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DE69325700T2 - Nichtreduzierendes saccharidbildendes Enzym, und dessen Herstellung und Verwendungen - Google Patents

Nichtreduzierendes saccharidbildendes Enzym, und dessen Herstellung und Verwendungen

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Publication number
DE69325700T2
DE69325700T2 DE69325700T DE69325700T DE69325700T2 DE 69325700 T2 DE69325700 T2 DE 69325700T2 DE 69325700 T DE69325700 T DE 69325700T DE 69325700 T DE69325700 T DE 69325700T DE 69325700 T2 DE69325700 T2 DE 69325700T2
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DE
Germany
Prior art keywords
reducing
trehalose
enzyme
saccharide
symbol
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE69325700T
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DE69325700D1 (de
Inventor
Michio Kubota
Kazuhiko Maruta
Toshio Miyake
Toshiyuki Sugimoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Original Assignee
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Application granted granted Critical
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Publication of DE69325700T2 publication Critical patent/DE69325700T2/de
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Description

    Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym und seine Herstellung und Anwendungen, insbesonders ein neues nicht reduzierendes saccharidbildendes Enzym, das ein nicht reduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur bildet, wenn man es auf ein mehr reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad von 3 oder höher wirken läßt und seine Herstellung und Mikroorganismen, die dieses Enzym bilden können. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren eine Zusammensetzung, die ein nicht reduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit enthält und mit diesem Enzym herstellbar ist, ein relativ gering reduzierendes Saccharid, das das nicht reduzierende Saccharid enthält und/oder Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Trehalose oder α, α-Trehalose ist bereits seit langem als nicht reduzierendes Saccharid, das aus Glukoseeinheiten besteht, bekannt. Nach der Beschreibung in Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol. 18, Seiten 201-225 (1963), veröffent licht von Academic Press, USA, und Applied and Environmental Mecrobiology, Vol. 56, Seiten 3,213-3,215 (1990) existiert die Trehalose in großem Ausmaß in Mikroorganismen, Pilzen, Insekten, etc., obwohl ihr Gehalt relativ niedrig ist. Da nicht reduzierende Saccharide einschließlich Trehalose nicht mit Substanzen reagieren, die Aminogruppen, wie Aminosäuren und Proteine, enthalten, induzieren sie weder die Aminocarbonylreaktion noch verändern sie aminosäurehaltige Substanzen. Daher wird angenommen, daß nicht reduzierende Saccharide verwendet werden, ohne daß die Gefahr der Verursachung einer unzufriedenen Braunfärbung und eines Abbaus besteht. Deswegen bestand ein großer Bedarf dahingehend, eine Präparation dieses nicht reduzierenden Saccharids zur Verfügung zu stellen.
  • In herkömmlichen Trehalosepräparationen, welche in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 154,485/75 beschrieben sind, werden Mikroorganismen verwendet, oder, wie in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 216,695/83 beschrieben ist, wird Maltose in Trehalose unter Verwendung von Maltose- und Trehalose- Phosphorylase in Kombination umgewandelt. Die erstgenannte ist allerdings nicht für die Herstellung in industriellem Ausmaß geeignet, weil der Trehalosegehalt in Mikroorganismen als Ausgangsmaterial in der Regel niedriger als 15 G/G-% (der Wortlaut "G/G-%" wird in der Spezifikation mit "%" abgekürzt, falls nichts anderes angegeben ist), auf trockener Feststoffbasis (d. s. b.) ist, und die Extraktions- und Reinigungsschritte kompliziert sind. Die letztgenannte hat folgende Nachteile: (i) da Trehalose über Glukose-1-phosphat gebildet wird, konnte Maltose als Substrat nicht bei relativ hohen Konzentrationen verwendet werden; (ii) da die enzymatischen Reaktionssysteme der Phosphorylasen reversible Reaktionen sind, ist die Ausbeute der gewünschten Trehalose relativ niedrig und (iii) es ist im wesentlichen schwierig, die Reaktionssysteme stabil zu halten und ihre enzymatischen Reaktionen mild durchzuführen. Da her ist eine Herstellung im industriellen Maßstab noch nicht realisiert worden.
  • Im Hinblick auf die Herstellung von Trehalose ist in der Spalte mit dem Titel "Oligosaccharides" im Kapitel mit dem Titel "Current Status of starch Application Development and Related Problems" in "Food Chemicals", Nr. 88, Seiten 67-72, (August, 1992) berichtet worden, daß "trotz einer breiten Anwendbarkeit von Trehalose, ihre enzymatische Herstellung über eine direkte Saccharidübertragungsreaktion oder hydrolytische Reaktion wissenschaftlich fast unmöglich auf diesem Gebiet sein soll". Daher ist angenommen worden, daß eine enzymatische Herstellung von Trehalose unter Verwendung von Stärke als Material vom wissenschaftlichen Standpunkt aus sehr schwierig sein soll.
  • Es ist bekannt, daß Stärketeilhydrolysate, die aus Stärke als Material, wie verflüssigte Stärke, Cyclodextrine und Maltooligosaccharide, hergestellt sind, in der Regel eine reduzierende Endgruppe als Endeinheit aufweisen. Diese Stärketeilhydrolysate werden in der Spezifizierung als "nicht reduzierende Stärketeilhydrolysate" bezeichnet. Das Reduktionsvermögen dieser reduzierenden Stärketeilhydrolysate wird in der Regel durch den "Dextroseäquivalenzwert (DE)", bezogen auf ihren trockenen Feststoff, ausgedrückt. Es ist bekannt, daß unter reduzierenden Stärketeilhydrolysate solche mit einem relativ hohen DE- Wert in der Regel ein vermindertes Molekulargewicht und Viskosität und eine verstärkt geeignete Süße und Reaktionsvermögen aufweisen und ohne weiteres mit Substanzen reagieren, die Aminogruppen, wie Aminosäuren und Proteinen, aufweisen, wobei eine unzufriedenstellende Bräunung, Geruch und Verschlechterung ihrer Qualität verursacht wird.
  • Diese ungünstigen Eigenschaften von reduzierenden Stärketeilhydrolysaten variieren je nach ihren DE-Werten, und das Verhältnis zwischen den reduzierenden Stärketeilhydrolysaten und ihren DE-Werten ist sehr wichtig. Es ist sogar angenommen worden, daß es unmöglich sei, auf diesem Gebiet dieses Verhältnis aufzubrechen.
  • Der einzige Weg, das Verhältnis aufzubrechen, ist ein Verfahren zur Bildung nicht reduzierender Saccharide aus reduzierenden Stärketeilhydrolysaten durch Hydrierung der Hydrolysate bei relativ hohem Wasserstoffdruck, um ihre reduzierenden Endgruppen in Hydroxylgruppen zu reduzieren. Das Verfahren erfordert allerdings einen Hochdruckautoklav und verbraucht große Mengen an Wasserstoff und Energie und es benötigt ebenfalls ein relativ hohes Ausmaß an Überwachungs- und Sicherheitseinrichtungen, um Katastrophen zu verhindern. Das Material reduzierende Stärketeilhydrolysate und die erhaltenen Produkte unterscheiden sich, weil die ersteren aus Glukoseeinheiten bestehen und die letzteren, d. h., die Zuckeralkohole der erhaltenen Stärketeiilhydrolysate, bestehen aus Glukose- und Sorbiteinheiten, die Symptome, wie Darmstörungen und Diarrhöe, verursachen können, wenn sie dem Körper verabreicht werden. Es gab daher einen großen Bedarf dahingehend, eine Methode zur Verfügung zu stellen, um das Reduktionsvermögen von reduzierenden Stärketeilhydrolysaten herabsetzen oder sogar auszuschalten, ohne daß Glukoseeinheiten zu Saccharidbestandteilen verändert werden.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung soll ein neues nicht reduzierendes Saccharid zur Verfügung stellen, und seine Anwendungen und Herstellungen aus reduzierenden Stärketeilhydrolysaten, um das herkömmlicher Weise angenommenes Verhältnis zwischen reduzierenden Stärketeilhydrolysate und ihren DE-Werten aufzubrechen, und die Untersuchung neuer Anwendungsgebiete dieser nicht reduzierenden Saccharide.
  • Um die vorgenannte Aufgabe zu lösen, haben die Erfinder in großem Ausmaß Mikroorganismen untersucht, die ein neues nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym produzieren können, das nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur bildet, wenn man es auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt.
  • Im Ergebnis haben wir neue Mikroorganismen der Genera Rhizobium, bezeichnet als "Rhizobium sp. M-11" und Arthrobacter, bezeichnet als "Arthrobacter sp. Q36", aus den jeweiligen Erdböden in Okayama-City, Okayama, Japan und Soja-City, Okayama, Japan, isoliert und festgestellt, daß die Mikroorganismen ein neues nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym produzieren, das nicht reduzierende Saccharide mit Trehlaosestruktur bildet, wenn man es auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt und daß die jeweiligen nicht reduzierenden Saccharide ohne weiteres hergestellt werden, wenn man das Enzym auf nicht reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt.
  • Wir haben ebenfalls festgestellt, daß Trehalose ohne weiteres herstellbar ist, indem man zunächst das Enzym auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt, dann die erhaltenen nicht reduzierenden Saccharide der Wirkung von Glukoamylase oder α- Glukosidase unterwirft. Auf diese Weise sind die Erfinder zu der Erfindung gelangt. Wir haben ebenso intensiv Mikroorganismen untersucht, die das Enzym aus herkömmlichen Mikroorganismen produzieren können.
  • Im Ergebnis wurde festgestellt, daß Mikroorganismen der Genera Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Curtobacterium und Terrabacter das vorliegende nicht reduzierende saccharidbildende Enzym als Mikroorganismen der Genera Rhizobium und Arthrobacter produzieren, was wir zu dieser Erfindung gelangten. Ebenfalls haben wir Herstellungen von Zusammensetzungen, wie Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika zur Verfügung gestellt, die die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierende Saccharide, die die nicht reduzierenden Saccharide enthalten und/oder Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt sind, enthält, womit die Erfindung vollendet wurde.
    • Kurze Erklärung der anliegenden Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt den Einfluß der Temperatur auf die Aktivität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium-sp. M-11.
  • Fig. 2 zeigt den Einfluß des pHs auf die Aktivität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium sp. M-11.
  • Fig. 3 zeigt die thermische Stabilität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium sp. M-11.
  • Fig. 4 zeigt die pH-Stabilität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium sp. M-11.
  • Fig. 5 zeigt den Einfluß der Temperatur auf die Aktivität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Arthrobacter sp. Q36.
  • Fig. 6 zeigt den Einfluß des pHs auf die Aktivität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Arthrobacter sp. Q36.
  • Fig. 7 zeigt die thermische Stabilität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Arthrobacter sp. Q36.
  • Fig. 8 zeigt die pH-Stabilität des nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms aus Arthrobacter sp. Q36.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym und seine Herstellung und Anwendungen. Die Erfindung betrifft des Weiteren einen Mikroorganismus, der dieses Enzym produzieren kann, nicht reduzierende Saccharide, die mit dem Enzym hergestellt sind, relativ schwach reduzierende Saccharide, die die nicht reduzierenden Saccharide enthalten, Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist und Zusammensetzungen, die diese Saccharide entweder einzeln oder zusammen, und Trehalose enthalten.
  • Die vorliegenden Erfinder haben intensiv Mikroorganismen untersucht, die ein neues nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym produzieren können, das nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur bildet, wenn man auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt, wobei schließlich die gewünschten Mikroorganismen aufgefunden wurden.
  • Die Erfinder erklären nun zunächst den Identifikationstest der Mikroorganismen des Genus Rhizobium, d. h. "Rhizobium sp. M-11" gemäß der vorliegenden Erfindung. Der Test wurde nach der Methode in "Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei", (Klassifikation und Identifizierung von Mikroorganismen), herausgegeben von Tekeji Hasegawa, veröffentlicht von Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Japan (1985) durchgeführt. Die Ergebnisse sind folgendermaßen:
    • A. Morphologie
  • Eigenschaften der Zellen bei der Inkubation bei 27ºC in Nähragar
  • existiert in der Regel in Stäbchenform von 0,6-0,8 · 1,0-1,5 um;
  • existiert einzeln oder eher unüblich in paarweiser Form oder verbundener Form;
  • zeigt keinen Polymorphismus;
  • besitzt Bewegungsvermögen, Asporogenizität und Geißel; nicht säurefastend;
  • Grammstamm: negativ;
  • Kapsel: negativ;
  • metachromatische Granulae: positiv;
  • Akkumuliert Poly-β-hydroxybutyrat.
    • B. Kultureigenschaft
  • (1) Eigenschaften der Kolonie, die sich bildet, wenn bei 27ºC auf einer Nähragarplatte inkubiert wird. Gestalt: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 1,5 mm nach 24 Stunden Inkubation;
  • Rand: insgesamt;
  • Projektion: planare oder hemisphärische Gestalt; Glanz: positiv;
  • Oberfläche: glatt;
  • Farbe: cremig und halbtransparent;
  • (2) Eigenschaften der Kolonie, die sich bei Inkubation bei 27ºC auf einer Agarplatte mit Dextrose und Trypton bildet;
  • cremige und halbtransparente Kolonie mit Mukoid;
  • (3) Eigenschaften der Kolonie, die sich bei Inkubation bei 27ºC auf einer Agarplatte mit Hefeextrakt und Mannit bildet;
  • Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 3 mm nach 5 Tagen Inkubation und Farbe: cremige und halbtransparente Kolonie mit Mukoid;
  • (4) Eigenschaften der Kolonie, die sich bei Inkubation bei 27ºC auf einer Agarplatte mit Hefeextrakt, Mannit und Kongorot bildet;
  • zeigt ein schwaches Rosa und im wesentlichen keine Absorption von Kongorot;
  • (5) wächst bei 27ºC auf der Agarplatte mit Hefeextrakt, Mannit und 2 G/V-% NaCl;
  • (6) Eigenschaften der Kolonie, die sich bei Inkubation in Schrägnähragar bildet;
  • Wachstum: zufriedenstellend;
  • Form: fadenartig; und
  • (7) verflüssigt nicht Gelatine in Stabkultur bei 27ºC in Nährgelatine.
    • C. Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion von Nitrat: positiv
  • (2) Denitrifikationsreaktion: negativ
  • (3) Methylrottest: negativ
  • (4) VP-Test: negativ
  • (5) Bildung von Indol: negativ
  • (6) Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv
  • (7) Hydrolyse von Stärke: negativ
  • (8) Verwendung von Zitronensäure: positiv (9) Nutzbarmachung einer anorganischen Stickstoffquelle: verwendet Ammoniumsalze und Nitrate;
  • (10) Bildung von Pigment: bildet kein lösliches Pigment;
  • (11) Urease: positiv
  • (12) Oxidase: negativ
  • (13) Katalase: positiv
  • (14) Wachstumsbedingungen: wächst bei einem pH im Bereich von 5,9-9 und einer Temperatur im Bereich von 4-35ºC;
  • (15) Sauerstofferfordernisse: aerob
  • (16) Nutzbarmachung von Kohlenstoffquelle und Säurebildung
  • (17) Decarboxylasetest mit Aminosäure;
  • negativ gegenüber L-Lysin; L-Arginin und L- Ornithin;
  • (18) Nutzbarmachen von Aminosäuren;
  • verwendet Natrium-L-glutamat, Natrium-L-asparat, L-Histidin und L-Prolin;
  • (19) DNase: negativ;
  • (20) Bildung von 3-Ketolaktose: negativ; und
  • (21) Mol%-Guanin (G) plus Cytosin (C) von DNA: 61%.
  • Die bakteriologischen Eigenschaften wurden mit denen bekannter Mikroorganismen mit Bezug auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984) verglichen. Es kam im Ergebnis heraus, daß der Mikroorganismus als Mikroorganismus des Genus Rhizobium identifiziert wurde. Der Mikroorganismus ist ähnlich denjenigen der Spezies Rhizobium meliloti hinsichtlich einiger Eigenschaften, aber sie unterscheiden sich durch die Tatsache, daß der vorliegende Mikroorganismus Maltose, Laktose und Mannit verwendet, allerdings keine Säure bildet, und er produziert ein nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym, das nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur produziert, wenn man es auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt. Keine Veröffentlichung hat diesen Mikroorganismus mit diesen Eigenschaften beschrieben.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse nannten die Erfinder diesen Mikroorganismus "Rhizobium sp. M-11" und hinterlegten ihn am 24. Dezember 1992 beim Fermentation Research Institut, Agency of Industrial Science and Technology, Ibaraki, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde am gleichen Tag ak zeptiert und wird durch das Institut unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4130 aufbewahrt.
  • Zusätzlich zu dem oben identifizierten Mikroorganismus können erfindungsgemäß andere Stämme des Genus Rhizobium und seine Mutanten in geeigneter Weise verwendet werden, so lange sie das vorliegende nicht reduzierende Saccharid bildende Enzym produzieren.
  • Der Identifikationstest eines Mikroorganismus des Genus Arthrobacter, das heißt, des erfindungsgemäßen Arthrobacter sp. Q36 ergab die folgenden Ergebnisse. Der Test wurde ähnlich wie bei Rhizobium sp. M-11 nach der Methode in "Biseibutsu-no- Bunrui-to-Dotei" (Klassifikation und Identifizierung von Mikroorganismen), herausgegeben von Takeji Hasegawa, veröffentlicht von Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Japan (1985) durchgeführt. Die Ergebnisse waren folgendermaßen:
    • A. Morphologie
  • (1) Eigenschaften der Zellen bei der Inkubation bei 27ºC in Nähragar
  • existiert in der Regel in Stäbchenform von 0,5- 0,7 · 0,8-1,6 um;
  • existiert einzeln;
  • zeigt Polymorphismus;
  • besitzt keine Beweglichkeit, Asporogenizität und Geißel;
  • nicht säurefastend;
  • Grammstamm: positiv;
  • Kapsel: negativ; und
  • (2) Eigenschaften der Zellen bei Inkubation bei 27ºC in EYG-Agar zeigt einen Stabkokkenzyklus.
    • B. Kultureigenschaft
  • (1) Eigenschaften der Kolonie, die sich bildet, wenn bei 27ºC auf einer Nähragarplatte inkubiert wird. Gestalt: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 2-2,5 mm nach 3 Tagen Inkubation;
  • Rand: insgesamt;
  • Projektion: Halbkugelform;
  • Glanz: feuchter Glanz;
  • Oberfläche: glatt; und
  • Farbe: halbtransparent und weiß oder blaßgelb;
  • (2) Eigenschaften der Zellen in Schrägkultur bei 27ºC auf einer Nährgarplatte Wachstumsrate: zufriedenstellend; und
  • Form: nadelähnlich;
  • (3) Eigenschaften der Zellen in Schrägkultur 27ºC auf einer Agarplatte, die Hefeextrakt und Pepton enthält
  • Wachstumsrate: zufriedenstellend; und
  • Form: nadelähnlich; und
  • (4) Eigenschaften von Zellen in Stabkultur bei 27ºC in Bouillon und Gelatine;
  • verflüssigt Bouillon und Gelatine;
    • C. Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion von Nitrat: positiv
  • (2) Denitrifikationsreaktion: negativ
  • (3) Methylrottest: negativ
  • (4) VP-Test: positiv
  • (5) Bildung von Indol: negativ
  • (6) Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv
  • (7) Hydrolyse von Stärke: negativ
  • (8) Hydrolyse von Cellulose: negativ
  • (9) Nutzbarmachung von Zitronensäure: positiv
  • (10) Nutzbarmachung einer anorganischen Stickstoffquelle: verwendet Ammoniumsalze und Nitrate;
  • (11) Bildung von Pigment: negativ;
  • (12) Urease: positiv
  • (13) Oxidase: negativ
  • (14) Katalase: positiv
  • (15) Wachstumsbedingungen: wächst bei einem pH im Bereich von 5-10 und einer Temperatur im Bereich von 4-37ºC;
  • (16) Sauerstofferfordernisse: aerob
  • (17) Nutzbarmachung von Kohlenstoffquelle und Säurebildung
  • (18) Nutzbarmachen von Aminosäuren;
  • verwendet Natrium-L-glutamat, Natrium-L-asparat, L-Histidin und L-Prolin;
  • (19) DNase: positiv;
  • (20) Bildung von 3-Ketolaktose: negativ;
  • (21) Hauptdiaminosäure der Zellwand: Lysin; und
  • (22) Mol%-Guanin (G) plus Cytosin (C) von DNA: 63%.
  • Die bakteriologischen Eigenschaften wurden mit denen bekannter Mikroorganismen mit Bezug auf Bergeyts Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (1984) verglichen. Es kam im Ergebnis heraus, daß der Mikroorganismus als Mikroorganismus des Genus Arthrobacter identifiziert wurde. Der Mikroorganismus hat die Eigenschaft, ein nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym zu produzieren, das nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur bildet, wenn man es auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt. Keine Veröffentlichung hat bisher dieses Enzym beschrieben.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse nannten die Erfinder diesen Mikroorganismus "Arthrobacter sp. Q-36" und hinterlegten ihn am 3. Juni 1993 am National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Sciene and Technology, Ibaraki, Japan. Die Hinterlegung des Mikroorganismus wurde am gleichen Tag akzeptiert und wird durch das Institut unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4316 aufbewahrt.
  • Zusätzlich zu dem oben identifizierten Mikroorganismus können andere Stämme des Genus Arthrobacter und seine Mutanten erfindungsgemäß in geeigneter Weise verwendet werden, so lange sie das vorliegende nicht reduzierende Saccharid bildende Enzym produzieren, wenn man es auf reduzierende Stärketeilhydrolysate wirken läßt.
  • Jeder Mikroorganismus kann erfindungsgemäß verwendet werden, so lange er das vorliegende Enzym produziert. Beispielsweise können zusätzlich zu dem vorgenannten Rhizobium sp. M-11 (FERM BP-4130) und Arthrobacter sp. Q36 (FERM BP-4316) andere bisher bekannte Mikroorganismen, wie solche des Spezies Brevibacterium helovolum (ATCC 11822), Flavobacterium aquatitle (IFO 3772), Micrococcus luteus (IFO 3064), Micrococcus roseus (ATCC 186), Curtobacterium citreum (IFO 15231), Mycobacterium smegmatis (ATCC 19420), Terrabacter tumescens (IFO 12960) und ihre Mutanten in geeigneter Weise erfindungsgemäß verwendet werden.
  • Jedes Nährkulturmedium kann erfindungsgemäß verwendet werden, solange diese Mikroorganismen darin wachsen und das vorliegende nicht reduzierende Saccharid bildende Enzym produzieren können: beispielsweise können synthetische und natürliche Nährkulturmedien als Nährkulturmedium verwendet werden. Jede kohlenstoffhaltige Substanz kann als Kohlenstoffquelle erfindungsgemäß verwendet werden, solange sie von den Mikroorganismen verwendet werden: Beispiele für diese Kohlenstoffquelle sind Saccharide, wie Glukose, Fruktose, Laktose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Molassen und reduzierende Stärketeilhydrolysate und organische Säuren, wie Zitronensäure und Bernsteinsäure. Die Konzentrationen dieser Kohlenstoffquellen in den Nährkulturmedien werden entsprechend gewählt. Beispielsweise liegt bei der Verwendung von reduzierenden Stärketeilhydrolysaten die bevorzugte Konzentration in der Regel bei 20% oder niedriger, insbesondere 5% oder niedriger, d. s. b., unter Zugrundelegung des Wachstums der Mikroorganismen. Die erfindungsgemäß verwendbaren Stickstoffquellen sind beispielsweise anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze und Nitrate; und organische stickstoffhaltige Substanzen, wie Harnstoff, Maislaugenflüssigkeit, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Rindfleischextrakt. Die erfindungsgemäß verwendbaren anorganischen Bestandteile sind beispielsweise Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate und andere Salze von Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybden und Kobalt. Nach Bedarf können Aminosäuren und Vitamine in geeigneter Weise zusammen verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen werden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur, in der Regel im Bereich von 4-40ºC, vorzugsweise im Bereich von 20-37ºC und bei einem pH im Bereich von 4-10, vorzugsweise einem pH im Bereich von 5-9 gezüchtet. Die erfindungsgemäße Kultivierungsdauer wird auf einen Zeitraum gesetzt, der länger als derjenige für die Wachstumsinitiierung der Mikroorganismen, vorzugsweise 10-100 Stunden, erforderlich ist. Die Konzentration von gelöstem Sauerstoff (DO) im Nährkulturmedium ist nicht besonders eingeschränkt, er liegt allerdings im Bereich von 0,5-20 ppm. Die Konzentration von DO kann innerhalb dieses Bereiches durch Überwachen der Belüftung, Rühren, Belüften mit Sauerstoff und Erhöhung des Innendrucks des Fermentors gehalten werden. Die Kultivierung wird ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt.
  • Nach Vervollständigung der Kultivierung der Mikroorganismen wird das vorliegende Enzym gewonnen. Sofern die Aktivität des vorliegenden Enzyms in den Zellen und in den zellfreien Überständen aufgefunden wird, können diese Zellen und Überstände als Rohenzym gewonnen werden. Die erhaltene Kultur kann ebenfalls intakt als Rohenzym verwendet werden. Herkömmliche Flüssigkeits/Feststoff-Trennmethoden können erfindungsgemäß als Methode zur Entfernung der Zellen aus der Kultur angewendet werden. Beispielsweise können Methoden zur sofortigen Zentrifugation der Kultur, und auch solche zur Filtrierung der Kultur mit vorbeschichteten Filtern oder zur Trennung der Zellen durch Membranfiltration unter Verwendung von Planfiltern oder Hohlfasern in geeigneter Weise angewendet werden. Während die in dieser Weise erhaltenen zellfreien Filtrate intakt als Enzymlösung verwendet werden können, können sie vor ihrer Verwendung eingeengt werden. Die erfindungsgemäß verwendbaren Einengungsmethoden sind beispielsweise das Aussalzen unter Verwendung vom Ammoniumsulfat, die Sedimentation mit Aceton und Alkohol und die Einengung unter Verwendung von Membranen, wie Planfilter und Hohlfasern.
  • Zellfreie Filtrate und ihre Konzentrate können einer herkömmlichen Immobilisation unterworfen werden. Beispiele für herkömmliche Methoden sind Konjugationsmethoden unter Verwendung von Ionenaustauschern, kovalenten Bindungen und Absorptionen und Verwendung von Harzen und Membranen, und Einschlußmethoden unter Verwendung von hochmolekularen Substanzen. Zellen, die aus den erhaltenen Kulturen abgetrennt werden, können als Rohenzym ohne weitere Behandlung verwendet werden oder können vor ihrer Verwendung immobilisiert werden. Beispielsweise können diese Zellen immobilisiert werden, indem sie mit Natriumalginat vermischt werden und die erhaltene Mischung in Calciumchloridlösung getropft wird, um die Tropfen in Granulae zu gelatinisieren. Die in dieser Weise erhaltenen Granulae können fixiert werden, indem man sie mit Polyethylenamin oder Glutaraldehyd behandelt. Extrakte aus den Zellen können erfindungsgemäß als Rohenzymlösung verwendet werden. Beispielsweise kann eine klare Rohenzymlösung, die das vorliegende Enzym enthält, hergestellt werden, indem das vorliegende Enzym aus den Zellen, die mit Ultraschall, mittels mechanischer Zerstörung mit Glasperlen und Aluminiumoxid und Frenchwalzenzerstörung behandelt sind, extrahiert und den erhaltenen Extrakt zentrifugiert oder einer Membranfiltration unterzieht.
  • Die in dieser Weise erhaltene Rohenzymlösung kann intakt oder nach Reinigung mit herkömmlichen Methoden verwendet werden. Beispielsweise kann eine gereinigte Enzympräparation, die in der Elektrophorese eine einzelne Bande zeigt, hergestellt werden, indem eine Rohenzymlösung, die durch Aussalzen einer Rohenzymlösung mit Ammoniumsulfat und Einengen des Ergebnisses hergestellt worden war, dialysiert wird und danach die dialysierte Lösung auf einer Anionenaustauschersäule chromatographisch unter Verwendung von "DEAE Toyopearl®", ein Anionenaus tauscherharz chromatographisch auf einer hydrophoben Säule unter Verwendung von "Butyl Toyopearl®", ein hydrophobes Harz und chromatographisch durch Gelfiltration mit "Toyopearl® HW- 55", ein Gel für die Gelfiltration, alle diese Produkte sind von Toso Corporation, Tokyo, Japan, gereinigt wird.
  • Das in dieser Weise erhaltene vorliegende nicht reduzierende Saccharid bildende Enzym weist folgende physikalisch-chemische Eigenschaften auf:
  • (1) Wirkung bildet nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur als Endeinheit wenn man es auf ein oder mehr reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher wirken läßt;
  • (2) Molekulargewicht etwa 76.000 ± 87.000 Dalton gemäß Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
  • (3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 3,6 ± 4,6 in der Isoelektrophorese mit einem Ampholyt;
  • (4) optimale Temperatur etwa 35-40ºC bei der Inkubation bei 7,0 für 60 Minuten
  • (5) optimaler pH-Wert etwa 6,4-7,2 bei der Inkubation bei 40ºC für 60 Minuten;
  • (6) thermische Stabilität stabil bis zu einer Temperatur von etwa 35-40ºC bei der Inkubation bei einem pH von 7,0 für 60 Minuten und
  • (7) pH-Stabilität stabil bei einem pH im Bereich von etwa 5,5-11,0 bei der Inkubation bei 25ºC für 16 Stunden.
  • Die Aktivität des vorliegenden nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms wird wie folgt untersucht: Ein ml einer Enzymlösung wird mit 4 ml 1,25 G/V-% Maltopentaose in 50 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) versetzt, und das Lösungsgemisch wird bei 40ºC für 60 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird bei 100ºC für 10 Minuten zur Beendigung der enzymatischen Reaktion umgesetzt, und das Reaktionsgemisch wird genau um das 10-fache mit deionisiertem Wasser verdünnt, wonach dann das Reduktionsvermögen der verdünnten Lösung gemäß der Somogyi- Nelson-Methode bestimmt wird. Als Kontrolle wird eine Enzymlösung, die bei 100ºC bei 10 Minuten zur Enzymaktivierung erhitzt worden war, ähnlich wie oben, behandelt. Eine Einheit Aktivität des vorliegenden Enzyms wird als Menge Enzym definiert, die das Reduktionsvermögen von demjenigen von 1 uMol Maltopentaose pro Minute verringert.
  • Reduzierende Stärketeilhydrolysate, die als Substrat für das vorliegende Enzym verwendet werden können, sind solche, die durch Teilhydrolyse stärkehaltiger Substanzen, wie Stärke, Amylopeptin und Amylose mit Amylase oder Säuren hergestellt werden. Diese reduzierenden Stärketeilhydrolsate, die durch Hydrolyse mit Amylasen erhalten werden, umfassen solche, die lineare und verzweigte Kettenstrukturen aufweisen, die durch Hydrolyse stärkehaltiger Substanzen wie Amylasen, wie α- Amylase, Maltotriose bildende Amylase, Maltotetraose bildende Amylase, Maltopentaose bildende Amylase und Maltohexaose bildende Amylase nach der Beschreibung in Handbook of Amylase and Related Enzymes, veröffentlicht von Pergamon Press, Tokyo, Japan (1988), hergestellt werden. Bei der Herstellung reduzierender Stärketeilhydrolysate können Entzweigungsenzyme, wie Pullulanase und Isoamylase in geeigneter Weise zusammen mit den Amylasen verwendet werden. Ein oder mehr Maltooligosaccharide, wie Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltopentaose können als reduzierende Stärketeilhydrolysate willkürlich verwendet werden.
  • Die Konzentration der erfindungsgemäß als Substrat verwendeten reduzierenden Stärketeilhydrolysate ist nicht besonders festgelegt. Während die vorliegende enzymatische Reaktion auch mit einer 0,1% Substratlösung fortschreitet, läuft die enzymatische Reaktion noch günstiger mit Lösungen mit einer Konzentration von 2% oder höher, vorzugsweise mit solchen mit einer Konzentration von 5-50% Substrat, d. s. b. Mit diesen Konzentrationen werden nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur ohne weiteres in zufriedenstellend hoher Ausbeute gebildet. Suspensionen, die unlösliche Substrate enthalten, können erfindungsgemäß verwendet werden. Die in der vorliegenden Reaktion verwendete Reaktionstemperatur kann auf eine Temperatur gesetzt werden, bei der das vorliegende Enzym nicht inaktiviert wird, das heißt, eine Temperatur bis zu etwa 55ºC, vorzugsweise einer Temperatur im Bereich von 40-50ºC. Der Reaktions-pH-Wert in der vorliegenden enzymatischen Reaktion wird im Bereich von 5-10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6 -8 gesteuert. Die Reaktionsdauer für die vorliegende enzymatische Reaktion wird in geeigneter Weise je nach Bedingungen der enzymatischen Reaktion gewählt.
  • Die erhaltenen Reaktionsgemische, die die nicht reduzierenden Saccharide enthalten, haben ein Reduktionsvermögen das, viel niedriger als dasjenige des Materials reduzierende Stärketeilhydrolysate, die als Substrat verwendet werden. Beispielsweise erniedrigt sich bei der Verwendung von Maltopentaose als Sub strat des anfänglichen Reduktionsvermögens um etwa 93% oder das Reduktionsvermögen geht auf etwa 7% im Hinblick auf das anfängliche Reduktionsvermögen zurück.
  • Die erhaltenen Reaktionsgemische werden in üblicher Weise einer Filtration und Zentrifugation unterworfen, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und die erhaltenen Lösungen werden mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH- Form entsalzen und in sirupartige Produkte eingeengt. Die sirupartigen Produkte können in geeigneter Weise in pulverförmige Produkte getrocknet werden. Nach Bedarf können die pulvrigen Produkte ohne weiteres in nicht reduzierende Saccharide mit der höchstmöglichen Reinheit hergestellt werden.
  • Die pulvrigen Produkte können mittels einer oder mehr Methoden, z. B. die Säulenchromatographie, Fraktionierungen, wie die Ionenaustauschersäulenchromatographie, Säulenchromatographie und Verwendung von Aktivkohle oder Kieselgel, Trennungen mit organischen Säulen, wie Aceton und Alkohol und alkalischer Behandlungen gereinigt werden, um die verbleibenden reduzierenden Saccharide zu zersetzen und zu entfernen.
  • Insbesondere kann die Ionenaustauschersäulenchromatographie in geeigneter Weise erfindungsgemäß als Herstellungsverfahren der gewünschten Saccharide in industriellem Ausmaß angewendet werden. Die gewünschten nicht reduzierenden Saccharide mit erhöhter Reinheit können willkürlich beispielsweise durch die Säulenchromatographie unter Anwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes nach den Beschreibungen in den japanischen Patentoffenlegungen mit den Nrn. 23,799/83 und 72,598/83 hergestellt werden, um konkurrierende Saccharide zu entfernen. In diesem Fall können Methoden, wie die Festbettmethode, Bewegungsbettmethode und Halbbewegungsmethode angewendet werden.
  • Nach Bedarf können die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide mit Trehalosestruktur oder relativ gering reduzierenden Sacchariden, die die nicht reduzierenden Saccharide enthalten, durch Amylasen, wie die α-Amylase, β-Amylase, Glukoamylase und α-Glukosidase hydrolysiert werden, um deren Süßkraft und Reduktionsvermögen zu steuern oder deren Viskosität herabzusetzen, und die erhaltenen Produkte können des weiteren verarbeitet werden, indem die verbleibenden reduzierenden Saccharide in Zuckeralkohole hydriert werden, um deren Reduktionsvermögen herabzusetzen.
  • Insbesondere wird Trehalose auf einfache Weise hergestellt, indem man Glukoamylase oder α-Glukosidase auf die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide oder relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, wirken läßt. Eine Fraktion mit hohem Trehalosegehalt wird erhalten, indem man Glukoamylase oder α-Glukosidase auf diese Saccharide unter Bildung einer Mischung aus Trehalose und Glukose wirken läßt und die Mischung den vorgenannten Reinigungen, wie Ionenaustauschersäulenchromatographie, zur Entferung von Glukose unterwirft. Die Fraktion mit dem höchsten Trehalosegehalt kann willkürlich gereinigt werden und in ein sirupartiges Produkt eingeengt werden und nach Bedarf kann das sirupartige Produkt in eine supergesättigte Lösung eingeengt werden, wonach dann wasserhaltige oder wasserfreie kristalline Trehalose auskristallisiert wird und der erhaltene Kristall gewonnen wird.
  • Zur Herstellung wasserhaltiger kristalliner Trehalose wird eine etwa 65-90% Lösung Trehalose mit einer Reinheit von etwa 60% oder höher in einen Kristallisator gegeben und nacheinander abgekühlt, während in Gegenwart eines 0,01-20% Impfkristalls bei einer Temperatur von 95ºC oder niedriger, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 10-90ºC, unter Bildung einer Kristallmasse, die wasserhaltige kristalline Trehalose enthält, gerührt wird. Herkömmliche Methoden, wie die Abtrennung, Blockpulverisierung, Granulation im Wirbelbett und Sprühtrocknen können erfindungsgemäß eingesetzt werden, um aus der Kristallmasse wasserhaltige Trehalose oder kristalline Saccharide, die diese enthalten, herzustellen.
  • Bei der Abtrennung werden die Kristallmassen in der Regel in einer Korbzentrifuge zentrifugiert, um wasserhaltige kristalline Trehalose aus der Mutterflüssigkeit abzutrennen, und nach Bedarf wird die wasserhaltige kristalline Trehalose durch Aufsprühen mit einer kleinen Menge kaltem Wasser gewaschen, um die Herstellung wasserhaltiger kristalliner Trehalose mit verbesserter Reinheit zu vereinfachen. Beim Sprühtrocknen werden kristalline Saccharide, die nicht oder im wesentlichen nicht hygroskopisch sind, auf einfache Weise hergestellt, indem Kristallmassen mit einer Konzentration von 70-85%; d. s. b., und einer Kristallinität von etwa 20-60%, d. s. b., aus einer Düse mit einer Hochdruckpumpe besprüht werden, die erhaltenen Produkte mit 60-100ºC heißer Luft, die nicht die entstandenen kristallinen Pulver schmilzt, getrocknet wird und die erhaltenen Pulver für etwa 1-20 Stunden gealtert werden, während darauf eine 30-60ºC heiße Luft geblasen wird. Bei der Blockpulverisierung werden kristalline Saccharide, die nicht oder im wesentlichen nicht hygroskopisch sind, auf einfache Weise hergestellt, indem man Kristallmassen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 10-20% und einer Kristallinität von etwa 10 bis 60%, d. s. b., für etwa 0,1-3 Tage stehen läßt, um den gesamten Inhalt in Blöcke zu kristallisieren und zu verfestigen, und die erhaltenen Blöcke pulverisiert oder schneidet.
  • Obwohl wasserfreie kristalline Trehalose hergestellt werden kann, indem wasserhaltige kristalline Trehalose getrocknet wird, um diese in eine wasserfreie umzuwandeln, wird sie im allgemeinen hergestellt, indem eine Lösung mit hohem Trehalosegehalt und einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% genommen wird, die Lösung in einen Kristallisator gegeben wird, die Lösung in Gegenwart eines Impfkristalls bei einer Temperatur im Bereich von 50-160ºC, vorzugsweise einer Temperatur im Bereich von 80-140ºC unter Rühren gehalten, um eine Kristallmasse zu erhalten, die wasserfreie kristalline Trehalose enthält und die wasserfreie kristalline Trehalose mit herkömmlichen Verfahren, wie Blockpulverisierung, Granulation im Wirbelbett und Sprühtrocknen, kristallisiert und pulverisiert wird.
  • Die erhaltenen nicht reduzierenden Saccharide und relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese erfindungsgemäß enthalten, haben ein relativ geringeres Reduktionsvermögen und eine relativ höhere Stabilität als solche des reduzierenden Stärketeilhydrolysatmaterials, und deswegen können diese Saccharide mit anderen Materialien, insbesondere Aminosäuren und Aminosäure enthaltene Substanzen, wie Oligopeptide und Proteine, vermischt und verarbeitet werden, ohne daß Gefahr besteht, daß eine unzufriedenstellende Braunfärbung, Geruch und Zerstörung der Materialien auftritt. Im Gegensatz zu reduzierenden Stärketeilhydrolysaten haben diese Saccharide ein relativ geringes Reduktionsvermögen und Viskosität. Und unter diesen Sacchariden haben diese mit einem relativ geringen Glukosepolymerisationsgrad eine zufriedenstellend bessere Qualität und eine mildere Süße als die Hydrolysate.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide werden durch Amylasen, wie α-Amylase aus Pankreas, in relativ niedrigmolekulare, nicht reduzierende Oligosaccharide oder Maltooligosaccharide hydrolysiert, und diese Oligosaccharide werden ohne weiteres durch α-Glucosidase und Darmenzyme in Glukose- und Trehalosemoleküle hydrolysiert. Die erhaltene Trehalose wird ohne weiteres durch Trehalase in Glukose hydrolysiert. Daher können die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und die relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und auch Trehalose, als Energiequelle vom Körper bei der oralen Verabreichung verwendet werden. Die vorliegenden Saccharide und Trehalose werden im wesentlichen nicht durch Mikroorganismen, die Zahnkaries induzieren, fermentiert, und dies macht diese als Süßungsmittel zur Verhütung von Zahnkaries geeignet.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und auch Trehalose, haben eine zufriedenstellende Stabilität und Süße, und diejenigen in kristalliner Form können in geeigneter Weise als Zuckerbeschichtungsmaterial für Tabletten zusammen mit Bindemitteln, wie Pullulan, Hydroxyethylstärke und Polyvinylpyrrolidon, verwendet werden. Diese Saccharide und Trehalose haben Eigenschaften, wie die Eigenschaft zur Steuerung des osmotischen Drucks, die Eigenschaft als Füllstoff, die Eigenschaft zur Verleihung von Glanz, die Eigenschaft zur Feuchtigkeitserhaltung und die Eigenschaft zur Verleihung von Viskosität, sie fermentieren im wesentlichen nicht und sie haben die Eigenschaft zur Bildung gelatinierter Stärke und die Eigenschaft zur Verhinderung der Kristallisation anderer Saccharide.
  • Wasserfreie kristalline Trehalose kann in willkürlicher Weise als Entwässerungsmittel für Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika, Pharmazeutika, verwendet werden und ihre Materialien und Zwischenprodukte werden ohne weiteres zu Zusammensetzungen in Form von Pulver, Granulae und Tabletten mit zufriedenstellender Stabilität und Qualität hergestellt.
  • Daher können die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und relativ niedrig reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, sowohl auch die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt wird, in geeigneter Weise als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator, Trägerstoff und Entwässerungsmittel in einer Vielzahl von Zusammensetzungen, Nahrungsmittelprodukten, Tabak, Zigaretten, Futtermittel, Haustierfutter, Kosmetika und Pharmazeutika, verwendet werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und die relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und auch die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können intakt als Gewürz zum Süßen verwendet werden. Nach Bedarf können sie zusammen mit geeigneten Mengen eines oder mehreren anderen Süßungsmitteln, z. B. gepulverter Sirup, Glukose, Maltose, Saccharose, isomerisierter Zucker, Honig, Ahornzucker, Isomaltooligosaccharid, Galaktooligosaccharid, Fruktooligosaccharid, Lactosaccherose, Sorbit, Maltit, Laktit, Dihydrocharcon, Steviosid, α-Glycosylsteviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, Saccharin, Glycin und Alanin; und/oder Füllstoff, wie Dextrin, Stärke und Laktose, verwendet werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und auch eine pulvrige oder kristalline Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können intakt verwendet werden, oder nach Bedarf können sie mit einem Trägerstoff, Füllstoff und Bindemittel vermischt werden und in Granulae, Kugeln, Stangen, Plättchen, Kuben und Tabletten, vor ihrer Verwendung vermischt werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und die Trehalose, die auf diesen Sacchariden hergestellt ist, weisen folgende Merkmale auf: (i) sie haben eine Süße, die gut mit anderen Materialien mit saurem, säurehaltigen, salzigen, bitteren, astringenten und delikaten Geschmacksrichtungen harmonisiert und (ii) sie sind stark säure- und hitzebeständig. Daher können sie im allgemeinen in geeigneter Weise in Nahrungs mittelprodukten als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel und Qualitätsverbesserungsmittel verwendet werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können in Gewürzen, wie Aminosäuren, Peptiden, Sojasoße, pulvriger Sojasoße, "miso", "funmatsu-miso" (gepulvertes miso), "moromi" (verfeinerter Sake), "hishio" (verfeinerte Sojasoße), "furikake" (gewürzte Fischmahlzeit), Majonaise, Dressing, Essig, "sanbi-zu" (Zuckersauce, Sojasauce und Essig), "funmatsusushi-su" (gepulverter Essig für sushi), "chuka-no-moto" (Fertigmischung für chinesisches Essen), "tentsuyu" (eine Sauce für japanische frittierte Nahrungsmittel), "mentsuyu" (eine Sauce für japanisches Grillfleisch), Currymehlschwitze, Fertigeintopfmischung, Fertigsuppenmischung, "dashi-no-moto" (Fertigvorratsmischung), Nukleinsäurewürze, Gewürzgemisch, "mirin" (süßer Sake), "shin-mirin" (synthetischer Mirin), Tafelzucker und Kaffeezucker, verwendet werden.
  • Ebenfalls können die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, ohne weiteres zum Süßen von "wagashi", (japanischer Kuchen), wie "senbei" (Reiscracker), "arare-mochi" (Reiskuchenkasten), "okoshi" (Hirse-und Reiskuchen), "mochi" (Reispaste), "manju" (süßes Brötchen mit Bohnenmarmelade), "uiro" (süßes Reisgelee), "an" (Bohnenmarmelade (yukan" (süßes Bohnegelee), "mizu-yokan" (süßes adzuki-Bohnengelee), "kingyoku" (Yokanart), Gelee, pao de Castella und "amedama" (japanisches Sahnebonbon); Süßwaren, wie süßes Brötchen, Biscuit, Cracker, Keks, Pastete, Pudding, Buttercreme, Eiercreme, Cremewindbeutel, Waffel, Schwammkuchen, Doughnut, Schokolade, Kaugummi, Karamel und Bonbon; gefrorene Desserts, wie Eiscreme und Sorbet; Sirups, wie "kajitsu-no-syrup-zuke", (konservierte Frucht) und "korimitsu" (Zuckersirup für Schäleis); Pasten, wie Mehlpaste, Erdnußpaste, Fruchtpaste und Aufstrich; verarbeitete Früchte und Gemüse, wie Marmelade, Konfitüre, "syrup-zuke" (Fruchteingelegtes) und "toka" (Konserven); Eingelegtes und eingelegte Produkte, wie "fukujinzuke" (rotes Retticheingelegtes), "bettara-zuke" (Art von eingelegten ganzen frischen Rettich), "senmai-zuke" (Art von Stücken aus frischem eingelegten Rettich) und "rakkyo-zuke" (eingelegte Scharlotten); Vormischungen, Eingelegtes und eingelegte Produkte wie "takuan-zuke-no-moto" (Vormischung für eingelegten Rettich) und "hakusai-zuke-no-moto" (Vormischung für frischen weißen eingelegten Raps); Fleischprodukte, wie Schinken und Wurst; Produkte aus Fischfleisch, wie Fischschinken, Fischwurst, "kamoboko" (geräucherte Fischpaste), "chikuwa" (Art Fischpaste und "tenpura" (japanische frittierte Fischpaste); "chinmi" (Appetithappen, wie "uni-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Seeigel), "ika-no-shiokara" (gesalzene Eingeweide vom Tintenfisch), "su-konbu" (verarbeitete Algen), "saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und "fugu-no-mirin-bishi" (getrockneter mirin-gewürzter Kugelfisch); "tsukudani" (in Sojasoße gekochte Nahrungsmittel), wie solche von Leber(laver), eßbaren Wildpflanzen, getrocknetem Tintenfisch und Schellfisch; tägliche Gerichte, wie "nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und "konbu-maki" (Algenrolle); Milchprodukte; Produkte in Konserven und Flaschen, wie solche von Fleisch, Fischfleisch, Früchten und Gemüse; alkoholische Getränke, wie synthetischer Sake, Wein und Liköre; alkoholfreie Getränke, wie Kaffee, Tee, Kakao, Saft, kohlensäurehaltige Getränke, Sauermilchgetränk und Getränk mit Milchsäurebakterien, Fertignahrungsmittelprodukte, wie Fertigpuddingmischung, scharfe Fertigkuchenmischung und "sokusekishiruco" (Fertigmischung aus adzuki-Bohnensuppe mit Reiskuchen) und Fertigsuppenmischung; und Getränke, wie Babynahrungsmittel, Nahrungsmittel für die Therapie, Getränke, die mit Nährstoffen angereichert sind, Peptidnahrungsmittel und gefrorene Nahrungsmittel und auch für die Verbesserung des Geschmacks und Qualitäten der genannten Nahrungsmittelprodukte verwendet werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, die relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können ebenfalls in Futtermitteln und Haustierfutter für Tiere, wie Haustiere, Federvieh, Honigbienen, Seidenwürmer und Fische, verwendet werden, um deren Geschmack zu verbessern. Diese Saccharide und Trehalose kann willkürlich als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel und Stabilisator in anderen Produkten in pasteuser und in flüssiger Form, wie Tabak, Zigarette, Zahnpasta, Rouge, Lippenstift, Lippencreme, interne Medizin, Tablette, Pastille, Lebertranöl in Form von Tropfen, Cachou, Munderfrischungsmittel, Gurgelwasser, Kosmetikum und Pharmazeutikum, verwendet werden.
  • Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können als Qualitätsverbesserungsmittel und Stabilisator in biologisch-aktiven Substanzen, die dazu neigen, ihre wirksamen Bestandteile und Wirkungen zu verlieren, und auch in Reformkost und Pharmazeutika, die biologisch aktive Substanzen enthalten, verwendet werden. Beispiele für eine biologisch aktive Substanz sind Lymphokine, wie α-, β- und γ-Interferone, α- Tumornecrosisfaktor, (α-TNF), β-Tumornecrosisfaktor, (β-TNF), Makrophagenwanderungsinhibitorfaktor, koloniestimulierender Faktor, Übertragungsfaktor und 2-Interleukin; Hormone wie Insulin, Wachstumshormon, Prolaktin, Erythropoietin und follikestimulierendes Hormon, biologische Präparate, wie BCG- Impfstoff, japanischer Encephalitisimpfstoff, Masernimpfstoff, lebender Polioimpfstoff, Windpockenimpfstoff, Tetanustoxoid, Trimerisuros-Antitoxin und menschliches Immunglobulin; Anti biotika, wie Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine wie Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertranöl, Karotenoid, Egosterol und Tocopherol; Enzyme, wie Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glucanase und Laktase; Extrakte wie Ginseng-Extrakt, Kaiman-Schildkrötenextrakt, Chlorellaextrakt, Aloeextrakt und Propolisextrakt, lebende Mikroorganismen, wie Viren, Milchsäurebakterien und Hefen und andere biologisch aktive Substanzen, wie Gelee royale. Mit den vorliegenden nicht reduzierenden Sacchariden, relativ gering reduzierenden Sacchariden, die diese enthalten, und der Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können die vorgenannten biologisch aktiven Substanzen in geeigneter Weise zu Gesundheitsnahrungsmitteln und Pharmazeutika mit zufriedenstellend hoher Stabilität und Qualität hergestellt werden, ohne daß Gefahr besteht, daß ihre wirksamen Bestandteile und Aktivitäten verloren gehen oder inaktiviert werden.
  • Wie oben beschrieben wurde, umfassen die Methoden zur Einarbeitung der vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, der relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten, und/oder Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, in die oben genannten Zusammensetzungen, herkömmliche Methoden, z. B. das Vermischen, Verkneten, Lösen, Schmelzen, Vollsaugen, Durchtränken, Aufsprenkeln, Auftragen, Beschichten, Aufsprühen, Injizieren, Kristallisieren und Verfestigen. Diese Saccharide und die Trehalose werden in der Regel in die oben genannten Zusammensetzungen in einer Menge von 0,1% oder höher, vorzugsweise 1% oder höher, d. s. b., eingearbeitet.
  • Die folgenden Experimente erläutern die vorliegende Erfindung im einzelnen.
  • Zunächst wird die Herstellung, Reinigung und die Eigenschaften einer nicht reduzierendes Saccharid bildenden Amylase aus ei nem neuen Mikroorganismus Rhizobium sp. M-11 erklärt und zweitens wird ein nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym aus dem Mikroorganismus Arthrobacter sp. Q36 ähnlich wie beim Mikroorganismus Rhizobium sp. M-11 erklärt. Drittens werden nicht reduzierende Saccharid bildende Enzyme aus bisher bekannten Mikroorganismen erklärt.
    • Experiment 1 Herstellung eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms aus Rhizobium sp. M-11
  • Ein flüssiges Nährkulturmedium, das aus 2,0 G/V-% Maltose, 0,5 G/V-% Pepton, 0,1 G/V-% Hefeextrakt, 0,1 G/V-% Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1 G/V-% Caliumhydrogenphosphat und Wasser bestand, wird auf einen pH von 7,0 eingestellt. Aliquots mit etwa 100 ml Nährkulturmedium wurden in 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, bei 120ºC für 20 Minuten für die Sterilisierung autoklaviert, abgekühlt, mit einer Vorratskultur Rhizobium sp. M- 11 (FERM BP-4130) geimpft und bei 27ºC für 24 Stunden unter Rühren bei 130 rpm inkubiert. Die erhaltenen Kulturen wurden vereint und als Impfkultur verwendet.
  • Etwa 20 l einer frischen Präparation des gleichen in der obigen Kultur verwendeten Nährkulturmediums wurden in einen 30 l Fermentor gegeben, sterilisiert, auf 30ºC abgekühlt, mit einem G/V-% Impfkultur geimpft und für etwa 24 Stunden unter Rühren bei aeroben Bedingungen bei 30ºC und einem pH von 6,0-8,0 inkubiert. Die erhaltene Kultur wies eine Enzymaktivität von 1,5 Einheiten/ml auf. Ein Teil der Kultur wurde zur Abtrennung der Zellen und Kulturüberstand zentrifugiert, und die Zellen wurden in 50 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) bis zum Ursprungsvolumen des Teils suspendiert, wonach dann die Enzymaktivitäten der Zellsuspension und des Kulturüberstands untersucht wurden, wobei sich etwa 0,6 Einheiten/ml bzw. etwa 0,9 Einheiten/ml ergaben.
    • Experiment 2 Enzymreinigung
  • Etwa 18 l der in Experiment 1 erhaltenen Kultur wurde mit "Mini-Rabo", ein Superhochdruck Zerstörungsapparat, im Handel erhältlich von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan, zur Zerstörung der Zellen behandelt. Die erhaltene Mischung wurde bei 10.000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein Überstand von etwa 16 l bildete. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat gegeben und bis zu einem Sättigungsgrad von 0,2 gelöst, und man ließ die erhaltene Lösung bei 4ºC für eine Stunde stehen und zentrifugierte bei 10.000 rpm für 30 Minuten zur Herstellung eines Überstands.
  • Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand bis zu einem Sättigungsgrad von 0,6 gegeben und die erhaltene Lösung wurde bei 10.000 rpm für 30 Minuten zur Bildung eines Niederschlags zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und die erhaltene Lösung wurde gegen eine frische Präparation des gleichen Phosphatpuffers für 24 Stunden dialysiert und bei 10.000 rpm für 30 Minuten zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert. 360 ml der erhaltenen dialysierten Lösung wurde in zwei Teile geteilt, die dann getrennt voneinander auf einer Säule unter Verwendung einer Säule, die mit 300 ml "DEAE-Toyopearl®", ein Anionenaustauscher, im Handel erhältlich von Toso Corporation, Tokyo, Japan, gepackt war, chromatographiert wurden.
  • Das gewünschte Enzym wurde auf dem Anionenaustauscher adsorbiert, und von der Säule mit einer frischen Präparation des gleichen Phosphatpuffers, der mit Salz angereichert war, eluiert. Die erhaltenen Fraktionen mit der gewünschten Enzymaktivität wurden vereint und gegen eine frische Präparation des gleichen Phosphatpuffers, der mit zwei Mol Ammoniumsulfat ergänzt war, dialysiert. Die in dieser Weise erhaltene dialysierte Lösung wurde bei 10.000 rpm für 30 Minuten zur Entfernung unlöslicher Substanzen zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde mit einer hydrophoben Säule, die mit 300 ml "Butyl-Toyopearl® 650", ein hydrophobes Gel, im Handel erhältlich von Toso Corporation, Tokyo, Japan, gepackt war, chromatographiert. Das am Gel adsorbierte Enzym wurde von der Säule mit einem linearen Gradientenpuffer von 2 Mol bis 0 Mol eluiert, wonach dann Fraktionen mit Enzymaktivität gewonnen wurden. Die erhaltenen Fraktionen wurden über eine Gelfiltration unter Verwendung von "Toyopearl® HW-55", ein Gel für die Gelchromatographie, im Handel erhältlich von Toso Corporation, Tokyo, Japan, chromatographiert, wonach dann Fraktionen mit Enzymaktivität gewonnen wurden. Die Enzymaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in jeder Reinigungsstufe sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1
  • Eine gereinigte Enzympräparation, die als Eluat aus der Gelfiltrationssäule in Tabelle 1 erhalten wurde, wurde auf ihre Reinheit elektrophoretisch mit einem 7,5% Polyacrylamid untersucht und zeigte eine einzelne Proteinbande, und dieses zeigte, daß die Präparation ein elektrophoretisch homogenes Enzym mit relativ hoher Reinheit war.
    • Experiment 3 Enzymeigenschaften
  • Die in Experiment 2 erhaltene gereinigte Enzympräparation wurde unter Verwendung eines 10% Dodecylsulfat/Polyacrylamid- Gels elektrophoretisiert, und es kam dabei heraus, daß das Mo lekulargewicht etwa 77.000-87.000 Dalton im Vergleich mit denjenigen der Markerproteine, die von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan, erhältlich sind, betrug.
  • Die gereinigte Enzympräparation wurde unter Verwendung eines Polyacrylamidgels, das 2 V/V-% "Ampholine", ein Ampholyt, das von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Apsala, Schweden, erhältlich ist, enthielt, einer Isoelektrophorese unterworfen. Das erhaltene Gel wurde in Stücke geschnitten und ein Gelstück, daß das Enzym enthielt, wurde auf seinen pH-Wert bestimmt, wobei herauskam, daß das Enzym einen pI-Wert von etwa 3,6-4,6 hatte.
  • Die Wirkungen der Temperatur und des pH-Werts auf das Enzym wurden nach der Untersuchung, die für die Enzymaktivität durchgeführt wurde, untersucht. Die Ergebnisse in sind in jeweils in den Fig. 1 und 2 gezeigt. Die optimale Temperatur des Enzyms betrug etwa 40ºC bei der Umsetzung bei einem pH von 7,0 für 60 Minuten und der optimale pH-Wert betrug etwa 7,0 bei der Umsetzung bei 40ºC über 60 Minuten. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem es in 50 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) bei verschiedenen Temperaturen über 60 Minuten inkubiert wurde, die Puffer gekühlt wurden und die Restenzymaktivitäten in jedem Puffer bestimmt wurden. Die pH-Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem es in 50 mMol Phosphatpuffer mit verschiedenen pHs bei 25ºC über 16 Stunden inkubiert wurde, die Puffer auf pH 7 eingestellt wurden und die Restenzymaktivität in jedem Puffer bestimmt wurde. Die Ergebnisse der thermischen Stabilität und pH-Stabilität sind jeweils in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Das Enzym war bis zu einer Temperatur von etwa 40ºC und einem pH von etwa 6-9 stabil.
    • Experiment 4 Herstellung von nicht reduzierenden Sacchariden
  • Eine wäßrige Lösung, die 20% Glukose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose als Substrat enthielt, wurde hergestellt und mit 2 Einheiten pro Gramm Substrat, d. s. b., der in Experiment erhaltenen gereinigten Enzympräparation vermischt, und die erhaltene Mischung wurden einer enzymatischen Reaktion bei 40ºC in einem pH von 7,0 über 48 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde entsalzen und in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung von "Wakobeads WB-T-330- Säule", ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, analysiert. Das HPLC-Verfahren wurde bei Umgebungstemperatur und einer Fließrate von 0,5 ml/Min Wasser als Laufmittel durchgeführt und "RI-8012", ein Differenzialrefraktometer, im Handel erhältlich von Toso Corporation, Tokyo, Japan wurde zur Untersuchung der Reaktionsprodukte verwendet.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
    • Bemerkung:
  • In der Tabelle bedeuten die Symbole "P I, "P II", "P III", "P IV" und "P V" neue Saccharide, die aus den jeweiligen Substraten Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose gebildet sind.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, bestand jedes Reaktionsprodukt im wesentlichen aus dem restlichen Substrat und einem neugebildeten Saccharid P I, P II, P III, P IV oder P V, und andere Sacchariden wurden im wesentlichen nicht nachgewiesen. Es ist herausgekommen, daß P II, P III, P IV und P V, die einen Glukosepolymerisationsgrad von 4 oder höher aufweisen, eine hohe Ausbeute ergaben, das heißt eine Prozentzahl von 85% oder höher, d. s. b., während die Ausbeute P I, die einen Glukosepolymerisationsgrad von 3 oder höher aufweist, eine relativ niedrige Ausbeute ergab. Es wurde festge stellt, daß kein neues Saccharid aus Glukose und Maltose gebildet wurde.
  • Zur Reinigung der neu gebildeten Saccharide in jedem Reaktionsgemisch, wurden sie über eine Säule auf "XT-1016 (Na&spplus;-Form, Polymerisationsgrad 4%)", ein stark saures Alkalimetallaustauscherharz, im Handel erhältlich von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, chromatographiert. Das Gel wurde in 3 mit stahlfreiem Stahl ummandelten Säulen gepackt, wobei jede Säule einen Innendurchmesser von 2,0 cm und eine Länge von 1 m aufwies, und die Säulen wurden in Serie geschaltet, mit einem 5 V/V-% Reaktionsgemisch, das die Saccharide enthielt, gegen das Gel aufgegeben, während der Innendurchmesser bei 55ºC gehalten wurde, und mit 55ºC heißem Wasser bei einer Fließrate von SV (Raumgeschwindigkeit) von 0,13 eluiert, wobei eine hochreine Saccharidfraktion, die 97% oder höher eines neuen Saccharids, d. s. b., enthielt, erhalten wurde. Die Fraktion wurde im Vakuum getrocknet, wobei eine hochreine Präparation des neuen Saccharids erhalten wurde. Die Ausbeuten P I, P II, P III und P IV betrugen jeweils etwa 9%, 65%, 82%, 80% und 77%, bezogen auf ihre Saccharidmaterialien, d. s. b. Die Reinheiten von P I, P II, P III, P IV und P V betrugen jeweils 97,5%, 98,6%, 99,5%, 78,4% und 98,4%, d. s. b.
  • Die reduzierenden Pulver dieser neuen Saccharide wurden mit der Somogyi-Nelson-Methode bestimmt und durch das DE (Dextroseäquivalent) ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
  • Wie aus dem Ergebnis in Tabelle 3 ersichtlich ist, zeigte jede Saccharidpräparation nur ein geringes Reduktionsvermögen. Es wurde geschätzt, daß das geringe Reduktionsvermögen auf restliche reduzierende Maltooligosaccharide, die aus den Substraten stammen, zurückzuführen ist, und dieses führte zu der Schlußfolgerung, daß die neu gebildeten Saccharide im wesentlichen nicht reduzierende Saccharide waren.
    • Experiment 5 Maillard-Reaktion
  • Eine Lösung, die 1% Glycin und 10% einer Saccharidpräparation P I, P II, P III, P IV, P V in Experiment 4 und 50 mMol- Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt, wurde bei 100ºC für 90 Minuten gehalten, wonach dann die erhaltene Lösung abgekühlt wurde und ihre Absorption bei einer Wellenlänge von 480 nm in einer 1 cm-Zelle bestimmt wurde. Als Kontrolle wurden Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose als Material für die Saccharidpräparationen ähnlich wie oben behandelt, und ihre Absorptionen wurden bei einer Wellenlänge von 480 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 ersichtlich ist, ist herausgekommen, daß die neu gebildeten nicht reduzierenden Saccharide P I, PII, P III, P IV und P V nur eine geringe Färbung zeigten, die durch die Maillard-Reaktion verursacht wurde, das heißt, der Färbungsgrad betrug nur 3-6% vor dem, ihrer entsprechenden Maltooligosaccharidmaterialien. Die Ergebnisse zeigten, daß die durch das vorliegende Enzym gebildeten nicht reduzierenden Saccharide im wesentlichen keine Maillard- Reaktion zeigen.
    • Experiment 6 Enzymatische Hydrolyse durch Glukoamylase
  • 50 mg-Aliquots der nicht reduzierenden Saccharide P I, P II, P III, P IV und P V in Experiment 4 wurden jeweils in 1 ml 50 mMol Acetatpuffer (pH 4,5) gelöst, mit einer Einheit Glukoamylase, im Handel erhältlich von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japan, vermischt, um die enzymatische Hydrolyse bei 40ºC über 6 Stunden zu bewirken. Die einzigen Saccharide, die in jeder erhaltenen Mischung in der HPLC-Analyse nachgewiesen wurden, waren Glukose und Trehalose. Die Gehalte an nachgewiesener Glukose und Trehalose und ihr Molekülverhältnis sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersichtlich ist, ist herausgekommen, daß (1) das nicht reduzierende Saccharid P I in ein Mol Glukose und ein Mol Trehalose hydrolysiert wurde; P II hydrolysierte in 2 Mol Glukose und 1 Mol Trehalose; (iii) P III hydrolysierte in 3 Mol Glukose und 1 Mol Trehalose; (iv) P IV hydrolysierte in 4 Mol Glukose und 1 Mol Trehalose; und (v) P V hydrolysierte in 5 Mol Glukose und 3 Mol Trehalose.
  • Im Hinblick auf den Enzymreaktionsmechanismus von Glukoamylase ist festgestellt worden, daß diese nicht reduzierenden Saccharide eine Saccharidstruktur aufweisen, die aus einem oder mehr Mol Glukose, die an ein Mol Trehalose über die α-1,4-Bindung oder α-1,6-Bindung gebunden ist, besteht: Das nicht reduzierende Saccharid P I ist ein nicht reduzierendes Saccharid mit einem Glukosepolymerisationsgrad von 3 (DP 3) und besteht aus einem Mol Glukose, die an ein Mol Trehalose gebunden ist; P II ist ein nicht reduzierendes Saccharid mit einem DP von 4, das aus 2 Molen Glukose besteht, die an einem Mol Trehalose gebunden sind; P III ist ein nicht reduzierendes Saccharid mit einem DP von 5, das aus 3 Mol Glukose besteht, die mit einem Mol Trehalose gebunden sind, P IV ein nicht reduzierendes Saccharid mit einem DP von 6, das aus 4 Mol Glukose besteht und an ein Mol Trehalose gebunden ist; und P V ist ein nicht reduzierendes Saccharid mit einem DP von 7, das aus 5 Mol Glukose besteht, die mit einem Mol Trehalose gebunden sind. Es wurde festgestellt, daß, wenn man β-Amylase auf diese nicht reduzierenden Saccharide ähnlich wie bei Glukoamylase wirken läßt, P I und PII nicht hydrolysiert wurden, allerdings wurden jeweils P III, P IV und PV in ein Mol Maltose und ein Mol P I, ein Mol Maltose und ein Mol P II und zwei Mol Maltose und ein Mol P I hydrolysiert.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist geschlossen worden, daß die Enzymreaktion des vorliegenden nicht reduzierenden Saccharid bildenden Enzyms eine intramolekulare Reaktion ist, ohne daß die Molekulargewichte der verwendeten Substrate verändert werden, das heißt, eine intramolekulare Reaktion ohne Veränderung ihrer Glukosepolymerisationsgrade. Es wurde geschlossen, daß die nicht reduzierenden Saccharide, P I, P II, P III, P IV und P V die jeweiligen α-Glykosyltrehalosen (Gn-T, worin das Symbol "G" einen Glukoserest bedeutet, das Symbol "n" eine oder mehr oder ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest) von α-Glukosyltrehalose, α-Maltosyltrehalose, α-Maltotriosyltrehalose, α-Maltotetraosyltrehalose und α-Maltopentaosyltrehalose darstellten.
    • Experiment 7 Hydrolyse durch Enzyme
  • Das nicht reduzierende Saccharid P I, P II, PIII, P IV oder P V als Substrat in Experiment 4 wurde einer α-Amylase-Probe aus dem Schweinepankreas, einer α-Glukosidase-Probe aus Reis oder einem Rattendarm Acetonpulver, alles erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Lois, USA, unterworfen, und jedes erhaltene Hydrolysat wurde über HPLC, um die jeweilige Saccharidzusammensetzung zu bestimmen, analysiert. Die Enzymreaktion mit der α-Amylase war folgendermaßen: Auflösen von 10 mg eines Substrats in einem ml 50 mMol Phosphatpuffer (pH 6,9), Vermischen der erhaltenen Lösung mit einer Einheit α-Amylase und Inkubleren der erhaltenen Mischung bei 37ºC für 18 Stunden. Die enzymatische Reaktion mit der α-Glukosidase wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei der α-Amylase durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 50 mMol Acetatpuffer (pH 4,0) als Puffer verwendet wurden. Die Enzymreaktion mit dem Rattendarm Acetonpulver wurden unter den gleichen Bedingungen wie bei der α-Amylase durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 50 mMol Maleatpuffer (pH 6,0) als Puffer verwendet wurden. Die Saccharidzusammensetzungen, die mit der α-Amylase, α-Glukosidase und dem Rattendarm Acetonpulver erhalten wurden, sind in dieser Reihenfolge in den Tabellen 6, 7 und 8 gezeigt. TABELLE 6
    • Bemerkung:
  • In der Tabelle bedeuten die Symbole "G3", "G2" und "G1" jeweils Maltotriose, Maltose und Glukose. TABELLE 7 TABELLE 8
  • Wie aus der Tabelle 6 ersichtlich ist, ist festgestellt worden, daß die Saccharidpräparationen P I und P II im wesentlichen nicht durch die α-Amylase hydrolysiert wurden, während die Saccharidpräparationen P III, P IV und P V durch die α- Amylase in Oligosaccharide mit niedrigerem Molekulargewicht, P I, P II, Maltotrioase, Malotose und Glukose hydrolysiert wurden.
  • Wie aus den Ergebnissen in den Tabellen 7 und 8 ersichtlich ist, ist festgestellt worden, daß ähnlich wie im Experiment 6 mit der Glukoamylase die Saccharidpräparationen P I, P II, P III, P IV und P V durch die α-Glukosidase und das Rattendarma Acetonpulver in Glukose- und Trehalosemoleküle hydrolysiert wurden.
  • Zu dem erhaltenen Hydrolysat, das mit der α-Glukosidase oder dem Rattendarm Acetonpulver erhalten wurde, wurde eine Einheit Trehalase aus der Schweineniere, eine Enzympräparation von Sigma Chemical Co., St. Louis, USA, gegeben, und die Mischung wurde bei einem pH von 5,7 und 37ºC über 18 Stunden inkubiert, wonach dann die Saccharidzusammensetzung der erhaltenen Mischung mittels HPLC analysiert wurde, wobei herauskam, daß Trehalose, die aus den Saccharidpräparationen P I, P II, P III, P IV und P V gebildet wurde, durch die Trehalose in Glukosemoleküle hydrolysiert wurde.
  • Diese Beobachtungen werden wie folgt zusammengefaßt:
  • (1) Das vorliegende nicht reduzierendes Saccharid bildende Enzym bildet nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur, wenn man es auf ein oder mehr reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad oder höher wirken läßt, ohne daß ihre Glukosepolymerisationsgrade verändert werden und
  • (2) Das nicht reduzierende Saccharid P V wird hauptsächlich durch α-Amylase in die nicht reduzierenden Sac charide P II und Maltotriose hydrolysiert, während das nicht reduzierende Saccharid P II durch Glukoamylase in ein Mol Trehalose und zwei Mol Glukose hydrolysiert wird.
  • Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde geschlossen, daß das vorliegende nicht reduzierendes Saccharid bildende Enzym ein neues Enzym ist, das intramolekular eine reduzierende Einheit in reduzierenden Stärketeilhydrolysate in eine nicht- reduzierende Endeinheit, einen Trehaloserest, das heißt eine Trehalosestruktur, umwandelt.
    • Experiment 8 Akuter Toxizitätstest
  • Unter Verwendung sieben Wochen alter Mäuse vom dd-Stamm wurde die nicht reduzierende Saccharidpräparation P I, P II, P III, P IV oder P V oral den Mäusen für den akuten Toxizitätstests verabreicht. Im Ergebnis ist herausgekommen, daß diese Saccharidpräparationen sichere Substanzen mit relativ geringer Toxizität waren, und daß keine Maus starb, auch wenn sie die höchstmöglichen Dosen erhalten haben. Wenn auch nicht ganz ackurat, so betragen die LD&sub5;&sub0;-Werte dieser Präparationen 50 g/kg oder höher.
    • Experiment 9 Herstellung des nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms aus Arthrobacter sp. Q36
  • Ähnlich wie in Experiment 1 wurde eine Impfkultur von Arthrobacter sp. Q 36 (FERM BP-4316) in einem Fermentor über etwa 72 Stunden anstelle von Rhizobium sp. M-11 (FERM BP-4130) gezüchtet. Die Enzymaktivität eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms in der erhaltenen Kultur betrug 1, 2 Einheiten/ml. Ähnlich wie in Experiment 1 wurden eine Zellsuspension und ein Überstand, die aus der erhaltenen Mischung hergestellt wurden, im Hinblick auf ihre Aktivitäten untersucht, wobei etwa 0,5 Einheiten/ml und etwa 0,7 Einheiten/ml herauskamen.
    • Experiment 10 Reinigung des Enzyms
  • Unter Verwendung von etwa 18 l der nach der Methode in Experiment 9 erhaltenen entstandenen Kultur, wurde das erhaltene nicht reduzierendes Saccharid bildende Enzym ähnlich wie in Beispiel 2 gereinigt. Die Ergebnisse in jeder Reinigungsstufe sind in Tabelle 9 aufgeführt. TABELLE 9
  • Bemerkung: Das Symbol "*" bedeutet ein nicht reduzierendes Saccharid bildendes Enzym.
  • Eine gereinigte Enzympräparation, die aus dem Eluat aus der Gelfiltrationssäule in Tabelle 9 erhalten wurde, wurde hinsichtlich ihrer Reinheit ähnlich wie in Experiment 2 elektrophoretisiert, wobei eine einzelne Proteinbande herauskam, und dieses zeigte, daß die Enzympräparation ein Enzym mit relativ hoher Reinheit war, das elektrophoretisch als einzelne Bande aufwies.
    • Experiment 11 Enzymeigenschaften
  • Die in Experiment 10 erhaltene gereinigte Enzympräparation wurde hinsichtlich ihres Molekulargewichts mittels SDS-PAGE bestimmt, wobei sich etwa 76.000-86.000 Dalton ergaben. Der pI-Wert der Enzympräparation wurde ähnlich wie in Experiment 3 isoelektrophoretisch bestimmt und ergab einen pI von 3,6- 4,6. Die Wirkung der Temperatur und des pHs auf die Enzympräparation und die thermische Stabilität und die pH-Stabilität wurden ähnlich wie in Experiment 3 untersucht. Die Ergebnisse hinsichtlich der Temperatur, pH, thermischen Stabilität und pH-Stabilität sind jeweils in den Fig. 5, 6, 7 und 8 gezeigt.
  • Wie aus diesen Figuren zu ersehen ist, beträgt die optimale Temperatur der Enzympräparation etwa 40ºC, der optimale pH etwa 6,5-7,0 und die thermische Stabilität bis zu etwa 40ºC und die pH-Stabilität etwa 6,0-9,5.
    • Experiment 12 Herstellung eines nicht reduzierenden Saccharids
  • Unter Verwendung der in Experiment 10 erhaltenen gereinigten Enzympräparationen wurden die Herstellung und die Bestätigung der Struktur der nicht reduzierenden Saccharide nach den Methoden in den Experimenten 4 und 6 experimentell bestimmt. Im Ergebnis ist herausgekommen, daß die Enzympräparation ein oder mehr nicht reduzierende Saccharide bildet, die eine Trehalosestruktur als Endeinheit und einen Glukosepolymerisationsgrad von 3 oder höher aufweisen, wenn man sie auf ein oder mehr reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher wirken läßt.
    • Experiment 13 Herstellung und Eigenschaften des nicht reduzierendens Saccharid bildenden Enzyms aus bekannten Mikroorganismen
  • Unter bekannten Mikroorganismen, wurden die in Tabelle 10 aufgelisteten Mikroorganismen, bei denen sicher war, daß sie das vorliegende nicht reduzierende Saccharid bildende Enzym produzieren, in einem Fermentor bei 27ºC über 72 Stunden ähnlich wie in Experiment 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß der Mikroorganismus Mycobacterium smegmatis (ATCC 19420) bei 37ºC gezüchtet wurde. 18 l jeder entstandenen Kultur wurde in einen Zellzerstörungsapparat gegeben, und der erhaltene Überstand wurde mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, dialysiert und einer Ionenaustauschersäule unterworfen, wobei eine teilweise gereinigte Enzympräparation erhalten wurde, die dann hinsichtlich ihrer Eigenschaften untersucht wurde.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt. TABELLE 10
  • Nach der Methode in Experiment 12 werden nicht reduzierende Saccharide hergestellt, indem teilgereinigte Enzympräparationen aus diesen bekannten Organismen verwendet wurden und hinsichtlich ihrer Strukturen untersucht wurden, wobei herauskam, daß ähnlich wie das nicht reduzierende Saccharid bildende Enyzm von Rhizobium sp. M-11 jede Enzympräparation nicht reduzierende Saccharide mit Trehalosestruktur als Endeinheit und einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher bildete, wenn man es auf ein oder mehr reduzierende Stärketeilyhdrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher wirken läßt.
    • Experiment 14 Teilaminosäuresequenz des nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms Experiment 14 (1) Aminosäuresequenz, die den N-Terminus enthält
  • Ein Teil einer gereinigten Enzympräparation aus Rhizobium sp. M-11, die nach der Methode in Experiment 2 erhalten wurde und ein Teil einer gereinigten Enzympräparation aus Arthrobacter sp. Q36, die nach der Methode in Experiment 10 erhalten wurde, wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert, und etwa 80 ug Protein jeder erhaltenen Präparation wurde als Probe verwendet, um ihre Aminosäuresequenzen, die ihre N-Termini enthalten, zu bestimmen. Die Aminosäuresequenzen wurden mit einem "Protein sequencer Model 473A", ein Gerät von Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA, analysiert, um ihre 10 Aminosäuren von ihren N-Termini zu ermitteln. Teilaminosäuresequenzen, die die N-Termini enthalten, der Enzympräparationen sind in Tabelle 11 gezeigt.
    • TABELLE 11
  • Ursprung Teilaminosäuresequenz, die den N-Terminus enthält
  • Rhizobium sp. M-11 Valine (oder Methionin)-Arginin-Threonin-Prolin-Alanin-Serin-Threonin-Tyrosin-Arginin-Leucin
  • Arthrobacter sp. Q36 Methionin-Arginin-Threonin-Prolin-Valin-Serin-Threonin-Tyrosin-Arginin-Leucin
  • Wie aus Tabelle 11 ersichtlich ist, unterscheidet sich die Teilaminosäuresequenz, die den N-Terminus enthält, der Enzympräparation aus Rhizobium sp. M-11 von derjenigen von Arthrobacter sp. Q 36 dahingehend, daß der Aminosäurerest am N- Terminus des ersteren Valin oder Methionin ist und das das jenige des letzteren Methionin ist, während sie 8 gemeinsame Aminosäurereste unter den analysierten zehn Aminosäureresten aufweisen. Insbesondere stimmen sie vollständig miteinander dahingehend überein, daß sie dieselbe Aminosäuresequenz aus drei Aminosäureresten aufweisen, die sich zwischen dem L- Arginin entsprechend dem zweiten Aminosäurerest im Hinblick auf ihre N-Termini und dem L-Prolin entsprechend dem vierten Aminosäurerest im Hinblick auf ihre N-Termini befinden; sie haben ebenfalls die gleiche Aminosäuresequenz aus fünf Aminosäureresten, die sich zwischen dem L-Serin entsprechend dem sechsten Aminosäurerest im Hinblick auf ihre N-Termini und dem L-Leucin entsprechend dem zehnten Aminosäurerest im Hinblick auf ihre N-Termini befinden. Es ist festgestellt worden, daß diese Enzympräparationen eine gemeinsame Teilaminosäuresequenz aufweisen, die als N-Terminus X&sub1;-Arginin-Threonin-Prolin-X&sub2;- Serin-Threonin-Tyrosin-Arginin-Leucin-, (worin "X&sub1;" Valin oder Methionin und "X&sub2;" Alanin oder Valin bedeuten) enthalten.
    • Experiment 14 (2) Interne Teilaminosäuresequenz
  • Ein Teil einer gereinigten Enzympräparation aus Rhizobium sp. M-11, die nach der Methode in Experiment 2 erhalten wurde und ein Teil einer gereinigten Enzympräparation aus Arthrobacter sp. Q 36, die nach der Methode in Experiment 10 erhalten wurde, wurden gegen 10 mMol Tris-HCL-Puffer (pH 9,0) dialysiert, und die Ergebnisse wurden jeweils mit einer frischen Präparation des gleichen Puffers bis etwa 1 mg/ml verdünnt. Zu einem ml Aliquots der erhaltenen Lösungen wurden 10 ug "Lysyl Endopeptidase", im Handel erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, gegeben und man ließ bei 30ºC für 22 Stunden zur Bildung von Peptiden reagieren. Die erhaltenen Mischungen wurden einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Umkehrphasen HPLC) zur Auftrennung der Peptide unterworfen. Das Gerät und die Bedingungen zur Abtrennung der Peptide der Enzympräparation aus Rhizobium sp. M-11 mittels Umkehrphasen-HPLC waren eine "CAPCELL PAK C18 Säule", mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 250 mm, ein Produkt von Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan; eine Fließrate von 0,6 mm/Min, eine Temperatur bei Umgebungstemperatur, eine Elutionszeit von 60 Minuten und ein Gradient in Form eines linearen Gradienten einer Lösung, die 0,1 V/V-% Trifluoracetat und Acetonitril im Bereich von 16-48 V/V-% enthielten. Das Gerät und die Bedingungen für die Auftrennung der Peptide der Enzympräparation aus Arthrobacter sp. Q 36 mittels Umkehrphasen-HPLC waren eine "u-Bondapak C18 Säule" mit einem Durchmesser von 2,1 mm und einer Länge von 150 mm, ein Produkt von Waters, Chromatography Div., MILLIPORE Corp., Milford, USA; eine Fließrate von 0,9 ml/Min., eine Temperatur bei Umgebungstemperatur, eine Elutionsdauer von 60 Minuten und ein Gradient in Form eines linearen Gradienten einer Lösung, die 0,1 V/V-Trifluoracetat und Acetonnitril im Bereich von 30-55 V/V-% enthielt.
  • Die von den Säulen eluierten Peptide wurden durch Überwachung der Absorption bei einer Wellenlänge von 210 nm nachgewiesen. Aus der Enzympräparation von Rhizobium sp. M-11 wurden drei Peptide mit den Bezeichnungen R 37, R 40 und R 42 mit den jeweiligen Retentionszeiten von etwa 37, 40 und 42 und aus der Enzympräparation von Arthrobacter sp. Q 36 drei Peptide mit den Bezeichnungen A 17, A 22 und A 40 mit den jeweiligen Retentionszeiten von etwa 17, 22 und 40 nach der Abtrennung konkurrierender Peptide gewonnen, wonach die erhaltenen Peptide im Vakuum getrocknet wurden und diese in 200 ul-Aliquotlösungen mit verschiedenen Konzentrationen von 0,1-50% Acetonitril gelöst wurden. Jede in dieser Weise erhaltene Peptidprobe wurde einem Proteinsequenziergerät unterworfen, um ihre Aminosäuresequenz bis zu 10 Aminosäureresten zu bestimmen. Die analysierten internen Teilaminosäuresequenzen sind in Tabelle 12 gezeigt. TABELLE 12
  • Wie aus Tabelle 12 zu ersehen ist, stimmte die Teilaminosäuresequenz von Peptid R 37 mit der Enzympräparation aus Rhizobium sp. M-11 vollständig mit derjenigen von Peptid R 40 überein, während diejenige von Peptid R 40 vollständig mit derjenigen von Peptid A 22 übereinstimmte. Die Peptide R 42 und A 40 weisen sieben gemeinsame Aminosäurereste unter den analysierten zehn Aminosäureresten auf, das heißt, die Peptide R 42 und A 40 haben die gemeinsame Teilaminosäuresequenz Glutarsäure- Glycin-Arginin-X&sub3;-Serin-X&sub4;-Tyrosin-Alanin-X&sub5;-Alanin (worin "X&sub3;" Glycin oder Glutamin, "X&sub4;" Prolin oder Arginin und "X&sub5;" Valin oder Glutarsäure bedeuten) auf.
  • Die folgenden Beispiele A erläutern die Herstellung der vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten und Trehalose; und die Beispiele B erläutern Zusammensetzungen, die ein oder mehr dieser Saccharide und Trehalose enthalten.
    • Beispiel A-1
  • Eine Impfkultur von Rhizobium sp. M-11 (FERM BP 4130) wurde in ein Nährkulturmedium geimpft und in einem Fermentor für etwa 36 Stunden nach der Methode in Experiment 1 inkubiert. Nach Vervollständigung der Inkubation wurde die erhaltene Kultur zur Entfernung der Zellen mit einer SF-Membran filtriert, wobei ein Filtrat von etwa 18 l erhalten wurde, das dann mit einer UF-Membran eingeengt wurde, wobei etwa 1 l einer konzentrierten Lösung, die 17,7 Einheiten/ml des vorliegenden nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms enthielt, erhalten wurde.
  • Eine 6%ige Suspension Kartoffelstärke d. s. b. wurde durch Erhitzen gelatiniert, auf einen pH von 4,5 und 50ºC eingestellt, mit 2.500 Einheiten pro Gramm Stärke Isoamylase, im Handel erhältlich von Hayashibara Biochemical, Laboratories, Co., Okayama, Japan, vermischt und einer enzymatischen Reaktion für 20 Stunden unterworfen. Die erhaltene Mischung wurde auf einen pH von 6,0 eingestellt, bei 120ºC über 10 Minuten autoklaviert, auf 45ºC abgekühlt, mit 150 Einheiten pro Gramm Stärke "Termamyl 60L", eine α-Amylase, im Handel erhältlich von Novo Industries A/S, Kopenhagen, Dänemark, vermischt und einer enzymatischen Reaktion für 24 Stunden unterworfen.
  • Die Reaktionsmischung wurde bei 120ºC während 20 Minuten autoklaviert, auf 45ºC abgekühlt, mit einer Einheit pro Gramm Stärke des obigen nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms vermischt und einer enzymatischen Reaktion von 96 Stunden unterworfen. Die erhaltene Mischung wurde bei 95ºC über 10 Minuten gehalten, abgekühlt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt und durch Aussalzen mit Ionenaustauscherharzen in der H- und OH-Form gereinigt. Die erhaltene Lösung wurde in einen 70%igen Sirup in einer Ausbeute von etwa 91%, d. s. b., eingeengt.
  • Das Produkt zeigt ein DE von 18,8 und enthält 8,3% P I, 5,5% P II, 37,7% P III, 1,4% P IV und 1,3% P V, d. s. b. Das Produkt hat eine milde Süße hoher Qualität und auch eine geeignete Viskosität und Feuchtigkeitserhaltungsvermögen, so daß dieses insbesondere in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff verwendbar ist.
    • Beispiel A-2
  • Eine Saccharidlösung als Aufgabenlösung, die nach der Methode in Beispiel A-1 erhältlich war, wurde unter Verwendung einer Säule, die mit "XT-016 (Na&spplus;-Form, Polymerisationsgrad 4%)", ein stark saures Alkalimetall-Kationenaustauscherharz, im Handel erhältlich von Tokyo Organic Chemical, Industries, Ltd., Tokyo, Japan, fraktioniert. Das Verfahren war folgendermaßen: das Gel wurde in vier mit rostfreiem Stahl ummandelten Säulen mit einem Innendurchmesser von 5,4 cm gepackt, und die Säulen wurden in Serie bis zu einer Gesamtgelbetttiefe von 20 m geschaltet. Die Säulen wurden bis zu einer Innensäulentemperatur von 55ºC erhitzt und mit 5 V/V-% der Saccharidlösung ausgegeben, während bei der Temperatur gehalten wurde, und die Saccharidlösung wurde fraktioniert, indem auf die Säulen 55ºC heißes Wasser gegeben wurde, um Fraktionen zu entfernen, die reich an Glukose und Maltose waren, wonach dann Fraktionen gewonnen worden, die reich an nicht reduzierenden Sacchariden waren. Die Fraktionen, die reich an nicht reduzierenden Sacchariden waren, wurden vereint, gereinigt, eingeengt, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, wobei ein pulverförmiges Produkt erhalten wurde, das nicht reduzierende Saccharide in einer Ausbeute von etwa 61%, d. s. b., enthielt.
  • Das Produkt zeigt ein DE von 5,7 und enthält 9,3% P I, 7,4% P II, 55,5% P. III, 2,1% P IV und 1,9% P V, d. s. b. Ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-1, hatte das Produkt eine milde Süße hoher Qualität und auch eine entsprechende Viskosität und Feuchtigkeiterhaltungsvermögen, so daß es insbesondere in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff verwendbar ist.
    • Beispiel A-3
  • Eine 33%ige Suspension aus Maisstärke, d. s. b., wurde mit Calciumcarbonat bis zu einer Endkonzentration von 0,1%, d. s. b., vermischt, und die erhaltene Mischung wurde auf einen pH von 6,5 eingestellt, mit 0,2%, d. s. b., pro Gramm Stärke "Termamyl 60 L", eine α-Amylase, im Handel erhältlich von Novo Industries A/S Kopenhagen, Dänemark, vermischt und einer Enzymreaktion bei 95ºC über 15 Minuten unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 120ºC für 10 Minuten autoklaviert, auf 55ºC abgekühlt, mit 5 Einheiten pro Gramm Stärke einer Maltotetraose bildenden Amylase, im Handel erhältlich von Hayashibara, Biochemical, Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vermischt, und einer Enzymreaktion über sechs Stunden unterworfen. Die erhaltene Mischung wurde mit 30 Einheiten pro Gramm Stärke "α- Amylase 2A", eine α-Amylase, im Handel erhältlich von Ueda Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan, vermischt und einer Enzymreaktion bei 65ºC für 4 Minuten unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 120ºC für 10 Minuten autoklaviert, auf 45ºC abgekühlt, mit 2 Einheiten pro Gramm Stärke eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms, das nach der Methode in Beispiel A-1 hergestellt war, vermischt und einer Enzymreaktion über 64 Stunden unterworfen. Das erhaltene Gemisch wurde bei 95ºC für 10 Minuten gehalten, abgekühlt und filtriert, um ein Filtrat zu erhalten, das dann mit Aktivkohle in üblicher Weise entfärbt wurde und durch Aussalzen mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form gereinigt wurde, wonach dann die erhaltene Lösung eingeengt wurde, wobei ein 70%iger Sirup in einer Ausbeute von etwa 90%, d. s. b., erhalten wurde.
  • Das Produkt zeigt ein DE von 10,5 und enthält 3,7% P I, 43,7 % P II, 1,2% P III, 1,1% P IV und 0,6% P V, d. s. b. Das Produkt hat eine milde Süße hoher Qualität und auch eine entsprechende Viskosität und Feuchtigkeitserhaltungsvermögen, so daß es insbesondere in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff verwendbar ist.
    • Beispiel A-4
  • Eine Saccharidlösung als Aufgabelösung, die nach der Methode in Beispiel A-3 hergestellt war, wurde auf der Säule nach der Methode in Beispiel A-2 chromatographiert, mit der Ausnahme, daß "50 W-X4 (Mg&spplus;&spplus;-Form)", ein stark saures Kationenaustauscherharz, im Handel erhältich von Dao Chemical, Midland, Michigan, USA, als Harz für die Fraktionierung verwendet wurde, um den Gehalt des nicht reduzierenden Saccharids P II (DP 4) zu erhöhen und eine Fraktion zu erhalten, die reich an dem nicht reduzierenden Saccharid P II ist. Die Fraktion wurde gereinigt, eingeengt und sprühgetrocknet, wobei ein pulverförmiges Produkt erhalten wurde, das reich an nicht reduzierenden Sacchariden war, in einer Ausbeute von etwa 40%, d. s. b.
  • Das Produkt enthält 8,5% P I, 68,0% P II und 1,4% P III, d. s. b., als nicht reduzierendes Saccharid und zeigt einen DE von 3,5 und hat im wesentlichen kein oder nur ein geringes Reduktionsvermögen. Ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-3 hat das Produkt eine milde Süße hoher Qualität und auch eine entsprechende Viskosität und Feuchtigkeitshaltevermögen, so daß es insbesondere in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff verwendbar ist.
    • Beispiel A-5
  • Zu einer 20%igen wäßrigen Lösung aus Maltopentaose, im Handel erhältlich von Hayashibara Biochemical, Laboratories, Inc., Okayama, Japan, wurden 1,0 Einheiten pro Gramm Maltopentaose eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms, das nach der Methode in Beispiel A-1 hergestellt war, gegeben und einer enzymatischen Reaktion bei 45ºC für 48 Stunden unterworfen.
  • Die enzymatische Reaktion führte zur Umwandlung von etwa 93%, d. s. b., Maltopentaose in das nicht reduzierende Saccharid P III. Das Reaktionsgemisch wurde bei 95ºC für 10 Minuten gehalten, abgekühlt und filtriert, um ein Filtrat zu erhalten, daß dann in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt wurde, mit Ionenaustauscherharzen in H- und OH-Form entsalzen wurde und eingeengt wurde. Zur Erhöhung des Gehalts des nicht reduzierenden Saccharids P III (DP 5), wurde das erhaltene Konzentrat ähnlich wie in Beispiel A-2 auf der Säule unter Verwendung eines stark sauren Alkalimetall Kationenaustauscherharzes chromatographiert, um eine Fraktion zu erhalten, die reich an P III war. Die Fraktion wurde gereinigt, eingeengt und sprühgetrocknet, wobei ein pulverförmiges Produkt erhalten wurde, das nicht reduzierende Saccharide hoher Reinheit in einer Ausbeute von etwa 55%, d. s. b., enthielt.
  • Das Produkt enthielt 99,0% P III als nicht reduzierendes Saccharid, d. s. b., und zeigte ein DE von weniger als 0,2, was ein extrem niedriger Wert ist. Das Produkt hat eine leichte Süße und kann in geeigneter Weise in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel und Stabilisator angewendet werden.
    • Beispiel A-6
  • 40 Gew.-Teile "PINE-DEX #4", ein Stärketeilhydrolysat, im Handel erhältlich von Matsutani Chemical Ind., Tokyo, Japan, wurden in 60 Gew.-Teilen Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wurde auf 45ºC erhitzt, auf einen pH von 6,5 eingestellt, mit einer Einheit pro Gramm Stärketeilhydrolysat eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms, das nach der Methode in Beispiel A-1 hergestellt war, vermischt und einer Enzymreaktion für 96 Stunden unterworfen, während die Temperatur und der pH gehalten wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch bei 100ºC für 10 Minuten erhitzt, um das Restenzym zu inaktivieren, auf eine Konzentration von etwa 20%, d. s. b., verdünnt, mit 10 Einheiten pro Gramm Stärketeilhydrolysat "GLUCOZYME", eine Glukoamylase, im Handel erhältlich von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, vermischt und einer Enzymreaktion über 40 Stunden unterworfen, wonach dann die erhaltene Mischung zur Inaktivierung des Restenzyms erhitzt wurde. Die in dieser Weise erhaltene Mischung wurde in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, mit einem Ionenaustauscherharz entsalzen und bis zu einer Konzentration von 60%, d. s. b., eingeengt.
  • Die in dieser Weise erhaltene Saccharidlösung enthielt 29,5% Trehalose, d. s. b., die Saccharidlösung wurde auf der Säule nach der Methode in Beispiel A-2 chromatographiert, mit der Ausnahme, daß "CG 6000 (Na&spplus;-Form)", ein stark saures Kationenaustauscherharz, im Handel erhältlich von Japan Organo Co., Ltd., Tokyo, Japan, als Harz für die Fraktionierung verwendet wurde, wonach eine Fraktion, die reich an Trehalose war, gewonnen wurde. Die Fraktion enthielt etwa 90% Trehalose, d. s. b. Die Fraktion wurde in eine 75%ige Lösung eingeengt, die dann in einen Kristallisator eingegeben wurde, mit etwa 2 %, d. s. b., wasserhaltiger kristalliner Trehalose als Impfkristall vermischt und allmählich abgekühlt, um eine Kristallmasse mit einem Kristallisationsgrad von etwa 45% zu erhalten. Die Kristallmasse wurde aus einer Düse, die auf der Spitze eines Sprühturms angebracht war, bei einem Druck von 150 kg/cm² gesprüht. In der Sprühstufe wurde die Kristallmasse gleichzeitig mit einer 85ºC heißen Luft ventiliert, die von der Spitze des Sprühturms kam, und das erhaltene kristalline Pulver wurde auf einem Metalldrahtnetzförderband gesammelt, das im unteren Teil des Sprühturms angebracht war und allmählich aus dem Turm bewegt, während ein Storm mit 40ºC Luft nach oben durch das Metalldrahtnetz gelassen wurde. Das erhaltene kristalline Pulver wurde in einen Alterungsturm eingespritzt und für 10 Stun den zur Vervollständigung der Kristallisation und des Trocknens gealtert, wonach dann pulverförmige wasserhaltige kristalline Trehalose gewonnen wurde.
  • Das Produkt war im wesentlichen nicht Hygroskop und zeigte eine zufriedenstellene Handhabbarkeit, so daß es in vorteilhafter Weise in Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff verwendbar ist.
    • Beispiel A-7
  • Ein Gew.-Teil Kartoffelstärke wurde unter Rühren mit 6 Gew.- Teilen Wasser, das 0,01% pro Gramm Stärke "NEO-SPITASE", eine α-Amylase, im Handel erhältlich von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, enthielt, vermischt, und die erhaltene Suspension wurde auf einen pH von 6,0 eingestellt, auf 85-90ºC erhitzt und gleichzeitig bei dieser Temperatur gelatiniert und verflüssigt. Danach wurde das Ergebnis sofort auf 120ºC für 5 Minuten erhitzt, um das DE (Dextroseäquivalent) unterhalb von 1,0 zu halten, schnell auf 55ºC gekühlt, auf einen pH von 7,0 eingestellt, mit 150 Einheiten pro Gramm Stärke "PULLULANASE (EC 3.2.1.41)", eine Enzymprobe, im Handel erhältlich von Hayashibara Chemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, und 8 Einheiten pro Gramm Stärke eines Maltotetraose bildenden Enzyms, das in Beispiel A-3 beschrieben wurde, vermischt und einer Enzymreaktion bei einem pH von 7,0 und 50ºC über 36 Stunden unterworfen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde bei 120ºC über 10 Minuten autoklaviert, auf 45ºC abgekühlt, mit 2 Einheiten pro Gramm Stärke eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms aus Brevibacterium helovolum ATCC 11822, das nach der Methode in Ex periment 13 hergestellt war, vermischt und einer Enzymreaktion für 64 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 95ºC für 10 Minuten erhitzt, gekühlt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde in üblicher Weise mit Aktivkohle entfärbt, ausgesalzen und mit Ionenaustauscherharzen der H- und OH-Form gereinigt. Die erhaltene Lösung wurde eingeengt und sprühgetrocknet, wobei ein pulverförmiges nicht reduzierendes Saccharid in einer Ausbeute von etwa 90%, d. s. b., erhalten wurde.
  • Das Produkt zeigt einen DE von 11,2, enthält 2,9% P I, 61,5% P II und 0,8% P III, d. s. b., und hat eine milde Süße hoher Qualität sowie eine zufriedenstellende Viskosität und Feuchtigkeitserhaltungsvermögen, so daß es insbesondere in Zusammensetzungen, wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel und Stabilisator verwendbar ist.
    • Beispiel A-8
  • Eine Impfkultur eines Mikroorganismus von Arthrobacter sp. Q36 (FERM BP-4316), wurde in ein Nährkulturmedium geimpft und mit einem Fermenter für etwa 42 Stunden nach der Methode in Experiment 9 gezüchtet. Die erhaltene Kultur wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, und der entstandene Überstand wurde auf das etwa 10-fache mit einer UF-Membran eingeengt, wobei eine Enzymlösung erhalten wurde, die etwa 15,2 Einheiten/ml des vorliegenden nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms enthielt.
  • Nach der Methode in Beispiel A-3 wurde eine 30%ige Suspension von Maisstärke der Wirkung einer α-Amylaseprobe, im Handel erhältlich von Novo Industries A/S. Kopenhagen, Dänemark, einer Maltotetraose bildenden Amylaseprobe, im Handel erhältlich von Hayashiabara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan und einer α-Amylaseprobe, im Handel erhältlich von Ueda Chemical, Co., Ltd., Osaka, Japan, unterworfen. Die erhaltene Mischung wurde bei 120ºC autoklaviert, auf 45ºC abgekühlt, mit 2 Einheiten pro Gramm Stärke eines nicht reduzierendes Saccharid bildenden Enzyms, das nach der oben erwähnten Methode hergestellt war, vermischt und einer Enzymreaktion über 64 Stunden unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde auf 100ºC für 10 Minuten zur Inaktivierung des Restenzyms erhitzt. Nach der Methode in Beispiel A-6 wurde die erhaltene Lösung der Wirkung von Glukoamylase, im Handel erhältlich von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, unterworfen, entfärbt, entsalzen und in eine etwa 60%ige Lösung eingeengt. Die in dieser Weise erhaltene Saccharidlösung enthielt etwa 25% Trehalose, d. s. b. Die Saccharidlösung wurde auf der Säule unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes fraktioniert, um Fraktionen zu erhalten, die reich an Trehalose waren. Die Fraktionen wurden vereint, in einen Behälter eingegeben und unter vermindertem Druck in einem Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 4% heruntergekocht. Der Sirup wurde in einen Kristallisator eingegeben und mit 1% wasserfreier kristalliner Trehalose als Impfkristall, bezogen auf den Sirup, d. s. b., vermischt, wonach die wasserfreie kristalline Trehalose bei 95ºC für 5 Minuten unter Rühren kristallisiert wurde. Das Ergebnis wurde in einen Aluminiumbehälter übertragen und bei 100ºC für sechs Stunden unter Bildung eines Blocks gealtert. Der erhaltene Block wurde mit einer Schneidemaschine pulverisiert und einer Trocknung im Wirbelbett unterworfen, wobei pulverförmige wasserfreie kristalline Trehalose mit einem Flüssigkeitsgehalt von etwa 0,3% erhalten wurde.
  • Das Produkt kann in geeigneter Weise in wäßrigen Medien, wie Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika und ihren Materialien und Zwischenprodukten als Entwässerungsmittel und auch als weißes pulverförmiges Süßungsmittel mit hoher Qualität und milder Süße eingesetzt werden.
    • Beispiel B-1 Süßungsmittel
  • Zu einem Gewichtsteil eines pulverförmigen Produkts, das reich an nicht reduzierenden Sacchariden ist und nach der Methode in Beispiel A-4 hergestellt war, wurden gleichmäßig 0,1 Gew.- Teile "αG Sweet", ein α-Glycosylsteviosid, im Handel erhältich von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan, und 0,01 Gew.-Teile L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, im Handel erhältlich von Ajinomoto Co., Ltd., gegeben, und die Mischung wurde in einem Granulator überführt, um einen körnchenförmigen Süßstoff zu erhalten. Das Produkt hatte eine zufriedenstellene Süße und ein um das zweifache verstärkte Süßungsvermögen von Saccharose, und der Kalorienwert war auf etwa die Hälfte desjenigen von Saccharose vermindert.
  • Das Produkt, das eine zufriedenstellende Stabilität aufweist, beeinflußt weder andere Süßstoffe mit relativ starkem Süßvermögen, wenn es mit diesen vermischt wird, noch zerstört es diese, und deswegen kann es in geeigneter Weise als Süßstoff mit niedrigem Kalorienwert in Nahrungsmittelprodukten mit niedrigem Kalorienwert für dicke Personen und Diabetiker, die auf eine verringerte Kalorienaufnahme angewiesen sind, verwendet werden.
  • Das Produkt bildet kaum Säuren und unlösliche Glukane, wenn Dentalkaries induzierende Mikroorganismen darauf wirken, so daß es für das Süßen von Nahrungsmittelprodukten für die Verhütung von Dentalkaries verwendbar ist.
    • Beispiel B-2 Hartes Bonbon
  • 100 Gew.-Teile einer 55%igen Saccharoselösung wurden mit 30 Gew.-Teilen eines Sirups, der nicht reduzierende Saccharide enthält, die nach der Methode in Beispiel A-3 hergestellt waren, vermischt, und die erhaltene Mischung wurde durch Erhitzen im Vakuum eingeengt, bis sich der Feuchtigkeitsgehalt auf unterhalb von 2% erniedrigte. Die konzentrierte Lösung wurde mit 1 Gew.-Teil Zitronensäure und geeigneten Mengen Zitronengeschmack und einem Färbemittel vermischt, und die erhaltene Mischung wurde in üblicher Weise hergestellt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt ist ein hartes Bonbon hoher Qualität mit einem zufriedenen Geschmack und Beißeigenschaft und es besteht keine Gefahr, daß sich die Form ändert und somit die Kristallisation von Saccharose verursacht wird.
    • Beispiel B-3 Kaugummi
  • 3 Gew.-Teile einer Gummibasis wurden durch Erhitzen bis zur Erweichung geschmolzen, und das Ergebnis wurde mit 4 Gew.- Teilen Saccharose und 3 Gew.-Teilen eines wasserhaltigen kristallinen Pulvers, das nach der Methode in Beispiel A-6 hergestellt war, vermischt, und weiter mit entsprechenden Mengen eines Aromas und eines Färbemittels vermischt. Die erhaltene Mischung wurde mit einer Walze in üblicher Weise geknetet, in Form gebracht und verpackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt ist ein Kaugummi mit zufriedenstellender Textur und Aroma.
    • Beispiel B-4 Gesüßte Kondensmilch
  • 3 Gew.-Teile eines Sirups, der nicht reduzierende Saccharide, die nach der Methode in Beispiel A-1 hergestellt waren, enthielt und ein Gew.-Teil Saccharose wurden in 100 Gew.-Teilen frischer Milch gelöst, und die erhaltene Lösung wurde durch Erhitzen mit einem Plattenheizgerät sterilisiert und in eine 70%ige Lösung eingeengt, wonach aseptisch das Ergebnis in das geeignete Produkt konserviert wurde.
  • Das Produkt mit milder Süße und einem zufriedenstellenden Aroma kann in geeigneter Weise als Gewürz für Babynahrungsmittel, Früchte, Kaffee, Kakao und Tee verwendet werden.
    • Beispiel B-5 Getränk, das Milchsäurebakterien enthält
  • 175 Gew.-Teile entfettete Milch, 80 Gew.-Teile eines Pulvers mit einem hohen Gehalt an nicht reduzierendem Saccharid, das nach der Methode in Beispiel A-2 hergestellt war und 50 Gew.- Teile eines Pulvers mit hohem Laktosaccharosegehalt, das in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 281,795/92 beschrieben ist, wurden in 1.200 Gew.-Teilen Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wurde unter Erhitzen bei 65ºC für 30 Minuten sterilisiert, auf 40ºC abgekühlt, in üblicher Weise mit 30 Gew.-Teilen Milchsäurebakterien als Starter vermischt und bei 37ºC für 8 Stunden inkubiert, wobei ein Getränk erhalten wurde, das Milchsäurebakterien enthielt.
  • Das Produkt ist ein milchsäurenbakterienhaltiges Getränk mit zufriedenstellendem Geschmack und Aroma. Das oligosaccharidhaltige Produkt hält stabil die Milchsäurebakterien und fördert das Wachstum von Bifidusbakterien.
    • Beispiel B-6 Pulversaft
  • 33 Gew.-Teile eines pulverförmigen Orangensafts, der durch Sprühtrocknen hergestellt war, wurden bis zur Homogenität unter Rühren mit 50 Gew.-Teilen eines Pulvers, das reich an nicht reduzierenden Sacchariden war und nach der Methode in Beispiel A-2 hergestellt war, 10 Gew.-Teilen Saccharose, 0,65 Gew.-Teilen wasserfreier Zitronensäure, 0,1 Gew.-Teilen Apfelsäure, 0,1 Gew.-Teilen L-Ascorbinsäure, 0,1 Gew.-Teilen Natriumcitrat, 0,5 Gew.-Teilen Pullulan und einer geeigneten Menge eines pulverförmigen Aromas vermischt. Die erhaltene Mischung wurde pulverisiert, in einen Wirbelbett-Granulator überführt und für 30 Minuten granuliert, indem darauf ein Sirup, der nicht reduzierende Saccharide als Bindemittel enthielt und nach der Methode in Beispiel 1 hergestellt war, gesprüht wurde, während darauf 40ºC warme Luft aufgebracht wurde. Die in dieser Weise erhaltenen Granulae wurden gewogen und verpackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt enthält 30% Orangensaft, d. s. b. Das Produkt war für einen relativ langen Zeitraum stabil, ohne daß sich ein unzufriedener Geschmack und Geruch einstellte.
    • Beispiel B-7 Eiercreme
  • 100 Gew.-Teile Maisstärke, 100 Gew.-Teile eines Sirups, der nicht reduzierende Saccharide enthielt, die nach der Methode in Beispiel A-3 hergestellt waren, 80 Gew.-Teile Maltose, 20 Gew.-Teile Saccharose und 1 Gew.-Teil Salz wurden bis zur Homogenität vermischt. Die erhaltene Mischung wurde mit 280 Gew.-Teilen Eiern vermischt und allmählich mit 1.000 Gew.- Teilen kochender Milch versetzt. Die in dieser Weise erhaltene Mischung wurde unter Erhitzen kontinuierlich gerührt, und das Erhitzen wurde beendet, als die Maisstärke in der Mischung vollständig gelatiniert war, wobei der Inhalt insgesamt halb transparent, wonach dann das Ergebnis abgekühlt wurde und dazu eine entsprechende Menge Vanillearoma gegeben wurde. Die erhaltene Mischung wurde ausgewogen, eingespritzt und verpackt, wobei das erhaltene Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt hatte eine glatte Oberfläche und Glanz und auch einen milden Geschmack und Süße.
    • Beispiel B-8 An (Bohnenpaste)
  • 10 Gew.-Teile adzuki-Bohnen als Material wurden durch Zugabe von Wasser in üblicher Weise gekocht, wonach die Astringenz und Bitterkeit der Bohnen und auch wasserunlösliche Verunreinigungen entfernt wurden, so daß etwa 21 kg "adzuki-tsubu-an" erhalten wurden. Dazu wurden 14 Gew.-Teile Saccharose, 5 Gew.- Teile eines Sirups, der nicht reduzierende Saccharide enthielt, die nach der Methode in Beispiel A-3 hergestellt waren, und 4 Gew.-Teile Wasser gegeben, und die erhaltene Mischung wurde gekocht, mit einer kleinen Menge Salatöl vermischt und vorsichtig geknetet, um nicht die Bohnen zu verkleben. Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von etwa 35 kg erhalten.
  • Das Produkt, das nicht durch das Kochen entfärbt war, hatte einen zufriedenstellenden Geschmack und Aroma, so daß es als Material für süße Brötchen mit Bohnenmarmelade, süße Brötchen mit Bohnenmarmeladefüllung, Klöße, mit Bohnenmarmelade gefüllten Waffeln, Sorbets und Eis geeignet ist.
    • Beispiel B-9 Brot
  • 100 Gew.-Teile Weizenpulver, 2 Gew.-Teile Hefe, 5 Gew.-Teile Zucker, 1 Gew.-Teil eines Pulvers, das nicht reduzierende Saccharide enthielt und nach der Methode in Beispiel A-7 hergestellt war, 0,1 Gew.-Teile eines anorganischen Hefenahrungsmittels wurden mit Wasser in üblicher Weise verknetet, um eine Fermentierung bei 26ºC für 2 Stunden zu bewirken, und des weiteren für 30 Minuten gealtert, wonach dann das Ergebnis aufgebacken wurde.
  • Das Produkt ist ein Brot hoher Qualität mit zufriedenstellender Feuchtigkeit und Aufgehvermögen, und es weist ebenfalls eine zufriedenstellende Elastizität und milde Süße auf.
    • Beispiel B-10 Schinken
  • Zu 1000 Gew.-Teilen Schinkenfleischstücken wurden 15 Gew.- Teile Salz und 3 Gew.-Teile Kaliumnitrat gegeben, welche bis zur Homogenität gemahlen waren, und die erhaltenen Stücke wurden aufgeschichtet und über Nacht in einem kalten Lagerraum stehengelassen. Danach wurden die erhaltenen Stücke zunächst über sieben Tage in dem kalten Lagerraum in eine Salzlösung, die aus 500 Gew.-Teilen Wasser, 100 Gew.-Teilen Salz, 3 Gew.- Teilen Kaliumnitrat, 40 Gew.-Teilen eines Pulvers, das nicht reduzierende Saccharide enthielt und nach der Methode in Beispiel A-7 hergestellt war und einer geeigneten Menge Pfefferminz eingetaucht, dann in üblicher Weise mit kaltem Wasser gewaschen, aufgehangen, geräuchert, gekocht, abgekühlt und verpackt, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Das Produkt ist ein Schinken hoher Qualität mit zufriedenstellender Feuchtigkeit, Geschmack und Aroma.
    • Beispiel B-11 Pulverförmiges Peptid
  • 50% "Hinute S", eine Peptidlösung von eßbaren Sojabohnen, im Handel erhältlich von Fuji Oil Co., Ltd., Tokyo, Japan, wurden mit 2 Gew.-Teilen eines Pulvers, das wasserfreie kristalline Trehalose enthielt und nach der Methode in Beispiel A-6 hergestellt war, vermischt, und die erhaltene Mischung wurde in einen Kunststoffbehälter eingegeben, im Vakuum bei 50ºC getrocknet und pulverisiert, wobei ein pulverförmiges Peptid erhalten wurde. Das Produkt mit einem zufriedenstellendem Geschmack und Aroma kann in geeigneter Weise als Material für Süßwaren, wie Vormischungen, Sorbets und Eis und auch in Babynahrungsmittel und als therapeutisches Nahrungsmittel in Form von oralen Nahrungsmitteln und Intubationsnahrungsmitteln verwendet werden.
    • Beispiel B-12 Pulverförmiges Eigelb
  • Eigelbe, die aus frischen Eiern hergestellt waren, wurden bei 60-64ºc mit einem Plattenheizgerät sterilisiert, und die erhaltene Flüssigkeit wurde mit vier Gew.-Teilen einer pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose, die nach der Methode in Beispiel A-8 hergestellt war, bezogen auf einen Teil der Flüssigkeit, vermischt. Die erhaltene Mischung wurde in einen Behälter übertragen, über Nacht unter Bildung eines Blocks stehengelassen, während die wasserfreie kristalline Trehalose sich in wasserhaltige kristalline Trehalose umwandeln konnte. Der in dieser Weise erhaltene Block wurde mit einer Schneidemaschine pulverisiert, wobei pulverförmiges Eigelb erhalten wurde.
  • Das Produkt kann in geeigneter Weise als Material für Süßwaren für Vormischungen, Sorbets, Eis und Emulgatoren, und auch als Babynahrungsmittel und therapeutische Nahrung in Form von oralen Nahrungsmitteln und Intubationsnahrungsmitteln verwendet werden. Das Produkt kann ebenfalls als Hautverbesserungsmittel und Haarwuchsmittel verwendet werden.
    • Beispiel B-13 Kosmetische Creme
  • 2 Gew.-Teile Polyoxyethylenglykolmonostearat, 5 Gew.-Teile Glycerylmonostearat, selbstemulgierend, 2 Gew.-Teile eines Pulvers, das reich an nicht reduzierenden Sacchariden war und nach der Methode in Beispiel A-2 hergestellt war, ein Gew.- Teil α-Glycosylrutin, ein Gew.-Teil flüssige Rohvaseline, 10 Gew.-Teile Glyzeryl-tri-2-ethylhexanoat, und eine geeignete Menge eines Antiseptikums wurden unter Erhitzen in üblicher Weise gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 Gew.-Teilen L- Milchsäure, 5 Gew.-Teilen 1,3-Butylenglykol und 66 Gew.-Teilen destilliertem Wasser versetzt, und die erhaltene Mischung wurden in einem Homogenisator emulgiert und unter Rühren mit einer geeigneten Menge eines Aromas vermischt, um eine kosmetische Creme zu erhalten.
  • Das Produkt zeigt eine Antioxidanswirkung und weist eine relativ hohe Stabilität auf, so daß es insbesondere als Sonnenschutzmittel hoher Qualität, Hautverbesserungsmittel und Hautbleichmittel verwendbar ist.
    • Beispiel B-14 Festes Pharmazeutikum
  • Auf eine Säule eines immobilisierten anti-humanen α-Interferon-Antikörper wurde in üblicher Weise eine natürliche menschliche α-Interferon-Präparation, im Handel erhältich von Cosmo Bio, Tokyo, Japan, gegeben, um das α-Interferon zu adsorbieren, wonach ein Pulver, der Kalbsserum albumin als Stabilisator enthielt, aufgegeben wurde, wonach dann überschsüssige Mengen an Albumin entfernt wurden. Danach wurde das α- Interferon mit physiologischer Kochsalzlösung, die 5% eines hoch reinen nicht reduzierenden Saccharids, d. s. b., erhalten nach der Methode in Beispiel A-5, eluiert, während der pH-Wert der physiologischen Kochsalzlösung verändert wurde.
  • Das erhaltene Eluat wurde auf der Membran filtriert, und das Filtrat wurde durch das etwa 20-fache Volumen "FINETOSE®", ein wasserfreies kristallines Maltosepulver, im Handel erhältlich von Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japan, dehydratisiert, wonach das erhaltene dehydratisierte Produkt pulverisiert wur de und mit einer Tablettiermaschine in Tabletten umgewandelt wurde, die etwa 150 Einheiten natürliches menschliches α- Interferon pro Tablette, 200 mg Gewicht, enthielten.
  • Das Produkt kann oral als sublinguale Tabletten an Patienten in einer Dosis von 1-10 Tabletten/Erwachsener/Tag verabreicht werden, und es kann in geeigneter Weise zur Behandlung von Viruserkrankungen, Allergien, Rheumatismus, Diabetis und malignen Tumoren angewendet werden. Insbesondere kann das Produkt in geeigneter Weise als therapeutisches Mittel gegen Aids und Hepatitis eingesetzt werden, die Anzahl dieser Patienten hat sich bemerkenswert erhöht. Die vorliegenden nicht reduzierenden Saccharide und die wasserfreie kristalline Maltose, die in dem Produkt enthalten sind, wirken als Stabilisator für natürliches menschliches α-Interferon, so daß die Aktivität für einen relativ langen Zeitraum auch bei Umgebungstemperatur gut erhalten bleibt.
    • Beispiel B-15 Zuckerbeschichtete Tablette
  • Eine Rohtablette als Kern, 150 mg Gewicht,- wurde mit einer Lösung, die aus 40 Gew.-Teilen einer pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, die nach der Methode in Beispiel A-6 hergestellt war, 2 Gew.-Teilen Pullulan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 200.000, 30 Gew.-Teilen Wasser, 25 Gew.-Teilen Talk und 3 Gew.-Teilen Titanoxid bestand, beschichtet, bis das Gesamtgewicht etwa 230 mg erreichte, und das Ergebnis wurde weiter mit einer Lösung, die aus 65 Gew.-Teilen einer frischen Präparation der gleichen pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, ein Gew.-Teil Pullulan und 34 Gew.-Teilen Wasser bestand, beschichtet und mit flüssigen Wachs überzogen, wobei eine zuckerbeschichtete Tablette erhalten wurde, die einen zufriedenstellenden Glanz und Aussehen aufwies.
  • Das Produkt hat eine relativ hohe Schocktoleranz und erhält seine hohe Qualität über einen relativ langen Zeitraum.
  • Wie aus dem obigen ersichtlich ist, wandelt das vorliegende neue nicht reduzierendes Saccharid bildende Enzym reduzierende Stärketeilhydrolysate in nicht reduzierende Saccharide in zufriedenstellend hohen Ausbeuten unter relativ milden enzymatischen Reaktionen zu Bedingungen um, ohne daß der Glukosepolymerisationsgrad der reduzierenden Stärketeilhydrolysate verändert wird. Die nicht reduzierenden Saccharide, die ohne weiteres abgetrennt und gereinigt werden können, und die relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten und auch die Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, weisen eine zufriedenstellende Stabilität, Qualität und milde Süße auf. Diese Produkte werden vom Körper angenommen und als Energiequelle verwendet, wenn sie oral verabreicht werden. Diese nicht reduzierenden Saccharide, relativ gering reduzierenden Saccharide, die diese enthalten und die Trahalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, können in geeigneter Weise in Zusammensetzungen, wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika, als Süßungsmittel, Geschmacksverbesserungsmittel, Qualitätsverbesserungsmittel, Stabilisator und Füllstoff, verwendet werden.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung eine neue Technik zur Verfügung, in industriellem Maßstab und bei relativ niedrigen Kosten nicht reduzierende Saccharide herzustellen, die bisher trotz des großen Bedarfs noch nicht ohne weiteres hergestellt werden konnten, wobei reduzierende Stärketeilhydrolysate, die aus Stärke hergestellt sind, als billige und reichhaltig vorkommende Quelle verwendet wird und relativ gering reduzierende Saccharide, die die nicht reduzierenden Saccharide enthalten und Trehalose, die aus diesen Sacchariden hergestellt ist, hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung hat einen großen Einfluß auf Gebieten, wie die Stärke- und Enzymwissenschaft und biochemische Wissenschaft und anderen industriellen Gebieten, insbesondere die Nahrungsmittel-, Kosmetik- und Pharmazeutikaindustrien und auch in der Forstwirtschaft, Fischereiwirtschaft und Industrien auf dem landwirtschaftlichen, Lebenserhaltungs- und chemischen Gebiet. Daher ist der Einfluß der vorliegenden Erfindung auf diese Gebiete von unschätzbarem Wert.

Claims (34)

1. Enzym, das ein nicht reduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur bildet, wenn man es auf ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat wirken läßt, wobei die Gegenwart von Trehalose nicht erforderlich ist.
2. Enzym nach Anspruch 1, worin sich die Trehalosestruktur in dem nicht reduzierenden Saccharid an seiner Endeinheit befindet und das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
3. Enzym nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches aus einem Mikroorganismus stammt.
4. Enzym nach Anspruch 3, worin der Mikroorganismus ein solcher ist, der aus der Gruppe der Genera Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Curtobacterium, Mycobacterium und Terrabacter und Mutanten davon gewählt ist.
5. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das folgende physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist:
(1) Wirkung bildet ein nicht reduzierendes Saccharid mit Trehalosestruktur als Endeinheit, wenn man es auf ein oder mehr reduzierende Stärketeilhydrolysate mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher wirken läßt;
(2) Molekulargewicht etwa 76.000-87.000 Dalton bei der Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
(3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 3,6 ± 4,6 bei der Isoelektrophorese unter Verwendung eines Ampholyts;
(4) optimale Temperatur etwa 35-40ºC bei der Inkubation bei einem pH von 7,0 für 60 Minuten;
(5) optimaler pH-Wert etwa 6,4-7,2 bei der Inkubation bei 40ºC für 60 Minuten;
(6) Wärmestabilität stabil bis zu einer Temperatur von etwa 35-40ºC bei der Inkubation bei einem pH von 7,0 für 60 Minuten und
(7) pH-Stabilität stabil bei einem pH von etwa 5,5-11,0 bei Inkubation bei 25ºC für 16 Stunden.
6. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das eine oder mehr Teilaminosäuresequenzen aufweist, die aus der Gruppe gewählt sind:
(1) X&sub1;-Arginin-Threonin-Prolin-X&sub2;-Serin-Threonin-Tyrosin- Arginin-Leucon (worin das Symbol "X&sub1;" Valin oder Methionin bedeutet und das Symbol "X&sub2;" Alanin oder Valin bedeutet);
(2) Glycin-Valin-Glutaminsäure-Asparaguinsäure-Threonin- Alanin-Phenylalanin-Phenylalanin-Arginin-Tyrosin;
(3) Leucin-Valin-Glutamin-Leucin-Threonin-Methionin- Prolin-Glycin-Valin-Prolin; und
(4) Glutaminsäure-Glycin-Arginin-X&sub3;-Serin-X&sub4;-Thyrosin- Alanin-X&sub5;-Alanin (worin das Symbol "X&sub3;" Glycin oder Glutamin; "X&sub4;" Prolin oder Arginin und "X&sub5;" Valin oder Glutaminsäure bedeuten).
7. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das nicht- reduzierende Saccharid eine α-Glycosyltrehalose ist, die durch die Formel dargestellt ist:
Gn-T worin das Symbol "G" einen Glukoserest; das Symbol "n" eine oder mehr ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest bedeuten.
8. Verfahren zur Herstellung des Enzyms von Anspruch 1, bei dem in einem Nährkulturmedium ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der das Enzym produzieren kann und das Enzym aus der erhaltenen Kultur gewonnen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Mikroorganismus ein solcher ist, der aus den Genera Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Curtobacterium, Mycobacterium und Terrabacter und Mutanten davon gewählt ist.
10. Mikroorganismus, der das Enzym von Anspruch 1 produzieren kann, welcher ein Mikroorganismus ist, der aus der Gruppe Rhizobium sp. M-11 (FERM BP-4130), Arthrobacter sp. Q36 (FERM BP-4316) und Mutanten davon gewählt ist.
11. Verfahren zur Herabsetzung des Reduktionsvermögens eines reduzierenden Stärketeilhydrolysats, welches einen Schritt aufweist, bei dem man das Enzym von Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat enthält, wirken läßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
13. Verfahren zur Herstellung eines nicht reduzierenden Saccharids mit Trehalosestruktur, welches umfaßt:
(a) Einwirkenlassen des Enzyms von Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat enthält, um das nicht reduzierende Saccharid zu bilden und
(b) Gewinnen des nicht reduzierenden Saccharids zusammen oder ohne intakten reduzierenden Stärketeilhydrolysaten.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin sich die Trehalosestruktur in dem nicht reduzierendem Saccharid an seiner Endeinheit befindet.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, worin das nicht- reduzierende Saccharid eine α-Glykosyltrehalose ist, die durch die Formel dargestellt ist:
Gn-T worin das Symbol "G" einen Glukoserest; das Symbol "n" eine oder mehr ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest bedeuten.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
17. Verfahren zur Herstellung zu einer Zusammensetzung, welches umfaßt:
(a) Einwirkenlassen des Enzyms von Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat enthält, zur Bildung eines nicht reduzierenden Saccharids mit Trehalosestruktur;
(b) Gewinnen des nicht reduzierenden Saccharids zusammen oder ohne intakten reduzierenden Stärketeilhydrolysaten und
(c) Eingeben des gewonnenen Produkts in ein Nahrungsmittelprodukt, kosmetisches Produkt oder Pharmazeutikum.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin sich die Trehalosestruktur in dem nicht reduzierendem Saccharid an seiner Endeinheit befindet.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin das nicht- reduzierende Saccharid eine α-Glykosyl-Trehalose ist, die durch die Formel dargestellt ist:
Gn-T worin das Symbol "G" einen Glukoserest; das Symbol "n" eine oder mehr ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest bedeuten.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, worin das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
21. Verfahren zur Herstellung von Trehalose, welches umfaßt:
(a) Einwirkenlassen des Enzyms von Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat enthält, zur Bildung eines nicht reduzierenden Saccharids mit Trehalosestruktur;
(b) Einwirkenlassen von Glukoamylase oder α-Glukosidase auf das erhaltene nicht reduzierende Saccharid, um Trehalose zu bilden und
(c) Gewinnen der erhaltenen Trehalose.
22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Stufe (b) weiterhin eine Stufe aufweist, in der die Trehalose kristallisiert wird.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin die Trehalose eine wasserhaltige oder wasserfreie kristalline Trehalose ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin die erhaltene Mischung in Stufe (b) weiterhin einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes unterworfen wird, um den Trehalosegehalt zu erhöhen.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, worin sich die Trehalosestruktur in dem nicht reduzierenden Saccharid an seiner Endeinheit befindet.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, worin das nicht reduzierende Saccharid eine α-Glykosyltrehalose ist, die durch die Formel dargestellt ist:
Gn-T worin das Symbol "G" einen Glukoserest; das Symbol "n" eine oder mehr ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest bedeuten.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, worin das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
28. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welches umfaßt:
(a) Einwirkenlassen des Enzyms von Anspruch 1 auf eine Lösung, die ein reduzierendes Stärketeilhydrolysat enthält, zur Bildung eines nicht reduzierenden Saccharids mit Trehalosestruktur;
(b) Einwirkenlassen von Glukoamylase oder α-Glukosidase auf das erhaltene nicht reduzierende Saccharid, um Trehalose zu bilden und
(c) Eingeben der erhaltenen Trehalose in ein Nahrungsmittelprodukt, Kosmetikprodukt oder Pharmazeutikum.
29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Stufe (b) weiterhin eine Stufe umfaßt, in der die Trehalose kristallisiert wird.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, worin die Trehalose eine wasserhaltige oder wasserfreie kristalline Trehalose ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, worin die erhaltene Mischung in Stufe (b) weiterhin einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines stark sauren Ka tionenaustauscherharzes unterworfen wird, um den Trehalosegehalt zu erhöhen.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 31, worin sich die Trehalosestruktur in dem nicht reduzierenden Saccharid an seiner Endeinheit befindet.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, worin das nicht-reduzierende Saccharid mit Trehalosestruktur eine α-Glykosyltrehalose ist, die durch die Formel dargestellt ist:
Gn-T worin das Symbol "G" einen Glukoserest; das Symbol "n" eine oder mehr ganze Zahlen und das Symbol "T" einen α, α-Trehaloserest bedeuten.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33, worin das reduzierende Stärketeilhydrolysat aus einem oder mehr reduzierenden Stärketeilhydrolysaten mit einem Glukosepolymerisationsgrad von drei oder höher besteht.
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