JP2899071B2 - Ｌ―α―アラニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＬ−α−アラニンの製造法に関する。

Ｌ−α−アラニンは、医薬品、食品添加物および各種
工業薬品の合成中間体として重要な化合物である。

従来の技術 Ｌ−α−アミノ酸は、一般に直接発酵法または有機化
学合成法により製造されたDL−α−アミノ酸を光学分割
を行うことにより得られている。

DL−α−アミノ酸の光学分割を行う方法としては、例
えばDL−α−アミノ酸のＮ−アシル誘導体に微生物の生
産するアシラーゼを作用させる方法（特公昭41−22380
号公報）およびDL−α−アミノ酸のヒダントイン誘導体
に微生物の生産するヒダントイナーゼを作用させる方法
（特公昭54−2274号公報）などが知られている。

また、DL−アミノ酸アミドに、微生物が生産するＬ−
アミダーゼを作用させ、対応するＬ−アミノ酸を得る方
法として、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコッ
カス属およびブレビバクテリウム属に属する微生物が生
産するＬ−アミダーゼを用いる方法（公表昭56−500319
号公報）、種々の酵母、細菌類が生産するＬ−アミダー
ゼを用いる方法（特開昭57−13000号公報、特開昭59−1
59789号公報、特開昭60−36446号公報）、エンテロバク
ター・クロアッセイＮ−7901またはシュードモナスsp.N
−7131またはＮ−2211の微生物が生産するＬ−アミダー
ゼを用いる方法（特開昭62−55097号公報）、ミコプラ
ナ属またはプロタミノバクター属に属する細菌が生産す
るＬ−アミダーゼを用いる方法（特開平１−277499号公
報）などが知られている。

ラフネラ属に属する微生物が有する、Ｌ−α−アラニ
ンアミドを不斉加水分解する能力を利用してＬ−α−ア
ラニンアミドからＬ−α−アラニンを製造する方法は知
られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、微生物が生産するＬ−α−アラニンアミド
を不斉加水分解する作用を利用することにより、Ｌ−α
−アラニンアミドから光学純度の高いＬ−α−アラニン
を工業的により効率よく安価に製造する方法を提供する
ことを目的としている。

課題を解決するための手段 本発明はラフネラ属に属し、Ｌ−α−アラニンアミド
を不斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌体
またはそれらの処理物の存在下、DL−α−アラニンアミ
ドまたはＬ−α−アラニンアミドを含有する水性媒体中
で光学選択的に加水分解を行わせ水性媒体中にＬ−α−
アラニンを生成させ、該水性媒体よりＬ−α−アラニン
を採取することを特徴とするＬ−α−アラニンの製造法
を提供する。

本発明で用いる微生物としては、ラフネラ属に属し、
DL−α−アラニンアミドまたはＬ−α−アラニンアミド
を不斉加水分解してＬ−α−アラミンを生成する能力を
有する微生物であればいずれでもよいが、例えばラフネ
ラ・エスピー（Rahnella sp.）Ｈ−7246があげられる。

上記微生物の菌学的性質を以下に述べる。

（ａ） 形態 細胞の形および大きさ；桿状、直径0.7−1.0μｍ、
長さ2.0−4.0μｍ 細胞の多形性；な し 運動性;25℃では側鞭毛で運動性があるが、36℃で
は運動性がない。

胞 子；形成しない。

グラム染色性；陰 性 抗酸性；ほとんど認められない。

（ｂ） 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養；アイボリー色のなめらかな集落
を形成する。拡散性色素は生成しない。

肉汁寒天斜面培養；十分に生育し、アイボリー色の
滑らかな集落を形成する。

肉汁液体培養；混濁状に生育し、表面には生育しな
い。

肉汁ゼラチン穿刺培養；液化しない。

リトマス・ミルク；弱酸性。１日目で凝固はみられ
ない。

（ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の還元；陽 性 脱窒反応；ガスは生成せず、生育する。

MRテスト；陰 性 VPテスト；陽 性 インドールの生成；陽 性 硫化水素の生成；陰 性 デンプンの加水分解；陰 性 クエン酸の利用（シモンズの培地）；陽性 無機窒素源の利用；硝酸塩（陽性） アンモニウム
塩（陽性） 色素の生成；水溶性色素を生成しない ウレアーゼ；陰 性 オキシダーゼ；陰 性 カタラーゼ；陽 性 生育の範囲 （１）pH;pH4.0−9.0（最適pH:7.0） （２）温度;15−42℃（最適温度:30℃） 酸素に対する態度；好気性ないし通性嫌気性 Ｏ−Ｆテスト；発 酵 糖類から酸、ガスの生成； 塩化ナトリウム耐性；要求性はない。1600mMで生育
阻害を受ける。

DNAの分解；陰 性 アルギニンの分解；陰 性 リジンの脱炭酸反応；陰 性 オルニチンの脱炭酸反応；陰 性 イエローピグメント；陰 性 （ｄ） 化学的組成 mol％Ｇ＋Ｃ（HPLC）;53.0 以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイズ
・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジ
ー（Bergey's Manual of Systematic bacteriology）vo
l.1（1986年）の記載と照合すると、本菌株はグラム陰
性桿菌で、運動性があり、好気性ないし通性嫌気性であ
り、グルコースから著しく酸およびガスを生成し、オキ
シダーゼに陰性で、鞭毛の着性は側鞭毛であり、ナトリ
ウムイオンの要求性がないことから、本菌株はEnteroba
cteriaceae科に属する細菌に分類される。さらにVP反応
に陽性を示し、クエン酸を利用し、硫化水素の生成、ウ
レアーゼ、DNAの分解、アルギニンの分解、リジンの脱
炭酸反応およびオルニチンの脱炭酸反応に陰性で、DNA
のmol％Ｇ＋Ｃが53.0であることに基づいて検索した結
果、本菌株をラフネラ（Rahnella）属に属する細菌と同
定し、ラフネラ・エスピー（Rahnella sp.）Ｈ−7246と
命名した。

本菌株は平成２年４月16日付で工業技術院微生物工業
技術研究所にFERM BP−2871として寄託されている。

本発明の微生物を培養する培地は、用いる微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、DL−
α−アラニンアミドまたはＬ−α−アラニンアミドから
Ｌ−α−アラニンを生成する能力を有する微生物の培養
を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地
のいずれでも良い。

炭酸源としては、グルコース、フラクトース、シュー
クロース、糖蜜、廃糖蜜、デンプン加水分解物などの炭
水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、およびエタ
ノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられ
る。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、各種硝
酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水
分解物、各種発酵菌体およびその消化物などの窒素含有
有機物など種々のものが用いられる。

無機物としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅お
よび炭酸カルシウムなどが用いられる。

培養は、振盪培養または深部通気撹拌培養などの好気
的条件下で行う。培養温度は15〜45℃、培養時間は通常
12〜72時間である。培養中pHは5.0〜9.0に保持する。pH
の調整は塩酸、硫酸などの無機あるいは酢酸などの有機
の酸、炭酸カルシウムなどの塩、アンモニアなどのアル
カリ溶液を用いて行う。

培養の際、高い酵素活性を誘導させるために、Ｌ−α
−アラニンアミド、Ｄ−α−アラニンアミドあるいはDL
−α−アラニンアミドを培地に添加することは効果的で
あり、その添加量は培地に対して0.01〜2.0％程度が好
ましい。

このようにして培養した培養物、菌体またはそれらの
処理物が本発明のDL−α−アラニンアミドの不斉加水分
解反応に用いられる。

培養物、菌体の処理物としては、乾燥物、界面活性剤
処理物、酵素処理物、超音波処理物、溶媒処理物、固定
化物などがあげられる。

水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、
ホウ酸塩、クエン酸塩およびトリス塩酸などの緩衝液、
メタノール、エタノールおよびプロパノールなどのアル
コール類などがあげられる。

反応は通常10〜70℃でpH5.0〜11.0で１〜72時間行
う。反応液中の培養物、菌体またはそれらの処理物の濃
度は、用いるDL−α−アラニンアミドの量および反応時
間により適宜決定すれば良いが、通常乾燥菌体として反
応液当たり0.01〜10％（重量）である。反応に用いるDL
−α−アラニンアミドおよびＬ−α−アラニンアミド
は、遊離型、塩酸塩、硫酸塩のいずれでも良く、濃度
は、DL−α−アラニンアミドおよびＬ−α−アラニンア
ミドの飽和濃度以下であれば一般に制限はないが、好ま
しくは反応液当たり0.1〜40％（重量）である。なお、D
L−α−アラニンアミドおよびＬ−α−アラニンアミド
は市販（バッケム社）されていて、容易に入手すること
ができる。

反応において、Ｄ−α−アラニンの生成を極力おさえ
るために、光学活性なアラニンのラセミ化を触媒する酵
素であるアラニンラセマーゼ活性を抑制する公知の方法
を用いることができる。例えば、通常の変異処理により
アラニンラセマーゼ活性がないかあるいは活性が低下し
た変異株を取得し反応に用いる〔モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）19
8,315−322（1985）〕、熱処理などによりアラニンラセ
マーゼ活性を失活させる〔日本化学会誌９,1369（198
3）〕あるいはアラニンラセマーゼ阻害剤を反応時添加
する〔化学と生物20,770−772（1986）；生化学実験講
座11,275−296〕などの方法を適宜用いることにより、
光学純度の高いＬ−α−アラニンを得ることができる。

反応が終了した時点で、反応生成液を加熱あるいはpH
を低下させるなどの常法により速やかに反応を停止させ
た後、反応生成液から目的物質であるＬ−α−アラニン
と未反応のＤ−α−アラニンアミドとをそれぞれ分離、
回収する。分離方法としては、イオン交換樹脂などを用
いるカラムクロマトグラフィーあるいは晶出法など通常
の分離方法が用いられる。

未反応のＤ−α−アラニンアミドは、公知の方法、例
えば、酸またはアルカリで加水分解することによりＤ−
α−アラニンに変換することができる。また、Ｄ−α−
アラニンアミドをラセミ化した後、反応系へ循環させる
こともできる。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例１ ペプトン10g/、イーストエキス5g/および塩化ナ
トリウム5g/を含む培地（pH7.2）40mlを250ml容三角
フラスコに分注し、120℃、20分間オートクレーブにか
けて滅菌し種培養培地とした。この培地にラフネラ・エ
スピーＨ−7246を一白金耳植菌し、30℃で24時間振動培
養し、種培養液として用いた。

グルコース10g/、ペプトン10g/、肉エキス5g/
、リン酸二水素カリウム2g/、硫酸マグネシウム0.5
g/、硫酸第一鉄1mg/、硫酸マンガン1mg/およびDL
−α−アラニンアミド5g/を含む培地（pH7.0）１を
２容量のミニジャーファーメンターに分注し、120
℃、30分間オートクレーブにかけて滅菌し主培養培地と
した。この培地に種培養液1mlを無菌的に接種し、30℃
で48時間通気撹拌培養（通気量1.0VVM）した。なお、培
養中、４規定アンモニア水により培地のpHを7.0±0.1に
調整した。この主培養液500mlを遠心分離（10,000rpm,1
0分間）し、生菌体を得た。

DL−α−アラニンアミド（バッケム社製）50gを含む5
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）１に、生菌体5g（乾燥菌体
重量換算）を加え、40℃で１時間振盪し、反応を行っ
た。反応終了後、反応液を遠心分離（10,000rpm,10分
間）して得られた上澄液をイオン交換樹脂ダイヤイオン
SK−1B（Ｈ型）（三菱化成社製）１に通塔し、Ｌ−α
−アラニンを吸着させた。該樹脂を水洗後、２規定アン
モニア水でＬ−α−アラニンを溶出した。溶出液を減圧
濃縮し、結晶を析出させ、ろ取し、乾燥した結果、Ｌ−
α−アラニン17g（光学純度99.8ee％以上）を得た。

旋光度▲〔α〕^D ₂₀▼＝＋14.5゜（ｃ＝10,6規定塩酸） 実施例２ 粉末ブイヨン20g/、イーストエキス5g/および塩
化ナトリウム2.5g/を含む培地（pH7.2）40mlを250ml
用三角フラスコに分注し、120℃、20分間オートクレー
ブにかけて滅菌して種培養培地とした。この培地にラフ
ネラ・エスピーＨ−7246を一白金耳植菌し、30℃で24時
間振動培養し、種培養液として用いた。

シュークロース10g/、ペプトン5g/、イーストエ
キス5g/、硫酸アンモニウム5g/、リン酸二水素カリ
ウム2g/、硫酸マグネシウム0.5g/、硫酸第一鉄1mg/
、硫酸マンガン1mg/およびDL−α−アラニンアミド
（バッケム社製）5g/を含む培地（pH7.0）１を２
容量のミニジャーファーメンターに分注し、120℃、30
分間オートクレーブにかけて滅菌して主培養培地とし
た。この培地に、種培養液1mlを無菌的に接種し、30℃
で48時間通気撹拌培養（通気量1.0VVM）した。なお、培
養中、４規定アンモニア水により培地のpHを7.0±0.1に
調整した。この主培養液500mlを遠心分離（10,000rpm,1
0分間）し、得られた湿菌体9gを生理食塩水で洗浄し、
遠心分離（10,000rpm,10分間）した後、1mM2−メルカプ
トエタノールを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁
し、超音波処理（５℃,20分間）により菌体破砕を行っ
た。菌体破砕液を遠心分離（15,000rpm,30分間）して得
られた上清をＬ−α−アミダーゼ粗酵素液として45ml得
た。

DL−α−アラニンアミド25gを含む50mMリン酸緩衝液
（pH7.0）500mlに、Ｌ−α−アミダーゼ粗酵素液25mlを
加え、30℃で２時間振盪し、反応を行った。以下実施例
１と同様に行った結果、Ｌ−α−アラニン9g（光学純度
99.8ee％以上）を得た。

旋光度▲〔α〕^D ₂₀▼＝＋14.6゜（ｃ＝10,6規定塩酸） 実施例３ Ｌ−α−アラニンアミド（バッケム社製）50gを含む5
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）１に、実施例１と同様に行
って得たラフネラ・エスピーＨ−7246の生菌体5g（乾燥
菌体重量換算）を加え、40℃で４時間振盪し、反応を行
った。反応終了後、反応液を遠心分離（10,000rpm,10分
間）して得られた上澄液をイオン交換樹脂ダイヤイオン
SK−1B（Ｈ型）（三菱化成社製）１に通塔し、Ｌ−α
−アラニンを吸着させた。該樹脂を水洗後、２規定アン
モニア水でＬ−α−アラニンを溶出した。溶出液を減圧
濃縮し、結晶を析出させ、ろ取し、乾燥した結果、Ｌ−
α−アラニン32g（光学純度99.8ee％以上）を得た。

旋光度▲〔α〕^D ₂₀▼＝＋14.5゜（ｃ＝10,6規定塩酸） 発明の効果 本発明により、医薬品、食品添加物および各種工業薬
品の合成中間体として重要なアミノ酸であるＬ−α−ア
ラニンを安価にかつ効率よく製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 落合 恵子 神奈川県海老名市上今泉４―21―17 審査官 滝本 晶子 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 41/00 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ラフネラ属に属し、Ｌ−α−アラニンアミ
   ドを不斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌
   体またはそれらの処理物の存在下、DL−α−アラニンア
   ミドまたはＬ−α−アラニンアミドを含有する水性媒体
   中で光学選択的に加水分解を行わせ水性媒体中にＬ−α
   −アラニンを生成させ、該水性媒体よりＬ−α−アラニ
   ンを採取することを特徴とするＬ−α−アラニンの製造
   法。
2. 【請求項２】微生物がラフネラ・エスピー（Rahnella s
   p.）Ｈ−7246（FERM BP−2871）である請求項１記載の
   製造法。