DE68929217T2

DE68929217T2 - Insulinotropes hormon

Info

Publication number: DE68929217T2
Application number: DE68929217T
Authority: DE
Inventors: F. Habener
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1989-03-20
Publication date: 2000-11-30
Anticipated expiration: 2009-03-21
Also published as: EP0464022A4; WO1990011296A1; ATE193541T1; EP0464022A1; DE68929217D1; CA1341363C; EP0464022B1; JPH04504246A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Entdeckung, daß bestimmte Peptidfragmente des Prähormons Proglukagon hormonelle Aktivitäten besitzen und zur Stimulierung der Synthese und Sekretion des Hormons Insulin verwendet werden können. Diese Peptidfragmente sind in der Therapie für die Krankheit Diabetes mellitus nützlich.

Beschreibung des Standes der Technik

Die endokrinen Sekretionen der Pankreasinseln stehen unter der komplexen Steuerung nicht nur von durch Blut übertragenen Metaboliten (Glukose, Aminosäuren, Katecholaminen usw.) sondern auch von lokalen parakrinen Einflüssen. Die Haupthormone der Pankreasinseln (Glukagon, Insulin und Somatostatin) stehen unter ihren spezifischen Zelltypen (A-, B- bzw. D- Zellen) zur Modulierung sekretorischer Reaktionen, die von den Metaboliten vermittelt werden, in Wechselwirkung. Obwohl die Insulinsekretion vorwiegend durch den Blutglukosespiegel gesteuert wird, stimuliert Glukagon bzw. hemmt Somatostatin die glukosevermittelten Insulinsekretionsreaktionen. Zusätzlich zu der vorgebrachten parakrinen Regulierung der Insulinresekretion innerhalb der Inseln gibt es Hinweise auf das Vorhandensein insulinotroper Faktoren im Darm. Dieses Konzept stammt von den Beobachtungen, daß Glukose, oral eingenommen, ein viel stärkeres Stimulans der Insulinsekretion ist als eine vergleichbare, intravenös verabreichte Glukosemenge.
Das humane Hormon Glukagon ist ein 29-Aminosäuren Peptidhormon, das in den A-Zellen des Pankreas erzeugt wird. Das Hormon gehört zu einer Multigen- Familie strukturell verwandter Peptide, die Sekretin, gastrisches inhibitorisches Peptid, vasoaktives intestinales Peptid und Enteroglukagon umfassen. Diese Peptide regulieren unterschiedlich den Kohlenhydratstoffwechsel, die gastrointestinale Mobilität und die sekretorische Verarbeitung. Die wesentlichen, anerkannten Wirkungen von pankreatischem Glukagon sind jedoch die Förderung der Glykogenolyse und Glukoneogenese, was zu einer Erhöhung des Blutzuckerspiegels führt. In diesem Zusammenhang sind die Wirkungen von Glukagon zu jenen von Insulin gegenregulatorisch und können zur Hyperglykämie beitragen, die Diabetes mellitus begleitet (Lund, P. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79: 345-349 (1982)).
Es hat sich gezeigt, daß Glukagon zur Bindung an spezifische Rezeptoren imstande ist, die an der Oberfläche insulinproduzierender Zellen liegen. Wenn Glukagon an diese Rezeptoren gebunden ist, stimuliert es die rasche Synthese von cAMP durch diese Zellen. Zu cAMP seinerseits wurde gefunden, daß es die Insulinexpression stimuliert (Korman, L. Y., et al., Diabetes 34: 717-722 (1985)). Insulin wirkt zur Hemmung der Glukagonsynthese (Review of Medical Physiology, Ganong, W. F., 1979, Lang Publications, Los Altos, Kalifornien (S. 273)). Somit wird die Expression von Glukagon sorgfältig durch Insulin und schließlich durch den Serumglukosespiegel reguliert.
Das Glukagongen wird zunächst von einem 630-Basenpaar Vorläufer zur Bildung des Polypeptids Präprogylkagon translatiert (Lund et al., (1982)). Dieses Polypeptid wird anschließend zur Bildung von Proglukagon verarbeitet. Patzelt, C., et al. (Nature 282: 260-266 (1979)) zeigten, daß Proglukagon anschließend in Glukagon und ein zweites Polypeptid gespalten wird. Die folgenden Arbeiten von Lund, P. K., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 345-349 (1982)); Lopez, L. C., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5485-5489 (1983)) und Bell, G. L, et al. (Nature 302: 716-718 (1983)) zeigten, daß das Proglukagonmolekül unmittelbar nach den Lysin-Arginin-Dipeptidresten gespalten wurde. Studien von Proglukagon, das vom Katzenwels (Ictalurus punctata) produziert wird, zeigten, daß Glukagon von diesem Tier auch proteolytisch nach benachbarten Lysin-Arginin- und Arginin-Arginin- Dipeptidresten gespalten wird (Andrews, P. C., et al., J. Biol. Chem. 260: 3910-3914 (1985)). Lopez. L. C., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5485-5489 (1983)) und Bell, G. L, et al., entdeckten, daß Säugetier-Proglukagon an Lysin-Arginin- und Arginin-Arginin-Dipeptiden gespalten wird, und zeigten, daß das Proglukagonmolekül drei einzelne und hochhomologe Peptidmoleküle enthält, die als Glukagon, glukagonartiges Protein 1 (GLP-1) und glukagonartiges Protein 2 (GLP-2) bezeichnet wurden. Lopez et al. schlossen, daß das glukagonartige Protein 1 37 Aminosäurereste lang ist, und daß das glukagonartige Protein 2 34 Aminosäurereste lang ist. Analoge Studien zur Struktur von Ratten-Präproglukagon enthüllten ein ähnliches Muster einer proteolytischen Spaltung zwischen benachbarten Lysin-Arginin- und Arginin-Arginin-Dipeptidresten, die zur Bildung von Glukagon, GLP-1 und GLP-2 führt (Heinrich, G., et al., Endocrinol. 115: 2176-2182 (1984)). Es hat sich gezeigt, daß humane, Ratten-, Rinder- und Hamstersequenzen von GLP-1 identisch sind (Ghiglione, M., et al., Diabetologia 27: 599-600 (1984)).
Der Schluß, zu dem Lopez et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5485-5489 (1983)) in bezug auf die Größe von GLP-1 gelangten, wurde durch die Arbeit von Uttenthal, L. O., et al. (J. Clin. Endocrinol. Metabol. 61: 472-479 (1985)) bestätigt. Uttenthal et al. prüften die molekularen Formen von GLP-1, die im menschlichen Pankreas vorhanden sind. Ihre Forschung zeigt, daß GLP-1 und GLP-2 im Pankreas in Form von Proteinen mit 37 bzw. 34 Aminosäureresten vorhanden sind.
Die Ähnlichkeit zwischen GLP-1 und Glukagon, ließ früher Forscher schließen, daß GLP-1 biologische Aktivität besitzen könnte. Obwohl einige Forscher feststellten, daß GLP1 Rattengehirnzellen veranlassen konnte, cAMP zu synthetisieren (Hoosein, N. M., et al., FEBS Lett. 178: 83-86 (1984)), gelang es anderen Forschern nicht, eine physiologische Rolle für GLP-1 zu identifizieren (Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5485-5489 (1983)). Die nicht mögliche Identifizierung einer physiologischen Rolle für GLP-1 ließ einige Forscher rätseln, ob GLP-1 tatsächlich ein Hormon ist und ob die Verwandtschaft zwischen Glukagon und GLP-1 künstlich hervorgerufen sein könnte (Ghiglione, M., et al., Diabetologia 27: 599-600 (1984).
Somit enthüllt der Stand der Technik zusammenfassend das Wissen um die Verarbeitung eines Glukagonhormonvorläufers zu einem Satz von Peptiden, die eine umfassende Homologie aufweisen. Es wird allgemein von Fachleuten angenommen, daß diese eng verwandten, glukagonartigen Peptide eine biologische Aktivität aufweisen. Dennoch waren umfassende Untersuchungen, welche die biologischen Wirkungen dieser Moleküle erhellen sollten, nicht erfolgreich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, welche entweder (A) ein Peptid mit der Sequenz
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-S er-S er-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys; oder
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly; oder
(B) ein Peptid, das mindestens 80% Homologie mit dem einen oder dem anderen der Peptide gemäß (A) aufweist, mit der Maßgabe, daß das Peptid nicht GLP-1 7-36, GLP-1 7-37 oder GLP-1 1-36 ist, oder
(C) ein Peptid ist, das
i) ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz der Peptide gemäß (A) oder (B);
ii) ein pharmazeutisch akzeptables Carboxylatsalz der Peptide gemäß (A) oder (B);
iii) ein pharmazeutisch akzeptabler niedriger Alkylester der Peptide gemäß (A) oder (B); und/oder
iv) ein pharmazeutisch akzeptables Amid, Alkylamid oder Dialkylamid von i), ii) und/oder iii) ist;
wobei die Verbindung im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist und eine insulinotrope Aktivität aufweist, die die insulinotrope Aktivität von GLP-1 (1-36) oder GLP-1 (1-37) übersteigt.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Verbindung der Erfindung, welche ein Peptid mit der Sequenz
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys; oder
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly
ist.
Vorzugsweise sind die Verbindungen der Erfindung im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen und weisen eine insulinotrope Aktivität bei einer Konzentration von wenigstens 10&supmin;¹¹ M auf, und insbesondere bei einer Konzentration von wenigstens 10&supmin;¹&sup0; M.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung auch eine Verbindung mit der allgemeinen Formel:
(1) H&sub2;N--X--CO-R¹
bereit, in welcher R¹ OH, OM oder -NR²R³ ist;
M ein pharmazeutisch akzeptables Kation oder eine niedrige verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe ist;
R² und R³ gleich oder verschieden sind und jeder ein Wasserstoffatom oder eine niedrige verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe darstellt;
X ein die Sequenz
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys; oder
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly
aufweisendes Peptid ist, worin NH&sub2; die Aminogruppe des Amino-Terminus von X ist, mit der Maßgabe, daß X nicht GLP-1 7-36, GLP-1 7-37, GLP-1 1-36 oder GLP-1 1-37 ist, und
CO die Carbonylgruppe des Carboxy-Terminus von X ist; oder
(2) ein Säureadditionssalz davon ist;
(3) die geschützten oder teilweise geschützten Derivate davon sind;
wobei die Verbindung eine insulinotrope Aktivität aufweist, welche die insulinotrope Aktivität von GLP-1 (1-36) oder GLP-1 (1-37) übersteigt. In weiteren Aspekten stellt die Erfindung:
i) ein insulinotropes Medikament, welches eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem passenden physiologisch verträglichen Träger enthält;
ii) eine Verbindung für die Verwendung in der Medizin; und
iii) die Verwendung der Verbindung der Erfindung bei der Herstellung eines Mittels zur Verstärkung der Expression von Insulin in einer Säugetier- Pankreasinselzelle vom B-Typ bereit.
Die Dokumente WO-A-8706941, The Lancet, 5. Dezember 1987, 1300-1393, und Glukagon and Related Peptides Proceedings of International Symposium, Osaka, 15.-16. Juli 1988, und Biomedical Research, 9(3), 201-206 (1988), betreffen alle glukagonartige Peptide, aber diese Dokumente offenbaren GLP-1 (7-36) und (7-37).

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die DNA-Struktur und entsprechende Aminosäuresequenz des Ratten-Präproglukagons. Der Präproglukagonvorläufer wird an den Stellen, die durch Kreise gekennzeichnet sind, proteolytisch gespalten.
Fig. 2 zeigt die Fähigkeit der insulinotropen Peptide Glukagon und GLP-1 (7-37), die cAMP-Bildung in der Insulinomlinle RIN 1046-3 8 zu stimulieren.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der insulinotropen Aktivität von Glukagon mit jener von GLP-1 (7-37).
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der insulinotropen Aktivitäten von GLP-1 (7- 34), GLP-1 (7-35) und GLP-1 (7-37) unter Verwendung der Rattenpankreas- Perfusionstechnik.
Fig. 5 zeigt den Abbau von GLP-1 (1-37) zu GLP-1 (7-37) unter Versuchsbedingungen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

A. GLP-1 und seine Derivate

Es ist bekannt, daß das Hormon Glukagon als Vorläufermolekül mit hohem Molekulargewicht synthetisiert wird, das anschließend proteolytisch in drei Peptide gespalten wird: Glukagon, glukagonartiges Peptid 1 (GLP-1) und glukagonartiges Peptid 2 (GLP2). GLP-1 hat in seiner unverarbeiteten Form 37 Aminosäuren. Die vorliegende Erfindung offenbart, daß das unverarbeitete GLP-1 im wesentlichen nicht imstande ist, die Auslösung der Insulinbiosynthese zu vermitteln. Das unverarbeitete GLP-1 Peptid wird jedoch von Natur aus zu einem 31-Aminosäuren langen Peptid (7-37 Peptid) mit Aminosäuren 7-37 von GLP-1 ("GLP-1 (7-37)") umgewandelt. Diese Verarbeitung erfolgt im Pankreas und im Darm. Das 7-37 Peptid, das zuvor nicht beschrieben wurde, ist ein Hormon, das insulinotrope Aktivität aufweist. Von einer Verbindung wird behauptet, daß sie "insulinotrope Aktivität" aufweist, wenn sie imstande ist, die Synthese oder Expression des Hormons Insulin zu stimulieren oder dessen Stimulierung zu veranlassen. Die hormonelle Aktivität von GLP-1 (7-37) scheint für die pankreatischen Betazellen spezifisch zu sein, wo sie die Biosynthese von Insulin auszulösen scheint. Das insulinotrope Hormon ist in der Studie der Pathogenese des nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus nützlich, eines Zustandes, in dem die Dynamik der Insulinsekretion anormal ist. Weiters ist das insulinotrope Hormon in der Therapie für diese Erkrankung nützlich.
Peptidteile (-fragmente), die aus der bestimmten Aminosäuresequenz von humanem GLP-1 gewählt werden, bilden den Ausgangspunkt in der Entwicklung, welche die vorliegende Erfindung umfaßt. Die untereinander austauschbaren Begriffe "Peptidfragment" und "Peptidteil" sollen sowohl die synthetischen als auch die in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenzen beinhalten, die von einer in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz ableitbar sind.
Die Aminosäuresequenz für GLP-1 wurde von mehreren Forschern berichtet (Lopez, L. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 5485-5489 (1983); Bell, G. L, et al., Nature 302: 716-718 (1983); Heinrich, G., et al., Endocrinol. 115: 2176-2181 (1984); Ghiglione, M., et al., Diabetologia 27: 599-600 (1984)). Die Struktur des Präproglukagongens und seiner entsprechenden Aminosäuresequenz ist in Fig. 1 dargestellt. Diese Figur zeigt weiters die proteolytische Verarbeitung des Vorläufergenproduktes in Glukagon und die beiden glukagonartigen Peptide. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff GLP-1 (1-37) ein GLP-1 Polypeptid mit allen Aminosäuren von 1 (N-Terminus) bis 37 (C-Terminus). Ebenso bezeichnet GLP-1 (7-37) ein GLP-1 Polypeptid mit allen Aminosäuren von 7 (N-Terminus) bis 37 (C-Terminus).
In einem Ausführungsbeispiel werden GLP-1 (7-37) und seine Peptidfragmente durch herkömmliche Mittel synthetisiert, wie durch die allgemein bekannte Festphasenpeptidsynthese, die von Merrifield, J. M. (Chem. Soc. 85: 2149 (1962)) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman, San Francisco, 1969), S. 27-66) beschrieben ist, die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden. Es ist jedoch auch möglich, Fragmente des Proglukagonpolypeptids oder von GLP-1 durch Fragmentieren der in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz zu erhalten, wobei zum Beispiel ein proteolytisches Enzym verwendet wird. Weiters ist es möglich, die gewünschten Fragmente des Proglukagonpeptids oder von GLP-1 durch die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie zu erhalten, die von Maniatis, T., et al., in: Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1982), offenbart wurde, das durch Bezugnahme hier aufgenommen wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Peptide, die von GLP-1 (1-37) ableitbar sind. Ein Peptid wird als "von einer in der Natur vorkommenden Sequenz ableitbar" bezeichnet, wenn es durch Fragmentieren einer in der Natur vorkommenden Sequenz erhalten werden kann, oder wenn es, basierend auf der Kenntnis der Sequenz der in der Natur vorkommenden Aminosäuresequenz oder des genetischen Materials (DNA oder RNA), das für diese Sequenz kodiert, synthetisiert werden kann.
Im Umfang der vorliegenden Erfindung sind jene Moleküle enthalten, die als "Derivate" von GLP-1 (1-37) bezeichnet werden. Ein solches "Derivat" hat die folgenden Eigenschaften: (1) es teilt eine wesentliche Homologie mit GLP-1 (1-37) oder einem ähnlich großen Fragment von GLP-1 (1-37), (2) es kann als insulinotropes Hormon fungieren; und (3) unter Verwendung von zumindest einem der hierin bereitgestellten Tests hat das Derivat entweder (i) eine insulinotrope Aktivität, welche die insulinotrope Aktivität entweder von GLP-1 (1-37) oder GLP-1 (1-36) überschreitet, oder vorzugsweise (ii) eine insulinotrope Aktivität, die selbst dann nachgewiesen werden kann, wenn das Derivat in einer Konzentration von 10&supmin;¹&sup0; M vorliegt, oder insbesondere (iii) eine insulinotrope Aktivität, die selbst dann nachgewiesen werden kann, wenn das Derivat in einer Konzentration von 10&supmin;¹¹ M vorliegt.
Von einem Derivat von GLP-1 (1-37) wird behauptet, daß es eine "wesentliche Homologie" mit GLP-1 (1-37) teilt, wenn die Aminosäuresequenz des Derivates mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu 90% und insbesondere mindestes zu 95% gleich jener von entweder GLP-1 (I-37) oder einem Fragment von GLP-1 (1-37) ist, das dieselbe Anzahl von Aminosäureresten wie das Derivat hat.
Die Derivate der vorliegenden Erfindung umfassen GLP-1 (1-37) Fragmente, die zusätzlich zu einer Sequenz, die im wesentlichen homolog zu jener eines in der Natur vorkommenden GLP-1 (1-37) Peptids ist, auch eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren an ihren Amino- und/oder ihren Carboxytermini enthalten können. Somit betrifft die Erfindung Polypeptidfragmente von GLP-1 (1-37), die eine oder mehrere Aminosäuren enthalten können, die in der in der Natur vorkommenden GLP-1 (1-37) Sequenz nicht enthalten sein mögen, vorausgesetzt, daß solche Polypeptide eine insulinotrope Aktivität aufweisen, die jene von GLP-1 (1-37) oder GLP-1 (1-36) überschreitet.
Ebenso umfaßt die Erfindung GLP-1 (1-37) Fragmente, die zwar eine Sequenz enthalten, die im wesentlichen zu jener eines in der Natur vorkommenden GLP-1 (1-37) Peptids homolog ist, welchen aber eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren an ihren Amino- und/oder ihren Carboxytermini fehlen können, die von Natur aus in einem GLP-1 (1-37) Peptid vorgefunden werden. Somit betrifft die Erfindung Polypeptidfragmente von GLP-1 (1-37), welchen eine oder mehrere Aminosäuren fehlen können, die für gewöhnlich in einer in der Natur vorkommenden GLP-1 (1-37) Sequenz vorhanden sind, vorausgesetzt, solche Polypeptide haben eine insulinotrope Aktivität, die jene von GLP-1 (1-37) oder GLP1 (1-36) überschreitet.
Die Erfindung umfaßt auch die offensichtlichen oder trivialen Varianten der zuvor beschriebenen Fragmente, die bedeutungslose Aminosäuresubstitutionen aufweisen (und somit Aminosäuresequenzen haben, die sich von jener der natürlichen Sequenz unterscheiden), vorausgesetzt, solche Varianten haben eine insulinotrope Aktivität, die im wesentlichen mit jener der zuvor beschriebenen GLP- 1 Derivate identisch ist. Zu Beispielen für offensichtliche oder triviale Substitutionen zählen die Substitution eines Basenrestes für einen anderen (d. h. Arg anstelle von Lys), die Substitution eines hydrophoben Restes für einen anderen (d. h., Leu anstelle von Ile) oder die Substitution eines aromatischen Restes für einen anderen (d. h. Phe anstelle von Tyr) usw.
Zu Beispielen für Derivate von GLP-1 (1-37) zählen GLP-1 (7-37); GLP-1 (7-36); GLP-1 (7-35); GLP-1 (7-34); und die des-Gly amidierten Formen dieser Moleküle. Ebenso enthalten ist die Verwendung zusätzlicher Aminosäurereste, die solchen Sequenzen hinzugefügt werden, um die Kopplung an Trägerprotein zu verstärken, oder von Aminosäureresten, die zur Verstärkung der insulinotropen Wirkung hinzugefügt werden.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, können die Aminosäurereste in ihrer geschützten oder ungeschützten Form vorliegen, wobei geeignete Amino- oder Carboxylschutzgruppen verwendet werden. Zweckdienliche Kationen sind Alkali- oder Erdalkalimetallkationen (d. h., Na, K, Li, 1/2Ca, 1/2Ba usw.) oder Aminkationen (d. h., Tetraalkylammonium, Trialkylammonium, wobei Alkyl C&sub1;-C&sub1;&sub2; sein kann).
Die Peptide variabler Länge können dann die Form der freien Amine (am N- Terminus) oder deren Säureadditionssalze aufweisen. Herkömmliche Säureadditionssalze sind Salze der Halogenwasserstoffsäure, d. h., HBr, HI oder vorzugsweise HCl.

B. Tests auf insulinotrope Aktivität

Die vorliegende Erfindung betrifft GLP-1 (1-37) Derivate, die eine insulinotrope Aktivität aufweisen, welche die insulinotrope Aktivität von entweder GLP-1 (1-37) oder GLP-1 (1-36) überschreitet. Die insulinotrope Eigenschaft einer Verbindung kann bestimmt werden, indem diese Verbindung tierischen Zellen zugeführt wird, oder indem diese Verbindung Tieren injiziert wird, und die Freisetzung von immunoreaktivem Insulin (IRI) in die Medien bzw. das zirkulatorische System des Tieres aufgezeichnet wird. Die Gegenwart von IRI wird durch die Verwendung eines Radioimmunoassays nachgewiesen, der Insulin spezifisch nachweisen kann. Obwohl jeder Radioimmunoassay verwendet werden kann, der die Gegenwart von IRI nachweisen kann, wird bevorzugt, eine Modifizierung der Testmethode von Albano, J. D. M., et al. (Acta Endocrinol. 70: 487- 509 (1972)) zu verwenden. Bei dieser Modifizierung wurde ein Phosphat/Albuminpuffer mit einem pH von 7,4 verwendet. Die Inkubation wurde mit der Folgebedingung von 500 ul Phosphatpuffer, 50 ul Perfusatprobe oder Ratteninsulinstandard in Perfusat, 100 ul Anti-Insulinantiserum (Wellcome Laboratories; 1: 40000 Verdünnung) und 100 ul [¹²&sup5;I] Insulin vorbereitet, wodurch ein Gesamtvolumen von 750 ul in einem 10 · 75 mm Einwegglasröhrchen erhalten wurde. Nach der Inkubation über 2-3 Tage bei 4ºC wurde freies Insulin von dem antikörpergebundenen Insulin durch Aktivkohleabtrennung getrennt. Die Testempfindlichkeit betrug 1-2 uE/ml. Zur Messung der Freisetzung von IRI in das Zellkulturmedium von Zellen, die in Gewebekultur gezüchtet wurden, wird vorzugsweise ein radioaktiver Marker in Proinsulin eingebracht. Obwohl jeder radioaktive Marker verwendet werden kann, der ein Polypeptid markieren kann, ist die Verwendung von ³H Leucin bevorzugt, um eine Proinsulinmarkierung zu erhalten. Die Markierung kann über jeden Zeitraum erfolgen, der die Bildung eines nachweisbar markierten Pools von Proinsulinmolekülen ermöglicht; es ist jedoch bevorzugt, Zellen in der Gegenwart eines radioaktiven Markers über einen Zeitraum von 60 Minuten zu inkubieren. Obwohl jede Zellinie, die zur Expression von Insulin imstande ist, zur Bestimmung verwendet werden kann, ob eine Verbindung eine insulinotrope Wirkung hat, wird die Verwendung von Ratteninsulinomzellen bevorzugt, und insbesondere von RIN-38 Ratteninsulinomzellen. Solche Zellen können in jedem geeigneten Medium gezüchtet werden; es ist jedoch bevorzugt, DME-Medium zu verwenden, das 0,1% BSA und 25 mM Glukose enthält.
Die insulinotrope Eigenschaft einer Verbindung kann auch durch pankreatische Infusion bestimmt werden. Die in situ isolierte, perfundierte Rattenpankreaszubereitung war eine Modifizierung des Verfahrens von Penhos, J. C. et al. (Diabetes 18: 733-738 (1969)). Gemäß einem derartigen Verfahren werden nüchterne Ratten (vorzugsweise männliche Albinoratten vom Charles River Stamm), mit einem Gewicht von 350-600 g, mit einer intraperitonealen Injektion von Amytal Sodium (Eli Lilly und Co., 160 ng/kg) anästhesiert. Nieren-, Nebennieren-, Magen- und untere Dickdarmblutgefäße werden ligiert. Der gesamte Darm wird reserziert, mit Ausnahme von etwa vier cm Duodenum und dem absteigenden Kolon und Rektum. Daher wird nur ein kleiner Teil des Darms perfundiert, wodurch eine mögliche Beeinflussung durch enterische Substanzen mit glukagonartiger Immunoreaktivität minimiert wird. Das Perfusat ist vorzugsweise ein modifizierter Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer mit 4% Dextran T70 und 0,2% Rinderserumalbumin (Fraktion V), und wird vorzugsweise mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; durchperlt. Eine Vierkanal-Rollenlagerpumpe mit pulsationsfreiem Strom (Buchler polystatic, Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Corp.) wird vorzugsweise verwendet, und das Umschalten von einer Perfusatquelle zu einer anderen wird vorzugsweise durch Umschalten eines Dreiweg-Sperrhahns ausgeführt. Die Art und Weise, in welcher die Perfusion durchgeführt, modifiziert und analysiert wird, folgt vorzugsweise den Methoden von Weir, G. C., et al. (J. Clin. Investigat. 54: 1403-1412 (1974)), die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden.

C. Formulierung insulinotroper Verbindungen

Die insulinotropen Peptide (oder Peptidderivate) von GLP-1 (1-37) können als therapeutische Zusammensetzungen verwendet werden. Solche therapeutischen Zusammensetzungen können nur aus den insulinotropen Peptiden (oder Peptidderivaten) bestehen, obwohl die Zusammensetzungen vorzugsweise die insulinotropen Peptide (oder deren Derivate) kombiniert gemischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff enthalten.
Geeignete Träger und deren Formulierung, enthaltend andere Humanproteine, z. B. Humanserumalbumin, sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Ausgabe, A. Oslo Ed Mack, Easton, PA (1980)) beschrieben. Zur Bildung einer pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzung, die zur effektiven Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge von GLP-1 (7-37) oder eines Derivates von GLP-1 (7-37), gemeinsam mit einer geeigneten Menge eines Trägerstoffes. Die GLP-1 Derivate solcher Verbindungen sind vorzugsweise gereinigt, so daß sie im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind. Ein Material wird als "frei von natürlichen Verunreinigungen" bezeichnet, wenn es im wesentlichen von Materialien gereinigt ist, mit welchen es normalerweise und von Natur aus vorgefunden wird. Beispiele für natürliche Verunreinigungen, mit welchen GLP-1 (7-37) verbunden sein könnte, sind: andere Peptide, Kohlenhydrate, glykosylierte Peptide, Lipide, Membrane usw. Ein Material wird auch als "frei von natürlichen Verunreinigungen" bezeichnet, wenn diese Verunreinigungen im wesentlichen in einer Probe des Materials fehlen.
Zusammensetzungen, die GLP-1 (7-37) oder seine Derivate enthalten, können intravenös, intramuskulär oder subkutan in Dosierungen im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 1000 ug/kg oder in Konzentrationen, die zur Erzeugung von Serumspiegeln von 10&supmin;¹&sup0; M bis 10&supmin;¹¹ M ausreichend sind, verabreicht werden, obwohl eine höhere oder geringere Dosierung verabreicht werden kann. Die erforderliche Dosierung hängt von der Schwere des Zustandes des Patienten und von Kriterien wie der Größe, dem Gewicht, dem Geschlecht, dem Alter und der medizinischen Geschichte des Patienten ab.
Zum Zwecke der parenteralen Verabreichung werden Zusammensetzungen, welche die Derivate von GLP-1 (7-37) enthalten, vorzugsweise in destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert wird vorzugsweise auf etwa 6 bis 8 eingestellt. Zur Erleichterung des Lyophilisierungsverfahrens, das ein geeignetes Produkt ergibt, kann der Lösung Laktose zugegeben werden. Vorzugsweise wird die Lösung dann gefiltert, sterilisiert, in Ampullen eingebracht und lyophilisiert. Die Konzentration der GLP-1 (1-37) Derivate in diesen Zusammensetzungen kann von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;&sup5; M schwanken.
Zur Steuerung der Wirkungsdauer können zusätzliche pharmazeutische Methoden verwendet werden. Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren für die Komplexbildung mit oder Adsorption von GLP-1 (1-37) Derivaten erreicht werden. Die kontrollierte Abgabe kann durch die Wahl geeigneter Makromoleküle (zum Beispiel Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und der Konzentration von Makromolekülen wie auch der Verfahren zur Einbringung, um die Freisetzung zu steuern, ausgeführt werden. Eine andere mögliche Methode zur Kontrolle der Wirkungsdauer durch Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung ist das Einbringen der Derivate von GLP-1 (1-37) in Partikel aus einem polymeren Material, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly(milchsäure) oder Ethylen-Vinylacetat-Copolymeren. Als Alternative zu dem Einbringen der GLP-1 (1-37) Derivate in diese polymeren Partikel ist es möglich, diese Derivate in Mikrokapseln einzuschließen, die zum Beispiel durch Koazervierungstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, zum Beispiel Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine- Mikrokapseln bzw. Poly(Methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Arzneimittelabgabesysteme, zum Beispiel Liposome, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Lehren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart.
Es ist möglich, die biologische Halbwertzeit der GLP-1 (1-37) Derivate der vorliegenden Erfindung zu verlängern und somit die Retention oder Stabilität der Derivate in einem Empfänger zu erhöhen, indem solche Derivate an eine oder mehrere chemischen "Einheiten" gebunden werden, um dadurch eine Verbindung zu erzeugen, die erkannt und in einem Empfänger verarbeitet werden kann, um ein GLP-1 (1-37) Derivat zu erhalten. Die "Einheiten" solcher Verbindungen können ein(en) oder mehrere Lipide, Kohlenhydrate, Aminosäurereste usw. enthalten. Eine bevorzugte "Einheit" ist ein Aminosäurerest. Die bevorzugteste "Einheit" ist ein Peptid. Der aminoterminale (Histidin-) Rest von GLP-1 (7-37) ist eine bevorzugte Stelle zur Bindung der "Einheit".
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ist bei Betrachtung der natürlichen Verarbeitung von GLP-1 (1-37) zu erkennen. GLP-1 (1-37) hat eine biologische Halbwertzeit von 30-50 Minuten. Eine natürliche Spaltung des aminoterminalen Hexapeptids, GLP-1 (1-6), tritt ein, um GLP-I (7-37) zu erhalten, dessen biologische Halbwertzeit nur 3-5 Minuten beträgt. Somit ist das aminoterminale Hexapeptid, GLP-1 (I-6) eine natürliche "Einheit", die, wenn sie an GLP-1 (7-37) gebunden ist, die biologische Halbwertzeit von GLP-1 (7-37) erhöht. Die Entdeckung einer solchen natürlichen "Einheit" ist in Fig. 5 offenbart und unterstützt das Konzept, daß zusätzliche oder alternative Einheiten auf dieselbe Weise wie GLP-1 (1-6) zur Erhöhung der biologischen Halbwertzeit der GLP-1 (1-37) Derivate der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Obwohl die vorliegende Erfindung die Verwendung von GLP-1 (1-6) als "Einheit" nicht umfaßt, beinhaltet sie Varianten von GLP-1 (I-6) wie auch anderer Peptide mit nicht verwandter Sequenz, die imstande sind, die Halbwertzeit der Peptide und Peptidderivate der Erfindung zu verlängern.
Zusammenfassend wird die Insulinsekretion von der β-Zelle des endokrinen Pankreas durch ein komplexes Netzwerk metabolischer Faktoren gesteuert. Zu diesem Netzwerk gehören verschiedene Komponenten, wie Glukose, Aminosäuren, Katecholamine und Peptide. Das Dekodieren des Glukagongens hat zwei zusätzliche, glukagonartige Peptide enthüllt, die in Proglukagon, dem Polypeptidvorläufer von Glukagon, kodiert sind. Eines dieser Peptide, das glukagonartige Peptid 1 (GLP-1) wird von Proglukagon zu zwei Formen verarbeitet: das 37-Aminosäuren GLP-1 (1- 37) und das 31-Aminosäuren GLP-1 (7-37). Die spezifische Freisetzung des GLP1 Peptids in den Darm und, bis zu einem gewissen Grad, in das Pankreas, ließ die Erfinder schließen, daß die GLP-1 Peptide Komponenten der Darm-Insel-Achse sein könnten. Zur Lösung dieser Frage wurden die Wirkungen der GLP-1 Peptide auf eine β-Zellinie unter Verwendung eines perfundierten Pankreas der Ratte und einer gezüchteten Ratteninsulinomzellinie untersucht. Diese Studien haben gezeigt, daß in dem isolierten, perfundierten Pankreas GLP-1 (7-37) ein starker Stimulator der Insulinsekretion bei Konzentrationen von nur 5 · 10&supmin;¹² M ist. Die Insulinfreisetzung als Reaktion auf GLP-1 (7-37) ist stark von der umgebenden Glukosekonzentration abhängig. Das längere Peptid (GLP-1 (1-37)) hat keine insulinfreisetzende Aktivität, auch nicht bei so hohen Konzentrationen wie 5 · 10&supmin;&sup7; M. Ein Vergleich der insulinotropen Wirkungen von GLP-1 (7-37) und Glukagon zeigt, daß (im perfundierten Pankreas der Ratte) GLP-1 (7-37) zumindest um das Hundertfache stärker bei der Stimulierung der Insulinsekretion ist. In der Ratteninsulinomzellinie (RIN 1046-38) erhöhte GLP-1 (7-37) bei Konzentrationen von 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;¹¹ M sowohl die zellulären Werte von cAMP (fünffach) als auch die Spiegel der Insulin mRNA (dreifach) und stimulierte auch die Insulinfreisetzung. Auch hier waren die Wirkungen von GLP-1 (7-37) stärker als jene von Glukagon. Die Größe der insulinotropen Wirkungen bei solch niederen Konzentrationen macht GLP-1 (7-37) zu einem der stärksten beschriebenen Insulinsekretagogen, einschließlich Glukagon und des gastrischen inhibitorischen Polypeptids. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß GLP-1 (7-37) an der physiologischen Regulierung der β- Zellfunktionen beteiligt sein könnte.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf spezifische Beispiele besser verständlich, die zur Veranschaulichung angeführt sind, und, wenn nicht anders angegeben, keine Einschränkung der Erfindung darstellen sollen.

SPEZIFISCHE BEISPIELE

BEISPIEL 1

Spezifität von GLP-1 Peptiden

Zur Demonstration, daß die Wirkungen von GLP-1 (1-37), GLP-1 (1-36) und GLP-1 (7-37) für Insulin spezifisch sind und nicht imstande sind, eine nichtspezifische Genexpression herbeizuführen oder auszulösen, wurde die Wirkung dieser Peptide auf die Werte von Insulin, Actin und Angiotensinogen mRNAs in Ratteninsulinomzellen verfolgt.
Ratteninsulinomzellen der Zellinie RIN-38 wurden von einer kontinuierlichen Inselzellinie RIN-r abgeleitet, die von einem transplantierbaren Ratteninselzelltumor etabliert wurde (Gazdar, A. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77: 3519-3523 (1980)). Die Zellen wurden in DMEM (Gibco) bei einer Glukosekonzentration von 4500 mg/l gehalten und mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (Gibco), 100 E/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ergänzt. Inkubationen wurden bei 37ºC in 95% Luft : 5 % CO&sub2; ausgeführt. Zellen, die in der zuvor beschriebenen Weise gezüchtet worden waren, wurden gewaschen und in DMEM (Gibco) resuspendiert, das 0,1% Rinderserumalbumin und 25 mM Glukose enthielt. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von insulinotropen Peptiden (d. H., Glukagon, GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37) oder GLP-1 (1-36 des-gly-arg Amid); Peninsula Laboratories) sechs Stunden inkubiert, wonach die Wirkungen dieser Mittel auf die mRNA Expression bestimmt wurden. In allen Fällen betrug die Konzentration von Peptiden 10&supmin;&sup7; M. Die Inkubationen dauerten sechs Stunden.
Boten RNAs, die für Insulin, Actin oder Angiotensinogen spezifisch sind, wurden wie folgt durch Northern Hybridisierung identifiziert: zelluläre RNA wurde von festen Tumoren und Zellen durch Homogenisierung in Guanidinthiocyanat und Sedimentation durch einen Cäsiumchloridpolster extrahiert. Poly A&spplus; RNA wurde durch oligo-dT Zellulosechromatographie isoliert (Aviv, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 1408-1412 (1972)). Zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA von jeder Probe wurden nach der Größe auf einem 1,4% Agarosegel nach der Denaturierung in Glyoxal fraktioniert, wonach eine Elektroübertragung auf eine Nylonmembran folgte (Nytran; Schleicher und Schuell). Geblottete Membrane wurden zwei Stunden bei 80ºC unter Vakuum gebacken, in 1 M NaCl/1% SDS/10% Dextransulfat bei 50ºC über Nacht vorhybridisiert und bei derselben Temperatur 24 h nach der Zugabe der markierten Sonden (3-5 · 10&sup5; cpm/ml) hybridisiert; sie wurden dann bei 55ºC zweimal in 1 · SCC (0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat)/1% SDS) gewaschen und über unterschiedliche Zeiträume bei -70ºC mit einer Verstärkerfolie einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die relativen Mengen der spezifischen mRNA wurden durch Mikrodensitometrie bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die glukagonartigen Peptide erhöhten die Werte der Insulin mRNA während der 24 h Inkubation (Tabelle 1). Die Erhöhung der Insulin mRNA Werte war als Reaktion auf das kürzere 31-Aminosäuren Peptid durchwegs höher; dreimal höher als Kontrollwerte bei 24 h. Diese stimulatorischen Wirkungen auf Insulin mRNA Werte und auf die Freisetzung von Insulin wurden in Gegenwart von hohen (25 mM) und nicht geringen (5,5 mM) Konzentrationen von Glukose beobachtet. Der Beweis, daß die stimulatorischen Wirkungen von GLP-1 relativ spezifisch für Insulin mRNA sind, wurde erhalten, indem gezeigt wurde, daß (i) GLP-1 (7-37) vernachlässigbare Wirkungen auf die Werte von Actin und Angiotensinogen mRNAs in der Insulinomzellinie hatte; (ii) Glukagon und GLP-II keine Wirkungen auf Insulin mRNA Werte hatten; und (iii) GLP-1 (7-37), wenn es der glukagonproduzierenden Ratteninselzellinie 1056A und zwei Hypophysenzellinien zugegeben wurde, wobei die eine Prolaktin (GH4) und die andere Kortikotropin (AtT-20) erzeugte, keine Wirkungen auf die Werte von Glukagon, Prolaktin bzw. Kortikotropin mRNAS hatte.
GLP-1(1-37) wurde geprüft, um zu bestimmen, ob es die Biosynthese einer mRNA anderer Hormone als Insulin auslösen konnte. Daher wurde GLP-1 (1-37) (bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup7; M) einer glukagonproduzierenden Ratteninselzellinie und zwei Hypophysenzellinien (GH4 und AtT-20), welche das Hormon Prolaktin bzw. ACTH produzieren konnten, zugegeben, und die Menge der produzierten hormonspezifischen mRNA wurde nach 24 Stunden wie zuvor beschrieben bestimmt. GLP-1 Peptide hatten keine nachweisbare Wirkung, weder auf den Wert der Prolaktin mRNA in GH4 Hypophysenzellen, noch auf den Wert der ACTH mRNA in AtT-20 Hypophysenzelle Tabelle 1. Densitometrische Quantifizierung der Wirkungen von glukonartigen Peptiden auf die Werte von Insulin und Actin
¹ Bestimmt durch Abtasten von Autoradiogrammen von RNA-Blots. Die Werte von Experiment 1 und 3 sind Mittel ± SEM dreifacher Zellplatten; die Werte von Experiment 2 sind Mittel von Duplikaten (die einzelnen Werte sind in Klammem angegeben). Die statistische Signifikanz zwischen Kontrolle und Versuchsbeobachtungen wurde mittels ungepaartem, zweiseitigen Student-t-Test berechnet.
² Keine Peptidzugabe.
³ p < 0,02.
&sup4; p < 0,05.
&sup5; p < 0,001.
A 48.7B.WP.

BEISPIEL 2

Wirkung von GLP-1 (7-37) auf die Transkription des Insulins und anderer Gene

Die Wirkung von GLP-1 (7-37) auf die Transkription des Insulin- und Actingens in RIN-38 Insulinomzellen wurde untersucht. Die Gentranskriptionsraten wurden durch Quantifizierung naszierender Insulin- und Beta-Actin RNA- Transkripten in Nuklei von Kontroll- und GLP 7-37-behandelten Zellen bestimmt. Die GLP-1 (7-37) Konzentration betrug 10&supmin;&sup7; M. Die Inkubatin erfolgte über 4 Stunden. Nukleare RNA wurde an einen Überschuß geklonter, spezifischer DNA hybridisiert, die an Nitrozellulose gebunden war, und die Filter wurden gewaschen, wie von McKnight, G. S., et al. (J. Biol. Chem. 254: 9050-9058 (1979)) beschrieben. Es wurden Ratteninsulin (Ullrich, A., et al., Science 196: 113-119 (1977)) und, zur Kontrolle, Küken-Beta-Actin cDNAs verwendet, die von Dr. D. Cleveland, The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland, bereitgestellt worden waren. Die Effizienz der Hybridisierung wurde durch die Zugabe der Hybridisierungslösung [³H] UTP Insulin cRNA kontrolliert. Experimente wurden zweifach ausgeführt, und die Werte sind in ppm/kb cDNA Insert angegeben, auf Effizienz der Hybridisierung korrigiert (40-50%). Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, daß GLP-1 (7-37) die Rate der Insulingentranskription erhöhte, aber keine nachweisbare Wirkung auf die Rate der Actingentranskription hatte.

BEISPIEL 3

Wirkung von GLP-1 Derivaten auf zelluläre cAMP Werte

Zur Bestimmung, ob glukagonartige Proteine imstande sind, cAMP Werte zu beeinflussen, wurden die Wirkungen von GLP-1 (7-37) und GLP-1 (1-37) auf cAMP Werte in RINS-38 Insulinomzellen (Exp. I bzw. Exp. II) bestimmt.
Die Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Kulturschalen mit 26 Vertiefungen gezüchtet. Den Kulturvertiefungen wurden verschiedene Mengen glukagonartiger Peptide in dreifacher Ausführung zugegeben. Nach einer Inkubation über 10 Minuten wurden die gesamten Zellmedien auf cAMP untersucht und die Konzentration von cAMP bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 dargestellt. Von jeder Kulturvertiefung wurden 20 Mikroliter getestet. Tabelle 2
Dieses Experiment zeigt, daß GLP-1 (7-37) imstande war, cAMP Werte zu stimulieren, selbst wenn es in einer Konzentration von 10&supmin;¹¹ M vorhanden war. Der Anstieg in den cAMP Werten ist ein Hinweis, daß GLP-1 (7-37) mit zellulären Rezeptoren in Wechselwirkung treten kann. Im Gegensatz dazu, wiesen weder GLP1 (1-37) noch GLP-II eine solche Aktivität auf.
Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, um die insulinotropen Aktivitäten von GLP-1 (1-37), GLP-1-(1-36)-NH&sub2; und GLP-1 (7-37) mit der insulinotropen Aktivität von Glukagon zu vergleichen. Die Prozeduren für dieses Experiment sind dieselben wie die zuvor beschriebenen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 3 dargestellt.
Bei der relativ hohen Konzentration von 0,5 uM erhöhten GLP-1 (1-37), GLP-1-(1-36)-NH&sub2;, GLP-1 (7-37) und Glukagon jeweils die cAMP Werte. Bei 5 nM erhöhte GLP-1 (7-37) die cAMP Werte zumindest um das Vierfache und war noch bei 50 pM aktiv. Im Gegensatz dazu waren die Wirkungen von Glukagon, GLP-1- (1-37) und GLP-1-(1-36)-NH&sub2; auf die Bildung von cAMP bei diesen Konzentrationen vernachlässigbar.
Die Fähigkeit der insulinotropen Peptide Glukagon und GLP-1-(7-37), die cAMP Bildung in der Insulinomlinie, RIN 1046-38, zu stimulieren, wurde untersucht. Die insulinotrope Aktivität wurde nach der Beschreibung von Mojsov, S., et al. (J. Clin. Invest. 79: 616-619 (1987)) und Drucker, D. J., et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3434-3438 (1987)), aufgezeichnet, wobei beide Literaturquellen hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 2 dargestellt und zeigen, daß GLP-1 (7-37) zumindest tausendmal stärker als Glukagon bei der Auslösung der cAMP Bildung ist Tabelle 3. Stimulierung der cAMP Bildung durch Glukagon und glukagonnartige Peptide in RIN 1046-38 Zellen
Die statistische Signifikanz zwischen der Kontrolle (kein Peptid) und den experimentellen Beobachtungen (durch ungepaarten, zweiseitigen t-Test) ist wie folgt: a (P < 0,05); b (P < 0,01); c (P < 0,001); NS, nicht signifikant.
* Alle Werte sind pro 1/50 Zellextrakt pro Platte
A93-03A.WP

BEISPIEL 4

Wirkung von GLP-1 Peptiden auf die Insulinproduktion

Ratteninsulinomzellen der Zellinie RIN-38 wurden in DME-Medium, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Nach der Inkubation mit 5 · 10&supmin;&sup7; M GLP-1 (7-37) wurden die Insulinkonzentrationen in den Zellkulturmedien durch Radioimmunassay (wie zuvor beschrieben) bestimmt. Die Insulinproteinwerte wurden nach der Inkubation über 1 oder 24 Stunden bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4

BEISPIEL 5

Pankreatischer Perfusionstest der insulinotropen Aktivität

Das Pankreas einer lebenden Ratte wurde mit verschiedenen Konzentrationen von GLP-1 (1-37) und GLP-1 (7-37) wie zuvor beschrieben perfundiert. Ein isoliertes Rattenpankreas wurde nach der Methode von Weir, G. C., et al. (J. Clin. Invest. 54: 1403-1412 (1974)), und Penkos, J. C., et al. (Diabetes 18: 733-738 (1969)) hergestellt. Das Perfusat enthielt Bicarbonatpuffer (pH 7,4) und 120 mg/dl Glukose, 4% Dextran T-70 und 0,2% Rinderserumalbumin, und war mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid äquilibriert. Die ersten 20 Minuten jeder Perfusion waren eine Gleichgewichtsperiode. Nach dieser Anfangsperiode wurden Teilmengen des Perfusats alle 2-4 Min über weitere 20 Min. entfernt, so daß eine Äquilibrierung des Systems über insgesamt 40 Min. möglich war. Die Perfusion, einschließlich des hinzugefügten insulinotropen Peptids, erfolgte über 6 Min. und Proben wurden in 1 Min. Intervallen entnommen. Wenn mehr als eine Perfusion durchzuführen war, folgten auf die Peptidperfusionen Äquilibrierungsperioden von 20 Min., in welchen vier Proben in Abständen von 5 Min. entnommen wurden. Eine zweite 6 Min. Perfusion folgte mit demselben Peptid wie in der ersten Perfusion, aber bei einer 100-fach höheren Peptidkonzentration. Auch hier wurden im Abstand von 1 Min. Proben entnommen. Die gesamte Perfusionsdauer betrug 70 bis 85 Min.
In jeder erhaltenen Teilmenge an Perfusat wurde Insulin durch Radioimmunoassay bestimmt. Zusätzlich wurde die Effizienz der Abgabe des insulinotropen Peptids durch Radioimmunoassay entsprechender Teilmengen des Perfusats bestätigt, in welchen Insulin gemessen wurde (Mojsov, S. G., et al., J. Biol. Chem. 261: 11880-11889 (1986), wobei diese Literaturquelle durch Bezugnahme aufgenommen wird). In Intervallen von 1 Minute wurden Rattenseruminsulinwerte in Pikogramm/ml durch Radioimmunoassay (wie zuvor beschrieben) bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 5 angeführt. Die Perfusionen erfolgten unter Verwendung von Peptidkonzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup7; M, 5 · 10&supmin;&sup8; M und 5 · 10&supmin;¹&sup0; M, 5 · 10&supmin;¹¹ M und 5 · 10&supmin;¹² M. Die Peptide wurden zugegeben, nachdem der Null-Minuten Serumwert bestimmt worden war.
Es zeigte sich, daß GLP-1 (1-37) einen 3,4-fachen Anstieg in den Seruminsulinkonzentrationen vermittelte, wenn es in das Rattenpankreas bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup7; M perfundiert wurde; bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup8; M konnte dieses Peptid nur einen zweifachen Anstieg in den Seruminsulinwerten vermitteln. Bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;¹&sup0; M zeigte sich, daß dieses Peptid nur einen 20% Anstieg in den Seruminsulinwerten vermittelte. Die in diesen Experimenten beobachtete insulinotrope Aktivität von GLP-1 (1-37) widerspiegelt wahrscheinlich die Gegenwart von GLP-1 (7-37) in den Zubereitungen (entweder durch den Abbau von GLP-1 (1-37) oder aufgrund einer geringen Verunreinigung). GLP-1 (7-37) erwies sich als fähig, einen 132-fachen Anstieg in den Insulinwerten zu stimulieren, wenn es einem Rattenpankreas in einer Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup7; M bereitgestellt wurde. Bei einer zehnfach geringeren Konzentration (5 · 10&supmin;&sup8; M) konnte dieses Peptid einen 21-fachen Anstieg in der Serumkonzentration von Insulin bewirken. Bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;¹&sup0; M erwies sich GLP-1 (7-37) als imstande, einen Anstieg in Seruminsulinwerten (32-fach) herbeizuführen. Selbst bei einer Konzentration von 5 · 10&supmin;¹¹ M führte GLP-1 (7-37) zu einem 15-fachen Anstieg in Insulinwerten, während GLP-1 (1-37) keine Wirkung zeigte.
Dieses Experiment zeigt, daß GLP-1 (7-37) mehr als 1000-mal stärker als GLP-1 (1-37) in der in vivo Stimulierung der Insulinexpression ist. Zusätzlich hatten die GLP-1 Peptide in denselben Experimenten keine Wirkungen auf die Freisetzung der Peptidhormone Glukagon und Somatostatin. Somit sind die stimulatorischen Wirkungen von GLP-1 für die Betazellen spezifisch und wirken nicht auf pankreatische Alpha- oder Deltazellen.
Der Wert von GLP-1 (1-37) und GLP-1 (7-37) im Pfortaderblut der Ratte wurde durch Radioimmunoassay mit etwa 150 pg/ml (50 pM) gemessen. Der entsprechende Wert im peripheren Blut ist 50 pg/ml (15 pM). Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden unter Verwendung von GLP-1 (7-37) bei einer Konzentration von 5-50 pM erhalten. Somit zeigen diese Ergebnisse, daß GLP-1 (7-37) eine insulinotrope Aktivität bei seiner physiologischen Konzentration hat. Tabelle 5

BEISPIEL 6

Vergleich der insulinotropen Aktivitäten von Glukagon und GLP-1 (7-37)

Rattenpankreas-Perfusionsexperimente wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, um die insulinotrope Aktivität von Glukagon mit jener von GLP-1 (7-37) zu vergleichen. Peptide wurden bei Konzentrationen von 10&supmin;&sup9; M und 10&supmin;¹¹ M (über 5 Minuten) perfundiert. Wie in Fig. 3 dargestellt, wies GLP-1 (7-37) mehr als das 100-Fache der insulinotropen Aktivität von Glukagon auf.
Diese Erkenntnis wird durch die Studie der Wirkungen von Glukagon, GLP-1 (1-37) und GLP-1 (7-37) auf die cAMP Werte in RIN 1046-38 Insulinomzellen bestätigt, die in Tabelle 3 dargestellt ist.

BEISPIEL 7

Insulinotrope Aktivität von Derivaten von GLP-1 (1-37)

Die insulinotropen Aktivitäten von GLP-1 (7-34) und GLP-1 (7-35) wurden mit jenen von GLP-1 (7-37) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Rattenpankreas-Perfusionstechnik verglichen. Es wurden fünfminütige Perfusionen verwendet. Wie in Fig. 4 dargestellt, hatten drei dieser Peptide nachweisbare insulinotrope Aktivität bei einer Konzentration von 10&supmin;¹¹ M. Diese Ergebnisse zeigen, daß die getesteten Derivate von GLP-1 (7-37) alle eine insulinotrope Aktivität aufweisen, die höher als jene von GLP-1 (7-37) ist, das bei 10&supmin;¹¹ M inaktiv ist.
Die GLP-1 verwandten Peptide: GLP-1 (7-36)-NH&sub2; und GLP-1 (7-37) wurden verglichen, um ihre relativen insulinotropen Aktivitäten zu bestimmen. Die insulinotrope Aktivität wurde unter Verwendung des pankreatischen Perfusionstest von Beispiel 6 bestimmt; die Perfusion wurde über 5 Minuten ausgeführt. Peptide waren in einer Konzentration von 10&supmin;¹¹ M vorhanden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl GLP 1 (7-37) als auch GLP-1 (7-36)-NH&sub2; deutliche insulinotrope Aktivität haben. Tabelle 6: Vergleich der insulinotropen Aktivität von GLP-1 (7-37) und GLP-1 (7-36)-NH&sub2;
Die Wirkungen von GLP-1 (7-37) und GLP-1 (7-36)-NH&sub2; auf die cAMP Bildung in der Insulinomzellinie RIN 1046-38 wurden unter Verwendung der Prozedur von Beispiel 1 bestimmt. Die Zellen wurden 10 Minuten in Gegenwart von 0, 10&supmin;¹¹, 10&supmin;&sup9; oder 10&supmin;&sup7; M Peptiden inkubiert. Die Ergebnisses dieses Experiments sind in Tabelle 7 dargestellt. Diese Ergebnisse bestätigen, daß sowohl GLP-1 (7-37) als auch GLP-1 (7-36)-NH&sub2; insulinotrope Peptide sind. Tabelle 7: Wirkungen von GLP-1 (7-37) im Vergleich zu GLP-1 (7-36)-NH&sub2; auf die cAMP Bildung in einer Insulinomzellinie (RIN 1046-38 Zellen)
* Alle cAMP-Werte sind als fmol/10 ul Zellextrakt angegeben

BEISPIEL 8

Stabilität von GLP-1 (1-37)

Zur Bewertung der Stabilität des 37 Aminosäuren Peptids unter Versuchsbedingungen wurde GLP-1 (1-37) 24 h nur in Kulturmedium oder in Medium, das entweder mit 0,1% Rinderserumalbumin oder 10% fötalem Rinderserum supplementiert war, inkubiert. Teilmengen der Medien wurden durch Hochdruckflüssigchromatographie und Radioimmunoassay analysiert.
Vor der Inkubation wurde kein GLP-1 (7-37) in der Zubereitung von GLP-1 (1-37) nachgewiesen (Fig. 5). Nach der Inkubation von GLP-1 (1-37) in konditioniertem Medium, das 0,1 % Rinderserumalbumin enthielt, erschien eine kleine GLP-1 (7-37) Spitze, die darauf hinweist, daß die Spaltung von GLP-1 (1-37) zu einem kleineren, aktiveren GLP-1 (1-37) unter diesen Versuchsbedingungen eintritt.

BEISPIEL 9

Insulinotrope Wirkung von GLP-1 (8-37)

Wie zuvor besprochen, hat sich Glukagon als Betazellensekretagoge erwiesen, der bei Konzentrationen von nur 10&supmin;&sup9; M wirkt. GLP-1 (7-37), das auf dem Präproglukagon cokodiert ist, hat, wie gezeigt wurde, die Fähigkeit, eine insulinotrope Wirkung selbst bei Konzentrationen von nur 10&supmin;¹² M zu vermitteln. Zur Bestimmung, ob getrennte Rezeptoren in der Erkennung von Glukagon und GLP-1 (7-37), einem möglichen GLP-1 Antagonisten, beteiligt sind, wurde das Analog des- 7 Histidin GLP-1 (7-37) konstruiert. Dieses Analog wird in der Folge als "GLP-1 (8-37)" bezeichnet.
Die Insulinsekretion wurde in dem Test des perfundierten Rattenpankreas, der zuvor beschrieben wurde, mit einem Perfusat-Glukosewert von 6,6 mM untersucht. Es zeigte sich, daß GLP-1 (8-37) keine nachweisbare Wirkung bei Konzentrationen von 10&supmin;¹¹, 10&supmin;&sup9; oder 10&supmin;&sup8; M hat. Eine schwäche insulinotrope Wirkung wurde bei 10&sup7; M nachgewiesen. Bei einem Perfusat-Glukosewert von 16,7 mM hatte das Analog bei 10&supmin;&sup9; M keine Wirkung.
Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von Glukagon durchgeführt. Glukagon wurde in ein Rattenpankreas über 5 Minuten bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup9; M perfundiert, mit einem Perfusat-Glukosewert von 6,6 mM, entweder mit oder ohne 10&supmin;&sup8; M GLP-1 (8-37). Es zeigte sich, daß Glukagon eine erhöhte mittlere Perfusat-Insulinkonzentration von 4,98 ± 0,96 ng/ml hervorbrachte, und im Prinzip identische Ergebnisse (5,26 ± 0,89 ng/ml) wurden bei Glukagon in Gegenwart von GLP-1 (8-37) beobachtet (N = 4).
Das zuvor beschrieben Protokoll wurde zur Untersuchung der Wirkungen des GLP-1 (7-37) bei Gegenwart oder Abwesenheit von GLP-1 (8-37) untersucht. GLP-1 (7-37) alleine, bei einer Konzentration von 10&supmin;¹¹ M, stimulierte eine mittlere Insulinfreisetzung von 2,25 ± 0,30 ng/ml. Diese Reaktion war jedoch geringer (1,30 ± 0,19 ng/ml (P < 0,025, N = 7 für jedes)), wenn dieselbe Dosis vor einem Hintergrund des Analogs verabreicht wurde. Diese Daten zeigen, daß die Entfernung des 7- Histidins von GLP-1 (7-37) zu einem Verlust der Agonistenfunktion in diesem System führt und daß sich Agonisteneigenschaften zeigen. Da die Agonistenaktivität nur gegenüber GLP-1 (7-37) und nicht gegenüber Glukagon demonstriert werden konnte, scheinen diese beiden Sekretagogen durch getrennte Rezeptoren zu wirken.
Unter Verwendung des zuvor beschriebenen Systems des perfundierten Rattenpankreas und eines Glukoseperfusats von 6,6 mM zeigte sich, daß 10&supmin;&sup9; M GLP-1 (7-37) ein Zweiphasenmuster der Insulinsekretion mit einer anfänglichen Freisetzungspitze, auf die das Plateau anhaltender Freisetzung folgt, hervorbringen kann. Weiters erwies sich diese Reaktion als glukoseabhängig; bei 10&supmin;&sup9; M und einer Perfusat-Glukosekonzentration von 2,8 mM wurde keine Stimulierung der Insulinfreisetzung beobachtet; bei einer Perfusat-Glukosekonzentration von 6,6 mM oder 16,7 mM betrug die mittlere, inkrementelle Freisetzung gegenüber der Kontrolle 4,7 ± 1,0 bzw. 22,8 ± 4,7 ng/ml. GLP-1 (7-37) erwies sich als außerordentlich stark. Es zeigte sich, daß es bei Konzentrationen von 10&supmin;¹² M die Insulinsekretion bei einer Perfusat-Glukosekonzentration von 6,6 mM von einer Grundlinie von 0,8 ± 0,2 ng/ml auf eine Spitze von 1,6 ± 0,5 ng/ml (P < 0; 05) erhöhte. Bei einer Infusion mit 10&supmin;¹¹ M wurde die Insulinfreisetzung bis zu einer Spitze von 4,1 ± 1,4 ng/ml stimuliert, und bei 10&supmin;&sup9; M wurde eine Spitze von 23,1 ± 1,3 ng/ml erhalten. Es ist noch nicht bekannt, ob dieses GLP-1 Peptid als die 7-37 Form sezerniert wird oder das 7-36-Amid ist; beide Verbindungen sind gleich starke Sekretagogen.
Synthetisches Glukagon war weitaus weniger stark, wobei bei 10&supmin;¹¹ M keine Freisetzung festgestellt wurde. Bei 10&supmin;&sup9; M wurde bei Glukagon jedoch die Erzeugung einer Spitze von 4,5 ± 0,5 ng/ml festgestellt.
Somit sind GLP-1 (7-37) und das 7-36-Amid Kandidaten für die physiologische Regulation als "Sekretin" oder als endokriner Modulator.

BEISPIEL 10

Auswirkungen von GLP-1 (8-37) auf die cAMP Bildung in einer Insulinomzellinie

Ein Vergleich der insulinotropen Wirkungen von GLP-1 (8-37), GLP-1 (7-37) und Glukagon auf die cAMP Bildung durch die Insulinomzellinie RIN 1046-38 wurde unter Verwendung der Prozedur von Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 8 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß GLP-1 (8-37) eine insulinotrope Aktivität hat, die mit jener von Glukagon vergleichbar ist, und daß GLP-1 (7-37) eine insulinotrope Aktivität hat, die mehr als 100-mal größer als jene von GLP-1 (8-37) oder Glukagon ist. Tabelle 8: Wirkungen von GLP-1 (8-37) im Vergleich zu GLP-1 (7-37) und Glukagon auf die cAMP Bildung in einer Insulinomzellinie (RIN 1046-38 Zellen)
* Alle cAMP-Werte sind als f-mol/5 ul Zellextrakt/15 Min-Peptidexposition angegeben
** Mittel ± S. E. M. (n = 4)

Claims

1. Zusammensetzung, welche entweder

(A) ein Peptid mit der Sequenz

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys oder

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly oder

(B) ein Peptid, das mindestens 80% Homologie mit dem einen oder dem anderen der Peptide gemäß (A) aufweist, mit der Maßgabe, daß das Peptid nicht GLP-1 (7-36); GLP-1 (7-37) oder GLP-1 (1-36) ist, oder

(C) ein Peptid ist, das

i) ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz der Peptide gemäß (A) oder (B);

ii) ein pharmazeutisch akzeptables Carboxylatsalz der Peptide gemäß (A) oder (B);

iii) ein pharmazeutisch akzeptabler niedriger Alkylester der Peptide gemäß (A) oder (B); und/oder

iv) ein pharmazeutisch akzeptables Amid, Alkylamid, oder Dialkylamid von i), ii) und/oder iii) ist; wobei die Verbindung im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist und eine insulinotropische Aktivität aufweist, die die insulinotropische Aktivität von GLP-1 (1-36) oder GLP-1 (1-37) übersteigt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, welche ein Peptid mit der Sequenz

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys

ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, welche ein Peptid mit der Sequenz

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly ist.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche im wesentlichen frei von Verunreinigungen ist und eine insulinotropische Aktivität bei einer Konzentration von wenigstens 10&supmin;¹¹ M aufweist.

5. Verbindung nach Anspruch 4, welche eine insulinotropische Aktivität bei einer Konzentration von wenigstens 10&supmin;¹&sup0; aufweist.

6. Verbindung mit der allgemeinen Formel

(1) H&sub2;N--X--CO-R¹

in welcher R¹ OH, OM oder -NR²R³;

M ein pharmazeutisch akzeptables Kation oder eine niedrige verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe;

R² und R³ gleich oder verschieden und jeder ein Wasserstoffatom oder eine niedrige verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe darstellt;

X ein die Sequenz

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys oder

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val- Lys-Gly

aufweisendes Peptid, worin NH&sub2; die Aminogruppe des Amino-Terminus von X ist, mit der Maßgabe, daß X nicht GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-37), GLP-1 (1-36) oder GLP-1 (1-37) ist, und

CO die Carbonylgruppe des Carboxy-Terminus von X ist; oder

(2) ein Säureadditionssalz davon ist;

(3) die geschützten oder teilweise geschützten Derivate davon sind; wobei die Verbindung eine insulinotrope Aktivität aufweist, welche die insulinotrope Aktivität von GLP-1 (1-36) oder GLP-1 (1-37) übersteigt.

7. Ein insulinotropisches Medikament, welches eine wirksame Menge einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Verbindung mit einem passenden physiologisch verträglichen Träger enthält.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Verwendung in der Medizin.39