DE69838791T3

DE69838791T3 - Neue exendinagonist verbindungen

Info

Publication number: DE69838791T3
Application number: DE69838791T
Authority: DE
Inventors: Nigel Robert Solana Beach BEELEY; Kathryn S. San Diego PRICKETT
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: DK1019077T4; AU8772998A; ES2293688T5; DK1019077T3; EP1019077A4; HK1026627A1; EP1019077B1; AU749914B2; PT1019077E; CY1107829T1; EP1019077B2; WO1999007404A1; ES2293688T3; NZ502592A; DE69838791T2; BR9811866A; CA2299425A1; DE69838791D1; EP1019077A1; JP2001513512A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, welche eine Aktivität als Exendin-Agonisten aufweisen.
Exendin
Die Exendine sind Peptide, welche in dem Gift des Gila-Monsters gefunden werden, einer in Arizona und Nordmexiko häufigen Eidechse. Exendin-3 [SEQ ID NO: 1] liegt in dem Gift von Heloderma horridum vor, und Exendin-4 [SEQ ID NO: 2] liegt in dem Gift von Heloderma suspectum vor (Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259–62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402–05, 1992). Die Aminosäuresequenz von Exendin-3 ist in 2 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Exendin-4 ist in 3 gezeigt. Die Exendine weisen einige Sequenzähnlichkeit mit mehreren Mitgliedern der Glucacon-ähnlichen Peptidfamilie auf, wobei die höchste Homologie von 53% zu GLP-1[7–36]NH₂ [SEQ ID. NO: 3] besteht (Goke, et al., J. Biol. Chem., 268: 19650–55, 1993). GLP-1[7–36]NH₂, auch als Proglucagon [78–107] oder einfach ”GLP-1” bekannt, weist einen insulinotrophen Effekt auf, die Insulinsekretion von β-Zellen des Pankreas stimulierend. Die Aminosäuresequenz von GLP-1 ist in 4 gezeigt. GLP-1 inhibiert auch die Glucagonsekretion aus α-Zellen des Pankreas (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993; D'Alessio, et al., J. Clin. Invest., 97: 133–38, 1996). Es wird von GLP-1 berichtet, dass es das Entleeren des Magens (Willms B, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81(1): 327–32, 1996; Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 38(4): 665–73, 1993) und die Sekretion von Magensäure inhibiert. Schjoldager BT, et al., Dig. Dis. Sci. 34(5): 7-03-8, 1989; O'Halloran DJ, et al., J. Endocrinol. 126(1): 169–73, 1990; Wettergren A, et al., Dig. Dis. Sci. 38(4): 665–73, 1993). GLP-1[7–37], welches einen zusätzlichen Glycinrest an seinem Carboxyterminus aufweist, stimuliert auch die Insulinsekretion bei Menschen (Ørsov, et al., Diabetes, 42: 658–61, 1993). Es wurde ein Transmembran G-Protein-Adenylatcyclase-gekoppelter Rezeptor aus einer β-Zelllinie geklont, von dem angenommen wird, dass er für den insulinotrophen Effekt von GLP-1 verantwortlich ist (Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8641–45 (1992)).
Es wird berichtet, dass Exendin-4 an GLP-Rezeptoren auf Insulin-sekretierenden βTC1-Zellen, an verteilten azinösen Zellen des Pankreas von Meerschweinchen und an parietalen Zellen des Magens wirkt; es wird von dem Peptid auch berichtet, dass es die Freisetzung von Somatostatin stimuliert und die Freisetzung von Gastrin in isolierten Mägen inhibiert (Goke, et al., J. Biol. Chem. 268: 19650–55, 1993; Schepp, et al., Eur. J. Pharmacol., 69: 183–91, 1994; Eissele, et al., Life Sci., 55: 629–34, 1994). Es wurde berichtet, dass Exendin-3 und Exendin-4 cAMP-Produktion in und Amylasefreisetzung aus pankreatischen acinösen Zellen stimuliert (Malhotra, R., et al., Regulatory Peptides, 41: 149–56, 1992; Raufman, et al., J. Biol. Chem. 267: 21432–37, 1992; Singh, et al., Regul. Pept. 53: 47–59, 1994). Basierend auf ihren insulinotrophen Aktivitäten wurde die Verwendung von Exendin-3 und Exendin-4 zur Behandlung von Diabetes mellitus und zur Vorsorge gegen Hyperglykämie vorgeschlagen (Eng, US-Patent Nr. 5,424,286 ).
Agenzien, welche dazu dienen, die Entleerung des Magens zu verzögern, haben als diagnostische Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen einen Platz in der Medizin gefunden. Zum Beispiel ist Glucagon ein Polypeptidhormon, welches von den α-Zellen der Langerhans'schen Inseln des Pankreas produziert wird. Es ist ein hyperglykämisches Agens, welches Glucose durch die Aktivierung von Glycogenolyse in der Leber mobilisiert. Es kann in einem geringeren Ausmaß die Sekretion von Insulin aus dem Pankreas stimulieren. Glucagon wird bei der Behandlung von Insulin-induzierter Hypoglykämie verwendet, z. B., wenn eine Verabreichung von Glucose intravenös nicht möglich ist. Da Glucagon die Motilität des Gastrointestinaltrakts reduziert, wird es jedoch auch als diagnostisches Mittel bei gastrointestinalen radiologischen Untersuchungen genutzt. Glucagon wurde auch in mehreren Studien zur Behandlung verschiedener schmerzhafter gastrointestinaler Störungen, welche mit Krämpfen assoziiert sind, verwendet. Daniel, et al. (Br. Med. J., 3: 720, 1974) berichteten von einem schnelleren Nachlassen von Symptomen akuter Divertikulitis bei mit Glucagon behandelten Patienten, verglichen mit denen, welche mit Analgetika oder Antispasmodika behandelt wurden. Ein Übersichtsartikel von Glauser, et al., (J. Am. Coll. Emergency Physns, 8: 228, 1979) beschrieb ein Nachlassen von akutem ösophagialen Nahrungsmittelverschluss nach Glucagontherapie. In einer anderen Studie befreite Glucagon 21 Patienten mit Gallentrakterkrankung deutlich von Schmerzen und Empfindlichkeit, verglichen mit 22 mit Placebo behandelten Patienten (M. J. Stower, et al., Br. J. Surg., 69: 591–2, 1982).
Verfahren zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Amylin-Agonisten sind in der internationalen Anmeldung Nr. WO 95/07098 , veröffentlicht am 16. März 1995, beschrieben.
Verfahren zur Regulation der gastrointestinalen Motilität unter Verwendung von Exendin-Agonisten sind in US 6,858,576 beschrieben.
Bestimmte Exendin-Agonisten sind in WO 99/25727 und in WO 99/25728 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptidverbindungen nach Formel (I) [SEQ ID NO: 4] zur Verfügung gestellt, wobei die Peptidverbindungen eine agonistische Exendin-Aktivität als ein Agens zeigen, welches gastrische Motilität herabsetzt und die Entleerung des Magens verlangsamt, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 5, 6 und 7 aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Regulation der gastrointestinalen Motilität, welche mit einer Erkrankung assoziiert ist, in der eine Abnahme der gastrointestinalen Motilität therapeutisch wäre. Zum Beispiel kann eine Regulation der gastrointestinalen Motilität ein Reduzieren der gastrischen Motilität oder ein Verlangsamen der Entleerung des Magens umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Dosis-abhängige Effekte von Exendin-4 im Vergleich mit Verbindung 1 von 1 [SEQ ID NO: 5] auf Plasma-Glucosespiegel in db/db Mäusen.
2 zeigt einen Vergleich von Effekten von Exendin-4, Exendin-4-Säure und Verbindung 1 von 1 [SEQ ID NO: 5] auf die Entleerung des Magens.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptidverbindungen zur Verfügung gestellt, welche eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOS: 5, 6 und 7 aufweisen. Die Erfindung stellt ferner Zusammensetzungen zur Verfügung, welche diese Verbindungen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Regulation einer gastrointestinaler Motilität, welche mit einer Erkrankung assoziiert ist, in der eine Abnahme der gastrointestinalen Motilität therapeutisch wäre. Zum Beispiel kann eine Regulation der gastrointestinalen Motilität ein Reduzieren der gastrischen Motilität oder ein Verlangsamen der Entleerung des Magens umfassen.
Die oben in Bezug genommenen Verbindungen bilden Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren und Basen. Solche Salze schließen Salze ein, welche mit organischen und anorganischen Säuren hergestellt wurden, z. B. HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Methansulfonsäure, Toluensulfonsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure und Camphersulfonsäure. Mit Basen hergestellte Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, z. B. Natrium- und Kaliumsalze und Erdalkalisalze, z. B. Calcium- und Magnesiumsalze, ein. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoressigsäuresalze sind bevorzugt. Die Salze können durch konventionelle Mittel gebildet werden, wie durch ein zur Reaktion Bringen der freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehr Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder einem Medium, in dem das Salz nicht löslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch Austausch der Ionen eines bestehenden Salzes gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
Nützlichkeit
Die oben beschriebenen Verbindungen sind in Anbetracht ihrer pharmakologischen Eigenschaften nützlich. Insbesondere sind die Verbindungen der Erfindung Exendin-Agonisten und besitzen eine Aktivität als Agenzien, um gastrische Motilität zu regulieren und eine Entleerung des Magens zu verlangsamen, wie durch die Fähigkeit erwiesen wird, die post-prandialen Glucosespiegel in Säugern zu reduzieren.
Herstellung der Verbindungen
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Standard-Festphasen Peptidsynthese-Techniken und bevorzugt mit einem automatisierten oder semi-automatisierten Peptid-Synthesizer hergestellt werden. Typischerweise werden unter Verwendung solcher Techniken eine α-N-Carbamoyl geschützte Aminosäure und eine Aminosäure, welche mit der wachsenden Peptidkette auf einem Harz verbunden ist, bei Raumtemperatur in einem inerten Lösungsmittel wie Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidinon oder Methylenchlorid in der Anwesenheit von Kopplungsmitteln wie Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol in der Anwesenheit einer Base wie Diisopropylethylamin gekoppelt. Die α-N-Carbamoyl-Schutzgruppe wird von dem sich ergebenden Peptidharz unter Verwendung eines Reagenzes wie Trifluoressigsäure oder Piperidin entfernt, und die Kopplungsreaktion wird mit der nächsten gewünschten N-geschützten Aminosäure wiederholt, welche zu der Peptidkette hinzugefügt werden soll. Geeignete N-Schutzgruppen sind in der Technik gut bekannt, wobei t-Butyloxycarbonyl (tBoc) und Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) hierin bevorzugt sind.
Die Lösungsmittel, Aminosäurederivate und 4-Methylbenzhydryl-Aminharz, welche in dem Peptid-Synthesizer verwendet werden, können von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erworben werden. Die folgenden an den Seitenketten geschützten Aminosäuren können von Applied Biosystems, Inc. erworben werden: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) kann von Applied Biosystems, Inc. oder Bachem Inc. (Torrance, CA) erworben werden. Anisol, Dimethylsulfid, Phenol, Ethandithiol und Thioanisol können von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) erhalten werden. Air Products and Chemicals (Allentown, PA) liefert HF. Ethylether, Essigsäure und Methanol können von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) erworben werden.
Eine Festphasen-Peptidsynthese kann mit einem automatischen Peptid-Synthesizer (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) unter Verwendung des NMP/HOBt (Option 1) Systems und tBoc- oder Fmoc-Chemie mit Capping durchgeführt werden (siehe Handbuch von Applied Biosystems für den ABI 430A Peptid-Synthesizer, Version 1.3B, 1. Juli 1988, Abschnitt 6, Seiten 49–70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Boc-Peptidharze können mit HF gespalten werden (–5°C bis 0°C, 1 Stunde). Das Peptid kann von dem Harz durch Abwechslung von Wasser und Essigsäure extrahiert werden, und die Filtrate werden lyophilisiert. Die Fmoc-Peptidharze können gemäß Standardverfahren gespalten werden (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, Seiten 6–12). Peptide können auch unter Verwendung eines Advanced Chem Tech Synthesizers (Model MPS 350, Louisville, Kentucky) zusammengesetzt werden.
Peptide können durch RP-HPLC (präparativ und analytisch) unter Verwendung eines Waters Delta Prep 3000 Systems gereinigt werden. Eine C4, C8 oder C18 präparative Säule (10 μ, 2,2 × 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) kann zur Isolation von Peptiden verwendet werden, und Reinheit kann unter Bestimmung einer C4, C8 oder C18 analytischen Säule bestimmt werden (5 μ, 0,46 × 25 cm; Vydac). Lösungsmittel (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/CH₃CN) können der analytischen Säule bei einer Flussrate von 1,0 ml/min und der präparativen Säule bei 15 ml/min zugeführt werden. Aminosäureanalysen können mit dem Waters Pico Tag System durchgeführt und unter Verwendung des Maxima Programms prozessiert werden. Peptide können durch Säurehydrolyse in der Dampfphase (115°C, 20–24 h) hydrolysiert werden. Hydrolysate können mit Standardverfahren derivatisiert und analysiert werden (Cohen et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, Seiten 11–52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Eine schnelle Atombombardmentanalyse (fast atom bombardment analysis) kann mit M-Scan, Incorporated durchgeführt werden (West Chester, PA). Eine Massenkalibration kann unter Verwendung von Cäsiumiodid oder Cäsiumiodid/Glycerol durchgeführt werden. Eine Plasmadesorptionsionisationsanalyse unter Verwendung eines Nachweises der Flugzeit (time of flight detection) kann mit einem Applied Biosystems Bio-Ion 20 Massenspektrometer durchgeführt werden. Elektrospraymassenspektroskopie kann mit einer VG-Trio-Maschine durchgeführt werden.
In der Erfindung nützliche Peptidverbindungen können auch unter Verwendung von Gentechnik hergestellt werden, unter Verwendung von nun in der Technik bekannten Methoden. Siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor.
Die oben in Bezug genommenen Verbindungen können Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren und Basen bilden. Solche Salze schließen Salze ein, welche mit organischen und anorganischen Säuren hergestellt wurden, z. B. HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Methansulfonsäure, Toluensulfonsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure und Camphersulfonsäure. Mit Basen hergestellte Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, z. B. Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalisalze, z. B. Calcium- und Magnesiumsalze, ein. Acetat-, Hydrochlorid- und Trifluoressigsäuresalze sind bevorzugt. Die Salze können mit konventionellen Mitteln gebildet werden, wie z. B. durch ein zur Reaktion Bringen der freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehr Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder Medium, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
Formulierung und Verabreichung
Erfindungsgemäße Verbindungen sind in Anbetracht ihrer Exendin-artigen Effekte nützlich, und können bequemerweise in der Form von Formulierungen zur Verfügung gestellt werden, die zur parenteralen (einschließlich intravenösen, intramuskulären und subkutanen) oder nasalen oder oralen Verabreichung geeignet sind. In einigen Fällen wird es bequem sein, ein Exendin oder einen Exendin-Agonisten und ein anderes Agens gegen Entleerung des Magens, so wie Glucagon, ein Amylin oder einen Amylin-Agonisten, in einer einzigen Zusammensetzung oder Lösung zur gemeinsamen Verabreichung zur Verfügung zu stellen. In anderen Fällen kann es von größerem Vorteil sein, ein anderes Agens gegen die Entleerung getrennt von dem Exendin oder Exendin-Agonisten zu verabreichen. In noch anderen Fällen kann es von Vorteil sein, ein Exendin oder einen Exendin-Agonisten entweder gemeinsam formuliert oder getrennt von anderen Glucosesenkenden Agenzien wie Insulin zur Verfügung zu stellen. Ein geeignetes Format zur Verabreichung kann am besten für jeden Patienten individuell durch einen medizinischen Praktiker bestimmt werden. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und ihre Formulierung sind in Standardwerken zur Formulierung beschrieben, z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Siehe auch Wang, Y. J. und Hanson, M. A. ”Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers,” Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report Nr. 10, Supp. 42: 2S (1988).
In der Erfindung nützliche Verbindungen können als parenterale Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion zur Verfügung gestellt werden. Sie können z. B. in einem inerten Öl suspendiert werden, geeigneterweise einem Pflanzenöl wie einem Sesam-, Erdnuss-, Olivenöl oder anderem akzeptablen Träger. Bevorzugt sind sie in einem wässrigen Träger suspendiert, z. B. in einer isotonischen Pufferlösung bei einem pH von etwa 5,6 bis 7,4. Diese Zusammensetzungen können durch konventionelle Sterilisierungstechniken sterilisiert werden, oder sie können sterilfiltriert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie sie benötigt werden, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie den pH-Wert puffernde Agenzien. Nützliche Puffer schließen z. B. Natriumacetat/Essigsäure-Puffer ein. Eine Form von Vorrats- oder „Depot”-Zusammensetzung mit langsamer Freisetzung kann verwendet werden, so dass therapeutisch effektive Mengen der Zusammensetzung über mehrere Stunden oder Tage nach transdermaler Injektion oder Verabreichung in den Blutstrom freigesetzt werden.
Die erwünschte Isotonizität kann unter Verwendung von Natriumchlorid oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Agenzien, zum Beispiel Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol, Polyolen (zum Beispiel Mannitol und Sorbitol) oder anderen anorganischen oder organischen zu lösenden Substanzen erreicht werden. Natriumchlorid ist besonders für Puffer bevorzugt, welche Natriumionen enthalten.
Die beanspruchten Verbindungen können auch als pharmazeutisch akzeptable Salze (z. B. Säureadditionssalze) und/oder Komplexe davon formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze sind nicht-toxische Salze in der Konzentration, in der sie verabreicht werden. Die Herstellung solcher Salze kann die pharmakologische Verwendung erleichtern, indem die physikalisch/chemischen Charakteristika der Zusammensetzung verändert werden, ohne dass die Zusammensetzung daran gehindert wird, ihren physiologischen Effekt auszuüben. Beispiele von nützlichen Änderungen bei physikalischen Eigenschaften schließen eine Verringerung des Schmelzpunkts ein, um eine Verabreichung über die Mukosa zu erleichtern, und eine Erhöhung der Löslichkeit, um die Verabreichung von höheren Konzentrationen des Medikaments zu erleichtern.
Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Säureadditionssalze ein, zum Beispiel jene, welche Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfamat, Acetat, Citrat, Lactat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzensulfonat, p-Toluensulfonat, Cyclohexylsulfamat und Quimat enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Salze können von Säuren wie Hydrochlorsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfaminsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzensulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Cyclohexylsulfaminsäure, und Chinasäure ein. Solche Salze können z. B. hergestellt werden, indem man die freien Säure- oder Baseformen des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der geeigneten Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder einem Medium zur Reaktion bringt, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie Wasser, welches dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch Austauschen der Ionen eines bestehenden Salzes gegen ein anderes Ion mit einem geeigneten Ionenaustauschharz.
Auch Träger oder Hilfsstoffe können verwendet werden, um eine Verabreichung der Verbindung zu erleichtern. Beispiele von Trägern oder Hilfsstoffen schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker so wie Lactose, Glucose oder Sucrose oder Arten von Stärke, Cellulosederivaten, Gelatine, Pflanzenölen, Polyethylenglykolen und physiologisch kompatiblen Lösungsmitteln ein. Die Zusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können über verschiedene Routen verabreicht werden, einschließlich intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, oral, topisch oder transmukosal.
Wenn gewünscht, können Lösungen der obigen Zusammensetzungen mit einem Verdickungsmittel wie Methylcellulose verdickt werden. Sie können in Emulsionsform, entweder Wasser-in-Öl oder Öl-in-Wasser, hergestellt werden. Jedes einer großen Vielzahl von pharmazeutisch akzeptablen emulsionsbildenden Agenzien kann genutzt werden, einschließlich z. B. Akazienpuder, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie ein Tween) oder ein ionisches oberflächenaktives Mittel (so wie Alkalipolyetheralkoholsulfate oder -sulfonate, z. B. ein Triton).
In der Erfindung nützliche Zusammensetzungen werden hergestellt, indem man die Zutaten nach allgemein akzeptierten Verfahren mischt. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardvorrichtung gemischt werden, um eine konzentrierte Mischung zu bilden, welche dann durch das Hinzufügen von Wasser oder Verdickungsmittel und eventuell eines Puffers zur Kontrolle des pH oder eines zusätzlichen Soluts zur Kontrolle der Tonizität an die Endkonzentration und -viskosität angepasst werden kann.
Zur Verwendung durch den Arzt werden die Verbindungen in Form von Dosiereinheiten bereitgestellt, welche eine Menge eines Exendin-Agonisten mit oder ohne ein weiteres Agens gegen das Entleeren enthält. Therapeutisch effektive Mengen eines Exendin-Agonisten zur Verwendung bei der Kontrolle der Entleerung des Magens und bei Zuständen, bei denen eine Entleerung des Magens vorteilhafterweise verlangsamt oder reguliert wird, sind solche, die die post-prandialen Blutglucosespiegel verringern, bevorzugt auf nicht mehr als etwa 8 oder 9 mM, oder so, dass die Blutglucosespiegel so wie gewünscht reduziert werden. Bei diabetischen oder glucoseintoleranten Individuen sind Plasmaglucosespiegel höher als bei normalen Individuen. Bei solchen Individuen kann eine vorteilhafte Reduktion oder ein „Glätten” von post-prandialen Blutglucosespiegeln erhalten werden. Wie durch die in dem Gebiet Tätigen erkannt werden wird, wird eine effektive Menge an therapeutischem Agens von vielen Faktoren abhängen, einschließlich des Alters und des Gewichts des Patienten, des physischen Zustands des Patienten, des Blutzuckerspiegels oder des Niveaus der Inhibition des Entleerens des Magens, welches erhalten werden sollen, und anderer Faktoren.
Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich beim Bewirken von gastrischer Hypomotilität bei einem Subjekt und können auch in anderen Störungen verwendet werden, bei denen vorteilhafterweise die gastrische Motilität reduziert wird.
Die effektive tägliche Dosis der Verbindungen gegen das Entleeren wird typischerweise in dem Bereich von 0,01 oder 0,03 bis etwa 5 mg/Tag liegen, bevorzugt etwa 0,01 oder 0,5 bis 2 mg/Tag oder mehr bevorzugt etwa 0,01 oder 0,1 bis 1 mg/Tag für einen Patienten mit 70 kg, verabreicht in einer einzigen Dosis oder in aufgeteilten Dosen. Die exakte zu verabreichende Dosis wird durch den betreuenden Kliniker bestimmt und hängt davon ab, wo die besondere Verbindung in dem oben genannten Bereich liegt, genau wie von dem Alter, Gewicht und Zustand des Individuums. Die Verabreichung sollte bei dem ersten Zeichen von Symptomen oder kurz nach einer Diagnose von Diabetes mellitus beginnen. Eine Verabreichung kann durch Injektion, bevorzugt subkutan oder intramuskulär, durchgeführt werden. Oral aktive Verbindungen können oral gegeben werden, die Dosierung sollte jedoch 5- bis 10-fach erhöht werden.
Allgemein können bei der Behandlung oder der Vorbeugung von erhöhten, unangemessenen oder unerwünschten post-prandialen Blutglucosespiegeln die erfindungsgemäßen Verbindungen Patienten mit Bedarf für eine solche Behandlung in Dosisbereichen ähnlich den oben angegebenen verabreicht werden, die Verbindungen werden jedoch häufiger verabreicht, z. B. einmal, zweimal oder dreimal am Tag.
Die optimale Formulierung und Art der Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung an einen Patienten hängt von in der Technik bekannten Faktoren wie der bestimmten Erkrankung oder der Störung, dem gewünschten Effekt und der Art des Patienten ab. Während die Verbindungen typischerweise verwendet werden, um menschliche Patienten zu behandelt, können sie auch verwendet werden, um ähnliche oder identische Erkrankungen bei anderen Vertebraten, so wie anderen Primaten, Bauernhoftieren wie Schweinen, Rindern und Geflügel und Sporttieren und Haustieren wie Pferden, Hunden oder Katzen, zu behandeln.
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, sind die folgenden Beispiele angefügt, welche die Ergebnisse einer Folge von Experimenten beschreiben.
BEISPIEL 1
Herstellung eines amidierten Peptids mit SEQ ID NO: [5]
Das oben identifizierte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt. Im Allgemeinen wurden bei der Synthese durchgängig Zyklen mit einzelnem Koppeln verwendet, und Fast Moc(HBTU-Aktivierung)-Chemie wurde genutzt. An einigen Positionen war die Kopplung jedoch weniger effizient als erwartet, und doppelte Kopplungen wurden benötigt. Insbesondere bedurften die Reste Asp₉, Thr₇ und Phe₆ alle einer doppelten Kopplung. Das Entschützen (Entfernen der Fmoc-Gruppe) der wachsenden Peptidkette unter Verwendung von Piperidin war nicht immer effizient. Eine doppelte Entschützung wurde an Positionen Arg₂₀, Val₁₉ und Leu₁₄ benötigt. Endgültiges Entschützen des fertiggestellten Peptidharzes wurde unter Verwendung einer Mischung von Triethylsilan (0,2 ml), Ethandithiol (0,2 ml), Anisol (0,2 ml), Wasser (0,2 ml) und Trifluoressigsäure (15 ml) gemäß Standardverfahren (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.) erreicht. Das Peptid wurde in Ether/Wasser (50 ml) präzipitiert und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in Eisessig rekonstituiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Peptid wurde in Wasser gelöst. Die Reinheit des Rohstoffs war etwa 55%.
Bei Reinigungsschritten und Analyse wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet.
Die Peptid enthaltende Lösung wurde auf eine präparative C-18-Säule aufgetragen und gereinigt (10% bis 40% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 40 Minuten). Die Reinheit der Fraktionen wurde isokratisch unter Verwendung einer analytischen C-18 Säule bestimmt. Reine Fraktionen wurden vereinigt, was das oben identifizierte Peptid lieferte. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt mit einer beobachteten Retentionszeit von 14,5 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4131,7; gefunden 4129,3.
BEISPIEL 2
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO: [6]
Das oben genannte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 25% bis 75% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt mit einer beobachteten Retentionszeit von 21,5 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4168,6; gefunden 4171,2.
BEISPIEL 3
Herstellung des Peptids mit SEQ ID NO: [7]
Das oben identifizierte Peptid wurde auf einem 4-(2'-4'-Dimethoxyphenyl)-Fmoc-aminomethylphenoxyacetamidnorleucin MBHA-Harz (Novabiochem, 0,55 mmol/g) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz abgespalten, entschützt und ähnlich wie in Beispiel 1 aufgereinigt. Bei der Analyse wurden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids ergab ein Peptidprodukt mit einer beobachteten Retentionszeit von 17,9 Minuten. Elektrospraymassenspektrometrie (M): berechnet 4147,6; gefunden 4150,2.
BEISPIEL 12
Herstellung des C-terminalen Carbonsäurepeptids entsprechend den obigen C-terminalen Amidsequenzenen
Die obigen Peptide der Beispiele 1 bis 3 werden auf dem sogenannten Wang-Harz (p-Alkoxybenzylalacoholharz (Bachem, 0,54 mmol/g)) unter Verwendung von mit Fmoc geschützten Aminosäuren (Applied Biosystems, Inc.) zusammengesetzt, von dem Harz gespalten, entschützt und auf eine ähnliche Art wie in Beispiel 1 gereinigt. Bei der Analyse werden Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) und Lösungsmittel B (0,1% TFA in ACN) verwendet. Dann wird eine analytische RP-HPLC (Gradient 30% bis 60% Lösungsmittel B in Lösungsmittel A über 30 Minuten) des lyophilisierten Peptids durchgeführt, um die Retentionszeit des Peptidprodukts zu bestimmen. Elektrospraymassenspektrometrie stellt eine experimentell bestimmte (M) zur Verfügung.
BEISPIELE A BIS D
Verwendete Reagenzien
GLP-1 wurde von Bachem (Torrance, CA) erworben, alle anderen Peptide wurden im Hause unter Verwendung von Synthesemethoden wie den hierin beschriebenen hergestellt. Alle Chemikalien waren vom höchsten kommerziellen Grad. Der cAMP SPA Immunoassay wurde von Amersham erworben. Die Radioliganden wurden von New England Nuclear (Boston, MA) erworben. RINm5f-Zellen (American Type Tissue Collection, Rockville, MD) wurden in DME/F12-Medium, welches 10% fötales bovines Serum und 2 mM L-Glutamin enthielt, wachsen gelassen. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂/95% befeuchteter Luft wachsen gelassen, und Medium wurde alle 2 bis 3 Tage ersetzt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, dann geerntet und unter Verwendung eines Polytron-Homogenisierers homogenisiert. Zellhomogenate wurden bis zur Verwendung gefroren bei –70°C gelagert.
Beispiel A
GLP-1-Rezeptorbindungsstudien
Die Rezeptorbindung wurde durch Messung der Verdrängung von [¹²⁵I] humanen GLP-1 (7–36) oder [¹²⁵I] Exendin (9–39) von RINm5f Membranen beurteilt. Der Testpuffer enthielt 5 μg/ml Bestatin, 1 μg/ml Phosphoramidon, 1 mg/ml bovines Serumalbumin (Fraktion V), 1 mg/ml Bacitracin und 1 mM MgCl₂ in 20 mM HEPES, pH 7,4. Um die Bindung zu messen, wurden 30 μg Membranprotein (Bradford Protein assay) in 200 μl Testpuffer resuspendiert und mit 60 pM [¹²⁵I] humanem GLP-1 oder Exendin (9–39) und unmarkierten Peptiden für 120 Minuten bei 23°C in 96 Well-Platten (Nagle Nunc, Rochester, NY) inkubiert. Die Inkubationen wurden durch schnelle Filtration mit kalter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung, pH 7,4, durch mit Polyethylenimin behandelte GF/B-Glasfiberfilter (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) unter Verwendung eines Tomtec Mach II Plattenerntegeräts (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) beendet. Die Filter wurden getrocknet, mit Szintillationsflüssigkeit kombiniert und die Radioaktivität in einem Betaplate flüssigen Szintillationszähler (Wallac Inc.) bestimmt.
Peptidproben wurden in dem Test als duplikate Punkte bei 6 Verdünnungen über einen Konzentrationsbereich von 10^–6 M bis 10^–12 M laufen gelassen, um Antwortkurven zu bestimmen. Die biologische Aktivität einer Probe wird als ein IC₅₀-Wert angegeben, berechnet aus den Rohdaten unter Verwendung eines iterativen Kurvenanpassungsprogramms unter Verwendung einer logischen Gleichung mit 4 Parametern (Prism, GraphPAD Software).
BEISPIEL B
Cyclase-Aktivierungsstudie
Der Testpuffer enthielt 10 μM GTP, 0,75 mM ATP, 2,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Phosphocreatin, 12,5 U/ml Creatinkinase, 0,4 mg/ml Aprotinin, 1 μM IBMX in 50 mM HEPES, pH 7,4. Membranen und Peptide wurden in 100 ml Testpuffer in 96 Well-Platten mit Filterunterseite (Millipore Corp., Redford, MA) zusammengegeben. Nach 20 Minuten der Inkubation bei 37°C wurde der Test durch Transfer des Überstands durch Filtration in eine frische 96 Well-Platte unter Verwendung eines Millipore Vakuum-Mehrfachverteilers beendet. Der Gehalt an cAMP in den Überständen wurde durch einen SPA-Immunassay quantifiziert.
Peptidproben wurden in dem Test als triplikate Punkte bei 7 Verdünnungen über einen Konzentrationsbereich von 10^–6 M bis 10^–12 M gemessen, um Antwortkurven herzustellen. Die biologische Aktivität einer bestimmten Probe wurde als ein EC₅₀-Wert angegeben, wie oben beschrieben berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I tabelliert. TABELLE I Aktivität in dem RINm5f Cyclase-Test

EC₅₀

Exendin-4 [SEQ ID NO: 2] 0,23

Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] 0,17

Verbindung 2 [SEQ ID NO: 6] 0,23

Verbindung 3 [SEQ ID NO: 7] 0,42
Beispiel C
Bestimmung des Blutglucosespiegels in db/db Mäusen – 1 Stundenprotokoll
C57BL/6J-m=/=Lepr^db-Mäuse mit mindestens 3 Monaten Alter wurden für die Studie verwendet. Die Mäuse wurden von dem Jackson Laboratory erhalten und durften sich für mindestens 1 Woche in dem Vivarium aklimatisieren. Die Mäuse wurden in Gruppen von 10 bei 22° ± 1°C bei einem 12:12 Hell:Dunkelzyklus beherbergt, wobei die Lichter um 6:00 Uhr morgens angingen.
Allen Tieren wurden 2 Stunden vor der Entnahme von Blutproben für die Basislinie das Essen weggenommen. Etwa 100 μl Blut wurden von jeder Maus über Einstich ins Auge nach leichter Anästhesie mit Methophan entnommen. Nach der Entnahme der Blutproben für die Basislinie zur Messung von Plasmaglucosekonzentrationen erhielten alle Tiere eine subkutane Injektionen entweder von Träger, von Exendin-4 oder von Testverbindung in den angegebenen Konzentrationen. Nach genau 1 Stunde nach den Injektionen wurden unter Verwendung der gleichen Prozedur wieder Blutproben entnommen, und Plasmaglucosekonzentrationen wurden gemessen.
Bei jedem Tier wurde die prozentuale Veränderung in dem Plasmawert gegenüber dem Basislinien-Wert berechnet und eine Dosis-abhängige Beziehung wurde unter Verwendung von Graphpad Prizm^TM Software evaluiert.
1 zeigt die Effekte der Variation der Dosis von Exendin-4 und Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] auf die Plasmaglucosespiegel.
Beispiel D
Die folgende Studie wurde ausgeführt, um die Effekte von Exendin-4, Exendin-4-Säure und eines Exendin-Agonisten (Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5]) auf die Entleerung des Magens bei Ratten zu untersuchen. Dieses Experiment folgte einer Modifikation des Verfahrens von Scarpignato, et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286–94 (1980).
Es wurden männliche Harlan Sprague Dawley (HSD) Ratten verwendet. Alle Tiere wurden bei 22,7 ± 0,8°C in einem 12:12 Stunden Hell:Dunkelzyklus beherbergt (wobei Experimente während des hellen Zyklus durchgeführt wurden), und wurden ad libitum gefüttert und mit Wasser versorgt (Diät LM-485, Teklad, Madison, WI). Exendin-4 und Exendin-4-Säure wurden nach Standardpeptidsyntheseverfahren synthetisiert. Die Herstellung von Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] ist in Beispiel 1 beschrieben.
Die Bestimmung des Entleerens des Magens durch das unten beschriebene Verfahren wurde nach einem Fasten von ~20 Stunden durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Magen keinen Speisebrei enthalten würde, der mit spektrophotometrischen Absorptionsmessungen wechselwirken könnte.
Ratten bei Bewusstsein erhielten über eine Magensonde 1,5 ml eines akalorischen Gels, welches 1,5% Methylcellulose (M-0262, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) und 0,05% Phenolrot-Indikator enthielt. 20 Minuten nach der Magensondierung wurden die Ratten unter Verwendung von 5% Halothan anästhesiert, der Magen freigelegt und unter Verwendung von Arterienzangen an den pylorischen und unteren Speiseröhrenschließmuskeln verschlossen, entfernt und in eine alkalische Lösung geöffnet, welche auf ein festes Volumen eingestellt wurde. Der Mageninhalt ergab sich aus der Intensität des Phenolrots in der alkalischen Lösung, gemessen durch Absorption bei einer Wellenlänge von 560 nm. Bei getrennten Experimenten bei 7 Ratten wurden der Magen und der Dünndarm beide ausgeschnitten und in eine alkalische Lösung geöffnet. Die Menge an Phenolrot, welches aus dem oberen Gastrointestinaltrakt innerhalb von 20 Minuten nach Sondierung wiedergewonnen werden konnte, war 89 ± 4%; Farbstoff, welcher unwiderruflich an die luminale Oberfläche des Eingeweides zu binden schien, könnte den Rest ausgemacht haben. Um eine maximale Wiedergewinnung von weniger als 100 Farbstoff zu berücksichtigen, wurde der Prozentsatz von Mageninhalt, der nach 20 Minuten verblieb, als ein Anteil des Mageninhalts ausgedrückt, der von Kontrollratten wiedergewonnen wurde, die in dem gleichen Experiment direkt nach der Sondierung geopfert wurden. Prozent Restmageninhalt = (Absorption nach 20 min)/(Absorption bei 0 min) × 100.
In Studien zur Basislinie ohne medikamentöse Behandlung wurde die Entleerung des Magens über 20 Minuten bestimmt. In Dosisantwortstudien wurden Ratten mit 0,01, 0,1, 0,3, 1, 10 und 100 μg Exendin-4, 0,01, 0,03, 0,1, 1, 10 und 100 μg Exendin-4-Säure und 0,1, 0,3, 1, 10 und 100 μg Verbindung 1 [SEQ ID NO: 5] behandelt.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die in 2 und Tabelle II gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Exendin-Agonisten Exendin-4-Säure und Verbindung 1 starke Inhibitoren des Entleerens des Magens sind. Der E₅₀ von Exendin-4 war 0,27 μg. Die EC₅₀s von Exendin-4-Säure und von Verbindung 1 waren vergleichbar (jeweils 0,12 μg und 0,29 μg). TABELLE II

Verbindung EC₅₀ (μg)

Exendin-4 0,27

Exendin-4-Säure 0,12

Verbindung 1 0,29

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptidverbindung der Formel (I) [SEQ ID Nr: 4], wobei die Peptidverbindung Exendin-Agonistaktivität aufweist, als Wirkstoff zur Herabsetzung der gastrointestinalen Motilität und zur Verlangsamung der Magenentleerung, wobei die Verbindung eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NOs: 5, 6 und 7, hat.
Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Regulation der gastrointestinalen Motilität im Zusammenhang mit einer Funktionsstörung, bei der die Herabsetzung der gastrointestinalen Motilität therapeutisch wäre.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Regulation der gastrointestinalen Motilität eine Verlangsamung der Magenentleerung umfaßt.