CS273163B2

CS273163B2 - Method of l-carnitine production

Info

Publication number: CS273163B2
Application number: CS222085A
Authority: CS
Inventors: Hans Dr Kulla; Pavel Dr Lehky
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1984-03-29
Filing date: 1985-03-27
Publication date: 1991-03-12
Also published as: EP0158194A3; DK138085D0; DD232310A5; IL74552A0; CN1004146B; CA1265757A; FI850781A0; RO92477B; US5187093A; YU45708B; IL74552A; EP0158194A2; FI86889B; NO164918B; ES541663A0; NO851261L; ZA851959B; FI86889C; IE58045B1; AU4019285A

Description

Je známa příprava 1-karaitinu z ý⁴-butyrobetainu. ^-Butyrobetain se uvede do styku s hydroxylázovým enzymem získaným ze spor Keurospora crassa /US-PS 4371618/ za přítomnosti natrium-2-oxoglutarátu, redukčního činidla, zdroje železa a vzdušného kyslíku. Tento způsob má tu nevýhodu, že vyžaduje značný počet kofaktorů. Tak se v reakci stechiometrická množství 2-oxoglutarátu oxidačně dekarboxylují na sukoinát. Pe²⁺ je potřebný jako Og-aktivátor, askorbát pro udržení iontu železa v redukované formě a kataláza pro likvidaci škodlivého peroxidu vodíku vznikajícího ve stopovém množství.

lindstedt a kol. /Biochemistry _6_, 1262-1270 /1967/ The Pormation and Degradation of Camitin in Pseudomonas/ izolovali mikroorganismus rodu Pseudomonss, který se kultivuje s ^-butyrobetainem jako zdrojem uhlíku a dusíku. První reakcí odbourávání je hydroxylaoe -butyrobetainu na 1-kamitin, přičemž intermediárně vznikající 1-kamitin je dále zcela katabolizován na oxid uhličitý, vodu a amoniak.

Také při tomto postupu, který používá hydroxylázu získanou z bakterií pro přípravu I-karaitinu, je třeba značného množství kofaktorů /linstedt a kol., Biochemistry 16, 2181-2188 /1977/ Purifikation and Properties of -hutyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1/.

Úkolem vynálezu je nalézt nový mikroorganismus, který nemá nevýhody známých způsobů a umožnit tak získat jednoduchým způsobem ne racemát, ale enantio-selektivní 1-kamitin z krotonbetainu, butyrobetainu nebo jejich směsi.

1-kamitin se podle vynálezu vyrábí kultivací bakteriálního produkčního kmene v* živné půdě, která obsahuje ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain jako zdroj uhlíku a dusíku, růstové faktory, při podmínkách čeření do maximálního nahromadění konečného produktu a jeho následnou izolací. Způsob výroby spočívá v tom, že se jako bakteriálního produkčního kmene použije Agrobaoterium ÍHK4DSM 2938 ·, nebo Agrobacterium HK 13 DSM 2903, nebo Agrobacterium HK 1331 b DSM 3225. ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain se použije v množství od 0,1 do 10,0 %. hmotnostních, vztaženo na kultivační médium.

Ma rozdíl od způsobů podle známého stavu techniky používají mikroorganismy podle vynálezu jako donátor hydroxylových skupin vodu a ne kyslík, což je dokázáno pokusy za použití Hg^O a ¹⁸0.

Mikroorganismy podle vynálezu jsou schopny produkovat 1-kamitin z krotonobetainu a/nebo ^-butyrobetainu, přičemž vzniklý 1-kamitin nekatabolizují.

Jak ukazují srovnávací pokusy na vzorcích půd ze čtyř kontinentů, jsou mikroorganismy, které katabolizují butyrobetain a krotonobetain na I-karaitin, všudypřítomné, Izolace se podařila také z aktivovaného kalu z čistíren odpadních vod. Všechny tyto kmeny přicházejí v úvahu jako producenti I-kamitinu, jestliže se podrobí mutagennímu procesu dále uvedeným způsobem podle vynálezu.

Takové mutanty se získají následující selekční metodou:

a/ mikroorganismy, které rostou na betainu, ^butyrobetainu, krotonobetainu a 1-kamitinu jako zdroji uhlíku a dusíku, se běžným způsobem podrobí mutagennímu procesu.

b/ Z kultury mikroorganismů získané kultivací se oddělí ten, který je stabilní, nekatabolizuje I-kamitin a neroste s I-kamitinem, krotonobetainem,^-butyrobetainemj ale raději s betainem.

Výhodně se volí ty mikroorganismy získané ve stupni selekce b/, které produkují

1-kamitin a nerostou s 1-kamitiněm, krotonobetainem, ^-butyrobetainem, ale raději b betainem.

Účelně se mikroorganismy podrobené mutagennímu procesu dále kultivují v betainovém mediu- a tyto dále kultivované mikroorganismy se provedením stupně selekce b/ dále kultivují, výhodně v I-karaitinovém mediu. Kultivace kmenů rostoucích s betainem, ^“«butyrobetainem, krotonobetainam a L-karnltinem jako zdroji uhlíku a dusíku sa účelně provádí tak, že se ze směsi bakterií připraví naočkováním krotonobétainového živného roztoku směsná kultura a z této se běžnou mikrobiologickou technikou získá čistá kultura mikroorganismu kultivovaného na krotonobetainu.

Mutace takové kultury, která roste na betainu, ψ -butyrobetainu, krotonobetainu a L-karnltinu jako zdrojích uhlíku a dusíku, se může provést známými postupy /J.H.Miller, Experimente in Molecular Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972/.

Účelně užívanými metodami pro přípravu stabilních mutant jsou Práme-Shift-metoda, deleční' metoda nebo transposon-inserČní metoda.

Mikroorganismy tekto podrobené mutagennímu procesu se pak po další kultivaci v betainovém médiu a převedení do L-karnitinového média podrobí selekčnímu stupni b/, kde se známými counter-salekčními činidly /P.Gerhardt a kol. /eds./, Manual of Methods for General Baoteriology, Am.Soo. for Mikrobiology, 1981/ oddělí ty mikroorganismy, které L-kamitin nekatabolizují a nerostou s L-kamitinem, krotonobetainem, ^-butyrobetainem, ale spíše s betainem.

Výhodným mikroorganismem, který roste s betainem, ^-butyrobetainem, krotonobetainem, L-kamitinem jako zdroji uhlíku a dusíku, je kmen HK 4 /DSM č. 2938/ a jeho descendenty a mutanty.

Tento kmen byl 3.3.1984 uložen v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellsohaft fur Biotechnologische Porschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Gottingen, Spolková republika Německa, pod číslem DSM 2938.

Vědecký popis kmene HK 4 /DSM č. 2938/

Buňky	tyčinka pleomorfní	kataláza růst	+
délka μιη	1 až 2	anaerobní	-
šířka (Um	0,5 až 0,8	37 °C	+
pohyblivost		41 °C	-
bičíky	peritrichní	pH 5,6	-
Gramova reakce	-	Mao-Conkejův
spory	-	agar	+
tvorba póly-/? -		SS-agar	-
hydroxybutyrátu	M	oetrimidový
oxidáza	+	agar	-
tvorba pigmentu		odbourávání
nadifundující	-	škrobu	-
difundujíoí	-	želatiny	-
fluoreskující	-	kaseinu	-
tvorba kyseliny		tyrosinu	-
/OP-test/ z		Tneenu 80	-
glukózy aerobně	ae	DNA	+
anaerobně		aesoullnu	+
fruktózy aerobně	-	využití substrátu
ASS glukóza	+	acetát	-
xylóza	+	citrát	-
trehalóza	+	malonát	-
ethanol		glyoin	-
fenylalanindeamináza	-	norleucin	-
omitindekarboxyláza	-	xylóza	+

C.S 273163 B2

H₂S

Voges-Proakauer indol dusitan z dusičnanu + denitrifikace + tvorba levanu lecithinaza ureáza + argininhydroláza lysindekarboxyláza

fruktóza	+
glukóza	+
autotrofní růst	-
s H₂
3-ketolaktoza	-
tvorba plynu z glu-
kozy	-
ONPG	+
růst
betain	+
L-karaitin	+
-butyrobetain	+·
krotonobetain	+

Přednostním mikroorganismem, který vzniká z popsaného mikroorganismu mutagenním procesem a selekcí, je stabilní, nekatabolizuje E-karnitin, avšak jej vylučuje a neroste s l-karnitinem, krotonobetainem a ýi -butyrobetainem, ale spíše s betainem, je HK 13,

Uvedený kmen byl 23.1.1984- deponován v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellschaft fur Biotechnologiaohe Porschung mbH, Griesebachstrasse 8, 43000 Gottingen, Spolková republika Německa, pod číslem 2903.

Vědecký popis kmene HK 13 /DSM 6.2903/

Buňky	tyčinky pleomorfní	tvorba poly-^-hydroxybutyrátu
délka jim	1 až 2	oxidáza	+
šířka jim	0,5 až 0,8	kataláza	+
pohyblivost	+	fenylalanindeamináza	-
bičíky	peritriohní	ornitindekarboxyláza	-
Gramova reakce	-	h₂s	-
spory	-	Voges-ProBkauer
indol	-	anaerobně	-
dusitan z dusična-		fruktózy aerobně	-
nu	+	ASS glukóza	+
denitrifikace	+	xylóza	+
tvorba levanu	-	trehalóza	+
lecithináza	-	ethanol	-
ureáza	+	tvorba plynu z glu-
růst		kózy	-
anaerobní	-	ONPG	+
37 °C	+	argininhydroláza	-
41 °C	-	lysidekarboxyláza	-
pH 5,6	-	odbourávání
Mac-Conkeyův		škrobu	-
agar	+	želatiny	OB
SS-agar	-	kaseinu	-
Cetrimidový		tyrosinu	-
agar	-	Tweenu 80	-
tvorba pigmentu		DNA	+
nedifundujíoí		aesculinu	+
difundujíoí	a·	využití substrátu
fluoreskující	-	acetát	-

tvorba kyseliny /OF-test/z glukózy aerobně norleuoin xylóza + fruktóza + . glukóza + autotrofní růst s Hg 3-ketolaktóza citrát malonát glycin růst betain +

L-karaitin ^-butyrobetain krotonobetain L-glutamát a krotonbetain L-glutamát a butyrobetain .i

L-glutamát a

L-kamitin i

Příkladem descendentu mikroorganismu HK 13, který je stabilní, nekatabolizuje L-kamitin, avšak produkuje jej, naroste na L-karnitinu, krotonbetainu a -butyrobstainu, ale spíše na betainu, L-glutamátu a krotonbetainu, L-glutamátu a butyrobe- i tainu, L-glutamátu a L-karaitinu, je kman HK 1331 b.

Tento byl izolován jako spontánně, dobře rostoucí mutantová kolonie z povrchu agarem ztuženého živného media, které obsahuje L-glutamát a ý^-butyrobetain.

Tento kmen byl 8.2,1985 deponován v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellsehaft fur Biotechnologisohe Forsohung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Gottingen/ Spolková republika Německa, pod číslem DSM 3225.

Vědecký popis kmene HK 1331 b /DSM č. 3225/s

buňky	tyčinky pleomorfní	délka ^im 1 a: šířka pum 0,5
pohyblivost	+	anaerobně
bičíky	peritriehní	fruktóza aerobně
Gramova reakce	-	ASS glukózy
spory	-	xylózy
tvorba póly--		trehalózy
hydroxybutyrátu	-	ethanolu
oxidáza	+	tvorba plynu z glukózy
kataláza	+	ONPG
růst		arginindihydroláza
anaerobní	-	lysind ekarboxyláza
37 °C	+	fenylalanindeamináza
41 °C	-	omitlndekarboxyláza
pH 5,6	-	H₂S
Mae-Conkeyův		Voges-Proskauer
agar	+	indol
SS-agar	-	dusitan z dusičnanu ,
oetrimidový		denitrifikace
agar	-	tvorba levanu
tvorba pigmentu		lecithináza
nedifundující	-	ureáza
difundujíoí	-	odbourávání
fluoreskující	-	škrobu

C.S 273 163 B2 tvorba kyseliny /OF-test/z glukóza aerobně Tweenu 80 DNA aesculinu využiti substrátu aoetát citrát malonát glycin norleucin xylóza fruktóza glukóza želatiny kaseinu tyroeinu autotrofní růst s H₂

3-ketolaktóza růst betain 1-karaitin Λ-butyrobetain krotonobetain L-glutamát a krotonobetain

L-glutamát a butyrobetain

L-glutamát a L-karnitin

Způsob výroby L-kamitinu ss výhodně provádí tak, že se kultivuje předkultura mikroorganismu, přednostně mikroorganismu označeného HK 13_zve sterilním, výhodně vitaminy obsahujícím minerálním médiu /Kulla a kol., Aroh.líicrobiol, 135, 1 /1983//, při 20 až 40 °0, výhodně při 30 °C, při hodnotě pH 6 až 8, výhodně 7, po dobu 20 až 50 hodin, výhodně 30 až 40 hodin. Tato předkultura obsahuje účelně 0,1 až 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmotu, oholinu, glutamátu, acetátu, dimethylglycinu nebo betainu jako růstového substrátu. Zvláště je výhodný betain v množství od 0,5 do 5 % hmot.

Dále se pracuje běžnou mikrobiologickou technikou, k předkultuře se přidají také výchozí sloučeniny, -butyrobetain, krotonobetain, nebo jejich směs v množství 0,1 až 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmot., vztaženo na reakční médium.

-butyrobetain, popřípadě krotonobetain, může být použit jako hydrochlorid, jako volná vnitřní sůl, jakož i ve formě svého derivátu.

S předkulturou vyrobenou uvedeným postupem mohou být očkovány další kultury.

Tyto další kultury mají účelně stejné složení jako předkultury.

Koncentrace přidávaného krotonobetainu, ^-butyrobetainu něho jejich směsi se pohybují od 0,1 do 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmot.

Také růstové substráty - cholin, glutamát, acetát, dimethylglycin a betain- se výhodně používají v koncentracích používaných pro předkulturu.

Výhodně se při další kultivaci používají stejné podmínky kultivace jako pro předkulturu.

Teploty se také výhodně pohybují mezi 20 až 40 °C, výhodně 30 °C a hodnota pH pravidelně mezi 6 a 8, výhodně 7.

Tímto způsobem provedená výroba L-kamitinu se po 20 až 30· hodinách zastaví.

Koncentrace L-kamitinu pak zpravidla odpovídá ekvivalentnímu množství ^-butyrobetainu nebo krotonobetainu použitého jako výchozí látka.

Buňky mohou být odstředěny nebo odfiltrovány a použity jako očkovací materiál pro novou kulturu.

sobě známým způsobem /J.P.Vandecasteele, Appl.Environ. Microbiol. 39. 327 /1980// lze L-karaitin pomocí kationtovýměnné chromatografie izolovat ze zbytku a přečistit krystalizací.

Způsob výroby L-kamitinu je možno provádět také kontinuálním způsobem, při kterém

C.S 273163 B2 se buňky kultivují v chemostatu při přibližném zřeáovacím poměru 0,04 až 0,2 b“\ výhodně při 0,06 až 0,08 h“\ za podobných podmínek jako v batoh-kultuře.

Příklad 1

Izolace mikroorganismu odbourávájícího krotonobetain:

Mikroorganismy se extrahují z půdy neutrálním fosfátovým pufrem za míchání, nakonec se větší částice oddělí filtrací papírem a krotonobetainové živné médium se očkuje takto získanými bakteriemi až do slabého zákalu. Po 9 dnech vzrostl zákal jako míra koncentrace buněk devadesátkrát. Krotonobetain z roztoku zcela zmizel a amoniak jako produkt odbourávání byl prokazatelný.

Ze směsné kultury se pomocí běžných mikrobiologických technik /zpevněná agarová živná půda/ získají;.': čisté kultury mikroorganismů odbourávájících krotonobetain. Jedna kultura byla zvolena pro další práci a označena jako HK 4.

Tento kmen také roste s ý⁷-butyrobetainem, L-kamitinem a betainem.

Příklad 2

Izolace stabilní karaitin-dehydrogenázové negativní mutanty:

Takový mutant by neměl dále katabolizovat L-kamitin vzniklý z ^-butyrobetainu nebo krotonobetainu a v ideálním případě tento také produkovat.

Kultura HK 4 se stabilně podrobí, mutagennímu procesu za přítomnosti Acridin Mutagen ICR 191 5 mikrogramů na ml, v sukcinátovém mediu /J.H.Miller, Experiment in Molecular Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972/, pak se buňky nechají standardním způsobem růst v Nutrient Broth pro zvýraznění mutace, pak se převedou do betainového me^?dla. Vyprodukovanou kulturou bylo naočkováno L-karnitinové medium.

Po málo hodinách dosáhla kultura logaritmického růstu. V této době se přidá penicilín G /15 mg/ml/ a D-cykloserin /0,5 mg/ml/ /Ornston a kol., Biochim. Biophys.Res. Commun. £6, 179 /1969//. Tato counter-selekční činidla ničí pouze rostoucí bakterie. Mutanty, které již nemohou růst s L-karaitinem, a které jsou středem našeho zájmu, přežívají a tímto způsobem se relativně obohacuji. Po 30 hodinách počet živých buněk klesl na setinu, antibiotika byla vymyta a kultura byla převedena do betainového média. Po kultivaci byla kultura zředěna a převedena na zpevněný živný agar. Takto rozdělené buňky vytvořily kolonie a byly jednotlivě zkoušeny.

Byla zvolena mutanta HK 13. Nemá již stabilní karnitindehydrogenázu a podle toho již neroste s L-karnitinem. -butyrobetainem nebo krotonobetainem, ale spíše s betainem. Při růstu na betainu, dimethylglycinu, oholinu, glutamátu nebo acetátu přeměňuje tento kmen krotonobetain nebo -butyrobetain na L-karnitln a produkuje jej.

Příklad 3

1 předkultury HK 13 se kultivuje v minerálním médiu obsahujícím vitamíny /Kulla a kol., Arch. Mlcrobiol. 135, 1 /1983//, které obsahuje 1 % hmot. betainu a 0,5 % hmot. chloridu krotonobetainu při 30 °C a pH 7,0 32 hodin. Tímto médiem se naočkuje kultura stejného složení o objemu 15 1 a kultivuje se 24 hodin za stejných podmínek jako předkultura /30 °C, pH 7,0, pOg * 3 ppm/. Po ukončení produkce se buňky odstředí a mohou být použity jako očkovací materiál pro další vsázku. Koncentrace L-karaitinu ve zbytku /19,8 1/ byla stanovena enzymatickou analýzou.

Zbytek obsahoval 4,26 mg L-kamitinu na ml. To odpovídá výtěžku 95,0 % vztaženo na výchozí množství chloridu krotonobetainu.

Edukty a jiné nečistoty nebyly v NMR spektru prokázány.

Jak bylo popsáno /J.P.Vandecasteele, Appl.Environ.Microbiol. 39, 327 /1930//, může být L-kamitin izolován ze zbylého média.kationtovýměnnou chromatografií a přečištěn překrystalováním.

Příklad 4 litrů předkultury HK 13 se kultivuje 32 hodin v minerálním médiu obsahujícím vitamíny /podle příkladu 1/, které obsahuje 1 % oholinu a 0,6 % ^-butyroberain-chloridu, při pH 7,0 a 30 °C. Touto předkulturou se naočkuje 15 1 média stejného složení a kultivace se provádí za stejných podmínek jako v příkladu 1.

Když je produkce asi po 30 hodinách ukončena, oddělí se buňky mikrofiltrací /Amioon Hollow-fiber cartridge/. Tato hmota buněk může být použita pro další produkci L-karnitinu. Koncentrace L-karnitinu se ve filtrátu /19,6 1/ stanoví enzymaticky. Filtrát- obsahuje 5,3 ng L-karnitinu na ml. Tato hodnota odpovídá analytickému výtěžku 97,6 %, vztaženo na výchozí množství chloridu^¹-butyrobetainu.

HMR-analýzou nebyly ve filtrátu prokázány žádné edukty ani jiné cizí organické produkty. Proto je možno izolovat z roztoku L-karaitin známým způsobem, např. azeotropní destilací /DE-IS 2300492/.

Příklad 5

Fermentor pro kontinuální fermentaci, který obsahuje 1,5 1 minerálního média obsahujícího vitamíny /podle příkladu 1/, ve kterém je obsaženo 1,5 % betainu a 1,0 % chloridu ý^-butyrobetainu, se naočkuje 150 ml předkultury HK 13 ve stejném médiu. Po 20 hodinách aerobní kultivace při 30 °0 a pH 7,0 kultura-vyrostla a mohla začít kontinuální výroba s průtokovou rychlostí 0,1 1/h. Roztok kultury odebíraný z fermentoru byl umístěn do nádoby chlazené na 4 °C. Buňky byly odděleny odstředěním. Filtrát obsahuje 8,8 g L-kamitinu, což bylo stanoveno enzymatickou analýzou.

Tato hodnota odpovídá výtěžku 99,2 %, vztaženo na výchozí koncentraci chloridu ý^-butyrobetainu.

Pevný chlorid í-karnitinu může být z roztoku izolován iontovýmšnnou chromatografií a oddělením vody.

Příklad	Mikroorga- nismus	Edukt množství	Růstový substrát		Podmínky	Výtěžek L-karnitinu
6	HK 1331b	0,1 % Bubet	Dimethylglycin 1 %	25 47	°C h	pH 6,5	94,1 %
7	HK 13	10 % Bubet	Acetat	2 %	35 25	°C h	PH 7,5	96,3 %
8	HK 13	0,1 % Crotbet	Glutamat	0,7 %	20 33	°C h	pH 7	92,5 %
9	HK 13	1 % Bubet	Betain	10 %	30 30	°C h	pH 8	97,1 %
10	HK 1331b	1 % Bubet	Betain	0,1 %	30 24	°C h	pH 6	97,9 %
11	HK 13	1 % Crotbet	Betain	1,6 %	50 22	°C h	pH 7	98,8 %
12	HK 1331b	0,5 % Bubet 0,5 %Crot-	Betain	1,5 %	30 24	°C h	pH 7	98,9 %

bet

Bubet =y-butyrobetainhydrochlorid

Crotbet Crotonobetainhydrochlorid

Claims

Způsob výroby L-karnitinu kultivací bakteriálního produkčního kmene v živné půdě, která obsahuje ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain jako zdroj uhlíku a dusíku, růstové faktory při podmínkách čeření do maximálního nahromadění konečného produktu a jeho následnou izolací, vyznačující se tím, že se jako bakteriálního produkčního kmene použije Agrobaoterium HK 4 DSM 2938, nebo Agrobacterium HK 13 ĎSM 2903, nebo Agrobacterium HK 1331 b DSM 3225, přitom se ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain použije v množství od 0,1 až 10,0 % hmotnostních, vztaženo na kultivační médium.