DE69221777T2 - Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure - Google Patents
Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-GulonsäureInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure durch fermentative Umwandlung von D-Sorbit in hoher Ausbeute.
- 2-Keto-L-gulonsäure ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, in die sie mit der wohlbekannten Reichstem-Methode umgewandelt werden kann.
- Die fermentative Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Sorbit oder L-Sorbose ist bekannt.
- So offenbart die Japanische Patentschrift 40154/1976 die Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Sorbit mit Hilfe von Mikroorganismen der Gattung Acetobacter, Bacterium oder Pseudomonas, die D-Sorbit unter aeroben Bedingungen oxidieren können, was 2-Keto-L-gulonsäure erzeugt. Die Ausbeute mit diesem bekannten Verfahren ist jedoch sehr gering, nämlich weniger als 6 g/l.
- Gemäß einem anderen bekannten Verfahren, das in "Acta Microbiologica Sinica" 21(2), 185 bis 191 (1931), offenbart wird, wird 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose hergestellt mit Hilfe einer gemischten Kultur von Mikroorganismen, die Pseudomonas striata und Gluconobacter oxydans umfaßt, wobei die Ausbeute 30 g/l ist, wenn von einer Konzentration von 70 g/l L-Sorbose ausgegangen wird, und 37 g/l ist, wenn von einer Konzentration von 100 g/l L-Sorbose ausgegangen wird.
- Außerdem offenbart die Europäische Patentschrift Nr. 0 221 707 die Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose mit Hilfe von Pseudogluconobacter saccharoketogenes mit und ohne begleitende Bakterien. Jedoch ist die Ausbeute bei diesem bekannten Verfahren mit Hilfe von Pseudogluconobacter saccharoketogehes an sich höchstens 55,3 bis 87,6 g/l (Umwandlungsverhältnis: 34,2 bis 54,1%) (siehe Seite 13, Tabelle 4 der Europäischen Patentschrift Nr. 0 221 707).
- Außerdem offenbart die Europäische Patentschrift Nr. 0 278 447 ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose mit Hilfe einer gemischten Kultur von Mikroorganismen, von denen einer die kennzeichnenden Merkmale des Stammes DSM Nr. 4025 hat und der andere die kennzeichnenden Merkmale von DSM Nr. 4026 (ein Bacillus megatenum Stamm). Die Ausbeute bei diesem Verfahren ist 40 g/l und mehr.
- Wie oben beschrieben gibt es verschiedene Versuche, 2-Keto-L- gulonsäure entweder aus L-Sorbose oder D-Sorbit mikrobiologisch herzustellen, aber diese sind noch weit von einer industriellen Anwendung entfernt aufgrund der geringen Ausbeuten, insbesondere bei den Verfahren ausgehend von D-Sorbit. Das vorliegende Verfahren ermöglicht Ausbeuten von mindestens ca. 60 g/l und Ausbeuten von ca. 130 g/l sind erreichbar.
- Andererseits ist die fermentative Herstellung von L-Sorbose aus D-Sorbit bekannt und daß das Verfahren Teil des Reichstein-Verfahrens ist.
- Von verschiedenen Acetobacter(derzeit als Gluconobacter klassifiziert)-Stämmen wie Acetobacter xylinum und Acetobacter suboxydans, ist bekannt, daß sie L-Sorbose aus D-Sorbit effizient produzieren (Biotechnology, Band 6a, 436 bis 437, 1984, herausgegeben von H.-J. Rehm und G. Reed, veröffentlicht vom Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland).
- Unter der Voraussetzung, daß man ein effizientes Herstellungsverfahren für 2-Keto-L-gulonsäure ausgehend von einer billigeren Kohlenstoffquelle, wie D-Sorbit, statt L-Sorbose, einführen kann, ist es offensichtlich, daß das Reichstein- Verfahren dramatisch vereinfacht werden kann.
- Der Stamm DSM Nr. 4025 kann 2-Keto-L--gulonsäure aus L-Sorbose, wie oben erwähnt, wirksam produzieren, wohingegen er aus D-Sorbit niedrige Umwandlungsraten liefert. Die geringe Umwandlungsrate für 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Sorbit beruht auf der Bildung von Nebenprodukten, wie D-Glucose, D-Gluconat und 2-Keto-D-gluconsäure, die aus D-Sorbit abgeleitet werden. Die Reinigung von 2-Keto-L-gulonsäure von ihrem Isomer, 2-Keto-D-gulonsäure, führt zu Schwierigkeiten. Ein möglicher metabolischer Weg von D-Sorbit in dem Stamm DSM Nr. 4025 ist unten gezeigt.
- Um die Ausbeute an 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Sorbit bei der Fermentation unter Verwendung des Stamms DSM 4025 zu verbessern, wurde in Betracht gezogen, daß dies erreicht werden könnte, indem der Weg zur L-Sorbose-Bildung soweit wie möglich mit irgendwelchen Mitteln verstärkt wird.
- Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Sorbit mit hoher Umwandlungsrate bereitzustellen, z.B. mindestens ca. 50 Mol% und bis zu einer Umwandlungsrate von ca. 89 Mol%.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Betriebsart bereitzustellen, bei der die Erzeugung von unerwünschten Nebenprodukten, wie D-Glucose, D-Gluconsäure und 2-Keto-D-gluconsäure vermieden wird.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung von 2-Keto-L-gulonsäure oder eines Salzes davon, das umfaßt, daß man eine Mischkultur von einem Mikroorganismus (A) der L-Sorbose aus D-Sorbit erzeugen kann, der der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter angehört, und von einem Mikroorganismus (B), der 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose erzeugen kann und die kennzeichnenden Merkmale des Stamms DSM Nr. 4025, eines funktionellen Aquivalents, einer Subkultur, einer Mutante oder Variante davon, aufweist, in einem Medium, das D-Sorbit enthält, kultiviert, wobei das Mischkultivieren so durchgeführt wird, daß beide Mikroorganismen zu gleicher Zeit in dem Medium existieren während mindestens eines Teils des gesamten Kultivierungszeitraumes, und die 2-Keto-L-gulonsäure oder ein Salz davon gewinnt.
- Außerdem kann erfindungsgemäß aus D-Sorbit durch einen L-Sorbose erzeugenden Stamm erzeugte L-Sorbose von dem 2-Keto-L- gulonsäure produzierenden Stamm verwertet werden unter Bildung von 2-Keto-L-gulonsäure. Außerdem wurde eine Ansammlung von Nebenprodukten, wie oben erwähnt, im wesentlichen nicht beobachtet.
- In diesem Zusammenhang gehört der Mikroorganismus (A), der L-Sorbose aus D-Sorbit erzeugen kann, der hier angewendet wird, zu der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter. Der Mikroorganismus (B), der 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose erzeugen kann, wird angewendet mit den kennzeichnenden Merkmalen des Stamms DSM Nr. 4025, eines funktionellen Aquivalents, einer Subkultur, Mutante oder Variante davon.
- Beim vorliegenden Verfahren kann jedes Produkt, das z.B. durch Behandlung der Zellen der Mikroorganismen (A) und (B) erhalten wurde, z.B. ruhende Zellen, lyophilisierte Zellen oder immobilisierte Zellen, angewendet werden.
- Das vorliegende Verfahren kann mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden; z.B. mit einer Methode, bei der das Medium zu Beginn der Züchtung mit beiden Arten von Mikroorganismen (A) und (B) gleichzeitig beimpft wird, einer Methode, bei der zuerst mit Mikroorganismus (A) und anschließend mit Mikroorganismus (B) nach einer Züchtungsperioode beimpft wird, und einer Methode, bei der beide Mikroorganismen (A) und (B) getrennt in entsprechende Medien geimpft werden und dann entweder einer der beiden zu der Brühe des anderen auf einmal, portionsweise oder kontinuierlich nach einer gewissen Züchtungszeit zugegeben wird, woran sich eine weitere Züchtungsperiode anschließt.
- Für das erfindungsgemäße Verfahren kann jede geeignete Methode für die zu züchtenden Mikroorganismen angewendet werden, z.B. indem das Verfahren des Vermischens in übereinstimmung mit den Eigenschaften der einzelnen angewendeten Mikroorganismen verändert wird. Das Verhältnis der Menge des einen Mikroorganismus, der geimpft werden soll, zu der des anderen und die Impfzeiten werden bevorzugt im Hinblick auf die Wachstumsrate der jeweiligen Mikroorganismen und der L-Sorbose erzeugenden Fähigkeit und der Fähigkeit, L-Sorbose in 2- Keto-L-gulonsäure umzuwandeln bei den betroffenen Mikroorganismen und auf Basis der Eigenschaften der zu verwendenden Medien ausgewählt und bestimmt. In einigen Fällen können die durch Behandlung der Zellen erhaltenen Produkte auch als Ersatz für eine der wachsenden Zellen verwendet werden.
- Der Mikroorganismus (A), der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden kann, schließt solche Mikroorganismen ein, die in einer öffentlichen Hinterlegungsstelle (culture collection) zur Abgabe an irgendjemanden auf Antrag, wie z.B. das Institute of Fermentation Osaka, Japan (IFO) hinterlegt wurden, und im folgenden aufgeführt sind:
- Gluconobacter suboxydans IFO 3130
- Gluconobacter suboxydans IFO 3255
- Gluconobacter suboxydans IFO 3256
- Gluconobacter suboxydans IFO 3257
- Gluconobacter suboxydans IFO 3258
- Gluconobacter suboxydans IFO 3289
- Gluconobacter suboxydans IFO 3290
- Gluconobacter suboxydans IFO 3291
- Gluconobacter gluconicus IFO 3171
- Gluconobacter gluconicus IFO 3285
- Gluconobacter gluconicus IFO 3286
- Gluconobacter rubiginosus IFO 3244
- Gluconobacter albidius IFO 3251
- Gluconobacter albidius IFO 3253
- Gluconobacter industrius IFO 3261
- Gluconobacter cerinus IFO 3262
- Gluconobacter cerinus IFO 3263
- Gluconobacter cerinus IFO 3265
- Gluconobacter cerinus IFO 3266
- Gluconobacter cerinus IFO 3267
- Gluconobacter cerinus IFO 3270
- Gluconobacter diacetonicus IFO 3273
- Gluconobacter roseus IFO 3990
- Acetobacter aceti subsp. orleans IFO 3259
- Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281
- Acetobacter liquefaciens IFO 12257
- Acetobacter liquefaciens IFO 12258
- Acetobacter liquefaciens IFO 12388
- Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288
- Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693
- Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772
- Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13773
- Die hauptsächlichen kennzeichnenden Merkmale des Mikroorganismus (B), der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden kann, sind: negativer Oxidasetest; Ethanol wird zu Essigsäure oxidiert; D-Glucose wird zu D-Gluconsäure und 2- Keto-D-gluconsäure oxidiert; Ketogenese von Polyalkoholen; Dihydroxyaceton wird im wesentlichen nicht aus Glycerin erzeugt; 2-Keto-D-glucarsäure wird aus D-Glucarsäure erzeugt, nicht aber aus D-Glucose, D-Fructose, D-Gluconsäure, D-Mannit oder 2-Keto-D-gluconsäure; polymorph offensichtlich keine Geißeln; braune Pigmente werden aus D-Fructose erzeugt; gutes Wachstum wird beobachtet, wenn gleichzeitig in Gegenwart von Bacillus megatenum oder einem Zellextrakt davon gezüchtet wird; streptomycinempfindlich.
- Ein als Mikroorganismus (B) anzuwendender spezifischer und bevorzuger Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen unter DSM Nr. 4025 am 17. März 1987 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt (die derzeitige Adresse dieses Instituts ist: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland). Er wurde als Gluconobacter oxydans-Mikroorganismus bezeichnet.
- Weitere bevorzugte Mikroorganismen sind funktionelle Aquivalente, Subkulturen, Mutanten und Varianten des erwähnten Mikroorganismus.
- In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die vorher erwähnten Mikroorganismen (A) und (B) in ein Medium, das D-Sorbit enthält, geinpft und darin gezüchtet werden, und die Zellen dieser Mikroorganismen, z.B. ruhende Zellen oder irgendein verarbeitetes Produkt, das aus den Zellen erhalten wurde, können verwendet werden, um direkt auf D- Sorbit zu wirken. Jedes Mittel, das an sich bekannt ist als Methode in Zusammenhang mit der Züchtungstechnik für Mikroorganismen und an die Verwendung von belüfteten und gerührten Submers-Fermentern angepaßt werden kann, ist besonders bevorzugt. Ein bevorzugtes Ergebnis ist erhältlich bei einer Züchtung, bei der ein flüssiges Nährmedium verwendet wird.
- Was das Nährstoffnedium betrifft, das für die Züchtung der Mikroorganismen (A) und (B) verfügbar ist, so ist dies, obwohl keine spezifischen Beschränkungen bestehen, ein wäßriges Nährstoffmedium, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält. Andere anorganische Salze, geringe Mengen an anderen Nährstoffen und dgl., die von den Mikroorganismen verwertet werden können, sind wünschenswert für die vorteilhafte Inkubation der Mikroorganismen. Verschiedene Nährstoffmaterialien, die allgemein für das bessere Wachstum von Mikroorganismen verwendet werden, können geeigneterweise in dem Medium enthalten sein.
- Zusätzlich zu D-Sorbit, das als Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung verwendet wird, können auch andere Substanzen, die Kohlenstoffquellen sind, zugegeben werden, z.B. Glycerin, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, D-Arabit und dgl.
- Verschiedene organische oder anorganische Substanzen können auch als Stickstoffquellen für das vorliegende Verfahren verwendet werden, z.B. Fleischextrakt, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsalze und dgl. Als anorganische Substanzen können Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen(II) - und Eisen(III) chloride, Calciumcarbonat und dgl. verwendet werden.
- Das Mischverhältnis dieser Nährstoffe und die Mengen jedes Inhaltsstoffs können je nach den generischen Eigenschaften der angewendeten Mikroorganismen, der Mengen des Ausgangsmaterials D-Sorbit, der Menge eines der zu impfenden Mikroorganismen im Hinblick auf den anderen und der Impfzeiten variieren und die anderen Bedingungen der Inkubation können gemäß den Einzelheiten für den jeweiligen Fall ausgewählt und bestimmt werden.
- Die Konzentration des Ausgangsmaterials D-Sorbit in dem Medium kann auch je nach den generischen Eigenschaften und dgl. der angewendeten Mikroorganismen variieren. D-Sorbit kann dem Medium zu Beginn der Züchtung auf einmal oder getrennt während des Züchtungsverfahrens zugegeben werden. Im vorliegenden Verfahren erbringt die getrennte Zugabe von D- Sorbit etwas bevorzugtere Ergebnisse. Eine Konzentration von D-Sorbit, die insgesamt bei etwa 20 bis 250 gil liegt, wird allgemein verwendet und bevorzugter eine Konzentration von insgesamt etwa 50 bis 200 g/l
- Die Züchtungsbedingungen können auch variieren abhängig von der Art und den generischen Eigenschaften der angewendeten Mikroorganismen, die Zusammensetzung des Mediums kann natürlich je nach den Einzelheiten des jeweiligen Falles ausgewählt oder bestimmt werden, um das erwünschte Produkt am effizientesten zu liefern, obwohl Züchtungstemperaturen zwischen etwa 13 und 3600, bevorzugt zwischen etwa 18 und 3300, und ein pH-Wert des Mediums zwischen etwa 4,0 und 9,0, bevorzugt zwischen etwa 6,0 und 8,0, aufrechterhalten werden können. Normalerweise ist ein Züchtungszeitraum im Bereich von 20 bis 80 Stunden ausreichend und die Bildung des gewünschten Produktes in dem Medium erreicht den maximalen Wert innerhalb einer solchen Periode.
- Um den pH-Wert des Mediums so aufrechtzuerhalten, daß er für die enzymatische Aktivität am besten geeignet ist, kann irgendein geeignetes saures oder basisches Mittel dem Medium in einer geeigneten Menge zu einer geeigneten Zeit während der Züchtung zugegeben werden. Die gleiche Aufgabe kann alternativ gelöst werden, indem ein geeigneter Puffer oder ein Puffermittel in das Medium eingearbeitet wird zu Beginn der Züchtung.
- Die in den Medium erzeugte 2-Keto-L-gulonsäure kann mit üblichen Methoden, die an sich bekannt sind, abgetrennt und gereinigt werden und kann als Salz, z.B. von Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium oder dgl., abgetrennt werden. Dieses Salz kann in eine freie Säure mit üblichen an sich bekannten Methoden umgewandelt werden.
- Die Abtrennung kann mit irgendeiner geeigneten Kombination oder Wiederholung der folgenden Stufen durchgeführt werden, z.B. durch Bildung eines Salzes oder durch Verwendung von Unterschieden in den Eigenschaften zwischen Produkt und umgebenden Verunreinigungen, wie Löslichkeit, Absorbierbarkeit und Verteilungskoeffizient zwischen Lösungsmitteln. Die Adsorption z.B. an einem Ionenaustauschharz bildet ein geeignetes Mittel zur Isolierung des Produktes. Das so erhaltene Produkt kann in üblicher Weise weiter gereinigt werden, z.B. durch Umkristallisation oder Chromatographie.
- Die mit dem neuen Verfahren angesammelte 2-Keto-L-gulonsäure kann leicht isoliert werden, z.B. mit dem folgenden Verfahren: der überstand der Kulturbrühe wird nach Zentrifugation bei vermindertem Druck eingeengt. Zu dem Konzentrat wird ein organisches Lösungsmittel, wie Ethanol, zugegeben und die so erhaltenen 2-Keto-L-gulonsäurekristalle werden in Salzform abgetrennt, z.B. als Natriumsalz oder Calciumsalz. Unabhängig davon, ob das obige oder andere bekannte Verfahren angewendet werden, kann die 2-Keto-L-gulonsäure immer sehr leicht isoliert werden.
- Die so erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure oder ihr Salz kann direkt für die Umwandlung in L-Ascorbinsäure durch Veresterung und anschließende Enolisierung und Lactonisierung verwendet werden.
- Züchtungsmethoden, die verwendet werden können, schließen Standkulturen, Schüttelkulturen, Submerskulturen etc. ein. Für die Massenkultur stehen Subnerskulturen unter Verwendung von diskontinuierlichen, Fed-Batch- und kontinuierlichen Betriebstechniken im Vordergrund des Interesses. Es ist auch möglich, immobilisierte Zellen der Mikroorganismen (A) und (B) zu verwenden durch Absorptionsmethoden auf Materialien, wie Cellulose, Keramik oder Glasperlen etc. und durch Einfangmethoden, z.B. in einer Gelmatrix, wie Agar, Calciumalginat, K-Carrageen und anderen bekannten Polymeren. Diese Durchführungsform ermöglicht es, die Mikroorganismen wiederholt zu verwenden.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:
- Der Stamm DSM Nr. 4025 stellt den Mikroorganismus (B) dar, wohingegen die in Tabelle 1 aufgelisteten Mikroorganismen als Mikroorganismen (A) angewendet wurden.
- Die Impfkultur wurde auf zwei verschiedenen Wegen, wie unten beschrieben, hergestellt.
- Ein Teströhrchen (18 mm x 200 mm) wurde mit 5 ml Kulturmedium (SCM): D-Sorbit 2%, Hefeextrakt (Oriental Yeast) 0,3%, Rinderextrakt 0,3%, Maisquellwasser 0,3%, Polypepton 1,0%, Harnstoff 0,1%, KH&sub2;PO&sub4; 0,1%, MgSO&sub4;.7 H&sub2;O 0,02% und CaCO&sub3; 0,1% (pH 7,0 vor der Sterilisierung) beschickt und durch Autoklavieren bei 121ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Das Teströhrchen wurde mit einer Schlinge des Organismus (A) und einer Schlinge des Organismus (B) beimpft und bei 30ºC unter Schütteln (220 Upm) einen Tag lang inkubiert.
- Ein Teströhrchen (18 mm x 200 mm), das 5 ml SCM enthielt, wurde jeweils mit einer Schlinge des Mikroorganismus (B) und einer Schlinge des Mikroorganismus (A) beimpft und bei 30ºC unter Schütteln einen Tag lang gezüchtet. Ein Tropfen der entstehenden Kultur wurde auf einen Agar-Kulturmedium, das 2% Agar in SCM enthielt, ausgestrichen und 4 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Die Mikroorganismen, die auf der Agar-Kultur als Mischung gezüchtet wurden, wurden direkt als Inokulum für die folgende Flüssigkultur verwendet. Ein Röhrghen, das 5 ml SCM enthielt, wurde mit einer Schlinge der oben beschriebenen Mischung beimpft und bei 30ºC unter Schütteln (220 Upm) einen Tag lang inkubiert.
- 5 ml der entstehenden einzelnen Impfkulturen, die wie oben hergestellt wurden, wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben, der 50 ml Produktionsmedium (PM) enthielt, beimpft: D-Sorbit 8%, Maisquellwasser 1%, Harnstoff 1,5% (get;rennt sterilisiert), KH&sub2;PO&sub4; 0,1%, MgSO&sub4;.7 H&sub2;O 0,01%, CaCO&sub3; 0,6% und Antischaummittel 0,1% (pH 7,0 vor der Sterilisierung) und 4 Stunden lang bei 30ºC unter Schütteln (180 Upm) inkubiert. Tabelle 1 faßt die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung von 2-Keto-L-gulonsäure in den Kulturbrühen zusammen, die mit Hochleistungsflüssig-Chromatographie analysiert wurden. Tabelle 1
- Impfkulturen von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 und des Stamms DSM Nr. 4025 wurden auf gleiche Weise hergestellt, wie in Methode 1 von Beispiel 1 beschrieben. Die Zellkonzentration der Impfkulturen von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 und des Stamms DSM Nr. 4025 waren 3,7 x 10¹&sup0; Zellen/ml bzw. 5,4 x 10&sup8; Zellen/ml. Die jeweils entstehende Impfkultur wurde in 50 ml PM in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben geirnpft mit einer Gesamtgröße des Inokulums von 10% (V/V), wobei das Inokulumverhältnis (%, V/V) von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 zu Stamm DSM Nr. 4025 variiert wurde: 0:10, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 und 10:0. Die Kolben wurden 4 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wenn das Inokulumverhältnis des Stamms DSM Nr. 4025 zu Gluconobacter suboxydans IFO 3255 zwischen 1:9 und 4:6 lag, wurde 2-Keto-L-gulonsäure über diesen Bereich mit 63,9 g/l bis 66,6 g/l aus 80 g/l D-Sorbit erzeugt (Unwandlungsrate: 74,9 bis 78,1 Mol%) ohne Ansammlung von 2- Keto-D-gluconsäure. Tabelle 2
- Bemerkungen: 1. Gluconobacter suboxydans IFO 3255
- 2. Stamm DSM Nr. 4025
- 3. 2-Keto-L-gulonsäure
- 4. 2-Keto-D-gluconsäure
- Gluconobacter suboxydans IFO 3255 und Gluconobacter gluconicus IFO 3285 wurden als Mikroorganismus (A) verwendet und der Stamm DSM Nr. 4025 wurde als Mikroorganismus (B) verwendet. Eine einzelne Impfkultur (200 ml) wurde in gleicher Weise, wie bei Methode 2, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, hergestellt. Die einzelne Inpfkultur (200 ml) wurde in einen 3-1-Fermenter, der etwa 1,7 1 Fermentationsmedium enthielt, geimpft: D-Sorbit 8%, 10% oder 12%, Hefeextrakt 0,5%, Maisquellwasser 2,5%, MgSO&sub4;.7 H&sub2;O 0,0086%, Harnstoff 0,086% (getrennt sterilisiert), KH&sub2;PO&sub4; 0,086% und Antischaummittel 0,15%, 20 Minuten lang bei 121º0 sterilisiert. Nach der Beimpfung wurde das Kulturvolumen auf 2 1 eingestellt durch Zugabe von sterilisierten Wasser. Die Fementation wurde bei 30ºC mit 700 Upm für die Bewegung und 1 1/min für die Belüftung durchgeführt. Der pH der Kultur wurde mit 4 n Na&sub2;CO&sub3; auf 7,0 gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
- Anmerkungen: 1. 2-Keto-L-gulonsäure
- 2. 2-Keto-D-gluconsäure
- Auf gleiche Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde die Impfkultur (200 ml) der Mischung aus Gluconobacter suboxydans IFO 3255 und des Stamms DSM Nr. 4025 in einen 3-1-Fermenter geimpft, der 8% D-Sorbit im Fermentationsmedium enthielt und das Arbeitsvolumen wurde mit sterilisiertem Wasser auf 2 l eingestellt. Die Fermentation wurde unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben, gestartet. Getrennt wurde eine 500-ml-Mediumflasche mit 300 ml Beschickungsmedium beschickt: 120 g D-Sorbit, 10 g Hefeextrakt, 50 g Maisquellwasser, 0,172 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,72 g Harnstoff (getrennt sterilisiert) und 2,5 g Antischaummittel. Während der Fermentation wurde das obige Beschickungsmedium kontinuierlich den Fermenter in einer Rate von 15 ml/h in der Fermentationsperiode von 12 bis 18 Stunden, mit 60 ml/h von 18 Stunden bis 21 Stunden und mit 4,3 ml/h von 21 bis 28 Stunden zugeführt unter Verwendung einer Schlauchpumpe. Als Ergebnis wurden 224 g 2-Keto-L-gulonsäure aus 276 g D-Sorbit erzeugt mit einer Umwandlungsrate von 76,1 Mol% in 51 Stunden Fermentation.
- Eine Schlinge Gluconobacter suboxydans IFO 3255 wurde in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben geimpft, der 100 ml SCM enthielt, und bei 30ºC einen Tag lang inkubiert. 10 ml der so erhaltenen Kultur wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben ö überführt, der 100 ml SCM enthielt, und einen Tag lang bei 30ºC inkubiert. Insgesamt wurden 1,5 l der Impfkultur von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 hergestellt. Andererseits wurde eine Schlinge des Stamms DSM Nr. 4025 in einen 500-ml- Erlenmeyerkolben geimpft, der 100 ml des folgenden Impfkultumediums enthielt: L-Sorbose 8%, Glycerin 0,05%, Harnstoff 0,5% (getrennt sterilisiert), Maisquellwasser 1,75%, Bäckerhefe (Oriental Yeast) 5,0%, MgSO&sub4; 7 H&sub2;O 0,25%, CaCO&sub3; 1,5% und Antischaummittel 0,1% (pH 7,0 vor der Sterilisierung), und einen Tag in einen Drehschüttler (180 Upm) bei 30ºC inkubiert. 10 ml der so hergestellten Kultur wurden in 100 ml des gleichen Mediums, wie oben geimpft und einen Tag bei 30ºC inkubiert. Insgesamt wurden 1,5 1 Impfkultur des Stamms DSM Nr. 4025 hergestellt. In einen 50-1-Fermenter wurden 25 1 des Fermentationsmediums D-Sorbit 8%, Maisquellwasser 0,5%, MgSO&sub4;.7 H&sub2;O 0,01%, KH&sub2;PO&sub4; 0,025% und Antischaummittel 0,17%, gegeben und bei 121ºC 30 Minuten lang sterilisiert. Beide Impfkulturen (jeweils 1,5 l) wurden gleichzeitig geimpft und das gesamte Kulturvolumen wurde durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 30 1 eingestellt. Die Fermentation wurde bei 30ºC, 400 Upm für die Bewegung und 20 l/min für die Belüftung durchgeführt. Der pH der Kultur wurde mit 6,25 n NaOH auf 7,0 gehalten. Getrennt wurde eine 5-l-Mediumflasche mit 4 1 Beschickungsmedium beschickt, das 1800 g D-Sorbit, 150 g Maisquellwasser, 1,29 g MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 7,5 g KH&sub2;PO&sub4; und 25 g Antischaummittel enthielt, und bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Nach 12 Stunden Züchtung wurde das Beschikkungsmedium kontinuierlich dem Fermenter in einer Rate von 222 ml/h 18 Stunden lang unter Verwendung einer Schlauchpumpe zugeführt. Nach 45,5 Stunden Züchtung wurden 36,8 1 Fermentationsbrühe, die 93,5 g/l 2-Keto-L-gulonsäure enthielt, erhalten. In anderen Worten wurden 3441 g 2-Keto-L-gulonsäure aus 4200 g D-Sorbit mit einer Umwandlungsrate von 76,8 Mol% hergestellt.
- Die Fermentationsbruhe (36,8 l), die in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde zentrifugiert, um Zellsedimente und andere Sedimente zu entfernen. Der überstand (2 l), der 93,5 g/l 2-Keto- L-gulonsäure enthielt, wurde bei vermindertem Druck bei 45ºC auf etwa 1 l eingeengt. Während des Einengens wurde ein weißer Niederschlag beobachtet. Dann wurde das Konzentrat zu 100 ml Ethanol zugegeben und bei 10ºC einen Tag stehengelassen. Die entstehenden Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt, mit einer geringen Menge von 50%igern kalten Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur bei vermindertem Druck getrocknet. Als Ergebnis wurden 137,6 g Mononatrium-2-keto-L- gulonsäuremonohydrat mit einer Reinheit von 99,14% als erste Ernte erhalten. Die Mutterlauge wurde bei vermindertem Druck auf etwa 400 ml eingeengt, 100 ml Ethanol zugegeben und bei 10ºC 24 Stunden lang stehengelassen. Als Ergebnis wurden 71,9 g Mononatrium-2-keto-L-gulonsäuremonohydrat (Reinheit 85,04%) als zweite Ernte erhalten.
- Der überstand (0,5 l), der in Beispiel 6 erhalten wurde, wurde über Amberlite IR-120 (H-Art) (Rohm und Haas Company) geleitet und bei verminderten Druck getrocknet. Zu dem getrockneten Material (etwa 50 g) wurden 400 ml Methanol und 0,5 ml 98% Schwefelsäure zugegeben. Nachdem die Mischung 2 Stunden lang auf 90ºC erhitzt worden war, wurde das Methanol entfernt und der Rückstand mit einer geringen Menge Methanol gewaschen und getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde dann in 150 ml Methanol suspendiert und mit 10 g Natriummethylat am Rückfluß erhitzt. Die nach dem Abkühlen entstehenden Kristalle wurden abfiltriert und bei vermindertem Druck getrocknet. Als Ergebnis wurden 35,1 g Natrium-L-ascorbinsäure erhalten.
- Eine Schlinge Gluconobacter suboxydans IFO 3291 wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben, der 100 ml SCM enthielt, geimpft und bei 30ºC 18 Stunden lang inkubiert. Andererseits wurde eine Schlinge des Stamms DSM Nr. 4025 in einen 500-ml- Erlenmeyerkolben geimpft, der 100 ml Impfkulturmedium, wie in Beispiel 5 beschrieben, enthielt und 22 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. 10 ml der so hergestellten Kultur wurden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben geimpft, der 100 ml des gleichen Mediums, wie oben, enthielt und 18 Stunden lang - bei 30ºC inkubiert.
- In einen 3-l-Fermenter wurden 1,6 1 des Fermentationsmediums, das 160 g D-Sorbit, 10 g Maisquellwasser, 0,2 g MgSO&sub4;.7 H&sub2;O, 0,5 g KH&sub2;PO&sub4; und 2 g Antischaummittel enthielt, zugegeben und bei 121ºC 30 Minuten lang sterilisiert.
- Beide oben hergestellten Impfkulturen (jeweils 100 ml) wurden gleichzeitig geimpft und das gesamte Kulturvolumen wurde durch Zugabe von sterilisiertem Wasser auf 2 1 eingestellt. Getrennt wurde eine 500-ml-Mediumflasche mit 300 ml Beschikkungsnedium, das 180 g D-Sorbit, 10 g Maisquellwasser, 0,086 g MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,215 g KH&sub2;PO&sub4; und 1 g Antischaummittel enthielt, beschickt und bei 121ºC 30 Minuten lang sterilisiert. Die Fermentation wurde mit einer Belüftungsrate von 1,0 l/min durchgeführt und der pH des Mediums wurde unter Verwendung von NaOH auf 7,0 eingestellt. Die anderen Fermentationsparameter sind in Tabelle 4 angegeben. Nach 6,5 Stunden Züchtung wurde das Beschickungsmedium kontinuierlich dem Fermenter in einer Rate von 30 ml/h 10 Stunden lang unter Verwendung einer Schlauchpumpe zugeführt. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurden insgesamt 322,7 g 2-Keto-L-gulonsäure aus 340 g D-Sorbit hergestellt mit einer molaren Umwandlungsrate von 89,0%, wenn die Fermentation bei 28ºC und mit einer Rührgeschwindigkeit von 800 Upm durchgeführt wurde. Tabelle 4
- Anmerkung: 340 g D-Sorbit wurden insgesamt verwendet
- Weitere Hinterlegungen gemäß Budapester Vertrag erfolgten am 30. März 1992 mit den einzelnen Stämmen und Mischungen von Stämmen, die in den Beispielen verwendet wurden, wie folgt:
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure oder eines
Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischkultur von
einem Mikroorganismus (A), welcher zur Erzeugung der L-Sorbose von D-
Sorbit befähigt ist und der Gattung Gluconobacter oder Acetobacter
angehört, und von einem Mikroorganismus (B), welcher zur Erzeugung der
2-Keto-L-gulonsäure von L-Sorbose befähigt ist und die kennzeichnenden
Merkmale des Stammes DSM Nr.4025 (FERM BP-3812) oder eines
flinktionellen Aequivalents, einer Subkultur, einer Mutante oder einer
Variante davon aufweist, in einem D-Sorbit enthaltenden Medium
kultiviert, wobei das Mischkultivieren so durchgeführt wird, dass unter
Vermeidung der Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte, wie
beispielsweise D-Glucose, D-Gluconsäure sowie 2-Keto-L-gluconsäure, eine
Umwandlungsausbeute der von D-Sorbit erzeugten 2-Keto-L-gulonsäure von
inindestens 50 % erreicht wird, und dass man die 2-Keto-L-gulonsäure oder
ein Salz davon abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der
Mikroorganismus (A) der Spezies angehört, die aus der Gruppe
a) Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter gluconicus, Gluconobacter
rubiginosus, Gluconobacter albidus, Gluconobacter industrius,
Gluconobacter cerinus, Gluconobacter diacetonicus, Gluconobacter roseus,
Acetobacter aceti subsp. orleans, Acetobacter liquefaciens und Acetobacter
aceti subsp. xylinum ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass
der Mikroorganismus (A) ein Gluconobactor-Stamm, vorzugsweise einer
der Stämme IFO 3255, 3256, 3258, 3267, 3285, 3290 und 3,291 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass
man einen Mikroorganismus (B) verwendet, der dem Stamm DSM Nr. 4025
oder einem funktionellen Aequivalent, einer Subkultur, einer Mutante oder
einer Variante davon entspricht.
5. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, dass man D-Sorbit bei einer Konzentration von etwa 20 g/l
bis etwa 250 g/l, vorzugsweise von etwa 50 g/l bis etwa 200 g/l, einsetzt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, dass das Kultivieren bei einem pH-Wert zwischen etwa 4,
und etwa 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und etwa 8,0, durchgeführt
wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, dass das Kultivieren bei einer Temperatur zwischen etwa
13 und etwa 36ºC, vorzugsweise zwischen etwa 18 und etwa 33ºC,
durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, dass die 2-Keto-L-gulonsäure zur Ascorbinsäure oder zu
einem Salz davon in an sich bekannter Weise umgesetzt wird.
9. Mischkultur eines Mikroorganismus,. die einen Mikroorganismus
(A), welcher zur Erzeugung der L-Sorbose von D-Sorbit befähigt ist und der
Gattung Gluconobacter oder Acetobacter angehört, und einen
Mikroorganismus (B), welcher zur Erzeugung der 2-Keto-L-gulonsäure von
Sorbose befähigt ist und die kennzeichnenden Merkmale des Stammes DSM
Nr.4025 (FERM BP-3812) oder eines flinktionellen Aequivalents, einer
Subkultur, einer Mutante oder einer Variante davon aufweist, enthält
10. Mikroorganismus-Kultur nach Anspruch 9, in der (A) der Stamm
IFO 3255, IFO 3256 oder IFO 3291 und eine funktionell äquivalente Kultur,
Subkultur, Mutante oder Variante davon ist.
11. Mikroorganismus-Kultur nach Anspruch 9, welche durch die
Befähigung zur Erzeugung der 2-Keto-L-gulonsäure von D-Sorbit in einer
Ausbeute von mindestens 60 g/l, vorzugsweise mindestens 120 g/l, ganz
bevorzugt mindestens 130 g/l, gekennzeichnet ist.
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