CZ333796A3 - Chimérická monoklonální protilátka, expresní vektory a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Chimérická monoklonální protiláf farmaceutický prostředek I

Oblast techniky

Vynález se týká nových chimérických monoklonálních protilátek, které obsahují umělou modifikovanou konvenční sekvenci, přinejmenším úseků základní struktury ve variabilní oblasti těžkého řetězce humánních imunoglobulinů.

Vynález se dále týká chimérických monoklonálních protilátek, které se vážou k epitopům epidermálního růstového faktoru. Vynález zveřejňuje sekvence aminokyselin odpovídajícího místa, vázajícího antigen pro tento receptor.

Dále se vynález týká farmaceutických přípravků, které obsahují tyto protilátky. Tyto farmaceutické přípravky se hodí pro léčbu nádorů, jako jsou melanomy, gliomy a karcinomy. Protilátek podle vynálezu je také možno používat při diagnostických aplikacích, při nichž se zjišňuje povaha a umístění těchto nádorů in vitro nebo in vivo.

V popisu se používá několika technických termínů, které budou nyní vysvětleny:

Pod pojmem humanizované protilátky se rozumějí protilátky, které obsahují úseky základní struktury variabilních oblastí a konstantních oblastí aminokyselin, umístěných v lehkém a těžkém řetězci, které pocházejí z humánních zdrojů. Naproti tomu, jejich hypervariabilní oblasti pocházejí z nehumánních zdrojů.

Pod pojmem chimérické protilátky se rozumějí protilátky, obsahující variabilní a hypervariabilní oblasti, které pocházejí z nehumánních zdrojů, zatímco jejich konstantní oblasti jsou humánního původu.

Úseky základní struktury protilátky jsou v dalším textu označovány zkratkou FRs (framework regions). FRs se nacházejí ve variabilních oblastech. V těchto oblastech dochází k určité alteraci aminokyselin.

Zkratkou CDRs (complementarity determining regions) se označují oblasti,určující komplementaritu či hypervariabilní oblasti protilátky. CDRs se nalézají ve variabilních oblastech. Tyto oblasti představují specifické místo vázající antigen a vykazují nesmírně velkou výměnu aminokyselin. CDRs jsou především zodpovědné za vazebnou afinitu antigenú.

Pod pojmem konvenční sekvence se rozumí sekvence aminokyselin, která se nevyskytuje v přírodě, jako variabilní oblasti lehkého nebo těžkého řetězce. Konvenční sekvence se používá jako náhrady za původně přítomné variabilní oblasti nehumánního těžkého nebo lehkého řetězce. Konvenční sekvence je syntetická a jedná se tedy o umělou sekvenci nejběžnějších aminokyselin určité třídy nebo podtřídy, či podskupiny těžkých nebo lehkých řetězců humánních imunoglobulinů.

Zkratkou EGF se označuje epidermální růstový faktor a zkratkou EGFR se označuje receptor epidermálního růstového faktoru.

Pod pojmem V_L oblasti se rozumějí variabilní oblasti lehkého řetězce.

Pod pojmem V_H oblasti se rozumějí variabilní oblasti těžkého řetězce.

Dosavadní stav techniky

Monoklonální protilátka z Muridae 425 (MAb 425) byla vypěstována proti humánní buněčné linii karcinomu A431 a zjistilo se, že se váže k polypeptidovému epitopů na vnější doméně receptoru humánního epidermálního růstového faktoru (EGFR). Tato protilátka inhibuje vazbu epidermálního růstového faktoru (EGF)^ na místech EGFR jak s nízkou, tak s vysokou afinitou (Murthy a další (1987), Arch. Biochem. Biophys. 252,

549). Ke zvýšené expresi EGFR dochází u maligní tkáně různého původu, což činní z MAb 425 možnou látku pro diagnostiku a léčbu humánních nádorů. Skutečně se zjistilo, že MAb 425 vykazuje cytotoxicitu vůči nádorům in vitro a potlačuje růst nádorových buněk z buněčných linií, odvozených od epidermoidního a colorectálního karcinomu in vitro (Rodeck a další (1987) , Cancer Res. 47, 3 692). Také bylo prokázáno, že se MAb 425, značená radioizotopem, váže ke xenoroubům humánních maligních gliomů u myší (Takahashi a další (1987), Cancer Res. 47, 3 847).

EGF je polypeptidovým hormonem, který je mitogenní pro epidermální a epithelové buňky. Při interakci EGF se senzitivními buňkami dochází k jeho vazbě na membránové receptory; komplexy receptor-EGF se shlukují a potom jsou pojmuty do endocytotických váčků. Tím dochází k úkazu, označovanému termínem regulace směrem dolů (down-regulation). Vazba EGF indukuje tyrosin kiná|ovou aktivitu receptorové molekuly a indukuje syntbézu DNA.

Receptor EGF je transmembránovým glykoproteinem o velikosti přibližně 170 000 Dalton (Cohen (1982), J. Biol. Chem. 258,

1523) . Je genovým produktem c-erb-B proto-onkogenu (Downward a další, Nátuře, sv. 307, strana 521 až 527, 1984). Tento receptor se vyskytuje ve dvou kinetických formách, které jsou označovány jako receptor s nízkou afinitou a receptor s vyso4 kou afinitou.

Buněčná linie karcinomu A431 exprimuje na povrchu svých buněk velké množství receptorů EGF, a proto jí bylo použito při mnoha studiích pro tvorbu protilátek anti-EGF-receptor. Receptory na A 431 se však liší od receptorů na jiných typech buněk v uhlovodíkových zbytcích, které jsou připojeny k polypeptidu. Mnohé protilátky, vypěstované proti membránám A431, jsou proto zaměřeny proti uhlovodíkům, které nejsou společné pro všechny formy receptorových molekul (viz například Schreiber (1983) J. Biol. Chem., 258, 846).

Jiné monoklonální protilátky jsou reaktivní vůči proteinovému zbytku receptorů EGF. Při vazbě k receptorům EGF vykazují tyto protilátky různé vlastnosti, o nichž se předpokládá, že jsou závislé na konkrétní části vázané receptorové molekuly a na i/fotypu protilátky. Některé protilátky napodobují některé účinky EGF (agonisty) a některé tyto účinky inhibují (antagonisty) .

V průběhu růstu nádoru se předpokládá exprese receptorů EGF. Zjistilo se, že gen pro tyto receptory je buněčným analogem ptačího virového onkogenů v-erb-B (Ulrych a další (1984), Nátuře, 309, 418). Kromě toho bylo nalezeno spojení mezi pozdními stadii vývoje melanomu a kopiemi, navíc^chromo^omu, nesoucího receptorový gen (Koprowski a další, Somatic Cell and Molecular Genetice, sv. 11, str. 297 až 302, 1985) .

Jelikož receptory EGF jsou exprimovány v celé řadě tuhých nádorů, poskytují vhodný cíl pro protinádorovou léčbu. Existuje však nutnost nalézt vhodnou protireceptorovou protilátku. Mnohé ze známých protilátek mají vlastnosti, které by při jejich použití jako protinádorových činidel byly škodlivé. Tak například protilátky, které napodobují účinky EGF, by mohly stimulovat růst nádorů, místo aby jej zastavovaly. Jiné protilátky, které se vážou k receptorům s vysokou nebo nízkou afinitou, by mohly mít účinnost nižší, než je účinnost optimální, poněvadž EGF by ještě mohl projevovat svůj účinek prostřednictvím nevázaných receptorů. Ještě další protilátky mění receptory s nízkou afinitou na receptory s vysokou afinitou, což by mohlo mít za následek výrazné posílení růstu nádoru namísto jeho inhibice. Existuje tedy v tomto oboru potřeba nalézt protilátku proti receptorů EGF, která by byla vhodná pro protinádorovou léčbu.

Protilátek MAb (z Muridae) se sice používalo pro léčbu lidí, vyvolávaly však imunologickou odpověd (Giorgi a další, /1983/ Transplant. Proč. 15, 639; Jaffers a další, /1986/, Transplantation 41, 572). Pro překonání tohoto problému se několik skupin snažilo humanizovat protilátky z Muridae.

Přitom lze použít dvou přístupů. Jednak lze domény z konstatníúh oblasti jak v lehkém, tak v těžkém řetězci Muridae nahradit humái?ími konstantními oblastmi. Takové chimérické murinohumánní protilátky byly úspěšně zkonstruovány z několika murinních protilátek,zaměřených proti antigenům, které jsou spojeny s humánními nádory (Sun a další /1987/,Proč. Nati.

Acad. Sci. USA , 84, 214;Whittle a další /1987/, Protein Eng., 1, 499; Liu a další /1987/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA,

84, 3439; Gillies a Wesolowski /1990/, Hum. Antibod. Hybridomas 1, 47) . Při tomto přístupu se úplně zachová místo, vázající antigen murinní protilátky a tedy i afinita pro antigen, a současně se dodají humánní i|íotypové a efektorové funkce.

Při druhém přístupu se pouze roubují oblasti, určující komplementaritu (CDRs), z myších variabilních oblastí spolu s humáy,-. laními úseky základní struktury (FRs) z variabilních domén z jak lehkého, tak těžkého řetězce (V_L a V^). Argumentuje se, že při této technice se převede kritická a hlavní část místa, vázajícího antigen,do humánní protilátky (Jones a další /1986/, Nátuře, 321, 14) .

Roubování CDR bylo prováděno u několika monoklonáinich protilátek,pocházejících z hlodavců (Jones a další /1986/ Nátuře, 321, 14; Reichmann a další /1988/, Nátuře 322, 21; Verhoeyen a další /1988/, Science 239, 18;Queen a další /1989/, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029; Co a další /1991/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2 869; Gorman a další /1991/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 4 181; Maeda a další /1991/ Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124; Tempest a další /1991/, Biol. Technology 9, 266). Všechny si zachovaly svou schopnost vázat antigen, přesto že jejich afinita byla obvykle snížena. Ve většině případů bylo zapotřebí vyměnit určité aminokyseliny v humánních úsecích základní struktury (FRs). Při klinickém zkoušení se jak chimérická, tak CDR roubovaná protilátka ukázala být lepší než myší protilátky (Hale a další /1988/, Lancet, ii, 1394; LoBuglio a další /1989/, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 4 220; Mathieson a další /1990/ N. Eng. J.Med. 323, 250). V žádném případě však není znám obecný poznatek, které aminokyseliny mají být vyměněny a takovou výměnu nelze ani úplně předvídat.

V EP 088 994 je navržena konstrukce vektorů rekombinantní DNA, které obsahují sekvenci DNA,kódující variabilní doménu lehkého nebo těžkého řetězce imunoglobulinu,specifického pro předem určený ligand. V této citaci se nepředpokládají variace v sekvenci variabilní domény.

V EP 102 634 se popisuje klonování a exprese genů,kódujících celý polypeptid humánního těžkého řetězce IgG nebo jeho část v bakteriálních hostitelských organismech. Ani zde se nepředpokládají variace v sekvenci polypeptidu.

V EP 239 400 se navrhuje, že humanizované protilátky lze získat tím, že se místo, vázající antigen (hypervariabilní oblasti) jakékoliv humánní protilátky, nahradí místem,vázajícím

Ί antigen nehumánní, například myší nebo krysí protilátky, prostřednictvím metod genového inženýrství.

Podle této citace je tedy možno vyrábět humánní nebo humanizované protilátky, obsahující specifická místa,vázající antigen, která až dosud nebyla k dispozici v protilátkách,pocházejících z lidí.

Chimérické protilátky je možno získat tak, že se nahradí nejen CDRs, ale celé variabilní oblasti lehkého a těžkého řetězce. Chimérické protilátky mohou však ještě být imunogenní. Chimérické protilátky jsou však velmi užitečné pro diagnostické účely a pro optimalizaci humanizovaných protilátek.

Bylo by možno ukázat, ža afinitu míst,vázajících antigen, lze ovlivnit selektivní výměnou některých jednotlivých aminokyselin ve variabilních oblastech, které přímo nejsou součástí CDRs (Reichmann a další /1988/, Nátuře, 322, 21).

Postupuje-li se podle údajů, uvedených v EP 239 400, může v nejhorším případě dojít k úplné ztrátě vazebné afinity pro antigen. Tuto skutečnost jsou schopni demonstrovat původci tohoto vynálezu, kterým se nepodařilo zkonstruovat odpovídající humanizovanou protilátku, zaměřenou na epitopy receptoru EGF.

Je proto třeba vzít v úvahu, že úspěšnost takové humanizace závisí na složení a konformaci použitých variabilních oblastí a jejich interakcí s odpovídajícím místem,vázajícím antigen. Nelze tedy úplně předvídat, zda nebo které modifikace ve variabilních doménách protilátky je zapotřebí modifikovat, aby se dosáhlo vazby antigenu k protilátce,nebo aby se tato vazba zlepšila.

Podstata vynálezu

Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout humanizovanou monoklonální protilátku, která je zaměřena . zejména na receptory EGF a která obsahuje místo_zvázající antigen nehumánního původu, a úseky základní struktury (FRs) z variabilních oblastí a konstantních oblastí humánního původu, které jsou, v případě potřeby, modifikovány takovým způsobem, aby specifiM-ta vazebného místa zůstala zachována, nebo se regenerovala.

Úkolem tohoto vynálezu je především charakterizovat hypervariabilní oblasti místa, vázajícího antigen protilátky proti receptorů EGF, a zavést tyto CDRs do humanizované monoklonální protilátky,definované výše.

Tato protilátka a její chimérická varianta může hrát důležitou úlohu jako terapeutické nebo diagnostické činidlo/sloužící k potlačování nádorů, jako jsou melanomy, gliomy nebo karcinomy.

Zjistilo se, že účinné a specifické humanizované monoklonální protilátky je možno snadno získat za použití konvenční sekvence přinejmenším z variabilních oblastí těžkého řetězce humánních imunoglobulinů. Vhodné jsou zejména všechny takové konvenční sekvence, které vykazují dobrou identitu (alespoň ze 60 až 70 %, zejména ze 65 až 70 %) ve srovnání s variabilními oblastmi původních nehumánních protilátek.

Dále se zjistilo, že tyto konvenční sekvence musí být modifikovány pouze v malém rozsahu, zatímco za použití variabilních oblastí přírodních humánních protilátek je třeba někdy provádět mnohem více modifikací. Často není nutno provádět žádné modifikace,nebo je nutno provádět jen málo modifikací v sekvenci aminokyselin, aby se podle vynálezu dosáhlo dobré specifické vazby antigenů. Je tedy třeba vyměnit pouze několik aminokyselin pro dosažení perfektní vazby receptoru EGF k přednostní humanizované protilátce podle tohoto vynálezu.

Podle poznatků,uvedených v EP 239 400, nelze v tomto případě dosáhnout vazby. Stupeň modifikace, kterého je podle vynálezu zapotřebí, je možno charakterizovat výměnou aminokyselin v rozsahu od 0 do 10 í, přednostně od 1 do 5 %.

Humanizovaná monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu má následující výhody: Konvenční sekvenci, což je sekvence, odpovídající nejčastějšímu výskytu aminokyselin v určité poloze řetězce humánního imunoglobulinu z definované třídy, podtřídy nebo podskupiny, je možno bez problémů syntetizovat jako celek nebo jako část. Není zde závislost na podrobné znalosti nebo dostupnosti určitých individuálních protilátek nebo jejich fragmentů. To znamená, že je možno pokrýt široký rozsah individuálně a přírodně se vyskytujících fragmentů protilátky prostřednictvím velmi omezeného počtu konvenčních sekvencí, které se klonují do odpovídajících expresních vektorů. Konvenční sekvence může být příznivá, pokud se týče imunogenicity, ve srovnání s individuálními přírodními sekvencemi, o nichž je známo, že se někdy jedná o epitopy pro jiné protilátky (například anti-idiotypické protilátky).

Ačkoliv bylo skutečně realizováno jen jedno přednostní provedení, poskytuje tento vynález obecné základní poznatky. Vzhledem k velkému počtu možných sekvencí a kombinací sekvencí ve variabilní a hypervariabilní doméněy není pouhou náhodou, že se na základě popsaných poznatků, vztahujících se ke konvenční sekvenci, podařilo zkonstruovat humanizovanou protilátku, zaměřenou na receptory EGF.

Dále se zjistilo, že těžké řetězce variabilních domén dodávají větší příspěvek místu,vázajícímu antigen, ve srovnání s odpovídajícími lehkými řetězci. Není proto nutno modifikovat stejným způsobem lehký řetězec humanizované protilátky, obsa10 hující konvenční sekvenci. Tento aspekt je zajímavý, poněvadž je známo, že lehké řetězce hrají u některých známých přírodních protilátek důležitější úlohu než odpovídající těž ké řetězce (viz Williams a další /1990/ Tibtech. 8, 256).

Podle vynálezu je konečně možno poprvé provéstý pomocí genetického inženýrství*· charakterizaci, klonování a amplifikaci místa,vázajícího antigen murinní protilátky proti receptoru EGF (MAb 425) . Tento aspekt vynálezu je nejdůležitější. Je možno syntetizovat odpovídající oligonukleotidy, kódující toto místo, vázající antigen a celou variabilní domě nu humanizované a chimérické monoklonální protilátky. Předmětem vynálezu jsou dále také odpovídajícím způsobem účinné expresní vektory, kterých lze používat pro transformaci vhod ných eukaryotických buněk.

Předmětem vynálezu je tedy chimérická monoklonální protilátka,obsahující místa,vázající antigen, CDR*· nehumánního původu, úseky základní struktury*· FR*· nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky:

i) váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptoru EGF, ii) konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnuj í sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa, iii) její oblasti CDR,reprezentující místa,vázající antigen,zahrnují následující sekvence aminokyselin lehký řetězec

CDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrtěžký řetězec

CDR-1 -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-AsnGlu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyriv) její úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům vázajícím antigen, zahrnují následující aminokyselinové sekvence lehký řetězec

FR-1 -Gln-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ile-Met-SerAla-Ser-Pro-Gly-Glu-Lys-Val-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-LeuLeu-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-GlyThr-Ser-Tyr-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Arg-Met-Glu-AlaGlu-Asp-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lystěžký řetězec

FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu-ValLys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-AlaSer-Gly-Tyr-Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-Trp

Ile-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-ThrAla-Tyr-Met-Gln-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Ser-Glu-AspSer-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-Val-Ser-SerPředmětem vynálezu je dále expresní vektor, obsahující sekvenci DNA, kódující variabilní a konstantní oblast lehkého řetězce výše uvedené chimérické monoklonální protilátky, který nese označení pCVL425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338.

Předmětem vynálezu je dále expresní vektor, obsahující sekvenci DNA,kódující variabilní a konstantní oblast těžkého řetězce výše uvedené chimérické monoklonální protilátky, který nese označení pCVH425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6337.

Konečně je předmětem vynálezu také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše uvedenou chimérickou monoklonální protilátku.

Všechny citace patentů a publikací,uvedené výše a dále v tomto textu,představují náhradu za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Mikroorganismy a plasmidy, použité při provádění vynálezu

a) pRVL425 (= HCMV-RVj^aS-k) uložen 1.února 1991^ v souladu s Budapeštskou dohodou^v Německé sbírce mikro-B-

organismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6340. ExpreSm vektor obsahuje sekvence hypervariabilních oblastí (CDRs) murinní protilátky 425 a FRs variabilní oblasti a konstantní (kappa) oblasti lehkého řetězce humanizované protilátky. Symbol R znamená přetvořený (reshaped).

b) pRVH425 (= HCMV-RV^g425-gamma) , uložen 1. února 1991y v souladu s Budapeštskou dohodou\ v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6339 . Tento expresM) ní vektor obsahuje sekvence hypervariabilních oblastí (CDRs) murinní protilátky 425 a FRs variabilní oblasti a konstantní (gamma-1) oblasti těžkého řetězce humanizované protilátky. Symbol R znamená přetvořený (reshaped).

c) pCVL425 (= HCMV-CV_L425-k), uložen 1. února 1991, v souladu s Budapeštskou dohodou, v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6338. Tento expres^^yií vektor obsahuje sekvence FRs a hypervariabilních oblastí(CDRs) variabilní oblasti lehkého řetězce murinní protilátky 425 a konstantní (kappa) oblasti lehkého řetězce humánního imunoglobulinu. Symbol C znamená chimérický.

d) pCVH425 (= HCMV-CVj_I425-gamma) , uložen 1. února 1991/ v souladu s Budapeštskou dohodou/ v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod přírůstkovým číslem DSM 6337. Tento expresfc^ní vektor obsahuje sekvence FRs a hypervariabilních oblastí (CDRs) variabilní oblasti lehkého řetězce murinní protilátky 425 a konstantní oblasti lehkého řetězce humánního gamma-1 imunoglobulinu. Symbol C znamená chimérický.

e) Hybridoma buněčná linie 425, uložena 26. února 1988/ v souladu s Budapeštskou dohodou^ v americké sbírce American Type Culture Collection (ATCC) pod přírůstkovým číslem HB 9629. Tato buněčná linie produkuje murinní protilátku 425, která je zaměřena na receptor EGF.

-XJiné biologické materiály:

V jiné mikroorganismy, buněčné linie, plasmidy, promotory, markéry rezistence, replikační počátky nebo jiné fragmenty vektorů, které jsou uvedeny v tomto popisu,jsou obchodně nebo jinak obecně dostupné. Pokud není v tomto popisu uvedeno jinak, používá se jich pouze jako příkladů a jejich konkrétní volba není při provádění vynálezCf důležitá, takže je možno nahradit j« jinými vhodnými prostředky a biologickými materiály.

Pro amplifikaci odpovídajících sekvencí DNA se přednostně používá bakteriálních hostitelů. Jako příklad takových hostitelů je možno uvést E. coli nebo Bacillus.

Při výrobě humanizovaných a chimérických protilátek podle tohoto vynálezu se dává přednost eukaryotickým buňkám, jako je COS (CV1 původ SV 40), nebo buňkám z vaječníků čínského křečka (CHO), nebo kvasinkám. Obzvláštní přednost se dává buňkám COS a CHO.

Obecné postupy výroby:

Technologie, které jsou pro provádění tohoto vynálezu podstatné, jsou podrobně uvedeny v tomto popisu.

Jiné technologie, které nejsou podrobně popsány, odpovídají známým standardním technologiím , které jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru,nebo které jsou popsány podrobněji v uvedených literárních odkazech , patentových přihláškách a standardní odborné literatuře.

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. 1 jsou schematicky znázorněny vektory, používané

pro expresi chimérických a přetvořených humánních protilátek. Restrikční místa,používaná při konstrukci expres$4ních pla^midů, jsou označena. Sekvence,kódující variabilní oblast/jsou znázorněny černými úseky, konstantní oblasti jsou znázorněny bílými úseky, promotor HCMV a zesilovač transkripce (enhancer) šrafovanými úseky a nukleotidový fragment z pla^midu pSVneo je·. znázorněn/' tečkovanými úseky. Směry transkripce jsou znázorněny šipkami.

Na obr.2 jsou znázorněny sekvence nukleotidů a aminokyselin

V_u425 (A) aV_T 425 (B) cDNA.klonované do pUCl8 . Aminokyseliny, přispívá jící k vedoucí sekvenci (leader), jsou podtrženy a CDRs jsou označeny závorkami. Místa sestřihu mezi variabilními oblastmi a konstantními oblastmi jsou také znázorněna. Také jsou zde znázorněny přední a zadní PCR-primary a jejich místa teplotní z hybridizace (annealing sites), použitá při konstrukci genů,kódujících chimérické protilátky.

Na obr. 3 jsou uvedeny sekvence nukleotidů a aminokyselin syntetizovaného genového fragmentu,kódujícího přetvořenou humánní V„a425. Vedoucí sekvence je podtržena a re/idua, přispívající k CDRs,jsou v závorkách.

Na obr. 4 je uvedeno srovnání sekvence aminokyselin myší a přetvořené humánní variabilní oblasti 425. Panel A ukazuje sekvenci myší V_L (V_L425) a přetvořené humánní V_LS (RV_La425 a RV_Lb425). Panel B ukazuje sekvence myší V_H (V_H425) a přetvořené humánní V_HS (RV_Ha425, RV_Hb425, RV_Rc425, RV_Hd425, RV_He425, RV^f425, RV_Hg425, RV_Rh425, RV^i425 a jsou označeny FRs a CDRs. Aminokyseliny jsou číslovány podle Kabat a další /1987/ Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices.

Na obr. 5 je znázorněn molekulární model variabilních oblastí myší MAb 425.

Na obr. 6 je znázorněna detekce vazby k EGFR pomocí metody ELISA. Aktivita vazby antigenu se stanovuje ve zředěných supernatantech transfektovaných COS buněk a vynáší se do grafu jako optická hustota při 450 nm proti koncentraci IgG (zjištěné metodou ELISA, viz část popisu Materiály a metody). Všechny verze přetvořených humánních V^ oblastí se kohtransfektují s RV_La425 a jsou reprezentovány následujícími grafickými symboly: RV_Ha425 4, RV_Hb425 φ, RV_Hc425A , RV_Hd425® , RV_He425D , RV_Hf425 B, RF_Hg425d, RV_Hh425O, RV_Hi425© , RV_Hb425 ko-transfektovaný s RV_Tb425 je reprezentován symbolem .

Produkty kotransfekce chimérického VL425 a VH425 jsou reprezentantovány symbolem ·.

Na obr. 7 je znázorněna konkurence při vazbě k antigenu. V okénku A je znázorněna konkurence mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) chimérickou protilátkou 425 (·), produkovanou buňkami COS po kotransfekci s HCMV-CV_L425-kappa a HCMV-CV_H4 25-gamma-l.

V okénku B je znázorněna konkurence mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) přetvořenými humánními protilátkami 425, produkovanými buňkami COS po kotransfekci s HCMV-RV_La425-kappa a HCMV-RV_Hi425gamma-1 (O) as HCMV-RV_La425-kappa a HCMV-RV_Hg425-gamma-l (□)· Ve všech případech se na horizonální osu vynáší koncentrace inhibitoru v ng/ml. Na vertikální osu se vynáší procento inhibice vazby.

Na obr. 8 jsou znázorněny účinky různých přetvořených humánních oblastí V_L na vazbu antigenu. V okénku A je ukázána vazba antigenu přetvořenými humánními protilátkami, produkovanými v buňkách COS trans fektovných HCMV-CVj_j425-kappa a HCMV-CV_H425-gamma-l (·), HCMV-RV_La425-kappa a HCMV-RV_Hg425gamma-1 (□), HCMV-RV_Lb425-kappa a HCMV-RV_Hg425-gamma-l ( ) , HCMV-RV_La425-kappa a HCMV-RV_Hc425-gamma-l ( Z) ) a HCMV-RV_Lb425kappa a HCMV-RV_Hc425-gamma-l (4 ). V okénku B je znázorněna konkurence o vazbu k antigenu mezi značenou myší protilátkou 425 a (1) neznačenou myší protilátkou 425 (+) a (2) přetvořenými humánními protilátkami 425, produkovanými v buňkách COS kotransfektovaných HCMV-V_La425-kappa a HCMV-V_Hg425-gammaI (□) a HCMV-V_Lb425-kappa a HCMV-V_Hg425-gamma-l ( ).

V okénku A se na vertikální osu vynáší optická hustota při 450 nm (θ°45θ) ^{a na} horizontální osu se vynáší koncentrace IgG v ng/ml. V okénku B se na horizontální osu vynáší koncentrá ce inhibitoru v ng/ml a na vertikální osu procento inhibice vazby.

Na obr. 9 je v okénku A znázorněna analýza přetvořených (dráhy 1 a 2)^chimérické (dráha 3) a murinní (dráha 4) MAbs 425 metodou SDS-PAGE za neredukujících podmínek (a), a za redukujících podmínek (b) . Dráhy 7 a 8 odpovídají přetvořeným, dráha 9 chimérické a dráha 10 murinní protilátce. Dráhy 5, 6,

II a 12 představují markéry molekulové hmotnosti. V okénku B je znázorněna purifikace přetvořené MAb 425 gelovou filtrací na Superose 12. Pík 2 odpovídá IgG.

/

Na obr. 10 je znázorněna konkurence mezi murinní, chimérickou a přetvořenými MAbs 4 25 o receptor EGF (EGFR) . Na vertikální osu se vynáší poměr mezi vázanou (MAb) a celkovou (MAb) v procentech (% vázaná/celkem) . Na horizontální osu se vynáší koncentrace protilátky (mol/1 /log/). Používá se následujících symbolů :

V znamená MAb 425 murinní,

O znamená MAb 425 chimérickou, znamená MAb 425 přetvořené.

Na obr. 11 je znázorněna konkurence mezi EGF a protilátkami o receptory EGF. Na vertikální osu se vynáší % vázaná/celkem (MAb). Na horizontální osu se vynáší koncentrace protilátky (mol/1 /log//). Symbol O znamená MAb 425 murinní a symboly Z) , 9 , D z znamenají MAb 425 přetvořené.

~ps- χNásleduje podrobný popis vynálezu.

Klonování a sekvenování genů variabilní oblasti MAb 425

Ze synt^ézy cDNA a klonování za použití primeru s kappa řetězcem se pro skríning přednostně vezme 300 až 400 kolonií.

Ze syntl^ézy cDNA a klonování za použití primeru gamma-2a se přednostně pro skríning vezme 200 až 300 kolonií. Po skríningu hybridizací za použití dvou odpovídajících klonovacích primerů poskytuje 20 až 30 kolonií s lehkým řetězcem a 10 až 20 kolonií s těžkým řetězcem silné signály. Z těchto kolonií se izoluje pla^midová DNA a analýzuje obvyklým způsobem štěpení obchodně dostupnými restrikčními enzymy, aby se stanovila velikost insertů cDNA. Jako kandidáti pro sekvenování se zvolí klony zřejmě ob sáhující insert 400 až 500 bp v případě klonování, a 500 až 600 bp v případě klonování. Tři V_L klony a tři V_H klony se sekvenují na obou vláknech za použití univerzálních a reversních sekvenačních primerů M13. Ze tří možných V_L klonů, které byly sekvenovány, jeden kóduje úplnou variabilní oblast a ostatní kódují peptidy, které k ní nemají vztah. Dva z V„klonů kódují identické V„oblasti, zatímco ostatní kódují V„ oblast s intronem mezi vedoucí sekvencí a ještě přítomným FR-1. Vedle intronu^ třetí V„ klon obsahuje kódující sekvenci, která je identická se sekvencemi prvních dvou klonů. Pro ověření sekvence oblasti se sekvenují tři další cDNA klony, které obsahují inserty vhodné velikosti. Dva z nich poskytují sekvence, které jsou v souhlasu s prvním V_L klonem. Třetí představuje nepodobnou DNA sekvenci. V sekvenovaných klonech nejsou přítomny všechny původní sekvence primeru. Rozsah delecí se mění od klonu ke klonu. Tyto delece, k nimž pravděpodobně dochází v průběhu synt^ézy cDNA a klonování, mohou snížit účinnost skríningu kolonie.

Geny V_ a V„ MAb 425 jsou znázorněny na obr.2. Sekvence L H aminokyselin V_L a V_R oblasti 425 se porovnává s jinými myšími\ variabilními oblastmi v Rabatově databázi (Kabat a další,

/1987/ Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, US Government Printing

Offices). Oblast je možno zatřídit do podskupiny IV nebo VI myších variabilních oblastí s řetězcem kappa. V úsecích základní struktury (FRs) vykazuje oblast 425 V_T přibližně 86% identitu s konvenční sekvencí myší kappa podskupiny IV a přibližně 89% identitu s podskupinou VI. Zdá se, že oblast 425 V_T používá segmentu JK4. Při zkoumání V„ oblasti se zjistí přibližně 98% identita s FRs konvenční sekvence myšího těžkého řetězce z pod)f^upiny XI (B) .

Správná volba vhodné třídy nebo podskupiny humánního imunoglobulinů je závislá na stupni identity s řetězcem, který je v nehumánní protilátce původně přítomen. Identita dedukované konvenční sekvence podle tohoto vynálezu by měla být vyšší než 65 až 70 %, při srovnávání se sekvencí původního nehumánního řetězce.

Dává se přednost konvenčním sekvencím těžkých řetězců, zejména však konvenční sekvenci humánního těžkého řetězce z podskupiny I. Pro jiné protilátky jsou však vhodné konvenční sekvence jiných humánních těžkých řetězců. Přednostní konvenční sekvence jsou modifikované. Možná výměna aminokyselin činí podle vynálezu 0 až 10 %, přednostně 5 až 10 %.

Konstrukce a exprese chimérické protilátky 425

Dříve než je možno použít při konstrukci chimérické protilátky 425 cDNA pro kódování V_L a V_H oblastí, je zapotřebí zavést několik modifikací do 5'- a 3'- konce. Tyto modifikace zahrnují zavedení vhodných míst pro restrikční enzymy tak, aby bylo možno sekvence_zkódující variabilní oblast, snadno subklonovat do expresj^ních vektorů HCMV. Je . nutno znovu vytvořit donorní sestřižená místa v 3'- lemujících oblastech pro správný a účinný sestřih variabilních oblastí ke konstantním oblastem.

-1)><Také 5'- lemující oblasti se modifikují, aby obsahovaly sekvenci, která by vytvořila účinná iniciační místa pro translaci eukaryotickými ribosomy (Kozák a další /1987/, J. Mol. Bio., 196 , 947) . Tyto modifíace se zavádějí za použití PCR primeru. Použité primery jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

K

Oligonukleotidy. použité pro klonování cDNA, konstrukci chimerik * a mutagene^i. Podtržené úseky označují báze, které se tepelně hybridizují k humánní struktuře.

číslo sekvence popis

1. 5' -GTAGGATCCTGGATGGTGGGAAGATG-3'

2. 5'-GTAGGATCCAGTGGATAGACCGATG-3'

3. 5'-CTCCAAGCTTGACCTCACCATGG-3' primer lehkého řetězce pro syntézu cDNA primer těžkého řetězce pro synbhézu cDNA přední primer chimérické oblasti V_H . 5' -TTGGATCCACTCACCTGAGGAGACTGTGA-3'

5. 5' -AGAAAGCTTCCACCATGGATTTTCAAGTG-3' . 5' -GTAGATCTACTCACGTTTTATTTCCAAC-3' . 5' -ACCATCACCTGTAGTGCCAGCTCAAGTG

TAACTTACATGTATTGGTACCAGCAG-3'

8. 5'-CTGCTGATCTACGACACATCCAACCTGGC

TTCTGGTGTGCCAAGC-3' zadní primer chimérické oblasti ^VH přední primer chimérické oblasti zadní primer chimérické oblasti ^VL

CDR-1 primer přetvořené oblasti V_L

CDR-2 primer přetvořené oblasti číslo sekvence — ΖΊ~

-χpopis . 5' -ACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTCACATATTCACGTTCGGCCAA-3 · *

10. 5' -AGCGGTACCGACTACACCTTCACCATC-3'

CDR-3 primer přetvořené oblasti primer pro zavádění F71Y do RV_l * *

11. 5' -ATACCTTCACATCCCACTG-3' primer pro ní S30T do zavádě ^RVH * *

12. 5'-CGAGTGGATTGGCGAGT-3' primer pro zavádění V48I do ★ * *

5' -TTTAAGAGCAAGGCTACCATGACCGTGGACACCTCT-3' *

5' -CATGACCGTGGACACCTCT-3' primer pro zavádění R66K, V67A a L71V do ^RVH primer pro zavádění L71V do ^RVH

-Zl-XPro každou variabilní oblast cDNA se přednostně vytvoří dva primery. V předních primerech se použije 15 bází na 3'- konci primeru pro hybridizací primeru k templářové DNA, zatímco 5- konec primeru obsahuje místo HindlII a Kozákovu sekvenci. Zadní primery mají podobné složení. Posledních 15 bází u 3'- konce se použije pro hybridizací primeru k templářové DNA a 5- konec primeru obsahuje místo BamHI donorní místo pro sestřih. V případě zadního primeru lehkého řetězce se používá místa BglII místo místa BamHI, poněvadž cDNA,kódující V_L,obsahuje interní místo BamHI (viz obr. 2). Reakce PCR se přednostně provádí způsobem, popsaným v příkladech.

DNA V_T oblasti modifikovaná PCR se klonuje do míst HindlII a BamHI expresV^ního vektoru lehkého řetězce HCMV, jakožto HindlII-BglII fragment. Tento vektor již obsahuje humánní genomovou konstantní oblast kappa s potřebným akceptorovým místem pro sestřih a místy poly(A⁺). Celý PCR-modifikovaný V_L fragment se sekvenuje za použití dvou primerů, které se tepelně hybridizují k místům, lemujícím klonovací místo expresVyního vektoru. Sekvenování potvrzuje, že v průběhu stupně PCR nebyly zavedeny žádné chyby. PCR-modifikovaná V_H DNA se klonuje do expresl^ního vektoru těžkého řetězce HCMV/- jako HindlIIBamHI fragment a také se sekvenuje, aby se potvrdilo, že během PCR nebyly zavedeny žádné chyby. Fragment BamHIyobsahující humánní genomovou konstantní oblast gamma-1, se vloží do vektoru HCMV-CV„ na 3- straně oblasti V„. Tento fragment obsahuri ti je potřebné akceptorové místo pro sestřih V-C, který má proběhnout in vivo a přírodní místo poly(A⁺).

Expres\Vní vektory, obsahující chimérické oblasti 425 a V_H,se kotransfektují do vhodných eukaryo-tických buněk, přednostně buněk COS. Po přibližně 72 hodinách přechodné exprese se médium buněčné kultury zkouší metodou ELISA na přítomnost produkovaného humánního IgG a na vazbu k EGFR proteinu.

_,₂3- XMnožství humánního IgG,detekovaného v médiu, kolísá v rozmezí od 100 do 400 ng/ml. Vyrobená chimérická protilátka se dobře váže k proteinu EGFR při standardní zkoušce vazby antigenu ELISA, čímž se potvrdí, že byly klonovány a sekvenovány správné myší variabilní oblasti.

Počáteční navržení, konstrukce a exprese přetvořených humánních lehkých a těžkých řetězců 425

Při návrhu přetvořené humánní protilátky 425 se největší důraz klade na oblast V_H, poněvadž tato doména je často při vazbě antigenu nejdůležitější (Amit a další /1986/, Science 233, 747; Verhoeyen a další /1988/ Science 239, 18). Při volbě humánních FRs^na nichž se mají roubovat myší CDRs,se FRs myší V„ oblasti MAb 425 porovnávají s FRs konvenčních sekvencí ze všech podskupin humánních oblastí (Kabat a další, /1987/ viz shora uvedená citace). Toto porovnání ukazuje, že FRs oblastí myší protilátky MAb 425 jsou nejpodobnější FRs humánních oblastí V_H podskupiny I. Je zde 73% identita mezi FRs a přibližně 65% identita mezi celými oblastmi V^.

Provede se další srovnávání myší oblasti V_R 425 s jinými myšími oblastmi V_H ze stejných Rabatových podskupin,aby se identifikovaly všechny zbytky FR, které jsou chrakteristické pro MAb 425 a mohly by se tedy podílet na vazbě antigenu.

Zbytek v poloze 94 myší oblasti V_H MAb 425 je serin, zatímco v jiných oblastech myší podskupiny II (B) a také humánní podskupiny I je zbytkem 94 arginin (Kabat a další, /1987/, viz shora uvedená citace). Tato substituce aminokyseliny je neobvyklá a poněvadž poloha 94 přiléhá k CDR-3, jedná se o překvapivě důležitou polohu. Z těchto důvodů se přetvořená oblast V„ humánní 425 přednostně navrhuje tak, že je založena na CDRs myší protilátky MAb 425 a FRs, odvozených z konvenční sekvence humánních FRs z podskupiny I (podle definice Kabata a dalších /1987/, viz shora uvedená citace). Polohy 94

ve FR-3 se obsadí serinem, jako je tomu u myší protilátky

MAb 425. V polohách konvenční sekvence FRs z humánní podskupiny I, kde nejsou uvedeny jednotlivé aminokyseliny, se zvolí aminokyselina, která se nejčastěji vyskytuje v této poloze. Jestliže se v určité poloze humánní konvenční sekvence nevyskytuje žádná aminokyselina přednostně, volí se jako aminokyselina ta aminokyselina, která se v této poloze sekvence nalézá v oblasti V_H myší MAb 425. Výsledná aminokyselinová sekvence obsahuje první verzi ( verzi a ) přetvořené humánní oblasti V„ 425 (viz obr. 3). Všechny následující verze přetvořené oblasti ν„ humánní 425 jsou modifikacemi této první verze.

Navrhne se a syntetizuje (viz příklady a obr. 3) 454bp fragment DNA, který kóduje přetvořenou V_R oblast humánní 425, jak je to popsáno výše. Kromě sekvencí DNA,kódujících aminokyseliny přetvořené V_H oblasti humánní 425, obsahuje tento fragment DNA také sekvence,kódující humánní vedoucí sekvenci. Humánní vedoucí sekvence může být vzata například z protilátky HG3 CL (Rechavi a další, /1983/, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80,855), což je člen humánní oblasti V_fí z podskupiny I (Kabat a další /1987/, viz shora uvedená citace). Fragment syntetické DNA také obsahuje eukaryo^tické translační signály na 5' - konci (Kozák /1987/, J. Mol. Bio. 196, 1947), donorní místo pro sestřih na 3'- konci (Breathnach a další /1978/, Proč. Nati.

Acad. Sci USA 75, 4 853), a místo HindlII na 5'- konci a místo BamHI na 3'- konci, pro subklonování do expres,^ního vektoru HCMV.

Podobného postupu se také použije pro sestrojení přetvořené oblasti V_L humánní 425. Oseky FRs myší V_L oblasti protilátky MAb 425 se porovnají s konvenčními sekvencemi všech podskupin humánních oblastí V_L (Kabat a další /1987/, viz shora uvedená citace). U FRs se zjistí přibližně 71% totožnost mezi oblastí myší 425 a humánní oblasti kappa z

Ο ζ

-Xpodskupiny ΙΙΙ^a přibližně 70% identita s humánní oblastí

V_L kappa z podskupiny I. DNA,kódující humánní FRs humánní oblasti V_L kappa zpodskupiny I, je již dostupná z přetvořené humánní oblasti V_L Dl.3 (EP 239 400, Winter) a přetvořené humánní Campath-1 (Reichmann a další /1988/, Nátuře 322, 21).

Návrh přetvořených humánních oblastí V_T v těchto dvou humánních protilátkách je založen na strukturně vyřešeném humánním imunoglobulinovém proteinu REI (Epp a další /1975/, Biochemistry 14, 4 943) . Z těchto důvodů se také používá humánních FRs z oblasti V_T z přetvořené humánní protilátky Dl.3 a CAMPATH-1H ll v přetvořené humánní oblasti V_T 425. Srovnání FRs myší oblasti ll

V_L 425 s FRs jiných myších protilátek z podobných podskupin neukazuje žádné podstatné rozdíly ve zbytcích aminokyselin ve funkčně důležitých polohách. Z těchto důvodů nejsou zapotřebí žádné změny v humánních FRs. Sekvence aminokyselin přetvořené humánní oblasti ν^425 verze a je ukázána na obr. 4.

Pro konstrukci přetvořené humánní V_T oblasti 425 se sestrojí ll tři oligonukleotidy, obsahující interní sekvence DNA,kódující tři CDRs myší V_L oblasti 425,a 12 bází na 5'- a 3'- koncích, které jsou určeny pro hybridizaci se sekvencemi DNA, které kódují humánní FRs v přetvořené humánní V_L oblasti protilátky Dl. 3 (viz oligonukleotidy 7 až 9 v tabulce I). Roubování CDR se provádí způsobem popsaným v příkladech. Po sekvenování DNA pravděpodobných pozitivních klonů ze skríningu je celkový výtěžek trojnásobného mutantu 5 až 15 %, přednostně 9 až 10 %. Přetvořená V_L oblast humánní 425, která neobsahuje žádné PCR omyly, se klonuje jako fragment HindlII - BamHI do expresi4ního vektoru lehkého řetězce za vzniku plasmidů HCMV-RV^a425- kappa (viz obr. 1).

Dva expres^Vní vektory, nesoucí přetvořené oblasti ν^425 a V„ 425, se nyní kotransfektuj í.. do vhodných buněk (viz výše), za účelem hledání přechodné exprese funkční přetvořené humánní protirtky 425. Přibližně po 72 hodinách se buněčné

-Μ-

supernatanty sklidí a metodou ELISA se v nich stanovuje humánní IgG. Humánní IgG může být stanoven na úrovni v rozmezí od 100 do 500 ng/ml, avšak při zkoušce ELISA, zaměřené na stanovení vazby antigenů, není vazba k EGFR s překvapením detekovatelná. Jestliže se buňky kotransfektují HCMV-RV_La425kappa/HCMV-CV^425-gamma-l, vyrobí se humánní IgG, který se váže k EGFR. Jestliže se však buňky kotransfektují . HCMV-CV_L425 kappa/HCMV-RV_Ha425-gamma-l, vyrobí se humánní IgG, který se však na detekovatelné úrovni neváže k EGFR. Z těchto neočekávatelných výsledků je zřejmé, že je zapotřebí dalších modifikací s charakterem vynálezu ve FRs přetvořené humánní oblasti

425, aby se získalo funkční místo, vázající antigen.

Modifikace FRs přetvořené oblasti V_H humánní 425

Na základě molekulárního modelu domén myších variabilních oblastí 425 se provedou další změny ve FRs přetvořené humánní V., oblasti 425. Prozkoumají se smyčky CDR přetvořené humánní oblasti V_H, aby se zjistilo, jak se shodují s kanonickými strukturami, které popsali Chothia a další /1989/, Nátuře 342, 877. Na základě této analýzy se provedou ve FRs určité změny . Provedou se také jiné změny FRs, které jsou založeny na funkční přetvořené humánní protilátce anti-Tac, která byla rovněž sestrojena na základě humánních FRs z podskupiny I (Queen a další /1989/, Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 10 029).

S překvapením bylo zjištěno, že oblast V_H myší protilátky anti-Tac je přibližně ze 79 % identická s V_H oblastí myší protilátky 425. Nyní se podle vynálezu vytvoří molekulární model variabilních oblastí myší protilátky 425 (obr. 5). Model je založen na struktuře HYHEL-5, což je protilátka s vyjasněnou strukturou, jejíž variabilní oblasti vykazují vysoký stupeň homologie s oblastmi myší protilátky 425. Na základě této analýzy se zbytky aminokyselin v polohách 30, 48, 67, 68 a 71 v přetvořené humánní oblasti protilátky 425 změní tak, aby byly identické se zbytky aminokyselin, které se vyskytují

v těchto polohách v myší oblasti V_R protilátky 425. Pro ozřejmění individuálních účinků těchto změn se prováděné změny při konstrukci podle vynálezu různě kombinují a potom zkoušejí.

Celkem se zkonstruuje 8 nových verzí přetvořené oblasti V_R humánní protilátky 425 (viz obr. 4). Z verzí, které se vytvoří způsoby, podrobně popsanými v příkladech, se další verze vyrobí rekombinací malých fragmentů DNA z dřívějších verzí. Když jsou již všechny požadované verze sestaveny, přednostně v pUC18, přenesou se přetvořené V_R oblasti humánní protilátky 425^ ve formě fragmentů HindlII-BamHI do expresVrního vektoru HCMV-V_h£ za vzniku verzí“b¹'až'i''plasmidu HCMV-RV_H 425— gamma-1 (obr. 4).

Modifikace ve FRs přetvořené oblasti V_T humánní protilátky 425

Ačkoliv odpovídající buňky, kotransfektované vektory, exprimujícími přetvořený lehký řetězec humánní protilátky 425, verzí a a chimérickým těžkým řetězcem protilátky 425, skutečně produkují protilátku, která se váže k EGFR, protilátka s přetvořeným lehkým řetězcem humánní protilátky 425 se neváže tak dobře, jako chimérická protilátka 425. Prozkoumáním oblastí V_L myší protilátky 425 a přetvořené humánní verze a protilátky 425 ukazuje, že zbytek 71, který je součástí kanonické struktury CDR-1 (Ll), není zachován ve verzi a (Chothia a další /1989/, Nátuře 342, 877). Pro zavedení změny Phe na Tyr v této poloze se přednostně použije PCR-mutagene^fé /Kamman a další /1989/, Nucleic Acids Res. 17, 5 404). Fragment HindlII- BamHI, vzniklý touto mutagene^í, se zavede do expresního vektoru HCMV-V^ pro vytvoření HCMV-RV^b425-kappa (viz obr. 4).

-28Analýza nových verzí přetvořené oblasti humánní protilátky 425

Expres^jní vektory, obsahující přetvořené humánní verze V_H a až i, se koťransfektují do shora uvedených buněk-fíjexpres\^ním vektorem, obsahujícím přetvořenou humánní V_L oblast verze a. Po asi 3 dnech se buněčné supernatanty analyzují metodou ELISA na produkci humánního IgG. Úroveň produkce kolísá v rozmezí od 50 do 500 ng/ml. Potom se vzorky analyzují meto dou ELISA na humánní IgG, který je schopen se vázat k EGFR. Různé verze přetvořených humánních oblastí V„ mají za následek

Π mnoho různých úrovní vazby antigenu (viz obr. 6) . Při tomto testu ELISA na vazbu antigenu se mohou různé přetvořené humánní protilátky 425 přímo·, porovnávat s chimérickou protilátkou 425, ale nikoliv s myší protilátkou 425. Je tomu tak proto, že protilátkou, použitou pro detekci vazby k antigenu, je antihumánní protilátka IgG. Devět verzí přetvořené humánní oblasti V_H je možno rozdělit do skupin podle jejich schopnosti vazby k EGFR. Verze g a i přetvořené humánní oblasti V„ poskytují nejvyšší úrovně vazby, potom následují verze c, f a h, načež následuje verze b. Při některých pokusech poskytuje verze e nízkou, ale detekovatelnou úroveň vazby.

Verze a a d nikdy neposkytují detekovatelnou úroveň vazby.

Pro přímé porovnání přetvořených humánních protilátek 425, obsahujících verze g a i V_R,a chimérické protilátky 425 s myší protilátkou 425 se použije konkurenčního vazebného testu (viz obr. 7). Jelikož protilátky v buněčných supernatantech nejsou purifikovány a proto jsou kvantifikovány metodou ELISA, je třeba považovat výsledky konkurenčního vazebného testu za hodnoty relativní úrovně vazby, spíše než za přesnou kvantifikaci afinity. Konkurenční vazebné testy se vzorky ze 4 pokusů, například v buňkách COS, poskytují konsistentní výsledky, pokud se týče relativní úrovně vazby k antigenu. Chimérická protilátka 425 dobře soutěží se značenou myší protilátkou 425 ~'2°í-Xa poskytuje procentickou inhibici vazby, která je právě o něco nižší, než je inhibice při konkurenčním testu za použití neznačené myší protilátky 425, která soutěží se značenou myší protilátkou 425 (viz obr. 7, okénko A). Přetvořená humánní protilátka s oblastí V^a a V^g je lepší než protilátka ε oblastí V^a a V^i (viz obr. 7, okénko B) . Porovnání, bodů, které odpovídají plato na křivkách vazby, ukazuje, že přetvořená humánní protilátka s oblastí V_Hg soutěží se značenou myší protilátkou 425 ze 60 až 80 % tak dobře, jako to činí neznačená myší protilátka 425 při stejném testu. Když se zprůměrují výsledky)/ za použití vzorků ze 4 nezávislých pokusů, například za použiti buněk COS nebo CHO, dospěje se ke zjištění, že přetvořená humánní protilátka_zobsahující oblast V^a a V_Hg/poskytuje vazbu, která odpovídá 60 až 80 % vazby myší protilátky 425.

Na základě těchto výsledků je možno komentovat relativní příspěvky jednotlivých zbytků ve FRs struktuře k vazbě antigenú. Nejsignifikantnější jednotlivá změna v této studii je změna L71V. Bez této změny s překvapením nelze detekovat žádnou vazbu k antigenú (srovnej verze a a b V„). Pro vazbu jsou s ti překvapením důležité také změny R67K a V68A (srovnej verze b a c a verze i a h V..)· Zatímco zavedení samotné změny ti

V48KI a změn V48I a S30T/ společně/ nemá za následek signifikantní vazbu antigenú, změny v těchto polohách skutečně zvyšují vazbu antigenú. Změna S30T má s překvapením vyšší účinek než změna V48I ( srovnej verze g a i a verze f a ”iV_H).

Analýza nové verze přetvořené oblasti V_ humánní protilátky 425

Expres^rní vektor, obsahující RV_Lb425, se kotransfektuje do vhodných, přednostně eukaryotických buněk s expres^rVním vektorem, obsahujícím verze b, c nebo g přetvořené humánní oblasti V„. Sklidí se buněčné supernatanty a zkouší na ti produkci humánního IgG a potom na humánní IgG, který je schopen

vazby k EGFR (viz obr 8, okénko A). Tyto výsledky ukazují, že verze b V_T oblasti přetvořené humánní protilátky 425 zvyšují vazbu k antigenú. Potom se provede konkurenční vazebný test* za účelem porovnání přetvořených humánních protilátek 425 s oblastí V_La plus V_Hg a V_Lb plus V_Hg s myší protilátkou 425. Přetvořená humánní protilátka MAb 425s verzí b oblasti V_L má vyšší afinitu pro antigen. Změna F71Y v oblasti V_L tedy zvyšuje vazbu antigenú. Přetvořená humánní protilátka MAb 425 s oblastí V_Lb a V_Hg vykazuje afinitu pro antigen, která činí 60 až 80 % afinity murinní protilátky MAb 425.

Z jiných experimentů* za použití přetvořené humánní protilátky, obsahující konbinaci V_Lb plus V_Hg (viz příklady 10 a 11)^ je zřejmé, že vazebná potence k EGFR je podobná pro chimérickou, přetvořenou a murinní protilátku.

Z vynálezu je zřejmé, že poměrně konzervativní změny ve FR zbytcích mohou silně ovlivnit vazbu antigenú.

Molekulární model variabilních oblastí myší protilátky 425 jasně ukazuje, že tento zbytek v poloze 30 je na povrchu této molekuly* v sousedství CDR-1. Ve skutečnosti^ Hl^ podle definice , kterou provedli Chothia a Lesk /1987/, J. Mol. Biol. 196, 901, zasahuje od zbytku 26 do zbytku 32, takže zahrnuje zbytek v poloze 30. Když se zbytek v poloze 30 v protilátce CAMPATH-1H změní ze Ser na Thr, nemá to žádný vliv na vazbu antigenú. Když se poloha 30 změní ze Ser na Thr v přetvořené humánní oblasti V_H425, zlepší se vazba k antigenu. Ukazuje se, že aminokyselina v poloze 30 skutečně hraje určitou úlohu při vazbě antigenú při této konkrétní interakci protilátky s antigenem. Jelikož změna S30T zlepšuje vazbu antigenú pouze nepatrně a jelikož tato změna není pro vazbu antigenú podstatná, vykazuje Thr v poloze 30 pouze slabou interakci s antigenem.

-ί1·

- χZměna zbytku v poloze 71 ve silně ovlivňuje vazbu antigenu. Tato skutečnost je překvapující, poněvadž dva zbytky, které byly zkoušeny v této poloze, t.j. Val a Leu, se liší pouze jednou methylskupinou. H2 myší protilátky 425 je členem H2^ skupiny 2 kanonických struktur, definovaných Chothiou a dalšími /1989/, Nátuře 342, 877. HyHEL-5 má H2 se sekvencí aminokyselin podobnou té, kterou má H2 myší protilátky 425.

V HyHEL-5 Pro v poloze 52A v CDR-2 se sbalí do dutiny,vytvořené malou aminokyselinou (Ala) v poloze 71 FRs. V modelu variabilních oblastí myší protilátky 425 existuje podobná interakce mezi Pro-52A a Val-71. Ve V^ myší protilátky 425 je sice Pro v poloze 52A schopen sbalit se do dutiny, vytvořené Val v poloze 71, nahrazení Val-71 Leu však způsobuje molekulární kolizi, která může změnit konformaci smyčky CDR2.

Z tohoto důvodu změna V71L v přetvořené V„ oblasti humánní protilátky 425 znovu vytváří interakci CDR-2-FR, k jaké dochází v oblasti V_H myší protilátky 425. To s překvapením velmi zlepšuje vazebné vlastnosti pro antigen přetvořených humánních protilátek 425 (srovnej přetvořené humánní protilátky s verzemi a a b V„ na obr. 6).

ri

Změna v poloze 71 V_L pravděpodobně ovlivňuje konformaci CDR, poněvadž zbytek 71 je členem navrhované kanonické struktury pro Ll (CDR-1) (Chothia a další /1989/, viz shora uvedená citace). Zbytek 29 v CDR-1 je pohřbený zbytek (buried residue) a má styk se zbytkem 71 ve FRs. V myší protilátce 425 je zbytkem 71 ve V_L Tyr. V humánních FRs, používaných pro konstrukci přetvořených humánních oblastí V^,je zbytkem 71 Phe. Ukazuje se, že hydroxyskupina, která je přítomna v Tyr, ale nikoliv ve Phe, má úlohu při udržování správné konformace CDR-1.

Z molekulárního modelu variabilních oblastí myší protilátky 425 je zřejmé, že Lys-66 vytváří solný můstek s Asp-86.

- 32-χZavedení většího zbytku Arg do polohy 66 by tuto strukturu rozbilo. Ala-67 může interagovat s CDR-2 a současná výměna zbytků 66 a 67 na Arg a Val, jako ve V_Ha425,by mohla mít nepříznivý sterický účinek na CDR-2. Zbytek v poloze 48 je, jak známo, zbytek pohřbený (Chothia a Lesk /1987/, viz shora uvedená citace) a model tuto skutečnost potvrzuje. Změna zbytku 48 z Ile, který se nalézá v myší protilátce 425, na Val, který se nalézá v humánních oblastech V_H podskupiny I, by mohl ovlivnit vazbu antigenu obecně tím, že by došlo k rozbití této struktury. Také aminokyselina v poloze 48 je blízko CDR-2 a může mít malý sterický účinek na smyčku CDR-2.

Ze studií konkurenční vazby je zřejmé, že nejlepšími přetvořenými humánními oblastmi a V^ jsou oblasti V^b a V_Rg. V_Hg obsahuje všech pět změn FR, diskutovaných výše, a zároveň změnu v poloze 94, která je zahrnuta v první verzi v oblasti V_H přetvořené humánní protilátky 425. FRS ve verzi b oblasti V_L přetvořené humánní protilátky 425 jsou ze 70 % identické s FRS v oblasti V_L myši protilátky 425. FRS ve verzi g oblasti V_R přetvořené humápní protilátky 425 jsou z 80 % identické s příslušnými oóastmi myší protilátky.

Terapeutické a diagnostické použití protilátek podle vynálezu

Protilátky podle vynálezu je možno podávat humánním pacientům z terapeutických nebo diagnostických důvodů v souladu s postupy, známými z dosavadního stavu techniky. Obvykle se protilátka nebo její fragmenty podávají ve formě parenterálních injekcí, přednostně intraperitoneálně. Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu se však také mohou podávat intravenopně.

Stanovení vhodných titrů protilátky pro podávání je v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru. Obvykle se při podávání monoklonálních protilátek podle vynálezu používá tak

- η- χvelkého rozmezí dávkování, aby se jím dosáhlo požadovaného účinku při potlačování nádorů. Dávkování by nemělo být tak vysoké, aby způsobovalo nepříznivé vedlejší účinky, jako jsou nežádoucí křížové reakce, anafylaktické reakce apod. Dávkování se bude obvykle lišit v závislosti na stáři, zdravotním stavu, pohlaví a rozvoji choroby u pacienta a je v rozsahu zkušeností odborníků v tomto oboru. Ošetřující lékař může dávkování upravit v případě jakýchkoliv kontraindikací, imunologické tolerance nebo podobných stavů. Dávkování může kolísat v rozmezí od 0,1 do 70 mg/kg, přednostně od 0,1 do 50 mg/ kg, přičemž tato dávka se může podávat jednou nebo .několikrát denně po dobu jednoho nebo více dnů.

Přípravky pro parenterální podávání zahrnují sterilní^ vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Jako příklady nevodných rozpouštědel je možno uvést propylen glykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje, jako olivový olej,a organické estery, které je možno podávat injekčním způsobem, jako je e^yloleát. Vodné nosiče zahrnují vodu, vodně-alkoholické roztoky, emulze nebo suspenze, včetně fyziologického roztoku a tlumených médií. Parenterální vehikula zahrnují roztok chloridu sodného , Ringerovu dextro^u, dextró|u a chlorid sodný, laktátované Ringerovy přípravky nebo stabilní oleje. Intravenó vehikula zahrnují přípravky doplňující kapalinu a živiny, nebo elektrolyt, jako jsou přípravky na bázi Ringerovy dextro^ý apod.. Také mohou být přítomny konzervační látky a jiné přísady, jako například antiraikrobiální látky, antioxidanty, chelatační činidla, inertní plyny apod..

Protilátky mohou být konjugovány k toxinu, jako je ricinová podjednotka A, toxin diphteria, nebo k toxickému enzymu. Alternativně mohou být označeny radiokativním izotopem/' v souladu se známými metodami tohoto oboru. Protilátka podle tohoto vynálezu však vykazuje vynikající cytotoxicitu za nepřítomnosti toxinu a za přítomnosti efektorových buněk, jako jsou humánní monocyty.

/-χTuhé nádory, které je možno detekovat a léčit za použití způsobů podle tohoto vynálezu,zahrnují melanomy, gliomy a karcinomy. Rakovinné buňky, které neexprimují receptory EGFR ve velkém rozsahu, je možno indukovat, aby tak činily, za použití lymfokinových přípravků. Lymfokinové přípravky mohou také způsobovat homogennější expresi receptorů. EGF v buňkách nádoru, což vede k účinnější léčbě.

Lymfokinové přípravky, které se hodí v této souvislosti pro podávání, zahrnují interferon-gamma, faktor nekropý nádorů a jejich kombinace. Lze je podávat intravenózně. Vhodná dávka lymfokinu činí 10 000 až 1 000 000 jednotek na pacienta.

Pro diagnostické účely je možno protilátku konjugovat k radio-opaknímu barvivu, nebo je inožno ji značit·' radioizotopem.

Přednostní metodou značení je Jodogenová metoda (Fraker a další /1978/, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 849).

Pro diagnostické účely se protilátka přednostně podává ve formě fragmentů Fíab'^· To zajišťuje dosažení vynikajících výsledků, takže není nutno odečítat pozadí. Fragmenty je možno připravovat známými postupy (viz například Herlyn a další /1983/, Cancer Res. 43, 2 731). Obvykle se provádí štěpení pepsinem při kyselém pH a fragmenty se oddělují od nerozštěpeného IgG a fragmentů těžkého řetězce chromatografií na Pro(R) tein A-Sepharose '.

Přetvořené humánní protilátky 425 podle tohoto vynálezu způsobují u lidí imunologickou odpoved s nižší pravděpodobností, než myší nebo chimérické protilátky 425. Afinita nej lepší verze přetvořené humánní protilátky 425, která tvoří nejlepší provedení tohoto vynálezu, je stejná, jako afinita myší nebo chimérické protilátky 425. Vazebné studie ukazují, že schopnost soutěžit s EGF o vazbu k EGFR za optimálních podmínek je u chimérické, přetvořené i murinní protilátky stejná. Kromě toho, přetvořené humánní protilátky 425 jsou při terapeutickém

použití u lidí účinnější než myší nebo chimérická protilátka 425. Díky velkému snížení imunogenicity vykazuje přetvořená humánní protilátka 425 v lidském těle delší poločas životnosti a pravděpodobnost, že u humánního pacienta způsobí nežádoucí imunologickou odpoved^je snížena na nejnižší míru.

Výsledky dosažené s definovanou protilátkou MAb 425 ukazují, že humanizované monoklonální protilátky, obsahující umělou konvenční sekvenci, nezpůsobují pozoruhodnou minimální odpověd. Další výhody vynálezu jsou popsány výše.

Na základě výše uvedeného popisu je možno konstatovat, že hodnota nových protilátek podle vynálezu pro terapeutické a diagnostické účely je mimořádně vysoká.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Molekulární klonování a sekvenování

Z buněčné linie W 425-15 (ACCT HB 9629), která produkuje protilátku MAb 425se izoluje veškerá RNA. Pro produkci veškeré RNA se použije přibližně 9,6 x 10 buněk, za použití metody s guanidinium-CsCl (Chirgwin a další /1979/, Bioche •mistry 18, 5 294). Supernatanty z buněk, které byly použity pro izolaci veškeré RNA, se zkoušejí metodou ELISA, aby se zajistilo, že buňky produkují ve vysokých množstvích správ nou protilátku MAb. Připraví se póly(A⁺)RNA (viz Aviv a Leder /1972/, Proč. Nati.Acad. Sci.USA 69, 1 408).

-ii

-χDvouvláknová cDNA se syntetizuje v podstatě způsoby, popsanými v publikaci Gubler a Hoffman /1983/, Gene 25, 263, pouze s tím rozdílem, že se pro zahájení syntVézy prvního vlákna použije primerů, které jsou homologické s 5'- oblastmi myších kappa a gamma-2a'imunoglobulinových konstantních, oblastí (viz Levý a další /1987/, Gene 54, 167). Primer lehkého řetězce je 26-mer (oligonukleotid 1), tabulka I), který byl sestrojen na základě publikovaných dat (Levý a další /1987/, Gene 54,167 ; Kaariten a další /1983/, J. Immunol. 130, 937). Primer těžkého řetězce je 25-mer (oligonukleotid 2, tabulka I), který byl sestrojen na základě publikovaných dat (Kaariten a další /1983/ J. Immunol. 130, 937; Kabat a další /1987/ Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.

Health and Human Services, US Government Printing Offices. Primery byly navrženy a synthetizováný* pomocí zařízení Applied Biosystems 380B DNA Synthesizer a přečištěny na močovino-akrylamidových gelech. Po synt^éze druhého vlákna se tupě zakončené cDNA klonují do Smal-štěpeného pUCl8 (obchodně dostupný produkt) a transformují do kompetentních buněk E. coli, například DH5-alfa (obchodně dostupný produkt). Kolonie se pomocí mřížky přenesou na agarové misky a provede se skríning hybridizací za použití ^^p__znag_ený_ch primerů pro synt^ézu prvního vlákna ( Carter a další /1985/, Oligonucleotide Sitedirected Mutagenesis in M 13, an Experimental Approach Manual, Anglian Biotechology Ltd. Colchester). Sekvenování dvouvláknové pla^midové DNA se provádí za použití Sequenase (United States Biochemical Corporation).

Příklad

Konstrukce chimérických genů

Pro každou variabilní oblast se syntetizuje přední 5'a zadní 3'primer pro PCR reakci (řetězová reakce pomocí polymera

Κ-

(oligonukleotidy 3 až 6, viz tabulka I). Reakce PCR se provádí za použití 1 ng DNA z plasmidu pUC18, obsahující klonovanou cDNA, předního a zadního PCR primeru, z nichž každý je přítomen v konečné koncentraci 1 ^uM, vždy 200 pM DNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,1 g/1 želatiny. Na každé stanovení se přidá 2,5 jednotky polymeráty DNA Amplitaq (Perkin Elmer Cetus). Po počátečním 1,5 minutovém tavení při 94 °C se provede 25 cyklů amplifikace při 9^°C po dobu 1 minuty, °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 3 minut. Závěrečný prodlužovací stupeň při 72 °C se provádí po dobu 10 minut. PCR reakční směsi se dvakrát extrahují směsí fenolu a chloroformu, provede se srážení ethanolem a potom štěpení produktu HindlII a BamHI. Fragment PCR,kódující oblast V_L nebo V_H,se potom klonuje do expres^lVního vektoru. Tento vektor obsahuje enhancer a promotor z HCMV (humánní cytomelovirus), bakteriální neo gen a počátek replikace SV40. Vloží se 2,0Kb BamHI fragment genomové DNA,kódující humánní gamma-1 konstantní oblast (Takahashi . Vs a další /1982/, Cell 29, 671), ve správné orientaci ^>e směru za V_R oblastí fragmentu (viz HCMV-CV^425-gamma-l na obr. 1) . Tento vektor se později přizpůsobí odstraněním místa BamHI u 3'- konce fragmentu konstantní oblasti, čímž se umožní, aby byly variabilní oblasti přímo vloženy do expresaního vektoru těžkého řetězce, jako HindlII-BamHI fragmenty (Maeda a další /1991/, Hum, Antibod. Hybridomas 2, 124). Fragment, kódující oblast V_T.se vloží do podobného HCMV expresMrního vektoru, který v tomto případě obsahuje BamHI fragment genomové DNA, přibližně o velikosti 2,6 Kb, který kóduje humánní kappa konstantní oblast a obsahuje akceptorové místo pro sestřih a poly(A⁺) (Rabbitts a další /1984/, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113, 166) (viz HCMV-CV_L-425-kappa na obr. 1).

-lS

Příklad 3

Molekulární modelování V_T a V„ MAb 425

J-ι ii

Molekulární model variabilních oblastí murinní protilátky MAb 425 byl vytvořen na základě vyřešené struktury vysoce homologické anti-lysosymové protilátky HyHEL-5 (Sheriff a další /1987/, Proč. Nati. Acad.Sci USA 84, 8075). Variabilní oblasti protilátek MAb 425 a HyHEL-5 vykazují přibližně 95% homologii.

Model byl vytvořen na zařízení Silicon Graphics Iris 4D workstation running UNIX za použití programovacího balíku pro modelování molekul QUANTA (Polygen Corp). Identické zbytky ve struktuře byly zachovány a neidentické zbytky byly nahrazeny za použití maximálního překrývání (maximum overlap, Snow a Amzel /1986/) , které bylo zavedeno do zařízení pro modelování proteinů QUANTA. Konformace hlavního řetězce tří N-terminálních zbytků v těžkém řetězci byly nahrazeny z homologické protilátkové struktury (HyHEL-10, Padlan a další /1989/, Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 5938), poněvadž jejich teplotní faktory byly abnormálně vysoké (vyšší než střed plus tři směrodatné odchylky, měřeno od teplotních faktorů hlavního řetězce) a poněvadž ovlivňovaly sbalování CDR-3 (H3) (Martin /1990/, disertační práce na doktorát filosofie na Oxfordské univerzitě). Sekvence CDR-1 (Ll) a CDR-2 (L2) oblasti a sekvence CDR-1 (Hl) a CDR-2 (H2) oblasti z protilátky MAb 425 odpovídají kanonickým formám, které postulovali Chothia a další /1989/, Nátuře 342, 877). Hlavní úhly tor^e řetězců těchto smyček byly udržovány tak jako v HyHEL-5. Sekvence CDR-3 (L3) oblasti V_T a sekvence CDR-3 (H3) oblasti

J-l

V„ z protilátky MAb 425 neodpovídají kanonickým strukturám, a proto byly modelovány odlišným způsobem. Bylo použito počítačového programu Martina a dalších /1989/, Proč. Nati. Acad. Sci USA 86, 9268) pro extrakci smyček z Brookhavenovy databanky ό¹ (

(Bernstein a další, /1977/, J. Mol. Bio 112, 525). Smyčky byly potom vytříděny na základě podobnosti sekvence, energie a zbytků,určujících strukturu (Sutcliffe /1988/, disertační práce na dokorát filosofie na Londýnské univer|4tě).Kvalitní smyčky byly kontrolovány na grafice a nej lepší z nich byly vybrány na základě vizuálního pozorování. H3 byl modelován na hovězí glutathion peroxidase (Epp a další /1983/, Eur. J. Biochem. 133, 51) v oblasti zbytků 92 až 103. L3 byl modelován na murinní IgA (J539) Fab fragmentu (Suh a další /1986/, Proteins 1, 74) v oblasti zbytků 88 až 96 lehkého řetězce.

Model byl podroben minimalizaci energie nejstrmějšími poklesy a konjugátovými gradienty za použití potenciálu CHARm (Brooksa další /1983/, J. Comp. Chem. 4, 187), zakomponovaným do QUANTA, aby se odstranily nežádoucí kontakty atomů a aby se optimalizovaly Van der Waalsovy a elektrostatické interakce.

Příklad 4

Konstrukce genů humanizované protilátky

Konstrukce první verze lehkého řetězce přetvořené humánní protilátky 425 byla prováděna za použití CDR-roubovacího postupu, který se podobá postupu, popsanému v Reichmann a další /1988/, Nátuře 322, 21; Verhoeyen a další /1988/, Science 239, 18). Jednovláknová templátová DNA byla připravena z vektoru Ml3mpl8 (který je obchodně dostupný), obsahujícího fragment HinDIII-BamHI,kódující humánní anti-lysosymovou oblast V_T (EP 239 400, G. Winter). FRs tohoto lehkého řetězce

Jj jsou odvozeny z krystalograficky vyřešeného proteinu REI.

Byly navrženy tři oligonukleotidy, které sestávaly ze sekvencí DNA, kódujících každou CDR lehkého řetězce myší protilátky MAb 425, lemovaných na každém konci 12 bázemi DNA,komplementární sekvencím DNA,kódujícím sousední FRs humánního REI

(oligonukleotidy 7 až 9 v tabulce I). Oligonukleotidy byly syntetizovány a purifikovány shora uvedeným způsobem. Všechny tři oligonukleotidy byly fosforylovány a současně použity 2, v systému pro mutagenepi in vitro, zaměřenou na oligonukleotidy. Použitý systém je založen na metodách, keré vypracovali Eckstein a jeho spolupracovníci (Taylor a další /1985/, Nucleic Acids Res, 13, strana 8749 a 8764; Nakamaye a Eckstein /1986/,

Nucleic Res. 14, 9679; Sayers a další /1988/, Nucleic Acids Res. 16, 791). Až do exonukleaZového III štěpícího stupně bylo postupováno podle instrukcí výrobce. Potom byla reakční směs extrahována směsí fenolu a chloroformu, produkt byl sražen ethanolem a resuspendován ve 100 yul TE. Objemu 10 ^il bylo použito jako templátové DNA při 10^x1 PCR amplifikační reakci za použití univerzálního primeru M13 a rever^ího sekvenačního primeru až do koncové koncentrace každé z těchto látek 0,2 ^liM. Pufrovací a t^ermocyklové podmínky byly stejné jako v příkladu 2 s výjimkou toho, že bylo použito hybridazační teploty 55 °C.

Reakční směs byla dva^krát extrahována směsí fenolu a chloroformu, produkt byl sražen ethanolem a potom štěpen HindlII a BamHI a subklonován do pUC18. Předpokládané pozitivní klony byly iden- j · · * tifikovány hybridizací k P - značeným mutagenním primerům (Carter a další /1987/, viz výše uvedená citace). Klony byly potvrzeny jako pozitivní sekvenováním. Oblast V_L,obsahující všechny tři roubované CDR,byla klonována jako fragment HindlII* 2

BamHI do expres^ního vektoru V^, za vzniku pla/midu

HCMV-RV_Ta425-kappa.

Jj - I

I

Verze b přetvořené oblasti V_T byla konstruována za j_i použití metody PCR mutagene/e (Kammann a další /1989/, Nucleic Acids Res. 17, 5404) s menšími modifikacemi. Templátovou DNA byla RV^a subklonovaná do pUC18. První PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 50 yul a reakční směs obsahovala jeden ^ug j templátu, M13 reversní sekvenační primer a primer 10 (tabulka I) | o konečné koncentraci 1 iuM, 200 uM každé dNTP, 10 mM Tris-HCl

-χ(ρΗ 8,3) , 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl a 0,1 g/1 želatiny. Ke každému stanovení byla přidána jedna jednotka DNA polymeraSy Amplitaq. Reakce byla prováděna se třemi replikacemi. Po 1,5 minutovém tavení při 94 °C následovalo 40 reakčních cyklů 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 37 °C a 2 minuty při 72 °C. Nakonec bylo provedeno prodlužování po dobu 10 minut při 72 °C. Reakční produkty byly spojeny a extrahovány směsí fenolu a chloro formu. Před izolací PCR produktu z TAE agarosového gelu byl produkt sražen ethanolem. Jedné desetiny prvního PCR reakčního produktu se potom použilo jako jednoho z primerů při druhé PCR reakci. Druhá reakce byla stejná jako první, s výjimkou použití prvního reakčního produktu a 20 pmol univerzálního primeru M13. Cyklování bylo prováděno způsobem,popsaným v publikaci Kammann a další /1989/ Nucleic Acids Res 17, 5404). Fragment HindlIIBamHI byl klonován do p-UC18 a sekvenován. Fragment DNA,nesoucí požadovnou změnu, byl subklonován do expres^tního plasmidu za vzniku pla^ínidu HCMV-RV^b425-kappa.

První verze přetvořené humánní oblasti V„ protilátky 425 byla syntetizována chemicky. Byla sestrojena DNA sekvence, kódující požadovanou sekvenci aminokyselin a obsahující potřebné lemovací sekvence DNA (viz výše) . Použití kodonu bylo optimalizováno pro savčí buňky zabudováním užitečných míst pro restrik ční enzymy do sekvencí DNA,kódujících FRs. Byl syntetizován úsek o velikosti 454 bp a subklonován do pUC18, jako EcoRIHindlII fragment. Potom byl HindlII-BamHI fragment, kódující těžký řetězec přetvořené humanizované protilátky 425, přenesen do Vjj expres\Vního vektoru, za vzniku plasmidu HCMV- RV^a-425gamma-1.

Různými způsoby byly zkonstruovány další verze (celkem 8) přetvořených humanizovaných těžkých řetězců. Fragment HindlIIBamHI, kódující verzi a těžkého řetězce,byl přenesen do M13mpl8 a byla připravena jednovláknová DNA. Za použití oligonukleotidů 11 až 13 ( viz tabulka I) byla výše popsanou

-1,2-χPCR-přizpůsobenou Μ13 mutagene^i, popsanou výše, připravena DNA,kódující verze d_z e, f a g oblastí V_H přetvořené humánní protilátky 425 v pUC18, Tyto verze byly subklonovány do expresivního vektoru těžkého řetězce jako fragmenty HindlII-BamHI, za vzniku pla^midů HCMV-RV_Hd425-gamma-l, HCMVRV_He425-gamma-l, HCMV-RV^f425-gamma-l a HCMV-RV_Hg425-gamma-l.

Verze b a c oblastí V_H přetvořené humánní protilátky 425 byly vytvořeny za použití PCR mutageneze, kterou popsali Kammann a další /1989/, viz výše uvedená citace. Jako templáto vé DNA bylo použito verze a oblasti V_H humánní protilátky 425, subklonované do pUC18,a jako mutagenního primerů bylo při první PCR reakci použito bud primerů 13 nebo 14 (viz tabulka I) . Po mutagenefúi a sekvenování byly sekvence, nesoucí požadované změny, subklonovány do expresivního pla^midu těžkého řetězce, za vzniku pla^ínidů HCMV-RV_Hb425-gamma-l a HCMVRVHc425-gamma-l.

Přetvořené verze h a i těžkého řetězce byly zkonstruo vány z klonů existujících verzí na bázi pUC. 0,2 Kb fragment HindlII-Xhol z verze e byl ligován k 2,8 Kb fragmentu XholHindlII bud z verze b nebo c, za vzniku nových verzí h a i. Fragmenty HindlII-BamHI, kódující tyto verze,byly subklonovány do expres^ního faktoru těžkého řetězce za vzniku HCMV-RV_Hh425-gamma-l a HCMV-RV_Hi425-gamma-l

Příklad 5

Transfekce DNA do buněk COS

Buňky COS byly elektroporovány vždy 10 jag expres.iAního vektoru,nesoucího jednak gen,kódující těžký řetězec,a jednak gen,kódujícílehký řetězec. Krátce řečeno, 10 pg každého pla^· midu bylo přidáno k 0,8 ml alikvotního dílu suspenze buněk COS v PBS o koncentraci 1 x 10 buněk na ml. Bylo použito za- Ú-χí R) 2.

řízení Bio-Rad Gene Pulser pro dodání pulsu 1 900 V s kapacitou 25 yuF. Buňky byly ponechány zotavit se v průběhu 10 minut při teplotě místnosti a potem byly naneseny na misky do 8 ml DMEM s obsahem 10 % fetálního telecího séra.

Po 72 hodinách inkubace byla média shromážděna, zbavena úlomků buněk odstředěním a před provedením analýzy metodou ELISA byla uložena za sterilních podmínek krátkou dobu při 4 °C nebo delší dobu při -20 °C.

Příklad 6

Transfekce DNA do buněk CHO byla prováděna způsobem popsaným v příkladu 5.

Příklad 7

Kvantifikace produkce IgG a detekce vazby antigenu

Humánní IgG, přítomný v supernatantech z buněk COS, byl detekován metodou ELISA. Při stanovení humánního IgG testem ELISA byly plotny s 96 jamkami povlečeny kozím anti-humánním IgG (celé molekuly) a humánní IgG ve vzorcích, který se navázal na plotny, byl detekován za použití alkalickou fosfata^ou konjugovaného kozího anti-humánního IgG (specifického vůči gamma-řetězcům) . Jako standardu bylo použito zakoupeného přečištěného humánního IgG. Vazba antigenu,rozpoznaná protilátkou MAb 425/ byla stanovena druhým testem ELISA. Plotny byly povlečeny EGFR proteinovým přípravkem (který lze získat například způsobem, popsaným v publikaci Rodeck a další /1987/, Cancer Res.

47, 3692), a protilátky, vázající se k EGFR, byly detekovány za použití bud anti-humánní igG (specifického vůči gamma-řetězcům) peroxidajlového konjugátu (v případě chimérických a přetvořených humánních protilátek)' nebo za použití anti-myší IgG (celá molekula) peroxidá^óvého konjugátu (v případě myší yprotilátky MAb 425). Oba konjugáty byly dodány firmou Sigma. Purifikované murinní protilátky MAb 425 bylo použito jako standardu.

Příklad 8

Konkurenční vazebná zkouška

Murinní protilátka MAb 425 byla biotinylována za použití odpovídající soupravy, která je k dostání na trhu. Plotny pro test ELISA byly povlečeny EGFR proteinem v optimálním zředění. Zředěné supernatanty buněk COS v objemu 50 yul byly smíseny s 50 jul biotinylované murinní protilátky MAb 425 (o koncentraci podle Lestu ELISA 1,75 yug/ml) . Každý supernatant z buněk COS byl zkoušen dvakrát. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě místnosti. Vázaná biotinylované murinní protilátka MAb 425 byla detekována přídavkem komplexu streptavidin-peroxidaga z ředkve, kterýžto komplex je k dostání na trhu. Kontrolní pokus, při němž není přítomna žádná konkurenční látka, vedl k hodnotě procenta inhibice nebo blokování, již lze vypočítat pro každý supernatant buněk COS podle následujícího vzorce :

100 - C. (°°45o vzorku/OD_45Q kontrolního vzorku) x 100 J

Příklad 9 _z

Různé p»óby murinní, přetvořené a chimérické protilátky

MAb 425 byly analyzovány metodou SDS-PAGE (SDS - PolyacrylamideGelspaceelectrophoresis) kterou popsali Laemmli a další. Do každé jamky bylo naneseno 2,5 yug každého vzorku jak za neredukujících, tak za redukujících podmínek. Protein byl vi^uali^óván barvením Coomassie . Obr. 9 (A) ukazuje, že

- /,5--xvzorky měly podobnou čistotu. Rozmezí molekulové hmotnosti protilátek bylo 180 000 až 200 000.

Příklad 10

Přetvořená protilátka MAb 425 byla purifikována gelovou (R) prostorovou filtrací na Superose 12 (Pharmacia Corp., Švédsko) za použití standardních metod. Protilátka byla eluována pomocí PBS (pH 7,4, 0,8 M NaCl) (0,1 M) . Je možno získat jediný pík (při 5 minutách) (obr.9 (B) ) .

Příklad 11

Biotinem značené protilátky MAb 425 bylo použito jako konkurentu neznačené protilátky MAb 425 nebo jejích derivátů při vazbě k EGFR. Značení biotinem bylo provedeno standardními metodami. EGFR byl převeden do roztoku z membrán A431 standardními metodami. Buňky A 431 byly zakoupeny na trhu.Detekce byla prováděna po inkubaci s POD-konjugovaným streptavidinem a substrátem. Z těchto dat byly sestrojeny inhibiční křivky (obr. 10) . Křivky ukazují, že vazba různých protilátek je srovnatelná.

Příklad 12

Různé próby· purifikované murinní, chimérické a přetvořené MAb 425 byly zkoušeny na svou schopnost soutěžit s EGF o vazbu k EGFR. Zkouška byla prováděna za použití 1 O cj

I-značeného EGF (Amersham Corp., Velká Británie) a různých protilátek, které značenému EGF konkurují při vazbě na EGFreceptor pozitivní membrány (A431). Zkušební systém je založen na technologii SPA. Konkurenční křivky murinní a přetvořených protilátek (3 ipaří&J’) jsou téměř identické (obr. 11) .

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chimérická monoklonální protilátka, obsahující místa,vázající antigen, CDR, nehumánního původu, úseky základní struktury, FR, nehumánního původu a konstantní oblasti humánního imunoglobulinu, která vykazuje tyto znaky:

   i) váže se k humánním receptorům EGF a inhibuje vazbu EGF k receptorů EGF, ii) konstantní oblasti jejího těžkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce gamma-1 a konstantní oblasti lehkého řetězce zahrnují sekvenci aminokyselin humánního řetězce kappa, iii) její oblasti CDR,reprezentující místa,vázající antigen,zahrnují následující sekvence aminokyselin lehký řetězec

   CDR-1 -Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Tyr-Met-TyrCDR-
2. 2 -Asp-Thr-Ser-Asn-Leu-Ala-SerCDR-3 -Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-His-Ile-Phe-Thrtěžký řetězec

   CDR-1 -Ser-His-Trp-Met-HisCDR-2 -Glu-Phe-Asn-Pro-Ser-Asn-Gly-Arg-Thr-Asn-Tyr-AsnGlu-Lys-Phe-Lys-SerCDR-3 -Arg-Asp-Tyr-Asp-Tyr-Asp-Gly-Arg-Tyr-Phe-Asp-Tyriv) její úseky základní struktury, FR, variabilní oblasti, která nemá vztah k místům vázajícím antigen, zahrnují následující aminokyselinové sekvence

   -χlehký řetězec

   FR-1 -Gln-I le-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-I le-Met-SerAla-Ser-Pro-Gly-Glu-Lys-Val-Thr-Met-Thr-CysFR-2 -Trp-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Gly-Ser-Ser-Pro-Arg-LeuLeu-Ile-TyrFR-3 -Gly-Val-Pro-Val-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-GlyThr-Ser-Tyr-Ser-Leu-Thr-Ile-Ser-Arg-Met-Glu-AlaGlu-Asp-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr-CysFR-4 -Phe-Gly-Ser-Gly-Thr-Lys-Leu-Glu-Ile-Lystěžký řetězec

   FR-1 -Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu-ValLys-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Lys-Leu-Ser-Cys-Lys-AlaSer-Gly-Tyr-Thr-Phe-ThrFR-2 -Trp-Val-Lys-Gln-Arg-Ala-Gly-Gln-Gly-Leu-Glu-TrpIle-GlyFR-3 -Lys-Ala-Thr-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Ser-Ser-ThrAla-Tyr-Met-Gln-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Ser-Glu-AspSer-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-SerFR-4 -Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Thr-Leu-Thr-Val-Ser-Ser2. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA,kódující variabilní a konstantní oblast lehkého řetězce chime rické monoklonální protilátky podle nároku 1, který nese označení pCVL425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6338.
3. 3. Expresní vektor, obsahující sekvenci DNA,kódující variabilní a konstantní oblast těžkého řetězce chime rické monoklonální protilátky podle nároku 1, který nese _ w-xoznačení pCVH425 a je uložen ve sbírce DSM pod přírůstkovým číslem DSM 6337.
4. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačuj í cí se tím, že obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 1.