ES2204890T3 - Anticuerpos monoclonales humanizados. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION ESTA RELACIONADA CON UN ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANIZADO NUEVO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE CONSENSO MODIFICADO ARTIFICIAL, AL MENOS, DE LOS FRS DE LA ZONA VARIABLE DE LA CADENA PESADA DE UNA INMUNOGLOBULINA HUMANA. LA INVENCION ESTA RELACIONADA, ADEMAS, CON LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANIZADOS Y QUIMERICOS QUE SE ENLAZAN CON EPITOPES DEL FACTOR DEL CRECIMIENTO EPIDERMAL EN EL QUE LAS ZONAS HIPERVARIABLES RESPONSABLES TIENEN LA SIGUIENTE SECUENCIA DE AMINOACIDOS: CADENA LIGERA: CDR MET ; CDR 2: GLU ERPOS SE PUEDEN UTILIZAR CON FINES TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO.

Description

Anticuerpos monoclonales humanizados.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales humanizados que contienen una secuencia consenso modificada artificial al menos de las FR en la región variable de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas.

La invención también se refiere a anticuerpos monoclonales humanizados que se unen a epítopos del factor de crecimiento epidérmico. La invención describe la secuencia de aminoácidos del sitio de unión al antígeno que presente respuesta para este receptor.

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos con el propósito de tratar tumores tales como melanomas, gliomas o carcinomas. Dichos anticuerpos también pueden utilizarse para aplicaciones de diagnóstico en relación con la localización y la evaluación de dichos tumores in vitro o in vivo.

La memoria descriptiva se refiere a varios términos técnicos que se definen en este documento como sigue:

Anticuerpos "humanizados" significa anticuerpos que contienen FR de las regiones variables y de las regiones constantes de aminoácidos situados en las cadenas ligera y pesada que proceden de fuentes humanas, mientras que las regiones hipervariables proceden de fuentes no humanas.

Anticuerpos "quiméricos" significa anticuerpos que contienen regiones variables e hipervariables que proceden de fuentes no humanas, mientras que las regiones constantes tienen un origen humano.

"FR" significa las regiones flanqueantes de un anticuerpo y se encuentran dentro de las regiones variables. En estas regiones se producen ciertas alteraciones de aminoácidos.

"CDR" significa las regiones determinantes de complementariedad o "hipervariables" de un anticuerpo y se encuentran dentro de las regiones variables. Estas regiones representan el sitio de unión específico de antígeno y muestran un inmenso intercambio de aminoácidos. Las CDR son responsables principalmente de la afinidad de unión del antígeno.

"Secuencia consenso" significa una secuencia de aminoácidos no natural para las regiones variables de la cadena ligera o pesada y se usa como sustituto de las regiones variables de la cadena pesada o ligera no humana presentes originalmente. La secuencia consenso es sintética y, por tanto, es una secuencia artificial de los aminoácidos más comunes de una clase, subclase o subgrupo distinto de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas humanas.

"EGF" y "EGFR" significan factor de crecimiento epidérmico y su receptor.

Regiones "V_{L}" significa regiones variables de la cadena ligera.

Regiones "V_{H}" significa regiones variables de la cadena pesada.

Antecedentes de la invención

El anticuerpo monoclonal murino 425 (Mab 425) se indujo contra la línea celular de carcinoma humano A431 y se descubrió que se unía a un epítopo polipeptídico en el dominio externo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) humano. Se descubrió que inhibía la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a los sitios de baja y alta afinidad del EGFR (Murthy et al., 1987). Se ha descubierto que se produce una mayor expresión de EGFR en tejidos malignos de una diversidad de fuentes, haciendo del Mab 425 un posible agente para el diagnóstico y el tratamiento terapéutico de tumores humanos. De hecho, se descubrió que el Mab 425 mediaba la citotoxicidad de tumores in vitro y reprimía el crecimiento de células tumorales de líneas celulares derivadas de carcinoma colorrectal y epidermoide in vitro (Rodeck et al., 1987). También se ha demostrado que el Mab 425 radiomarcado se une a xenoinjertos de gliomas malignos humanos en ratones (Takahashi et al., 1987).

El EGF es una hormona polipeptídica que es mitogénica para las células epiteliales y epidérmicas. Cuando el EGF interacciona con células sensibles, se une a receptores de membrana; los complejos de receptor y EGF se agrupan y después se internalizan en vesículas endocíticas. Esto es responsable del fenómeno de "regulación negativa". La unión del EGF induce una actividad tirosina quinasa de la molécula receptora e induce la síntesis de ADN.

El receptor de EGF es una glicoproteína transmembrana de aproximadamente 170.000 Daltons (Cohen, 1982). Es el producto génico del protooncogen c-erb-B (Downward et al., Nature, Vol. 307, pg. 521-527, 1984). El receptor se presenta en dos formas cinéticas: los llamados receptores de baja afinidad y de alta afinidad.

La línea celular de carcinoma A431 expresa abundantes receptores del EGF en sus superficies celulares y por eso se ha utilizado en muchos estudios para generar anticuerpos anti-receptor de EGF. Sin embargo, los receptores en A431 se diferencian de los de otros tipos celulares en los restos de carbohidrato unidos al polipéptido. De esta forma, muchos anticuerpos inducidos contra membranas de A431 están dirigidos contra carbohidratos que no son comunes en todas las formas de la molécula receptora (por ejemplo, Schreiber, 1983).

Otros anticuerpos monoclonales reaccionan con el resto proteico de los receptores del EGF. Estos anticuerpos presentan una diversidad de propiedades tras la unión a receptores del EGF, que supuestamente dependen de la porción particular de la molécula receptora unida y del isotipo del anticuerpo. Algunos anticuerpos imitan algunos de los efectos del EGF (agonistas) y otros inhiben los efectos (antagonistas).

La expresión de receptores del EFG se ha implicado en la progresión del crecimiento tumoral. Se ha descubierto que el gen para los receptores es el análogo celular del oncogen viral de aves v-erb-B (Ulrich, 1984). Además se ha detectado una asociación entre las últimas etapas del desarrollo del melanoma y las copias extra del cromosoma portador del gen del receptor (Koprowski et al., Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 11, pg. 297-302, 1985).

Como los receptores del EGF se expresan en una amplia diversidad de tumores sólidos, éstos proporcionan un blanco adecuado para una terapia antitumoral. Sin embargo, la técnica necesita un anticuerpo adecuado contra el receptor. Muchos de los anticuerpos conocidos tienen propiedades que serían perjudiciales si se usaran como agentes antitumorales. Por ejemplo, los anticuerpos que imitan los efectos del EGF podrían estimular la progresión del tumor en lugar de detenerlo. Otros anticuerpos que sólo se unen a receptores de alta o baja afinidad podrían tener una eficacia por debajo de la óptima porque el EGF podría incluso ejercer su efecto a través de los receptores no unidos. Otros anticuerpos incluso convierten receptores de baja afinidad en receptores de alta afinidad, lo cual podría exacerbar el crecimiento tumoral en lugar de inhibirlo. De esta manera, en la técnica existe la necesidad de un anticuerpo anti-receptor de EGF que sea adecuado para la terapia antitumoral.

Aunque se han usado Mab murinos para tratamientos terapéuticos en seres humanos, éstos han desencadenado una respuesta inmune (Giorgi et al., 1983; Jaffers et al., 1986). Para solucionar este problema, varios grupos han tratado de "humanizar" anticuerpos murinos. Esto puede implicar una de dos estrategias. En primer lugar, los dominios de la región constante murina tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera pueden reemplazarse por regiones constantes humanas. Tales anticuerpos "quiméricos" murino-humano se han construido con éxito a partir de varios anticuerpos murinos dirigidos contra antígenos humanos asociados a tumores (Sun et al., 1987; Whittle et al., 1987; Liu et al., 1987; Gillies y Wesolowski, 1990). Esta estrategia conserva totalmente el sitio de unión al antígeno del anticuerpo murino y, por lo tanto, la afinidad por el antígeno, mientras que confiere las funciones de isotipo y efectoras humanas. En la segunda estrategia sólo se injertan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables del ratón junto con las regiones flanqueantes (FR) humanas de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada (V_{L} y V_{H}). Se deduce que esta técnica transferirá al anticuerpo humano la porción principal y crítica del sitio de unión al antígeno (Jones et al., 1986).

El injerto de CDR se ha llevado a cabo en varios monoclonales de roedor (Jones et al., 1986; Reichmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988; Queen et al., 1989; Co et al., 1991; Gorman et al., 1991; Maeda et al., 1991; Temptest et al., 1991). Todos retenían su capacidad para unir el antígeno, aunque la afinidad generalmente se reducía. En la mayoría de los casos se consideró necesario alterar ciertos aminoácidos en los restos flanqueantes (FR) humanos. Se ha demostrado que tanto los anticuerpos quiméricos como los injertados con CDR son superiores clínicamente a los anticuerpos de ratón (Hale et al., 1988; LoBuglio et al., 1989; Mathieson et al., 1990). Sin embargo, no se conoce una pauta general de qué aminoácido tiene que cambiarse, y en ningún caso es completamente predecible.

El documento EP 088 994 propone la construcción de vectores de ADN recombinante compuestos de una secuencia de ADN que codifica un dominio variable de una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina específica para un ligando predeterminado. La solicitud no considera variaciones en la secuencia del dominio variable.

El documento EP 102 634 describe la clonación y expresión en organismos hospedadores bacterianos de genes que codifican para todo o parte del polipéptido de la cadena pesada de la IgG humana, pero no contempla variaciones en la secuencia del polipéptido.

El documento EP 239 400 propone que se pueden obtener anticuerpos humanizados reemplazando el sitio de unión al antígeno (regiones hipervariables) de cualquier anticuerpo humano por un sitio de unión al antígeno de un no humano, por ejemplo, de un anticuerpo de ratón o de rata, por métodos de tecnología génica.

De esta forma, siguiendo esta pauta, se pueden obtener anticuerpos humanos o humanizados con sitios de unión al antígeno específicos no disponibles hasta ahora en anticuerpos procedentes de humanos.

Se pueden obtener anticuerpos quiméricos reemplazando no sólo las CDR, sino también las regiones variables completas de las cadenas ligeras y pesadas. Los anticuerpos quiméricos, sin embargo, pueden seguir siendo inmunogénicos. Los anticuerpos quiméricos son, no obstante, muy útiles para fines de diagnóstico y para optimizar anticuerpos humanizados.

Podría demostrarse que la afinidad de los sitios de unión al antígeno puede estar influenciada por el intercambio selectivo de algunos aminoácidos individuales dentro de las regiones variables que no son directamente parte de las CDR (Reichmann et al., 1988).

Como consecuencia, en el peor de los casos, la afinidad de unión del antígeno se puede perder completamente si se trabaja según la pauta del documento EP 239 400. Este hecho podría demostrarse por los inventores de la presente invención, que no pudieron construir el correspondiente anticuerpo humanizado que estaba dirigido a epítopos del receptor de EGF.

Por lo tanto, debe considerarse que el éxito de tal humanización depende de la constitución y conformación de las regiones variables usadas y sus interacciones con el correspondiente sitio de unión al antígeno. De esta manera, no es completamente predecible si son necesarias o qué modificaciones son necesarias dentro de los dominios variables del anticuerpo con el fin de obtener o mejorar la unión del antígeno al anticuerpo.

Sumario de la invención

De esta manera, la invención tiene el objeto de proporcionar un anticuerpo monoclonal humanizado que está dirigido, en particular, contra el receptor de EGF, que contiene un sitio de unión al antígeno de origen no humano y las FR de las regiones variables y constantes de origen humano, que, si es necesario, se modifican de forma que la especificidad del sitio de unión pueda conservarse o restaurarse.

En particular, la invención tiene el objeto de caracterizar las regiones hipervariables del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo contra el receptor de EGF y proporcionar estas CDR dentro de un anticuerpo monoclonal humanizado definido como se ha indicado anteriormente.

Este anticuerpo puede jugar un papel importante como agente terapéutico o de diagnóstico con el fin de combatir tumores, tales como melanomas, gliomas o carcinomas.

Se ha descubierto que se pueden obtener fácilmente anticuerpos monoclonales humanizados específicos y eficaces usando una secuencia consenso de al menos las regiones variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanas. En particular, son adecuadas todas las secuencias consenso que tienen una buena identidad (de al menos un 60 a un 70%, en particular de un 65 a un 70%) en comparación con las regiones variables de los anticuerpos no humanos originales.

Además, se ha descubierto que estas secuencias consenso tienen que modificarse sólo en una pequeña medida mientras que, algunas veces, tienen que llevarse a cabo muchas más modificaciones usando regiones variables de anticuerpos humanos que se encuentran de forma natural. A menudo no son necesarias modificaciones, o sólo unas pocas, en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención para conseguir una unión buena y específica al antígeno. De esta manera, para conseguir una unión perfecta del receptor de EGF al anticuerpo humanizado preferido de acuerdo con la invención sólo deben reemplazarse algunos aminoácidos, mientras que de acuerdo con las pautas del documento EP 239 400 se puede obtener falta de unión. Las modificaciones que son necesarias de acuerdo con la invención pueden indicarse con un 0 a un 10%, o preferiblemente de un 1 a un 5% en relación con el intercambio de aminoácidos.

Un anticuerpo monoclonal humanizado de acuerdo con la invención tiene la siguiente ventaja: puede sintetizarse una secuencia consenso, que es una secuencia de acuerdo con la frecuencia del aminoácido más común en una posición determinada de una cadena de inmunoglobulina humana de una clase, subclase o subgrupo definido, en su totalidad o en parte sin problemas. No hay dependencia del conocimiento detallado o de la disponibilidad de ciertos anticuerpos individuales o fragmentos de anticuerpo. Esto significa que puede cubrirse una amplia serie de fragmentos de anticuerpo que aparecen de forma individual o natural, proporcionando un número de secuencias consenso muy restringido que se clonan en los correspondientes vectores de expresión. Una secuencia consenso puede ser favorable con respecto a la inmunogenicidad en comparación con secuencias naturales individuales que se sabe que algunas veces son epítopos de otros anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-idiotipo).

Aunque sólo se hizo una realización preferida, de acuerdo con la presente invención se describe una pauta general principal. No es un mero accidente, en lo que respecta al amplio número de posibles secuencias y combinaciones de secuencias en los dominios variables e hipervariables, que la pauta descrita con respecto a la secuencia consenso fuera satisfactoria en la construcción de un anticuerpo humanizado dirigido contra el receptor de EGF.

Además, se ha descubierto que las cadenas pesadas de los dominios variables proporcionan una mayor contribución al sitio de unión al antígeno que las correspondientes cadenas ligeras. Por lo tanto, no es necesario modificar de la misma forma la cadena ligera de un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia consenso. Éste es un aspecto interesante ya que es sabido que, en algunos anticuerpos naturales conocidos, las cadenas ligeras juegan un papel más importante que las correspondientes cadenas pesadas (véase Williams et al., 1990).

Finalmente y sobre todo, la invención proporciona por primera vez la caracterización, clonación y amplificación por medio de ingeniería genética del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo murino contra el receptor de EGF (Mab 425). Se podrían sintetizar oligonucleótidos correspondientes que codificaran ese sitio de unión al antígeno y el dominio variable completo de un anticuerpo monoclonal humanizado y quimérico. La invención proporciona, además, vectores de expresión eficaces correspondientes que pueden usarse para la transformación de células eucariotas apropiadas.

Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que contiene sitios de unión al antígeno (CDR) de origen no humano, y las FR de las regiones variables y constantes de las cadenas ligeras y pesadas de origen humano, caracterizado porque al menos las FR de las regiones variables de la cadena pesada contienen una secuencia consenso modificada de regiones variables diferentes de una clase o subgrupo distinto de una inmunoglobulina humana.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado, donde las FR de la secuencia consenso tienen una homología de al menos un 70% en comparación con la secuencia de aminoácidos de las FR de la región variable del anticuerpo no humano del que proceden los sitios de unión al antígeno.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene las siguientes propiedades:

(a) se une a receptores del EGF humano;

(b) inhibe la unión del EGF al receptor de EGF;

(c) inhibe la actividad tirosina quinasa dependiente de EGF del receptor de EGF; y

(d) inhibe el crecimiento de células sensibles al EGF.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado, donde las regiones hipervariables de los sitios de unión al antígeno contienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

Cadena ligera:

1

Cadena pesada:

2

En particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado, donde las FR de las regiones variables que no están relacionadas con los sitios de unión al antígeno contienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

Cadena ligera:

3

donde:

Xaa_{1} es Tyr o Phe.

Cadena pesada:

4

donde:

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Arg y Xaa_{5} es Val.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene la capacidad de unirse a receptores del EGF humano y de inhibir la unión del EGF a dichos receptores, constando cada cadena ligera y pesada de una región de unión al antígeno (CDR) específica de origen no humano, una región flanqueante (FR) variable de origen humano y una región constante de origen humano,

donde

(i) la región CDR de la cadena ligera contiene las siguientes secuencias de aminoácidos:

5

(ii) la región CDR de la cadena pesada contiene las siguientes secuencias de aminoácidos:

6

(iii) la región FR de la cadena ligera contiene las siguientes secuencias de aminoácidos:

7

(iv) la región FR de la cadena pesada contiene las siguientes secuencias de aminoácidos:

8

donde

Xaa_{1} es Tyr o Phe, y

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Arg y Xaa_{5} es Val.

En particular, y como una realización preferida, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado 425, donde

Xaa_{1} es Tyr, Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado, donde las regiones constantes de la cadena pesada contienen la secuencia de aminoácidos de una cadena gamma-1, y las regiones constantes de la cadena ligera contienen la secuencia de aminoácidos de una cadena kappa de una inmunoglobulina humana.

En particular, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que contiene un derivado de una secuencia de aminoácidos modificada por deleción, sustitución, adición o inversión de aminoácidos dentro de las regiones variable y constante, donde se conserva la función biológica de unión específica al antígeno.

Además, la invención se refiere a un vector de expresión, adecuado para la transformación de células hospedadoras, caracterizado porque contiene una secuencia de ADN que codifica las regiones variables y/o constantes de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo humanizado.

Además, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un anticuerpo monoclonal humanizado, que contiene regiones hipervariables (CDR) de sitios de unión al antígeno de origen no humano, y FR de regiones variables y constantes de las cadenas ligeras y pesadas de origen humano, por medio del cultivo de células hospedadoras transformadas en un medio de cultivo y la purificación y aislamiento de las proteínas de anticuerpo expresadas, caracterizado por:

(a)

la síntesis, la síntesis parcial o el aislamiento de una secuencia oligonucleotídica que codifica una secuencia consenso de aminoácidos de regiones variables diferentes (FR-1 a FR-4) de una cadena pesada de una clase o subgrupo de una inmunoglobulina humana, donde la secuencia consenso usada tiene una homología de al menos un 70% en comparación con la secuencia de aminoácidos de las FR de las regiones variables del anticuerpo no humano del que proceden los sitios de unión al antígeno, y donde la secuencia consenso se modifica alterando como máximo el 10% de los aminoácidos con el fin de mantener la capacidad de unión del antígeno a las regiones hipervariables;

(b)

la síntesis, la síntesis parcial o el aislamiento de una secuencia oligonucleotídica que codifica una secuencia consenso de aminoácidos bajo las condiciones proporcionadas en (a) de regiones variables diferentes (FR-1 a FR-4) de una cadena ligera de una clase o un subgrupo de una inmunoglobulina humana o, como alternativa, que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente que aparece de forma natural;

(c)

en cada caso la síntesis, la síntesis parcial o el aislamiento de una secuencia oligonucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de las regiones hipervariables (CDR) de las cadenas ligera y pesada correspondientes a las regiones hipervariables del anticuerpo no humano básico;

(d)

en cada caso la síntesis, la síntesis parcial o el aislamiento de una secuencia oligonucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina humana;

(e)

la construcción de uno o varios vectores de expresión que contengan en cada caso al menos un promotor, un origen de replicación y las secuencias de ADN codificantes de acuerdo con (a) a (d), donde las secuencias de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada pueden estar presentes conjuntamente en uno o, como alternativa, en dos o más vectores diferentes,

y finalmente,

(f)

la transformación de las células hospedadoras con uno o más de los vectores de expresión de acuerdo con (e).

En particular, la invención se refiere a un proceso donde se usan secuencias de ADN que codifican las siguientes secuencias de aminoácidos que representan las regiones hipervariables (CDR) y las FR de las regiones variables como se ha representado anteriormente.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humanizado.

Además, la invención se refiere al uso de un anticuerpo humanizado para la fabricación de un medicamento dirigido contra tumores.

Finalmente, la invención se refiere al uso de un anticuerpo humanizado para la localización diagnóstica y la evaluación del crecimiento de un tumor.

En resumen, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que contiene una secuencia consenso de regiones variables de una cadena pesada de una clase o un subgrupo de inmunoglobulinas humanas.

Microorganismos y plásmidos usados en la invención

(a)

pRVL425 (= HCMV-RV_{L}b425-\kappa), depositado el 1 de febrero de 1991, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) con el número de acceso DMS 6340. El vector de expresión contiene las secuencias de las regiones hipervariables (CDR) del anticuerpo murino 425 y las FR de la región variable y la región constante (kappa) de la cadena ligera del anticuerpo humanizado. R significa "reformado".

(b)

pRVH425 (= HCMV-RV_{H}g425-\gamma), depositado el 1 de febrero de 1991, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) con el número de acceso DSM 6339. El vector de expresión contiene las secuencias de las regiones hipervariables (CDR) del anticuerpo murino 425 y las FR de la región variable y la región constante (gamma-1) de la cadena pesada del anticuerpo humanizado. R significa "reformado".

(c)

pCVL425 (= HCMV-CV_{L}425-\kappa), depositado el 1 de febrero de 1991, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) con el número de acceso DSM 6338. El vector de expresión contiene las secuencias de las FR y las regiones hipervariables (CDR) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo murino 425 y la región constante (kappa) de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana. C significa quimérico.

(d)

pCVH425 (= HCMV-CV_{H}425-\gamma), depositado el 1 de febrero de 1991, de acuerdo con el Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) con el número de acceso DSM 6337. El vector de expresión contiene las secuencias de las FR y de las regiones hipervariables (CDR) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo murino 425 y de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina gamma-1 humana. C significa quimérico.

(e)

Línea celular del hibridoma 425, depositada el 26 de enero de 1988, de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso HB 9629. La línea celular produce el anticuerpo murino 425 dirigido contra el receptor de EGF.

Otros materiales biológicos

Otros microorganismos, líneas celulares, plásmidos, promotores, marcadores de resistencia, orígenes de replicación u otros fragmentos de vectores que se mencionan en la solicitud están disponibles en el mercado o se pueden adquirir generalmente de otra forma. Siempre que no se proporcionen otras indicaciones en la solicitud, se usan sólo como ejemplos y no son esenciales de acuerdo con la invención y pueden reemplazarse por otras herramientas y materiales biológicos adecuados, respectivamente.

Los hospedadores bacterianos se usan preferiblemente para la amplificación de las secuencias de ADN correspondientes. Son ejemplos de estos hospedadores: E. coli o Bacillus.

Se prefieren células eucariotas tales como COS (origen CV1 de SV40) o CHO (ovario de hámster chino) o levaduras, por ejemplo, para producir los anticuerpos humanizados y quiméricos de acuerdo con la invención. Se prefieren las células COS y CHO.

Métodos generales de fabricación

Las técnicas que son esenciales de acuerdo con la invención se describen con detalle en la memoria descriptiva.

Otras técnicas que no se describen con detalle corresponden a métodos convencionales conocidos que son bien conocidos por una persona especialista en la técnica o se describen con más detalle en la bibliografía y en las solicitudes de patentes citadas y en la literatura convencional.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 Representaciones esquemáticas de los vectores usados para la expresión de anticuerpos humanos quiméricos y reformados. Están marcados los sitios de restricción usados en la construcción de los plásmidos de expresión. Las secuencias codificantes de la región variable se representan por los recuadros negros, las regiones constantes por los recuadros blancos, el promotor y el potenciador de HCMV por los recuadros rayados, y el fragmento de nucleótidos del plásmido pSVneo por los recuadros punteados. Las direcciones de transcripción se representan por flechas.

Fig. 2 Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los ADNc de V_{H} 425 (A) y V_{L}425 clonados en pUC18. Los aminoácidos que contribuyen al líder están subrayados y las CDR se indican entre paréntesis. También se muestran los sitios de ayuste entre las regiones variables y las regiones constantes. Se muestran los cebadores de PCR directos e inversos y sus sitios de hibridación, usados para la construcción de los que genes que codifican para los anticuerpos quiméricos.

Fig. 3 Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del fragmento génico sintetizado que codifica V_{H} a425 humana reformada. La secuencia líder está subrayada y los restos que contribuyen a las CDR están entre paréntesis.

Fig. 4 Comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de 425 de ratón y humano reformado. El panel A muestra las secuencias de V_{L} de ratón (V_{L}425) y V_{L}S humana reformada (RV_{L}a425 y RV_{L}b425). El panel B muestra las secuencias de V_{H} de ratón (V_{H}425) y V_{H} s humana reformada (RV_{H}a425, RV_{H}b425, RV_{H}c425, RV_{H}d425, RV_{H}e425, RV_{H}f425, RV_{H}g425, RV_{H}h425 y RV_{H}i425). Se indican las FR y las CDR. Los aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat et al., 1987.

Fig. 5 Modelo molecular de las regiones variables del Mab 425 de ratón.

Fig. 6 Detección de la unión a EGFR por ELISA. La actividad de unión al antígeno se ensayó en diluciones de sobrenadantes de células COS transfectadas y representadas como densidad óptica a 450 nm frente a la concentración de IgG (cuantificada por ELISA, véase la sección de Materiales y Métodos). Todas las versiones de las regiones V_{H} humanas reformadas se cotransfectaron con RV_{L}a425 y se representa como sigue: RV_{H}a425

\pointtriangle

, RV_{H}b425 \diamondsuit, RV_{H}c425 \Delta, RV_{H}d425 \otimes, RV_{H}e425 \square, RV_{H}f425 \boxtimes, RF_{H}g425 \square, RV_{H}h425 \medcirc, RV_{H}i425 \odot, RV_{H}b425 cotransfectado con RV_{L}b425 se representa como \Diamondblack. Una cotransfección de las VL425 y VH425 quiméricas se representa como \bullet.

Fig. 7 Competición por la unión al antígeno. El panel A muestra la competición entre el anticuerpo 425 de ratón marcado y (1) el anticuerpo 425 de ratón sin marcar (+) y (2) el anticuerpo 425 quimérico (\bullet) producido por células COS después de la cotransfección con HCMV-CV_{L}425-kappa y HCMV-C_{H}425-gamma-1. El panel B muestra la competición entre el anticuerpo 425 de ratón marcado y (1) el anticuerpo 425 de ratón sin marcar (+) y (2) los anticuerpos 425 humanos reformados producidos por células COS después de la cotransfección con HCMV-RV_{L}a425-kappa y HCMV-RV_{H}i425-gamma-1 (\medcirc) y con HCMV-RV_{L}a425-kappa y HCMV-RV_{H}g425-gamma-1 (\square). En cada caso, el eje horizontal representa la concentración de inhibidor (ng/ml). El eje vertical representa el porcentaje de inhibición de la unión.

Fig. 8 Un examen de los efectos de diferentes regiones V_{L} humanas reformadas sobre la unión al antígeno. El panel A muestra la unión al antígeno de anticuerpos humanos reformados producidos en células COS transfectadas con HCMV-CV_{L}425-kappa y HCMV-CV_{H}425-gamma-1 (\bullet), HCMV-RV_{L}a425-kappa y HCMV-RV_{H}g425-gamma-1 (\square), HCMV-RV_{L}b425-kappa y HCMV-RV_{H}g425-gamma-1 (\blacksquare), HCMV-RV_{L}a425-kappa y HCMV-RV_{H}c425-gamma-1 (\Delta), y HCMV-RV_{L}b425-kappa y HCMV-RV_{H}c425-gamma-1 (\blacktriangle). El panel B muestra la competición por la unión al antígeno entre el anticuerpo 425 de ratón marcado y (1) el anticuerpo 425 de ratón no marcado (+) y (2) los anticuerpos 425 humanos reformados producidos en células COS cotransfectadas con HCMV-V_{L}a425-kappa y HCMV-V_{H}g425-gamma-1 (\square) y con HCMV-V_{L}b425-kappa y HCMV-V_{H}g425-gamma-1 (\blacksquare). En el panel A, el eje vertical representa la densidad óptica a 450 nm (OD_{450}) y el eje horizontal representa la concentración de IgG (ng/ml). En el panel B, el eje horizontal representa la concentración de inhibidor (ng/ml) y el eje vertical representa el porcentaje de inhibición de la unión.

Fig. 9 Panel A: Análisis de los Mab 425 reformado (calles 1, 2), quimérico (calle 3) y murino (calle 4) por SDS-PAGE en condiciones no reductoras (a) y en condiciones reductoras (b). Reformado (calles 7, 8), quimérico (calle 9) y murino (calle 10). Las calles 5, 6, 11 y 12 son marcadores de peso molecular.

Panel B: Purificación por exclusión molecular en Superose 12 del Mab 425 reformado. El pico 2 representa la IgG.

Fig. 10 Unión competitiva de los Mab 425 murino, quimérico y reformado al receptor de EGF (EGFR). El eje vertical representa la proporción de (Mab) unido con respecto a (Mab) total en porcentaje (% unido/total). El eje horizontal representa la concentración de anticuerpo (mol/l [log]).

\triangledown significa Mab 425 murino

\medcirc significa Mab 425 quimérico

\bullet, \blacktriangledown significa Mab 425 reformado

Fig. 11 Competición de EGF y anticuerpos por el receptor de EGF. El eje vertical representa el % (Mab) unido/total. El eje horizontal representa la concentración de anticuerpo (ml/l[log]).

\medcirc significa Mab 425 murino

\Delta, \triangledown, \oblong significan Mab 425 reformado

Descripción detallada Clonación y secuenciación de los genes de la región variable del Mab 425

A partir de la síntesis y clonación del ADNc usando el cebador de la cadena kappa, se cogen preferiblemente para la selección 300-400 colonias. A partir de la síntesis y clonación del ADNc usando el cebador de gamma-2a, se cogen preferiblemente para la selección 200-300 colonias. Tras la selección por hibridación usando los dos cebadores de clonación respectivos, proporcionan señales fuertes 20-30 colonias de la cadena ligera y 10-20 colonias de la cadena pesada. Se aísla ADN plasmídico a partir de estas colonias y se analiza por digestión con enzimas de restricción disponibles en el mercado y habituales para determinar el tamaño de los insertos de ADNc. Se seleccionan como candidatos para secuenciación los clones que tienen insertos de 400-500 pb o 500-600 pb para la clonación de V_{L} y V_{H}, respectivamente. Se secuencian tres clones de V_{L} y tres clones de V_{H} en las dos cadenas usando cebadores de secuenciación inversos y universales de M13. De los tres posibles clones de V_{L} secuenciados, uno codifica una región variable completa y los otros parecen codificar péptidos no relacionados. Dos de los clones de V_{H} codifican regiones V_{H} idénticas mientras que el otro parece codificar la región V_{H} con el intrón entre la secuencia líder y la FR-1 aún presente. Aparte del intrón, el tercer clon de V_{H} contiene una secuencia codificante idéntica a la de los dos primeros clones. Para verificar la secuencia de la región V_{L}, se secuencian los ADNc de tres clones más que contienen insertos del tamaño apropiado. Dos de éstos proporcionan secuencias en concordancia con el primer clon de V_{L}. El tercero es una secuencia de ADN no relacionada. En los clones secuenciados no está presente toda la secuencia del cebador original. El grado de las deleciones varía de un clon a otro. Estas deleciones, que probablemente tienen lugar durante la síntesis y clonación del ADNc, pueden reducir la eficacia de la selección de colonias.

Los genes de V_{L} y V_{H} del Mab 425 se muestran en la figura 2. Se comparan las secuencias de aminoácidos de las regiones V_{L} y V_{H} de 425 con otras regiones variables de ratón de la base de datos de Kabat (Kabat et al., 1987). La región V_{L} puede clasificarse en el subgrupo IV o VI de las regiones variables de la cadena kappa de ratón. Dentro de las FR, la región V_{L} de 425 tiene una identidad de aproximadamente el 86% con la secuencia consenso del subgrupo IV de kappa de ratón y una identidad de aproximadamente el 89% con el subgrupo VI. La región V_{L} de 425 parece usar el segmento JK4. El examen de la región V_{H} muestra una identidad de aproximadamente el 98% con las FR de la secuencia consenso para el subgrupo II de la cadena pesada de ratón (B).

La elección correcta de una clase o subgrupo adecuado de inmunoglobulina humana depende del grado de la identidad con la cadena presente originalmente en el anticuerpo no humano. La identidad de la secuencia consenso deducida de acuerdo con la presente invención debe ser mayor del 65 al 70% en comparación con la secuencia de la cadena no humana original.

Para la secuencia consenso de las cadenas pesadas se prefiere especialmente, sin embargo, la secuencia consenso del subgrupo I de la cadena pesada humana. No obstante, para otros anticuerpos, son adecuadas las secuencias consenso de otras cadenas pesadas humanas. Las secuencias consenso preferidas están modificadas. El posible intercambio de aminoácidos es del 0 al 10% de acuerdo con la invención, preferiblemente del 5 al 10%.

Construcción y expresión del anticuerpo 425 quimérico

Antes de que los ADNc que codifican las regiones V_{L} y V_{H} puedan usarse en la construcción del anticuerpo 425 quimérico, es necesario introducir varias modificaciones en los extremos 5' y 3'. Éstas incluyen la introducción de sitios apropiados para enzimas de restricción de manera que las secuencias que codifican la región variable puedan subclonarse convenientemente dentro de los vectores de expresión de HCMV. Es necesario volver a crear sitios donadores de ayuste en las regiones que flanquean el extremo 3' para que las regiones variables se ayusten correcta y eficazmente con las regiones constantes. Las regiones que flanquean el extremo 5' también se modifican para incluir una secuencia que pueda crear sitios de iniciación eficaces para la traducción a cargo de los ribosomas eucarióticos (Kozak, 1987). Estas modificaciones se introducen usando cebadores de PCR. Los cebadores usados se indican en la tabla 1.

TABLA 1 Oligonucleótidos usados para clonación de ADNc, construcción de quiméricos y mutagénesis

Las secciones subrayadas denotan las bases que se alinean con la región flanqueante humana.

(Tabla pasa a página siguiente)

9

10

Para cada ADNc de la región variable se diseñan preferiblemente dos cebadores. En los cebadores directos se usan 15 bases en el extremo 3' del cebador para hibridar el cebador con el molde de ADN mientras que el extremo 5' del cebador contiene un sitio HindIII y la secuencia "Kozak". Los cebadores inversos tienen un diseño similar con 15 bases en el extremo 3' usado para hibridar el cebador con el molde de ADN y el extremo 5' del cebador contiene un sitio BamHI y un sitio donador de ayuste. En el caso del cebador inverso de la cadena ligera, se usa un sitio BglII en lugar de un sitio BamHI porque el ADNc que codifica la V_{L} contiene un sitio BamHI interno (figura 2). La reacción de PCR preferiblemente se lleva a cabo como se describe en los ejemplos.

El ADN de la región V_{L} modificado por PCR se clona en los sitios HindIII-BamHI del vector de expresión de la cadena ligera de HCMV como un fragmento HindIII-BglII. Este vector ya contiene la región constante kappa del genoma humano con el sitio aceptor de ayuste necesario y sitios de poli(A^{+}). El fragmento completo de V_{L} modificado por PCR se secuencia usando dos cebadores que hibridan con los sitios que flanquean el sitio de clonación en el vector de expresión. La secuenciación confirma que no se han incorporado errores durante la etapa de PCR. El ADN de V_{H} modificado por PCR se clona en el vector de expresión de la cadena pesada de HCMV como un fragmento HindIII-BamHI y también se secuencia para confirmar la ausencia de errores de PCR. Un fragmento BamHI que contiene la región constante gamma-1 del genoma humano se inserta en el vector HCMV-CV_{H} en el extremo 3' de la región V_{H}. Este fragmento contiene el sitio aceptor de ayuste necesario para que se produzca in vivo el ayuste V-C y el sitio del poli(A^{+}) que existe de forma natural.

Los vectores de expresión que contienen las regiones V_{L} y V_{H} de 425 quimérico se utilizar para cotransfectar células eucariotas apropiadas, preferiblemente células COS. Tras aproximadamente 72 horas de expresión transitoria, se ensaya el medio de cultivo por ELISA con respecto a la producción de IgG humana y la unión a la proteína EGFR. Las cantidades de IgG humana detectadas en el medio varían de 100 a 400 ng/ml. El anticuerpo quimérico producido se une bien a la proteína EGFR en un ensayo ELISA convencional de unión a antígeno, lo cual confirma que se han clonado y secuenciado las regiones variables de ratón correctas.

Diseño inicial, construcción y expresión de las cadenas ligera y pesada de 425 humano reformado

En el diseño de un anticuerpo 425 humano reformado, se le concede la máxima importancia a la región V_{H}, ya que este dominio a menudo es el más importante en la unión al antígeno (Amit et al., 1986; Verhoeyen et al., 1988). Para seleccionar las FR humanas en las que se van a injertar las CDR de ratón, se comparan las FR de la región V_{H} del Mab 425 de ratón con las FR de las secuencias consenso de todos los subgrupos de regiones V_{H} humanas (Kabat et al., 1987). Esta comparación demuestra que las FR de la V_{H} del Mab 425 de ratón se asemejan más a las FR de las V_{H} humanas del subgrupo I, mostrando una identidad de aproximadamente un 73% dentro de las FR y una identidad de aproximadamente un 65% en las regiones V_{H} completas.

Se lleva a cabo una comparación adicional de la región V_{H} de 425 de ratón con otras regiones V_{H} de ratón procedentes de los mismos subgrupos de Kabat para identificar cualquier resto de la FR que sea característico del Mab 425 y que, por lo tanto, pueda estar implicado en la unión al antígeno. El resto en la posición 94 de la región V_{H} del Mab 425 de ratón es una serina, mientras que en otras regiones V_{H} del subgrupo II (B) de ratón, y también del subgrupo I humano, el resto 94 es una arginina (Kabat et al., 1987). Esta sustitución de aminoácidos es inusual y, como la posición 94 es adyacente a la CDR-3, está en una posición sorprendentemente importante. Por estas razones, la región V_{H} del 425 humano reformado se diseña preferiblemente basándose en las CDR del Mab 425 de ratón y las FR derivadas de la secuencia consenso para las FR del subgrupo I humano (como definen Kabat et al., 1987). La posición 94 en la FR-3 es una serina, como se observó en el Mab 425 de ratón. En las posiciones en la secuencia consenso para las FR del subgrupo I humano, donde no se indica ningún aminoácido único, se selecciona el aminoácido más común en esta posición. Si no hay un aminoácido preferido en una posición en particular en la secuencia consenso humana, se selecciona el aminoácido que se encuentra en esa posición en la secuencia de la V_{H} del Mab 425 de ratón. La secuencia de aminoácidos resultante contiene la primera versión (versión "a") de la V_{H} de 425 humana reformada (figura 3). Todas las versiones posteriores de la V_{H} de 425 humana reformada son modificaciones de esta primera versión.

Se diseña y se sintetiza un fragmento de ADN de 454 pb que codifica la región V_{H} de 425 humana reformada, como se ha descrito anteriormente (véanse los ejemplos y la figura 3). Además de las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos de la región V_{H} de 425 humana reformada, este fragmento de ADN también contiene secuencias que codifican una secuencia líder humana. La secuencia líder humana puede tomarse, por ejemplo, a partir del anticuerpo HG3 CL (Rechavi et al., 1983), un miembro del subgrupo I de V_{H} humana (Kabat et al., 1987). El fragmento de ADN sintético también contiene señales de traducción eucarióticas en el extremo 5' (Kozak, 1987), un sitio donador de ayuste en el extremo 3' (Breathnach et al., 1978), y sitios HindIII y BamHI en los extremos 5' y 3', respectivamente, para la subclonación en el vector de expresión de HCMV.

Se realiza un procedimiento similar para el diseño de la región V_{L} de 425 humana reformada. Se comparan las FR de la V_{L} del Mab 425 de ratón con las secuencias consenso para todos los subgrupos de regiones V_{L} humanas (Kabat et al., 1987). En las FR, se encuentra una identidad de aproximadamente un 71% entre la V_{L} de 425 de ratón y el subgrupo III de V_{L} kappa humana, y una identidad de aproximadamente un 70% con el subgrupo I de V_{L} kappa humana. El ADN que codifica las FR humanas del subgrupo I de V_{L} kappa humana ya está disponible a partir de la región V_{L} del D1.3 humano reformado (documento EP 239 400, Winter) y CAMPATH-1 humano reformado (Reichmann et al., 1988). El diseño de las regiones V_{L} humanas reformadas en estos dos anticuerpos humanos se basa en la proteína REI de la inmunoglobulina humana de estructura resuelta (Epp et al., 1975). Por estas razones, las FR de las V_{L} humanas de D1.3 y CAMPATH-1H humanos reformados se usan también en la V_{L} de 425 humana reformada. Una comparación de las FR de la región V_{L} de 425 de ratón con FR de otros anticuerpos de ratón de grupos similares no revela diferencias significativas en los restos aminoacídicos de las posiciones importantes desde el punto de vista funcional. Por lo tanto, no son necesarios cambios en las FR humanas. La secuencia de aminoácidos de la versión "a" de la región V_{L} de 425 humana reformada se muestra en la figura 4.

Para construir la región V_{L} de 425 humana reformada, se diseñan tres oligonucleótidos que contienen secuencias internas de ADN que codifican las tres CDR de la región V_{L} de 425 de ratón y también contienen 12 bases en los extremos 5' y 3' diseñadas para hibridar con las secuencias de ADN que codifican para las FR humanas en la región V_{L} del D1.3 humano reformado (véanse los oligonucleótidos 7 a 9 en la tabla I). El injerto de la CDR se realiza como se describe en los ejemplos. Tras la secuenciación de ADN de los supuestos clones positivos en la selección, el rendimiento total del triple mutante es del 5 al 15%, preferiblemente del 9 al 10%. Una región V_{L} de 425 humana reformada que no contiene errores de PCR se clona como un fragmento HindIII-BamHI en el vector de expresión de la cadena ligera para crear el plásmido HCMV-RV_{L}a425-kappa (figura 1).

Los dos vectores de expresión portadores de las regiones V_{H} y V_{L} de 425 humanas reformadas después se utilizan para cotransfectar las células apropiadas (véase anteriormente) para buscar la expresión transitoria de un anticuerpo 425 humano reformado funcional. Después de aproximadamente 72 h, se recogen los sobrenadantes de las células y se ensayan por ELISA con respecto a la presencia de la IgG humana. La IgG humana puede detectarse a niveles que varían de 100 a 500 ng/ml, sin embargo, en el ensayo de ELISA para la unión al antígeno, la unión al EGFR es sorprendentemente indetectable. Cuando las células se cotransfectan con HCMV-RV_{L}a425-kappa/HCMV-CV_{H}425-gamma-1, se produce IgG humana y se une a EGFR. Sin embargo, cuando las células se cotransfectan con HCMV-CV_{L}425-kappa/HCMV-RV_{H}a425-gamma-1, se produce IgG humana pero no se une al EGFR a niveles detectables. A partir de estos resultados inesperados, está claro que son necesarias otras modificaciones ingeniosas en las FR de V_{H} de 425 humana reformada para conseguir un sitio de unión al antígeno funcional.

Modificaciones en las FR de la región V_{H} de 425 humana reformada

Se han hecho más cambios en las FR de la región V_{H} de 425 humana reformada basados en un modelo molecular de los dominios de la región variable de 425 de ratón. Se examinan los bucles de las CDR de la región V_{H} humana reformada para ver como encajan en las estructuras canónicas descritas por Chothia et al., 1989. Como resultado de este análisis, se realizan ciertos cambios en las FR. Se realizan otros cambios en las FR basándose en un anticuerpo anti-Tac humano reformado funcional que también se diseñó basándose en las FR humanas del subgrupo I (Queen et al., 1989). Sorprendentemente, la región V_{H} del anticuerpo anti-Tac de ratón tiene una identidad de aproximadamente el 79% con la región V_{H} del anticuerpo 425 de ratón. Ahora, de acuerdo con la invención, se realiza un modelo molecular de las regiones variables de 425 de ratón (figura 5). El modelo se basa en la estructura de HyHEL-5, un anticuerpo de estructura resuelta cuyas regiones variables muestran un alto grado de homología con las del anticuerpo 425 de ratón. Como resultado del análisis anterior, se cambian los restos aminoacídicos en las posiciones 30, 48, 67, 68 y 71 en la región V_{H} de 425 humana reformada para ser idénticos a los aminoácidos que existen en esas posiciones en la región V_{H} de 425 de ratón. Para analizar los efectos individuales de estos cambios, se construyen diferentes combinaciones de estos cambios y se ensayan de acuerdo con la invención.

En total, se construyen 8 nuevas versiones de la región V_{H} de 425 humana reformada (véase la figura 4). A partir de las versiones generadas por los métodos descritos con detalle en los ejemplos, se realizan otras versiones por recombinación de fragmentos de ADN pequeños procedentes de versiones previas. Una vez que se han ensamblado todas las versiones deseadas, preferiblemente en pUC18, las regiones V_{H} de 425 humanas reformadas se transfieren como fragmentos HindIII-BamHI al vector de expresión HCMV-V_{H}, generando de esta manera versiones "b" a "i" del plásmido HCMV-RV_{H}425-gamma-1 (figura 4).

Modificaciones en las FR de la región V_{L} de 425 humana reformada

Aunque las correspondientes células cotransfectadas con vectores que expresan la cadena ligera 425 humana reformada, versión "a", y la cadena pesada de 425 quimérica producen un anticuerpo que se une al EGFR, el anticuerpo con la cadena ligera de 425 humana reformada no parece unirse tan bien como el anticuerpo 425 quimérico. El examen de las regiones V_{L} de 425 de ratón y la versión "a" de 425 humano reformado revela que el resto 71, que forma parte de la estructura canónica de la CDR-1 (L1), no se mantiene en la versión "a" (Chothia et al., 1989). Para introducir un cambio de Phe a Tyr en esta posición preferiblemente se usa el método de mutagénesis por PCR (Kamman et al., 1989). El fragmento HindIII-BamHI generado a partir de esta mutagénesis se introduce en el vector de expresión HCMV-V_{L} para generar HMCV-RV_{L}b425-kappa (figura 4).

Análisis de las nuevas versiones de la región V_{H} de 425 humana reformada

Los vectores de expresión que contienen las versiones "a" a "i" de V_{H} humana reformada se utilizan para cotransfectar las células caracterizadas anteriormente con el vector de expresión que contiene la versión "a" de la región V_{L} humana reformada. Después de aproximadamente 3 días, se analizan los sobrenadantes de las células por ELISA para determinar la producción de IgG humana. Los niveles de producción varían entre 50 y 500 ng/ml. Las muestras después se analizan por ELISA para determinar la IgG humana capaz de unirse al EGFR. Las diferentes versiones de las regiones V_{H} humanas reformadas dan como resultado una gran diversidad de niveles de unión al antígeno (figura 6). En este ensayo ELISA para la unión al antígeno, los diversos anticuerpos 425 humanos reformados pueden compararse directamente con el anticuerpo 425 quimérico, pero no con el anticuerpo 425 de ratón. Esto se debe a que el anticuerpo usado para detectar la unión al antígeno es un anticuerpo anti-IgG humana. Las nueve versiones de la región V_{H} humana reformada pueden agruparse según su capacidad para unirse al EGFR. Las versiones "g" e "i" de la región V_{H} humana reformada proporcionan los niveles más altos de unión, seguidas de las versiones "c", "f" y "h", y luego seguidas de la versión "b". En algunos experimentos, la versión "e" proporciona niveles bajos, pero detectables, de unión. Las versiones "a" y "d" nunca proporcionan niveles detectables de unión.

Se usa un ensayo de unión competitiva para comparar directamente los anticuerpos 425 humanos reformados que contienen las versiones "g" e "i" de V_{H}, y el anticuerpo 425 quimérico, con el anticuerpo 425 de ratón (figura 7). Como los anticuerpos en los sobrenadantes de las células no están purificados y, por tanto, se cuantifican por ELISA, se considera que los resultados del ensayo de unión competitiva proporcionan niveles relativos de unión en lugar de una cuantificación exacta de la afinidad. Los ensayos de unión competitiva con muestras procedentes de cuatro experimentos realizados, por ejemplo, en células COS, proporcionan resultados consistentes con respecto a los niveles relativos de unión al antígeno. El anticuerpo 425 quimérico compite bien con el anticuerpo 425 de ratón marcado y proporciona un porcentaje de inhibición de la unión sólo ligeramente menor que el obtenido cuando el anticuerpo 425 de ratón sin marcar compite con el anticuerpo 425 de ratón marcado (figura 7, panel A). El anticuerpo humano reformado con V_{L}a y V_{H}g es mejor que el que tiene regiones V_{L}a y V_{H}i (figura 7, panel B). La comparación de los puntos de la meseta de las curvas de unión indica que el anticuerpo humano reformado con V_{H}g compite con el anticuerpo 425 de ratón marcado en un 60-80%, igual que el anticuerpo 425 de ratón sin marcar en el mismo ensayo. Cuando se promediaron los resultados usando muestras de cuatro experimentos independientes realizados, por ejemplo, en células COS o CHO, el anticuerpo humano reformado que contiene V_{L}a y V_{H}g proporciona una unión que es de un 60 a un 80% de la del anticuerpo 425 de ratón.

Basándose en estos resultados, es posible comentar las contribuciones relativas que hacen los restos individuales de las FR a la unión al antígeno. El cambio individual más significativo en este estudio es el cambio L71V. Sorprendentemente, sin este cambio no se detecta unión al antígeno (compárense las versiones "a" y "b" de V_{H}). Sorprendentemente, los cambios R67K y V68A también son importantes para la unión (compárense las versiones "b" y "c", y las versiones "i" y "h" de V_{H}). Aunque la introducción del cambio V48KI solo, y V48I y S30T juntos, no produce una unión al antígeno significativa, ciertos cambios en estas posiciones aumentan la unión al antígeno. Sorprendentemente, el cambio S30T parece tener un efecto mayor que el cambio V48I (compárense las versiones "g" e "i", y las versiones "f" e "i" de V_{H}).

Análisis de la nueva versión de la región V_{L} de 425 humana reformada

El vector de expresión que contiene el RV_{L}b425 se usa para cotransfectar células apropiadas, preferiblemente células eucariotas, con el vector de expresión que contiene las versiones "b", "c" o "g" de la región V_{H} humana reformada. Se recogen los sobrenadantes de las células y se ensayan con respecto a la producción de IgG humana y luego con respecto a la producción de IgG humana capaz de unirse al EGFR (figura 8, panel A). Estos resultados demuestran que la versión "b" de la región V_{L} de 425 humana reformada aumenta la unión al antígeno. Después se realiza un ensayo de unión competitiva para comparar los anticuerpos 425 humanos reformados con V_{L}a más V_{H}g y V_{L}b más V_{H}g con el anticuerpo 425 de ratón. El Mab 425 humano reformado con la versión "b" de la región V_{L} tiene mayor avidez por el antígeno. De esta manera, un cambio F71Y en la V_{L} aumenta la unión al antígeno. El Mab 425 humano reformado con V_{L}b y V_{H}g tiene una avidez por el antígeno que es de un 60 a un 80% de la del Mab 425 murino.

En otros experimentos, usando un anticuerpo humano reformado que contiene V_{L}b más V_{H}g (ejemplos 10, 11), se puede ver que la potencia de unión al EGFR es similar para los anticuerpos quimérico, reformado y murino.

La invención demuestra que ciertos cambios relativamente conservativos en los restos de las FR pueden influir fuertemente sobre la unión al antígeno.

El modelo molecular de regiones variables de 425 de ratón muestra claramente que este resto en posición 30 de la V_{H} está sobre la superficie de la molécula, en las proximidades de la CDR-1. De hecho, H1, como definen Chothia y Lesk, 1987, se extiende desde el resto 26 al 32, abarcando así el resto en posición 30. Cuando el resto en posición 30 se cambia de Ser a Thr en el anticuerpo CAMPATH-1H, no tiene ningún efecto sobre la unión al antígeno. Cuando la posición 30 se cambia de Ser a Thr en la V_{H}425 humana reformada, mejora la unión al antígeno. Parece ser que el aminoácido de la posición 30 juega un papel en la unión al antígeno en esta interacción antígeno-anticuerpo particular. Como el cambio S30T sólo mejora la unión al antígeno ligeramente y puesto que el cambio no es esencial para la unión al antígeno, la Thr en posición 30 tiene sólo una débil interacción con el antígeno.

El cambio de resto en la posición 71 en V_{H} afecta fuertemente a la unión al antígeno. Esto es sorprendente, ya que los dos restos ensayados en esta posición, Val y Leu, sólo se diferencian en un grupo metilo. H2 del anticuerpo 425 de ratón es un miembro de las estructuras canónicas del grupo 2, H2, definidas por Chothia et al., 1989. HyHEL-5 tiene un H2 con una secuencia de aminoácidos similar a la del H2 del anticuerpo 425 de ratón. En HyHEL-5, una Pro en la posición 52A de la CDR-2 se empaqueta en una cavidad creada por el aminoácido pequeño (Ala) en la posición 71 de las FR. En el modelo de regiones variables de 425 de ratón, hay una interacción similar entre la Pro-52A y la Val-71. Aunque en la V_{H} de 425 de ratón la Pro de la posición 52A es capaz de empaquetarse en la cavidad creada por la Val de la posición 71, la sustitución de Val-71 por Leu provoca un choque molecular que podría alterar la conformación del bucle de CDR-2. Por esta razón, el cambio V71L en la V_{H} de 425 humana reformada vuelve a crear de nuevo la interacción CDR-2-FR como ocurre en la V_{H} de 425 de ratón. Esto, sorprendentemente, mejora en gran medida las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos 425 humanos reformados (compárense los anticuerpos humanos reformados con las versiones "a" y "b" de V_{H} en la figura 6).

El cambio en la posición 71 de V_{L} probablemente afecta a la conformación de las CDR, porque el resto 71 es un miembro de la estructura canónica propuesta para L1 (CDR-1) (Chothia et al., 1989). El resto 29 en la CDR-1 es un resto oculto y tiene contacto con el resto 71 en las FR. En el anticuerpo 425 de ratón, el resto 71 en V_{L} es Tyr. En las FR humanas usadas para construir las V_{L} humanas reformadas es una Phe. Parece ser que el grupo hidroxilo que se encuentra en Tyr, pero no en Phe, juega un papel en el mantenimiento de la conformación correcta de CDR-1.

A partir del modelo molecular de las regiones variables de 425 de ratón, parece ser que la Lys-66 forma un puente salino con Asp-86. La introducción de un resto de Arg más grande en la posición 66 rompería la estructura. La Ala-67 puede interaccionar con la CDR-2 y, cambiando simultáneamente los restos 66 y 67 por Arg y Val, como en V_{H}a425, se podría tener un efecto estérico adverso sobre la CDR-2. Se sabe que el resto en la posición 48 está oculto (Chothia y Lesk, 1987), y el modelo confirma esto. Cambiando el resto 48 de una Ile, como se encuentra en el anticuerpo 425 de ratón, a una Val, como se encuentra en las regiones V_{H} humanas del subgrupo I, podría verse afectada la unión al antígeno, generalmente, por la ruptura de la estructura. El aminoácido en la posición 48 también está cerca de la CDR-2 y puede tener un efecto estérico sutil sobre el bucle de la CDR-2.

Según los estudios de unión competitiva, las mejores regiones V_{L} y V_{H} humanas reformadas son V_{L}b y V_{H}g. V_{H}g tiene los 5 cambios de FR discutidos anteriormente más el cambio en la posición 94 que se incluye en la primera versión de la región V_{H} de 425 humana reformada. Las FR de la versión "b" de la región V_{L} de 425 humana reformada tienen una identidad del 70% con las de la región V_{L} de 425 de ratón. Las FR de la versión "g" de la región V_{H} de 425 humana reformada tienen una identidad del 80% con las de ratón.

Uso diagnóstico y terapéutico de los anticuerpos

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden administrarse a pacientes humanos para terapia o diagnóstico de acuerdo con procedimientos conocidos. Típicamente, el anticuerpo, o los fragmentos de anticuerpo, se inyectará por vía parenteral, preferiblemente por vía intraperitoneal. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales de la invención también pueden administrarse por vía intravenosa.

La determinación de las titulaciones apropiadas de anticuerpos a administrar está bien dentro de la experiencia en la técnica. Generalmente, los intervalos de dosificación para la administración de los anticuerpos monoclonales de la invención son suficientemente grandes para producir el efecto supresor del tumor deseado. La dosis no debe ser demasiado grande como para producir efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, el estado, el sexo y el grado de la enfermedad en el paciente, y puede determinarse por un especialista en la técnica. El médico individual puede ajustar la dosis en caso de cualquier contraindicación, tolerancia inmune o situaciones similares. La dosis puede variar de 0,1 mg/kg a 70 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 500 mg/kg/dosis, administrados en una o más dosis diarias durante uno o varios días.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos o tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, solución de Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen líquidos y suministros de nutrientes, suministros de electrólitos, tales como los basados en la solución de Ringer con dextrosa, y similares. Pueden también estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes, y similares.

Los anticuerpos pueden conjugarse con una toxina, tal como la subunidad A de la ricina, la toxina diftérica, o con un enzima tóxico. Como alternativa, pueden marcarse radiactivamente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Sin embargo, el anticuerpo de la presente invención manifiesta una excelente citotoxicidad en ausencia de toxinas y en presencia de las células efectoras, es decir, monocitos humanos.

Los tumores sólidos que pueden detectarse y tratarse usando los presentes métodos incluyen melanomas, gliomas y carcinomas. Las células cancerosas que no expresan niveles altos de receptores de EGF pueden ser inducidas a hacerlo usando preparaciones de linfoquinas. Las preparaciones de linfoquinas también pueden originar una expresión más homogénea de receptores de EGF entre las células de un tumor, proporcionando una terapia más eficaz.

Las preparaciones de linfoquinas adecuadas para su administración incluyen interferón gamma, factor de necrosis tumoral y combinaciones de éstos. Éstas pueden administrarse por vía intravenosa. Las dosis adecuadas de linfoquinas son de 10.000 a 1.000.000 de unidades/paciente.

Con fines de diagnóstico, el anticuerpo puede conjugarse con un colorante radiopaco o se puede marcar radiactivamente. El método de marcaje preferido es el método del Iodogen (Fraker et al., 1978). Preferiblemente, el anticuerpo se administrará como fragmentos F(ab')_{2} con fines diagnósticos. Esto proporciona resultados superiores, de forma que no se necesita restar el efecto de fondo. Los fragmentos pueden prepararse por métodos conocidos (por ejemplo, Herlyn et al., 1983). Generalmente se realiza una digestión con pepsina a pH ácido y los fragmentos se separan de la IgG sin digerir y de los fragmentos de cadena pesada mediante cromatografía en Proteína A-Sepharose®.

Los anticuerpos 425 humanos reformados de acuerdo con la invención tienen una menor probabilidad de desencadenar una respuesta inmune en humanos que los de ratón o los quiméricos. La avidez de la mejor versión del anticuerpo 425 humano reformado equivale a la del anticuerpo 425 de ratón o quimérico en las mejores realizaciones de la invención. Los estudios de unión demuestran que la potencia para competir con EGF por la unión al EGFR en condiciones optimizadas es la misma para los anticuerpos quimérico, reformado y murino. Además, los anticuerpos 425 humanos reformados son más eficaces, cuando se usan terapéuticamente en humanos, que los anticuerpos 425 de ratón o quiméricos. Debido a la gran reducción de la inmunogenicidad, el anticuerpo 425 humano reformado tiene una vida media más larga en humanos y es el que tiene menos probabilidad de desencadenar cualquier respuesta inmune adversa en el paciente humano.

Los resultados del Mab 425 definido demuestran que anticuerpos monoclonales humanizados que tienen una secuencia consenso artificial no llevan a cabo una respuesta mínima destacable. Anteriormente, en el párrafo: Resumen de la Invención, se describen otras ventajas.

Por tanto, el valor de los nuevos anticuerpos de la invención con fines terapéuticos y de diagnóstico es extraordinariamente alto.

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Ejemplo 1 Secuenciación de la clonación molecular

Se aisló ARN total a partir de la línea celular W425-15 (ATCC HB 9629) que produce el Mab 425. Se usaron aproximadamente 9,6 x 10^{7} células para producir ARN total usando el método de guanidinio-CsCl (Chirgwin et al., 1979). Los sobrenadantes de las células usadas para el aislamiento del ARN total se ensayaron por ELISA para asegurarse de que las células producían el Mab correcto en altas cantidades. Se preparó ARN poli(A^{+}) (Aviv y Leder, 1972). Se sintetizó ADNc bicatenario esencialmente de acuerdo con los métodos de Gubler y Hoffman (1983) con la excepción de que se usaron cebadores homólogos a las regiones 5' de las regiones constantes kappa y gamma-2a de inmunoglobulinas de ratón para cebar la síntesis de la primera cadena (Levy et al., 1987). El diseño del cebador de la cadena ligera fue un 26-mero (oligonucleótido 1, tabla I) que se diseñó basándose en datos publicados (Levy et al., 1987; Kaariten et al., 1983). El diseño del cebador de la cadena pesada fue un 25 mero (oligonucleótido 2, tabla I) y se diseñó basándose en datos publicados (Kaariten et al., 1983; Kabat et al., 1987). Los cebadores se diseñaron y sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380B y se purificaron en geles de urea y acrilamida. Después de la síntesis de la segunda cadena, se clonaron los ADNc de extremos romos en pUC18 digerido con SmaI (disponible en el mercado) y se usaron para transformar células E. coli competentes, por ejemplo DH5-alfa (disponibles en el mercado). Las colonias se sembraron sobre placas de agar y se seleccionaron por hibridación usando cebadores para la síntesis de la primera cadena marcados con ^{32}P (Carter et al., 1985). La secuenciación del ADN plasmídico bicatenario se realizó usando Sequenase (United States Biochemical Corporation).

Ejemplo 2 Construcción de genes quiméricos

Para cada región variable se sintetizó un cebador 5' directo y 3' inverso para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (oligonucleótidos 3-6, tabla I). Las reacciones de PCR se establecieron usando 1 ng de ADN del plásmido pUC18 que contenía el ADNc clonado, los cebadores para PCR directo e inverso a una concentración final de 1 \muM cada uno, 200 \muM de cada dNTP, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM y 0,01% (p/v) de gelatina. Se añadió ADN polimerasa de Amplitaq (Perkin Elmer Cetus) a 2,5 unidades por ensayo. Después de una fusión inicial a 94ºC durante 1,5 min, se realizaron 25 ciclos de amplificación a 94ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min y 72ºC durante 3 min. Se llevó a cabo durante 10 min una etapa de extensión final a 72ºC. Las reacciones de PCR se extrajeron dos veces con fenol/cloroformo, y se precipitaron con etanol antes de digerir con HindIII y BamHI. El fragmento de PCR que codificaba para las regiones V_{L} o V_{H} después se clonó en un vector de expresión. Este vector contiene el potenciador y el promotor del HCMV (citomegalovirus humano), el gen neo bacteriano y el origen de replicación de SV40. Un fragmento BamHI de 2,0 kb de ADN genómico que codifica para la región constante gamma-1 humana (Takahashi et al., 1982) se insertó en la orientación correcta cadena abajo del fragmento de la región V_{H} (véase HCMV-CV_{H}425-gamma-1 en la figura 1). Este vector posteriormente se adaptó eliminando el sitio BamHI en el extremo 3' del fragmento de la región constante, permitiendo así a las regiones variables insertarse directamente en el vector de expresión de la cadena pesada como fragmentos HindIII-BamHI (Maeda et al., 1991). El fragmento que codificaba par la región V_{L} se insertó en un vector de expresión de HCMV similar, en este caso que contenía un fragmento BamHI de ADN genómico, de un tamaño de aproximadamente 2,6 kb, que codificaba para la región constante kappa humana y que contenía un sitio aceptor de ayuste y un poli(A^{+}) (Rabbitts et al., 1984) (véase HCMV-CV_{L}-425-kappa en la figura 1).

Ejemplo 3 Creación del modelo molecular de V_{L} y V_{H} del Mab 425

Se construyó un modelo molecular de las regiones variables del Mab 425 murino sobre la estructura resuelta del anticuerpo anti-lisozima altamente homólogo, HyHEL-5 (Sheriff et al., 1987). Las regiones variables del Mab 425 y HyHEL-5 tienen una homología de aproximadamente un 90%.

El modelo se construyó en una estación de trabajo Silicon Graphics Iris 4D en UNIX y usando el paquete de creación de modelos moleculares "QUANTA" (Polygen Corp.). Se conservaron restos idénticos en la región flanqueante; los restos no idénticos se substituyeron usando el máximo solapamiento (Snow y Amzel, 1986) incorporado en la instalación de modelado de proteínas de QUANTA. La conformación de la cadena principal de los tres restos N-terminales en la cadena pesada se sustituyó a partir de una estructura de un anticuerpo homólogo (HyHEL-10 (Padlan et al., 1989)) ya que sus factores de temperatura eran anormalmente altos (mayores que la media más tres desviaciones típicas de los factores de temperatura del esqueleto) y ya que afectan al empaquetamiento de la CDR-3 de V_{H} (H3) (Martin, 1990).

Las secuencias de CDR-1 (L1) y CDR-2 (L2) de la región V_{L} y las secuencias de CDR-1 (H1) y CDR-2 (H2) de la región V_{H} del Mab 425 correspondían a formas canónicas postuladas por Chothia et al., (1989). Los principales ángulos de torsión de la cadena de estos bucles se mantuvieron como en HyHEL-5. La secuencia de CDR-3 (L3) de la región V_{L} y la secuencia de CDR-3 (H3) de la región V_{H} del Mab 425 no correspondían a estructuras canónicas y, por lo tanto, se modelaron de una forma diferente. Se usó el programa de ordenador de Martin et al. (1989) para extraer bucles del banco de datos de Brookhaven (Bernstein et al., 1977). Los bucles después se clasificaron basándose en la similitud de secuencia, energía y restos determinantes de estructura (Sutcliffe, 1988). Los bucles principales se examinaron en los gráficos y el mejor se seleccionó a simple vista. H3 se modeló sobre la glutatión peroxidasa bovina (Epp et al., 1983) en la región de los restos 92 a 103. L3 se modeló sobre el fragmento Fab de la IgA murina (J539) (Suh et al., 1986) en la región de los restos 88 a 96 de la cadena ligera.

El modelo se sometió a los descensos más pronunciados y a minimización de los gradientes de energía del conjugado usando un potencial de CHARm (Brooks et al., 1983) como se lleva a cabo en QUANTA con el fin de liberar los contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones de Van der Waals y electrostáticas.

Ejemplo 4 Construcción de los genes del anticuerpo humanizado

La construcción de la primera versión de la cadena ligera de 425 humana reformada se realizó usando una estrategia de injerto de CDR similar a la descrita por Reichmann et al. (1988) y Verhoeyen et al. (1988). El molde de ADN monocatenario se preparó a partir de un vector M13mp18 (disponible en el mercado) que contenía un fragmento HindIII-BamHI que codificaba para la región V_{L} de anti-lisozima humana (documento EP 239 400, G. Winter). Las FR de esta cadena ligera derivan de la proteína REI resuelta cristalográficamente. Se diseñaron tres oligonucleótidos que contenían secuencias de ADN que codificaban cada una de las CDR de la cadena ligera del Mab 425 de ratón flanqueadas en cada extremo por 12 bases de ADN complementario a las secuencias de ADN que codificaban las FR adyacentes de REI humana (oligonucleótidos 7 a 9 en la tabla I). Los oligonucleótidos se sintetizaron y se purificaron como se ha indicado anteriormente. Los tres oligonucleótidos se fosforilaron y se usaron simultáneamente en un sistema de mutagénesis in vitro dirigida a oligonucleótidos basado en los métodos de Eckstein y colaboradores (Taylor et al., 1985; Nakamaye y Eckstein, 1986; y Sayers et al., 1988). Se siguieron las instrucciones del fabricante a través de la etapa de digestión con exonucleasa III. Después, la reacción se extrajo con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en 100 \mul de TE. Se usó un volumen de 10 \mul como molde de ADN en una reacción de amplificación de PCR de 100 \mul que contenía el cebador universal de M13 y el cebador de secuenciación inversa a una concentración final de 0,2 \muM cada uno. El tampón y las condiciones de termociclado fueron como se describe en el ejemplo 2 con la excepción de que se usó una temperatura de hibridación de 55ºC. La reacción de PCR se extrajo con fenol/cloroformo dos veces y se precipitó con etanol antes de la digestión con HindIII y BamHI, y se subclonó en pUC18. Los supuestos clones positivos se identificaron por hibridación con cebadores mutagénicos marcados con ^{32}P (Carter et al., 1987). Mediante secuenciación se confirmaron los clones positivos. Una región V_{L} que contenía las tres CDR injertadas se clonó como un fragmento HindIII-BamHI en el vector de expresión de V_{L} para crear el plásmido HCMV-RV_{L}a425-kappa.

La versión "b" de la V_{L} reformada se construyó usando el método de mutagénesis por PCR de Kammann et al. (1989), con pocas modificaciones. El molde de ADN fue el RV_{L}a subclonado en pUC18. La primera reacción de PCR se estableció en un volumen total de 50 \mul y que contenía 1 ng de molde, cebador de secuenciación inversa de M13 y cebador 10 (tabla I) a una concentración final de 1 \muM, dNTP 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM y 0.01% (p/v) de gelatina. Se añadió ADN polimerasa de Amplitaq a una concentración de 1 unidad por ensayo. La reacción se estableció por triplicado. Tras la fusión a 90ºC durante 1,5 min, se hicieron ciclos de reacciones de 1 min a 94ºC, 1 min a 37ºC y 2 min a 72ºC durante 40 ciclos, seguidos de una extensión a 72ºC durante 10 min. Las reacciones se juntaron, se extrajeron con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol antes de aislar el producto de la PCR de un gel de agarosa TAE. Se usó un décimo de la primera reacción de PCR como uno de los cebadores en la segunda reacción de PCR. La segunda reacción fue como la primera con la excepción de que se usó el primer producto de la reacción y 20 pmoles de cebador universal de M13. Los ciclos fueron como describen Kammann et al. (1989). El fragmento HindIII-BamHI se clonó en pUC18 y se secuenció. Se subclonó un fragmento de ADN que llevaba el cambio deseado en el plásmido de expresión de V_{L} para crear el plásmido HCMV-RV_{L}b425-kappa.

La primera versión de la región V_{H} humana reformada del 425 se sintetizó químicamente. Se diseñó una secuencia de ADN que codificaba la secuencia de aminoácidos requerida y que contenía las secuencias de ADN flanqueantes necesarias (véase anteriormente). El uso de codones se optimizó para células de mamífero con sitios para enzimas de restricción útiles introducidos por ingeniería genética en las secuencias de ADN que codificaban las FR. Se sintetizaron las 454 pb y se subclonaron en pUC18 como un fragmento EcoRI-HindIII. El fragmento HindIII-BamHI que codificaba para la cadena pesada de 425 humanizada reformada después se transfirió al vector de expresión de V_{H} para producir el plásmido HCMV-RV_{H}a-425-gamma-1.

Se construyeron otras ocho versiones de las cadenas pesadas humanizadas reformadas por una diversidad de métodos. El fragmento HindIII-BamHI que codificaba la versión "a" de la cadena pesada se transfirió a M13mp18 y se preparó ADN monocatenario. Usando los oligonucleótidos 11 a 13 (tabla I), se usó mutagénesis de M13 adaptada a PCR, como se ha descrito anteriormente, para generar ADN que codificara para las versiones "d", "e", "f" y "g" de las regiones V_{H} de 425 humanas reformadas en pUC18. Estas versiones se subclonaron en el vector de expresión de la cadena pesada como fragmentos HindIII-BamHI para crear los plásmidos HCMV-RV_{H}d425-gamma-1, HCMV-RV_{H}e425-gamma-1, HCMV-RV_{H}f425-gamma-1 y HCMV-RV_{H}g425-gamma-1.

Las versiones "b" y "c" de las regiones V_{H} de 425 humanas reformadas se generaron usando el método de mutagénesis por PCR de Kammann et al. (1989) como se ha descrito anteriormente. El ADN molde fue la versión "a" de la región V_{H} de 425 humana reformada subclonado en pUC18, y el cebador mutagénico usado en la primera reacción de PCR fue el cebador 13 o el 14 (tabla I). Tras la mutagénesis y secuenciación, las secuencias que llevaban los cambios deseados se subclonaron en el plásmido de expresión de la cadena pesada para crear los plásmidos HCMV-RV_{H}b425-gamma-1 y HCMV-RV_{H}c425-gamma-1.

Las versiones "h" e "i" de las cadenas pesadas reformadas se construyeron a partir de los clones basados en pUC de versiones existentes. Un fragmento HindIII-XhoI de 0,2 kb de la versión "e" se unió a un fragmento XhoI-HindIII de 2,8 kb de la versión "b" o "c" produciendo las nuevas versiones "h" e "i", respectivamente. Los fragmentos HindIII-BamHI que codificaban estas versiones se subclonaron en el vector de expresión de la cadena pesada para producir HCMV-RV_{H}h425-gamma-1 y HCMV-RV_{H}i425-gamma-1.

Ejemplo 5 Transfección de ADN en células COS

Se sometieron a electroforesis células COS con 10 \mug de cada uno de los vectores de expresión que llevaban los genes que codificaban las cadenas pesada y ligera. En resumen, se añadieron 10 \mug de cada plásmido a una alícuota de 0,8 ml de una suspensión de 1 x 10^{7} células/ml de células COS en PBS. Se usó un Bio-Rad™ Gene Pulser para suministrar un pulso de 1.900 V, con una capacitancia de 25 \muF. Se dejó que las células se recuperaran a temperatura ambiente durante 10 min antes de ponerlas en placas en 8 ml de DMEM que contenía un 10% de suero de ternero fetal. Tras 72 h de incubación, se recogió el medio, se centrifugó para eliminar los restos celulares y se almacenó en condiciones estériles a 4ºC durante cortos períodos de tiempo, o a -20ºC durante períodos más largos, antes del análisis por ELISA.

Ejemplo 6

La transfección de ADN en células CHO se realizó de acuerdo con el ejemplo 5.

Ejemplo 7 Cuantificación de la producción de IgG y detección de la unión al antígeno

Se detectó la presencia de IgG humana en sobrenadantes de células COS mediante ELISA: en el ensayo ELISA para la IgG humana, se cubrieron placas de 96 pocillos con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana (molécula completa) y se detectó la IgG humana presente en las muestras que se había unido a las placas usando un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina (específico de la cadena gamma). Como patrón se usó una IgG humana purificada comercial. La unión al antígeno reconocido por el Mab 425 se determinó en un segundo ELISA. Se recubrieron placas con una preparación de la proteína EGFR (que se puede obtener, por ejemplo, de acuerdo con Rodeck et al., 1980) y se detectaron los anticuerpos que se unían a EGFR usando un anticuerpo anti-IgG humana (específico de la cadena gamma) conjugado con peroxidasa (para los anticuerpos quimérico y humano reformado) o un anticuerpo anti-IgG de ratón (molécula completa) conjugado con peroxidasa (para el anticuerpo Mab 425 de ratón) (ambos conjugados suministrados por Sigma). Como patrón se usó el Mab 425 murino purificado.

Ejemplo 8 Ensayos de unión competitiva

El Mab 425 murino se biotiniló usando un kit comercial correspondiente. Se recubrieron placas ELISA con una dilución óptima de la proteína EGFR. Se mezclaron diluciones de los sobrenadantes de células COS, en un volumen de 50 \mul, con 50 \mul del Mab 425 murino biotinilado (por ELISA se estimó que tenía una concentración de 1,75 \mug/ml). Cada uno de los sobrenadantes de las células COS se ensayó por duplicado. Las placas se incubaron a temperatura ambiente, durante una noche. El Mab 425 murino biotinilado unido se detectó mediante la adición de un complejo de estreptavidina peroxidasa de rábano picante comercial. Un control sin competidor presente permitió obtener un valor del porcentaje de inhibición o bloqueo, que se calculó para cada sobrenadante de células COS como sigue:

100 -- [(OD_{450} de la muestra/OD_{450} del control x 100]

Ejemplo 9

Se analizaron diferentes sondas de los Mab 425 murino, reformado y quimérico por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de acuerdo con Laemmli et al. Se aplicaron 2,5 \mug de cada muestra a cada pocillo en condiciones reductoras y no reductoras. La proteína se visualizó mediante la tinción con Coomassie. La fig. 9 (A) demuestra que las muestras tenían una pureza similar.

Intervalo de pesos moleculares de los anticuerpos: 180.000 a 200.000.

Ejemplo 10

El Mab 425 reformado se purificó por exclusión molecular en Superose 12™ (Pharmacia Corp. Suiza) de acuerdo con métodos convencionales. El anticuerpo se eluyó con PBS (pH 7,4, NaCl 0,8 M) (0,1 M). Se puede obtener un solo pico (a los 5 min) (fig. 9 (B)).

Ejemplo 11

Se usó el Mab 425 marcado con biotina para competir con el Mab 425 o derivados sin marcar por la unión al EGFR. El marcaje con biotina se realizó de acuerdo con métodos convencionales. El EGFR se solubilizó a partir de membranas de A431 por métodos convencionales. Las células A431 se adquirieron comercialmente. La detección se realizó después de la incubación con estreptavidina conjugada con POD y substrato. A partir de estos datos se construyeron curvas de inhibición (figura 10). Las curvas demuestran que las uniones de los diversos anticuerpos son comparables.

Ejemplo 12

Se ensayó la potencia para competir con EGF de diferentes sondas de Mab 425 murino, quimérico y reformado con respecto a su unión a EGFR. El ensayo se realizó por competición del EGF marcado con ^{125}I (Amersham Corp., GB) y diversos anticuerpos por la unión a membranas positivas para el receptor-EGF (A431). El sistema de ensayo se basa en la tecnología SPA (Amersham). Las curvas de competición de los anticuerpos murino y reformado (3 sondas) son casi idénticas (figura 11).

Claims (10)

1. Un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene la capacidad de unirse a receptores de EGF humano e inhibir la unión de EGF a dichos receptores, constando cada cadena ligera y pesada de una región de unión al antígeno (CDR) específica de origen no humano, una región flanqueante (FR) variable de origen humano y una región constante de origen humano, donde

(i) la región CDR de la cadena ligera comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

11

(ii) la región CDR de la cadena pesada comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

12

(iii) la región FR de la cadena ligera comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

13

(iv) la región FR de la cadena pesada comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

14

donde

Xaa_{1} es Tyr o Phe, y

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Ser, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala, o

Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Val, Xaa_{4} es Arg y Xaa_{5} es Val.

2. Un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, donde

Xaa_{1} es Tyr, Xaa_{2} es Thr, Xaa_{3} es Ile, Xaa_{4} es Lys y Xaa_{5} es Ala.

3. Un anticuerpo monoclonal humanizado de la reivindicación 1 ó 2, donde la región constante de la cadena ligera contiene la secuencia de aminoácidos de una cadena kappa de una inmunoglobulina humana y la región constante de la cadena pesada contiene la secuencia de aminoácidos de una cadena gamma-1 de una inmunoglobulina humana.

4. Un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica las regiones variable y constante de la cadena pesada y/o de la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica las regiones variable y constante de la cadena ligera de un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a los receptores del EGF humano y de inhibir la unión de EGF a dichos receptores, teniendo dicho vector la designación pRVL425 depositado en el DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) con el número de acceso DSM 6340.

6. Un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica las regiones variable y constante de la cadena pesada de un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a los receptores del EGF humano y de inhibir la unión de EGF a dichos receptores, teniendo dicho vector la designación pRVH425 depositado en el DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) con el número de acceso DSM 6339.

7. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Un proceso para la preparación de un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene la capacidad de unirse a los receptores del EGF humano y de inhibir la unión del EGF a dichos receptores, mediante la transformación de células hospedadoras con un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, el cultivo de dichas células hospedadoras transformadas en un medio de cultivo y la purificación y aislamiento de las proteínas de anticuerpo expresadas.

9. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la fabricación de un medicamento dirigido contra tumores.