ES2136409T5 - Metodo para mejorar las propiedades de una pasta de harina. - Google Patents

Abstract

UN METODO DE MEJORA DE LAS PROPIEDADES REOLOGICAS DE UNA MASA DE HARINA Y LA CALIDAD DEL PRODUCTO FINAL REALIZADO A PARTIR DE DICHA MASA, QUE SE BASA EN LA ADICION DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UNA OXIDORREDUCTASA CAPAZ DE OXIDAR LA MALTOSA, EN PARTICULAR UNA HEXOSA OXIDASA, AISLADA DE UNA DETERMINADA ESPECIE DE ALGAS COMO IRIDOPHYCUS FLACCIDUM, CHONDRUS CRISPUS O EUTHORA CRISTATA Y UNA MEJORA DE LA COMPOSICION DE LA MASA QUE CONTIENE LA OXIDORREDUCTASA.

Description

Método para mejorar las propiedades de una pasta de harina.

\global\parskip0.900000\baselineskip

La presente invención se refiere a la provisión de pastas de harinas que tienen propiedades reológicas mejoradas y a productos alimenticios harinosos que tienen características de calidad mejoradas, y proporciona una composición que contiene una óxido-reductasa que oxida a la maltosa, capaz de conferir tales propiedades mejoradas a las pastas y a los productos alimenticios acabados fabricados a partir de esta memoria cuando se añade como componente a las pastas, y a un método para preparar pastas y productos alimenticios harinosos mejorados.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

En particular, la invención se refiere a un método para proporcionar pastas de harinas que tienen propiedades reológicas mejoradas y para proporcionar productos acabados secados u horneados fabricados a partir de tales pastas, que tienen características dimensionales, de calidad alimenticia y de textura, mejoradas.

Con respecto a esto, la "fortaleza" o "debilidad" de las pastas es un aspecto importante para fabricar productos acabados harinosos a partir de pastas, incluyendo la fabricación de pan. La "fortaleza" o "debilidad" de una pasta se determina primariamente por su contenido de proteínas y, en particular, el contenido y la calidad de la proteína gluten es un factor importante a este respecto. Generalmente, las harinas con un bajo contenido de proteínas se caracterizan como "débiles". Así, la masa cauchoide, extensible y cohesiva que se forma mezclando agua y harina débil será usualmente altamente extensible cuando se somete a tensión, pero no volverá a sus dimensiones originales cuando se elimine la tensión.

Generalmente, las harinas con un alto contenido de proteínas se caracterizan como harinas "fuertes", y la masa formada mezclando dichas harinas y agua será menos extensible que la masa formada a partir de una harina débil, y la tensión que se aplica durante el mezclado se restaurará sin ruptura en una extensión mayor que la del caso con una masa de harina formada a partir de una harina débil.

Generalmente, se prefiere una harina fuerte en la mayoría de los casos de fabricación de pan debido a las superiores propiedades reológicas y de manipulación de la pasta y a la superior calidad de forma y textura de los productos secados u horneados acabados fabricados a partir de la pasta de harina fuerte.

Generalmente, las pastas fabricadas de harinas fuertes son más estables. La estabilidad de una pasta es una de las características más importantes de las pastas de harinas. Según la "American Association of Cereal Chemists (AACC)", método 36-01A, el término "estabilidad" se puede definir como "el intervalo de tiempo de la pasta sobre el que se obtiene una respuesta positiva y la propiedad de una pasta redondeada mediante la que resiste el aplastamiento bajo su propio peso durante el curso del tiempo". Según el mismo método, el término "respuesta" se define como "la reacción de una pasta a un estímulo, sustancia o serie de condiciones, específico y desconocido, determinado usualmente cociéndolo en comparación con un testigo".

Dentro de las industrias de la panadería y molinería se sabe usar "acondicionantes" de la pasta para fortalecer la pasta. Normalmente, tales acondicionantes de la pasta son agentes oxidantes no específicos tales como, por ejemplo, yodatos, peróxidos, ácido ascórbico, bromato de potasio o azo-dicarbonamida, y se añaden a la pasta con el fin de mejorar la eficiencia del horneado de la harina para lograr una pasta con estirabilidad mejorada y tener, así, una resistencia y estabilidad deseables. El mecanismo detrás de este efecto de los agentes oxidantes es que las proteínas de la harina, en particular el gluten que contiene grupos tiol que, cuando llegan a oxidarse, forman enlaces disulfuro mediante los que la proteína forma una matriz más estable dando lugar a una mejor calidad de la pasta y a mejoras del volumen y la estructura de migas de los productos horneados.

Además de la utilidad anterior del ácido ascórbico/ascorbato como acondicionante de pastas debido a su capacidad oxidante, estos compuestos también pueden actuar como sustrato de una óxido-reductasa, ascorbato-oxidasa que se describe en el documento EP 0682116 A1. En presencia de su sustrato, esta enzima convierte el ácido ascórbico/ascorbato en ácido deshidroascórbico y H_{2}O_{2}. Esta técnica anterior no sugiere que la ácido ascórbico-oxidasa en presencia de ácido ascórbico/ascorbato podrá tener un efecto acondicionador de las pastas, pero asumiblemente este es el caso.

Sin embargo, los consumidores se oponen al uso de varios de los agentes oxidantes actualmente disponibles o no están permitidos por los entres legisladores y, por consiguiente, se ha intentado encontrar alternativas a estos aditivos convencionales de pastas y harinas y, entre otros compuestos, la técnica anterior ha sugerido el uso de glucosa-oxidasa para este fin.

Así, el documento US 2.783.150 describe la adición de glucosa-oxidasa a harina para mejorar la resistencia y la textura de la pasta y el aspecto del pan horneado.

El documento CA 2.012.723 describe composiciones que mejoran el pan que comprenden enzimas celulolíticas tales como xilanasas y glucosa-oxidasa, añadiéndose la última enzima para reducir ciertos efectos desventajosos de las enzimas celulolíticas (reducida resistencia y pegajosidad de la pasta) y se describe que se requiere la adición de glucosa a la pasta para obtener una actividad suficiente de glucosaoxidasa.

\global\parskip1.000000\baselineskip

El documento JP-A-92-084848 sugiere el uso de una composición que mejora el pan que comprende glucosa-oxidasa y lipasa.

El documento EP-B1-321811 describe el uso de una composición enzimática que comprende sulfidrilo-oxidasa y glucosa-oxidasa para mejorar las características reológicas de las pastas. En este documento de la técnica anterior se menciona que el uso de glucosa-oxidasa sola no tuvo éxito.

En el documento EP-B1-338452 se describe una composición enzimática para mejorar la estabilidad de la pasta, que comprende una mezcla de celulasa/hemicelulasa, glucosa-oxidasa y opcionalmente sulfidrilo-oxidasa.

Sin embargo, el uso de glucosa-oxidasa como un aditivo mejorador de la pasta tiene la limitación de que esta enzima requiere la presencia de cantidades suficientes de glucosa como sustrato con el fin de ser eficaz en un sistema de pasta y generalmente, el contenido de glucosa en harinas de cereales es bajo. Por lo tanto, la ausencia de glucosa o su bajo contenido en pastas será un factor limitante de la efectividad de la glucosa-oxidasa como agente mejorador de pastas.

En contraste, generalmente el contenido de maltosa en harinas de cereales es significativamente mayor que el de glucosa y, por consiguiente, una pasta recientemente preparada contendrá normalmente más maltosa que glucosa. Así, en un experimento en el que se analizó el contenido de azúcares en sobrenadantes a partir de suspensiones de harina de trigo y de una pasta preparada a partir de la harina y que además comprendía agua, levadura, sal y sacarosa (como se describe en el ejemplo siguiente 2.3), se encontraron los siguientes valores (% en peso calculado sobre la harina):

1

Además, el contenido de maltosa permanece en un valor relativamente alto en una pasta que se fermentó mediante levadura, puesto que la levadura utiliza primariamente glucosa, o incluso puede aumentar en la pasta por ejemplo durante la actividad de las levaduras debido a la actividad de las enzimas que degradan el almidón tales como por ejemplo la \beta-amilasa, que está intrínsecamente presente en la harina o se añade a la pasta.

Mientras que la técnica anterior ha reconocido los útiles efectos mejoradores de la glucosa-oxidasa sobre las características reológicas de pastas de pan y sobre la calidad de los correspondientes productos horneados, también se ha dado cuenta que el uso de esta enzima tiene varios inconvenientes. Así, se puede requerir añadir a la pasta sacarosa o glucosa como sustrato para obtener un efecto suficiente y, cuando se usa sola sin la adición de otras enzimas, la glucosa-oxidasa no proporciona constantemente un efecto mejorador del pan o la pasta deseado.

Sin embargo, ahora se ha encontrado que la adición de una óxido-reductasa, que es capaz de oxidar maltosa, que incluye hexosa-oxidasa como un único agente acondicionador de la pasta, es decir, sin la adición concomitante de un sustrato para la enzima añadida, o de otras enzimas, a una pasta harinosa da lugar a un aumento de su resistencia a la ruptura cuando la pasta se estira, es decir, esta enzima confiere en sí misma a la pasta una resistencia aumentada mediante la que la pasta llega a tener menos tendencia a la deformación mecánica. Se contempla que este efecto de adición de hexosa-oxidasa a una pasta es el resultado de la formación de retículos entre grupos tiol en aminoácidos del gluten de trigo que contienen grupos azufre que se produce cuando el H_{2}O_{2} generada por la enzima en la pasta reacciona con los grupos tiol que se oxidan por la misma.

La hexosa-oxidasa (D-hexosa:O_{2}-oxido-reductasa, EC 1.1.3.5) es una enzima que en presencia de oxígeno es capaz de oxidar D-glucosa y varios otros azúcares reductores que incluyen maltosa, glucosa, lactosa, galactosa, xilosa, arabinosa y celobiosa, a sus correspondientes lactonas con subsiguiente hidrólisis a los ácidos aldobiónicos respectivos. Por consiguiente, las hexosa-oxidasas difieren de la glucosa-oxidasa que sólo se puede convertir D-glucosa, en que las hexosa-oxidasas pueden utilizar un intervalo más amplio de sustratos azúcares. La oxidación catalizada por la enzima se puede ilustrar como sigue:

\quad

D-glucosa + O_{2} \longrightarrow \delta-D-gluconolactona + H_{2}O_{2},

\vskip1.000000\baselineskip

\quad

D-galactosa + O_{2} \longrightarrow \gamma-D-galactogalactona + H_{2}O_{2}

La hexosa-oxidasa (en lo que sigue también denominada como HOX) se ha aislado de varias especies de algas rojas tales como Iridophycus flaccidum (Bean and Hassid, 1956, J. Biol. Chem., 218:425-436) y Chondrus crispus (Ikawa 1982, Methods Enzymol., 89:145-149). Adicionalmente, se ha mostrado que las especies de algas Euthora cristata (Sullivan et al., 1973, Biochemica et Biophysica Acta, 309:11-22) produce HOX.

Otras fuentes potenciales de hexosa-oxidasa según la invención incluyen especies microbianas o especies de plantas que crecen en tierra. Así, como ejemplo de tal fuente de plantas, Bean et al., Journal of Biological Chemistry (1961) 236:1235-1240, han descrito una oxido-reductasa de zumos de cítricos que es capaz de oxidar un amplio intervalo de azúcares, que incluyen D-glucosa, D-galactosa, celobiosa, lactosa, maltosa, D-2-desoxiglucosa, D-manosa, D-glucosamina y D-xilosa. Otro ejemplo de una enzima que tiene actividad hexosa-oxidasa es el sistema enzimático de Malleomyces mallei descrito por Dowling et al., Journal of Bacteriology (1956) 72:555-560.

Se ha informado que la hexosa-oxidasa aislada de las anteriores fuentes naturales puede ser de uso potencial en la fabricación de ciertos productos alimenticios. Así, se ha mostrado que la hexosa-oxidasa aislada de Iridophycus flaccidum es capaz de convertir lactosa en la leche con la producción del correspondiente ácido aldobiónico y se ha mostrado que es de potencial interés como agente acidulante de la leche, por ejemplo para reemplazar los cultivos microbianos acidulantes para ese propósito (Rand, 1972, Journal of Food Science, 37:698-701). A este respecto, la hexosa-oxidasa se ha mencionado como una enzima más interesante que la glucosa-oxidasa, ya que esta última enzima sólo puede ser enzimáticamente eficaz en la leche u otros productos alimenticios que no contengan glucosa o que tengan un bajo contenido de glucosa, si también se añade glucosa o la enzima que degrada la lactosa, la lactasa, que convierte la lactosa en glucosa y galactosa.

También se ha utilizado la capacidad de las oxido-reductasas que incluye la de la hexosa-oxidasa para generar peróxido de hidrógeno, para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento de ciertos productos alimenticios que incluyen queso, mantequilla y jugo de frutas como se describe en el documento JP-B-73/016612. También se ha sugerido que las oxido-reductasas pueden ser potencialmente útiles como antioxidantes en productos alimenticios.

Sin embargo, la presente invención ha demostrado que la hexosa-oxidasa es altamente útil como agente acondicionante de la pasta en la fabricación de productos de pastas de harinas que no sólo incluyen productos de panadería sino también otros productos fabricados a partir de pastas de harinas tales como tallarines y productos de pastas alimenticias.

Sumario de la invención

Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para mejorar las propiedades reológicas de una pasta de harina y la calidad del producto acabado fabricado a partir de la pasta, que comprende añadir a los ingredientes de la pasta, aditivos de la pasta o a la pasta una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos sea capaz de oxidar maltosa, tal como por ejemplo una hexosa-oxidasa.

En todavía otros aspectos, la invención se refiere a un método para preparar un producto de panadería, que comprende preparar una pasta de harina que incluye añadir una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos sea capaz de oxidar maltosa y cocer la pasta, y a un método para preparar un producto alimenticio basado en una pasta que comprende añadir a la pasta una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que oxida la maltosa.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, el presente método contempla un método para mejorar las propiedades reológicas de pastas de harinas. El método comprende, como se mencionó anteriormente, la adición de una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que oxida la maltosa a un componente de la receta de la pasta o a la pasta que resulta del mezclado de todos los componentes de la pasta. En el contexto presente, "una cantidad eficaz" se usa para indicar que la cantidad es suficiente para conferir a la pasta y/o al producto acabado características mejoradas como se definen en esta memoria.

En una realización útil del método según la invención, la oxido-reductasa es una hexosa-oxidasa. Como se describe con detalle en esta memoria, la hexosa-oxidasa se puede aislar de especies de algas marinas que producen de forma natural esa enzima. Tales especies se encuentran en la familia Gigartinaceae que pertenece al orden Gigartinales. Ejemplos de hexosa-oxidasa que producen especies de algas que pertenecen a las Gigartinaceae son Chondrus crispus e Iridophycus flaccidum. También son fuentes potenciales de hexosa-oxidasa las especies de algas del orden Cryptomeniales, que incluyen las especie Euthora cristata.

Cuando se usan dichas fuentes naturales para la hexosa-oxidasa, típicamente la enzima se aísla del material de partida, las algas, por extracción usando un medio de extracción acuoso. Como material de partida se pueden usar algas en su estado fresco como se cosechan del área marina en la que crecen, o el material de algas se puede usar para la extracción de la hexosa-oxidasa después de secar las láminas, por ejemplo por secado con aire a la temperatura ambiente o por cualquier método de secado industrial apropiado tal como secado con aire caliente circulante o por liofilización. Con el fin de facilitar la etapa de extracción subsiguiente, el material de partida fresco o secado se puede ventajosamente triturar, por ejemplo por molienda o mezcla.

Como medio de extracción acuoso son adecuadas disoluciones amortiguadoras, que por ejemplo tengan un pH en el intervalo de 5-8, tales como disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, disolución amortiguadora de trietanolamina 20 mM o disolución amortiguadora Tris-HCl 20 mM. Típicamente, la hexosa-oxidasa se extrae del material de algas suspendiendo el material de partida en la disolución amortiguadora y manteniendo la suspensión a una temperatura en el intervalo de 0-20ºC tal como a aproximadamente 5ºC durante 1 a 5 días, preferiblemente con agitación.

A continuación, el material de algas suspendido se separa del medio acuoso mediante un método de preparación adecuado tal como filtración, tamizado o centrifugación y la hexosa-oxidasa se recupera subsiguientemente del filtrado o del sobrenadante. Opcionalmente, el material de algas separado se somete a una o más etapas de extracción.

Ya que varias algas marinas contienen pigmentos coloreados tales como ficocianinas, se puede requerir someter al filtrado o al sobrenadante a una etapa de purificación adicional mediante la que se separan estos pigmentos. Como ejemplo, los pigmentos se pueden separar tratando el filtrado o sobrenadante con un disolvente orgánico en el que los pigmentos sean solubles y separando subsiguientemente del medio acuoso el disolvente que contiene los pigmentos disueltos. Alternativamente, los pigmentos se pueden separar sometiendo el filtrado o el sobrenadante a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba.

La recuperación de la hexosa-oxidasa del medio de extracción acuoso se lleva a cabo por cualquiera de los métodos convencionales que permiten el aislamiento de proteínas de medios acuosos. Tales métodos, ejemplos de los cuales se describirán con detalle en lo que sigue, incluyen métodos convencionales para el aislamiento de proteínas tales como cromatografía de intercambio iónico, opcionalmente seguida por una etapa de concentración tal como ultrafiltración. También es posible recuperar la enzima añadiendo sustancias tales como, por ejemplo, (NH_{4})_{2}SO_{4} o polietilenglicol (PEG) que provocan que la proteína precipite, seguido por la separación del precipitado y sometiéndolo opcionalmente a condiciones que permiten que la proteína se disuelva.

Para ciertas aplicaciones de la hexosa-oxidasa es deseable suministrar la enzima en una forma sustancialmente pura, por ejemplo como una preparación esencialmente sin otras proteínas o no proteínas concomitantes y, por consiguiente, la preparación de la enzima relativamente bruta que resulta de las anteriores etapas de extracción y aislamiento, se puede someter a más etapas de purificación tales como más etapas cromatográficas, de filtración por gel o cromatofocalización como también se describirá a título de ejemplo en lo que sigue.

En una realización preferida del método según la invención, se prepara una pasta de harina mezclando harina con agua, un agente de fermentación tal como levadura o un agente de fermentación químico convencional, y una cantidad eficaz de hexosa-oxidasa en condiciones de formar una pasta. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención que se puedan añadir más componentes a la mezcla de la pasta.

Típicamente, tales otros componentes de la pasta incluyen componentes para pastas convencionalmente usados tales como sal, un agente edulcorante tal como azúcares, jarabes o agentes edulcorantes artificiales, sustancias lipídicas que incluyen manteca, margarina, mantequilla o un aceite vegetal o animal y uno o más aditivos para pastas tales como agentes emulsionantes, enzimas que degradan el almidón, enzimas que degradan la celulosa o hemicelulosa, proteasas, lipasas, agentes oxidantes no específicos tales como los anteriormente mencionados, agentes saborizantes, cultivos bacterianos de ácido láctico, vitaminas, minerales, hidrocoloides tales como alginatos, carragenanos, pectinas, gomas vegetales que incluyen, por ejemplo, goma guar y goma de algarrobilla, sustancias que proporcionan fibra en la dieta.

Como ejemplo, los emulsionantes convencionales usados para fabricar productos de pastas de harinas incluyen monoglicéridos, diacetil-ácido tartárico, ésteres de mono- y diglicéridos de ácidos grasos, y lecitinas, por ejemplo obtenidas a partir de soja. Entre las enzimas que degradan el almidón, las amilasas son particularmente útiles como aditivos que mejoran la pasta. La \alpha-amilasa fracciona el almidón en dextrinas que a su vez son fraccionadas por la \beta-amilasa en maltosa. Otras enzimas útiles que degradan el almidón que se pueden añadir a una composición de pasta incluyen glucoamilasas y pululanasas. En el presente contexto, otras enzimas interesantes son xilanasas y otras oxido-reductasas tales como glucosaoxidasa, piranosa-oxidasa y sulfidril-oxidasa.

Una harina preferida es la harina de trigo, pero también se contemplan pastas que comprenden harina derivada de otras especies de cereales tales como de arroz, maíz, cebada, centeno y sorgo.

La pasta se prepara mezclando harina, agua, la oxido-reductasa según la invención y otros posibles ingredientes y aditivos. La oxido-reductasa se puede añadir junto cualquier ingrediente de la pasta que incluya el agua o mezcla de ingredientes de la pasta o con cualquier aditivo o mezcla de aditivos. La pasta se puede preparar por cualquier método convencional de preparación de pastas común en la industria panadera o en cualquier otra industria que fabrique productos basados en pastas de harinas.

La oxido-reductasa se puede añadir como una preparación líquida o en la forma de una composición de polvo seco que comprende la enzima como el único componente activo o en mezcla con uno o más ingredientes o aditivos de la pasta. La cantidad del componente enzimático añadido es normalmente una cantidad que da lugar en presencia de la pasta acabada a 1 a 10.000 unidades por kg de harina, preferiblemente 5 a 5.000 unidades tal como 10 a 1.000 unidades. En las realizaciones útiles, la cantidad está en el intervalo de 20 a 500 unidades por kg de harina. En el presente contexto 1 unidad de oxido-reductasa corresponde a la cantidad de enzima que en las condiciones especificadas da lugar a la conversión de 1 \mumol de glucosa por minuto. La actividad se especifica como unidades por g de preparación enzimática.

El efecto de la oxido-reductasa sobre las propiedades reológicas de la pasta se puede medir mediante métodos estándar según la "International Association of Cereal Chemistry (ICC)" y la "American Association of Cereal Chemistry (AACC)" que incluye el método de amilografía (ICC 126), el método de farinografría (AACC 54-21) y el método de extensigrafía (AACC 54-10). El método de extensigrafía mide por ejemplo la capacidad de las pastas para retener el gas desprendido por la levadura y la capacidad para superar la actividad de las levaduras. En efecto, el método de extensigrafía mide la resistencia relativa de una pasta. Una pasta resistente exhibe una curva extensigráfica mayor y, en algunos casos, más larga que una pasta débil. El método AACC 54-10 define la extensigrafría de la siguiente manera: "la extensigrafía registra una curva de carga-extensión de una probeta de ensayo hasta que se rompe. Las características de las curvas carga-extensión o extensigramas se usan para evaluar la calidad general de una harina y su respuesta a agentes mejoradores".

En una realización preferida del método según la invención, la resistencia a la extensión de la pasta en términos de la relación entre la resistencia a la extensión (altura de la curva, B) y la extensibilidad (longitud de la curva, C), es decir la relación B/C que se mide por el método AACC 54-10, se incrementa en al menos un 10% relativa a la de otra pasta, por lo demás similar, que no contiene oxido-reductasa. En las realizaciones más preferidas, la resistencia a la extensión se incrementa en al menos un 20%, tal como en al menos 50%, y en particular en al menos 100%.

El método según la invención se puede usar para cualquier tipo de pasta de harina con el fin de mejorar las propiedades reológicas de la misma y la calidad de los productos acabados fabricados a partir del tipo particular de harina. Así, el método es altamente adecuado para la fabricación de tipos convencionales de productos de panadería fermentados con levaduras, incluyendo los productos de panadería basados en harina de trigo tales como panes y bollos. Sin embargo, También se contempla que el método puede mejorar las propiedades de las pastas en las que la fermentación se provoca por la adición de agentes de fermentación químicos, que incluyen productos dulces de panadería tales como pasteles que incluyen como ejemplos pasteles triturados y molletes, o bollos.

En un aspecto interesante, la invención se usa para mejorar las propiedades reológicas de pastas para productos tallarines que incluyen "tallarines blancos" y "tallarines chinos" y para mejorar las calidades texturales de los productos tallarines acabados. Una receta típica básica para la fabricación de tallarines comprende los siguientes ingredientes: harina de trigo 100 partes, sal 0,5 partes y agua 33 partes. Típicamente, los tallarines se preparan mezclando los ingredientes en un aparato para mezclar apropiado seguido por laminación de la pasta de tallarines usando una máquina apropiada de fabricar tallarines para formar las cintas de tallarines que subsiguientemente se secan con aire.

La calidad de los tallarines acabados se evalúa entre otros por su color, calidad al cocer y textura. Los tallarines se deben cocer tan rápidamente como sea posible, permanecer firmes después de cocer y preferiblemente no perder ningún sólido en el agua de cocción. Al servir, preferiblemente los tallarines deben tener una superficie lisa y firme, no mostrar pegajosidad y proporcionar un "mordisco" firme y una buena sensación en la boca. Es importante que los tallarines tengan un color claro.

Puesto que la adecuación de la harina de trigo para proporcionar tallarines que tengan las calidades texturales y de comer deseadas pueden variar según el año y el área de crecimiento, es usual añadir a la pasta agentes mejoradores de los tallarines con el fin de compensar la calidad subóptima de la harina. Típicamente, tales agentes mejoradores comprenderán sustancias que proporcionan fibra a la dieta, proteínas vegetales, emulsionantes e hidrocoloides tales como por ejemplo alginatos, carragenanos, pectinas, gomas vegetales que incluyen goma guar y goma de algarrobilla, y amilasas.

Se ha intentado usar glucosa-oxidasa como agente mejorador de los tallarines. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el contenido de glucosa en la harina de trigo puede ser tan bajo que esta enzima no será eficaz.

Por lo tanto, es un aspecto importante de la invención que la oxido-reductasa según la invención sea útil como agente mejorador de los tallarines, opcionalmente en combinación con otros componentes actualmente usados para mejorar la calidad de los tallarines. Así, se contempla que los tallarines preparados según el método anterior tendrán propiedades mejoradas con respecto a las calidades del color, cocción y de comer, que incluyen una consistencia y textura firme, elástica y no pegajosa.

En otra realización útil, la pasta que se prepara por el método según la invención es una pasta para preparar un producto de una pasta alimenticia. Tales productos, que incluyen como ejemplos los espaguetti y los macarrones, se preparan típicamente a partir de una pasta que comprende como ingredientes principales harina y huevos. Después de mezclar los ingredientes, se conforma la pasta en el tipo deseado de producto de pasta y se seca en aire. Se contempla que la adición a una pasta tendrá un efecto mejorador significativo sobre su extensibilidad y estabilidad dando lugar a un producto de pasta acabado que tiene calidades de comer y texturales mejoradas.

La composición mejoradora de pastas puede comprender la oxido-reductasa según la invención y al menos otro ingrediente o aditivo de pastas.

En una realización preferida, la oxido-reductasa es la hexosa-oxidasa. El aditivo o ingrediente adicional puede ser cualquiera de los ingredientes o aditivos que se describieron anteriormente. Convenientemente, la composición puede ser una preparación líquida que comprenda la oxido-reductasa. Sin embargo, la composición está convenientemente en forma de una composición seca. Se entenderá que la cantidad de actividad de oxido-reductasa en la composición dependerá de los tipos y cantidades de los ingredientes o aditivos adicionales. Sin embargo, la cantidad de actividad de oxido-reductasa está preferiblemente en el intervalo de 10 a 100.000 unidades, preferiblemente en el intervalo de 100 a 50.000 unidades, tal como 1.000 a 10.000 unidades que incluyen 2.000 a 5.000 unidades.

Opcionalmente, la composición puede estar en forma de una mezcla o premezcla completa de aditivos para pasta para fabricar un producto acabado particular y que contenga todos los ingredientes y aditivos secos para tal pasta. En realizaciones específicas, la composición puede ser una particularmente útil para preparar un producto horneado o en la fabricación de un producto de tallarines o un producto de una pasta alimenticia.

Como se mencionó anteriormente, la presente invención proporciona un método para preparar un producto de panadería que incluye la adición a la pasta de una oxido-reductasa tal como, por ejemplo, hexosa-oxidasa. En particular, este método da lugar a productos de panadería tales como los productos anteriormente mencionados, en los que se aumenta el volumen específico en relación a un producto de panadería por lo demás similar, preparado a partir de una pasta que no contiene oxido-reductasa. En este contexto, la expresión "volumen específico" se usa para indicar la relación entre el volumen y el peso del producto. Sorprendentemente, se ha encontrado que según el método anterior, el volumen específico se puede aumentar significativamente tal como al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, incluyendo al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, y más preferiblemente al menos 50%.

En una realización ventajosa del método anterior, al menos se añade a la pasta una enzima más. Ejemplos adecuados de la misma incluyen una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una enzima que degrade el almidón, una glucosa-oxidasa, una lipasa y una proteasa.

Ahora, en los ejemplos siguientes se describirá la invención a modo de ilustración.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 1.1. Purificación de hexosa-oxidasa de Chondrus crispus

Se obtuvo una preparación de hexosa-oxidasa purificada usando los procedimientos de extracción y purificación de más adelante. Durante estos procedimientos y las caracterizaciones siguientes de la enzima purificada, se usó el siguiente ensayo para la determinación de la actividad de la hexosa-oxidasa:

1.1.1. Ensayo de la actividad de la hexosa-oxidasa

El ensayo se basó en el método descrito por Sullivan e Iwaka (Biochimica et Biophysica Acta, 1973, 309:11-22), pero modificado para realizarse en placas de microvaloración. Una mezcla de ensayo contenía 150 \mul de \beta-D-glucosa (0,1 M en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,3), 120 \mul de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,3, 10 \mul de o-dianisidina-dihidrocloruro (Sigma D-3252, 3,0 mg/ml en H_{2}O), 10 \mul de peroxidasa (POD) (Sigma P-8125, 0,1 ml en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,3) y 10 \mul de disolución enzimática (HOX). Se fabricaron blancos añadiendo disolución amortiguadora en lugar de disolución enzimática.

La incubación se inició mediante la adición de glucosa. Después de 15 minutos de incubación a 25ºC, se leyó a 25ºC la absorbancia a 405 nm en un lector ELISA. Se construyó una curva patrón usando concentraciones variables de H_{2}O_{2} en lugar de la disolución enzimática.

La reacción se puede describir de la siguiente manera:

\quad

\beta-D-glucosa + H_{2}O + O_{2} \ \frac{HOX}{POD} \ ácido glucónico + H_{2}O_{2}

\vskip1.000000\baselineskip

\quad

H_{2}O_{2} + o-dianisidina_{red} \longrightarrow 2 H_{2}O + o-dianisidina_{ox}

La o-dianisidina oxidada tiene un color amarillo que absorbe a 405 nm.

1.1.2. Extracción

Se recolectaron láminas frescas de Chondrus crispus a lo largo de la costa de Bretaña, Francia. Este material fresco se homogeneizó en un molino de púas (Alpine). Se añadieron 300 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, pH 6,8, a una muestra de 100 g del material en láminas homogeneizado resultante. La mezcla se sonicó subsiguientemente en un baño de sonicación durante 5 minutos y a continuación se extrajo a rotación constante durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación de la mezcla a 47.000 x g durante 20 minutos.

Se desalaron 300 ml del sobrenadante rosa claro resultante por ultrafiltración usando una unidad de ultrafiltración Amicon equipada con una membrana de ultrafiltración Omega (valor de corte 10 kD, Filtron).

1.1.3. Etapa de intercambio de aniones

El retenido resultante a partir de 1.1.2 se aplicó a una columna de 5 x 10 cm con 200 ml de Q-Sepharosa FF equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y la hexosa-oxidasa se eluyó con un gradiente de 450 ml de 0 a 1 M de NaCl en la disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 6 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 14 ml. Las fracciones 9-17 (un total de 125 ml) se juntaron y se concentraron hasta 7,5 ml por ultrafiltración usando una unidad Amicon 8400 equipada con una membrana de ultrafiltración Omega (valor de corte 10 kD, Filtron).

1.1.4. Filtración por gel

El anterior retenido de 7,5 ml se aplicó a una columna de filtración por gel Superdex 200 de 2,6 x 60 cm, equilibrada en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,4, y se eluyó a un caudal de 1 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 4 ml. Se juntaron las fracciones 17-28 (volumen total 50 ml) que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa.

1.1.5. Cromatografía de interacción hidrófoba

A la mezcla resultante de la etapa 1.1.4 de filtración por gel se añadió sulfato de amonio hasta una concentración final de 2 M. A continuación, esta mezcla se aplicó a una columna de 1,6 x 1,6 cm con 32 ml de fenil-sepharosa equilibrada en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,3, y (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con una disolución amortiguadora de equilibrado seguido por elución de la hexosa-oxidasa a un caudal de
2 ml/minuto usando una gradiente lineal 140 desde 2 M a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 20 mM. Se recogieron fracciones de 4 ml y se juntaron las fracciones 24-33 que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa.

El color rosa mencionado anteriormente acompaña a la enzima, pero se separa de la hexosa-oxidasa en esta etapa de purificación.

1.1.6. Intercambio de aniones Mono Q

La mezcla anterior resultante de la anterior etapa de cromatografía en fenil-sepharosa se desaló por ultrafiltración como se describió anteriormente. Se aplicaron 2 ml de esta mezcla a una columna Mono Q HR 5/5 equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. La columna se eluyó subsiguientemente usando un gradiente lineal de 45 ml desde NaCl 0 a 0,65 M en la disolución amortiguadora de equilibrado a un caudal de 1,5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 1,5 ml y se juntaron las fracciones 14-24.

1.1.7. Intercambio de aniones Mono P

La mezcla que contenía la hexosa-oxidasa de la anterior etapa 1.1.6 se aplicó a una columna Mono P HR 5/5 equilibrada en disolución amortiguadora bis-Tris 20 mM, pH 6,5. La enzima se eluyó usando un gradiente lineal de
45 ml desde NaCl 0 a 0,65 M en la disolución amortiguadora de equilibrado a un caudal de 1,5 ml/minuto y se recogieron fracciones de 0,75 ml. La mayor actividad de la hexosa-oxidasa se encontró en la fracción 12.

\vskip1.000000\baselineskip

1.2. Caracterización de la hexosa-oxidasa purificada

Las mezclas de las etapas anteriores 1.1.6 y 1.1.7 que contenían hexosa-oxidasa se usaron en los experimentos de caracterización de más adelante:

1.2.1. Determinación del peso molecular

El tamaño de la hexosa-oxidasa nativa purificada se determinó por cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superose 6 HR 10/30 a un caudal de 0,5 ml/minuto en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,4. Como patrones de tamaño se usaron ferritina (440 kD), catalasa (232 kD), aldolasa (158 kD), albúmina de suero bovino (67 kD) y quimotripsinógeno (25 kD). Se determinó que el peso molecular de la hexosa-oxidasa purificada era 120 \pm 10 kD.

1.2.2. Determinación del pH óptimo

Las mezclas de ensayo para la determinación del pH óptimo (volumen final 300 \mul) contenían 120 \mul de una disolución madre 0,1 M de disolución amortiguadora fosfato de sodio/citrato de sodio de valores variables de pH. Todos los otros componentes de la mezcla de ensayo se disolvieron en H_{2}O. El pH se determinó en las disoluciones amortiguadoras madre diluidas a 25ºC.

La hexosa-oxidasa mostró actividad enzimática de pH 3 a pH 8, pero con el óptimo en el intervalo de 3,5 a 5,5.

1.2.3. K_{m} de la hexosa-oxidasa para glucosa y maltosa, respectivamente

Los datos cinéticos se ajustaron a v = V_{max}S/(K_{m} + S), en la que V_{max} es la velocidad máxima, S es la concentración de sustrato y K_{m} es la concentración que da 50% de la velocidad máxima (constante de Michaelis), usando un programa de microordenador EZ-FIT para ajustar curvas (Perrella, F.W., 1988, Analytical Biochemistry, 174:437-447).

Se obtuvo una típica curva hiperbólica de saturación para la actividad enzimática en función de glucosa y maltosa, respectivamente. Se calculó que para la glucosa K_{m} era 2,7 mM \pm 0,7 mM y para la maltosa se encontró que el valor de K_{m} era 43,7 \pm 5,6 mM.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Efecto mejorador de la pasta de la hexosa-oxidasa extraída de Chondrus crispus 2.1. Purificación de la hexosa-oxidasa de Chondrus crispus

Para este experimento, se preparó hexosa-oxidasa de la siguiente manera:

Se recogió material fresco de Chondrus crispus en la costa de Bretaña, Francia. El material se liofilizó y subsiguientemente se molió. Se suspendieron 40 g de este material molido en 1.000 ml de disolución amortiguadora de trietanolamina (TEA) 20 mM, pH 7,3, y se dejaron reposar a 5ºC durante aproximadamente 64 horas con agitación suave, y a continuación se centrifugaron a 2000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se filtró a través de filtros de vidrio de GF/A y GF/C seguido por filtración a través de un filtro de tamaño de poro de 45 \mum para obtener una preparación del filtrado de 800 ml que tenía actividad de hexosa-oxidasa que correspondía a una actividad de glucosa-oxidasa de 0,44 unidades por g de preparación. La actividad se determinó usando el procedimiento de más adelante.

El sobrenadante se aplicó en una columna cromatográfica de 330 ml de volumen de lecho con bolas grandes intercambio aniónico de Sepharosa Q (volumen muerto 120 ml). Las proteínas enlazadas se eluyeron en 180 minutos usando un gradiente de 0 a 0,5 M de NaCl en una disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, seguido por NaCl 1 M en una disolución amortiguadora de TEA 20 mM, y se recogieron fracciones de 9 ml y se analizaron respecto a la actividad de hexosa-oxidasa usando el procedimiento analítico de más adelante.

Se juntaron las fracciones 60-83 que contenían la actividad de la hexosa-oxidasa (aproximadamente 250 ml) y se concentraron y desalaron por ultrafiltración hasta a aproximadamente 25 ml. Esta etapa se repitió dos veces con los retenidos a los que se añadieron 100 ml de TEA 0,05 mM. El retenido de 25 ml resultante contenía 0,95 unidades de actividad de glucosa-oxidasa por g.

2.2. Determinación de la actividad de glucosa-oxidasa

Definición: 1 unidad de glucosa-oxidasa (GOD) corresponde a la cantidad de enzima que en las condiciones especificadas da lugar a la conversión de 1 \mumol de glucosa por minuto. La actividad se especifica como unidades por g de preparación enzimática.

Reactivos: (i) disolución amortiguadora: se disuelven 20 g de Na_{2}HPO_{4}-2H_{2}O en 900 ml de agua destilada y se ajusta el pH a 6,5; (ii) reactivo colorante (disolución madre): se disuelven 200 mg de 2,6-dicloro-fenol-indofenol, Sigma nº D-1878, en 1000 ml de agua destilada con agitación vigorosa durante 1 hora; (iii) peroxidasa (disolución madre): Boehringer Mannheim nº 127361, se disuelven 10.000 unidades en 10 ml de agua destilada y se añaden
4,2 g de sulfato de amonio; (iv) sustrato: disolución de D-glucosa al 10% peso/volumen en disolución amortiguadora, (v) enzima patrón: hidrasa #1423 de Amano.

Principio y procedimiento analítico: la glucosa se convierte en ácido glucónico y H_{2}O_{2}, que subsiguientemente se convierte por la peroxidasa en H_{2}O y O_{2}. El oxígeno generado oxida el reactivo colorante azul 2,6-dicloro-fenol-indofenol que de este modo cambia su color a púrpura. El color oxidado se mide espectrofotométricamente a 590 nm y los valores de la actividad enzimática se calculan con relación a un patrón.

2.3. El efecto de la preparación de hexosa-oxidasa sobre la reticulación entre los grupos tiol de una pasta basada en harina de trigo

Se estudió el efecto de la hexosa-oxidasa sobre la formación de reticulación entre grupos tiol midiendo el contenido de grupos tiol libres en una pasta preparada a partir de 1500 g de harina de trigo, 400 Unidades Brabender (BU) de agua, 90 g de levadura, 20 g de sacarosa y 20 g de sal a los que se añadieron 0, 100, 250, 875 y 1250 unidades por kg de harina, respectivamente, de la anterior preparación de hexosaoxidasa. Esencialmente, la medida se llevó a cabo según el método colorimétrico de Ellman (1958) como También se describe en Cereal Chemistry, 1983, 70, 22-26. Este método se basa en el principio de que el 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) reacciona con los grupos tiol en la pasta para formar un anión altamente coloreado de ácido 2-nitro-5-mercapto-benzoico, que se mide espectrofotométricamente a 412 nm.

Suponiendo que el cambio relativo de la cantidad de grupos tiol en una pasta se refleja como el cambio de la densidad óptica (OD) que resulta de la reacción entre los grupos tiol y el DTNB en la pasta, se obtuvieron los siguientes resultados:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

Así, este experimento mostró una disminución significativa de la OD, que indicó una reducción del contenido de grupos tiol libres que se proporcionaron a la cantidad añadida de actividad de hexosaoxidasa.

\vskip1.000000\baselineskip

2.4. Mejora de las características reológicas de la pasta por adición de hexosa-oxidasa

La pasta anterior se sometió a medidas extensigráficas según el método AACC 54-10, con y sin la adición de una cantidad de la preparación de hexosa-oxidasa correspondiente a 100 unidades/kg de harina de actividad de hexosa-oxidasa. La pasta sin adición de enzima sirvió como testigo.

El principio del método anterior es que las pasta después de formarse se somete a un ensayo de carga-extensión después de reposar a 30ºC durante 45, 90, 135 y 180 minutos, respectivamente, usando un extensógrafo capaz de registrar una curva de carga-extensión (extensigrama) que es un índice de la resistencia de la pasta a la deformación física cuando se estira. A partir de esta curva, se pueden calcular la resistencia a la extensión, B (altura de la curva) y la extensibilidad, C (longitud total de la curva). La relación B/C (D) es un índice de la resistencia al horneado de la pasta de harina.

Los resultados del experimento se sumarizan en la tabla 2.1 más adelante.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2.1 Medidas extensigráficas de pasta suplementada con 100 unidades de GOD/kg de harina de hexosa-oxidasa (HOX)

3

\vskip1.000000\baselineskip

Es evidente a partir de esta tabla que la adición de hexosa-oxidasa (HOX) tiene un efecto mejorador sobre la resistencia de la pasta a la extensión como indica el incremento de los valores B. Esto se refleja en casi una duplicación de la relación B/C como un claro índice de que la resistencia al horneado de la harina aumenta significativamente mediante la adición de hexosa-oxidasa.

En un experimento similar, se añadieron 100 unidades/kg de harina de un producto comercial de glucosa-oxidasa y los anteriores parámetros se midieron de la misma manera usando como testigo una pasta a la que no se añadió enzima. Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 2.2. más adelante:

TABLA 2.2 Medidas extensigráficas de pasta suplementada con 100 unidades de GOD/kg de harina de glucosa-oxidasa (GOX)

4

Cuando se comparan los resultados de los dos experimentos anteriores con respecto a las diferencias entre la pasta testigo y las pastas suplementadas con hexosa-oxidasa o glucosa-oxidasa, parece que la hexosa-oxidasa tiene un efecto de refuerzo más fuerte que la glucosa-oxidasa. Además, la relación B/C aumenta más rápidamente con la hexosa-oxidasa en relación a la glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente mediante la hexosaoxidasa que mediante la glucosa-oxidasa (Fig. 1).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Efecto mejorador de la pasta de la hexosa-oxidasa extraída de Chondrus crispus

Para este experimento, se recolectaron láminas frescas de algas Chondrus crispus junto a la costa de Hirsholmene, Dinamarca. La hexosa-oxidasa se aisló usando dos procedimientos de extracción diferentes, y los materiales de ambos se juntaron para el experimento mejorador de la pasta de más adelante.

3.1. Purificación de la hexosa-oxidasa de Chondrus crispus, I

Se enjuagaron 954 g de láminas frescas con agua destilada, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring y se añadieron a las algas mezcladas 1908 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación constante durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación de la mezcla a 20.000 x g durante 30 minutos.

Los 1910 ml resultantes de sobrenadante (351,1 U/ml) se concentraron hasta 440 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi R110. El concentrado se fraccionó en sulfato de amonio al 25%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 20 minutos a 47.000 x g. El sobrenadante (395 ml) se dializó durante toda la noche frente a 20 l de disolución amortiguadora de trietanolamina (TEA) 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen final de 610 ml (367,1 U/ml).

Los anteriores 610 ml se aplicaron en dos experimentos a una columna de 2,6 x 25 cm con 130 ml de Q-Sepharosa FF equilibrada en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando 800 ml de un gradiente de 0 a 0,8 M de NaCl en la disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 4 ml/minuto y se recogieron fracciones de 12 ml. Se recogieron las fracciones que contenían la actividad de hexosa-oxidasa y se juntaron hasta un volumen final de 545 ml
(241,4 U/ml).

3.2. Purificación de hexosa-oxidasa de Chondrus crispus, II

Se enjuagaron 1250 g de láminas frescas con agua destilada, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring, seguido por la adición de 2500 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos.

Los 2200 ml resultantes de sobrenadante (332,8 U/ml) se concentraron hasta 445 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi R110. El concentrado resultante se fraccionó en sulfato de amonio al 25%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 20 minutos a 47.000 x g. El precipitado se descartó. Los 380 ml del sobrenadante se dializaron durante toda la noche frente a 20 l de disolución amortiguadora de TEA 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen final de 850 ml (319,2 U/ml).

Los anteriores 850 ml se aplicaron a una columna de 2,6 x 25 cm con 130 ml de Q-Sepharosa FF equilibrada en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 800 ml de NaCl 0 a 0,8 M en la disolución de equilibrado. La columna se eluyó a 4 ml/minuto y se recogieron fracciones de 12 ml. Se recogieron las fracciones que contenían la actividad de hexosa-oxidasa y se juntaron hasta un volumen final de 288 ml.

El retenido de la etapa anterior se aplicó a una columna de 2,6 x 31 cm con 185 ml de sepharosa FF quelante de metales cargada con Ni2+ y equilibrada en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 1 M , pH 7,4. Las proteínas enlazadas se eluyeron con un gradiente de 740 ml de imidazol 0 a 35 mM, pH 4,7, en la disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 2 ml/minuto y se recogieron fracciones de 11 ml. Se juntaron las fracciones 41-54 (140 ml, 352,3 U/ml). Parte de la hexosa-oxidasa se movió a través de la columna.

3.3. Mezcla y concentración de los extractos

La parte que se movió a través de la columna y los 140 ml de la purificación II y los 545 ml de la purificación I se juntaron hasta un volumen final de 1120 ml (303,6 U/ml). Los 1120 ml de evaporaron en rotavapor hasta un volumen de 210 ml seguido por diálisis durante toda la noche frente a 20 l de disolución amortiguadora de TEA 10 mM, pH 7,3, hasta un volumen final de 207 ml (1200,4 U/ml).

3.3.1. Etapa de intercambio de aniones

El retenido resultante de la etapa anterior se aplicó a una columna de 2,6 x 25 cm con 130 ml de Q-sepharosa FF equilibrada en trietanolamina 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 800 ml de NaCl 0 a 0,8 M en la disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 4 ml/minuto, y se recogieron fracciones de 12 ml. Se recogieron y juntaron las fracciones 30-50 que contenían la actividad de hexosa-oxidasa (260 ml, 764,1 U/ml).

3.3.2. Otra actividad enzimática

La anterior disolución juntada se ensayó respecto a las siguientes actividades enzimáticas secundarias: catalasa, proteasa, xilanasa, \alpha- y \beta-amilasa y lipasa. No se encontró en la disolución ninguna de estas actividades.

3.4. Mejora de las características reológicas de la pasta mediante la adición de hexosa-oxidasa

Se preparó una pasta a partir de harina de trigo, agua y sal y se añadieron a la misma 0, 72, 216 y 360 unidades por kg de harina, respectivamente, de la anterior preparación de hexosa-oxidasa. La pasta sin adición de enzima sirvió como testigo. Además, se prepararon dos pastas a las que se añadieron 216 y 360 unidades de Gluzyme, una glucosa-oxidasa disponible a partir de Novo Nordisk A/S, Dinamarca, por kg de harina, respectivamente.

Las pastas se sometieron a medidas extensigráficas según una modificación del anterior método AACC 54-10. Los resultados del experimento se sumarizan más adelante en la tabla 3.1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3.1 Medidas extensigráficas de pasta suplementada con hexosa-oxidasa (HOX) o glucosa-oxidasa (unidades por kg de harina)

5

Es evidente a partir de la tabla anterior que la adición de hexosa-oxidasa (HOX) o glucosa-oxidasa tuvo un efecto mejorador sobre la resistencia a la extensión de las pastas como indicó el aumento de los valores B. Esto se refleja en un aumento de la relación B/C como un claro índice de que la resistencia de la harina al horneado se aumentó significativamente mediante la adición de enzimas.

También es evidente que la hexosa-oxidasa tuvo un mayor efecto reforzante que la glucosa-oxidasa. Además, la relación B/C aumentó más rápidamente con hexosa-oxidasa en relación a la glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente mediante hexosa-oxidasa que mediante glucosa-oxidasa.

Ejemplo 4 Efecto mejorador de la pasta de la hexosa-oxidasa extraída de Chondrus crispus 4.1. Purificación de la hexosa-oxidasa de Chondrus crispus

Se recolectaron láminas frescas de Chondrus crispus junto a la costa de Bretaña, Francia. Se enjuagaron con agua 2285 g de este material fresco, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring, seguido por la adición de 4570 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio
0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación magnética continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos.

Los 4930 ml resultantes de sobrenadante (624,4 U/ml) se concentraron hasta 1508 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi R110. El concentrado resultante se fraccionó en polietilenglicol al 3% (peso/volumen). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 47.000 x g. Se descartó el pelet. Los 1470 ml del sobrenadante (2118,7 U/ml) se fraccionaron en PEG al 24%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 47.000 x g. El sobrenadante se descartó y los 414,5 g de precipitado se resuspendieron en 200 ml de disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, seguido por diálisis durante toda la noche a 5ºC frente a 20 l de disolución amortiguadora de TEA 10 mM, pH 7,3.

Después de la diálisis el volumen fue 650 ml (2968,6 U/ml). La suspensión se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 x g. El precipitado se descartó y el sobrenadante se diluyó hasta 3200 ml con agua destilada.

Los anteriores 3200 ml (829,9 U/ml) se aplicaron a una columna de 10 x 14 cm con 1100 ml de QSepharosa FF equilibrada en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 15.000 ml de NaCl 0 a 0,8 M en la disolución de equilibrado. La columna se eluyó a 50 ml/minuto. La hexosa-oxidasa se movió a lo largo de la columna y se recogieron 840 ml de ésta.

La suspensión de 840 ml se trató con kieselguhr y se concentró hasta 335 ml (2693,3 U/ml).

Los anteriores 335 ml se aplicaron a una columna de 10 x 40 cm de desalación con 3 l de Sephadex G25C. La columna se equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto y se recogieron 970 ml de eluido. Este eluido se aplicó a una columna de 10 x 14 cm con 1100 ml de Q-Sepharosa FF equilibrada en TEA 20 mM, pH 7,3. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado y las proteínas enlazadas se eluyeron usando un gradiente de 15.000 ml de NaCl 0 a 0,8 M en la disolución amortiguadora de equilibrado. La columna se eluyó a 50 ml/min. La hexosa-oxidasa se movió a lo largo de la columna y se recogieron 1035 ml de ésta.

Al eluido anterior (1035 ml) se añadió sulfato de amonio hasta una concentración final de 2 M. A continuación, la mezcla se aplicó en dos ensayos a una columna de 5 x 10 cm con 200 ml de fenil-sepharosa HP equilibrada en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,3, y (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado seguido por la elución de las proteínas enlazadas a un caudal de 50 ml/minuto usando un gradiente de 5.000 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M a 0 M en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM. De los ensayos 1 y 2 se recogieron, respectivamente, fracciones de 500 y 29 ml. La fracción 5 del ensayo 1, y las fracciones 27-42 del ensayo 2 que contenían la actividad de hexosa-oxidasa se juntaron hasta un total de 1050 ml
(563,9 U/ml).

La mezcla anterior se desaló mediante una columna de filtración por gel con 3 l de Sephadex G25C. La columna se equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto y se recogieron 1.000 ml de eluido.

Los 1.000 ml de eluido se concentraron hasta 202 ml (2310,2 U/ml) y esta preparación se usó para el ensayo de reología siguiente.

\vskip1.000000\baselineskip

4.2. Mejora de las características reológicas de la pasta mediante la adición de hexosa-oxidasa

Se preparó una pasta a partir de harina de trigo, agua y sal y se añadieron a la misma 0, 288, 504 y 720 unidades de oxido-reductasa, respectivamente, de la anterior preparación de hexosa-oxidasa por kg de harina. La pasta sin adición de enzima sirvió como testigo. Además, se prepararon dos pastas a las que se añadieron 288 y 504 unidades de oxido-reductasa por kg de harina, respectivamente, de Gluzyme, una glucosa-oxidasa disponible a partir de Novo Nordisk A/S, Dinamarca.

Las pastas se sometieron a medidas extensigráficas según una modificación del anterior método AACC 54-10.

Los resultados del experimento se sumarizan más adelante en la tabla 4.1.

TABLA 4.1 Medidas extensigráficas de pasta suplementada con hexosa-oxidasa (HOX) o glucosa-oxidasa (unidades por kg de harina)

6

Es evidente a partir de los resultados anteriores que la adición de hexosa-oxidasa (HOX) o glucosaoxidasa tiene un efecto mejorador sobre la resistencia de las pastas a la extensión como indica el aumento de los valores B. Esto se refleja en un aumento de la relación B/C.

También es evidente que la hexosa-oxidasa tiene un efecto reforzante más fuerte que la glucosa-oxidasa, siendo el efecto reforzante de ambas enzimas proporcional a la cantidad de enzima añadida. Además, la relación B/C aumentó más rápidamente con hexosa-oxidasa en relación a la glucosa-oxidasa, lo que es un claro índice de que el aumento de la resistencia al horneado se confiere más eficientemente mediante hexosa-oxidasa que mediante glucosa-oxidasa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Efecto mejorador de la hexosa-oxidasa extraída de Chondrus crispus sobre el volumen específico del pan 5.1. Purificación de la hexosa-oxidasa de Chondrus crispus

Se cosecharon láminas frescas de Chondrus crispus junto a la costa de Bretaña, Francia. Se enjuagaron con agua destilada 2191 g de este material fresco, se secaron con una toalla y se almacenaron en nitrógeno líquido. Las algas se mezclaron usando un mezclador Waring, seguido por la adición de 4382 ml de disolución amortiguadora de fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 1 M, pH 6,8. La mezcla se extrajo con agitación magnética continua durante 4 días a 5ºC, seguido por centrifugación a 20.000 x g durante 20 minutos.

Los 4600 ml resultantes de sobrenadante (746,1 U/ml) se concentraron hasta 850 ml a 40ºC en un Rotavapor Büchi R110. Este concentrado (3626,9 U/ml) se fraccionó en polietilenglicol al 3% (peso/volumen). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 x g. El precipitado se descartó. Los 705 ml del sobrenadante (2489,8 U/ml) se fraccionaron en PEG al 25%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se centrifugó durante 30 minutos a 20.000 x g. El sobrenadante se descartó y los 341 g de precipitado se resuspendieron en 225 ml de disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3. La suspensión (500 ml) se desaló en una columna de desalación de 10 x 40 cm con 3 l de Sephadex G25C. La columna se equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto. Se recogieron 1605 ml de eluido.

Se añadió sulfato de amonio al eluido anterior (687,5 U/ml) hasta una concentración final de 2 M. A continuación, la mezcla se aplicó en dos pruebas a una columna de 5 x 10 cm con 200 ml de fenil-sepharosa HP equilibrada en una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,3 y (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M. La columna se lavó con la disolución amortiguadora de equilibrado seguido por elución de las proteínas enlazadas a un caudal de 50 ml/minuto usando un gradiente de 5.000 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 M a 0 M en disolución amortiguadora de fosfato de sodio 25 mM. Se recogieron fracciones de 29 ml. Las fracciones 85-105 del ensayo 1 y las fracciones 36-69 del ensayo 2, que contenían la actividad de hexosa-oxidasa, se juntaron hasta un total de 1485 ml (194,7 U/ml).

La mezcla anterior se desaló mediante una columna de filtración por gel con 3 l de Sephadex G25C, la misma que se usó en 4.1. La columna se equilibró en disolución amortiguadora de TEA 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a un caudal de 100 ml/minuto. Se recogieron 1.200 ml de eluido.

Los 1.200 ml de eluido se concentraron hasta 685 ml (726,2 U/ml) y se usaron para los experimentos de horneado.

5.2. Mejora del volumen específico del pan mediante la adición a la pasta de hexosa-oxidasa

Se preparó una pasta a partir de 1500 g de harina de trigo, 90 g de levadura, 24 g de sal, 24 g de azúcar y 400 BU de agua y se añadieron a la misma 0 ó 108 unidades de la hexosa-oxidasa purificada anteriormente y 108 unidades de Gluzyme (glucosa-oxidasa disponible a partir de Novo Nordisk, Dinamarca), respectivamente, por kg de harina. La pasta se mezcló en un mezclador Hobart durante 2+9 minutos a 26ºC y se dividió en dos partes seguido por reposo durante 10 minutos a 30ºC en una cabina de calentamiento, moldeo con una Fortuna 3/17/7 y actividad de las levaduras durante 45 minutos a 34ºC y 85% de HR. La pasta así sometida a la actividad de las levaduras se coció a 220ºC durante 17 minutos con vapor 12 sec. en un horno Bago.

Los resultados del experimento se sumarizan en la tabla 5.1 más adelante.

TABLA 5.1 Mejora de los volúmenes específicos del pan preparado a partir de pasta suplementada con hexosa-oxidasa o glucosa-oxidasa (unidades por kg de harina)

7

Es evidente a partir de la tabla anterior que la adición de hexosa-oxidasa o glucosa-oxidasa tuvo el efecto de aumentar el volumen total, siendo el peso esencialmente el mismo. Esto se refleja en un aumento del volumen específico en comparación con el pan cocido sin adición de enzimas.

También es evidente que la hexosa-oxidasa tiene un efecto significativamente mayor sobre el aumento del volumen específico que el que tiene la glucosa-oxidasa a la misma dosis.

Ejemplo 6 Caracterización de la hexosa-oxidasa purificada

Se usaron preparaciones de las anteriores purificaciones para la caracterización de la hexosa-oxidasa.

6.1. Revelado de la actividad de la hexosa después de PAGE no desnaturalizante

Se analizó la actividad de la hexosa-oxidasa mediante PAGE nativo usando geles Novex prelaminados con Tris-glicina 8-16%, según las instrucciones del fabricante (Novex, San Diego, EE.UU.). Después de la electroforesis, los geles se revelaron respecto a la actividad de la hexosa-oxidasa por incubación del gel en una disolución que contenía una disolución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0, glucosa 100 mM, 50 mg/l de fenazina-metosulfato (Sigma P9625) y 250 mg/l de nitroazul-tetrazolio (sigma N6876) como se describe en la tesis de doctorado de Witteveen, C.F.B. (1993) "Formación de gluconato y metabolismo de polioles en Aspergillus niger". Después de aproximadamente 30 minutos, la actividad de la hexosa-oxidasa fue visible como una doble banda muy próxima una a otra. También se vio la misma doble banda cuando se reveló con plata un PAGE nativo de hexosa-oxidasa. Se determinó que el peso molecular de la hexosa-oxidasa purificada era 144 kD por PAGE nativa. La mitad del gel se reveló con plata, y la otra mitad se reveló respecto a la actividad. Como patrones se usaron albúmina de suero bovino (67 kD), lactato-deshidrogenasa (140 kD), catalasa (232 kD), ferritina (440 kD) y tiroglobulina (669 kD).

6.2. Determinación del peso molecular por SDS-Page

También se determinó el peso molecular del material que se aplicó primero a un PAGE nativo que se describió anteriormente, después del revelado de la actividad la banda de hexosa-oxidasa se cortó del gel y a continuación se electroeluyó usando un Electro-Eluidor (modelo 422, Bio-Rad, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. La proteína electroeluida se sometió a SDS-PAGE y se reveló con plata. Este material dio "una" doble banda a aproximadamente 70 kDa en geles SDS-PAGE. La hexosa-oxidasa electroeluida es por lo tanto un dímero de dos subunidades.

6.3. Determinación del pI de la hexosa-oxidasa

Se analizaron muestras que contenían actividad de hexosa-oxidasa por enfoque isoeléctrico (IEF) usando un gel IEF prelaminado 3-10 según las recomendaciones del fabricante (Novex, San Diego, EE.UU.). después de la electroforesis, la mitad del gel se reveló con plata y la otra mitad se reveló con nitroazul-tetrazolio como se describió en 6.1.

La hexosa-oxidasa se reveló como una doble banda. El pI de la primera banda fue 4,79, el pI de la segunda banda fue 4,64. Como patrones se usaron tripsinógeno (9,30), banda básica de lectina de lenteja (8,65), banda media de lectina de lenteja (8,45), banda ácida de lectina de lenteja (8,15), banda ácida de mioglobina de caballo (6,85), anhidrasa carbónica B humana (5,85), \beta-lactoglobulina A (5,20), inhibidor de tripsina de soja (4,55), y amiloglucosidasa (3,50).

6.4. Determinación de la K_{m} de la hexosa-oxidasa para diferentes azúcares

La K_{m} de la hexosa-oxidasa se determinó para 7 azúcares diferentes como se describió en 1.2.3. Los resultados se sumarizan más adelante en la tabla 6.1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6.1 Determinación de la K_{m} de la hexosa-oxidasa para diferentes azúcares

8

\vskip1.000000\baselineskip

6.5. Determinación de una secuencia peptídica de la hexosa-oxidasa

Se suspendieron 50 \mul de la mezcla electroeluida en 6.2 en 450 l de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA).

Para separar el Tris, la glicina y el SDS, la mezcla anterior se sometió a cromatografía HPLC de fase inversa. La disolución resultante se aplicó en 9 ensayos a una columna Brownlee C2 de 4,6 x 30 cm equilibrada en TFA 0,1%. La columna se lavó en la disolución amortiguadora de equilibrado y los péptidos enlazados se eluyeron con un gradiente de 14 ml de 10 a 80% de acetonitrilo en TFA 0,1%, a un caudal de 0,7 ml/min. Se recogieron y liofilizaron las fracciones del pico mayor que contenían el enzima.

6.5.1. Digestión con endoproteinasa Lis-C

La enzima liofilizada resultante se disolvió en 50 \mul de urea 8 M, NH_{4}HCO_{3} 0,4 M, pH 8,4. La desnaturalización y reducción de la proteína se llevó a cabo mediante la adición de 5 \mul de ditiotreitol 45 mM y bajo un manto de N_{2} a 50ºC durante 15 min. La disolución se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron 5 \mul de yodoacetamida 100 mM, derivatizándose las cisteínas durante 15 min. a temperatura ambiente en la oscuridad bajo N_{2}. Subsiguientemente, la disolución se suspendió en 135 \mul de agua y se llevó a cabo la digestión a 37ºC en N_{2} durante 24 horas mediante la adición de 5 \mug de endoproteinasa Lis-C disuelta en 5 \mul de agua. La reacción se terminó congelando la mezcla de reacción a -20ºC.

6.5.2. Separación de péptidos por HPLC en fase inversa

Los péptidos resultantes se separaron por HPLC en fase inversa en una columna VYDAC C18 de 0,46 x 15 cm (The Separation Group, CA, EE.UU.) usando como disolvente A, TFA al 0,1% en agua y como disolvente B, TFA al 0,1% en acetonitrilo.

6.5.3. Secuenciado de péptidos

El secuenciado se llevó a cabo en un secuenciador Applied Biosystems 476A (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) usando ciclos rápidos de líquido pulsado según las instrucciones del fabricante. Se identificó un péptido que tenía la secuencia de aminoácidos de más adelante: D P G Y I V I D V N A G T P D K P D P.

Claims (20)

1. Método para mejorar las propiedades reológicas de una pasta de harina y la calidad del producto acabado fabricado a partir de la pasta, que comprende añadir a los ingredientes de la pasta, aditivos de la pasta o a la pasta una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos sea capaz de oxidar la maltosa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la oxido-reductasa es hexosa-oxidasa.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la hexosa-oxidasa se deriva de una fuente seleccionada de una especie de algas, una especie de plantas y una especie microbiana.

4. Método según la reivindicación 3, en el que la hexosa-oxidasa se deriva de Chondrus crispus.

5. Método según la reivindicación 2, en el que la hexosa-oxidasa se añade en una cantidad que está en el intervalo de 1 a 10.000 unidades por kg de harina.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la hexosa-oxidasa se añade en una cantidad que está en el intervalo de 10 a 1.000 unidades por kg de harina.

7. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la resistencia a la extensión de la pasta en términos de la relación entre la resistencia a la extensión (altura de la curva, B) y la extensibilidad (longitud de la curva, C), es decir la relación B/C, que se mide por el método AACC 54-10 aumenta en al menos un 10% en relación a la de la pasta, por lo demás similar, que no contiene oxido-reductasa.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el producto acabado es pan.

9. Método según la reivindicación 1, en el que el producto acabado es un producto de tallarines.

10. Método según la reivindicación 1, en el que el producto acabado es un producto de una pasta alimenticia.

11. Método según la reivindicación 1, en el que al menos se añade una enzima adicional a los ingredientes de la pasta, aditivos de la pasta o a la pasta.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la enzima adicional se selecciona del grupo que consta de una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una enzima que degrada el almidón, una glucosaoxidasa, una lipasa y una proteasa.

13. Método para preparar un producto de panadería, método que comprende preparar una pasta de harina a la que se añade una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que al menos sea capaz de oxidar la maltosa, y cocer la pasta en un horno.

14. Método según la reivindicación 13, en el que se aumenta el volumen específico del producto de panadería en relación a un producto de panadería, por lo demás similar, preparado a partir de una pasta que no contiene oxido-reductasa.

15. Método según la reivindicación 14, en el que el volumen especifico se aumenta en al menos un 20%.

16. Método según la reivindicación 13, en el que al menos se añade a la pasta una enzima adicional.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la enzima adicional se selecciona de entre el grupo constituido por una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una enzima que degrada el almidón, una glucosaoxidasa, una lipasa y una proteasa.

18. Método según la reivindicación 13, en el que la oxido-reductasa es hexosa-oxidasa.

19. Método para preparar un producto alimenticio basado en una pasta de harinas, que comprende añadir a la pasta una cantidad eficaz de una oxido-reductasa que oxida la maltosa.

20. Método según la reivindicación 19, en el que la oxido-reductasa es hexosa-oxidasa.