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DE69534869T2 - Matrix für Gewebekultur, Verfahren zum Züchten von Gewebe, Verfahren zur Befestigung von gezüchtetem Gewebe und befestigte Kunsthaut - Google Patents

Matrix für Gewebekultur, Verfahren zum Züchten von Gewebe, Verfahren zur Befestigung von gezüchtetem Gewebe und befestigte Kunsthaut Download PDF

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DE69534869T2
DE69534869T2 DE1995634869 DE69534869T DE69534869T2 DE 69534869 T2 DE69534869 T2 DE 69534869T2 DE 1995634869 DE1995634869 DE 1995634869 DE 69534869 T DE69534869 T DE 69534869T DE 69534869 T2 DE69534869 T2 DE 69534869T2
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DE
Germany
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tissue
sponge
skin
gelatin
cultured
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
DE1995634869
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English (en)
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DE69534869D1 (de
Inventor
Katsuyasu Ayabe-shi Morota
Shinichiro Ayabe-shi MORITA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gunze Ltd
Original Assignee
Gunze Ltd
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Publication date
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Publication of DE69534869T2 publication Critical patent/DE69534869T2/de
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Gewebe und ein Produkt, welches durch dieses Verfahren erhältlich ist.
  • Auf dem Gebiet der Medizin, der Lebensmittel, Kosmetika, etc. wird jährlich eine Vielzahl von Produkten entwickelt und verkauft. Um derartige Produkte zu entwickeln, die direkt auf den menschlichen Körper aufgebracht werden, ist die Bestätigung ihrer Sicherheit wesentlich. Das Testen an Tieren, das hauptsächlich als Sicherheitsüberprüfungstest durchgeführt wird, hat Nachteile in Bezug auf Kosten, einer langen Testperiode und unvollständigen Äquivalenz in Bezug auf Menschen. Außerdem wird eine Verbesserung von Tiertestmethoden in Bezug auf die Verhinderung von Grausamkeit gegenüber Tieren verlangt.
  • Ein Verfahren zum Bestimmen einer Intensität der Antwort von Prüfsubstanzen, umfassend das Aufbringen einer gewebespezifischen Substanz auf ein Gewebemodell, das in vitro mit Zellen oder Substanzen des Gewebes wiederhergestellt wurde, wurde kürzlich als eine Alternative versucht.
  • Andererseits wurden im klinischen Bereich konventionelle künstliche Organe, die aus Kunststoffen und Metallen als Ausgangsmaterialien zusammengesetzt sind, künstliche Organe, die weiter mit Materialien aus Organismen kombiniert sind, und sogenannte hybridähnliche künstliche Organe, die weiter mit kultivierten Zellen kombiniert sind, entwickelt.
  • Gezüchtete Haut ist ein vergleichsweise gut entwickeltes Beispiel auf dem Gebiet der Gewebemodelle und künstlichen Organe. Eine gezüchtete Haut umfasst Haut, die hergestellt wurde, indem menschliche Fibroblasten in Collagengel gezüchtet werden, gefolgt durch Impfen und Züchten von menschlichen Keratinozyten auf dem Gel, wenn das Gel geschrumpft ist (US Patent Nr. 4,485,096); Haut, die durch Impfen und Züchten von menschlichen Fibroblasten auf Nylongewebe hergestellt ist, gefolgt von Impfen und Züchten von menschlichen Keratinozyten darauf, wenn die Poren des Gewebes mit sekretierten Materialien der Fibroblasten gefüllt sind (Slivka, S.R., L. Landeen, Zimber, M., G. K. Naughton und R. L. Bartel, J. Invest. Dermatol., 96: 544A, 1991); und Haut, die durch Impfen und Züchten von menschlichen Fibroblasten in einem Collagenschwamm hergestellt wurde, gefolgt von Laminieren des Collagengels oder des Filmes und dem Impfen und Züchten von menschlichen Keratinozyten darauf (J. Jpn. P.R.S., 10, 165-180 (1990); japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. 47043/1995).
  • Das wichtigste Problem bei der Herstellung von Gewebemodellen, typischerweise gezüchteter Haut und künstlicher Organe besteht darin, eine dreidimensionale Struktur von Geweben oder Organen so schnell wie möglich wiederherzustellen Beispielsweise umfasst eine Haut hauptsächlich Keratinozyten in der Epidermis, Fibroblasten in der Dermis und interzelluläre Substanzen wie Collagen, die nicht in einer gemischten Form existieren. Eine Haut umfasst eine Schicht aus der Dermis, die durch eine dreidimensionale Wucherung von Fibroblasten in einer Collagenfasermatrix und einer Epidermisschicht, die darauf durch mehrmaliges Laminieren von Keratinozyten mit einer komplexen Differenzierung von einer Grundschicht zur Hornschicht über mehrere Schritte gebildet ist. Jedoch haben herkömmliche Gewebemodelle und künstliche Organe nicht die gewünschte dreidimensionale Struktur und haben ein Problem dahingehend, dass trotz des Fortschrittes der Entwicklung insbesondere in Bezug auf gezüchtete Haut, es mehr als einen Monat erfordert, um übliche gezüchtete Haut aus der Impfung von Zellen zur Vervollständigung der Hautrekonstruktion zu haben, und dass Keratinozytenlaminate in nur mehreren Lagen existieren und sie nur eine geringes Differenzierungsstadium, verglichen mit wirklicher menschlicher Haut, aufweisen.
  • Um die vorstehend erwähnten Probleme zu überwinden, ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Matrix für eine Gewebekultur zur Verfügung zu stellen und ein Verfahren zum Züchten von Gewebe, dass es ermöglicht, eine Gewebekultur zu erhalten, die die gewünschte dreidimensionale Struktur aufweist und zwar innerhalb eines kurzen Zeitraums, indem heterogene oder homogene Zellen einzeln oder gleichzeitig unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden. Die Lösung des vorstehenden Problems wird erzielt, indem jener der in den Ansprüchen definierter Gegenstand bereitgestellt wird.
  • Insbesondere wird ein Verfahren zum Züchten von Gewebe zur Verfügung gestellt umfassend die Schritte:
    • i) des Impfens eines ersten biokompatiblen Polymerschwamms mit einer Porengröße von 80 bis 95 Mikrometer und einer Dicke von 1 bis 5 Millimeter und wobei chemische Vernetzung in den Schwamm eingeführt ist, mit Fibroblasten,
    • ii) des Züchtens der Fibroblasten,
    • iii) des Laminierens eines zweiten biokompatiblen locker vernetzten Polymerschwamms mit einer Porengröße von 1 bis 30 Mikrometer und einer Dicke von 1 bis 2 Millimeter oben auf den ersten Schwamm,
    • iv) des Impfens des zweiten Schwamms mit Keratinozyten und
    • v) des Züchtens der Keratinozyten auf dem zweiten Schwamm,
    und ein Produkt, erhältlich durch dieses Verfahren, worin das Produkt vorzugsweise ein humanes Hautmodell ist.
  • 1 zeigt eine Querschnittsansicht, die typischerweise die Kulturbedingungen zeigt.
  • 2 zeigt eine Fotografie einer erfindungsgemäßen künstlichen Haut.
  • Daher stellt die Erfindung eine Gewebekultur bereit und ein Verfahren zum Züchten von Gewebe, wie es unter Bezugnahme auf die nachstehend gezeigten Punkte 1 bis 14 erklärt ist:
    Punkt 1. Eine Matrix für Gewebekultur, umfassend einen ersten Schwamm und einen zweiten Schwamm, der wenigstens eine verschiedene physikalische Eigenschaft aufweist und/oder wenigstens eine verschiedene chemische Eigenschaft.
    Punkt 2. Eine Matrix für eine Gewebekultur gemäß Punkt 1, worin die physikalische Eigenschaft die Porengröße ist.
    Punkt 3. Eine Matrix für Gewebekultur gemäß Punkt 1, worin die chemische Eigenschaft das Ausmaß der Quervernetzung ist.
    Punkt 4. Eine Matrix für Gewebekultur gemäß Punkt 1, worin der Schwamm aus einem biokompatiblen Polymer hergestellt ist.
    Punkt 5. Eine Matrix für Gewebekultur gemäß Punkt 1, worin das biokompatible Polymer Collagen ist.
    Punkt 6. Ein Verfahren zum Züchten von Gewebe unter Verwendung einer Matrix für eine Gewebekultur, umfassend einen ersten Schwamm und einen zweiten Schwamm, der wenigstens eine verschiedene physikalische Eigenschaft und/oder wenigstens eine verschiedene chemische Eigenschaft aufweist, wobei das Verfahren das Impfen und Züchten einer ersten Zelle auf dem ersten Schwamm umfasst, das Laminieren des zweiten Schwamms darauf und das Impfens und Züchtens einer zweiten Zelle auf dem zweiten Schwamm.
    Punkt 7. Ein Verfahren zum Züchten von Gewebe gemäß Punkt 6, worin die erste Zelle von der zweiten Zelle verschieden ist.
    Punkt 8. Verfahren zum Züchten von Gewebe gemäß Punkt 7, worin die erste Zelle ein Fibroblast ist und die zweite Zelle ein Keratinozyt ist.
    Punkt 9. Ein Verfahren zum Züchten von Gewebe gemäß Punkt 6, worin der zweite Schwamm in einem Züchtungsverfahren abgebaut wird und verschwindet.
    Punkt 10. Verfahren zur Fixierung eines gezüchteten Gewebes umfassend das Platzieren des gezüchteten Gewebes in eine Gelatinelösung, gelöst durch das Erhöhen der Temperatur, das Erniedrigen der Temperatur, um die Gelatine zu gelatinieren, um das gezüchtete Gewebe durch die gelatinierte Gelatine zu fixieren.
    Punkt 11. Verfahren zum Fixieren eines gezüchteten Gewebes gemäß Punkt 10, worin das gezüchtete Gewebe eine gezüchtete Haut ist.
    Punkt 12. Verfahren zum Fixieren eines gezüchteten Gewebes gemäß Punkt 10, worin die Gelatinelösung hergestellt wird, indem Gelatine in dem Gewebekulturmedium gelöst wird.
    Punkt 13. Ein Verfahren zum Fixieren eines gezüchteten Gewebes gemäß Punkt 11, worin die gezüchtete Haut eine Zweilagenstruktur aus einer Epidermis und einer Dermis aufweist, und wobei die Epidermis mit der Gasphase in Kontakt gebracht und die Dermis in eine Gelatinelösung gesetzt wird, um die gezüchtete Haut durch gelatinierte Gelatine zu fixieren.
    Punkt 14. Eine künstliche fixierte Haut, umfassend eine Dermisschicht, die durch Gelatine fixiert ist, und eine Epidermisschicht, die auf der Dermisschicht laminiert ist.
  • I. Punkte 1 bis 9
  • Die ersten und zweiten Schwämme, die erfindungsgemäß verwendet werden, weisen eine poröse Struktur auf. Die physikalische Eigenschaft umfasst die Porengröße. Im Falle des Impfens der ersten Zelle auf dem ersten Schwamm als Matrix für die Gewebekultur, wird die erste Zelle in den ersten Schwamm getropft und wuchert dreidimensional innerhalb der porösen Struktur, wenn die poröse Struktur ausreichend größer als die Größe der ersten Zelle ist. Im Gegensatz dazu, bleibt die zweite Zelle auf dem zweiten Schwamm, wenn die Poren des zweiten Schwamms kleiner sind als die Größe der Zellen. Daher erleichtert eine Kombination aus (i) ersten und zweiten Schwämmen, die eine verschiedene physikalische Eigenschaft aufweisen, wie die Porengröße und (ii) ersten und zweiten Zellen nicht nur die einzelne Kultur einer Vielzahl von Zellen, sondern ebenso die Kontrolle ihres Wucherungsstadiums.
  • Die Materialien der Schwämme umfassen biokompatible Polymere die Typ I, Typ II, Typ III und Typ IV Collagene, Gelatine, Natriumalginat, Fibronektin, Laminin, Hyaluronsäure, Chitin, Chitosan, EHS Maustumor gelöster Extrakt, etc., vorzugsweise umfassen sie Typ I, Typ II, Typ III und Typ IV Collagene.
  • Eine Vielzahl von Verfahren zur Herstellung der Schwämme wurde offenbart. Eines dieser Verfahren, offenbart in der ungeprüften japanischen Patentoffenlegung Nr. 43734/1993, umfasst die Zugabe eines lipophilen organischen Lösungsmittels zu einer Collagenlösung, das Homogenisieren dieser Lösung, damit sie sich vergrößert und anschließend das Lyophilisieren des Homogenats. Es können gemäß diesem Verfahren Collagenschwämme, die eine gleichmäßige Porengröße aufweisen, erhalten werden.
  • Die anderen bisher berichteten Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um erfindungsgemäße Schwämme herzustellen.
  • Die chemische Eigenschaft umfasst das Ausmaß des Quervernetzens. Wenn Collagen als biokompatibles Polymer verwendet wird, kann der Collagenschwamm durch die Einwirkung von Collagenase, die durch die Zellen abgesondert wird, abgebaut werden und verschwindet.
  • Eine Widerstandsfähigkeit gegenüber Collagenase kann jedoch durch die Einführung von Quervernetzung in den Collagenschwamm verliehen werden. Eine Stärke dieser Widerstandsfähigkeit kann durch das Ausmaß der Quervernetzung kontrolliert werden. Wenn das Züchten der ersten und zweiten Zellen unter Verwendung einer Matrix für eine Gewebekultur durchgeführt wird, vorausgesetzt dass die ersten und zweiten Collagenschwämme eine verschiedene Porengröße aufweisen, wird ein hohes Ausmaß an Quervernetzung in den ersten Collagenschwamm eingeführt und ein niedriges Ausmaß an Quervernetzung wird in den zweiten Collagenschwamm eingeführt, um sicherzustellen, dass nur der zweite Collagenschwamm selektiv abgebaut wird und verschwindet. Wenn die Quervernetzungsbedingungen von niedrig quervernetztem Collagenschwamm geeignet ausgewählt sind, kann weiterhin ein zweiter Collagenschwamm mit der gewünschten Rate des Verschwindens erhalten werden.
  • Das Einführen der Quervernetzung in den erfindungsgemäßen Schwamm kann beispielsweise durch Dehydrierungsquervernetzung unter Erhitzen, chemische Quervernetzung, etc. durchgeführt werden. Vernetzungsmittel für die chemische Quervernetzung sind nicht spezifisch beschränkt, aber umfassen Glutaraldehyd, Formaldehyd und ähnliche Aldehyde, Hexamethylendiisocyanat, Tolylendiisocyanat und ähnliche Diisocyanate, Ethylenglykoldiglycidylether und ähnliche Epoxide und Carbodiimidhydrochloride etc., vorzugsweise umfassen sie Glutaraldehyd.
  • Wie vorstehend gezeigt, kann die Matrix für die Gewebekultur, die die gewünschte Struktur aufweist, durch eine geeignete Kombination von ersten und zweiten Schwämmen erhalten werden, die wenigstens eine verschiedene physikalische Eigenschaft aufweisen und/oder wenigstens eine verschiedene chemische Eigenschaft.
  • Die Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben, indem ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Hautmodells als eine Ausführungsform genommen wird.
  • Ein erster Schwamm, der eine Porengröße von 80 bis 95 μm und eine Dicke von 1 bis 5 mm aufweist, wird hergestellt und anschließend wird chemische Quervernetzung in den Schwamm eingeführt.
  • Wenn humane Fibroblasten in der Dermis auf den ersten Schwamm geimpft werden, fallen die Fibroblasten in den ersten Schwamm und wuchern dreidimensional innerhalb der Poren des Schwamms. Der erste Schwamm wird nicht abgebaut und verschwindet nicht, weil eine starke Quervernetzung in den ersten Schwamm eingeführt wurde.
  • Der zweite Schwamm ist nur leicht quervernetzt und weist eine Porengröße von 1 bis 30 μm auf, vorzugsweise 5 bis 20 μm und eine Dicke von 1 bis 2 mm wird darauf laminiert. Humane Keratinozyten in der Epidermis werden auf den zweiten Schwamm geimpft. Die Keratinozyten wuchern auf der Oberfläche des zweiten Schwamms.
  • Obgleich es von der Art der zweiten Zelle, die auf den zweiten Schwamm geimpft wird, abhängt, wenn die Porengröße des zweiten Schwamms, in den Quervernetzung eingeführt wird, niedriger als 1 μm ist, können Wasser oder Nährverbindungen nicht frei durch den zweiten Schwamm gelangen, was zu einer ungenügenden Versorgung mit Nährstoffen für die zweite Zelle, die auf den zweiten Schwamm platziert ist, führt und ist daher nicht erwünscht. Außerdem, wenn die Porengröße mehr als 30 μm beträgt, kann eine zweite Zelle nicht auf den zweiten Schwamm fixiert werden. Eine schwache Quervernetzung, die in den zweiten Schwamm durch Dehydrierungsquervernetzen mittels Hitze unter den Bedingungen von 105 °C und während 24 Stunden eingeführt wird, wird abgebaut und verschwindet innerhalb von 5 Tagen während des Züchtens in DME-Medium, das 5 % Serum enthält.
  • Wie vorstehend gezeigt, übt der schwach quervernetzte zweite Schwamm nicht nur eine Wirkung dahingehend aus, dass er verhindert, dass menschliche Keratinozyten darauf tropfen, das heißt ein Gerüst für humane Keratinozyten zur Verfügung stellt, sondern ebenso, aufgrund des geringen Quervernetzens, Abbaus und Verschwindens des zweiten Schwamms nachdem er ein Gerüst für den humanen Keratinozyten gegeben hat, der auf dem zweiten Schwamm geimpft wurde und gewuchert ist.
  • Das Verschwinden des zweiten Schwamms der in wirklicher Haut nicht existiert, lässt das erhaltene Hautmodell näher an eine wirkliche Haut kommen.
  • Die ersten und zweiten Zellen, die gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Züchten von Gewebe verwendet werden, sind nicht auf menschliche Fibroblasten und menschliche Keratinozyten beschränkt, sondern umfassen andere Tierzellen.
  • II. Punkte 10 bis 14
  • Da gezüchtetes Gewebe, vorzugsweise Haut fixiert und gehalten wird durch die umgebende gallenartige Gelatine, indem das Gewebe in gelöste Gelatine eingetaucht wird, gefolgt von Gelatinieren der Gelatine, wird das Gewebe nicht bewegt oder von der umgebenden Gelatine getrennt, selbst das gewebefixierte Gelatine in einem Behälter geschüttelt wird, auf die Seite fällt oder umgedreht wird. Weiterhin fällt Gelatine nicht aus einem Behälter aufgrund ihrer hohen Viskosität. Daher ist das gezüchtete Gewebe, insbesondere Haut, die fixiert ist, während ihres Transports problemfrei.
  • Die Verwendung eines Zellkulturmediums als Lösungsmittel von Gelatine erleichtert die ausreichende Zufuhr von den nötigen Nährstoffen und stabilen Zellbedingungen während eines langen Zeitraums ohne den Tod und die Zerstörung der Zellen hervorzurufen. Gezüchtetes Gewebe, das eine Zweilagenstruktur aus einer Epidermis und einer Dermis aufweist, führt ein Problem ein, wie das Aufschwellen und der Zelltod, wenn die Epidermis nicht in Kontakt mit der Atmosphäre ist und wenn die Dermis nicht in Kontakt mit einer Nahrungsmittelzufuhr ist, das heißt mit einem Kulturmedium. Im Gegensatz dazu, führt das Verfahren zur Fixierung des gezüchteten Gewebes, insbesondere Haut, derartige Probleme nicht ein.
  • Gelatine ist nicht spezifisch darauf beschränkt, aber hergestellt durch die Extraktion aus Haut, Sehne, Körper, Kot, etc. von Tieren wie Schwein, Rindvieh etc. und hat einen Solgel-Übergangspunkt von 20–35 °C. Daher kann auch Leim als Gelatine verwendet werden.
  • Die Konzentration von Gelatine im Lösungsmittel reicht von 1 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 10 Gew.-% in Bezug auf die Solviskosität, die Gelatinierungszeit und die Stärke des gebildeten Gels. Wenn die Gelatinekonzentration zu hoch ist, tritt ein Problem der Zellbeschädigung während des Fixierungsvorganges und der Entfer nung auf. Wenn die Gelatinekonzentration zu niedrig ist, tritt ein Problem der zu langen Gelatinierungszeit und einer geringen Haltbarkeit auf.
  • Als Lösungsmittel ist ein DME-Medium, das 5 % Serum enthält, bevorzugt, um eine ausreichende Versorgung mit Nährstoffen während der Aufbewahrung und des Transports zur Verfügung zu stellen.
  • Eine bevorzugte gezüchtete Haut gemäß der Erfindung ist nicht spezifisch beschränkt, sondern umfasst zwei Schichten künstliche Haut für einen Toxizitätstest oder für eine Behandlung von Wunden, hergestellt durch Impfen und Wuchern eines Fibroblasten auf einen Collagenschwamm, gefolgt von Impfen und Wucherns eines Keratinozyten und eine einzelne Schicht künstlicher Haut.
  • Die Integration von gezüchtetem Gewebe mit Gelatinegel kann durch Hitze gelöste Gelatine in einer geeigneten Menge in einem Behälter mit Verschluss durchgeführt werden, indem das gezüchtete Gewebe in die Gelatine in der Mitte des Behälters platziert wird und anschließend der Behälters auf die Gelierungstemperatur heruntergekühlt wird, um das Gewebe zu fixieren.
  • Diese Integration kann ebenfalls durchgeführt werden, indem ein gezüchtetes Gewebe im Zentrum eines Behälters platziert wird, und die erforderliche Menge an gelöster Gelatine in den Behälter gegossen wird und anschließend der Behälter auf die Gelierungstemperatur gekühlt wird, um das Gewebe zu fixieren. Anschließend wird das fixierte Gewebe bei 10 °C oder einer höheren Temperatur gehalten, damit sich keine Zellen abtrennen oder unterhalb 37 °C, um Zelltod zu verhindern. Wenn man die fixierte Haut herausnimmt, kann die Haut direkt aus der gelatinierten Gelatine genommen werden, aber vorzugsweise wird der Behälter erwärmt, um Gelatine zu lösen, um Zellschäden zu verhindern. Wenn als Gel anstelle von Gelatine Agarose verwendet wird, verursacht das Eintauchen der Zellen in gelöste Agarose einen Zelltod, weil sich Agarose bei Temperaturen so hoch wie 60–70 °C löst, welches höher ist als die übliche Temperatur für Zellen, das heißt ungefähr 40 °C ist. Gelatine, die noch an gezüchtetem Gewebe hängt, wird vorzugsweise mit Salzlösung ausgewaschen.
  • Die Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Herstellung von gezüchteter Haut
  • (1) Herstellung eines stark quervernetzten Schwamms
  • Chloroform (0,5 g) wurde zu einer Lösung von Typ I Collagen (50 g) mit einer Konzentration 3 mg/ml zugegeben und die Mischung wurde mit einem Homogenisator bei 6000 Upm über 1 Minute homogenisiert. Das Homogenat wurde in einen Rahmen gegossen, der aus Edelstahl hergestellt wurde, und bei –40 °C eingefroren und nachfolgend bei 30 °C über 24 Stunden unter Vakuum (0,01 mm Hg) lyophilisiert. Nach der Dehydrierung unter Hitze für das Quervernetzen bei 105 °C für 24 Stunden unter Vakuum (0,01 mm Hg), wurde eine chemische Quervernetzung in den Schwamm eingeführt, indem man den Schwamm in eine 0,2 % Glutaraldehyd-Lösung für 24 Stunden tauchte. Der resultierende Schwamm wurde durch Lyophilisierung getrocknet, um einen stark quervernetzten Collagenschwamm zu ergeben, der eine Porengröße von 90 μm und eine Dicke von 3 mm aufwies.
  • (2) Herstellung eines schwach quervernetzten Schwamms
  • Eine 0,3 % wässrige Lösung von Typ I Collagen (pH 3) wurde mit Ethanol verdünnt, um eine wässrige Lösung zu ergeben, die 0,285 % Collagen und 10 % Ethanol enthielt. Ein Teil der Lösung mit 10 g wurde in eine Schale gegossen (Durchmesser 9 cm), die bei –135 °C eingefroren wurde und bei 40 °C für 24 Stunden unter 0,1 Grad Vakuum lyophilisiert wurde. Der erhaltene Schwamm wurde weiter unter Hitze dehydriert für das Quervernetzen bei 105 °C für 24 Stunden unter Vakuum (0,01 mm Hg), um einen schwach quervernetzten Collagenschwamm mit einer Porengröße von 30 μm und einer Dicke von 1 mm zu ergeben.
  • (3) Impfen und Züchten von Zellen
  • Der stark quervernetzte Collagenschwamm der in Schritt 1 hergestellt wurde, wurde auf der Oberfläche einer Platte mit 24 Vertiefungen zur Kultur verteilt, eine Suspension von humanen Fibroblasten (Produkt von KURABO Industries Ltd.) in MEM-Medium, das 10 % Serum enthielt, wurde auf den Schwamm mit einer Konzentration von 5,0 × 105 Zellen/cm2 geimpft und anschließend über Nacht bei 37 °C unter 5 % CO2 kultiviert, bis die Zellen vollständig daran hafteten. Der schwach quervernetzte Collagenschwamm der in Schritt 2 hergestellt wurde, wurde darauf laminiert, eine Suspension von menschlichen Keratinozyten (Produkt von KURABO Industries Ltd.) in KGM-Medium wurde mit einer Konzentration von 5,0 × 105 Zellen/cm2 aufgeimpft und anschließend über Nacht bei 37 °C unter 5 % CO2 kultiviert, bis die Zellen vollständig anhafteten.
  • Die Kulturmatrix wurde aus der Platte mit 24 Vertiefungen für die Kultur entnommen und auf eine Platte mit 6 Vertiefungen gegeben, wobei DME-Medium, das 5 % Serum enthielt, anstelle von KGM-Medium verwendet wurde. Die Kultur wurde während weiteren 5 Tage fortgesetzt, während menschliche Keratinozyten mit Luft in Kontakt gebracht sind, indem das Volumens des Kulturmediums angepasst wurde, um die gewünschte gezüchtete Haut zu ergeben.
  • Der stark quervernetzte Collagenschwamm und der schwach quervernetzte Collagenschwamm bedeuten einen zu einem hohen Grad quervernetzten Collagenschwamm und einen zu einem niederen Grad quervernetzten Collagenschwamm.
  • 1 zeigt die typischen Kulturbedingungen.
  • In 1, bedeutet 1 einen stark quervernetzten Collagenschwamm, 2 ist ein menschlicher Fibroblast, 3 ist ein schwach quervernetzter Collagenschwamm, 4 ist ein menschlicher Keratinozyt, 5 ist das Medium und 6 ist die Kulturplate.
  • Die so erhaltene gezüchtete Haut wurde einer Formalinfixierung und anschließend dem Färben mit HE unterzogen. Die Beobachtung der erhaltenen Haut zeigte deutlich, dass menschlicher Fibroblast 2 gut in dreidimensionaler Form in dem stark quervernetzten Collagenschwamm 1 wucherte. Die Fotografie der künstlichen erfindungsgemäßen Haut nach dem Färben mit HE ist in 2 gezeigt.
  • Nach Beginn der Luftflüssigphasengrenzenkultur, verschwand der schwach quervernetzte Collagenschwamm 3 fast vollständig und menschliche Keratinozyten wurden in mehreren Schichten am Tag 1 auflaminiert. Die Differenzierung der menschlichen Keratinozyten begann am Tag 3. Am Tag 5 wurde eine gut differenzierte Epidermis, die 10 Lagen ähnlich der menschlichen Haut aufwies, erhalten.
  • Wie vorstehend gesagt, wurde gezüchtetes Gewebe mit der gewünschten dreidimensionalen Struktur, insbesondere gezüchtete Haut, die menschliche Hautstrukturen reproduziert, künstlich und schnell erhalten, indem heterogene oder homogene Zellen getrennt oder gleichzeitig unter geeigneten Bedingungen für jede Zelle gezüchtet wurden. Daher ist das erfindungsgemäß gezüchtete Gewebe für einen Sicherheitstest in Bezug auf Toxizität, Reizung, Durchlässigkeit von Medizin, Kosmetika, etc. geeignet und es ist ebenso für die Behandlung von verbrannten Epidermis- und Dermisschichten verwendbar.
  • Beispiel 2
  • I. Fixierung eines Hautmodells durch Gelatine
  • (1) Herstellung der Gelatinelösung
  • Ein DME-Medium, enthaltend 5 % Serum (100 ml) als Lösungsmittel wurde bei 37 °C gehalten. Zur Lösung wurde Gelatinepulver (10 g) von Rinderknochen, sterilisiert durch EOG, zugegeben und die Mischung gerührt, um das Gelatinepulver zu lösen. Die Gelatinelösung war frei fließend und eine Lösung mit niedriger Viskosität wie Wasser.
  • (2) Fixierung durch ein Gel
  • Das Hautmodell, das in Beispiel 1 (3) erhalten wurde und eine Doppelschichtstruktur aus einer Dermis und Epidermis aufweist, wurde in die Mitte eine Platte mit 6 Vertiefungen platziert. Das Gelatinesol (3 ml), das in Beispiel 2 (1) hergestellt wurde, wurde um das Modell zugegeben. Wenn dieses Flüssigkeitsvolumen verwendet wurde, wurde die Oberflächenepidermisschicht mit der Gasphase, das heißt Luft, in Kontakt gebracht und die Dermisschicht wurde anschließend in Gelatinelösung eingetaucht. Die Platte wurde bei Raumtemperatur (ungefähr 20 °C) für 30 Minuten stehen gelassen, was zur Fixierung des Hautmodells durch quallenartige Gelatine mit hoher Viskosität führte.
  • II. Überprüfung während Aufbewahrung und Transport
  • Um die Stabilität des gezüchteten Hautmodells, das so fixiert wurde unter Aufbewahrungs- und Transportbedingungen zu überprüfen, wurde die Anzahl der normalen Zellen des erfindungsgemäßen Hautmodells nach dem das Modell bei Raumtemperatur (20 °C) für 3 und 5 Tage stehen gelassen wurde, durch das neutrale Rotverfahren gezählt. Das Hautmodell wurde vor der Fixierung, das bei 37 °C gezüchtet worden war, als Kontrolle verwendet. Die bestimmten Werte, d.h. 97,7 % (nach 1 Tag), 101,8 % (nach 3 Tagen), 102,0 % (nach 5 Tagen) wurden erhalten mit der Maßgabe, dass der bestimmte Kontrollwert als 100 % angesehen wurde.
  • Zur gleichen Zeit zeigte die Beobachtung der Gewebescheibe des erfindungsgemäßen Modells am Tag 5, dass die Zellen im Wesentlichen keine Veränderung in Bezug auf ihre Struktur aufwiesen. Weiter behielt die gezüchtete Haut, die mit Gelatinegel fixiert wurde, ihre ursprünglichen Bedingungen bei und war frei von Trennung und Schäden.
  • Wie in Beispiel 2 gezeigt, ist das erfindungsgemäße Hautmodell frei von Problemen wie Beschädigung oder Zerstörung von Zellen während des Transports oder während der Handhabung, da die gezüchtete Haut durch hochviskose Gelatine fixiert und gehalten wird unter Verwendung der Charakteristika der umkehrbaren Umwandlung zwischen Sol und Gel innerhalb eines Bereichs von 20 bis 35°C.
  • Das gezüchtete Gewebe der Erfindung wurde dahingehend charakterisiert, dass das Zellkulturmedium als Lösungsmittel verwendet werden kann, dass die Wachstumsbedingungen des Gewebes beibehalten werden können, indem geeignete Nährstoffe zugegeben werden und dass die Zellen nicht beschädigt werden oder absterben innerhalb der Solgelübergangstemperatur. Daher ist das gezüchtete fixierte Gewebe für die Aufbewahrung bis zur Verwendung und während des Transports geeignet. Außerdem wird bei der Verwendung von bodenfreien Behältern die Verarbeitbarkeit verbessert und Schädigungen werden vermindert, während des Herausnehmens und der Bewegungsvorgänge des fixierten gezüchteten Gewebes. Im Falle, dass eine Gelatinelösung als Zellkulturmedium verwendet wird, ist es für das gezüchtete Gewebe nicht nötig, bewegt zu werden, was zu einer Verbesserung der Verarbeitbarkeit führt und die Schäden während der Operation zur Verlagerung vermindert.

Claims (6)

  1. Verfahren zum Züchten von Gewebe, umfassend die Schritte: (i) des Impfens eines ersten biokompatiblen Polymerschwamms mit einer Porengrösse von 80 bis 95 μm und einer Dicke von 1 bis 5 mm, und wobei chemische Vernetzung in den Schwamm eingeführt ist, mit Fibroblasten, (ii) des Züchtens der Fibroblasten, (iii) des Laminierens eines zweiten biokompatiblen, locker vernetzten, Polymerschwamms mit einer Porengrösse von 1 bis 30 μm und einer Dicke von 1 bis 2 mm oben auf den ersten Schwamm, (iv) des Impfens des zweiten Schwamms mit Keratinozyten und (v) des Züchtens der Keratinozyten auf dem zweiten Schwamm.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biokompatible Polymer Kollagen ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste biokompatible Polymerschwamm durch chemische Vernetzung eng vernetzt ist und der zweite biokompatible Polymerschwamm durch Wärmedehydratationsvernetzung locker vernetzt ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Fibroblasten humane Fibroblasten und die Keratinozyten humane Keratinozyten sind.
  5. Produkt, welches durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist.
  6. Produkt nach Anspruch 5, wobei das Produkt ein humanes Hautmodell ist.
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