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DE69128530T2 - Zusammengesetztes äquivalent der lebenden haut - Google Patents

Zusammengesetztes äquivalent der lebenden haut

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DE69128530T2
DE69128530T2 DE69128530T DE69128530T DE69128530T2 DE 69128530 T2 DE69128530 T2 DE 69128530T2 DE 69128530 T DE69128530 T DE 69128530T DE 69128530 T DE69128530 T DE 69128530T DE 69128530 T2 DE69128530 T2 DE 69128530T2
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porous
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Mark Dower Heights Neusuedwales Eisenberg
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Description

    TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Lebendhaut-Äquivalente und insbesondere zusammengesetzte Lebendhaut-Äquivalente, die eine Epidermisschicht aus kultivierten Keratinocyten, eine Schicht von hochreinem nichtporösem Collagen und eine Dermisschicht kultivierter Fibroblasten in einem porösem vernetzten Collagenschwamm umfaßt. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt viele Verwendungen für Haut-Äquivalente, nicht nur als Ersatz für menschliche oder tierische Haut bei Hauttransplantationen sondern auch als Testhaut zur Bestimmung der Auswirkungen pharmazeutischer Substanzen und Kosmetika auf die Haut.
  • Ein Hauptproblem bei pharmakologischen, chemischen und kosmetischen Tests ist die Schwierigkeit, die Wirksamkeit und Sicherheit der Produkte auf der Haut zu bestimmen. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Haut-Äquivalente ist ihre Verwendung als Indikator der durch solche Substanzen erzeugten Auswirkungen durch in vitro Tests auf Testhaut.
  • Außerdem ergeben sich bei der Hautverpflanzung auf bloßgelegte Bereiche granulierender Wunden und Verbrennungen trotz der Fortschritte in der Verpflanzungstechnik immer noch erhebliche Heilungsprobleme. Autogene Spalthaut-Transplantate und autogene epidermale Transplantate (kultivierte autogene Keratinocyten) sind mit unterschiedlichem Erfolg verwendet worden. Beide Behandlungsformen haben jedoch Nachteile. Beispielsweise sind autogene Spalthaut-Transplantate im allgemeinen bei Verbrennungen großer Bereiche der Körperoberfläche nicht verfugbar, verursachen eine weitere Verletzung des Patienten, sind bei der Behandlung von Patienten mit dystrophischer Epidermolysis Bullosa (DEB) von begrenztem Nutzen, zeigen eingeschränkte Gewebeausdehung, erfordem wiederholte chirurgische Eingriffe und langwierige Hospitalisation und führen zu unerwünschten kosmetischen Ergebnissen. Es erfordert Zeit epidermale Transplantate herzustellen; sie weisen eine niedrige Erfolgsquote ("take") von 30-50% auf, bilden häufig spontane Blasen, sind empfindlich und schwer zu handhaben, weisen eine Kontraktion von 60-70% ihrer ursprünglichen Größe auf, sind während etwa der ersten 15 Tage nach der Verpflanzung verletzbar und haben praktisch keinen Nutzen bei der Behandlung tiefer Verbrennungen, bei denen sowohl die Dermis als auch die Epidermis zerstört worden sind.
  • Eine alternative Behandlungsform benutzt allogene Epidermis- Transplantate (kultivierte allogene Keratinocyten). Amerikanische Forscher haben Patienten mit Verbrennungen zweiten Grades durch Übertragung allogener Epidermis-Transplantate auf Wunden mit einigem Erfolg behandelt. Die Vorteile eines solchen allogenen Transplantates umfassen: Eine schnelle Versorgung mit solchen Transplantaten kann aufrecht erhalten werden, so dass die Patienten in einem einmaligen Vorgang mit einem Material bedeckt werden können, das dauerhafte Heilung gestattet; Auto-Transplantationen, die Wundareale vergrößern und schmerzhafte infektionsanfällige Donor-Stellen hinterlassen, werden vermieden; mit kultivierten allogenen Transplantaten bedeckte Brandwunden heilen so schnell wie Brandwunden, die mit Auto-Transplantaten bedeckt wurden; und die Behandlung von Patienten mit DEB wird ermöglicht.
  • Allogen Epidermis-Transplantate haben jedoch immer noch viele der Einschränkungen der epidermalen Auto-Transplantate.
  • Verletzungen der Haut über ihre gesamte Dicke, die von Verbrennungen herrühren, zerstören sowohl die Epidermis als auch die Dermis und die Behandlung mit kultivierter Haut muss diese beiden Komponenten ersetzen.
  • Hansborough, J.F. und Boyce, S.T: (JAMA 1989, 2125-2130) haben über die Applikation auto-epidermaler Zellen auf ein Dermis-Äquivalent berichtet, das dann auf eine Wunde übertragen wird. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt in der Herstellung des Dermis-Äquivalents.
  • Außerdem umfaßt dieses Verfahren die Verwendung von Chondroitin-6-sulfat (GAG), das bei neutralem pH eine schwache Bindung an Collagen aufweist und daher in die Wundumgebung freigesetzt werden kann, was bei Menschen unerwartete Langzeiteffekte verursachen kann. Es ist berichtet worden, dass GAG die Narbenbildung in Wunden verstärkt, was bei Transplantaten vermieden werden soll. Ein anderer Effekt von GAG-enthaltenden Collagen- Schwämmen besteht in der Verringerung der Blutgerinnungs-Kapazität von Collagen und ist unvorteilhaft für die Anwendung in blutenden Wunden. Fibringewinnung trägt zu einer Adhäsion des Transplantates auf der Wunde bei.
  • Außerdem wird in diesem Verfahren der Collagen-Schwamm stabilisiert, indem man ihn mit 0,25% Glutaraldehyd (GTA) vernetzt. Solch ein vernetztes Collagen wird mit einer niedrigeren Rate resorbiert und ist gegenüber Bakterien- oder Pilzinfektion resistent. Gleichzeitig ist das Einwachsen von Zellen, die die GTA-vernetzte Collagenmatrix infiltrieren, geringer. GTA-vernetztes Collagen kann dieses Agens als Polymer mit hohem Molekulargewicht zurückhalten, das kontinuierlich hydrolysiert wird und wobei monomerer GTA freigesetzt wird und bis zu sechs Wochen nachweisbar ist. Der zytotoxische Effekt von GTA auf Fibroblasten in Gewebekultur legt nahe, dass es kein ideales Vernetzungsagens für ein Dermis-Äquivalent ist, das von Wirtszellen infiltriert wird und in dem die bovine Collagen-Matrix schnell abgebaut wird, wobei GTA in die Körperflüssigkeiten freigesetzt wird.
  • Kürzlich sind Lebendhaut-Äquivalent-Transplantate, die eine Dermal-Schicht von Ratten-Fibroblastenzellen verteilt in löslichem Collagen und eine epidermale Schicht von kultivierten Rattenkeratinocyten umfassen, erfolgreich als allogene Transplantate auf Sprague Dawley Raten von Bell et.al. übertragen worden (Journal Investigative Dermatology, 1983; 81:25-10s). Die histologische Untersuchung des Transplantats zeigte, dass sich die epidermale Schicht vollständig differenziert und Dermosomen, Tonofilamente, Keratohyalin und eine Basallamina gebildet hatte. Versuche, das Lebendhaut-Äquivalent unter Verwendung menschlicher Fibroblasten und Keratinocyten zu reproduzieren waren jedoch nur begrenzt erfolgreich. Die Keratinocyten differenzierten nicht vollständig und bildeten keine Basallamina und die dermo-epidermale Funktion bildete eine grade Linie.
  • Probleme der Epidermalisierung der Oberfläche der oben genannten Haut-Äquivalente führten dazu, dass Bell sein Verfahren durch Verwendung von Hautbiopsien als Keratinocytenquelle , wie in der als WO 86/02273 veröffentlichten internationalen PCT- Anmeldung beschrieben, modifizierte. Die Probleme dieses Ansatzes bestehen darin, dass das so hergestellte Hautsubstitut nicht über seine ganze Oberfläche uniform ist, da die Biopsie einschließlich des dermalen Teils in dem Dermis-Substitut insertiert verbleibt. Außerdem ist das Oberflächenareal des erhaltenen Hautsubstitutes durch die Anzahl der Biopsien, die von einer einzelnen Person erhalten werden könne, eingeschränkt. Die Biopsie-Entnahme umfaßt ein medizinisches Verfahren mit dem möglichen Problem einer Infektion und Narbenbildung. Die Stanz-Biopsie von Haut-Äquivalenten als ein Mittel zur Ausweitung der Produktion von zusätzlichem Haut-Äquivalent ist ein zeitraubender Vorgang. In Folge dessen ist ein solches Haut-Äquivalent klinisch nicht angewendet worden. 1988 berichtete eine Publikation von Colounb et.al. in der Zeitschrift "Burns" über eine 100%ige Fehlerquote bei der Verwendung von Bell's Verfahren.
  • Bernard et.al., die Erfinder der australischen Patentanmeldung AU-A-13743/88 versuchen die oben angeführten Probleme durch Nutzbarmachung der Kultivierungskapazität von Keratinocyten, die in den Scheiden eines Haarfollikels enthalten sind, zu vermeiden. Ihre Hautbiopsie wird durch einen in seiner Hülle eingeschlossenen Haarfollikel ersetzt, der in senkrechter Position in die freie Oberfläche des zu bildenden Dermis-Substitutes implantiert wird. Die Hauptkritik an der oben genannten Erfindung ist die Natur der Dermis und die Tatsache, dass der Zeitraum epidermalen Wachstums mehrere Monate benötigen kann.
  • Es besteht daher ein Bedürfnis nach der Entwicklung von Lebendhaut-Äqivalent-Transplantaten, die sowohl die epidermalen als auch die dermalen Schichten umfassen, leicht herstellbar sind und in ausreichenden Mengen erhalten werden können, um eine einmalige Behandlung von Hautverletzungen zu ermöglichen.
  • Bei der Entwicklung eines Lebendhaut-Äquvalentes ist es wünschenswert, das dieses wenigstens manche oder alle der folgenden Eigenschaften umfaßt: Es sollte eine schnelle und anhaltende Haftung an die Wundoberfläche ermöglichen; es sollte gewebskompatibel sein; es sollte eine innere Oberfläche aufweisen, die in Kontakt mit der Wundoberf läche ist, die das Einwachsen von fibrovasculären Gewebe fördert; und/oder es sollte für Schutz von Infektionen und für Prävention von Flüssigkeitsverlust sorgen.
  • Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, kultivierte Lebendhaut-Äquivalente bereitzustellen, die wenigstens einige dieser Eigenschaften aufweisen und die eines oder mehrere der oben erwähnten Probleme im Wesentlichen überwinden oder verbessern.
    • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft zusammengesetzte Lebendhaut-Äquivalente, umfassend eine Epidermisschicht aus kultivierten Keratinocyten, eine Schicht von hochreinem, nicht-porösem Collagen und eine Dermisschicht aus kultivierten Fibroblasten in einem porösen, vernetzten Collagenschwamm.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von Lebendhaut-Äquivalenten, das umfaßt: eine Hautprobe bereitzustellen, die Hautprobe enzymatisch zu behandeln, um die Epidermis von der Dermis zu trennen, die Epidermis enzymatisch zu behandeln, um die Keratinocyten freizusetzten, die epidermalen Keratinocyten bis zur Konfluenz zu kultivieren, parallel dazu oder getrennt davon die Dermis enzymatisch zu behandeln, um die Fibroblasten freizusetzen und die Fibroblasten bis zur Subkonfluenz zu kultivieren, eine poröse, vernetzte Collagenschwamm-Membran mit den kultivierten Fibroblasten zu inokulieren, den inokulierten Collagenschwamm auf seiner Oberfläche zu inkubieren, um das Wachstum der Fibroblasten im Collagenschwamm zu bewirken, den Collagenschwamm umzudrehen und die andere Oberfläche des Schwammes mit einer dünnen Schicht aus hochreinem, vorzugsweise pepsinbehandeltem nicht-porösem Collagen zu beschichten, um einen beschichteten Schwamm-Komplex zu bilden, den Komplex zu inkubieren, um das nicht-poröse Collagen zu polymerisieren und ihn dann mit kultivierten Keratinocyten zu inokulieren und den zusammengesetzten Haut-Äquivalent-Komplex zu inkubieren, um weiteres Zellwachstum zu ermöglichen.
  • Vorzugsweise wird die Fibroblasten-Primärkultur hergestellt, indem man: eine Dermisprobe gewinnt, die Dermisprobe in einer Collagenaselösung suspendiert, um die Fibroblasten freizusetzen, die Kultur inkubiert, die Kultur zentrifugiert, um ein Zellpellet aus Fibroblasten zu erzeugen, das Kulturmedium entfernt, das Zellpellet wäscht, um das nicht dazugehörige Kulturmedium zu entfernen, die Zahl und Viabilität der Zellen bestimmt, Kulturgefäße mit den Zellen inokuliert und bis zur Subkonfluenz kultiviert.
  • Vorzugsweise ist das nicht-poröse hochgereinigte Collagen ausgewählt unter Typ 1-Collagen, Typ 3-Collagen oder Gemischen von Typ 1- und Typ 3-Collagen. Ein geeignetes bovines Hautcollagen ist beispielsweise das von Sigma erhältliche.
  • Idealerweise wird das Collagen durch Behandlung mit Pepsin gereinigt, um antigene Substanzen zu entfernen.
  • Der verwendete Collagenschwamm kann jeder geeignete Collagenschwamm sein, beispielsweise der von Mitaplast erhältliche.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Keratinocyten werden vorzugsweise durch das "Tropfen"-Verfahren erhalten. Die Keratinocyten werden aus der Epidermis freigesetzt, wobei man eine Einzelzell-Suspension erhält. Einzelne Tropfen dieser Suspension werden gleichmäßig auf das Kulturmedium aufgetropft und inkubiert, so dass die Zellen wachsen und gegebenenfalls verschmelzen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die Erfindung wird nun durch nicht-einschränkende Beispiele und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
  • Figur 1 das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes schematisch darstellt.
  • Figur 2 die Histologie einer Hautbiopsie aus einem Transplantat unter Verwendung des erfindungsgemäßen Haut-Äquivalentes zeigt.
  • Figur 3 das erfindungsgemäße zusammengesetzte Haut-Äquivalent zeigt.
  • Figur 4 eine Biopsie des Haut-Äquivalentes in einem Hauttransplantat aus einem menschlichen Patienten zeigt.
    • AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Figur 1 zeigt schematisch das Verfahren zur Herstellung des zusammengesetzten Lebendhauts-Äquivalentes.
  • In Figur 1 wird eine Hautprobe in Dermis, die als Quelle für Fibroblasten (10) verwendet wird und in Epidermis, die als Quelle für Keratinocyten (11) verwendet wird, aufgetrennt. Die kultivierten Fibroblasten (10) werden in den Collagen-Schwamm (12) inokuliert und nachdem die Fibroblasten den Schwamm besiedelt haben, wird die andere Seite des Schwammes mit dem Pepsin-behandelten nicht-porösen Collagen inokuliert. Nach weiterer Inkubation wird das nicht-poröse Collagen mit der Keratinocyten-Kultur inokuliert, vorzugsweise mittels des Tropfenverfahrens, und kultiviert, um gegebenenfalls das Haut-Äquivalent (13) herzustellen.
  • Erfindungsgemäß kann jede Zellkultur-Techniken zugängliche Hautprobe verwendet werden. Die Hautproben können autogen oder allogen sein.
  • Die Hautproben werden mit Trypsin behandelt, um die Epidermis von der Dermis zu trennen (Eisinger, M., Method in Skin Research, Hrsg. D. Skerrow, (1985) S.193 folgende). Die Epidermis wird zerkleinert und mit Trypsin behandelt, um die Keratinocyten freizusetzten. Die Keratinocyten werden bis zur Konfluenz unter Verwendung von Standardverfahren kultiviert. Vorzugsweise werden die Keratinocyten als Einzelzell-Suspensionen bis zur Konfluenz kultiviert.
  • Erfindungsgemäß verwendbare Primärkulturen von Fibroblasten können unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise dem in "A specific collagenase from Rabbit fibroblasts in monolayer culture" (Journal of Biochemistry (1974) 137, Seite 373- 385) offenbarten, hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Primärkulturen von Fibroblasten nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
  • Eine Dermisprobe wird in 1 mm-Würfel geschnitten und in einer Collagenase-Lösung suspendiert, die mit Tris-HCl pH 7,4 gepuffert ist. Die Dermisproben können allogen oder autogen sein. Eine geeignete Collagenase ist Clostridium histolyticum Collagenase. Die Dermisprobe wird vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 Mikrogramm/ml in Lösungen suspendiert. Die Suspension wird inkubiert und dann bei 1,5 Umdrehungen/Sekunde zentrifugiert, um die Zellen aus der Lösung zu entfernen. Die Suspension wird vorzugsweise 30 Minuten inkubiert. Das Zellpellet wird mit DMEM gewaschen und die Anzahl der Fibroblasten mit einem Hämocytometer bestimmt. Die Viabilität der Fibroblasten wird durch Farbausschluß unter Verwendung von Trypanblau bestimmt. Die Fibroblasten können direkt in Collagen-Schwämme injiziert oder als Saat in Kulturgefäßen verwendet werden und unter Verwendung von Standardverf ahren bis zur Subkonfluenz gezogen werden. Überraschenderweise ist dieses Verfahren bis zu zwei Wochen kürzer als andere bekannte Verfahren, die bis zu drei Wochen benötigen, um Primärkulturen von Fibroblasten herzustellen.
  • Die obige Kulturmethode ergibt außerdem überraschenderweise andere dermale Epithelzellen, die das Potential aufweisen, sich zu Schweißdrüsen oder anderen Hautzell-Typen zu entwickeln.
  • Vernetzte bovine Collagenschwamm-Membranen werden kommerziell erhalten und in gefrorenem Zustand aufbewahrt. Vor der Verwendung werden die Schwämme mit sterilem Wasser gewaschen und bei 37ºC entwässert, um die Membranen zu kompaktieren.
  • Der Collagenschwamm wird mit kultivierten Fibroblasten inokuliert. In einer Ausführungsform wird der Schwamm mit subkonfluenter Zellkultur inokuliert. Vorzugsweise weist das Fibroblasteninoculum eine Dichte von ungefähr 4 x 10&sup5; Zellen/ml auf.
  • Der inokulierte Schwamm wird unter Verwendung von Standardverfahren inkubiert, um das Wachstum der Fibroblasten durch die Collagenmatrix zu ermöglichen. In einer Ausführungsform wird der Schwamm bei 37ºC mit 5% CO&sub2; und Feutigkeitssättigung zehn Tage in DMEM und konditioniertem Medium inkubiert. Vorzugsweise werden DMEM und konditioniertes Medium jeden zweiten Tag ausgewechselt. Konditioniertes Medium ist DMEM, das in der Kultur menschlicher Keratinocyten über einen Zeitraum von zwei Tagen verwendet wurde. Es enthält verschiedene Makromoleküle, die von den Keratinocyten sezerniert werden, von denen bekannt ist, dass sie Fibroblasten stimulieren. Das konditionierte Medium kann bis zum Gebrauch in gefrorenem Zustand gelagert werden. Es wird in Verbindung mit frischem DMEM in einem Verhältnis von 1:2 verwendet.
  • Der Schwamm wird dann umgedreht und die obere Oberfläche wird mit Pepsin-behandeltem nicht-porösem Collagen beschichtet. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Beschichtung (gereinigtes) Pepsin-behandeltes, nicht-poröses steriles Typ 1-Rindercollagen oder einer Mischung von Typ 1- und 3-Rindercollagen. Das Rindercollagen wird kommerziell in im wesentlichen gereinigter Form erhalten. Es ist unter Verwendung des Verfahrens von Drake, M.P., Davison, P.F. und Bump, S. (1966) Biochemistry 5:301-312, mit Pepsin behandelt, um Teliopeptide zu entfernen. Der pH der Collagenlösung wird auf neutral eingestellt und es wird mit Gammastrahlen sterilisiert. Eine geeignete Konzentration der Collagenlösung ist 2mg/ml. Das Collagen wird als dünner Film auf den Schwamm geschichtet und bei 37ºC 60 Minuten inkubiert, um die Polymerisation des Collagens zu vervollständigen.
  • Kultivierte Keratinocyten werden dann auf die aufgetragene Schicht inokuliert. Vorzugsweise werden die Zellen mit Tropfen von Medium inokuliert, die Zellen in einer Dichte von 1 x 10&sup5; Zellen/Tropfen enthalten. Der Schwamm wird dann bei pH 7,2 und 35ºC zehn Tage in DMEM inkubiert, das mit 2% fetalem Rinderserum, 10 mg/ml menschlichem epidermalem Wachstumsfaktor, 0,4 mg/ml Hydrocortison und 10&supmin;&sup9;M Choleratoxin supplementiert ist.
  • Das Hautäquivalent verbleibt während des Inkubationszeitraumes in dem obigen Kulturmedium eingetaucht.
  • Vor der klinischen oder in vitro Applikation des zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes wird dem Kulturmedium Medium ohne Rinder-Hypophysenextrakt zugegeben.
  • Überraschenderweise führt das erfindungsgemäße zusammengesetzte Lebendhaut-Äquivalent zu einer schnellen Normalisierung zwischen Epidermis und Dermis der geheilten Transplantate. Eine histologische Untersuchung des erfindungsgemäßen Haut-Äquivalentes nach zweiwöchiger in vitro Kultur zeigte eine mehrschichtige Epidermis, die auf einer homogenen Membran wuchs. Eine histologische Untersuchung einer Biopsieprobe eines erfindungsgemäßen Haut-Äquivalentes, die zwei Wochen nach Verpflanzung entnommen wurde, bestätigte die Bildung eines Stratun corneum, mit einer vollständig keratinisierten Epidermis auf einer von nicht-inflammatorischen Bindegewebszellen besiedelten Epidermis.
  • Es ist von besonderer Bedeutung, dass es bei licht- und elektronenmikroskopischer Betrachtung eine wellenförmige und morphologisch ausgereifte Epidermis-Dermis-Verbindung gibt. Es gab dort eine Verknüpfung von Rete-Graten und dermalen Papillen, die für normale Haut charakteristisch und wichtig sind, wenn die Schnittstelle zwischen Epidermis und Dermis normalisiert werden soll.
  • Wenn das Haut-Äquivalent zuerst vier Tage immergiert in dem DMEM-Kulturmedium mit 0,05 x 10&supmin;³M Ca&spplus;&spplus; und dann 10 Tage mit exponierter Epidermis (Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche) in DMEM- Medium kultiviert wird, das eine erhöhte Konzentration von Ca&spplus;&spplus; von 0,05 x 10&supmin;³M enthält, ist es möglich, eine mehrschichtige differenzierte Epidermis nachzuweisen, die aus einer basalen Zellschicht auf einer gut entwickelten Basallamina und verschiedenen Schichten suprabasaler Zellen besteht, die frühe Keratinisierung zeigen.
  • Das obige in vitro System ähnelt stark der unstrukturierten Anordnung und der Biosyntheseleistung menschlicher Haut und kann dafür vorbereitet werden, um die Sicherheit von Chemikalien und Pestiziden und die Hautreizung durch kosmetische Substanzen zu testen. Auf die Oberfläche dieses Systems aufgebrachte Testsubstanzen können eine Irritation dieser Zellen verursachen und die Freisetzung von Mediatoren der inflammatorischen Antwort auslösen, die in der Kulturflüssigkeit nachgewiesen werden kann. Dieses System kann für in vitro Zytotoxizität-Tests geeignet sein: Der Gesamtzellprotein-Assay und der Neutralrot-Aufnahme- Assay, die Proteinkonzentrationen in Zellen messen, sind quantifizierbare Tests auf die Anwesenheit lebender und toter Zellen.
  • Das Haut-Äquivalent kann in Glasflaschen oder Schalen kultiviert und die verschiedenen zu testenden Chemikalien können auf diese kultivierte Haut aufgebracht werden. Bei fortwährender Versorgung mit geeignetem Kulturmedium wird die Haut weiterwachsen, bis der Test abgeschlossen ist.
  • Der Collagen-Schwamm stellt eine temporäre Matrix bereit, die die schnelle und anhaltende Anhaftung des zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes auf eine Wundoberfläche in einem Menschen oder einem Tier ermöglicht. Diese stellt eine Oberfläche im Kontakt mit der Wundoberfläche bereit, die fibrovasculäres Einwachsen von der Wundoberfläche und die Entwicklung neodermaler Strukturen gestattet. Die Collagen-Matrix wird verändert, allmählich abgebaut und wenn die Fibroblasten physikalisch mit ihr interagieren und biosynthetisch zu ihr beitragen durch endogenes collagen ersetzt. Da die Collagen-Schwämme jedoch aus vernetztem Collagen bestehen, kontrahieren sie nicht sind für einige Zeit lagerfähig und zeigen keine Kontraktionen, wenn sie auf Wunden übertragen werden.
  • Das auf die obere Oberfläche des Collagen-Schwammes plazierte, pepsinbehandelte nicht-poröse Collagen verhindert das Eindringen kultivierter Keratinocyten in den Collagen-Schwamm und sichert somit die Kompartimentierung des Haut-Äquivalentes in epidermale und dermale Schichten. Diese aufgetragene Schicht wird gleichfalls allmählich abgebaut, was die Ausbildung der normalen Grenzfläche zwischen Dermis und Epidermis gestattet.
  • Die erfindungsgemäßen zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalente sind ungefähr 0,8 mm dick, daher stärker als Epidermis- Transplantate und während der Verpflanzung leichter handhabbar. Die Erfolgsquote ("take") der erfindungsgemäßen Haut-Äquivalente beträgt ungefähr 90%, was auf das Vorhandensein der Dermisschicht zurückgeführt werden kann, die die Entwicklung der Vascularisierung des Transplantates fördert. Schließlich gestatten die erfindungsgemäßen zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalente die Anwendung des Transplantates in einem Schritt, wodurch nur ein einziges Transplantat-Akzeptanzereignis notwendig wird. Zur Erleichterung des Transportes und der Anwendung des zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes kann Vaseline-Gaze über das kultivierte Transplantat gelegt werden.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Fibroblasten und Keratinocyten können entweder autogen oder allogen sein. Die Verwendung allogener Zellen gestattet die Produktion und Lagerung des erfindungsgemäßen Lebendhaut-Äquivalentes, wodurch Verzögerungen bei der Beschaffung der Transplantate zur Behandlung von Wunden vermieden werden. Beide Zelltypen, Keratinocyten und Fibroblasten, können unter Verwendung bekannter Verfahren über Monate als Einzelzell-Suspensionen gefroren gelagert werden. Nach dem Auftauen waren diese Zellen lebensfähig, wuchsen sogleich in Kultur und waren daher für die Herstellung von Haut-Äquivalent geeignet. Das Haut-Äquivalent ist erfolgreich auf einen menschlichen Freiwilligen übertragen worden. Da Kühlung die Immunogenität von Hauttransplantaten unterdrückt (Baldwin, W.M. et. al., Transplantation 1973; 15:419-422), hilft die Tieftemperatur-Aufbewahrung allogener Zellen, einige unerwünschte Antigene abzuschwächen. Die Verfügbarkeit zusammengesetzter Lebendhaut-Äquivalente zur Behandlung flächiger Oberflächenwunden kann eine praktisch unbegrenzte Menge transplantierbarer Haut als Quelle permanenter wundbedeckung bieten.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den nun folgenden Beispielen beschrieben, in denen menschliche allogene Hautzellen verwendet wurden.
    • Beispiel 1
  • Zusammengesetzte Transplantate wurden aus getrennten, parallelen Kulturen allogener menschlicher Keratinocyten (HK) und menschlicher Fibroblasten (HF) und einer zellulären Rindercollagen-Membran hergestellt. Die dermale Membran wurde unter Verwendung von Typ 1-Rindercollagen modifiziert, um eine planare Oberfläche für kultivierte HK's zu bieten.
  • Menschliche Haut wurde aus chirurgischen Proben erhalten, d. h. aus neonataler Circumcision (Vorhaut). Nach der Excision wurde die Haut in einen sterilen Behälter mit Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) plaziert. Die Proben wurden innerhalb kurzer Zeit an das Gewebekultur-Labor übergegeben, wo die Epidermis gemäß dem Verfahren von Eisinger, M. (Method in Skin Research, Editor D. Skerrow 1985 S.193) enzymatisch von der Dermis getrennt wurde.
  • Die Keratinocyten wurden als Einzelzell-Suspension nach dem Verfahren von Eisinger, das wie folgt modifiziert wurde, kultiviert: HK's wurden in DMEM bei pH 7,2 kultiviert, das mit 2% fetalem Rinderserum, epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin und Hydrocortison supplementiert war. Die konfluenten Kulturen konnten nach 12 bis 14 Tagen entweder für Subkulturen oder zur Inokulierung auf die Collagen-Membran geerntet werden.
  • Die Fibroblasten wurden aus Dermisfragmenten freigesetzt, indem man diese mit Clostridium hibtolyticum Collagenase verdaute. Die HF's wurden dann in DMEM unter Verwendung von Standardverfahren gezogen.
  • Die Collagenschwamm-Membranen (6 cm Durchmesser), die in gefrorenem Zustand in Petrischalen aufbewahrt worden waren, wurden mit sterilem Wasser gewaschen und bei 37ºC in einem Inkubator entwässert, um die Membranen zu kompaktieren. Die Schwämme wurden dann über Nacht in mit konditioniertem Medium angereichertem DMEM inkubiert. Subkonfluente Kulturen von HF's wurden in einer Dichte von 4 x 10&sup5; Zellen/ml auf die Oberfläche des Schwammen inokuliert. Der Schwamm wurde dann zehn Tage in DMEM in einem Inkubator bei 37ºC, 5% Kohlendioxid und Feuchtigkeitssättigung plaziert.
  • Das Medium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Am Ende dieses Zeitraumes wurden die Schwämme umgedreht und eine nichtporöse Oberfläche wurde erzeugt, um eine glatte Oberfläche für die kultivierten HK's zu bieten.
  • Es wurde beschichtet, indem man einen dünnen Film von pepsinbehandeltem, nicht-porösem, sterilem Typ 1-Rindercollagen aufbrachte. Die Filme wurden aus kommerziell erhältlichem gereinigtem Typ 1-Collagen hergestellt, das pepsinisiert wurde, um Teliopeptide zu entfernen, und das durch Gammastrahlen sterilisiert wurde. Die Collagen-Lösung wurde auf einen neutralen pH gebracht, als ein dünner Film auf die Oberfläche des Collagen- Schwammes aufgetragen und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert.
  • Kultivierte HK's wurden dann in Tropfen mit einer Dichte von 1 x 10&sup5; pro Tropfen auf die nicht-poröse Oberfläche des Schwammes inokuliert und zehn Tage in wie oben erwähnt supplementiertem DMEM inkubiert. Vor der klinischen Anwendung wurde den Kulturschalen Kulturmedium ohne Rinderhypophysenextrakt zugegeben. Über die kultivierten Transplantate wurde Vaseline-Gaze gelegt, um den Transport des Transplantates und dessen Sicherung auf dem Wundbett zu erleichtern.
  • In acht Operationen, die an fünf Kindern unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lebendhaut-Äquivalente vorgenommen wurden, betrug die Erfolgsquote 90%.
  • Das klinische und histologische Erscheinungsbild der obigen Transplantate in den acht Operationen der RDEB-Kinder wies darauf hin, dass es keine Abstoßung gab.
  • Um jedoch einen direkten Beleg für das langfristige Überleben der kultivierten allogenen Transplantate oder ihren Beitrag zum Permanent-Epithel zu erhalten, wurden klinische Versuche mit gesunden erwachsenen Freiwilligen durchgeführt, die in dem folgenden Beispiel beschrieben sind.
    • BEISPIEL 2
  • Es wurden zusammengesetzte Transplantate und allogene Transplantate in der gleichen Weise gewonnen, wie in Beispiel 1 skizziert. Nachdem eine planare Oberfläche für kultivierte Keratinocyten bereitgestellt worden war, wurden menschliche Keratinocyten an die Oberfläche des vernetzten Rindercollagensubstrates angelagert. Dieses "Hautkultur-Sandwich" wurde dann en bbc auf das Wundbett menschlicher Patienten transplantiert, wobei die Collagenmatrix als Gerüst diente, um fibrovasculäres Einwachsen aus dem darunterliegenden Wundbett zu erlauben und somit das Überleben der menschlichen Keratinocyten und die Bildung der neodermalen Strukturen zu gestatten.
  • Klinische Studien wurden mit vier Freiwilligen, denen dekorative Tätowierungen entfernt wurden, durchgeführt. Jedem Freiwilligem wurden vier Hautbereiche auf einem Arm entfernt. In zwei Bereichen wurde die Haut bis zum Fett entfernt, wogegen bei den übrigen zwei Excisionen Dermiselemente an ihrem Platz belassen wurden. Vollhaut- und Spalthaut-Excisionen wurden mit kultivierter Haut und (als Kontrollen) mit Spalthaut Autotransplantaten gepfropft. Es wurde wöchentlich verbunden bis die Wunden vollständig abgeheilt waren. Die Wunden wurden fotografiert und es wurden Biopsien für histologische Untersuchungen und DNA-Fingerprinting durchgeführt.
  • Dem Freiwilligen 1 wurden zwei Areale mit kultivierter Haut und den anderen beiden mit einem Autotransplantat übertragen. Nach zwei Wochen waren die Transplantate angenommen und es gab kein Anzeichen für eine Transplantat-Kontraktion. Biopsien des Zentralbereiches der Transplantate ergaben eine gut differenzierte und mehrschichtige Epidermis; die Dermis enthielt zahlreiche Fibroblasten und nichtinflammatorische Zellen in einer locker gepackten Collagenmatrix. Die Figuren 2 und 4 zeigen die Histologie einer Hautbiopsie aus einem kultivierten Transplantat zwei Wochen nach der Operation. Figur 3 zeigt das Haut-Äquivalent vor der Transplantation. DNA-Fingerprinting wies darauf hin, dass es sich um eine gemischte Population von Zellen sowohl des Donors als auch des Empfängers handelte, was darauf hindeutete, dass einige der Dermiszellen von dem Patienten stammten, da es Anzeichen für eine ausgeprägte dermale Zellularität gab.
  • Freiwilliger 2. Das Transplantat wurde in keinem der Bereiche angenommen. Nach drei Wochen gab es histologische Anzeichen für eine granulierende Wunde.
  • Freiwilliger 3. Nach vier Wochen waren alle Transplantate ohne jede Kontraktion verheilt. Eine histologische Untersuchung zeigte eine vollständig differenzierte Epidermis und eine hyperzelluläre Dermis. DNA-Fingerprinting zeigte eine gemischte Population von Donor- und Empfängerzellen.
  • Freiwilliger 4. Nach acht Wochen zeigte das Transplantat eine gewisse Kontraktion (ungefähr 15 bis 20%); der Zentralbereich des Transpiantates dieses Patienten wies eine vollständig differenzierte Epidermis und eine ausgewachsene Dermis ohne Adnexe auf.
  • Dem Fachmann ist klar ersichtlich, dass zahlreiche Variationen und Modifikationen der oben beschriebenen Erfindung durchgeführt werden können, ohne den allgemeinen Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Claims (18)

1. Zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent, umfassend:
- eine Dermisschicht aus einem porösen, vernetzten Collagenschwamm, der kultivierte Fibroblasten enthält,
- eine Schicht von hochreinem, an der Dermisschicht befestigtem, nichtporösem Collagen und
- eine Epidermisschicht aus kultivierten Keratinocyten auf dem nichtporösen Collagen.
2. Zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent nach Anspruch 1, worin das nichtporöse Collagen ausgewählt ist unter Typ 1- Collagen, Typ 3-Collagen oder Gemischen davon.
3. Zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent nach Anspruch 1, worin das nichtporöse Collagen durch Vorbehandlung mit Pepsin hochgradig gereinigt worden ist.
4. Zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent nach Anspruch 1, worin die Fibroblastenzellen durch Behandlung einer Dermisprobe mit Collagenase erhalten werden.
5. Zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent nach Anspruch 1, worin die Keratinocytenschicht hergestellt wird, indem man eine Einzelzellsupsension von Keratinocyten erhält und Tropfen der Suspension gleichmäßig und diskontinuierlich auf die Schicht aus nichtporösem Collagen verteilt, die dann inkubiert wird.
6. Testkit zur Bestimmung der Auswirkung einer Substanz auf die Haut, enthaltend das zusammengesetzte Lebendhaut- Äquivalent nach Anspruch 1, das in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird, und auf das die Substanz aufbringbar ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes, wobei man:
(a) eine Hautprobe bereitstellt und die Probe enzymatisch behandelt, um die Epidermis von der Dermis zu trennen,
(b) die Epidermis enzymatisch behandelt, um Keratinocyten freizusetzen und die epidermalen Keratinocyten bis zur Konfluenz kultiviert,
(c) die Dermis enzymatisch behandelt, um Fibroblasten freizusetzen und die Fibroblasten bis zur Subkonfluenz kultiviert,
(d) eine poröse, vernetzte Collagenschwamm-Membran auf einer Seite mit den kultivierten Fibroplasten aus Schritt (c) inokuliert und den inokulierten Stamm inkubiert, um das Wachstum der Fibroblasten im Collagenschwamm zu bewirken,
(e) auf der anderen Seite des vernetzten Collagenschwammes eine Schicht aus nichtporösem Collagen bildet und diese inkubiert, um die Schicht aus nichtporösem Collagen zu polymerisieren,
(f) die polymerisierte Schicht aus Schritt (e) mit den kultivierten Keratinocyten aus Schritt (b) inokuliert und das so gebildete zusammengesetzte Hautäquivalent inkubiert, um weiteres Zellwachstum zu ermöglichen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das nichtporöse Collagen ausgewählt ist unter Typ 1-Collagen, Typ 3-Collagen oder Mischungen davon.
9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das poröse Collagen durch Vorbehandlung mit Pepsin weiter gereinigt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Fibroblasten durch Behandlung der Dermis mit Collagenase freigesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Inokulation in Schritt (f) durch gleichmäßige und diskontinuierliche Verteilung von Tropfen einer Einzelzellsuspension von Keratinocyten auf die polymerisierte Schicht aus nichtporösem Collagen durchgeführt wird.
12. Verfahren zur Herstellung eines zusammengesetzten Lebendhaut-Äquivalentes, wobei man:
(a) eine poröse, vernetzte Collagenschwamm-Membran mit kultivierten Fibroblasten inokuliert und den inokulierten Schwamm inkubiert, um das Wachstum der Fibroblasten durch den Collagenschwamm zu bewirken,
(b) eine Schicht von hochreinem, nichtporösem Collagen auf einer Seite des vernetzten Collagen-Schwammes aufbringt,
(c) die nichtporöse Collagenschicht mit kultivierten Keratinocyten inokuliert und das so gebildete, als Verbundstoff vorliegende Hautäquivalent inkubiert, um weiteres Zellwachstum zu ermöglichen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das nichtporöse Collagen ausgewählt ist unter Typ 1-Collagen, Typ 3-Collagen oder Gemischen davon.
14. Verfahren nach Anspruch 12, worin das nichtporöse Collagen durch Vorbehandlung mit Pepsin weiter gereinigt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Fibroblasten durch Behandlung einer Dermisprobe mit Collagenase freigesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Inokulation in Schritt (c) durch gleichmäßige und diskontinuierliche Verteilung von Tropfen einer Einzelzellsuspension von Keratinocyten auf die nichtporöse Collagenschicht durchgeführt wird.
17. Verfahren zur Herstellung eines Testkits zur Bestimmung der Auswirkung von Substanzen auf die Haut, wobei man ein zusammengesetztes Lebendhaut-Äquivalent gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 12 herstellt, und das Hautäquivalent an der Luft in einem geeigneten Kulturmedium weiter kultiviert.
18. Verfahren zur Bestimmung der Auswirkung einer Substanz auf die Haut, wobei man die zu testende Substanz auf das Hautäquivalent nach Anspruch 1 aufbringt, das an der Luft in einem geeigneten Kulturmedium weiter kultiviert worden ist, und dann jegliche Veränderung des Hautäquivalentes beobachtet oder bestimmt.
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