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EP0158194A2 - Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin auf mikrobiologischem Weg - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin auf mikrobiologischem Weg Download PDF

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Publication number
EP0158194A2
EP0158194A2 EP85103420A EP85103420A EP0158194A2 EP 0158194 A2 EP0158194 A2 EP 0158194A2 EP 85103420 A EP85103420 A EP 85103420A EP 85103420 A EP85103420 A EP 85103420A EP 0158194 A2 EP0158194 A2 EP 0158194A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
carnitine
microorganisms
butyrobetaine
crotonobetaine
betaine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP85103420A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP0158194A3 (en
EP0158194B1 (de
Inventor
Hans Dr. Kulla
Pavel Dr. Lehky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza AG filed Critical Lonza AG
Priority to AT85103420T priority Critical patent/ATE64154T1/de
Publication of EP0158194A2 publication Critical patent/EP0158194A2/de
Publication of EP0158194A3 publication Critical patent/EP0158194A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0158194B1 publication Critical patent/EP0158194B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/824—Achromobacter

Definitions

  • L-carnitine from y-butyrobetaine.
  • the y-butyrobetaine is contacted in the presence of sodium 2-oxoglutarate, a reducing agent, an iron ion source and an atmospheric oxygen as a hydroxyl group donor with a hydroxylase enzyme released from spores of Neurospora crassa (US Pat. No. 4,371,618).
  • This method has the disadvantage of requiring a large number of cofactors.
  • stoichiometric amounts of 2-oxoglutarate are oxidatively decarboxylated to succinate in the reaction.
  • Fe 2+ is required as the 0 2 activator, ascorbate to keep the iron ion in the reduced form, and catalase to destroy the harmful H 2 0 2 that is formed in traces.
  • the invention is based on the object of finding a new type of microorganism which does not have these disadvantages of the known processes and which makes it possible in a simple manner not to produce the racemate but rather enantio-selectively L-carnitine from crotonobetaine, butyrobetaine or mixtures thereof.
  • microorganisms according to the invention are capable of producing L-carnitine from crotonobetaine and / or y-butyrobetaine and of not catabolizing the latter.
  • those microorganisms which secrete L-carnitine and do not grow on L-carnitine, crotonobetaine, y-butyrobetaine, but probably with betaine, are preferably selected.
  • G Yet insomniassi be further culturing the mutant microorganisms in a betaine medium and these further cultured microorganisms for carrying out the selection step b preferably) in an L-carnitine medium further ez obviouslyt g.
  • strains growing with betaine, y-butyrobetaine, crotonobetaine and L-carnitine as the C and N source is expediently carried out in such a way that mixed cultures are produced from bacterial mixtures by inoculating crotonobetaine nutrient solutions and from these with the aid of traditional microbiological techniques Pure cultures of microorganisms that break down crotonobetaine.
  • Appropriate methods for producing stable mutants are the frame shift method, deletion method or the transposon insertion method.
  • the mutated microorganisms are then subjected to selection step b), where known "counter-selecting agents" [P.Gerhardt et al (eds. ), Manual of Methods for General Bacteriology, Am.Soc. for Microbiology, 1981] those microorganisms are selected which do not catabolize L-carnitine stably and do not grow on L-carnitine, crotonobetaine, y-butyrobetaine, but probably with betaine.
  • a preferred microorganism that grows with betaine, y-butyrobetaine, crotonobetaine, L-carnitine as the C and N source is the HK 4 strain (DSM No. 2938) and its descendants and mutants.
  • This strain was deposited on 8.2.198 5 with the German Collection for Microorganism (DSM), Society for Biotechnological Research mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen / FRG, under the number DSM 3225.
  • DSM German Collection for Microorganism
  • the process for the preparation of L-carnitine is expediently carried out in such a way that a preculture of a microorganism, preferably a microorganism with the designation HK 13, in a sterilized, preferably vitamin-containing mineral medium [Kulla et al, Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] at 20 to 40 ° C, preferably at 30 ° C, with a purposeful pH of 6 to 8, preferably 7, for 20 to 50 hours, advantageously for 30 to 40 hours.
  • This preculture appropriately contains 0.1 to 10% by weight, preferably 0.5 to 5% by weight, choline, glutamate, acetate, dimethylglycine or betaine as the growth substrate.
  • Betaine is particularly preferably used in amounts of 0.5 to 5% by weight.
  • the y-butyrobetaine or crotonobetaine can be present as a hydrochloride salt, as a free inner salt and in the form of its derivatives.
  • Additional cultures can be inoculated with the precultures prepared by the above-mentioned process.
  • the crotonobetaine, y-butyrobetaine or mixtures thereof to be reacted are present in a concentration of 0.1 to 10% by weight, preferably 0.5 to 5% by weight.
  • the growth substrates choline, glutamate, acetate, dimethylglycine and betaine are also expediently used in the concentrations used in the preculture.
  • the cultivation conditions of the further cultivation are advantageously adapted in accordance with the cultivation conditions of the pre-cultivation.
  • the temperatures therefore expediently range between 20 and 40 ° C., advantageously at 30 ° C., and the pH is generally kept between 6 and 8 pH, advantageously at 7 pH.
  • the concentration of L-carnitine is then generally equivalent to the amount of y-butyrobetaine or crotonobetaine used.
  • the cells can be centrifuged or filtered off and used as inoculation material for a new culture.
  • the L-carnitine can be extracted from the supernatant by means of cation exchange chromatography and purified by recrystallization.
  • the process for the production of L-carnitine can also be carried out in a continuous manner by placing the cells in a chemostat at appropriate dilution rates of 0.04 to 0.2 h-1, preferably 0.06 to 0.08 h-1 , with the analog conditions as with the batch culture.
  • Microorganisms were extracted from earth with neutral phosphate buffer solution by stirring, then larger constituents were separated off by filter paper and a crotonobetaine nutrient solution was inoculated with the bacterial mixture thus obtained until the mixture became slightly cloudy. After 9 days, the turbidity as a measure of the cell concentration had increased ninety times. Crotonobetaine had completely disappeared from the solution and ammonium was detectable as a degradation product.
  • Such a mutant should not be able to catabolize the L-carnitine built up from y-butyrobetaine or crotonobetaine and should ideally be eliminated instead.
  • a culture of HK 4 was stably mutagenized with "acridine mutagen ICR 191", 5 micrograms per ml, in a succinate medium according to the instructions [JHMiller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972], and then left the cells are grown as standard in "nutrient broth” for expression of the mutation, after which they are transferred to a betaine medium.
  • An L-carnitine medium was inoculated with the adult culture.
  • the cells isolated in this way grew into colonies and were examined individually.
  • the mutant HK 13 was selected. It no longer has any carnitine dehydrogenase and therefore no longer grows with L-carnitine, y-butyrobetaine or crotonobetaine, but it does grow with betaine.
  • this strain converts crotonobetaine or y-butyrobetaine into L-carnitine and excretes it.
  • the U eberstand contained 4.26 mg L-carnitine per ml. This corresponds s p rach a yield of 95.0% calculated on the amount of crotonobetaine chloride.
  • the L-carnitine could be extracted from the supernatant by means of cation-exchange chromatography and purified by recrystallization.
  • a 5-1 pre-culture of HK 13 was dissolved in a vitamin-containing ineralmedium M (according to Example 1) containing 1% and 0.6% of choline chloride y- B utyrobetain acid at pH 7.0 and 30 ° C for 32 hours cultured.
  • a culture of 15 l of medium of the same composition was inoculated with this preculture and grown under the same conditions as in Example 1.
  • the cells were separated by microfiltration (Amicon Hollow-fiber ca rtridge). This cell mass was able to further Production of L-carnitine can be used.
  • the concentration of L- carnitine in the filtrate (19.6 l) was determined enzymatically.
  • the filtrate contained 5.3 mg L-carnitine per ml. This corresponded to an analytical yield of 97.6%, calculated on the amount of y-butyrobetaine chloride used.
  • the L-carnitine could be extracted from the solution in a known manner, e.g. be isolated by azeotropic distillation (DE-PS 23 00 492).
  • a fermentor equipped for continuous culture which contained 1.5 l of a mineral medium containing vitamins (according to Example 1) with 1.5% betaine and 1.0% y-butyrobetaine chloride, was inoculated with 150 ml of HK 13 preculture of the same medium. After 20 hours of aerobic cultivation at 30 ° C and pH 7.0, the culture was fully grown and the continuous operation could start with a flow rate of 0.1 1 / h. The culture solution flowing out of the fermentor was collected in a vessel cooled to 4 ° C. The cells were removed by centrifugation.
  • the supernatant contained 8.8 g of L-carnitine per 1 culture.
  • the solid L-carnitine chloride could be isolated from the solution by means of ion chromatography and water separation.

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Abstract

L-Carnitin aus Crotonobetain und/oder γ-Butyrobetain auf mikrobiologischem Weg.

Description

  • Es ist bekannt, L-Carnitin aus y-Butyrobetain herzustellen. Das y-Butyrobetain wird in Gegenwart von Natrium-2-oxoglutarat, einem reduzierenden Agens, einer Eisenionenquelle und einem Luftsauerstoff als Hydroxylgruppendonator mit einem Hydroxylase-Enzym, freigesetzt aus Sporen von Neurospora crassa, in Berührung gebracht (US-PS 4 371 618). Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, eine Vielzahl von Cofaktoren zu benötigen. So werden in der Reaktion stöchiometrische Mengen 2-Oxoglutarat oxidativ zu Succinat decarboxyliert. Fe2+ wird als 02-Aktivator benötigt, Ascorbat, um das Eisen-Ion in der reduzierten Form zu halten, und Katalase, um das in Spuren entstehende, schädliche H202 zu zerstören.
  • Lindstedt et al, (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) "The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas") isolierten einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, der mit y-Butyrobetain als C- und N-Quelle wächst. Die erste Reaktion des Abbauweges war die Hydroxylierung des y-Butyrobetains zu L-Carnitin, wobei das intermediär entstehende L-Carnitin vollständig zu CO2, H20 und NH3 weiterkatabolisiert wurde.
  • Auch diese, aus Bakterien gewonnene Hydroxylase hätte, wenn sie für die L-Carnitin-Produktion eingesetzt werden würde, die geschilderten nachteiligen Cofaktor-Bedürfnisse (Lindstedt et al, Biochemistry 16, 2181- 2188 (1977) "Purification and Properties of y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1").
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Typ von Mikroorganismen zu finden, der diese Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist und es ermöglicht, auf einfache Weise nicht das Razemat, sondern enantio-selektiv L-Carnitin aus Crotonobetain, Butyrobetain oder Gemischen davon herzustellen.
  • Im Unterschied zu den im Stand der Technik bekannten Systemen verwenden unsere Mikroorganismen das H20 und nicht das 02 als Hydroxylgruppendonator, wie durch eigene Untersuchungen unter Verwendung von H2 18O und 18O2 festgestellt werden konnte.
  • Die erfindungsgemässen Mikroorganismen sind befähigt, aus Crotonobetain und/oder y-Butyrobetain L-Carnitin zu produzieren und letzteres nicht zu katabolisieren.
  • Wie eine vergleichende Untersuchung an Bodenproben aus vier Kontinenten zeigte, sind Mikroorganismen, die Butyrobetain und Crotonobetain via L-Carnitin katabolisieren, ubiquitär. Auch aus dem Belebtschlamm von Abwasserreinigungsanlagen gelingt die Isolierung. Potentiell kommen alle diese Stämme als L-Carnitin-Produzenten in Frage, wenn sie nach dem unten angegebenen, erfindungsgemässen Prinzip mutiert werden.
  • Solche Mutanten sind erhältlich durch folgende Selekionsmethode:
    • a) Mikroorganismen, die mit Betain, y-Butyrobetain, Crotonobetain und L-Carnitin als C- und N-Quelle wachsen, werden auf übliche Weise mutiert.
    • b) Aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur von mutierten Mikroorganismen werden jene selektioniert, die stabil sind, L-Carnitin nicht katabolisieren und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain, y-Butyrobetain wachsen, wohl aber mit Betain.
  • Vorzugsweise werden folgend auf Selektionsschritt b) jene Mikroorganismen ausgewählt, die L-Carnitin ausscheiden und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain, y-Butyrobetain wachsen, wohl aber mit Betain.
  • Zweckmässig werden die mutierten Mikroorganismen in einem Betain-Medium weiterkultiviert und diese weiterkultivierten Mikroorganismen zur Durchführung des Selektionsschrittes b) vorzugsweise in einem L-Carnitin-Medium weitergezüchtet.
  • Die Züchtung von mit Betain, y-Butyrobetain, Crotonobetain und L-Carnitin als C- und N-Quelle wachsenden Stämme wird zweckmässig so durchgeführt, dass man aus Bakteriengemischen durch Beimpfung von Crotonobetain-Nährlösungen Mischkulturen erzeugt und aus denen unter Zuhilfenahme traditioneller mikrobiologischer Techniken dann Reinkulturen von Crotonobetain abbauenden Mikroorganismen anlegt.
  • Die Mutation einer solchen Kultur, die mit Betain, y-Butyrobetain, Crotonobetain und L-Carnitin als C- und N-Quelle wächst, kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden [J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972].
  • Zweckmässig anwendbare Methoden zur Herstellung stabiler Mutanten sind die Frame-Shift-Methode, Deletionsmethode oder die Transposon-Insertionsmethode.
  • Die so mutierten Mikroorganismen werden dann nach der Weiterkultivierung in einem Betain-Medium und der Ueberführung in ein L-Carnitin-Medium dem Selektionsschritt b) unterzogen, wo mittels bekannten "counter-selektionierenden Agenzien" [P.Ger- hardt et al (eds.), Manual of Methods for General Bacteriology, Am.Soc. for Microbiology, 1981] jene Mikroorganismen selektioniert werden, die stabil L-Carnitin nicht katabolisieren und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain, y-Butyrobetain wachsen, wohl aber mit Betain.
  • Ein bevorzugter Mikroorganismus, der mit Betain, y-Butyrobetain, Crotonobetain, L-Carnitin als C- und N-Quelle wächst, ist der Stamm HK 4 (DSM Nr. 2938) und dessen Deszendenten und Mutanten.
  • Dieser Stamm wurde am 3.3.1984 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft. für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, unter der Nr. DSM 2938 hinterlegt.
  • Wissenschaftliche Beschreibung des Stammes HK 4 (DSM Nr. 2938)
    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
  • Ein bevorzugter Mikroorganismus, der aus dem vorstehend beschriebenen Mikroorganismus mutiert und selektioniert wurde, stabil ist, L-Carnitin nicht katabolisiert, sondern ausscheidet und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain und y-Butyrobetain wächst, wohl aber auf Betain wächst, ist der HK 13.
  • Dieser genannte Stamm wurde am 23.1.1984 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, unter der Nr. DSM 2903 deponiert.
  • Wissenschaftliche Beschreibung des Stammes HK 13 (DSM Nr.2903)
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
  • Als Beispiel eines Dezendenten des Mikroorganismus HK 13, der stabil ist, L-Carnitin nicht katabolisiert, sondern ausscheidet, nicht auf L-Carnitin, Crotonbetain und y-Butyrobetain wächst, wohl aber mit Betain, L-Glutamat und Crotonbetain, L-Glutamat und Butyrobetain, L-Glutamat und L-Carnitin wächst, ist der Stamm HK 1331 b.
  • Er wurde als spontane, gut wachsende Mutanten-Kolonie von der Oberfläche eines mit Agar verfestigten Nährmediums, das L-Glutamat und y-Butyrobetain enthielt, isoliert.
  • Dieser genannte Stamm wurde am 8.2.1985 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismus (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Göttingen/ BRD, unter der Nr. DSM 3225 deponiert.
  • Wissenschaftliche Beschreibung des Stammes HK 1331 b (DSM Nr. 3225 )
    Figure imgb0005
    Figure imgb0006
  • Das Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin wird zweckmässig derart ausgeführt, dass man eine Vorkultur eines Mikroorganismus, vorzugsweise eines Mikroorganismus mit der Bezeichnung HK 13 in einem sterilisierten, vorzugsweise vitaminhaltigen Mineralmedium [Kulla et al, Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)] bei 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 30°C, bei einem zweckmässigen pH-Wert von 6 bis 8, vorzugsweise 7, während 20 bis 50 Stunden, vorteilhaft während 30 bis 40 Stunden, kultiviert. Diese Vorkultur enthält zweckmässig 0,1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.%, Cholin, Glutamat, Acetat, Dimethylglycin oder Betain als Wachstumssubstrat. Besonders bevorzugt wird Betain in Mengen von 0,5 bis 5 Gew.% eingesetzt.
  • Des weiteren ist es in der mikrobiologischen Technik üblich, der Vorkultur auch die umzusetzenden Ausgangsverbindungen y-Butyrobetain, Crotonobetain oder Gemische davon in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.%, bezogen auf das Reaktionsmedium, zuzusetzen.
  • Das y-Butyrobetain bzw. Crotonobetain kann als Hydrochloridsalz, als freies inneres Salz sowie in Form seiner Derivate vorliegen.
  • Mit dem nach oben genannten Verfahren hergestellten Vorkulturen können weitere Kulturen beimpft werden.
  • Diese weiteren Kulturen haben zweckmässig die gleiche Zusammensetzung wie die Vorkulturen.
  • Das umzusetzende Crotonobetain, y-Butyrobetain oder Gemische davon liegen in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.%, vor.
  • Auch die Wachstumssubstrate Cholin, Glutamat, Acetat, Dimethylglycin und Betain werden zweckmässig in den bei der Vorkultur verwendeten Konzentrationen angewendet.
  • Vorteilhafterweise werden die Kultivierungsbedingungen der weiteren Kultivierung entsprechend den Kultivierungsbedingungen der Vorkultivierung angepasst.
  • Die Temperaturen bewegen sich also zweckmässig zwischen 20 und 40°C, vorteilhaft bei 30°C und der pH-Wert wird in der Regel zwischen 6 und 8 pH, vorteilhaft bei 7 pH, gehalten.
  • Eine auf diese Weise durchgeführte Herstellung von L-Carnitin kommt nach 20 bis 30 Stunden zum Stillstand.
  • Die Konzentration an L-Carnitin ist dann in der Regel der eingesetzten Menge an y-Butyrobetain oder Crotonobetain äquivalent.
  • Die Zellen können abzentrifugiert oder abfiltriert und als Impfmaterial für eine neue Kultur verwendet werden.
  • Auf an sich bekannte Weise (J.P.Vandecasteele, Appl.Environ. Microbiol. 39, 327 [1980]) kann das L-Carnitin mittels Kationen-Austauscherchromatographie aus dem Ueberstand herausgeholt und durch Umkristallisation gereinigt werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin kann auch auf kontinuierliche Weise durchgeführt werden, indem man die Zellen in einem Chemostaten bei zweckmässigen Verdünnungsraten von 0,04 bis 0,2 h-1, vorzugsweise bei 0,06 bis 0,08 h-1, bei den analogen Bedingungen wie bei der Batch-Kultur wachsen lässt.
    • Beispiel Isolation eines Crotonobetain abbauenden Mikroorganismus:
  • Mikroorganismen wurden aus Erde mit neutraler Phosphat-Pufferlösung durch Rühren extrahiert, anschliessend grössere Bestandteile durch Filtrierpapier abgetrennt und eine Crotonobetain-Nährlösung mit dem so gewonnenen Bakteriengemisch bis zur leichten Trübung beimpft. Nach 9 Tagen war die Trübung als Mass der Zellkonzentration auf das neunzigfache angestiegen. Crotonobetain war aus der Lösung vollständig verschwunden und Ammonium als Abbauprodukt nachweisbar.
  • Aus der Mischkultur wurden unter Zuhilfenahme traditioneller mikrobiologischer Techniken (verfestigte Agar-Nährböden) Reinkulturen von Crotonobetain abbauenden Mikroorganismen angelegt. Eine Kultur wurde für das weitere Arbeiten ausgewählt und als HK 4 benannt. Dieser Stamm wächst auch mit y-Butyrobetain, L-Carnitin und Betain.
    • Beispiel 2 Isolation einer stabilen Carnitin-Dehydrogenase negativen Mutante:
  • Eine solche Mutante sollte das aus y-Butyrobetain oder Crotonobetain aufgebaute L-Carnitin nicht weiter katabolisieren können und im Idealfall stattdessen ausscheiden.
  • Eine Kultur von HK 4 wurde mit "Acridin Mutagen ICR 191", 5 Microgramm pro ml, in einem Succinat-Medium vorschriftsgemäss [J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972] stabil mutagenisiert, danach liess man die Zellen standardgemäss in "Nutrient Broth" zur Expression der Mutation wachsen, danach wurde in ein Betain-Medium überführt. Mit der ausgewachsenen Kultur wurde ein L-Carnitin-Medium beimpft.
  • Nach wenigen Stunden erreichte die Kultur logarithmisches Wachstum. Zu diesem Zeitpunkt wurde Penicillin G (15 mg/ml) und D-Cycloserin (0,5 mg/ml) zugegeben [Ornston et al, Biochim. Biophys.Res.Commun. 36, 179 (1969)]. Diese "counterselektionierenden" Agenzien töten nur wachsende Bakterien ab. Die Mutanten, die mit L-Carnitin nicht mehr wachsen können und für die wir uns interessieren, überleben und reichern sich demgemäss relativ an. Nach 30 Stunden war die Lebendzellzahl auf ein Hundertstel zurückgegangen, die Antibiotika wurden weggewaschen und die Kultur wurde in ein Betain-Medium überführt. Nach Wachstum wurden entsprechende Verdünnungen der Kultur auf verfestigtem Nähragar verteilt. Die so vereinzelten Zellen-wuchsen zu Kolonien heran und wurden einzeln geprüft. Die Mutante HK 13 wurde ausgewählt. Sie hat stabil keine Carnitin-Dehydrogenase mehr und wächst demgemäss nicht mehr mit L-Carnitin, y-Butyrobetain oder Crotonobetain, wohl aber mit Betain. Bei Wachstum auf Betain, Dimethylglycin, Cholin, Glutamat oder Acetat wandelt dieser Stamm Crotonobetain oder y-Butyrobetain in L-Carnitin um und scheidet dieses aus.
    • Beispiel 3
  • Eine 5-1-Vorkultur von HK 13 wurde in einem vitaminhaltigen Mineralmedium [Kulla et al, Arch.Microbiol. 135, 1 (1983)], welches 1 Gew.% Betain und 0,5 Gew.% Crotonobetain-chlorid enthielt, bei30°C und pH 7,0 während 32 Stunden kultiviert. Hiermit wurde eine Kultur von 15 1 gleicher Zusammensetzung beimpft und wie die Vorkultur (30°C, pH 7,0, p02 = 3 ppm) 24 Stunden lang kultiviert. Als die Produktion zum Stillstand kam, wurden die Zellen abzentrifugiert und konnten als Impfmaterial für einen neuen Batch verwendet werden. Die Konzen- tration von L-Carnitin wurde im Ueberstand (19,8 1) durch enzymatische Analyse gemessen.
  • Der Ueberstand enthielt 4,26 mg L-Carnitin pro ml. Dies ent- sprach einer Ausbeute von 95,0%, auf die eingesetzte Menge von Crotonobetain-chlorid berechnet.
  • Edukte oder andere Verunreinigungen konnten im NMR-Spektrum nicht nachgewiesen werden.
  • Wie beschrieben [J.P.Vandecasteele, Appl.Environ.Microbiol. 39, 327 (1980)] konnte das L-Carnitin mittels Kationen-Austauscher-Chromatographie aus dem Ueberstand herausgeholt und durch Umkristallisation gereinigt werden.
    • Beispiel 4
  • Eine 5-1-Vorkultur von HK 13 wurde in einem vitaminhaltigen Mineralmedium (gemäss Beispiel 1), welches 1% Cholin und 0,6% y-Butyrobetain-chlorid enthielt, bei pH 7,0 und 30°C 32 Stunden lang kultiviert. Mit dieser Vorkultur wurde eine Kultur von 15 1 Medium gleicher Zusammensetzung beimpft und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet.
  • Als die Produktion nach ca. 30 Stunden zum Stillstand kam, wurden die Zellen durch Mikrofiltration (Amicon Hollow-fiber cartridge) abgetrennt. Diese Zellmasse konnte zur weiteren Produktion von L-Carnitin benutzt werden. Die Konzentration von L-Carnitin wurde im Filtrat (19,6 1) enzymatisch bestimmt. Das Filtrat enthielt 5,3 mg L-Carnitin pro ml. Dies entsprach einer analytischen Ausbeute von 97,6%, auf die eingesetzte Menge von y-Butyrobetain-chlorid berechnet.
  • Laut NMR-Analyse waren keine Edukte oder andere fremden organischen Nebenprodukte im Filtrat nachweisbar. Deshalb konnte aus der Lösung das L-Carnitin auf bekannte Weise, z.B. mittels azeotroper Destillation (DE-PS 23 00 492) isoliert werden.
    • Beispiel 5
  • Ein für kontinuierliche Kultur ausgerüsteter Fermentor, der 1,5 1 eines vitaminhaltigen Mineralmediums (gemäss Beispiel 1) mit 1,5% Betain und 1,0% y-Butyrobetain-chlorid enthielt, wurde mit 150 ml HK 13 Vorkultur gleichen Mediums beimpft. Nach 20 Stunden aerober Züchtung bei 30°C und pH 7,0 war die Kultur ausgewachsen und der kontinuierliche Betrieb konnte mit einer Flussrate von 0,1 1/h beginnen. Die dem Fermentor entströmende Kulturlösung wurde in einem auf 4°C gekühlten Gefäss aufgefangen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt.
  • Laut enzymatischer Analyse enthielt der Ueberstand 8,8 g L-Carnitin pro 1 Kultur.
  • Dies entsprach einer analytisch nachgewiesenen Ausbeute von 99,2%, auf die eingesetzte Konzentration des y-Butyrobetainchlorids berechnet.
  • Das feste L-Carnitinchlorid konnte aus der Lösung mittels Ionenchromatographie und Wasserabtrennung isoliert werden.

Claims (12)

1. Mikroorganismen, die befähigt sind, aus Crotonobetain und/oder y-Butyrobetain L-Carnitin zu produzieren und letzteres nicht zu katabolisieren.
2. Mikroorganismen nach Anspruch 1, erhältlich nach folgender Selektionsmethode:
a) Mikroorganismen, die mit Betain, y-Butyrobetain, Crotonobetain und L-Carnitin als C- und N-Quelle wachsen, werden auf übliche Weise mutiert.
b) Aus der durch Züchtung erhaltenen Kultur von mutierten Mikroorganismen werden jene selektioniert, die stabil sind, L-Carnitin nicht katabolisieren und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain, y-Butyrobetain wachsen, wohl aber mit Betain.
3. Mikroorganismen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass folgend auf Schritt b) jene Mikroorganismen selektioniert werden, die L-Carnitin ausscheiden und nicht auf L-Carnitin, Crotonobetain, y-Butyrobetain wachsen, wohl aber mit Betain.
4. Mikroorganismen nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die in a) mutierten Mikroorganismen in einem Betain-Medium weiterkultiviert werden.
5. Mikroorganismen nach Anspruch 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die im Betain-Medium weitergezüchteten Mikroorganismen zur Durchführung des Selektionsschrittes b) in einem L-Carnitin-Medium gezüchtet werden.
6. Mikroorganismus HK 13 (DSM Nr. 2903) und dessen Deszendenten und Mutanten.
7. Mikroorganismus HK 1331 b (DSM Nr. 3225 ) und dessen Deszendenten und Mutanten.
8. Mikroorganismus HK 4 (DSM Nr. 2938) und dessen Deszendenten und Mutanten.
9. Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus nach Ansprüchen 1 bis 7 mit Crotonobetain und/oder y-Butyrobetain in Gegenwart eines Wachstumssubstrates kultiviert und das angereicherte L-Carnitin isoliert.
10. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Crotonobetain, y-Butyrobetain oder die Gemische davon in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.%, bezogen auf das Kulturmedium, angewendet werden.
Ll. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichent, dass als Wachstumssubstrat Dimethylglycin, Cholin, Glutamat, Acetat und/oder Betain verwendet wird.
12. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wachstumssubstrate in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.%, bezogen auf das Kulturmedium, angewendet werden.
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