DE68918922T2

DE68918922T2 - Biologische Unterlage für Zellkulturen, bestehend aus durch Thrombin koagulierte Plasmaproteine, ihre Verwendung für die Keratinozytenkultur, deren Rückgewinnung und Transport für therapeutische Verwendungszwecke.

Info

Publication number: DE68918922T2
Application number: DE68918922T
Authority: DE
Inventors: Herve Broly; Vincent Ronfard
Original assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Current assignee: CENTRE REGIONAL DE TRANSFUSION
Priority date: 1988-12-06
Filing date: 1989-11-30
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2009-12-01
Also published as: EP0373044A1; DE68918922T3; DE68918922D1; ES2060803T5; ES2060803T3; EP0373044B2; FR2639958B1; ATE113071T1; EP0373044B1; FR2639958A1; US5474770A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine biologische Unterlage für Zellkulturen, die aus einer koagulierten Mischung eines Konzentrats von Plasmaproteinen und Thrombin gebildet wird, ihre Verwendung für die Keratinocytenkultur und deren Transport in Form wiederhergestellter Epidermen und die Verwendung dieser zu therapeutischen Zwecken.
Die Rekonstruktion im Labor einer lebenden Haut, ähnlich der menschlichen Haut, ausgehend von einigen Zellen einer Biopsie oder einer vereinfachten Haut, welche die physiologischen Funktionen der normalen Haut sichert, stellt das Objekt zahlreicher Studien dar zu dem Zweck, die durch ein schweres Leiden (genetisch ...) lädierte oder durch starke Brandwunden zerstörte Haut zu ersetzen.
Die Haut ist ein komplexes Organ, das aus drei nebeneinanderliegenden Geweben zusammengesetzt ist: die Epidermis, zu 85% aus Keratinocyten gebildet, welche die undurchlässige verhornte Schicht herstellen, welche den Körper vom äußeren Milieu abschirmt; das Corium, welches Zellen umfaßt, von denen die Fibrocyten, die durch ein Bindegewebe abgetrennt sind, vornehmlich Kollagen bilden; das Corium ruht auf dem Hypoderm, welches die in die Fetteinlagerung spezialisierten Zellen umfaßt. Die künstliche Rekonstruktion eines so komplexen Organs stellt also zahlreiche Probleme.
Das erste Gewebe, das teilweise in vitro rekonstruiert wurde, ist das Corium, durch das Team von Bell (Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 - 1979 - 1274). Ausgehend von Hautbiopsien, konnten die Fibroblasten in Kultur gezogen werden, zuerst in Monoschichten, dann, nach einigen Durchgängen, indem diese Zellen verteilt wurden im Kulturmilieu, welches Kollagen (Extrakt aus den Sehen von Rattenschwänzen) enthielt , wobei diese ein Gel bildeten und eine dreidimensionale Kultur ermöglichten. Man sieht, in dieser Kultur die Fibroblasten mit der Kollagenmatrix zusammenwirken, sie organisieren und sie wie ein normales Corium kontraktieren. Das in vitro rekonstruierte Gewebe ist unter dem Namen "äquivalentes Corium" bekannt. Nach einigen Wochen in Kultur ermöglichen es die mechanischen Eigenschaften des äquivalenten Coriums, es zu verwenden, um es bei einem Kranken oder einem Verletzten zu implantieren. Es scheint durch den Empfänger nicht abgestoßen zu werden. Dennoch ist diese äquivalente Haut nur ein provisorischer Verband: er kann nicht die Funktion der zur Haut gehörenden Grenze wiederherstellen.
Andererseits hat das Team von Green (H. Green et al. Proc. Natl. Adac. Sci 76, 1979, 5665) eine Methode und ein Kulturmilieu entwickelt, das es ermöglicht, Keratinocyten in verlängerter Weise zu kultivieren. Diese Methode umfaßt die Einimpfung von in Trypsin verteilten Keratinocyten in eine vorher errichtete Monoschicht von Fibroblasten, besonders von 3T3 Zellen, die tödlich bestrahlt wurden und die ans Nahrschicht und Matrix dienen. Das Epidermisblatt entwikkelt sich sehr schnell, um eine Gewebe von 3 bis 5 Zellen Dicke zu bilden; es kann bei einem Patienten eingepflanzt werden und setzt fort, sich in situ zu differenzieren. Große Brandwunden konnten schon durch diese Technik gerettet werden (G. Gallico et al. New England J. Med. 311, 1984, 448).
Durch die Technik von Green kann man ausgehend von einer Biopsie von zwei Quadratzentimetern nach drei Wochen eine Epidermis von einem Quadratmeter erhalten.
Die Wiederherstellung des rekonstituierten Gewebes, um daraus ein Implantat zu machen, stellt noch technische Probleme. Tatsächlich müssen die Zellen von der Kulturschale abgezogen werden durch eine enzymatische Behandlung, ohne sie voneinander zu trennen; im Lauf dieses Vorgangs beobachtet man immer ein Zusammenziehen des Zellteppichs und folglich einen Verlust eines bestiinmten Prozentsatzes der Implantatfläche. Der rekonstruierte Teppich wird abgelöst, er muß auf eine Unterlage implantiert werden, welche seinen Transport und sein Einpflanzen im Patienten ermöglicht. Man verwendet im Allgemeinen einen Verband aus Gaze mit Vaseline. Diese Handhabungseinheit ist empfindlich und benötigt viel Zeit.
Es wäre also sehr hilfreich, neue biologische Unterlagen zur Verfügung zu stellen, welche im Laufe der Zeit von dem Patienten mitdem Implantat resorbiert werden können und die Handhabung der Zellen vereinfachen. Um die Verfügbarkeit zu garantieren, müßten außerdem diese Unterlagen oder ihre Bestandteile zur Herstellung geeignet und unter industriellen Verfahren konditionierbar sein.
Die Antragstellerin hat daher eine biologische Unterlage für Zellkulturen entwickelt, die aus einer Mischung eines Konzentrats von durch Thrombin koaqulierbaren Plasmaproteinen und der Menge an Kalzium-Thrombin zusammengesetzt wird, die nötig ist, um die Koagulation auszulösen.
Die Koagulation der Plasmaproteine in Anwesenheit von Thrombin beruht prinzipiell auf der Bildung eines polymerisierten Fibrinnetzes, welches das Gebilde von Blutklümpchen nachahmt. Um eine an die Zellkultur angepaßte Unterlage zu bilden wird die Koagulation unter, die Bildung eines Films begünstigenden, Bedingungen ausgeführt und besonders in Petrischalen oder in jedem Flakon, der an die Zellkultur angepaßt ist.
Das Plasmaprotein-Konzentrat ist von der Antragstellerin schon in der europäischen Patentanmeldung 88.401 961.3 beschrieben: es wird durch Fällung frischen Plasmas erhalten, durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit Ethanol von 10% bei 4ºC. Das Konzentrat umfaßt außerdem mehr als 90% Fibrinogen und pro Gramm Protein mindestens 0,1 UI Faktor XIII und 0,03 bis 0,1 Gramm Fibrinoectin. Das Konzentrat wird abgepackt und gefriergetrocknet, um bis zu seiner Verwendung konserviert zu sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ebenso das durch Thrombin koagulierbare Proteinkonzentrat, das besonders für die Herstellung der biologischen Unterlage für Zellkulturen abgepackt ist.
Im Moment seiner Verwendung wird das Konzentrat wieder in einer waßrigen Salzlösung aufgelöst oder in einer Lösung, welche einen polyvalenten Proteaseinhibitor enthält, vorzugsweise Aprotinin, bei einer Konzentration von 3000 UIK/ml.
Um den Koagulierungsprozeß und somit die Bildung des Films, welcher als Unterlage für die Zellen dient, auszulösen, fügt man Thrombin mit oder ohne Kalzium hinzu. Der Prozeß umfaßt die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin unter der Einwirküng von Thrombin und die Polymerisation des Fibrinmonomers mit dem Fibrinoectin unter der Einwirküng des durch Ca&spplus;&spplus;-Ionen aktivierten Faktors XIII.
Um die Unterlage gemäß der Erfindung zu bilden, die für Zellkulturen besonders günstig ist, fügt man vorzugsweise die Thronbinkonzentration von ungefahr 10 UI/ml (wesentliche geringere Konzentration als die, die man verwendet, wenn die untersuchte Konsistenz verschieden ist, wie im Fall der biologischen Kleber - Patentanmeldung 88.401 961.3, weiter oben angeführt -).
Entsprechend verschiedenen Ausfuhrungsweisen der Erfindung kann man in die Unterlage verschiedene Zusätze einbauen, die besonders bestimmt sind, die Zellvervielfachung in vitro oder in situ zu begünstigen und somit die Vernarbung der Wunde nach der Implantation zu begünstigen.
Die Unterlage kann also einen Zusatz enthalten, der die Zellvervielfachung wie ein Wachstumsfaktor und ganz besonders der EGF ("epidermal growth factor") begünstigt.
Man kann auch ein Vernarbungsmittel und/oder ein Antibiotikum einbauen.
Die Unterlage gemäß der Erfindung ist besonders günstig für menschliche Keratinocytenkulturen. Die Zellen können sowohl primäre Kulturen sein, die von Hautbiopsien eines Patienten stammen und zwischen 1 und 4 Verdünnungsdurchläufen 1/15 bis 1/20 durch laufen haben, als auch Zellen, welche in Form einer Bank in flüssigem Stickstoff konserviert wurden.
Diese in einem verwachsenen Teppich befestigten Keratinocyten sind mit Trypsin versetzt und im Moment ihrer Einimpfung auf der Unterlage gemäß der Erfindung in einem geeigneten Kulturmilieu wieder in Suspension versetzt.
Die Verwendung der biologischen Unterlage gemäß der Erfindung kann in drei verschiedenen Weisen angepaßt werden.
Gemäß einer ersten Verwendungsweise wird die biologische Unterlage in der Form eines Films hergestellt, durch die Mischung der beiden Bestandteile auf einer Kulturschale; eine Suspension von Keratinocyten wird in diesen Film eingeimpft, in geeignetes Kulturmilieu. Wenn die Keratinocytenkultur verwachsen oder halb-verwachsen ist, bildet sie ein Ersatzgewebe, das direkt als Implantat abgenommen werden kann, das man mithilfe von Klemmen befestigen und in der Schale zu dem Patienten transportieren kann, für den es so angewendet wird, ohne eine Transportunterlage wie Gaze zu benötigen. Dies ermöglicht einen großen Zeitgewinn in der Präparation und eine Abnahme von 100% des Kulturgewebes.
Entsprechend einer anderen Verwendungsweise der Unterlage gemäß der Erfindung werden die beiden Bestandteile der Unterlage mit der Suspension der Keratinocyten in der Weise vermischt, daß die Zellen in dem Film, der sich nachher bildet, integriert werden. Gemäß dieser Verwendungsweise kann die Mischung der beiden Bestandteile mit der Zellsuspension in einer Kulturschale ausgeführt und dann als Implantat verwendet werden, wie in der vorhergehenden Verwendungsweise; sie kann auch direkt auf der Wunde des Patienten ausgeführt werden, die für die Aufnahme eines Implantats vorbereitet ist, besonders bei Pulverisierung der biologischen Unterlage und der Zellen mithilfe eines Trägergases (Stickstoff) unter einem Druck von 2 bis 2,5 Bar.
Gemäß einer anderen Verwendungsweise der Unterlage gemäß der Erfindung wird die Mischung der beiden Bestandteile auf einem vorher in einer Kulturschale errichteten Zellteppich von Keratinocyten hergestellt, in der Weise, daß die Zellen in dem gebildeten Film eingewickelt werden und somit befestigt und transportiert werden können, um als Implantat eingesetzt zu werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, jedoch ohne sie in ihrer Bedeutung zu beschränken.

Beispiel I - Herstellung der biologischen Unterlage für Zellkulturen.

Man stellt eine biologische Unterlage für Zellkulturen her, indem man ein Konzentrat von koagulierbaren Plasmaproteinen und die Menge an Kalzium-Thrombin mischt, die nötig ist, um die Koagulation auszulösen.

A. Herstellung des Plasmaprotein-Konzentrats

Die Herstellung des Proteinkonzentrats ist schon durch die Anmelderin in der europäischen Patentanmeldung 88.401 961.3 beschrieben worden. Zusammengefaßt verwendet man menschliches Plasma, das nicht bei Tiefteinperatur gefällt wurde; man unterzieht es nacheinander zwei Fällungen mit 10%igem Ethanol, bei einem pH-Wert von 7,2 und 4ºC. Zwischen den beiden Fällungen unterzieht man das Produkt einer Inaktivierungsbehandlung durch einen Virus. Der Niederschlag, durch Zentrifugation von der darüberliegenden Flüssigkeit getrennt, wird mit Ethanol bei 4ºC gewaschen und wieder zentrifugiert. Der Niederschlag wird wieder in Suspension überführt in einem Tris/Citrat-Puf fer bis zu einer Proteinkonzentration von ungefahr 35 g/l und Lysin zugeführt bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,2 g pro Gramm Protein. Nach einer Diafiltration, um den Alkohol und das Citrat zu beseitigen und um die Ionenstärke einzustellen, wird das Konzentrat in Flakons abgefüllt und gefriergetrocknet.
Dieses Proteinkonzentrat schließt pro Gramm Protein mindestens 0,9 g Fibrinogen, 0,03 bis 0,06 g Fibronectin und 0,15 bis 0,30 UI Faktor XIII ein.

B. Herstellung der Unterlage für Zellkulturen

Das weiter oben beschriebene Proteinkonzentrat wird wieder in Suspension in einer waßrigen Lösung überführt, mit oder ohne Aprotinin bei 3000 UIK/ml (Kallicrein-lhnibitor Einheiten/ml).
Man mischt diese Lösung mit einem Volumen gleich dem Kalzium-Thrombin bis 10 UI/ml.
Für eine Petrischale von 10 cm Durchmesser verwendet man 2 mi Proteinsuspension und 2 mi Thrombin, wobei diese beiden Lösungen gleichzeitig durch zwei Spritzen eingespritzt werden, die durch ein Verbindungsstück zum Mischen verbunden sind. Man rührt in der Petrischale so, daß man eine gleichmäßige Verteilung erhält, dann läßt man sie wahrend 15 bis 20 Minuten ruhen. Die Herstellung bildet einen Film, der die Schale bedeckt.
Die Kulturschalen sind von "für die Zellkultur nicht behandelter" Qualität, was es der Unterlage ermöglicht, nicht permanent anzuhaften, was ihre spätere Abnahme vereinfacht.
Dieser Film wird dann vom Kulturmilieu für Zellen bedeckt. Dieses Milieu wird mehrere Male erneuert, bis der osmotische Druck des Films in einem Bereich stabilisiert ist, der mit der Physiologie der Zellen verträglich ist, das heißt zwischen 260 und 340 mosM (Milliosmol)
Wahlweise kann man das vor der Mischung mit Thrombin rückgebildete Proteinkonzentrat dialysieren.

Beispiel 2. - Kultivieren der Keratinocyten auf der biologischen Unterlage.

Man verwendet primäre Keratinocytenkulturen, die gemäß der herkömmlichen Technik von Green hergestellt wurden, ausgehend von Haut-Biopsie(n) eines Patienten (oder der Haut eines Embryos, um fötale Zellbanken zu bilden). Diese primären Kulturen können 4 bis 5 Verdünnungsvorgängen 1/10 unterzogen werden.
Ein verwachsener Keratinocytenteppich wird mit Trypsin versetzt, wieder in einem Kulturmilieu in Suspension versetzt und in einer Verdünnung 1/10 auf eine Petrischale eingeimpft, die mit einem Film der biologischen Unterlage bedeckt ist, die in Beispiel 1 beschrieben.
Nach einigen Stunden haften die Zellen an der Unterlage; sie vervielfachen sich dort dann normal, bis sie ein verwachsenes Epidermisfragntent und eine Dicke von 3 oder 4 Zellschichten bilden.
Dieses wiedergebildete Epidermisfragment, das an der Unterlage haftet, kann an der Kulturschaie mithilfe von Klammern befestigt und so auf einer Wunde verwendet werden, die für die Aufnahme eines Implantats vorbereitet wurde.
Aufgrund der Haftung der Zellen an der Unterlage ist es nicht nötig, die wiedergebildete Epidermis auf einer anderen Unterlage wie Gaze mit Vaseline zu implantieren, die bei den anderen Kulturarten verwendet werden muß. Dies ermöglicht einen großen Zeitgewinn in der Präparation: man schafft es, 40 Schalen pro Stunde zu handhaben anstelle von 4 bei der herkömmlichen Technik.
Außerdem hält diese Unterlage gut den Handhäbungen stand und zieht sich nicht in dem Moment zusammen, da man sie befestigt, was es ermöglicht, 100% der Fläche des Zellteppichs in der Kultur abzunehmen.

Beispiel 3 - Abnahme eines vorher errichteten Zellteppichs mithilfe einer biologischen Unterlage.

Keratinocyten werden gemäß der herkömmlichen Methode von Green in einer Kultur gehalten, in einer Petrischale, die mit einer Schicht tödlich bestrahlter Fibroblasten bedeckt ist.
Wenn der Keratinocytenteppich verwachsen ist und einigen Zellschichten bildet, wird das Kulturmilieu beseitigt und man fügt eine EDTA-Lösung während 1 Stunde 30 hinzu, dann führt man zwei Waschungen mit PBS aus. Man laßt dann die biologische Unterlage direkt auf den Zellteppich gleiten, gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methode.
Wenn der Film auf den Zellen gebildet ist, kann er mit Klemmen befestigt und als Implantat verwendet werden, wie in dem vorhergehenden Beispiel.

Beispiel 4 - Einbau der Zellen in die biologische Unterlage.

Man stellt eine Spritze mit einer Proteinlösung und eine Spritze mit Thrombin her, welches die Keratinocyten in Suspension enthält. Diese Keratinocyten können aus einer frischen, mit Trypsin versetzten Kultur oder von einer in flüssigem Stickstoff konservierten Zellbank stammen.
Die beiden Spritzen werden mithilfe eines Verbindungsstücks zur Mischung verbunden und man pulverisiert die Unterlage, welche die Zellen in der Petrischale (oder auf der Wunde, in die implantiert werden soll) enthält ; die Zellen befinden sich also eingefangen in dem Film während seiner Koagulierung. Diese Pulverisierung kann mithilfe eines Trägergases (Stickstoff unter einem Druck von 2 bis 2,5 Bar) geschehen.
Diese Pulverisierung verändert nicht die Natur der Zellen und man beobachtet die Rückbildung eines Zellteppichs, in der Kultur in vitro. Die Zellen müssen sich also normal oder quasi normal vervielfachen, wenn die Mischung pulverisiert ist, in sehr dünnen Schichten, direkt auf einer Wunde.

Claims

1. Biologische Unterlage für Zellkulturen, bestehend aus dem Gemisch:

- aus einem Konzentrat von durch Thrombin koagulierbaren Proteinen, das durch Behandeln von menschlichem Plasma mit Ethanol erhalten wird und ausgeglichene Anteile von Fibrinogen, und vorzugsweise mehr als 90 %, von Faktor XIII, und vorzugsweise mindestens 0,1 IE/g, und von Fibronectin, und vorzugsweise 0,03 bis 0,1 g/g, enthält,

- und aus der Menge an Calcium-Thrombin, die erforderlich ist, um die Koagulation auszulösen,

dadurch gekennzeichnet, daß es konditioniert und lyophilisiert ist zur Verwendung:

durch einfaches Wiederauflösen in wäßriger Lösung in einem Gefäß von der Art einer Petrischale, um darin einen Film zu bilden,

und durch Einstellen des osmotischen Drucks dieses Films auf einen physiologischen Druck zwischen 260 und 340 mosM, vorzugsweise mit Zellkulturmedium,

- und dadurch, daß es somit mit der Vermehrung von Zellen vom Typ menschlicher Keratinocyten vereinbar ist, was die Bildung von Epidermisfragmenten zum Ersatz möglich macht.

2. Biologische Unterlage nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Calcium-Thrombin mit dem wieder in Lösung gebrachten Proteinkonzentrat in einer Dosis von ungefähr 10 IE/ml vermischt wird.

3. Biologische Unterlage nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Additiv eine Substanz enthält, welche die Zellvermehrung begünstigt.

4. Biologische Unterlage nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Additiv ein Antibiotikum enthält.

5. Biologische Unterlage nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Additiv eine Substanz enthält, welche die Wundheilung begünstigt.

6. Verwendung der biologischen Unterlage nach einein der Ansprüche 1 bis 5 zur Kultur von menschlichen, fötalen oder adulten Keratinocyten, um ein Ersatzgewebe zu bilden, das direkt gewonnen bzw. entnommen, transportiert und als Transplantat verwendet werden kann.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus den beiden Bestandteilen der biologischen Unterlage derart hergestellt wird, daß es einen einheitlichen Filin in einem Kulturgefäß bildet und daß die Keratinocyten in Suspension in Kulturmedium auf diesen Film ausgesät werden.

8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Bestandteile der biologischen Unterlage mit einer Keratinocytensuspension derart vermischt werden, daß die Zellen in den später gebildeten Film integriert sind.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinocytensuspension nach der Dispergierung eines zuvor bereits bestehenden frischen Zellrasens hergestellt wird.

10. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinocytensuspension aus einer in flüssigem Stickstoff konservierten Zellbank hergestellt wird.

11. Verwendung der biologischen Unterlage nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Gewinnung bzw. Entnahme und zum Transport einer zuvor bereits bestehenden Kultur von menschlichen, fötalen oder adulten Keratinocyten.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch der beiden Bestandteile der biologischen Unterlage auf dem zuvor bereits bestehenden Zellrasen in einem Kulturgefäß hergestellt wird.