （１７）麦芽糖資化 − （１８）グルコン酸塩資化＋（１９）カプリン酸塩資化＋（２０）アジピン酸塩資化＋（２１）リンゴ酸塩資化＋（２２）クエン酸塩資化＋（２３）酢酸フェニルエステル資化＋

【００１１】以上の菌学的性質をバージーの細菌分類書
［Ｂｅｒｇｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８
４）］に基づいて分類すると、ＯＭＴ−ＭＹ１４はアル
カリゲネス属に属する細菌であると決定した。

【００１２】本発明において用いられる微生物を培養す
る培地は、目的を達する限り何ら特別の制限はなく、使
用菌株の利用し得る炭素源、窒素源、無機塩類、更に微
量の有機栄養物などを適当に含有するものであれば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。また、培養に当
たっては３−アミノプロピオニトリルを少量培地に添加
することにより、３−アミノプロピオニトリル加水分解
活性が高い微生物菌体を得ることができる。

【００１３】培養条件としては、培地によっても異なる
が、培養温度は２０〜４０℃、培地のｐＨは、５〜１０
が望ましい。培養日数は通常１〜７日程度である。

【００１４】本発明においては、このようにして得られ
た培養液、遠心分離、濾過等により集菌した菌体または
菌体処理物を酵素源として用いる。菌体処理物として
は、菌体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾
燥処理、溶媒処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消
化、界面活性剤処理、酸素処理したもの、これらより得
られる酵素画分、菌体および菌体抽出物の固定化物など
がある。

【００１５】反応は通常０〜８０℃、好ましくは０〜６
０℃、より好ましくは０〜５０℃、ｐＨ４〜１１、好ま
しくは６〜１０、より好ましくは７〜１０の範囲で、静
置またはゆるやかな撹拌下に酵素源とニトリルを水性媒
体中で接触させることにより行われる。３−アミノプロ
ピオニトリルはアミノ基を置換基に持つ塩基性ニトリル
化合物であることから反応液を適当な酸で中和する必要
があるが、ｐＨ調整の酸としては炭酸が好ましい。

【００１６】反応時間は、酵素力価や基質であるニトリ
ルの種類や濃度等の反応条件により異なるが、通常は１
〜５０時間程度である。基質であるニトリルの濃度には
特に制限はないが、通常は０．１〜３０重量％程度であ
る。また、３−アミノプロピオニトリルは連続的または
間欠的に反応液に添加しても良い。その場合その添加に
伴い変化するｐＨは炭酸で中和するのが好ましい。

【００１７】このようにして反応を行うと反応液中に
は、β−アラニン及びアンモニアが生成する。生成した
アンモニアは炭酸と揮発性の塩を形成することになる。
この塩は濃縮晶析等公知の方法でβ−アラニンを採取す
る際に容易に分離することができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。β−アラニンの定量は、ｏ−フタル酸アルデヒドを
用いたポストラベル法を用い、ＰＥＧＡＳＩＬＯＤＳ
カラム（センシュー科学製）、蛍光検出器を備えた液体
クロマトグラフィにより行った。。アクリル酸、酢酸の
定量は、ＴＳＫ−ＧＥＬＳＣＸカラム（東ソー製）、
ＵＶ検出器を備えた液体クロマトグラフィーにより行っ
た。イミノジプロピオン酸の定量は、フェニルイソチオ
シアネートを用いたプレカラム法を用い、ＹＭＣＯＤ
Ｓカラム（ＹＭＣ製）、ＵＶ検出器を備えた液体クロマ
トグラフィーにより行った。

【００１９】実施例１酢酸ナトリウム０．２％、酵母エキス０．１％、リン酸
１カリウム０．１％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸
マグネシウム０．０５％、塩化ナトリウム０．１％、３
−アミノプロピオニトリル０．２％を含み、ｐＨを７．
５とした殺菌培地１００ｍｌに予め同培地にて培養した
アルカリゲネス・ｓｐＯＭＴ−ＭＹ１４の培養液を２％
接種し、２８℃で４８時間培養した。培養終了後、遠心
分離により菌体を集菌し、２０ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄後再度遠心分離
で菌体を得た。この菌体を同緩衝液に懸濁し適宜反応に
供した。反応は上記菌体懸濁液０．５重量％、３−アミ
ノプロピオニトリルまたはアクリロニトリルまたはアセ
トニトリルまたはイミノジプロピオニトリル１．０重量
％、炭酸アンモニウムを１．０重量％、０．２ＭＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２５重量％を含みイオン交換
水で１００％とした反応液を調整し３０℃で１時間反応
を行った。反応終了後１Ｎ塩酸で反応を停止し、除菌希
釈後液体クロマトグラフィーでβ−アラニン、アクリル
酸、酢酸及びイミノジプロピオン酸の生成量を分析し
た。反応結果は表１に示した。

【表１】

【００２０】実施例２グルコース０．２％、酵母エキス０．１％、リン酸１カ
リウム０．１％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム０．０５％、塩化ナトリウム０．１％、３−ア
ミノプロピオニトリル０．２％を含み、ｐＨを７．５と
した殺菌培地１００ｍｌに予め同培地にて培養したアミ
ノバクター・アミノボランスＡＴＣＣ２３３１４の培養
液を２％接種し、２８℃で４８時間培養した。培養終了
後、遠心分離により菌体を集菌し、２０ｍｌの５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で菌体を洗浄後再度
遠心分離で菌体を得た。この菌体を同緩衝液に懸濁し適
宜反応に供した。反応は上記菌体懸濁液０．５重量％、
３−アミノプロピオニトリルまたはアクリロニトリルま
たはアセトニトリルまたはイミノジプロピオニトリル
１．０重量％、炭酸アンモニウムを１．０重量％、０．
２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２５重量％を含み
イオン交換水で１００％とした反応液を調整し３０℃で
１時間反応を行った。反応終了後１Ｎ塩酸で反応を停止
し、除菌希釈後液体クロマトグラフィーでβ−アラニ
ン、アクリル酸の生成量を分析した。反応結果は表２に
示した。

【表２】

【００２１】

【発明の効果】本発明は、３−アミノプロピオニトリル
に特異的に働き、アセトニトリル等の脂肪族ニトリル、
アクリロニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、ベンゾニ
トリル等の芳香族ニトリルに作用せず、３−アミノプロ
ピオニトリルの縮合物であるイミノジプロピオニトリル
に作用しイミノジプロピオン酸を生成しない、３−アミ
ノプロピオニトリルを特異的に加水分解する活性を有す
る微生物を用いることを特徴とし、本発明によれば３−
アミノプロピオニトリルからβ−アラニンを生成せしめ
るに際し、活性及び生成物の蓄積濃度が高い上に、原料
３−アミノプロピオニトリルに含有する他のニトリル化
合物を加水分解することのない工業的に満足されるβ−
アラニンの製造法が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者福原信裕福岡県大牟田市浅牟田町30番地三井東圧化学株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属またはアミノバクター（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅ
ｒ）属に属し、３−アミノプロピオニトリルを加水分解
する活性を有する微生物の培養液、菌体、菌体処理物及
び菌体抽出物等を、３−アミノプロピオニトリルに作用
させることを特徴とするβ−アラニンの製造法。
【請求項２】アルカリゲネス属に属する微生物がアル
カリゲネス・ｓｐ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓｐ．）
ＯＭＴ−ＭＹ１４（生命研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１５６
９４）であるところの請求項１記載のβ−アラニンの製
造法。
【請求項３】アミノバクター属に属する微生物がアミ
ノバクター・アミノボランス（Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ
ａｍｉｎｏｂｒａｎｃｅ）ＡＴＣＣ２３３１４である
ところの請求項１記載のβ−アラニンの製造法。