DE69021613T2

DE69021613T2 - Polymer-Herstellung.

Info

Publication number: DE69021613T2
Application number: DE69021613T
Authority: DE
Inventors: Alistair James Anderson; David Byrom; Edwin Alfred Dawes; Geoffrey William Haywood
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1989-04-12
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2010-03-24
Also published as: EP0392687B1; NZ233296A; AU634218B2; KR900016467A; JPH02299590A; US5387513A; ATE126538T1; DE69021613D1; EP0392687A3; US5296362A; AU5240590A; GB9006727D0; EP0392687A2; CA2014238A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Polymeren, auf durch solch ein Verfahren hergestellte, neue Polymere und auf Mikroorganismen, die in solch einem Verfahren verwendet werden.
Es ist bekannt, daß viele Bakterien in der Lage sind, innerhalb ihrer Zellen Polymere als Energiereserve anzureichern, beispielsweise Polymere, wie 3-Hydroxybuttersäure (PHB). Zum Beispiel wird in EP-B-15669 PHB durch die aerobe Züchtung bestimmter Stämme von Methylobacterium organophilum mittels eines Methanol umfassenden Substrats erhalten.
PHB ist ein geradkettiges Polymer, das im wesentlichen aus Monomer-Wiederholungseinheiten mit vier Kohlenstoffatomen mit der Struktur
-O.CH(CH&sub3;).CH&sub2;.CO-
besteht.
Der Begriff Polymer impliziert, solange nicht anders angegeben, ein geradkettiges Polymer.
Die Monomer-Wiederholungseinheit aus der das PHB gebildet ist, ist ein Beispiel eines sogenannten C4-Monomers.
Es wurden auch mikrobiologisch Polymere hergestellt, bei denen mindestens einige der Monomer-Wiederholungseinheiten mehr als vier Kohlenstoffatome aufwiesen. So wird in EP-A- 69497 ein Verfahren offenbart, bei dem ein Polymer hergestellt wird, das Monomer-Wiederholungseinheiten des PHB in Verbindung mit Monomer-Wiederholungseinheiten umfaßt, die mehr als 4 Kohlenstoffatome aufweisen. Das Verfahren schließt die Züchtung eines geeigneten Mikroorganismus, wie Alcaligenes eutrophus NCIB 11599 mittels eines Substrats ein, das eine organische Säure umfaßt, die durch die Mikroorganismen zu einer geeigneten Monomer-Wiederholungseinheit metabolisiert werden kann. (Die Abkürzungen NCIB und NCIMB beziehen sich auf die National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd., PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom). Zum Beispiel synthetisiert der Mikroorganismus, wenn das Substrat aus Propionsäure besteht, die drei Kohlenstoffatome enthält, Monomer-Wiederholungseinheiten der Form
-O.CH(C&sub2;H&sub5;).CH&sub2;.CO-] -
d.h. die Monomer-Wiederholungseinheit des Polymers aus 3- Hydroxyvaleriansäure, die 5 Kohlenstoffatome aufweist, ein sogenanntes C5-Monomer.
Effektiv können die Mikroorganismen die Anzahl der in der Monomer-Wiederholungseinheit vorhandenen Kohlenstoffatome gegenüber der Anzahl der in der organischen Säure des Substrats vorhandenen Kohlenstoffe um 2 vergrößern.
De Smet et al, Journal of Bacteriology, May 1983, S. 870 bis 878, zeigten, daß Poly-B-hydroxyoctanoat, ein Polymer, das im wesentlichen aus Monomer-Wiederholungseinheiten mit 8 Kohlenstoffatomen gebildet ist, d.h. ein C8-Monomer, von Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 hergestellt und angereichert wird, wenn der Mikroorganismus auf n-Oktan, d.h. einem geradkettigen Alkan gezüchtet wird. (Die Abkürzung ATCC bezieht sich auf die American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 USA).
Brandl et al, Applied and Environmental Microbiology, August 1988, S. 1977 bis 1982, haben ferner gezeigt, daß Polymere, die Monomer-Wiederholungseinheiten mit bis zu elf Kohlenstoffatomen umfassen, d.h. C11-Monomere, mikrobiologisch hergestellt werden können. Das von Brandl et al offenbarte mikrobiologische Verfahren schließt die Züchtung von Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 mittels Substraten ein, die eine aus einer Anzahl verschiedener assimilierbarer geradkettiger Kohlenstoffverbindungen umfassen, wie Alkansäuren, Alkane und Alkene. Es wird gezeigt, daß solange kein Polymer erzeugt wird, bis eine assimilierbare geradkettige Kohlenstoffverbindung mit mindestens sechs Kohlenstoffatomen in dem Substrat verwendet wird, und die Maximalausbeute an Polymer tritt auf, wenn eine assimilierbare geradkettige Kohlenstoffverbindung mit acht oder neun Kohlenstoffatomen verwendet wird.
Brandl et al zeigten auch, daß eine Tendenz existiert, derart, daß die Anzahl der in den Monomer-Wiederholungseinheiten anwesenden Kohlenstoffatome der Zahl der Kohlenstoffatome in der verwendeten assimilierbaren geradkettigen Kohlenstoffverbindung entspricht. Es wird gezeigt, daß verschiedene Monomer-Wiederholungseinheiten hergestellt werden, die sich voneinander durch die Anzahl an darin enthaltenen Kohlenstoffatomen unterscheiden. Es wird gezeigt, daß die Anzahl an in einigen der Monomer-Wiederholungseinheiten anwesenden Kohlenstoffatome sich nur um ein oder zwei von der Anzahl der in der assimilierbaren geradkettigen Kohlenstoffverbindung anwesenden Kohlenstoffatome unterscheidet. Wenn die assimilierbare, geradkettige Kohlenstoffverbindung weniger als zehn Kohlenstoffatome aufweist, ist die häufigste, d.h. häufigst auftretende bzw. modale Anzahl an Kohlenstoffatomen, die in den Monomer-Wiederholungeinheiten angetroffen wird, gleich der Anzahl der Kohlenstoffatome in der assimilierbaren, geradkettigen Kohlenstoffverbindung. Wenn die assimilierbare, geradkettige Kohlenstoffverbindung zehn Kohlenstoffatome enthält, wird diese Tendenz jedoch nicht beibehalten und weniger als 12 Mol-% der Monomer-Wiederholungseinheiten weisen zehn Kohlenstoffatome auf.
Wenn es erforderlich ist, daß die Monomer-Wiederholungseinheiten mehr als vier Kohlenstoffatome enthalten, so umfaßt das Substrat, mittels dessen die Mikroorganismen gezüchtet werden, assimilierbare, geradkettige Kohlenwasserstoffverbindungen, die innerhalb einer Abweichung von 2 Kohlenstoffatome der geforderten Anzahl aufweisen, und insbesondere die gleiche Anzahl an Kohlenstoffatomen aufweisen. So muß das Substrat dort, wo eine Monomer-Wiederholungseinheit zehn Kohlenstoffatome enthält, d.h. ein C10-Monomer, mindestens eine assimilierbare, geradkettige Kohlenwasserstoffkette mit acht Kohlenstoffatomen enthalten.
EP-A-0274151 (Lageveen et al), von dem die Veröffentlichung in Applied and Environmental Microbiology, December 1988, S. 2924 bis 2932 stammt, offenbart die Züchtung von Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 mittels eines Substrats, das C&sub6;- bis C&sub1;&sub2;-Alkane oder Alkene enthält, um Polyester mit Wiederholungseinheiten bis zu C&sub1;&sub2; herzustellen. Die größte Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Wiederholungseinheit entspricht stets der Anzahl in dem Substrat. Wenn das Substrat nur C&sub6;- Alkan enthielt, wurde nur eine kleine Menge Polyester hergestellt, wobei der Polyester aus C&sub6;-Einheiten bestand. Wenn das Substrat eine Mischung aus Oktan mit Oktanol oder Oktanon war, kam es zu einer schwachen Polyesterbildung. Von einem höher oxidierten Substrat wird keine Polyesterbildung berichtet.
In einem Überblick über die Anreicherung neuer Polymere durch Bakterien von Haywood et al, in Biotechnology Letters, 1989, Band 11, Nr. 7, Seiten 471 bis 476 wird im wesentlichen die Arbeit von Lageveen et al bestätigt.
Die von Brandl et al und Lageveen et al verwendeten assimilierbaren, geradkettigen Kohlenstoffverbindungen können selbst schwer und teuer herzustellen sein. Deshalb neigen die mikrobiologisch hergestellten Polymere, die aus solchen assimilierbaren geradkettigen Kohlenstoffverbindungen synthetisiert wurden, dazu, auch teuer zu sein.
Ferner ist der Wirkungsgrad bzw. die Ausbeute der existierenden mikrobiologischen Verfahren für die Herstellung solcher Polymere ebenfalls gering, wodurch sich die Kosten des erzeugten Polymers erhöhen.
Überraschenderweise wurde von den Anmeldern gefunden, daß bestimmte, spezifische Mikroorganismen außer PHB Polymere herstellen und anreichern können, wenn sie mittels eines Substrats gezüchtet werden, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle umfaßt, wobei die assimilierbare Kohlenstoffquelle eine ist, die bisher durch bekannte PHB erzeugende und anreichernde Mikroorganismen nicht in ein Polymer, außer PHB, umwandelbar war, wodurch die Verwendung assimilierbarer Kohlenstoffverbindungen ermöglicht wurde, die diejenigen einschließen, die weithin erhältlich und billig sind. Ferner wurde von den Anmeldern gefunden, daß bei der Züchtung von mindestens einem spezifischen Mikroorganismus in einem allgemeinen mikrobiologischen Verfahren, bei dem ein Substrat zur Verfügung gestellt wird, das mindestens eine von bestimmten assimilierbaren Kohlenstoffverbindungen umfaßt, durch die Mikroorganismen Polymere synthetisiert und angereichert werden, wobei die Polymere Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, und die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen, die in den Monomer-Wiederholungseinheiten enthalten ist, die Anzahl der in den assimilierbaren Kohlenstoffverbindungen enthaltenen Kohlenstoffatome um mindestens 2 übersteigt. Ferner wurde von den Anmeldern gefunden, daß die spezifischen Mikroorganismen Polymere erzeugen und anreichern können, die eine Monomer-Wiederholungseinheit mit zehn Kohlenstoffatomen umfassen, wenn sie auf einem Substrat gezüchtet werden, bei dem die assimilierbare Kohlenstoffverbindung Glucose ist.
Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Polymeren zur Verfügung, die Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, wobei jede Monomer-Wiederholungseinheit eine Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält und die häufigst auftretende Anzahl an in der Monomer- Wiederholungseinheit enthaltenen Kohlenstoffatomen gleich N ist, wobei das Verfahren die Züchtung eines Bakteriums auf einem Substrat umfaßt, das eine assimilierbare Kohlenstoffverbindung mit weniger als N Kohlenstoffatome umfaßt, wobei das Bakterium entweder ein Bakterium, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas SD. NCIMB 40135, Pseudomonas putida NCIB 8865, Pseudomonas putida NCIB 9571, Pseudomonas aeruginosa NCIB 9904, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8626 und Pseudomonas fluorescens NCIB 9520 ist, oder die charakteristischen Merkmale bzw. Kennzeichen von mindestens einem Mitglied dieser Gruppe aufweist.
Das Verfahren stellt mikrobiologisch hergestellte Polymere zur Verfügung, die Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, wobei jede der Monomer-Wiederholungseinheiten eine Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält, und die häufigst auftretende Anzahl an in den Monomer-Wiederholungseinheiten enthaltenen Kohlenstoffatomen mindestens 10 beträgt.
Ferner werden durch das Verfahren der Erfindung auch mikrobiologisch hergestellte Polymere zur Verfügung gestellt, wobei die mikrobiologisch hergestellten Polymere Monomer- Wiederholungseinheiten umfassen, wobei jede der Monomer- Wiederholungseinheiten eine Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält, und
(a) die häufigst auftretende Anzahl an in der Monomer-Wiederholungseinheit enthaltenen Kohlenstoffatomen 8 ist,
(b) diejenigen Monomer-Wiederholungseinheiten, die die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen enthalten, mindestens 40 Mol-%, bevorzugt mindestens 50 Mol-% der Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, und
(c) nicht mehr als 10 Mol-%, bevorzugt nicht mehr als 1 Mol-% der Monomer-Wiederhoungseinheiten weniger als die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen enthalten.
Unter einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine biologisch reine Kultur eines Bakteriums zur Verfügung gestellt, wobei das Bakterium geeignet ist, Polymere zu synthetisieren und anzureichern und die Kennzeichen des Stammes Pseudomonas sp. NCIMB 40135 aufweist.
Das Verfahren der Erfindung kann zur Herstellung mikrobiologisch erzeugter Polymere verwendet werden, die Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, wobei jede der Monomer-Wiederholungseinheiten eine Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält, und die häufigst auftretende Anzahl von in den Monomer-Wiederholungseinheiten enthaltenen Kohlenstoffatomen, hier als N bezeichnet, mindestens acht oder zehn beträgt.
Die in dem Substrat bereitgestellte assimilierbare Kohlenstoffverbindung kann jede geeignete metabolisierbare Kohlenstoffverbindung sein. Bevorzugt ist die assimilierbare Kohlenstoffverbindung eine Zuckerverbindung, wie Glucose, oder eine Zuckerverbindung, die zu Glucose metabolisierbar oder umwandelbar ist, wie Sucrose oder Lactose. Oder aber die assimilierbare Kohlenstoffverbindung kann Essigsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure oder Glycerol sein.
Wenn die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Monomer-Wiederholungeinheit N beträgt, beträgt die Zahl an Kohlenstoffatomen in der assimilierbaren Kohlenstoffverbindung mindestens N-2, und bevorzugt mindestens N-4.
Wird die Struktur der assimilierbaren Kohlenstoffverbindungen, von der sich die mikrobiologisch erzeugten Polymere ableiten können, einer Betrachtung unterzogen, überrascht es, daß die mikrobiologisch erzeugten Polymere Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, die die nachstehende allgemeine Formel aufweisen:
-O.CH((CH&sub2;)xCH&sub3;).CH&sub2;.CO-
Basierend auf der vorstehend erwähnten Struktur, entspricht x somit gleich 4, wenn eine Monomer-Wiederholungseinheit 8 Kohlenstoffatome enthält. Ebenso ist eine Monomer-Wiederholungseinheit, die 10 Kohlenstoffatome enthält, dadurch definiert, daß x gleich 6 ist. Somit entspricht dem Wert von x gleich die Anzahl der in der Wiederholungseinheit enthaltenen Kohlenstoffatome weniger 4.
Die durch das Verfahren der Erfindung erzeugten Monomer-Wiederholungseinheiten können durch die hier vorstehend definierte allgemeine Formel dargestellt werden. So kann die Struktur der Monomer-Wiederholungseinheiten, die die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält, durch Gleichsetzen des Parameters x, wie er hier vorstehend definiert ist, mit N-4, dargestellt werden.
Die mikrobiologisch hergestellten Polymere, die Monomer-Wiederholungseinheiten mit einer häufigst auftretenden Anzahl an Kohlenstoffatomen von mindestens 10 aufweisen, können ferner dadurch definiert werden, daß die Monomer- Wiederholungseinheiten, die die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen aufweisen, insbesondere mindestens 70, vornehmlich mindestens 80 und vornehmlich mindestens 90 Mol-% der vorhandenen Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen.
Außerdem können die mikrobiologisch hergestellten Polymere, die Monomer-Wiederholungseinheiten mit einer häufigst auftretenden Anzahl von Kohlenstoffatomen von mindestens 10 aufweisen, auch dadurch definiert sein, daß insbesondere weniger als 5 Mol-% und besonders weniger als 1 Mol-% der Monomer-Wiederholungseinheiten eine größere Anzahl an Kohlenstoffatomen enthalten, als der häufigst auftretenden Anzahl entspricht.
Die mikrobiologisch erzeugten Polymere können ferner dadurch definiert werden, daß nicht mehr als 10 Mol-% und insbesondere nicht mehr als 2 Mol-% der Monomer-Wiederholungseinheiten sich um mehr als zwei Kohlenstoffatome von der häufigst auftretenden Anzahl an Kohlenstoffatomen unterscheiden.
Wie andere Mikroorganismen, wird ein Mikroorganismus, der die Kennzeichen von Pseudomonas sp. NCIMB 40135 aufweist, wenn er aerobisch gezüchtet wird, d.h. beim Vorhandensein von Sauerstoff, in einem Medium, das die für die Reproduktion wesentlichen Bedingungen erfüllt, und mit einem Substrat, das eine assimilierbare Kohlenstoffverbindung enthält, sich vermehren. Diese Vermehrung wird hier nachstehend mit dem Begriff Zunahme bzw. Wachstum belegt. Solch ein Wachstum tritt solange auf, bis eine oder mehrere der wesentlichen Bedingungen für das Wachstum erschöpft sind.
Die wesentlichen Bedingungen für ein Wachstum schließen verschiedene Nährstoffe ein. Diese Nährstoffe umfassen die nachstehenden Elemente, die normalerweise in einfach assimilierbarer Form vorliegen, normalerweise als wasserlösliche Salze: Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium und Eisen, zusammen mit Spuren an Mangan, Zink und Kupfer.
Während der Zeit, während der das Wachstum aufrechterhalten wird, kann etwas Polymer von den Mikroorganismen synthetisiert und angereichert werden. Im allgemeinen ist, solange die Mikroorganismen nicht in geeigneter Weise angepaßt oder ausgewählt wurden, um unter den Wachstumsbedingungen Polymererzeugungs- und Polymeranreicherungseigenschaften zu zeigen, die Geschwindigkeit und der Grad an dem unter solchen Wachstumsbedingungen Polymer angereichert wird, gering.
Durch Beschränkung der Menge von mindestens einer der Bedingungen, zu der die die Mikroorganismen Zugang haben, kann die Wachstumsmenge entweder in ihrem Ausmaß sehr eingeschränkt werden oder nicht mehr auftreten. Vorausgesetzt die Menge an in dem Substrat anwesender, assimilierbarer Kohlenstoffverbindung ist ausreichend, so neigen die unter diesen sogenannten wachstumsbeschränkenden Bedingungen gezüchteten Mikroorganismen dazu, Polymer mit einer Geschwindigkeit, die größer, und mit einem Grad zu erzeugen, der höher ist, als diejenige und derjenige, die unter nicht-wachstumsbeschränkenden Bedingungen gefunden wurden.
Bevorzugt umfaßt daher das Verfahren die Züchtung des Bakteriums unter wachstumsbeschränkenden Bedingungen.
Es ist besonders bevorzugt eine Polymeranreicherung durch Begrenzung der Zufuhr von einem oder mehreren Nährstoffen, wie vorstehend beschrieben, herbeizuführen. Die am praktischten zu beschränkenden Elemente sind Stickstoff, Phosphor oder weniger bevorzugt Magnesium, Schwefel oder Kalium. Der Stickstoff kann bequemerweise in Form eines Ammoniumsalzes zugeführt werden, wohingegen der Phosphor beguemerweise als ein Phosphat zugeführt werden kann.
Wenn eine Stickstoffbeschränkung angewandt wird, ist das Substrat bevorzugt frei von Stickstoff. Die Menge an erforderlichem, assimilierbaren Stickstoff beträgt ungefähr 10 bis 1-5 Gewichts-% des gewünschten Zellgewichts abzüglich des Gewichts des angereicherten Polymers.
Die Züchtung der Mikroorganismen kann unter Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes, des Belüftungsgrades und ähnlichem durchgeführt werden, wie sie üblicherweise für Mikroorganismen unter nicht-wachstumsbeschränkenden Bedingungen angewandt werden. Ähnlich können die verwendeten Mengen an Nährstoffen (außer demjenigen Nährstoff, der zur Beschränkung des Wachstums der Mikroorganismen verwendet wird) denjenigen entsprechen, die normalerweise für das Wachstum der Mikroorganismen zur Verfügung gestellt werden.
Die Züchtung der Mikroorganismen umfaßt bevorzugt ein Zweistufenverfahren. In der ersten Stufe wird der Mikroorganismus bevorzugt bis zu einem bestimmten Trockengewicht pro Liter gezüchtet, unter nicht-wachstumsbeschränkenden Bedingungen mittels eines Substrats, das eine leicht assimilierbare Kohlenstoffverbindung, wie ein Kohlenhydrat, zum Beispiel Glucose, umfaßt. In der zweiten Stufe wird mindestens ein für das Wachstum erforderlicher Nährstoff beschränkt, dergestalt, daß wachstumsbeschränkende Bedingungen auftreten.
Die Züchtung kann als diskontinuierliches Verfahren durchgeführt werden, dergestalt, daß Polymeranreicherung auftritt, wenn sich die Menge des für das Wachstum, nicht aber für die Polymeranreicherung erforderlichen Nährstoffs erschöpft.
Oder aber die Züchtung kann als ein kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden, wobei auf kontinuierlicher oder halbkontinuierlicher Basis ein Strom der Züchtung aus dem Behälter entnommen wird, in dem die Mikroorganismen gezüchtet werden. Der aus dem Behälter entnommene Strom enthält mikrobiologische Zellen in einem verbrauchten bzw. erschöpften wäßrigen Medium. Das erschöpfte wäßrige Medium umfaßt restliche Mengen an Nährstoffen und Substraten. Die Fließgeschwindigkeit des den Behälter verlassenden Stromes entspricht der Geschwindigkeit der Zugabe von frischem wäßrigen Medium zu dem Behälter. Das dem Behälter frisch zugeführte wäßrige Medium enthält in ausreichenden Mengen Nährstoffe und Substrat, um die Anreicherung des Polymers zu unterstützen. Bevorzugt beträgt die Menge an dem Nährstoff, der zur Begrenzung des Wachstums der Mikroorganismen verwendet wird, und der dem Behälter zugesetzt wird, soviel, daß wenig oder nichts von dem Nährstoff in dem aus dem Behälter entnommenen wäßrigen Medium anwesend ist. Ferner wird es bevorzugt, daß das verbrauchte wäßrige Medium ferner mindestens einer weiteren belüfteten Züchtungsstufe unter diskontinuierlichem oder kontinuierlichem oder halb-kontinuierlichem Betrieb zugeführt wird, wobei eine zusätzliche Polymeranreicherung durch die Zugabe von weiterem Substrat zu dem verbrauchten wäßrigen Medium angeregt wird. Der Gehalt an Nährstoffen und Substrat kann in dem verbrauchten wäßrigen Medium nach dem Verlassen der ersten Züchtungsstufe so eingestellt werden, daß der Optimalbetrieb des Gesamtverfahrens beibehalten wird.
In einer weiteren Alternative kann die Züchtung der Mikroorganismen als ein Einstufenverfahren durchgeführt werden. In solch einem Verfahren, bei dem die Polymeranreicherung durch eine Beschränkung der für das Wachstum, nicht aber für die Polymeranreicherung, erforderlichen Nährstoffmenge angeregt wird, wird die Verweilzeit des wäßrigen Mediums in dem Behälter ausreichend groß gemacht, um so eine Erschöpfung des beschränkenden Nährstoffs und eine Polymeranreicherung zuzulassen.
Sowohl in einem Ein- oder in einem Mehrstufenverfahren als auch in einem diskontinuierlichen oder halb-kontinuierlichen Verfahren oder einem kontinuierlichen Verfahren kann eine einzelne assimilierbare Kohlenstoffverbindung in dem Substrat während der Polymeranreicherung vorhanden sein, oder sie kann in einer Mischung mit anderen assimilierbaren Kohlenstoffverbindungen auftreten.
Das Bakterium, das geeignet ist, die wie vorstehend beschriebenen Polymere zu synthetisieren und anzureichern, und insbesondere diejenigen Polymere, in denen die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Monomer-Wiederholungseinheit zehn beträgt, ist bevorzugt von der Gattung Pseudomonas. Das Bakterium unterscheidet sich von verwandten Stämmen durch die Fähigkeit aus einer aus Glucose bestehenden, assimilierbaren Kohlenstoffquelle Polymere mit Monomer-Wiederholungseinheiten, deren häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen 10 beträgt, zu synthetisieren und anzureichern. Besondere Beispiele geeigneter Pseudomonas-Stämme sind Pseudomonas sp. Stamm NCIMB 40135, Pseudomonas putida Stämme NCIB 8865 und NCIB 9571, Pseudomonas aeruginosa Stämme NCIB 8626 und 9904 und Pseudomonas fluorescens NCIB 9520.
Andere Bakterienstämme, die gleiche Kennzeichen wie die vorstehend erwähnten bevorzugten Stämme aufweisen, können in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Die anderen Stämme können diese gewünschten Kennzeichen von Natur aus aufweisen, oder sie können diese gewünschten Kennzeichen durch Übertragung der notwendigen genetischen Information von Stämmen, die die gewünschten Kennzeichen besitzen, erworben haben. Die Übertragung von genetischer Information, die für die Herstellung und Anreicherung von PHB erforderlich ist, zwischen Stämmen von Bakterien, wurde zuvor von Schubert et al im Journal of Bacteriology 12 (1988) Seite 5837 bis 5847, und von Slater et al, ebenfalls im Journal of Bacteriology, 10 (1988), Seite 4431 bis 4436 offenbart.
Pseudomonas sp. NCIMB 40135 wurde am 5. Mai 1989 hinterlegt, unter den Bedingungen und Voraussetzungen (terms band conditions) des Budapester Abkommens.

Beschreibung von Pseudomonas sp. NCIMB 40135.

Morphologie

Gramnegative Stäbchen mit einer ungefähren Größe von 0,7 um bis 1,0 um x 2,0 bis 4,0 um.
Es wurden intrazelluläre Körnchen erzeugt.
Keine Sporenbildung.
Morphologie der Kolonien (Lab M Nährstoff Agar) - der Organismus erzeugt runde, regelmäßige, undurchsichtige, glatte, cremefarbene konvexe Kolonien. Nach einem 2-tägigen Wachstum betrug der Durchmesser ungefähr 2 mm.

Temperatur

Optimale Wachstumstemperatur 25 bis 30ºC
Kein Wachstum bei 41 ºC.

Kennzeichen

Nitratreduktion -
Indolerzeugung (aus Tryptophan) -
Glucose-Ansäuerung +
Arginindihydrolase +
Urease -
Äsculinhydrolyse -
Gelatineverflüssigung -
p-Nitrophenyl-B-D-galactopyranosidhydrolyse -
Glucoseassimilation +
Arabinoseassimilation +
Mannitolassimilation +
Mannoseassimilation +
N-Acetylglocosaminassimilation +
Maltoseassimilation +
Gluconatassimilation +
Capratassimilation +
Adipatassimilation
Malatassimilation +
Citratassimilation +
Acetatassimilation +
Phenylacetatassimilation +
Cytochromoxidase +
Eine spezielle Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben.
Der nachstehende Begriff stickstoff-beschränktes Medium bezieht sich auf ein Medium, in dem die in dem Medium vorhandene Stickstoffmenge sich zu der Menge anderer Bestandteile des Mediums disproportional verhält. Die Anteile an Stickstoff gegenüber den anderen Bestandteilen in solch einem Medium sind so beschaffen, daß ein Mikroorganismus, der mit dem Medium versorgt wird, Stickstoff und andere Bestandteile nutzen wird, aber den anwesenden Stickstoff vor den anderen anwesenden Bestandteilen verbraucht.

Beispiel 1

Pseudomonas sp. NCIMB 40135 wurde aerob in einer kontinuierlichen Kultur bei einem pH-Wert von 7 und bei 30 &sup0;c in einem 21-Chemostat mittels eines stickstoffbeschränkenden Mediums gezüchtet, das die nachstehende Zusammensetzung, ausgedrückt pro Liter an destilliertem Wasser, aufwies:
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,4 (g)
K&sub2;SO&sub4; 0,4 (g)
Na&sub2;SO&sub4; 0,025 (g)
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,025 (g)
H&sub3;PO&sub4; (85 Gew.-%) 1,0 (ml)
Glucose 30,0 (g)
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,62 (g)
Spurenelementlösung 10,0 (ml)
Die Spurenelementlösung wies, pro Liter an destilliertem Wasser, die nachstehende Zusammensetzung auf:
MnSO&sub4;.4H&sub2;O 0,406 (g)
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0,440 (g)
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,078 (g)
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 7,34 (g)
Das stickstoff-beschränkte Medium wurde durch den Chemostat zugeführt, um eine Verdünnungsrate von 0,1 h&supmin;¹ zu erreichen.
Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Der Polymergehalt der gesamten Bakterien wurde durch Gaschromatographie der durch Methanolyse erzeugten Methyl-3-hydroxysäuren ermittelt. Die Analysen zeigten, daß die Zellen 5,2 Gew.-% Polymer enthielten.

BEISPIEL 2

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Verdünnungsrate auf 0,035 h&supmin;¹ verringert wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß ein Polymergehalt von 21,4 Gew.-% vorhanden war.

BEISPIEL 3

Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Belüftung der Kultur so verringert wurde, daß der Grad der Spannung an gelöstem Sauerstoff 1% desjenigen des Luftsättigungswertes betrug. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts ergab, daß 10,4 Gew.-% Polymer vorhanden war.

BEISPIEL 4

In einem Vergleichsbeispiel wurde das Verfahren aus Beispiel 3 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Belüftungsrate noch weiter bis zu einem Ausmaß verringert wurde, bei dem die Kultur sauerstoff-beschränkt war. Dies wurde festgestellt, als unverbrauchter Stickstoff in der Kultur nachgewiesen werden konnte. Eine nachfolgende Analyse der Zellen ergab, daß kein Polymer vorhanden war.

BEISPIEL 5

In einem weiteren Beispiel des Verfahrens der Erfindung wurde Pseudomonas sp. NCIMB 40135 in einer Schüttelgefäß-Kultur bei einem pH-Wert von 7 und 30 ºC aerob gezüchtet, in einem 1 l-Kolben, der 200 ml eines Mediums enthielt, das die nachstehende, in pro Liter destilliertem Wasser ausgedrückte Zusammensetzung aufwies.
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,4 (g)
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,025 (g)
K&sub2;HPO&sub4; 7,6 (g)
NaH&sub2;pO&sub4; 6,24 (g)
Glucose 10,0 (g)
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 7,0 (g)
Spurenelementlösung 10,0 (ml)
Nach 24 Stunden wurden die Bakterien mittels Zentrifugierung aseptisch geerntet und in 200 ml eines frischen Mediums, das einen Mangel an Stickstoff aufwies, d.h. kein (NH&sub4;)SO&sub4; enthielt, überführt. Die Bakterien wurden dann in einer Schüttelgefäß-Kultur weitere 24 Stunden lang aerob gezüchtet. Die Bakterien wurden dann mittels Zentrifugierung geerntet, gewaschen und gefriergetrocknet. Der Polymergehalt der Zellen wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 ermittelt und lag bei 4 Gew.-%.

BEISPIEL 6

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Natriumacetat ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 6,4 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 7

Das Verfahren aus Beispiel 6 wurde wiederholt. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 4,6 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 8

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Glycerol ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 4,7 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 9

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Lactat ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 8,5 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 10

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Succinat ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 1,3 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 11

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Fructose ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 16,4 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 12

Das Verfahren aus Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Glucose durch Gluconat ersetzt wurde, in einer Konzentration von 10 g.l&supmin;¹. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 16,5 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 13

Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Pseudomonas sp. NCIMB 40135 durch den Stamm Pseudomonas putida NCIB 8865 ersetzt wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 25,8 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 14

Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Pseudomonas sp. NCIMB 40135 durch den Stamm Pseudomonas putida NCIB 9571 ersetzt wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 8,9 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 15

Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Pseudomonas sp. NCIMB 40135 durch den Stamm Pseudomonas aeruginosa NCIB 9904 ersetzt wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 2,5 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 16

Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Pseudomonas sp. NCIMB 40135 durch den Stamm Pseudomonas aeruginosa NCIB 8626 ersetzt wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 1,5 Gew.-% Polymer vorhanden waren.

BEISPIEL 17

Das Verfahren aus Beispiel 12 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß der Stamm Pseudomonas sp. NCIMB 40135 durch den Stamm Pseudomonas fluorescens NCIB 9520 ersetzt wurde. Eine nachfolgende Analyse des Polymergehalts der Zellen ergab, daß 0,2 Gew.-% Polymer vorhanden waren.
Weitere Analysen der nach dem mikrobiologischen Verfahren hergestellten Polymere, wie in den vorstehenden Beispielen 1 bis 3 und 5 bis 17 beschrieben, ergaben, daß die Polymere die nachstehenden Zusammensetzungen aufwiesen. Stamm (NCIB) Kohlenstoffquelle C-Atome Polymer Gew.-% Mol-% Monomer im Polymer

Claims

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Polyester, der in häufigster Anzahl auftretende Wiederholungseinheiten mit der Formel

-O.CH((CH&sub2;)xCH&sub3;).CH&sub2;.CO-

enthält, wobei x 4 oder 6 ist, wobei das Verfahren die Züchtung mindestens eines Bakteriums, unter aeroben Bedingungen, bei einem pH-Wert, der auf ungefähr 7 gehalten wird, mittels eines Substrats umfaßt, das eine assimilierbare Kohlenstoffverbindung mit 8 oder weniger Kohlenstoffatomen umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas sp. NCIMB 40135, Pseudomonas putida NCIB 8865, Pseudomonas putida NCIB 9571, Pseudomonas aeruginosa NCIB 9904, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8626, Pseudomonas fluorescens NCIB 9520 und anderen Pseudomonas-Arten, denen ein für die Umwandlung von Glucose in solch einen Polyester wirksamer Stoffwechselweg gemeinsam ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die assimilierbare Kohlenstoffverbindung aus Glucose, einer Zuckerverbindung, die zu Glucose metabolisierbar ist, Essigsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure und Glycerol ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bakterium Pseudomonas sp. NCIMB 40135 ist und die assimilierbare Kohlenstoffverbindung aus Glucose, einer Zuckerverbindung, die zu Glucose metabolisierbar ist, Fructose, Gluconat, Natriumacetat, Succinat und Lactat ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Anzahl der Kohlenstoffatome in der assimilierbaren Kohlenstoffverbindung nicht größer als N-2 ist, wobei N die Anzahl der Kohlenstoffatome in der häufigst auftretenden Wiederholungseinheit ist.

5. Biologisch reine Kultur eines Bakteriums, wobei das Bakterium geeignet ist, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, Polyester aus Glucose zu synthetisieren und anzureichern, und die Kennzeichen des Stammes Pseudomonas sp. NCIMB 40135 aufweist.

6. Biologisch reine Kultur eines Bakteriums nach Anspruch 5, wobei das Bakterium geeignet ist, wenn es mittels Glucose gezüchtet wird, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, Polyester zu synthetisieren und anzureichern, die Monomer-Wiederholungseinheiten umfassen, in denen die häufigst auftretende Anzahl an Kohlenstoffatomen 10 beträgt.