DE69725317T2

DE69725317T2 - Implantierbare agarose-kollagenkügelchen enthaltende zellen, die ein diffusionsfähiges biologisches produkt bilden und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69725317T2
Application number: DE69725317T
Authority: DE
Inventors: Kanti Jain; L. Albert RUBIN; Shirin Asina; Barry Smith; Kurt Stenzel
Original assignee: Rogosin Institute Inc
Current assignee: Rogosin Institute Inc
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2017-03-22
Also published as: EP0914043A4; FI120332B; CN1296477C; CN1215309A; ES2206696T3; EP0914043B1; AU722109B2; CN1495253A; IL126442A0; ATE374034T1; AU2218897A; NZ337109A; NO984627L; CA2250880C; CN1119080C; JP2001503380A; NO984627D0; FI981957L; AU722109C; ATE250858T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Einkapselung von Zellen in Agarose und Kollagen, gefolgt von Beschichten mit Agarose, therapeutische Verfahren, welche die Zellmaterialien verwenden, und die Herstellung davon.
Hintergrund und Stand der Technik
Die Einkapselung von verschiedenen biologischen Materialien in biologisch kompatiblen Materialien ist eine Technik, die während einiger Zeit verwendet worden ist, wenn auch mit beschränktem Erfolg. Beispiele für den Stand der Technik sind US Patent Nr. 5,227,298 (Weber et al.); 5,053,332 (Cook et al.); 4,997,443 (Walthall et al.); 4,971,83 (Larsson et al.); 4,902,295 (Walthall et al.); 4,798,786 (Tice et al.); 4,673,566 (Gooser et al.); 4,647,536 (Mosbach et al.); 4,409,331 (Lim); 4,392,909 (Lim); 4,352,883 (Lim) und 4,663,286 (Tsang et al.). Ebenfalls von Interesse ist US 5,643,569 (Jain et al.), eingereicht am 7. Juni 1995, und WO-A-95/19430, Jain et al., diskutiert in gewisser Ausführlichkeit das Einkapseln von sekretorischen Zellen in verschiedenen biokompatiblen Materialien. Wie darin diskutiert, sind sekretorische Zellen Zellen, die biologische Produkte sezernieren. Im Allgemeinen besitzen sekretorische Zellen mindestens manche Eigenschaften von endokrinen Zellen, und können im Allgemeinen als äquivalent zu Zellen, die endokriner Natur sind, behandelt werden. Die ebenfalls anhängige Anmeldung diskutiert z. B. die Einkapselung von Insulin-produzierenden Zellen, bevorzugt in der Form von Inseln, in Agarose-Kollagen-Kügelchen, die auch mit Agarose beschichtet sind. Die resultierenden Produkte sind nützlich bei der Behandlung von Zuständen, bei denen ein Lebewesen eine Insulin-Therapie benötigt, wie etwa Diabetes.
Die Anmeldung von Jain et al. diskutiert etwas detailliert die früheren Ansätze, die in der Technik in Transplantationstherapie unternommen worden sind. Diese werden ebenso hierin zusammengefasst.
Es sind fünf Hauptansätze bekannt, um das transplantierte Gewebe von der Immunreaktion des Wirts zu schützen. Alle beinhalten Versuche, das transplantierte Gewebe vom Immunsystem des Wirts zu isolieren. Die bisher verwendeten Immunisolationstechniken umfassen: extravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Ultrafiltrationskammern, Mikroeinkapselung und Makroeinkapselung. Alle diese Techniken haben jedoch aufgrund eines oder mehrerer der nachstehenden Probleme versagt: einer fibrotischen Reaktion des Wirts gegen das implantierte Material, Instabilität des implantierten Materials, begrenzte Diffusion von Nährstoffen über semi-permeable Membranen, Permeabilität von sekretfördernden Mitteln und Produkt, und Dauer der Diffusionsverzögerung über semi-permeable Membranbarrieren.
Beispielsweise wurde 1978 von Lim ein Mikroeinkapselungsverfahren zum Einschließen von lebenden Zellen, Geweben und anderen labilen Membranen innerhalb einer semi-permeablen Membran entwickelt (Lim, Research report to Damon Corporation (1978)). Lim verwendete Mikrokapseln aus Alginat und poly-L-Lysin zur Einkapselung von Langerhans'schen Inseln. 1980 wurde die erste erfolgreiche in vivo Anwendung dieser neuen Technik in der Diabetesforschung veröffentlicht (Lim et al., Science 210: 908 (1980)). Die Implantation dieser mikroeingekapselten Langerhans'schen Inseln führte dazu, dass in diabetischen Tieren ein normaler Blutglucosegehalt lange aufrechterhalten wurde. Andere Forscher, die diese Experimente wiederholten, fanden jedoch heraus, dass Alginat eine Gewebereaktion hervorrief und konnten die Ergebnisse von Lim et al. nicht reproduzieren (Lamberti et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101 (1984); Dupuy et al., J. Biomed. Material and Res. 2-2: 1061 (1988); Weber et al., Transplantation 49: 396 (1990); und Doon-shiong et al., Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)). Es wird nunmehr angenommen, dass die Wasserlöslichkeit dieser Polymere für die begrenzte Stabilität und Biokompatibilität dieser Mikrokapseln in vivo verantwortlich ist (Dupuy et al., oben, Weber et al., oben, Doon-shiong, oben, und Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57: 263 (1974)).
Vor kurzem verwendeten Iwata et al. (Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)) Agarose zur Mikroeinkapselung von allogenen pankreatischen Inseln und fanden heraus, dass sie als ein Medium zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden könnte. In ihrer Untersuchung wurden 1500-2000 Inseln einzeln in 5% Agarose mikroeingekapselt und in Streptozotocininduzierte diabetische Mäuse implantiert. Das Implantat überlebte einen langen Zeitraum, und die Empfänger hielten einen normalen Blutglucosegehalt auf unbestimmte Zeit.
Ihr Verfahren weist jedoch eine Anzahl von Nachteilen auf. Es ist beschwerlich und ungenau. Beispielsweise bleiben viele Kügelchen partiell beschichtet, und mehrere hundert Kügelchen aus leerer Agarose werden gebildet. Somit ist zusätzliche Zeit erforderlich, um eingekapselte Inseln von leeren Kügelchen abzutrennen. Darüber hinaus sammeln sich die meisten der implantierten Mikrokügelchen in der Beckenhöhle, und es ist eine große Anzahl von Inseln in vollständig beschichteten individuellen Kügelchen erforderlich, um einen normalen Blutglucosegehalt zu erreichen. Darüber hinaus sind die transplantierten Kügelchen schwierig wiederzugewinnen, tendieren dazu, zerbrechlich zu sein, und setzen nach geringfügiger Beschädigung leicht Inseln frei.
Ein Makroeinkapselungsverfahren ist ebenfalls getestet worden. Makrokapseln aus verschiedenen unterschiedlichen Materialien, wie etwa poly-2-Hydroxyethylmethacrylat, Polyvinylchlorid-c-acrylsäure und Celluloseacetat wurden für die Immunisolation von Langerhans'schen Inseln hergestellt (Siehe Altman et al., Diabetes 35: 625 (1986); Altman et al., Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984); Ronel et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); Klomp et al., Jour. Biomedical Material Research 17: 865–871 (1983)). In all diesen Untersuchungen wurde nur eine vorübergehende Normalisierung des Blutglucosegehalts erreicht.
Archer et al., Journal of Surgical Research 28: 77 (1980), verwendeten Acrylsäurecopolymer-Hohlfasern um vorübergehend die Abstoßung von Insel-Xenotransplantaten zu verhindern. Sie berichteten, dass dispergierte neonatale Pankreastransplantate aus Maus in Hohlfasern nach Transplantation in diabetische Hamster lange Zeit überlebten. Vor kurzem bestätigten Lacy et al., Science 254: 1782–1784 (1991), deren Ergebnisse, fanden aber heraus, dass der normale Blutglucosegehalt eine vorübergehende Phase ist. Sie fanden heraus, dass wenn die Inseln in die Faser injiziert werden, sie innerhalb der Hohlfaser aggregieren, mit resultierender Nekrose im Zentralbereich der Inselmassen. Die zentrale Nekrose schloss eine längere Lebensdauer des Transplantats aus. Zur Lösung dieses Problems verwendeten sie Alginat um die Inseln in der Faser zu dispergieren. Dieses Experiment wurde jedoch nicht umfassend wiederholt. Daher ist die Funktion der Membran als ein Transplantationsmedium für Inseln in Menschen fraglich.
Es bestand somit ein Bedarf, die Transplantation von sekretorischen Zellen zu erreichen, und insbesondere das Überleben von Allotransplantaten und Xenotransplantaten von pankreatischen Inseln ohne die Verwendung von chronisch immunsupprimierenden Mitteln.
In den oben diskutierten Arbeiten von Jain et al. berichteten die Erfinder, dass die Einkapselung von sekretorischen Zellen in einem hydrophilen Gelmaterial zu einem funktionellen, nicht-immunogenen Material führt, das in Tiere transplantiert werden kann und lange Zeiträume aufbewahrt werden kann. Die Einkapselung der sekretorischen Zellen stellte eine wirksamere und besser beherrschbare Technik für die Transplantation von sekretorischen Zellen bereit. Die Einkapselungstechnik wurde beschrieben als geeignet zur Einkapselung von anderen biologischen Materialien, wie etwa Enzymen, Mikroorganismen, trophischen Mitteln, umfassend rekombinant produzierten trophischen Mitteln, cytotoxischen Mitteln und chemotherapeutischen Mitteln. Es wurde diskutiert, dass die eingekapselten biologischen Mittel zur Behandlung von Zuständen geeignet sind, welche bekanntermaßen auf das biologische Mittel ansprechen.
Die Anmeldung diskutiert nicht in irgendeiner Weise den Einbau von Zellen, die biologische Materialien produzieren, welche diffundieren können, wobei die letzteren in einem therapeutischen Kontext nützlich sind. Es wird hierin ein Unterschied gemacht zwischen sekretorischen Zellen, und Zellen, die biologische Materialien produzieren, welche diffundieren können. Die ersteren beziehen sich, gemäß den Beispielen in der Anmeldung von Jain, im Allgemeinen auf Produkte wie etwa Hormone, Zellsignalsubstanzen, etc., die im Allgemeinen als biologische "Botenstoffe" erachtet werden. Im Gegensatz dazu bezeichnen biologische Materialien, die diffundieren können, Materialien wie etwa MHC-präsentierte Peptide, Zellexpressionsregulatoren, wie etwa Suppressoren, Promotoren, Induktoren und so weiter. Dieser Unterschied wird auf dem Gebiet der Onkologie erkannt werden, z. B. mittels der nachfolgenden Diskussion.
Umfassende Studien in der Krebsforschung haben Arbeiten mit heterogenen Zellextrakten und verschiedenen zellulären Komponenten umfasst. Über die Verwendung von monoklonalen Antikörpern hat die Technik relevante, mit Krebs assoziierte Antigene identifiziert, z. B. GM2, TF, STn, MUC-1, und verschiedene davon abgeleitete Epitope. Die derzeitige Theorie postuliert, dass Epitope, die von diesen verschiedenen Tumormarkern abgeleitet sind, nicht-kovalent mit MHC-Molekülen komplexieren, wodurch von spezifischen cytolytischen T-Zellen ein Agrotyp gebildet wird. Dieser Mechanismus ist den verschiedenen Mechanismen, die an der biologischen Reaktion gegen virale Infektionen beteiligt sind, nicht unähnlich. Siehe diesbezüglich Van der Bruggen et al., Science 254: 1643–1647 (1991); Boon et al., 5,405,940, und Boon et al., 5,342,774.
Zusätzliche Forschung, parallel zu den Arbeiten über die Identifizierung der so genannten Krebsepitope, hat sich auf die Regulation der Krebsproliferation konzentriert, wie etwa über Suppression oder allgemeiner Biomodulation. Siehe z. B. Mitchell, J. Clin. Pharmacol. 32: 2–9 (1992); Maclean et al., Can. J. Oncol. 4: 249–254 (1994). Das Ziel, das alle diese verschiedenen Ansätze gegen Krebs eint, ist die Modifizierung der Immunreaktion des Wirts, um so eine gewisse Verbesserung des Zustands des Patienten hervorzubringen.
Der Schlüssel zu all diesen Ansätzen ist die Aktivität von einem oder mehreren biologischen Produkten, die diffundieren können, und die mit anderen Materialien zusammenwirken um die Immunreaktion zu modulieren. Beispielsweise offenbaren Boon et al. und van der Bruggen et al. kleine Peptidmoleküle. Mitchell diskutiert größere Moleküle, die z. B. als Suppressoren wirken.
Ein Problem mit allen therapeutischen Ansätzen, welche diese Materialien verwenden, ist deren Ablieferung in einer sicheren, wirksamen Form. Dies wird nicht leicht erreicht. Es wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, dass die Techniken von Jain et al., die bei der Entwicklung von Therapien für Zustände, welche Produkte von sekretorischen Zellen benötigen, so nützlich waren, nunmehr in anderen Gebieten verwendet werden können.
Wie dies erreicht wird, ist der Gegenstand der Erfindung, deren ausführliche Beschreibung folgt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Beispiel 1
Dieses Beispiel, und diejenigen die folgen, verwenden RENCA Zellen. Diese sind spontane Nierenadenokarzinomzellen aus BALB/C-Mäusen, die weithin verfügbar sind und sowohl in vitro als auch in vivo in Kultur gehalten wurden. Siehe Franco et al., Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181–193 (1994).
Proben von gefrorenen RENCA Zellen wurden bei 37°C aufgetaut und danach in Gewebekulturkolben gegeben, die Dulbecco's Modified Medium (D-MEM) enthielten, das mit 10% Rinderserum, Penicillin (100 u/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) ergänzt worden war, wobei erhalten wird, was nachstehend hierin als "Komplettmedium" bezeichnet wird.
Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen und danach mit Trypsin behandelt, gefolgt von Waschen mit Hank's Balanced Salt Solution und danach mit dem oben angegebenen Komplettmedium.
Um zu bestimmen, ob die RENCA Zellen effizient Tumoren produzieren wurden zwei BALB/C-Mäusen 10⁶ dieser Zellen intraperitoneal injiziert. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 3–4 Wochen beobachtet. Vom klinischen Standpunkt her erschienen sie während der ersten zwei Wochen gesund und sie zeigten normale Aktivität. Danach wurden die klinischen Manifestationen von Krebs offensichtlich. Eine Maus starb nach 23 Tagen und die zweite nach 25 Tagen. Nach dem Tod wurden die Mäuse untersucht, und es wurden zahlreiche Tumoren verschiedener Größen festgestellt. Manche der Tumoren zeigten auch Blutungen.
Eine Probe eines Tumors, die aus einer der Mäuse entnommen worden war, wurde für spätere histologische Untersuchung in 10% Formalin fixiert.
Beispiel 2
Nachdem gezeigt worden war, dass die RENCA Zellen in vivo wuchsen, wurden Studien ausgeführt um zu bestimmen, ob diese Zellen in erfindungsgemäßen Kügelchen wachsen.
RENCA Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, wie vorstehend beschrieben, mit Trypsin behandelt und gewaschen, ebenfalls wie vorstehend beschrieben. Danach wurden Proben von zwischen 60.000 und 90.000 Zellen hergestellt. Die Zellen wurden danach bei 750 UpM zentrifugiert und Fluid wurde entfernt. Die Zellen wurden danach in Lösungen von 1% unvollständig entwickeltem Kollagen suspendiert, in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 6,5.
Eine Lösung von 1% Agarose mit niedriger Viskosität wurde in Minimalessentialmedium (MEM, minimal essential Medium) hergestellt, bei 60°C gehalten und danach wurden 100 μl davon zu der oben beschriebenen Suspension von RENCA Zellen und unvollständig entwickeltem Kollagen zugegeben. Die Materialien wurden danach unverzüglich als ein einziger großer Tropfen in steriles Mineralöl bei Raumtemperatur transferiert. Das Gemisch bildete ein einziges, glattes semi-festes Kügelchen. Dieses Verfahren wurde wiederholt um eine Anzahl von Kügelchen herzustellen.
Nach einer Minute wurden die Kügelchen in Komplettmedium, wie oben beschrieben, bei 37°C transferiert. Die Kügelchen wurden danach dreimal in Minimalessentialmedium, das die oben aufgelisteten Antibiotika enthielt, gewaschen. Die Kügelchen wurden danach über Nacht bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre aus Luft und 5% CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nunmehr festen Kügelchen zu einem sterilen Löffel transferiert, der 1 ml 5% Agarose in Minimalessentialmedium enthielt. Die Kügelchen wurden 2–3 Mal in der Lösung gerollt um sie gleichförmig mit Agarose zu beschichten. Bevor die Agarose fest wurde, wurden die Kügelchen in Mineralöl transferiert um eine glatte Außenoberfläche zu erhalten. Nach 60 Sekunden wurden die Kügelchen fünfmal mit Komplettmedium bei 37°C gewaschen um das Öl zu entfernen. Es folgt Inkubation über Nacht (37°C, angefeuchtete Atmosphäre aus Luft, 5% CO₂).
Diese RENCA-enthaltenden Kügelchen wurden in den nachfolgenden Experimenten verwendet.
Beispiel 3
Vor einer Durchführung von in vivo Untersuchungen war es notwendig, zu bestimmen, ob die RENCA Zellen in den Kügelchen, hergestellt in der oben beschriebenen Weise, wachsen würden.
Dazu wurden Kügelchen, hergestellt wie in Beispiel 2 diskutiert, in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium während eines Zeitraums von drei Wochen unter den aufgelisteten Bedingungen inkubiert. Drei von den Kügelchen wurden danach in kleine Stücke geschnitten und in Standardkulturkolben kultiviert, bei direktem Kontakt sowohl mit dem Kolben als auch mit dem Kulturmedium.
Beobachtung dieser Kulturen zeigte, dass die Zellen wuchsen und Standard-RENCA-Kolonien bildeten. Dies zeigte, dass die Zellen in den Kügelchen lebensfähig geblieben waren.
Beispiel 4
Danach wurden in vivo Experimente ausgeführt. In diesen Experimenten wurden die Kügelchen sieben Tage bei 37°C inkubiert. Danach empfingen Mäuse Kügelchentransplantate. Dazu wurde bei vier Mäusen jeweils ein Mittenlinieneinschnitt gemacht, der intraperitoneal ausgeführt wurde. Drei Kügelchen, von denen jedes 60.000 RENCA Zellen enthielt, wurden transplantiert. Die Einschnitte wurden danach verschlossen (zweilagiger Verschluss), unter Verwendung eines absorbierbaren Nähmaterials. Die vier Mäuse (BALB/C) waren normale männliche Mäuse, die zwischen 24–26 Gramm wogen und gesund zu sein schienen. Es wurden zwei Sätze Kontrollen durchgeführt. Beim ersten Satz empfingen zwei Mäuse drei Kügelchen, die keine RENCA Zellen enthielten, und beim zweiten waren zwei Mäuse völlig unbehandelt.
Drei Wochen nach der Implantation empfingen alle Mäuse intraperitoneale Injektionen von 10⁶ RENCA Zellen. Achtzehn Tage später starb eine Kontrollmaus. Alle restlichen Mäuse wurden geopfert und untersucht.
Kontrollmäuse zeigten zahlreiche Tumoren, während die Mäuse, welche die Implantate von in Kügelchen eingekapselten Zellen empfangen hatten, über die gesamte Bauchhöhle hinweg nur zufällige Knoten zeigten.
Diese ermutigenden Ergebnisse legten die Planung der Experimente, welche im nachfolgenden Beispiel angegeben sind, nahe.
Beispiel 5
In diesen Experimenten wurde etablierter Krebs simuliert, indem RENCA Zellen unter jeweils eine Nierenkapsel von sechs BALB/C Mäusen injiziert wurden. Fünfzehn Tage später wurden die Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt. Die drei Mäuse in der ersten Gruppe empfingen jeweils drei Kügelchen, wie oben in Beispiel 4 beschrieben. Die zweite Gruppe (die Kontrollgruppe) empfing Kügelchen, die keine RENCA Zellen enthielten.
Nach 4–5 Tagen erschienen Mäuse, die RENCA Zellen-enthaltende Implantate empfangen hatten lethargisch und ihr Fell war stachelig geworden, während die Kontrollgruppe energisch blieb, ohne eine Veränderung des Zustandes des Fells.
Zehn Tage nach Implantation (25 Tage nach Injektion von RENCA Zellen) wurden die Kontrollmäuse jedoch träge und wiesen aufgeblähte Bäuche auf. Eine der drei Kontrollmäuse starb am Tag vierzehn nach Transplantation der Kügelchen. Es folgte Opferung der Mäuse.
Die Körperhöhlen der Kontrollmäuse zeigten reichliche Blutungen, mit zahlreichen Tumoren über den Ernährungskanal, die Leber, den Magen und die Lungen. Die gesamte Bauchhöhle war aufgrund von üppigem Tumorwachstum nicht mehr wahrzunehmen. Die Mäuse, die Kügelchen mit eingekapselten RENCA Zellen empfangen hatten, zeigten jedoch keine Blutungen und nur ein paar Knoten auf den Ernährungskrebsgeschwüren. Ein Vergleich der Test- und Kontrollgruppen zeigte, dass sich in der Testgruppe Knoten nicht weiterentwickelt hatten.
Beispiel 6
Das Wachstum von frei angeimpften RENCA Zellen wird inhibiert, wenn sie zusammen mit eingekapselten RENCA Zellen inkubiert werden. Es wurde ein weiterer Satz an Experimenten ausgeführt, um zu bestimmen, ob diese Wirkung mit anderen Zellen beobachtet werden kann.
Eine Adenokarzinomzelllinie, d. h. MMT (mouse mammary tumor) wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Eingekapselte MMT Zellen wurden, wie oben beschrieben, mit MMT Zellen hergestellt, wobei Kügelchen mit 120.000 oder 240.000 Zellen pro Kügelchen produziert wurden. Nach der Herstellung der Kügelchen wurden sie verwendet um zu bestimmen, ob sie Proliferation von RENCA Zellen in vitro inhibieren würden. In genaueren Worten wurden zwei Petrischalen mit sechs Vertiefungen vorbereitet, mittels Animpfen mit 1 × 10⁴ RENCA Zellen pro Vertiefung in 4 ml Medium. In jeder Schale dienten drei Vertiefungen als Kontrolle und drei als Test. Eine der drei Kontrollvertiefungen in jeder Schale empfing ein Kügelchen. Jede der anderen Vertiefungen empfing entweder zwei oder drei leere Kügelchen. Die zweite Vertiefung wurde ähnlich behandelt, wobei die Vertiefungen ein, zwei oder drei Kügelchen, die 120.000 oder 240.000 MMT Zellen enthielten, empfingen. Die Vertiefungen wurden eine Woche bei 37°C inkubiert, wonach RENCA Zellen mit Trypsin behandelt, gewaschen und unter Verwendung einer Zählkammer ausgezählt wurden. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Beispiel 7
Den Ergebnissen von Beispiel 6 folgend wurden die gleichen Experimente durchgeführt, unter Verwendung von 1 × 10⁴ MMT Zellen anstelle von RENCA Zellen. Das Experiment wurde genau gleich wie Beispiel 6 durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben.
Diese Ergebnisse ermutigten zu einem in vivo Experiment. Dieses wird in Beispiel 8 erläutert.
Beispiel 8
RENCA Zellen, wie in den vorstehenden Beispielen verwendet, sind Nierenkrebszellen. Um die allgemeine Wirksamkeit der Erfindung vollständiger zu zeigen, wurden Arbeiten unter Verwendung eines unterschiedlichen Typs von Krebszellen ausgeführt. In genaueren Worten wurden Adenokarzinomzellen verwendet.
Eine Maus-Brusttumor-Zelllinie (MMT) wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Unter Verwendung der oben angegebenen Protokolle wurden Implantate hergestellt, die 120.000 Zellen pro Kügelchen und 240.000 Zellen pro Kügelchen enthielten.
Das verwendete Versuchsmodell war das Mausmodell, oben. Zweiundzwanzig Mäuse wurden in Gruppen von 4, 9 und 9 eingeteilt. Die erste Gruppe, d. h. die Kontrollen, wurden weiter in drei Gruppen von zwei, eins und eins eingeteilt. Die erste Untergruppe empfing Implantate aus einem Kügelchen, das keine Zellen enthielt. Eine Maus empfing zwei leere Kügelchen und eine empfing drei leere Kügelchen.
In der Versuchsgruppe A (9 Tiere) enthielten die Kügelchen 120.000 Zellen, während in Gruppe B die Kügelchen 240.000 Zellen enthielten. Innerhalb der Gruppen "A" und "B" gab es je drei Untergruppen, von denen jede drei Mäuse enthielt. Die Untergruppen empfingen ein, zwei oder drei Kügelchen mit MMT Zellen.
Einundzwanzig Tage nach der Implantation empfingen alle Tiere Injektionen von 40.000 RENCA Zellen. Unmittelbar nach der Injektion waren die Mäuse lethargisch, mit stacheligem Haar. Dies hielt etwa fünf Tage an, wonach normales Verhalten beobachtet wurde.
Nach zwanzig Tagen wiesen Kontrollmäuse aufgeblähte Bäuche und extrem stacheliges Haar auf. Eine Kontrollmaus starb 25 Tage nach der Injektion, während die restlichen Kontrollmäuse als im Endstadium befindlich erschienen. Alle Mäuse wurden geopfert und die Tumorentwicklung wurde beobachtet. Diese Beobachtungen sind nachstehend aufgezeichnet:
Diese Ergebnisse zeigen, dass von achtzehn getesteten Mäusen dreizehn keine Erkrankung zeigten. Von den Mäusen in Gruppe (A) wies eine Maus ein paar Knoten auf und eine andere Maus wies ein paar Tumoren auf. Eine Maus, die zwei Kügelchen empfangen hatte, wies ein paar Tumoren auf.
In Gruppe B wiesen eine Maus, die ein Kügelchen empfangen hatte, und eine Maus, die zwei Kügelchen empfangen hatte, ein paar Tumoren auf, die mit Därmen verheddert waren. Eine der Mäuse, die drei Kügelchen empfangen hatte, hatte einen großen festen Tumor entwickelt und war anscheinend sehr krank.
Nichtsdestoweniger zeigten die Ergebnisse insgesamt, dass die eingekapselten Maus-Brustkrebszellen die Tumorbildung inhibierten.
Beispiel 9
Wie oben nahe gelegt, führt die Praxis der Erfindung zur Produktion irgendeines Materials oder Faktors, das bzw. der die Tumorzellproliferation inhibiert und/oder verhindert. Dies wurde in dem nachfolgenden Experiment weiter untersucht.
Zusätzliche Kügelchen wurden hergestellt wie oben in Beispiel 2 beschrieben, außer dass unvollständig entwickeltes Kollagen nicht aufgenommen wurde. Diese Kügelchen sind daher Agarose/Agarose-Kügelchen. RENCA Zellen, wie oben beschrieben, wurden in diese Kügelchen eingebaut, wiederum wie oben beschrieben.
Zwei Sätze von drei Platten mit je sechs Vertiefungen wurden danach als Kontrolle und Versuchsgruppen verwendet. In der Kontrollgruppe wurden die Vertiefungen mit 4 ml RPMI Komplettmedium (10% fötales Kälberserum und 11 ml/l Penicillin) gefüllt. Jede Kontrollgruppe wurde danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
In der Versuchsgruppe war das RPMI Komplettmedium konditioniert, durch Zugabe von Material, welches erhalten worden war durch Inkubation von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden Kügelchen (120.000 Zellen pro Kügelchen) in einer 35 × 100 mm Petrischale, enthaltend 50 ml RPMI Komplettmedium. Nach fünftägiger Inkubation wurde Medium von diesen Schalen gesammelt, und 4 ml davon wurden in jede Testvertiefung gegeben. Diese Vertiefungen wurden danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft.
Alle Platten (sowohl Kontrollen als auch Versuche) wurden fünf Tage bei 37°C inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, gewaschen und unter Verwendung einer Zählkammer ausgezählt. Die Zellen jeder Vertiefung in den Schalen wurden nach der Trypsinbehandlung gepoolt und ausgezählt, das Ergebnis war wie folgt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zellen, wenn sie in z. B. den Kügelchen der Erfindung restringiert sind, irgendeinen Faktor produzieren, der zu einer Suppression der Tumorzellproliferation führt. Dieser Restriktionsinhibitionsfaktor wird von den Zellen aufgrund ihres Einschlusses in dem Kügelchen produziert und unterscheidet sich von anderen Materialien, wie etwa einem Kontaktinhibitionsfaktor, welche produziert werden, wenn Zellen einander kontaktieren.
Beispiel 10
Das oben angegebene Experiment zeigte, dass das Wachstum von RENCA Zellen in konditioniertem Medium etwa die Hälfte des Wachstums der Zellen in Kontrollmedium betrug. Die hierin angegebenen Experimente untersuchten, ob der wachstumsinhibierende Faktor nach Einfrieren des konditionierten Mediums aktiv bleiben würde.
Konditioniertes RENCA Medium wurde hergestellt durch fünftägige Inkubation von 10 immunisolierten, RENCA-enthaltenden Kügelchen. Die Inkubation erfolgte in 35 × 100 mm Petrischalen mit 50 ml RPMI Komplettmedium bei 37°C. Nach der Inkubation wurde das Medium gesammelt und bei –20°C aufbewahrt. Konditioniertes Medium wurde hergestellt durch Inkubation von immunisolierten Zellen, die MMT (mouse mammary tumor) Zellen enthielten. Die Kügelchen enthielten 240.000 Zellen pro Kügelchen, alle anderen Bedingungen waren gleich.
Eingefrorenes Medium wurde bei 37°C aufgetaut und danach in den nachfolgenden Tests verwendet. Drei Schalen mit sechs Vertiefungen wurden für jede Behandlung verwendet, d. h. (1) RPMI Kontrollmedium, (2) eingefrorenes konditioniertes RENCA Medium, und (3) eingefrorenes konditioniertes MMT Medium. Insgesamt wurden 4 ml Medium in jede Vertiefung pipettiert. Alle Vertiefungen wurden danach mit 10.000 RENCA Zellen angeimpft und fünf Tage bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden zwei Probenschalen von jeder Vertiefung genommen, mit Trypsin behandelt, gepoolt und in einer Zählkammer ausgezählt. Nach acht Tagen wurden die restlichen drei Schalen jeder Vertiefung auf die gleiche Weise getestet.
Die Ergebnisse folgen:
Wenn diese Ergebnisse mit denen von Beispiel 6, oben, verglichen werden, wird erkannt werden, dass während eingefrorenes/aufgetautes konditioniertes RENCA Medium das Wachstum nicht im gleichen Ausmaß inhibierte wie nichteingefrorenes Medium (vergleiche die Beispiel 6 und 7), es nichtsdestoweniger das Wachstum inhibierte. Eingefrorenes konditioniertes Medium unter Verwendung von MMT Zellen inhibierte das Wachstum sogar stärker als nicht-eingefrorenes konditioniertes MMT Medium. Diese Ergebnisse zeigen, dass von achtzehn getesteten Mäusen dreizehn keine Erkrankung zeigten. Von den Mäusen in Gruppe (A) wies eine Maus ein paar Knoten auf und eine andere Maus wies ein paar Tumoren auf.
Das Vorstehende beschreibt die Herstellung von implantierbaren Kügelchen, welche einen oder mehrere Typen von Zellen enthalten, welche ein biologisches Produkt erzeugen, das diffundieren kann, wie dieser Ausdruck hierin definiert ist. Das biologische Produkt, das diffundieren kann, ist eines, welches eine Wirkung auf das Lebewesen hat, in welches das Kügelchen implantiert wird. Bevorzugt ist diese Wirkung eine Immunmodulation, wie etwa die Stimulation einer Immunreaktion oder die Suppression einer Reaktion. Im Falle von Krebs kann das biologische Produkt, das diffundieren kann, beispielsweise ein Peptid sein, das mit MHC-Molekülen auf Krebszellen in einem Lebewesen komplexiert, wodurch eine CTL-Reaktion dagegen hervorgerufen wird, die wiederum zu einer Verringerung der Tumorbelastung in dem Lebewesen führt. Das Produkt, das diffundieren kann, kann auch ein Suppressor von Tumorwachstum sein. In Verbindung mit dieser Form einer Therapie ist es möglich, wenn auch nicht notwendigerweise bevorzugt, die implantierten Kügelchen in einem oder in der Nähe eines identifizierten Tumors zu positionieren.
"Biologisches Produkt, das diffundieren kann", wie hierin verwendet, bezeichnet Materialien wie etwa Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine, Kohlehydrate, Lipide, Glycolipide und Peptide. In genaueren Worten, sind Materialien wie etwa Antikörper, Cytokine, Hormone, Enzyme und so weiter beispielhaft, aber keinesfalls der einzige Typ an aufgenommenen Materialien. Ausgeschlossen sind die gut bekannten "Endprodukte" von zellulären Vorgängen, wie etwa CO₂ und H₂O.
Wie die Experimente zeigen, können die implantierbaren Kügelchen auch prophylaktisch verwendet werden. Es ist gut bekannt, dass zumindest ein Teil der Population der Krebspatienten für ein erneutes Auftreten des Zustandes anfällig ist. Die hierin beschriebenen Experimente zeigen, dass die Implantate das Auftreten oder das erneute Auftreten von Krebs verhindern können, über die biologische Wirkung, welche das Produkt, das diffundieren kann, auf das System des Lebewesens ausübt.
Die Diskussion der Erfindung hat sich auf in vivo Ansätze konzentriert. Es muss jedoch auch verstanden werden, dass es viele in vitro Ansätze für die Erfindung gibt, von denen manche nachstehend hierin diskutiert werden. Beispielsweise ist es gut bekannt, dass viele Zellen, welche erwünschte Produkte produzieren, bei Kultivierung in vitro die Gegenwart von Nährzellen benötigen. Mit derartigen Nährzellen gibt es immer wieder Probleme. Sie können schneller wachsen als die erwünschten Zellen, was de facto zu einer "Strangulierung" der interessierenden Materialien führt. Weiterhin kann es ein Problem geben mit verschiedenen toxischen Produkten, die von den Lagen von Nährzellen produziert werden. Die implantierbaren Kügelchen der Erfindung wirken praktisch als zelluläre Inkubatoren, wobei sie die eingebauten Zellen schützen, während sie ermöglichen, dass die Produkte, die diffundieren können, sich in ein Kulturmedium hinein bewegen, wo sie z. B. gesammelt werden können.
Wie oben angegeben, erfordert die Zubereitung der implantierbaren Kügelchen zunächst das Suspendieren der Zellen in Lösung, bevorzugt in einer wässrigen Lösung von Kollagen. Bevorzugt ist das Kollagen unvollständig entwickelts Kollagen, in einer Lösung von etwa 0,5 bis etwa 2%. In Abhängigkeit des Typs der verwendeten Zellen wird die Anzahl an Zellen in der Lösung zu einem gegebenen Zeitpunkt, und somit die Anzahl an Zellen in einem Kügelchen, variieren. Bevorzugt werden von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen pro Kügelchen verwendet, stärker bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000. Am meisten bevorzugt werden etwa 40.000 bis etwa 60.000 Zellen verwendet.
Nach dem Suspendieren der Zellen in der Kollagenlösung wird eine Agaroselösung zugegeben. Bevorzugt liegt diese Agaroselösung in einem Bereich von etwa 0,5% bis etwa 5%, bevorzugt um 1%. Bei tropfenweiser Zugabe dieses Gemisches auf oder in inerte Materialien wie etwa TEFLON^® oder Mineralöl bildet sich ein Kügelchen. Dieses Kügelchen ist semi-fest. Das semi-feste Kügelchen wird danach in ein steriles Medium transferiert, bevorzugt eines, das Antibiotika enthält, gewaschen, und zur Polymerisation von Kollagen inkubiert. Die Polymerisation von Kollagen ist ein gut untersuchtes Phänomen, und die Bedingungen, unter denen sie stattfindet, brauchen hierin nicht genau dargelegt werden.
Nach dem Festwerden des Kügelchens wird es danach mit Agarose beschichtet, bevorzugt indem es in einer Agaroselösung gerollt wird. Eine bevorzugte Weise, um dies zu bewirken ist ein einfacher, mit TEFLON^®-beschichteter Löffel, der eine Agaroselösung, bevorzugt 5% bis 10%, enthält.
Die vorstehende Diskussion bezüglich biologischer Produkte, die diffundieren können, sollte nicht als eingeschränkt auf Wildtypmaterialien ausgelegt werden. Man kann beispielsweise genauso einfach transformierte oder transfizierte Wirtszellen einbauen, wie etwa eukaryontische Zellen (z. B. 293 Zellen, CHO Zellen, COS Zellen) oder auch prokaryontische Zellen (z. B. E. coli), die behandelt wurden um heterogenes Protein zu produzieren, oder modifiziert wurden, über z. B. homologe Rekombination, um erhöhte Mengen von gewünschten biologischen Produkten zu produzieren. Andere Materialien, wie etwa Hybridome, können ebenfalls verwendet werden, wobei das biologische Produkt, das diffundieren kann, ein monoklonaler Antikörper ist.

Claims

Stoffzusammensetzung, umfassend ein Agarose-beschichtetes, festes Agarose-Kollagen-Kügelchen, wobei das Kügelchen Zellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, einen Tumorzellproliferation supprimierenden Faktor produzieren, wobei der Faktor durch das beschichtete, feste Agarose-Kollagen-Kügelchen diffundiert.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zellen Krebszellen, bevorzugt Nierenkrebszellen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Kügelchen von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen und bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000 Zellen enthält.
Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Behandlung eines pathologischen Zustands.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der pathologische Zustand durch abnormales Zellwachstum gekennzeichnet ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der pathologische Zustand Krebs ist.
Verfahren zur Verabreichung eines Faktors Zellen, die in vitro kultiviert werden, umfassend das Inkubieren der Zellen mit der Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Faktor durch die Stoffzusammensetzung diffundiert.
Verfahren zur Herstellung eines Agarose-beschichteten, Agarose-Kollagen-Kügelchens, das Zellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, einen Tumorzellproliferation supprimierenden Faktor produzieren, wobei der Faktor durch das Agarose-beschichtete, feste Agarose-Kollagen-Kügelchen diffundiert, umfassend: Suspendieren von Zellen, die, wenn restringiert, den Faktor produzieren, in einem Kollagen-enthaltenden Material, Zugeben von Agarose zu dem Kollagen-enthaltenden Material, Bilden eines semi-festen Kügelchens aus dem Kollagen, der Agarose und den Zellen, Polymerisieren von Kollagen in dem semi-festen Kügelchen, wobei ein festes, die Zellen enthaltendes Agarose-Kollagen-Kügelchen gebildet wird, und Beschichten des festen, die Zellen enthaltenden Agarose-Kollagen-Kügelchens mit Agarose.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zellen Krebszellen sind.
Verfahren nach Anspruch 8, umfassend das Suspendieren von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen und bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000 Zellen in der Kollagen-enthaltenden Lösung.
Stoffzusammensetzung, umfassend ein Agarose-beschichtetes, festes Agarose-enthaltendes Kügelchen, wobei das Kügelchen Zellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, einen Tumorzellproliferation supprimierenden Faktor produzieren, wobei der Faktor durch das Agarose-beschichtete, feste Agarose-enthaltende Kügelchen diffundiert.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die restringierten Zellen Krebszellen, und bevorzugt Nierenkrebszellen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Kügelchen von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen und bevorzugt von etwa 30.000 bis 100.000 Zellen enthält.
Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13 zur Verwendung bei der Behandlung eines pathologischen Zustands.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der pathologische Zustand durch abnormales Zellwachstum gekennzeichnet ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der pathologische Zustand Krebs ist.
Verfahren zur Verabreichung eines Faktors Zellen, die in vitro kultiviert werden, umfassend das Inkubieren der Zellen mit der Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei nach Inkubation der Faktor durch die Stoffzusammensetzung diffundiert.
Verfahren zur Herstellung eines festen Kügelchens, das Agarose enthält und mit Agarose beschichtet ist, wobei das feste Kügelchen Zellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, einen Tumorzellproliferation supprimierenden Faktor produzieren, der durch das Kügelchen diffundiert, umfassend: Zugeben von Agarose zu einer Lösung, die eine Probe von Zellen enthält, welche einen Tumorzellproliferation supprimierenden Faktor produzieren können, der durch die Kügelchen diffundiert, wenn die Zellen restringiert sind, Bilden eines semi-festen Kügelchens, umfassend die Agarose und die Zellen, Polymerisieren der Agarose in dem semi-festen Kügelchen, wobei ein festes, die Zellen enthaltendes Agarosekügelchen gebildet wird und die Zellen dadurch restringiert werden, und Beschichten des festen, Agarose-enthaltenden Kügelchens, das die restringierten Zellen enthält, mit Agarose.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zellen Krebszellen sind.
Verfahren nach Anspruch 18, umfassend das Suspendieren von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen und bevorzugt von etwa 30.000 bis etwa 100.000 Zellen in der Lösung.
Stoffzusammensetzung, umfassend ein Agarose-beschichtetes, festes Agarose-enthaltendes Kügelchen, wobei das Kügelchen aus einem Tier isolierte Krebszellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, mehr eines Tumorzellproliferation supprimierenden Materials produzieren, wobei das Material durch das Agarose-beschichtete, feste Agarose-enthaltende Kügelchen diffundiert.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 21, wobei die Krebszellen Nierenkrebszellen sind.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Kügelchen von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen enthält.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Kügelchen von etwa 30.000 bis etwa 100.000 Zellen enthält.
Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 für die Behandlung eines pathologischen Zustandes, der durch abnormales Zellwachstum gekennzeichnet ist.
Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 für die Behandlung eines pathologischen Zustandes der Krebs ist.
Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, zur Verwendung bei der Suppression der Proliferation von Krebszellen in einem Individuum.
Verwendung einer Stoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Implantation in ein Individuum, um die Proliferation von Krebszellen in dem Individuum zu supprimieren.
Verfahren zur Herstellung eines festen Kügelchens, das Agarose enthält und mit Agarose beschichtet ist, wobei das feste Kügelchen Krebszellen enthält, welche, wenn durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert, Tumorzellproliferation supprimierendes Material produzieren, welches durch das feste Kügelchen diffundiert, umfassend: (a) Zugeben von Agarose zu einer Lösung, die eine Probe von aus einem Tier isolierten Krebszellen enthält, welche ein Tumorzellproliferation supprimierendes Material produzieren können, das durch die Kügelchen diffundiert, wenn die Krebszellen durch Einschluss in dem Kügelchen restringiert sind, (b) Bilden eines semi-festen Kügelchens, umfassend die Agarose und die Krebszellen, (c) Polymerisieren der Agarose in dem semi-festen Kügelchen, wobei ein festes, die Zellen enthaltendes Agarosekügelchen gebildet wird und die Krebszellen dadurch restringiert werden, und (d) Beschichten des festen, Agarose-enthaltenden Kügelchens, das die restringierten Krebszellen enthält, mit Agarose, wobei die restringierten Krebszellen mehr von dem Material produzieren, als wenn die Krebszellen nicht in dem Kügelchen eingeschlossen sind.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Lösung von etwa 10.000 bis etwa 200.000 Zellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Lösung von etwa 30.000 Zellen bis etwa 100.000 Zellen enthält.