DE69532914T2

DE69532914T2 - Glucagonähnliche, insulinotrope Komplexe, ihre Zusammensetzungen und ihr Herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69532914T2
Application number: DE69532914T
Authority: DE
Inventors: John Allison Indianapolis Galloway; James Arthur Greenwood Hoffmann
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-03-21
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2015-05-24
Also published as: ZA954141B; AU708159B2; CA2150080A1; EP0733644A1; US5977071A; PL308783A1; KR960034219A; NZ272186A; US6410513B1; HUT74729A; NO952034D0; DK1364967T3; FI952536A0; PT733644E; DE69534678D1; PE23296A1; US5705483A; EP1364967A3; ES2250789T3; ES2218536T3

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der pharmazeutischen und organischen Chemie und liefert neue Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon, die zur Erhöhung der Expression von Insulin aus Säugerpankreasinselzellen vom B-Typ und zur Behandlung des altersbedingten Diabetes mellitus bei einem Säuger brauchbar sind.
Die endokrinen Sekretionen von Pankreasinselzellen werden durch komplexe Kontrollmechanis men reguliert, die nicht nur durch aus dem Blut stammende Metaboliten (Glucose, Aminosäuren und Catecholamine usw.) gesteuert werden, sondern auch durch lokale parakrine Einflüsse. Die hauptsächlichen Pankreasinselzellenhormone (Glucagon, Insulin und Somatostatin) wechselwirken mit spezifischen Pankreaszelltypen (jeweils A, B und D Zellen), um die Sekretionsreaktionen, die durch die vorher erwähnten Metaboliten vermittelt werden, zu modulieren. Obwohl die Insulinsekretion vorwiegend durch die Blutglucosespiegel kontrolliert wird, hemmt Somatostatin die durch Glucose vermittelte Insulinsekretion. Zusätzlich zur vorgeschlagenen parakrinen Regulation der Insulinsekretion zwischen den Inselzellen besteht ein Anhaltspunkt, die Existenz von insulinotropen Faktoren im Dünndarm zu unterstützen. Dieses Konzept stammt von den Beobachtungen, dass oral eingenommene Glucose ein viel stärkerer Stimulus für die Insulinsekretion ist, als die vergleichbare Menge an Glucose, die intravenös verabreicht wird.
Das humane Hormon Glucagon ist ein 29 Aminosäuren langes Peptidhormon, das in Pankreas-A-Zellen gebildet wird. Das Hormon gehört zu einer Multigenfamilie an strukturell verwandten Peptiden, die Sekretin, Enterogastron, vasoaktives-intestinales Peptid und Glicentin umfassen. Diese Peptide regulieren den Kohlenhydratmetabolismus, die gastrointestinale Motilität und die sekretorische Prozessierung auf verschiedene Weise. Jedoch sind die vorwiegend wahrgenommenen Wirkungen des Pankreasglucagons die Förderung der hepatischen Glycogenolyse und Glyconeogenese, was zu einer Erhöhung der Blutzuckerspiegel führt. Diesbezüglich wirken die Aktivitäten von Glucagon denen von Insulin entgegen und können zur Hyperglykämie beitragen, die Diabetes mellitus begleitet (P. K. Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 345–349 (1982)).
Von Glucagon wurde festgestellt, dass es zur Bindung an spezifische Rezeptoren fähig ist, die unter der Oberfläche der Insulin-bildenden Zellen liegen. Wenn Glucagon an diese Rezeptoren bindet, stimuliert es eine schnelle Synthese von cAMP durch diese Zellen. Von cAMP wurde wiederum festgestellt, dass es die Insulinexpression stimuliert (L. Y. Korman et al., Diabetes 34: 717–722 (1985)). Insulin hemmt die Glucagonsynthese (W. F. Ganong, Review of Medical Physiology, Lange Publications, Los Altos, California, Seite 273 (1979)). Daher wird die Expression von Glucagon sorgfältig von Insulin und letztlich durch die Serumglucosespiegel reguliert.
Das Glucagongen wird anfänglich von einem 360 Basenpaaren langen Vorläufer unter Bildung des Polypeptids Präproglucagon translatiert (Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 345–349 (1982)). Dieses Polypeptid wird anschließend unter Bildung von Proglucagon prozessiert. Patzelt et al., Nature, 282: 260–266 (1979) zeigen, dass Proglucagon weiter zu Glucagon und einem zweiten Polypeptid prozessiert wird. Spätere Arbeiten von P. K. Lund et al., L. C. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 5485–5489 (1983) und G. I. Bell et al., Nature 302: 716–718 (1983) haben gezeigt, dass das Proglucagonmolekül unmittelbar nach den Lysin-Arginindipeptidresten gespalten wird. Untersuchungen am Proglucagon, das vom Amerikanischen Wels (Ictalurus punctata) gebildet wird, zeigen dass das Glucagon von diesem Tier auch proteolytisch nach den benachbarten Lysin-Arginindipeptidresten gespalten wird [P. C. Andrews et al., J. Biol. Chem., 260: 3910–3914 (1985), L. C. Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80: 5485–5489 (1983)]. G. I. Bell et al., siehe obige Literaturstelle haben festgestellt, dass Säugerproglucagon an Lysin-Arginin- oder Arginin-Arginin-Dipeptiden gespalten wird und haben gezeigt, dass das Proglucagonmolekül 3 diskrete und hoch homologe Peptidmoleküle enthält, die als Glucagon, Glucagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1) und Glucagon-ähnliches Peptid 2 (GLP-2) bezeichnet werden. Lopez et al. haben die Schlussfolgerung gezogen, dass Glucagon-ähnliches-Peptid-1 37 Aminosäuren lang ist und dass Glucagon-ähnliches-Peptid-2 34 Aminosäuren lang ist. Analoge Untersuchungen bezüglich der Struktur von Rattenpräproglucagon haben ein ähnliches Muster an proteolytischer Spaltung an Lysin-Arginin oder Arginin-Arginin Dipeptidresten gezeigt, was zur Bildung von Glucagon, GLP-1 und GLP-2 führt (G. Heinrich et al. Endocrinol., 115: 2176–2181 (1984)). Es wurde festgestellt, dass GLP-1-Sequenzen aus dem Menschen, der Ratte, dem Rind und dem Hamster identisch sind (M. Ghiglione et al., Diabetologia, 27: 599–600 (1984)).
Die von Lopez et al. gezogene Schlussfolgerung bezüglich der Größe von GLP-1 wird durch die Arbeit von L. O. Uttenthal et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol., 61: 472–479 (1985)) bestätigt. Uttenthal et al., untersuchten die molekularen Formen von GLP-1, die im humanen Pankreas vorkommen. Ihre Forschung zeigt, dass GLP-1 und GLP-2 im Pankreas als Peptide mit jeweils 37 und 34 Aminosäuren vorkommen.
Die Ähnlichkeit zwischen GLP-1 und Glucagon hat die ersten Forscher vermuten lassen, dass GLP-1 eine biologische Aktivität haben könnte. Obwohl einige Forscher festgestellt haben, dass GLP-1 Rattenhirnzellen zur Synthese von cAMP veranlassen kann (N. M. Hoosein et al., Febs. Lett 178: 83–86 (1984)) ist es anderen Forschern nicht gelungen, eine physiologische Rolle für GLP-1 zu finden (L. C. Lopez et al., siehe obige Literaturstelle). Die Misserfolge eine physiologische Rolle für GLP-1 zu identifizieren, veranlassten einige Forscher dazu, in Frage zu stellen, ob GLP-1 tatsächlich ein Hormon ist und ob die Verwandtschaft von GLP-1 nicht ein Artefakt ist.
Diese Varianten von GLP-1 (7-37) und Analoga hiervon wurden ebenfalls beschrieben. Diese Varianten und Analoga umfassen beispielsweise Gln⁹-GLP-1(7-37), D-Gln⁹-GLP-1(7-37), Acetyl-Lys⁹-GLP-1(7-37), Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1(7-37), Lys¹⁸-GLP-1(7-37) und dergleichen und die Derivate hiervon umfassen beispielsweise Säureadditionssalze, Carboxylatsalze, Niederalkylester und Amide (siehe beispielsweise WO91/11457 A). Im allgemeinen stimulieren die verschiedenen beschriebenen Formen von GLP-1 die Insulinsekretion (insulinotrope Wirkung) und cAMP Bildung [siehe beispielsweise S. Mojsov, Int. J. Peptide Protein Research, 40: 333–343 (1992)].
Wichtiger ist, dass mehrere Autoren die Verbindung zwischen den Laborexperimenten und den insulinotropen Reaktionen beim Säuger, insbesondere dem Menschen, auf die exogene Verabreichung von GLP-1, insbesondere GLP-1 (7-36)NH₂ und GLP-1 (7-37) gezeigt haben [siehe beispielsweise M. A. Nauck et al., Diabetologia, 36: 741–744 (1993), M. Gutniak et al., New England J. of Medicine, 326(20): 1316–1322 (1992), M. A. Nauck et al., J. Clin. Invest., 91: 301–307 (1993) und B. Thorens et al., Diabetes, 42: 1219–1225 (1993)].
Genauer gesagt sind die fundamentalen Defekte, die die Hyperglykämie beim altersbedingten Diabetes verursachen, eine gestörte Sekretion des endogenen Insulins und eine Resistenz gegenüber den Wirkungen von Insulin durch Muskel und Leber [J. S. Galloway, Diabetes Care, 13: 1209–1239 (1990)]. Der letztere Defekt führt zu einer exzessiven Produktion der Glucose durch die Leber. Während ein normales Individuum Glucose mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 mg/kg/Minute freisetzt, übersteigt diese Menge bei Patienten mit altersbedingtem Diabetes gewöhnlich 2,5 mg/kg/Minute, was zu einem Nettoüberschuss von zumindest 70 Gramm Glucose pro 24 Stunden führt. Aufgrund der Tatsache, dass überaus hohe Korrelationen zwischen der Glucosebildung der Leber, dem Glucosespiegel im nüchternen Zustand und der insgesamten metabolischen Kontrolle bestehen, wie sie durch die Glycohämoglobinmessungen anzeigt werden [J. A. Galloway, siehe obige Literaturstelle und J. A. Galloway et al., Clin. Therap. 12: 460–472 (1990)] ist es naheliegend, dass die Kontrolle der Blutglucose im nüchternen Zustand ein sine quo non zur Erreichung der gesamten Normalisierung des Metabolismus ist, die ausreicht, um die Komplikation der Hyperglykämie zu verhindern. In Anbetracht der Tatsache, dass die vorliegenden Formen von Insulin selten die Glucoseproduktion der Leber normalisieren ohne eine signifikante Hyperinsulinämie und Hypoglykämie zu verursachen (J. A. Galloway und J. A. Galloway et al., siehe obige Literaturstellen), sind alternative Ansätze erforderlich.
Intravenöse Infusionen von GLP-1 (7-36)NH₂ bis zum Doppelten der normalen Serumkonzentrationen rufen die in der folgenden Tabelle gezeigten Wirkungen hervor:
Jedoch ist die Langzeitstabilität von GLP-1, insbesondere GLP-1 als Komponente einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Verabreichung an Säuger fraglich. Tatsächlich werden bei einer Lagerung bei niedriger Temperatur von 4°C Nebenprodukte von GLP-1 (7-37) schon nach 11 Monaten nach der Probenherstellung gefunden (S. Mojsov, siehe obige Literaturstelle). Daher existiert ein Bedarf für eine stabilere GLP-1 Verbindung, die sicher Säugern verabreicht werden kann, die einer solchen Behandlung bedürfen.
Darüberhinaus ist die biologische Halbwertszeit von GLP-1 Molekülen, insbesondere den Molekülen, die durch die Aktivität der Dipeptidyl-peptidase IV (DPP IV) beeinflusst wird, ziemlich kurz. Beispielsweise beträgt die biologische Halbwertszeit von GLP-1 (7-37) nur 3 bis 5 Minuten und wird weiter durch die schnelle Absorption nach einer parenteralen Verabreichung an einen Säuger beeinflusst. Daher besteht auch ein Bedarf für eine GLP-1 Verbindung, die die Absorption nach einer solchen Verabreichung verzögert.
Demnach löst die vorliegende Erfindung das Problem der Seruminstabilität und der kurzen Halbwertszeit, das mit nativen GLP-1 Molekülen assoziiert ist. Zusätzlich liefern die erfindungsgemäßen Verbindungen auch eine verzögerte Absorption nach einer parenteralen Verabreichung und daher sollten sie verlängerte biologische Halbwertszeiten aufweisen. Ebenfalls werden pharmazeutische Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Verbindungen bereitgestellt, wie auch Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung liefert einen Komplex, der besteht aus einem divalenten Metallkation, das mit der folgenden Verbindung assoziiert ist und zur Ausfällung mit dieser fähig ist:
R₁-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂
worin
R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus L-Histidin, D-Histidin, Desaminohistidin, 2-Aminohistidin, β-Hydroxyhistidin, Homohistidin, α-Fluormethylhistidin und α-Methylhistidin,
X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ala, Gly, Val, Thr Ile und α-Methyl-Ala,
Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly,
Z aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly,
R₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus NH₂ und Gly-OH,
mit der Maßgabe, dass die Verbindung einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 aufweist und ferner mit der Maßgabe, dass wenn R₁ für His steht, X für Ala steht, Y für Glu steht und Z für Glu steht, R₂ dann für NH₂ stehen muss.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Steigerung der Expression von Insulin, das die Bereitstellung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an eine Säugerpankreasinselzelle vom B-Typ umfasst wie auch ein Verfahren zur Behandlung des altersbedingten Diabetes mellitus, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen Säuger umfasst, der einer solchen Behandlung bedarf.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert einen Komplex, der aus einem GLP-1 Molekül mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 im Komplex mit einem divalenten Metallkation besteht.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "GLP-1 Molekül" auf ein natürlich vorkommendes GLP-1 (7-36)NH₂, GLP-1 (7-37) natürliche und unnatürliche funktionelle Analoga und Derivate hiervon und Salze hiervon. Die Aminosäuresequenz von GLP-1 (7-36)NH₂ ist in der Technik gut bekannt wird aber hier der Einfachheit halber für den Leser aufgeführt:
His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp¹⁵-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-NH₂
Für GLP-1 (7-37) wird die carboxyterminale Amidfunktionalität von Arg³⁶ durch Gly and der Position 37 des GLP-1 (7-36)NH₂ Moleküls ersetzt.
Zusätzlich wurde die Existenz und die Herstellung einer Vielzahl an geschützten, ungeschützten und teilweise geschützten natürlichen und unnatürlichen funktionellen Analoga und Derivaten an GLP-1 (7-36)NH₂ und GLP-1 (7-37) Molekülen in der Technik beschrieben [siehe beispielsweise US 5 120 712 A und US 5 118 666 A , die hiermit eingeführt sind und C. Orskov et al., J. Biol. Chem. 264(22): 12826–12829 (1989) und WO 91/11457 A (D. I. Buckley et al., vom 8. August 1991)].
Wie es in der Technik bekannt ist, können Aminosäurereste in ihrer geschützten Form vorkommen, worin sowohl Amino- als auch Carboxygruppen ihre geeigneten Schutzgruppen aufweisen, in ihrer teilweise geschützten Form vorkommen, worin entweder die Amino- oder die Carboxygruppen geeignete Schutzgruppen aufweisen oder in der ungeschützten Form vorkommen, worin weder Amino- noch Carboxygruppen eine geeignete Schutzgruppe aufweisen. Es sind mehrere Reaktionen zur Bildung und Entfernung solcher Schutzgruppen in mehreren Standardwerken beschrieben, beispielsweise in "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press (London und New York, 1973), T. H. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley (New York, 1981) und "The Peptides", Band I, Schröder und Lübke, Academic Press (London und New York, 1965).
Repräsentative Aminoschutzgruppen umfassen beispielsweise Formyl, Acetyl, Isopropyl, Butoxycarbonyl, Fluorenylmethoxycarbonyl, Carbobenzyloxy und dergleichen.
Repräsentative Carboxyschutzgruppen umfassen beispielsweise Benzylester, Methylester, Ethylester, t-Butylester, p-Nitrophenylester und dergleichen.
Zusätzlich zu geschützten Formen, worin beide Amino- und Carboxygruppen geeignete Schutzgruppen aufweisen, bezieht sich der Ausdruck geschützt auch auf die GLP-1 Moleküle, die der Aktivität der Dipeptidyl-Peptidase IV widerstehen oder diese hemmen [siehe beispielsweise R. Mentlein et al., Eur. J. Biochem., 214: 829–835 (1993)]. Zusätzlich zu GLP-1 (7-36)NH₂ sind Moleküle bevorzugt, die vor der Aktivität der DPP IV geschützt sind, und Gly⁸-GLP-1 (7-36)NH₂, Val⁸-GLP-1 (7-37)OH, α-Methyl-Ala⁸-GLP-1 (7-36)NH₂ und Gly⁸-GIn²¹-GLP-1 (7-37)OH sind bevorzugter.
Derivate von natürlich vorkommenden GLP-1 Molekülen sind die Peptide, die durch die Fragmentierung einer natürlich vorkommenden Sequenz erhalten werden oder auf der Grundlage der Kenntnis der Sequenz des genetischen Materials (DNA oder RNA), das für die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz kodiert, synthetisiert werden. Der Ausdruck "Derivate" umfasst auch eine chemische Modifikation der natürlichen oder unnatürlichen GLP-1 Moleküle. Verfahren zur Herstellung dieser Derivate sind den normalen organischen Chemikern oder Peptidchemikern bekannt (siehe beispielsweise WO 91/11457 A).
Die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung umfassen auch Analoga von GLP-1 (7-36)NH₂ und GLP-1 (7-37), worin eine oder mehrere Aminosäuren, die nicht in der ursprünglichen Sequenz vorkommen, hinzugefügt oder deletiert wurden, und Derivate hiervon. Genauer gesagt sind His und Desamino-Histidin für R₁ bevorzugt, solange der isoelektrische Punkt des Moleküls im Bereich von etwa 6 bis 9 liegt. Ala, Gly und Val sind an der Position "X" bevorzugt, solange der gesamte isoelektische Punkt des Moleküls im Bereich von etwa 6 bis 9 liegt. Ähnlich sind Glu und Gln an der Position "Y" bevorzugt, solange der gesamte isoelektrische Punkt des Moleküls im Bereich von 6 bis 9 liegt. Ebenfalls sind Glu und Gln an der Position "Z" bevorzugt, solange der gesamte isoelektrische Punkt des Moleküls im Bereich von etwa 6 bis 9 liegt. Schließlich ist Gly-OH für R₂ bevorzugt, solange der gesamte isoelektrische Punkt des Moleküls im Bereich von etwa 6 bis 9 liegt.
Darüberhinaus umfasst die vorliegende Erfindung eine Salzform eines GLP-1 Moleküls. Ein GLP-1 der Erfindung kann eine ausreichend saure, eine ausreichend basische oder beide funktionelle Gruppen enthalten und daher mit einer Vielzahl an anorganischen Basen und anorganischen und organischen Säuren unter Bildung eines Salzes reagieren. Säuren, die herkömmlich zur Bildung von Säureadditionssalzen verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen und organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche Salze umfassen Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte Säureadditionssalze sind die, die mit Mineralsäuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure, und speziell Chlorwasserstoffsäure.
Basenadditionssalze umfassen die, welche von anorganischen Basen stammen, wie Ammonium- oder Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, -carbonate, -bicarbonate und dergleichen. Solche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Salze brauchbaren Basen sind unter anderem Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat und dergleichen. Die Salzformen sind besonders bevorzugt.
Wenn natürlich die erfindungsgemäßen Verbindungen für therapeutische Zwecke verwendet werden, können diese Verbindungen auch in Form eines Salzes vorliegen, aber das Salz muss pharmazeutisch annehmbar sein.
Daher umfassen die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung unter anderem die GLP-1 Moleküle, deren Funktionalität eine insulinotrope Aktivität zeigt. Der Ausdruck "insulinotrope Aktivität" betrifft die Fähigkeit einer Substanz, die Synthese oder Expression des Hormons Insulin zu stimulieren oder die Stimulierung zu veranlassen.
Die insulinotrope Eigenschaft einer Verbindung kann durch die Bereitstellung der Verbindung an tierische Zellen oder die Injektion dieser Verbindung in Tieren und die jeweilige Verfolgung der Freisetzung des immunreaktiven Insulins (IRI) in das Medium oder den Kreislauf des Tieres bestimmt werden. Das Vorkommen von IRI wird durch die Verwendung eines Radioimmuntests verwendet, der spezifisch Insulin detektieren kann.
Obwohl jeder Radioimmuntest, der zur Detektion des Vorkommens von IRI fähig ist, verwendet werden kann, ist es bevorzugt, eine Modifikation der Testmethode des von J. D. M. Albano et al., Acta Endocrinol., 70: 487–509 (1972) beschriebenen Verfahrens zu verwenden. In dieser Modifikation wird ein Phosphat/Albuminpuffer mit einem pH von 7,4 verwendet. Die Inkubation wird mit der anschließenden Zugabe von 500 μl Phosphatpuffer, 50 μl Perfusatprobe oder Ratteninsulinstandard im Perfusat, 100 μl Antiinsulinantiserum (Wellcome Laboratories, 1 : 40 000 Verdünnung) und 100 μl [¹²⁵I] Insulin ausgeführt, was ein Gesamtvolumen von 750 μl in einem 10 × 75 mm Einwegglasröhrchen ergibt. Nach der Inkubation für 2–3 Tage bei 4°C wird das freie Insulin vom Antikörper-gebundenen Insulin durch Aktivkohleabtrennung getrennt. Die Testempfindlichkeit beträgt 1–2 μE/ml. Um die Freisetzung von IRI an das Zellkulturmedium von Zellen zu messen, die in Gewebekultur angezogen wurden, wird vorzugsweise eine radioaktive Markierung in das Proinsulin eingearbeitet. Obwohl jede radioaktive Markierung verwendet werden kann, die zur Markierung eines Polypeptids fähig ist, ist die Verwendung von ³H Leucin bevorzugt, um markiertes Proinsulin zu erhalten. Die Markierung kann für jede Zeitspanne ausgeführt werden, die eine Bildung eines detektierbaren, markierten Pools an Proinsulinmolekülen ausreicht, wobei es bevorzugt ist, die Zellen in Anwesenheit der radioaktiven Markierung für einen Zeitraum von 60 Minuten zu inkubieren.
Obwohl viele Zelllinien, die zur Expression von Insulin fähig sind, zur Bestimmung verwendet werden, ob eine Verbindung einen insulinotropen Effekt hat, ist es bevorzugt Ratteninsulinomzellen zu verwenden und speziell RIN-38 Ratteninsulinomzellen. Solche Zellen können in jedem geeigneten Medium angezogen werden, wobei es bevorzugt ist, DME Medium zu verwenden, das 0,1% BSA und 25 mM Glucose enthält.
Die insulinotrope Eigenschaft einer Verbindung kann auch durch Pankreasinfusion bestimmt werden. Die in situ isolierte perfundierte Rattenpankreaspräparation ist eine Modifikation des Verfahrens von J. C. Penhos et al., Diabetes, 18: 733–738 (1969). Gefastete männliche Albinoratten vom Charles River Stamm, die 350–600 g wiegen, werden mit einer intraperitonealen Injektion mit Amytal-Natrium (Eli Lilly und Co. 160 ng/kg) betäubt. Die Blutgefäße der Niere, der Nebenniere, des Magens und des unteren Colons werden ligiert. Der gesamte Dünndarm wird bis auf wenige cm des Duodenums und des absteigenden Colons und des Rektums entfernt. Daher ist nur ein kleiner Teil des Dünndarms perfundiert, was die mögliche Wechselwirkung durch enterische Substanzen mit Glucagon-ähnlicher Immunreaktivität minimiert. Das Perfusat ist ein modifizierter Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer mit 4% Dextran T70 und 0,2% Rinderserumalbumin (Fraktion V) und wird mit 95% O₂ und 5% CO₂ begast. Eine 4-Kanalrollenpumpe mit einem nicht pulsierenden Fluss (Buchler polystatisch, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.) wird verwendet und eine Umschaltung von einer Perfusatquelle zur anderen wird durch die Umschaltung eines Dreiwegehahns erreicht. Die Art, auf der die Perfusion ausgeführt, verfolgt und analysiert wird, folgt der Methode von G. C. Weir et al., J. Clin. Investigat. 54: 1403–1412 (1974), die hiermit eingeführt ist.
Die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung müssen eine Histidinfunktionalität am Aminoterminus aufweisen. Die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung können auch eine modifizierte Histidinfunktionalität anstelle der erforderlichen Histidinfunktionalität aufweisen.
Der Ausdruck "modifiziertes Histidin" bezieht sich auf eine Histidinfunktionalität, die chemisch oder biologisch verändert wurde oder auf eine veränderte Histidinfunktionalität, die de novo synthetisiert wurde, die aber die Metallbindungseigenschaften behält.
Es sind mehrere solche modifizierten Histidinfunktionalitäten und ihre Herstellung in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise D-Histidin (WO 91/11457 A), Desaminohistidin (WO 92/18531 A), 2-Aminohistidin (H. Levine-Pinto et al., Biochem. Biophys. res. Commun., 103(4): 1121–1130(1981)], β-Hydroxy-L-histidin [T. Owa et al., Chemistry Letters, Seiten 1873–1874 (1988)], L-Homohistidin [J. Altman et al., Synthetic Commun., 19(11&12): 2069–2076 (1989)], α-Fluormethylhistidin ( US 4 347 374 A ) und α-Methylhistidin [M. J. O'Donnell, Synthetic Commun., 19(7&8): 1157–1165 (1989)].
Die GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung müssen ferner einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 aufweisen. Es wurden mehrere GLP-1 Moleküle mit einem isolektrischen Punkt in diesem Bereich beschrieben und umfassen beispielsweise:
GLP-1 (7-36)NH₂
Gly⁸-GLP-1 (7-36)NH₂
Gln⁹-GLP-1 (7-37)
D-Gln⁹-GLP-1 (7-37)
Acetyl-Lys⁹-GLP-1 (7-37)
Thr⁹-GLP-1 (7-37)
D-Thr⁹-GLP-1 (7-37)
Asn⁹-GLP-1 (7-37)
D-Asn⁹-GLP-1 (7-37)
Ser²²-Arg²³-Arg²⁴-Gln²⁶-GLP-1 (7-37)
Thr¹⁶-Lys¹⁸-GLP-1 (7-37)
Lys¹⁸-GLP-1 (7-37)
Arg²³-GLP-1 (7-37)
Arg²⁴-GLP-1 (7-37) und dergleichen (siehe beispielsweise WO 91/11457 A, siehe obige Literaturstelle). Zusätzlich haben GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung, wenn sie eine der oben angegebenen Histidinfunktionalitäten anstelle der Histindfunktionalität aufweisen, isoeletrische Punkte, die in den oben definierten Bereich fallen. Verfahren zur Berechnung oder experimentellen Bestimmung des isoelektrischen Punkts anderer GLP-1 Moleküle sind dem Fachmann bekannt.
Verfahren zur Herstellung der GLP-1 Moleküle der vorliegenden Erfindung sind auch einem Peptidchemiker gut bekannt.
In einem Verfahren werden GLP-1 Moleküle durch gut bekannte Festphasenpeptidsyntheseschemata hergestellt, die von J. M. Merrifield, Chem. Soc., 85: 2149 (1962) und Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Seiten 24–66, Freeman (San Francisco, 1969) beschrieben sind. Jedoch ist es auch möglich, Fragmente des Proglucagonpolypeptids oder von GLP-1 (1-37) durch die Fragmentierung der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz unter Verwendung von beispielsweise einem proteolytischen Enzym zu erhalten. Ferner ist es auch möglich, die gewünschten Fragmente des Proglucagonpeptids von GLP-1 (1-37) über die Verwendung der rekombinanten DNA Technologie zu erhalten, wie dies von T. Maniatis et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, CSH (Cold Spring Harbor, 1982) beschrieben ist.
Ähnlich liefert der Stand der Technik in der Molekularbiologie dem Fachmann ein weiteres Mittel, durch das die erfindungsgemäßen Verbindungen erhalten werden können. Obwohl sie durch Festphasenpeptidsynthese oder rekombinante Verfahren hergestellt werden können, können rekombinante Verfahren bevorzugt sein, da höhere Ausbeuten möglich sind. Die grundlegenden Schritte bei der rekombinanten Herstellung umfassen:

a) Isolierung einer natürlichen DNA Sequenz, die für ein GLP-1 Molekül kodiert, oder Konstruktion einer synthetischen oder semisynthetischen für ein GLP-1 Molekül kodierenden DNA Sequenz,
b) Plazieren der kodierenden Sequenz in einen Expressionsvektor in einer Weise, die zur Expression der Proteine entweder alleine oder als Fusionsproteine geeignet ist,
c) Transformation einer geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor,
d) Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression eines GLP-1 Moleküls erlauben, und
e) Gewinnung und Reinigung des rekombinant hergestellten GLP-1 Moleküls.

Wie vorher erwähnt können die kodierenden Sequenzen vollkommen synthetisch sein oder das Ergebnis einer Modifizierung der längeren, für natives Glucagon kodierenden DNA sein. Eine DNA Sequenz, die für Präproglucagon kodiert, ist in Lund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 345–349 (1982) beschrieben und kann als Ausgangsmaterial bei der semisynthetischen Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Veränderung der nativen Sequenz zur Erreichung der gewünschten Ergebnisse verwendet werden.
Synthetische Gene, deren in vitro oder in vivo Transkription und Translation zur Bildung eines GLP-1 Moleküls führen, können durch Techniken konstruiert werden, die in der Technik gut bekannt sind. Aufgrund der natürlichen Degeneriertheit des genetischen Codes erkennt der Fachmann, dass eine beträchtliche aber definierte Anzahl an DNA Sequenzen konstruiert werden kann, die für GLP-1 Moleküle kodieren.
Die Methodik der Konstruktion von synthetischen Genen ist in der Technik gut bekannt. Siehe Brown et al., (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N. Y., Band 68, Seiten 109–151. DNA Sequenzen, die für ein GLP-1 Molekül kodieren, können aufgrund der hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen entworfen werden. Einmal entworfen, kann die Sequenz an sich mittels herkömmlicher DNA Synthesegeräte hergestellt werden, wie den Model 380A oder 380B DNA Synthesegeräten (PE-Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).
Um die Expression eines biologisch aktiven GLP-1 Moleküls zu bewirken, inseriert man die hergestellte synthetische DNA Sequenz in einem von vielen geeigneten rekombinanten DNA Expressionsvektoren durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen. Siehe allgemein Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., Band 1–3. Es werden Restriktionsschnittstellen an jedes Ende der für das GLP-1 Molekül kodierenden DNA angebracht, um die Isolierung von und die Integration in bekannte Amplifizierungs- und Expressionsvektoren zu erleichtern. Die im einzelnen verwendeten Endonukleasen werden durch das Restriktionsmuster des verwendeten Ausgangsexpressionsvektors vorgegeben. Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erfolgt so, dass die kodierende Sequenz mit den Kontrollsequenzen richtig orientiert wird, um eine im Leserahmen korrekte Ablesung und Expression des Proteins von Interesse zu erreichen. Die kodierende Sequenz muss so positioniert werden, dass sie im richtigen Leserahmen mit dem Promotor und der Ribosomenbindungsstelle des Expressionsvektors liegt, die beide in der Wirtszelle funktionsfähig sind, in der das Protein exprimiert werden soll.
Um eine effiziente Transkription des synthetischen Gens zu erreichen, muss es funktionsfähig mit einer Promotor-Operator Region verbunden sein. Daher wird die Promotor-Operator Region des syntheti schen Gens in derselben sequenziellen Orientierung in Bezug auf das ATG Startcodon des synthetischen Gens plaziert.
Es ist eine Vielzahl an Expressionsvektoren in der Technik gut bekannt, die zur Transformation von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen brauchbar sind. Siehe The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711–5399) und The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037). Die US 4 710 473 A beschreibt ebenfalls Plasmidtransformationsvektoren aus zirkulärer DNA, die zur Expression von exogenen Genen in E. coli in hohen Mengen brauchbar sind. Diese Plasmide sind als Transformationsvektoren in rekombinanten DNA Verfahren brauchbar und

(a) verleihen dem Plasmid die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle,
(b) kontrollieren die autonome Plasmidreplikation in Bezug zur Temperatur, bei der die Wirtszellkulturen gehalten werden,
(c) stabilisieren den Erhalt des Plasmids in den Wirtszellpopulationen,
(d) steuern die Synthese eines Proteinprodukts, das den Plasmiderhalt in einer Wirtszellpopulation anzeigt,
(e) liefern eine Reihe von Restriktionsschnittstellen, die in dem Plasmid nur einmal vorkommen, und
(f) beenden die mRNA Transkription.

Diese zirkulären DNA Plasmide sind als Vektoren in rekombinanten DNA Verfahren zur Sicherstellung von hohen Expressionsspiegeln von exogenen Genen brauchbar.
Nach der Konstruktion eines Expressionsvektors für ein GLP-1 Molekül ist der nächste Schritt die Plazierung in eine geeignete Zelle und die Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle hierdurch, die zur Expression des Polypeptids brauchbar ist. Techniken zur Transformation von Zellen mit rekombinanten DNA Vektoren sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Literaturen, wie Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle gefunden werden. Wirtszellen können entweder aus eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen konstruiert werden.
Prokaryotische Wirtszellen bilden im allgemeinen das Protein mit größeren Geschwindigkeiten und sind leichter zu kultivieren. Proteine, die in hohem Maß in bakteriellen Exressionssystemen exprimiert werden, aggregieren charakteristischerweise in Granula oder Einschlusskörperchen, die hohe Mengen des überexprimierten Proteins enthalten. Solche Proteinaggregate müssen typischerweise mittels in der Technik gut bekannter Verfahren aufgelöst, denaturiert und rückgefaltet werden. Siehe Kreuger et al., (1990) in Protein Folding, Gierasch und King, Herausgeber, Seiten 136–142, American Association for the Advancement of Science Publication Nr. 89-18S, Washington, D. C. und US 4 923 967 A .
Nach der Herstellung des gewünschten GLP-1 Moleküls mit der Maßgabe, dass es einen isoelektrischen Punkt im Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 aufweist, werden Komplexe der vorliegenden Erfindung durch die Komplexierung des gewünschten GLP-1 Moleküls mit einem divalenten Metallkation über in der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt. Solche Metalle umfassen beispielsweise Zn²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Ni²⁺ und dergleichen. Von den Metallkationen ist Zn²⁺ bevorzugt.
Im allgemeinen wird ein gewünschtes GLP-1 Molekül mit dem erforderlichen isoelektrischen Punkt mit einem Gemisch aus einem geeigneten Puffer und einer geeigneten Form eines Metallkations kombiniert.
Geeignete Puffer sind die, die das Gemisch in einem pH Bereich von etwa 6,0 bis etwa 9,0 halten, aber mit der Reaktion nicht wechselwirken. Bevorzugte Puffer umfassen Goode's Puffer, insbesondere HEPES und Tris und Trisacetat.
Geeignete Formen von Metallkationen umfassen alle Formen eines divalenten Metallkations, das unter Bildung eines Komplexes mit einem GLP-1 Molekül der vorliegenden Erfindung verfügbar ist. Vorzugsweise wird ein solches Salz eines divalenten Metallkations, wie Zinkchlorid, im Überschuss unter Bildung eines molaren Verhältnisses von bis zu etwa 50 Molekülen eines divalenten Metallkations für jedes Molekül des GLP-1 Substrats bereitgestellt.
Die Temperatur, die in diesem Schritt verwendet wird, ist die, welche ausreicht, um die Vollständigkeit der Reaktion zu bewirken. Typischerweise läuft die Reaktions bei Umgebungstemperatur ab.
Das Produkt der vorliegenden Reaktion, eine kristalline oder amorphe Suspension, wird isoliert und mittels Standardtechniken gereinigt.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthalten. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen werden auf eine in der pharmazeutischen Technik bekannte Weise hergestellt und werden einzeln oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln vorzugsweise über parenterale Wege verabreicht. Speziell bevorzugte Wege umfassen die intramuskuläre und subkutane Verabreichung.
Parenterale Tagesdosen, vorzugsweise eine einzelne Tagesdosis, liegen im Bereich von etwa 1 pg/kg bis etwa 1000 μg/kg Körpergewicht, obwohl geringere oder höhere Dosierungen verabreicht werden können. Die erforderliche Dosis hängt von der Schwere des Zustands des Patienten und von Kriterien ab, wie der Größe, dem Gewicht, dem Geschlecht, dem Alter und der Krankengeschichte.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff, der zumindest eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst, gewöhnlich mit einem Hilfsstoff gemischt oder mit einem Hilfsstoff verdünnt. Wenn ein Hilfsstoff als Verdünnungsmittel verwendet wird, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Träger oder Medium für den Wirkstoff dient.
Bei der Herstellung einer Formulierung kann es notwendig sein, den Wirkstoff zu mahlen, um die geeignete Partikelgröße vor der Kombination mit den anderen Inhaltsstoffen bereitzustellen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen unlöslich ist, wird er gewöhnlich auf eine Partikelgröße von weniger als etwa 200 Mesh gemahlen. Falls der Wirkstoff im wesentlichen wasserlöslich ist, wird die Partikelgröße normalerweise durch Mahlen eingestellt, um eine im wesentlichen gleichförmige Verteilung in der Formulierung bereitzustellen, beispielsweise etwa 40 Mesh.
Einige Beispiele für geeignete Hilfsstoffe sind unter anderem Lactose, Glucose, Saccharose, Trehalose, Sorbit und Mannit. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können so formuliert werden, dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten durch Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren bereitstellen.
Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer Einheitsdosierungsform formuliert, wobei jede Dosierung normalerweise etwa 50 μg bis etwa 100 mg, gewöhnlicher etwa 1 mg bis etwa 10 mg des Wirkstoffs enthält. Der Ausdruck "Einheitsdosierungsform" bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einmalige Dosierungen für den Menschen oder andere Säuger geeignet sind, wobei jede Ein heit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, die zur Herstellung des gewünschten therapeutischen Effekts berechnet wurde, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff enthält.
Für die Zwecke der parenteralen Verabreichung werden Zusammensetzungen, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung enthalten, vorzugsweise mit destilliertem Wasser kombiniert und der pH wird auf etwa 6,0 bis etwa 9,0 eingestellt.
Es können zusätzliche pharmazeutische Verfahren verwendet werden, um die Wirkdauer zu kontrollieren. Kontrolliert freisetzende Präparationen können durch die Verwendung von Polymeren erreicht werden, um eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zu komplexieren oder zu absorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann durch die Auswahl von geeigneten Makromolekülen (beispielsweise Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und die Konzentration von Makromolekülen, wie auch der Verfahren der Einarbeitung, um die Freisetzung zu kontrollieren, erreicht werden.
Ein weiteres mögliches Verfahren zur Verlängerung der Wirkdauer durch kontrolliert freisetzende Präparationen ist die Einarbeitung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung in Partikel aus einem polymeren Material, wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure oder Ethylenvinylacetatcopolymeren.
Alternativ dazu ist es anstelle der Einarbeitung einer Verbindung in diese polymeren Partikel möglich eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise jeweils Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapseln oder in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen, beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen einzuschließen. Solche Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine insulinotrope Aktivität. Daher liefert ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Insulinexpression, das die Bereitstellung einer wirksamen Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung an eine Säugerpankreasinselzelle vom B-Typ umfasst.
Ähnlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung des altersbedingten Diabetes mellitis bei einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen solchen Säuger umfasst.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfinudng bereitgestellt. Es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung durch eines der folgenden Beispiele zu beschränken.
Beispiel 1
Einzelne Aliquots von 5 unterschiedlichen GLP-1 Molekülen werden durch gut bekannte Festphasenpeptidsynthese hergestellt und in kleinen Gläschen lyophilisiert. Es werden Portionen 0,1 M HEPES Puffer (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) mit pH 7,4, die verschiedene Mengen an Zinkchlorid enthalten, zu den Aliquots gegeben, um eine Proteinkonzentration von etwa 0,1 mg/ml zu erhalten. Die Proben werden gemischt und bei Umgebungstemperatur (22°C) für etwa 18 Stunden gelagert. Die Gemische werden dann für 5 Minuten zentrifugiert (Fisher Model 235C Mikrozentrifuge). Die klaren Überstände werden aus den Röhrchen abpipettiert. Der Proteingehalt der Überstände wird durch die Messung der Absorption bei 280 nm in einem Spektrophotometer abgeschätzt (Gilford 260). Der theoretische Absorptionswert für eine 0,1 mg/ml Lösung der GLP-1 Moleküle bei dieser Wellenlänge in 1 cm Küvetten beträgt 0,207. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Dieses Beispiel zeigt, dass nur ein kleiner Teil des Zinks zur Komplexierung und Fällung eines signifikanten Teils des GLP-1 Moleküls aus diesen verdünnten Lösungen erforderlich ist.
Beispiel 2
5 mg an GLP-1 (7-36)NH₂ werden vollständig in 2,5 ml an zinkfreiem 0,1 M HEPES Puffer mit pH 7,4 gelöst. Zusätzliche 2,5 ml an 0,1 M HEPES Puffer mit pH 7,4, der 0,6 mM Zinkchlorid enthält, werden schnell zugegeben. Das ungefähre Molverhältnis an Zink zu GLP-1 (7-36)NH₂ in dieser Probe beträgt 1 : 1. Die Lösung wird sofort trüb und es bildet sich schnell ein Niederschlag. Das Gemisch wird bei Umgebungstemperatur (22°C) für 18 Stunden gelagert.
Der Niederschlag haftet dann fest am Boden des Glasröhrchens. Der Überstand wird vollständig durch eine Pipette abdekantiert. Der Niederschlag wird dann vollständig in 5,0 ml an 0,01 N Chlorwasserstoffsäure aufgelöst. Die Absorption bei 280 nm wird sowohl für den Überstand als auch die rückgelösten Niederschlagslösungen bestimmt. Die Zinkmengen in diesen Lösungen werden durch Atomabsorptionsspektrometrie quantifiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Dieses Beispiel zeigt, dass das meiste an GLP-1 (7-36)NH₂ aus der Lösung ausfällt, wenn die Zink-enthaltende HEPES Lösung zugegeben wird. Der Absorptionswert bei 280 nm von 1,932 zeigt, dass die GLP-1 (7-36)NH₂ Konzentration des rückgelösten Niederschlags 0,9333 mg/ml oder 283 μM beträgt. Die Zinkkonzentration dieser Lösung ist mit 13,3 ppm zu einer Zinkkonzentration von 203 μM äquivalent. Daher beträgt das Molverhältnis von Zink zu GLP-1 (7-36)NH₂ im Niederschlag 0,717 bis 1.

Claims

Polypeptid der Formel R₁-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ worin R₁ aus L-Histidin, D-Histidin, Desaminohistidin, 2-Aminohistidin, β-Hydroxyhistidin, Homohistidin, α-Fluormethylhistidin und α-Methylhistidin ausgewählt ist, X aus Val, Ile und α-Methyl-Ala ausgewählt ist, Y aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly ausgewählt ist, Z aus Glu, Gln, Ala, Thr, Ser und Gly ausgewählt ist, R₂ aus NH₂ und Gly-OH ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid einen isoelektrischen Punkt im Bereich von 6,0 bis 9,0 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin R₁ ausgewählt ist aus L-Histidin und Desaminohistidin.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin X für Val steht.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Y aus Glu und Gln ausgewählt ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin Z aus Glu und Gln ausgewählt ist.
Polypeptid der Formel R₁-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ worin R₁ für L-Histidin steht, X für Val steht, Y für Glu steht, Z für Glu steht, und R₂ für Gly-OH steht.
Polypeptid der Formel R₁-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R₂ worin R₁ für L-Histidin steht, X für Val steht, Y für Gln steht, Z für Glu steht, und R₂ für Gly-OH steht.
GLP-1 Molekülkomplex, der aus einem divalenten Metallkation besteht, das hiermit assoziiert ist und zur Co-Fällung mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 fähig ist.
Komplex nach Anspruch 8, worin das divalente Metallkation Zink ist.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff einen Komplex oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen hierfür enthält.
Wirksame Menge eines GLP-1 Molekülkomplexes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Verwendung bei der Behandlung von altersbedingtem Diabetes mellitus.
Verwendung einer wirksamen Menge eines GLP-1 Molekülkomplexes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von altersbedingtem Diabetes mellitus bei einem Säuger.
Verwendung einer wirksamen Menge eines GLP-1 Molekülkomplexes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die sich gegen β-Typ-Inselzellen des Säugerpankreas zur Erhöhung der Insulinexpression richtet.
Verfahren zur Herstellung eines GLP-1 Molekülkomplexes nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, das das Mischen des GLP-1 Polypeptids mit einem divalenten Metallkation umfasst.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff ein Polypeptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen hierfür umfasst.