JP2005104987A - 拡散性生物学的産物を生産する細胞を含有する移植可能なアガロース−コラーゲンビーズとその利用法 - Google Patents

Abstract

【課題】 拡散性生物学的産物を安全かつ有効な形態で送達することのできる治療アプローチ。
【解決手段】 アガロースおよびコラーゲンからなり、および／またはアガロースでコーティングした移植可能なビーズが、その中に拡散性生物学的産物を生産する細胞のサンプルを組み入れている。これらビーズはレシピエントの免疫応答を調節するための移植物として利用可能である。これらビーズはイン・ヴィトロにおいて特定のタイプの細胞の増殖を促進するため、培養中に所望の産物を生産するため、あるいは特定の細胞の増殖を抑制するためにも利用できる。移植物も対象へ投与された後特定の細胞の増殖を抑制することができる。
【選択図】 なし

Description

関連出願
本出願は、参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９６年４月３日出願の同時係属出願第０８／６２５，５９５号の一部継続出願である。

発明の分野
本発明は、アガロースとコラーゲン中へ細胞をカプセル封入した後、アガロースでコーティングすること、アガロース中に細胞をカプセル封入した後、アガロースでコーティングすること、これらの材料細胞を用いる治療法、および、その製造方法に関する。

様々な生物物質を生物学的に適合性の物質中へカプセル封入(encapsulation)することは、かなり以前から用いられてきた技術であるが、成功したものは限られている。この技術の例としては、米国特許第５，２２７，２９８号(ウェーバー（Weber）他);５，０５３，３３２号(クック（Cook）他);４，９９７，４４３号(ウォルサル（Walthall）他)；４，９７１，８３３号(ラーソン（Larsson）他)；４，９０２，２９５号(ウォルサル（Walthall）他)；４，７９８，７８６号(タイス（Tice）他)；４，６７３，５５６号(グーセン（Goosen）他)；４，６４７，５３６号(モスバック（Mosbach）他)；４，４０９，３３１号(リム（Lim）)；４，３９２，９０９号(リム（Lim）)；４，３５２，８８３号(リム（Lim）)；および４，６６３，２８６号(ツァング（Tsang）他)が挙げられる。参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９５年６月７日出願のジャイン（Jain）他の同時係属出願第０８／４８３，７３８号も注目される。ジャイン（Jain）他は、かなり詳細に様々な生物学的適合性物質中への分泌細胞のカプセル封入について論じている。そこで論じられているように、分泌細胞とは生物学的産物を分泌する細胞である。一般的に分泌細胞は少なくともいくらかの内分泌細胞の特性を有しており、通常、内分泌性の性質の細胞と同等に扱われる可能性を有する。この同時係属出願は、例えば、好ましくは島状形態のインシュリン産生細胞の、同様にアガロースでコーティングされたアガロース−コラーゲンビーズの中へのカプセル封入について論じている。その結果得られる産物は、糖尿病などのインシュリン治療を必要とする患者の病状を治療することにおいて有用である。

前記ジャイン（Jain）他の出願には、かなり詳細に移植療法における当業者によって採用されてきた従来のアプローチが記載されている。これらについて、本出願においても要約する。

移植した組織を宿主（ホスト）の免疫応答から保護するための５つの主要なアプローチが知られている。これらすべては宿主の免疫系から移植した組織を分離するための試みに関係している。現在まで使用されてきた免疫分離(immunoisolation)技術は以下のものを含む：血管外拡散チャンバー、血管内拡散チャンバー、血管内限外濾過チャンバー、マイクロカプセル化（マイクロカプセル封入）、およびマクロカプセル化（マクロカプセル封入）。しかしながら、以下に示す一以上の問題によってこれらすべての方法は不十分であった：移植物質に対する宿主の線維症(線維性:fibrotic)の応答、移植物質の不安定性、半透膜を横切る栄養素の拡散の制限、分泌促進物質と産物の透過性、および半透膜障壁を横切る拡散の遅れ時間。

例えば、生細胞、組織、および他の不安定な膜を、半透膜の内部に封入するマイクロカプセル化手法は、１９７８年にリム（Lim）によって開発された（リム（Lim）, Research report to Damon Corporation(1978))。リム（Li）はランゲルハンス島をカプセル封入するためにアルジネート(alginate)とポリＬ−リジンのマイクロカプセルを使用した。１９８０年には、糖尿病研究においてこの新規な技術のイン・ヴィヴォでの適用が初めて成功したということが報告された（リム（Lim）他, Science 210: 908 (1980))。これらのマイクロカプセル化したランゲルハンス島の移植（埋め込み：implantation）の結果、糖尿病の動物において正常血糖状態が持続した。しかし、他の研究者らがこれらの実験を繰り返したところアルジネートは組織反応を引き起こし、リム（Lim）他の結果を再現するのは不可能であることが判明した（ランバーティ（Lamberti）他 Applied Biochemistry and Biotechnology 10: 101 (1984); デュピュイ（Dupuy）他, J. Biomed. Material and Res. 22: 1061 (1988); ウェーバー（Weber）他, Transplantation 49: 396 (1990) およびドゥーン‐シオン（Doon-shiong）他, Transplantation Proceedings 22: 754 (1990)）。現在、これらポリマーの水溶性は、イン・ヴィヴォでこれらマイクロカプセルの安定性および生体適合性が制限されることの原因であると考えられている（デュピュイ（Dupuy）他，前出、ウェーバー（Weber），前出、ドゥーン‐シオン（Doon-shiong）他,前出、およびスミッズロッド（Smidsrod）, Faraday Discussion of Chemical Society 57: 263 (1974)）。

最近、イワタ（Iwata）他（イワタ（Iwata）他, Jour. Biomedical Material and Res. 26: 967 (1992)）が同種異系の（アロジェネイックな）膵島のマイクロカプセル化にアガロースを利用し、それがマイクロビーズの調製のための媒体として利用可能であることを見いだした。彼らの研究では、１５００−２０００の島組織をそれぞれ５％アガロース中にマイクロカプセル化し、そしてストレプトゾトシン糖尿病のマウスに移植した。移植片は長期間残存し、レシピエントは無期限に正常血糖を維持した。

彼らの方法は、しかし、多くの欠点を有していた。それは手間がかかり、不正確である。例えば、多くのビーズは部分的にコーティングされたまま残り、そして数百の空の(empty)アガロースのビーズが形成される。従って空のビーズからカプセル封入された島組織を分離するために更なる時間が必要となる。その上、ほとんどの移植されたマイクロビーズは骨盤腔中に集まり、そして、正常血糖を達成するためには完全にコーティングされた個々のビーズ中において多数の島組織が必要とされる。更に、移植されたビーズは回収するのが困難であり、壊れやすい傾向にあり、少し傷ついただけで簡単に島組織が放出されることになる。

マクロカプセル化の手順もテストされてきた。ポリ−２−ヒドロキシエチル−メタクリレート、ポリビニルクロリド−ｃ−アクリル酸、およびセルロースアセテート等の様々な異なる物質からなるマクロカプセルがランゲルハンス島の免疫分離のために製造された（アルトマン（Altman）他, Diabetes 35: 625 (1986); アルトマン（Altman）他, Transplantation: American Society of Artificial Internal Organs 30: 382 (1984); ロネル（Ronel）他, Jour. Biomedical Material Research 17: 855 (1983); クロンプ（Klomp）他, Jour. Biomedical Material Research 17: 865-871 (1983) を参照されたい）。これらすべての研究においては一時的な糖血症の正常化しか達成されなかった。

アーチャー（Archer）他, Journal of Surgical Research 28: 77 (1980) は島組織異種移植片の拒絶を一時的に妨げるためにアクリルコポリマー中空繊維（ホローファイバー）を使用した。彼らは、糖尿病のハムスター中に移植された中空繊維の中で分散した新生児マウスの膵移植片が長期残存することを報告した。最近、レイシー（Lacy）他, Science 254: 1782-1784 (1991)がこれらの結果を確認したが、正常血糖状態は一過性の期間のものであることを明らかにした。彼らによると、島組織が繊維中に注入される際、それらは中空管の中で凝集し、その結果島組織集団の中心部分が壊死するということが判明した。この中心壊死は移植片の延長残存を排除するものであった。この問題を解決するために、彼らは繊維中で島組織を分散させるためにアルジネートを使用した。しかし、この実験は広範に繰り返されてはいない。よって、ヒトにおける島組織移植媒体としてのこの膜の機能は疑わしい。

従って、分泌細胞移植、特に、免疫抑制薬の慢性使用無しに膵島同種移植片および異種移植片の残存、を達成する必要がある。

前述のジャイン（Jain）他の研究において、発明者らは親水性ゲル物質中への分泌細胞のカプセル封入の結果、機能性の非−免疫原性物質が得られ、それは動物に移植することができ、そして長期間にわたって保存することができるということを報告した。この分泌細胞のカプセル封入は、分泌細胞移植に関してより効率的で扱いやすい技術を提供するものであった。このカプセル封入技術は、酵素、微生物、組換えで生産された栄養剤を含む栄養剤、細胞傷害性剤、および化学治療剤等の他の生物学的因子をカプセル封入するのにも有用であるとして記載された。カプセル封入された生物学的因子は、その生物学的因子と反応することが知られている病気の治療に有用であるとして論じられた。

しかし、前記出願は、治療面において有用である、拡散性生物物質を生産する細胞を組み入れることについては全く論じていない。ここで分泌細胞と、拡散性生物物質を生産する細胞との間の差違を記載する。前者は前記ジャイン（Jain）の出願において提供される実施例によると、一般的に、ホルモン、細胞シグナル伝達物質などの、通常生物学的に“メッセンジャー”と考えられる産物のことを指す。それに対して拡散性生物物質は、ＭＨＣ提示ペプチド、サプレッサー、プロモーター、インデューサー等の細胞発現制御因子、といった物質を指す。この区別は、例えば以下の記載によるような、腫瘍学の分野において理解されるであろう。

ガンについての広範囲にわたる研究には不均質な細胞抽出物、および様々な細胞構成成分についての研究が含まれる。モノクローナル抗体の利用によって当業者は、例えば、ＧＭ２、ＴＦ、ＳＴｎ、ＭＵＣ−１およびそれらに由来する種々のエピトープ、といった、問題に関連するガン関連抗原を同定してきた。現在の理論ではこれら種々の腫瘍マーカーに由来するエピトープはＭＨＣ分子と、非共有結合的に複合体を形成し、それによって特異的な細胞溶解性Ｔ細胞によるアグロタイプ (agrotype)を形成すると推論されている。このメカニズムはウイルス感染に対する生物学的応答に関する種々のメカニズムと異なるものではない。この点については、すべて参考文献として本出願にその内容を合体させる、ファン・デア・ブルッゲン（Van der Bruggen）他, Scienc 254: 1643-1647 (1991): ブーン（Boon）他, ５，４０５，９４０号およびブーン（Boon）他, ５，３４２，７７４号を注目されたい。

いわゆるガンエピトープの同定に関する研究と並行して行われている他の研究では、抑制、またはより一般的にはバイオモデュレーションによるような、ガン増殖の調節について関心が向けられてきた。例えば、ミッチェル，ジェイ（Mitchell, J.） Clin. Pharmacol32: 2-9 (1992); マックリーン（Maclean）他, Can. J. Oncol.4: 249-254 (1994)を参照されたい。ガンに対するこれらすべての異なるアプローチに関連している目的は、患者の病状にいくらかの改善をもたらすために、宿主の免疫応答を調節することである。

これらすべてのアプローチの鍵となるのは、他の物質と協力して作用し、免疫応答を調節する、一以上の拡散性生物学的産物の活性である。ブーン（Boon）他およびファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他は、例えば、小さなペプチド分子を開示している。ミッチェル（Mitchell）は、例えば、サプレッサーとして機能するより大きな分子を記載している。

これらの物質を利用するすべての治療アプローチにおける一つの問題点は、これらを安全かつ有効な形態で送達することである。これは簡単には達成されない。

今回、驚くべきことに、分泌細胞の産物を必要とする病気の治療法の開発において有効であったジャイン（Jain）他の技術が、他の分野においても利用可能であることが判明したのである。

すなわち、本発明は、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズからなる組成物であって、前記ビーズが、ビーズ内に封入された際に、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有し、前記因子が、前記コーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズを通って拡散するものである、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズからなる組成物を提供する。

更に、本発明は、ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法であって、上記組成物を前記ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に移植することからなり、前記因子が前記組成物を通って拡散するものである、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法を提供する。好ましくは、前記ヒトを除く対象が、前記因子によって処置可能な病的状態を患うヒトを除く対象であり、更に、好ましくは、前記病的状態が、異常細胞増殖によって特徴づけられる。

また、本発明は、ビーズ内に封入された際に、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有する、アガロースコーティングした、アガロースコラーゲンビーズの製造方法であって、以下の工程：
コラーゲン含有物質中に、ビーズ内に封入された際に前記因子を生産する細胞を懸濁する工程、
前記コラーゲン含有物質にアガロースを添加する工程、
前記コラーゲン、アガロース、および細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、
前記半固体のビーズ中のコラーゲンを重合させて、前記細胞を含有する固体の、アガロース−コラーゲンビーズを形成する工程、そして、
前記細胞を含有する前記固体の、アガロース−コラーゲンビーズをアガロースでコーティングする工程、
を有する、アガロースコーティングした、アガロースコラーゲンビーズの製造方法を提供する。

更に、本発明は、固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズからなる組成物であって、前記ビーズが、ビーズ内に封入された際に、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有し、前記因子が、前記固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズを通って拡散するものである、固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズからなる組成物を提供する。

また、本発明は、ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法であって、上記組成物を前記ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に移植することからなり、移植後に、前記因子が前記組成物を通って拡散するものである、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法を提供する。

そして、本発明は、アガロースからなり、アガロースでコーティングした、固体のビーズの製造方法であって、前記固体のビーズが、前記ビーズ内に封入された際に、前記ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有するものであって、以下の工程：
前記細胞がビーズ内に封入された際に、前記ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産することが可能な細胞のサンプルを含有する溶液に添加する工程、
前記アガロースおよび前記細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、
前記半固体のビーズ中のアガロースを重合させて、前記細胞を含有し、それによって前記細胞をビーズ内に封入する、固体の、アガロースビーズを形成する工程、そして、
前記ビーズ内に封入された細胞を含有する、前記固体の、アガロース含有ビーズをアガロースでコーティングする工程、を有する、アガロースからなり、アガロースでコーティングした、固体のビーズの製造方法を提供する。

また、上記した組成物、つまり、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズからなる組成物、並びに、固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズからなる組成物をインキュベートして得られた、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を包含する、調整培地（conditioned medium）を提供する。

これがどのようにして達成されるかが本発明の主題であり、詳細な説明は以下に示す。

ここでその語句を定義するが、拡散性生物学的産物を生産する１以上のタイプの細胞を含有する移植可能なビーズの製造について記載している。拡散性生物学的産物とは、ビーズを移植された対象(subject)に対して効果を有するものである。好ましくは、この効果は、免疫応答の刺激、または応答の抑制などの免疫調節である。ガンの場合は、例えば、拡散性生物学的産物は、患者(subject)におけるガン細胞上でＭＨＣ分子と複合体を形成し、それによってそれに対するＣＴＬ応答を引き起こし、その結果その患者における腫瘍の負荷量の低下を導く、ペプチドであってもよい。また、拡散性産物は腫瘍成長のサプレッサーであってもよい。この形態の治療法と関連して、必ずしも好ましいというわけではないが、同定された腫瘍中、またはその近くに移植可能なビーズを載置することも可能である。

ここで使用する“拡散性生物学的産物”とは、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖質（炭水化物）、脂質、糖脂質、およびペプチドのような物質を指す。より具体的には、抗体、サイトカイン、ホルモン、酵素、等の物質が例として挙げられるが、それらのタイプの物質だけが本発明に含まれるというわけでは決してない。除外されるのは、ＣＯ２およびＨ２Ｏといった周知の、細胞過程の“最終産物”である。

前述の諸実験が示すように、移植可能なビーズは予防的にも使用することができる。ガン患者の人口（集団）のうち少なくとも一部が、病気を再発生する傾向にあることがよく知られている。ここに記載した諸実験は、移植によって、拡散性産物が患者のシステムに対して有する生物学的効果により、ガンの発生または再発生を妨げることができることを示している。

本発明の考察は、イン・ヴィヴォのアプローチに焦点を当てている。本発明に対するイン・ヴィトロのアプローチも存在するということも理解されなければならない。それらのいくつかについてはここで議論する。例えば、所望の産物を生産する多くの細胞は、イン・ヴィトロで培養される場合、支持細胞の存在を必要とするということがよく知られている。そのような支持細胞について常に問題が存在する。それらは所望の細胞よりも速く増殖し、事実上、問題の物質を“絞扼(strangulation)”することになる可能性がある。更に、支持細胞層によって生産される様々な毒性の産物についての問題の可能性もある。本発明の移植可能なビーズは、組み入れた細胞を保護する一方、拡散性産物を、例えばそこにおいてそれらを収集することができる培地へと移動させるのを可能にする、細胞のインキュベーターとして作用するようなものであるといえる。

先に示したように、移植可能なビーズの調製はまず、好ましくは水溶性のコラーゲンといった溶液中に細胞を懸濁することが必要とされる。好ましくは、コラーゲンは約０．５から約２％の溶液の、アテロコラーゲン(atelocollagen)である。使用する細胞のタイプによって、所与の時間における溶液中の細胞数、従ってビーズ中の細胞数は、異なるものとなる。好ましくは使用される細胞は、ビーズ当たり約１０，０００から約２００，０００細胞であり、より好ましくは、約３０，０００から約１００，０００である。最も好ましくは、約４０，０００から約６０，０００の細胞を使用するのがよい。

コラーゲン溶液中への細胞の懸濁に続いて、アガロース溶液が添加される。好ましくは、このアガロース溶液は約０．５％から約５％の範囲であり、約１％が好ましい。この混合物を、ＴＥＦＲＯＮ（登録商標）またはミネラルオイルのような不活性物質の上または中に滴下することによって、ビーズが形成する。このビーズは半固体である。次にこの半固体のビーズを、好ましくは抗生物質を含有する、無菌培地へと移し、洗浄し、コラーゲンが重合するようにインキュベートする。コラーゲンの重合はよく研究された現象であり、これが起こるような条件はここで詳述する必要はない。

ビーズの固化後、次に好ましくはアガロース溶液中でビーズを転がすことによって、ビーズをアガロースでコーティングする。これを達成する１つの好ましい手段は、好ましくは５％から１０％の、アガロースの溶液を含有する簡単なＴＥＦＲＯＮ（登録商標）コーティングされた匙である。

また、コラーゲンを含まない点を除いて、上記に記載した要領でビーズを調製することもでき、好ましくは、細胞が制限された際に、ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産することが可能な細胞のサンプルを含有する溶液に添加する工程、アガロースおよび前記細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、前記半固体のビーズ中のアガロースを重合させて、前記細胞を含有し、それによって前記細胞を制限する、固体の、アガロースビーズを形成する工程により調製する。

上記の、拡散性生物学的産物についての議論は野生型の物質に限定されることを意味するものではない。例えば、異種起源のタンパク質を生産するように処置された、または、所望の生物学的産物の生産量を増加させるように、例えば相同的組換えによって、モディファイされた、真核細胞（例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）または原核細胞（例えば大腸菌）などの、トランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を、簡単に組み入れることができる。ハイブリドーマのような他の材料も使用することができ、この場合、拡散性生物学的産物はモノクローナル抗体である。

例１
この例、および以下の諸例では、ＲＥＮＣＡ細胞を使用する。これはＢＡＬＢ／Ｃマウスの自然発症の腎腺ガン細胞であり、広く入手可能でイン・ヴィトロの培養およびイン・ヴィヴォの飼育(culture)の両方で維持されてきたものである。フランコ（Franco）, Cytokine Induced Tumor Immunogenecity, 181-193(1994)を参照されたい。

凍結されたＲＥＮＣＡ細胞のサンプルを３７℃で解凍し、そして１０％ウシ血清、ペニシリン（１００ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）を追加しておいたダルベッコ変法培地（Ｄ−ＭＥＭ）を含有する組織培養フラスコに載置した。この培地を以下“完全培地”と呼ぶことにする。

細胞を集密(confluency)するまで培養し、そしてトリプシン処理し、その後ハンクス平衡塩類溶液、続いて前述の完全培地で洗浄した。

ＲＥＮＣＡ細胞が腫瘍を有効に生成するかを判定するために、２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスに１０６のこれら細胞を腹腔内に注入した。これらのマウスを３−４週間にわたって観察した。臨床的に見てこれらマウスは最初の２週間は健康であるようにみえ、正常な活動を示していた。その後、ガンの臨床症状が明らかになった。１匹のマウスは２３日後に死に、２匹目は２５日後に死んだ。死後、これらマウスを調べたところ、様々な大きさの多くの腫瘍が記録された。腫瘍の中には出血を示すものもあった。

これらマウスのうち１匹から採取した１つの腫瘍サンプルを、後の組織学的調査のために１０％ホルマリン中で固定した。

例２
ＲＥＮＣＡ細胞がイン・ヴィヴォで実際に成長することが示されたことに続いて、これら細胞が本発明によるビーズの中で生育するかを判定するための研究を行った。

ＲＥＮＣＡ細胞を前述したように集密するまで培養し、同じく前述のようにトリプシン処理し、そして洗浄した。次に６０，０００細胞から９０，０００細胞の間のサンプルを準備した。これら細胞を次に７５０ＲＰＭで遠心分離し、そして液体を除去した。細胞を次にリン酸緩衝食塩水溶液、ｐＨ６．５中の１％アテロコラーゲン(atelocollagen)の溶液中に懸濁した。

最少必須培地（ＭＥＭ）中に低粘度アガロースの１％溶液を調製し、６０℃に維持し、そしてこれの１００ｕｌを、前述のＲＥＮＣＡ細胞とアテロコラーゲン(atellocollagen)との懸濁液に添加した。これら物質を次に、直ちに単一の大きな液滴として、無菌の室温のミネラルオイル中へと移した。この混合物は単一の、なめらかな半固体ビーズを形成した。この手順を繰り返して多数のビーズを作った。

１分後ビーズを３７度で前述の完全培地に移した。次にビーズを先に記載した抗生物質を含有する最少必須培地で３回洗浄した。ビーズを次に空気と５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で、３７℃で一晩インキュベートした。このインキュベーションの後、固体となったビーズを、最少必須培地中の５％アガロースを１ｍｌ含む無菌の薬匙へと移した。ビーズを溶液中で２−３回回転させて、アガロースで均一にコーティングした。アガロースが固化する前にビーズをミネラルオイルへと移し、なめらかな外面を生じさせた。６０秒後、オイルを除去するためにビーズを完全培地で３７℃で５回洗浄した。その後一晩インキュベーション（３７℃、空気、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気）した。

これらのＲＥＮＣＡ含有ビーズを以下の諸実験において使用した。

例３
イン・ヴィヴォでの研究を行うに先立って、ＲＥＮＣＡ細胞が前述の方法で調製したビーズの中で成長するか否かを判定することが必要であった。

これを行うために、例２に記載した要領で調製したビーズを、例２に記載の培地中で、３週間、前記された条件下でインキュベートした。３個のビーズを次に切断して小断片とし、そして標準的な培養フラスコ中で、フラスコと培地との両方に直接接触できるようにして培養した。

これら培養の観察により、細胞が成長して標準的なＲＥＮＣＡコロニーを形成することが示された。これは細胞がビーズの中で生存可能に残っていたことを示すものであった。

例４
次にイン・ヴィヴォ実験を行った。これらの実験において、ビーズを７日間３７℃でインキュベートした。次に対象マウスは、ビーズの移植を受けた。これを行うため、４匹のマウスはそれぞれ腹腔内を通る正中切開を受けた。それぞれが６０，０００のＲＥＮＣＡ細胞を含有する、３つのビーズが移植された。次に切開を吸収性縫合糸を使用して閉じた（二層縫合(two layer closure)）。４匹のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）は正常な雄のマウスであり、２４−２６グラムの体重で健康であるようだった。２セットのコントロールを設定した。第１のセットでは、２匹のマウスがＲＥＮＣＡ細胞を含有しない３つのビーズを与えられ、第２のセットでは、２匹のマウスは全く処置を受けなかった。

移植の３週間後、すべてのマウスは１０６のＲＥＮＣＡ細胞の腹腔内投与を受けた。１８日後、１匹のコントロールマウスが死んだ。すべての残存しているマウスを次に殺し(sacrifice)、そして観察した。

コントロールマウスは多数の腫瘍を示し、一方、ビーズ−カプセル封入した細胞の移植を受けたマウスは（腹）腔にわたってランダムな結節(nodule)を示しただけであった。

これらの有望な結果は、次の例において設定した実験計画を示唆するものであった。

例５
これらの実験では６匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのそれぞれの一つの腎臓被膜の下にＲＥＮＣＡ細胞を注入することによって確立したガンをシュミレートした。１５日後、マウスを２つのグループに分けた。第１のグループの３匹のマウスはそれぞれ前述の例４に記載した３つのビーズを与えられた。第２のグループ（コントロールグループ）はＲＥＮＣＡ細胞を含有しないビーズを与えられた。

４−５日後、ＲＥＮＣＡ細胞含有移植物を与えられたマウスは不活発に見え、そしてそれらの毛(fur)は長く尖った(spiky)ようになっていたのに対し、コントロールグループは活動的なままであり毛の状態に変化はなかった。

しかし、移植１０日後（ＲＥＮＣＡ細胞の注入の２５日後）、コントロールマウスは動きが鈍くなり、そして膨隆腹を示した。３匹のコントロールマウスのうち１匹はビーズ移植の１４日後に死んだ。その後マウスを殺した。

コントロールマウスの体腔はおびただしい出血を示し、消化管、肝臓、胃および肺のすべてにわたって多数の腫瘍がみられた。激しい腫瘍成長のため、全体の腹腔は識別できなくなっていた。しかし、ＲＥＮＣＡ細胞をカプセル封入したビーズを与えられたマウスは出血を示さず、消化器の(alimentary)ガン上に多少の結節がみられただけであった。テストグループとコントロールグループとを比較すると、テストグループでは結節が進行していなかったということが示された。

例６
制限を受けずに（固定されずに：freely）接種されたＲＥＮＣＡ細胞の増殖は、カプセル封入されたＲＥＮＣＡ細胞と一緒にインキュベートされた際は抑制される。この効果が他の細胞についても観察されるかを判定するために更なるセットの実験を行った。

腺ガン細胞ライン、即ち、ＭＭＴ（マウス乳腺腫瘍）をＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から入手した。前述の要領で、ＭＭＴ細胞を用いてカプセル封入されたＭＭＴ細胞を調製し、ビーズ当たり１２０，０００細胞または２４０，０００細胞を含有するビーズを作った。ビーズの調製後、それらを、それらがイン・ヴィトロでＲＥＮＣＡ細胞の増殖を抑制するかどうかを判定するために使用した。具体的には、４ｍｌの培地中でウェル当たり１ｘ１０４ＲＥＮＣＡ細胞を接種して、２つの、６ウェルのペトリプレートを準備した。各プレートにおいて３つのウェルはコントロールとし、３つはテストとした。各プレートにおける３つのコントロールウェルのうち１つに１つのビーズを与えた。他のウェルにはそれぞれ２または３のいずれかの空のビーズを与えた。第２のウェルは同様に処理し、ウェルに１２０，０００または２４０，０００のＭＭＴ細胞を含有するビーズを１つ、２つまたは３つ与えた。ウェルを３７℃で１週間インキュベートし、その後、ＲＥＮＣＡ細胞をトリプシン処理し、洗浄し、血球計数器(hemocytometer)を使用して計数した。結果を表１に示す。

＠
例７
例６の結果に続いてＲＥＮＣＡ細胞ではなく１ｘ１０４ＭＭＴ細胞を使用して同様の実験を行った。この実験は例６と全く同様にして行った。結果を表２に示す。

これらの結果はイン・ヴィヴォでの実験の使用を促すものであった。これを例８において示す。

例８
前記の諸実験で用いた、ＲＥＮＣＡ細胞は腎ガン細胞である。本発明の普遍的な有効性をより完全に証明するために、異なるタイプのガン細胞を使用した研究を行った。具体的には、腺ガン細胞を使用した。

マウス乳腺腫瘍細胞ライン（ＭＭＴ）をＡＴＣＣから入手した。前記したプロトコールを使用してビーズ当たり１２０，０００細胞およびビーズ当たり
２４０，０００細胞を含有する移植物を調製した。

使用した実験モデルは前述のマウスモデルであった。２２匹のマウスを４匹、９匹、および９匹のグループに分けた。最初のグループ、即ちコントロールをさらに２匹、１匹および１匹の３つのグループに分けた。第１のサブグループは細胞を含有しないビーズを１つ移植された。１匹のマウスは２つの空のビーズを与えられ、そして１匹は３つの空のビーズを与えられた。

実験グループＡ（９匹の動物）においては、ビーズは１２０，０００の細胞を含有するものであり、一方グループＢにおいてはビーズは２４０，０００の細胞を含有するものであった。グループ“Ａ”と“Ｂ”の内にも３つの細別グループがあり、その各々は３匹のマウスからなるものであった。これらサブグループは１つ、２つ、または３つのＭＭＴ細胞含有ビーズを与えられた。

移植後２１日目にすべての動物は４０，０００のＲＥＮＣＡ細胞の注入を受けた。注入の直後、マウスは不活発になり、毛は長く尖ったものとなった。これは約５日間持続し、その後正常の行動が観察された。

２０日後、コントロールマウスは膨隆腹を示し、非常に長く尖った毛を示した。１匹のコントロールマウスは注入後２５日目に死に、一方残りのコントロールマウスは末期であるようだった。すべてのマウスを殺し、腫瘍発達を観察した。これらの観察は以下の表３に記録する：

これらの結果はテストした１８匹のマウスの内、１３匹は疾病を示さないことを表している。グループ（Ａ）のマウスの中では、１匹のマウスが多少のモジュール(module)を示し、そしてもう１匹のマウスは多少の腫瘍を示した。２つのビーズを与えられたマウスのうち１匹はいくつかの腫瘍を示した。

グループＢのうち、１つのビーズを与えられたマウスのうち１匹と、２つのビーズを与えられたマウスのうち１匹は、いくつかの腫瘍を示し、腸と絡み合っていた。３つのビーズを与えられたマウスのうち１匹においては大きな固型腫瘍が発達しており、明らかに非常に病状が悪かった。しかしやはり、全体としてこの結果は、カプセル封入されたマウス乳腺腫瘍細胞は腫瘍形成を抑制するということを示していた。

例９
前記から示唆されるように、本発明の粒子は結果的に、腫瘍細胞増殖を抑制および／または阻止するなんらかの物質また因子の産生をもたらすものである。これを更に以下の実験において探究した。

アテロコラーゲン(atellocallogen)を含まないということを除いては、先の例２において記載した要領で、更にビーズを作った。従って、これらビーズはアガロース／アガロースビーズである。前述のＲＥＮＣＡ細胞を、同じく前述したように、これらビーズに組み入れた。

そして、２セットの、３つの６ウェルのプレートを、コントロール、および実験グループとして使用した。コントロールグループにおいては、ウェルを４ｍｌ ＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清および１１ｍｌ／ｌのペニシリン）で満たした。次に各コントロールグループのウェルに１０，０００のＲＥＮＣＡ細胞を播種した。

実験グループにおいては、ＲＰＭＩ完全培地を、１０の免疫分離されたＲＥＮＣＡ含有ビーズ（ビーズ当たり１２０，０００細胞）を、５０ｍｌのＲＰＭＩ完全培地を含有する３５ｘ１００ｍｍのペトリプレート中でインキュベートすることによって得られた物質を添加することにより調整(condition)した。５日間のインキュベーション後、培地をこれらプレートから収集し、そのうちの４ｍｌを各テストウェルに配分した。次にこれらウェルに１０，０００のＲＥＮＣＡ細胞を播種した。

すべてのプレート（コントロールと実験との両方）を３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション期間の後、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして血球計数器を使用して計数した。各ウェルからなるプレート中の細胞をトリプシン処理後、一緒に貯蔵し、計数した。結果を表４に示す。

これらの結果は、細胞が、例えば、本発明のビーズ内に制限された(restricted)際に、結果として腫瘍細胞の増殖を抑制することになるなんらかの因子を生産したということを示している。この制限抑制因子(restriction inhibitor factor)は、それらがビーズ中に封入されているということから、細胞によって生産されているのであり、細胞が互いに接触した際に生産される、接触抑制因子(contact inhibitor factor)のような他の物質とは異なるものである。

例１０
前記の実験は調整培地(conditioned medium)中でのＲＥＮＣＡ細胞の増殖が、コントロール培地中での細胞の増殖の約半分であるということを示していた。ここに示す実験では、増殖抑制因子が、調整培地を凍結した後でも活性を維持するかどうかを調べた。

ＲＥＮＣＡ調整培地を１０の免疫分離したＲＥＮＣＡ含有ビーズを５日間インキュベートすることによって調製した。インキュベーションは３５ｘ１００ｍｍのペトリプレート中、３７℃で、５０ｍｌのＲＰＭＩ完全培地とともに行った。インキュベーションの後、培地を収集して−２０℃で保管した。調整培地を免疫分離したＭＭＴ（マウス乳腺腫瘍）細胞含有ビーズをインキュベートすることによって調製した。ビーズは、ビーズ当たり２４０，０００細胞を含有していた；その他の点ではすべての条件は同一であった。

凍結した培地を３７℃で解凍し、次に以下のテストにおいて使用した。３つの６ウェルプレートを各処置、即ち（１）ＲＰＭＩコントロール培地、（２）ＲＥＮＣＡ凍結調整培地、そして（３）ＭＭＴ凍結調整培地について使用した。全部で４ｍｌの培地を各ウェルに分配した。次にすべてのウェルに１０，０００のＲＥＮＣＡ細胞を播種し、そして３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、２つのプレートのサンプルを各ウェルから取り出し、トリプシン処理し、貯蔵し、そして血球計数器で計数した。８日目に残りの３つのプレートの各ウェルを同じ方法でテストした。結果を表５に示す。

これらの結果を前述の例６の結果と比較すると、凍結／解凍ＲＥＮＣＡ調整培地は凍結されていない培地と同じ程度は増殖を阻止しない（例６と例７との比較）が、それでもなお実際に増殖を阻止したということが理解されるであろう。ＭＭＴ細胞を使用した凍結調整培地は凍結していないＭＭＴ調整培地よりもより強く増殖を阻止した。これらの結果は、テストした１８匹のマウスの内、１３匹は疾病を示さないことを表している。グループ（Ａ）のマウスの中では、１匹のマウスが多少のモジュール(module)を示し、そしてもう１匹のマウスは多少の腫瘍を示した。

上記のものは、ここでその語句を定義するが、拡散性生物学的産物を生産する１以上のタイプの細胞を含有する移植可能なビーズの製造について記載している。拡散性生物学的産物とは、ビーズを移植された対象(subject)に対して効果を有するものである。好ましくは、この効果は、免疫応答の刺激、または応答の抑制などの免疫調節である。ガンの場合は、例えば、拡散性生物学的産物は、患者(subject)におけるガン細胞上でＭＨＣ分子と複合体を形成し、それによってそれに対するＣＴＬ応答を引き起こし、その結果その患者における腫瘍の負荷量の低下を導く、ペプチドであってもよい。また、拡散性産物は腫瘍成長のサプレッサーであってもよい。この形態の治療法と関連して、必ずしも好ましいというわけではないが、同定された腫瘍中、またはその近くに移植可能なビーズを載置することも可能である。

ここで使用する“拡散性生物学的産物”とは、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖質（炭水化物）、脂質、糖脂質、およびペプチドのような物質を指す。より具体的には、抗体、サイトカイン、ホルモン、酵素、等の物質が例として挙げられるが、それらのタイプの物質だけが本発明に含まれるというわけでは決してない。除外されるのは、ＣＯ２およびＨ２Ｏといった周知の、細胞過程の“最終産物”である。

前述の諸実験が示すように、移植可能なビーズは予防的にも使用することができる。ガン患者の人口（集団）のうち少なくとも一部が、病気を再発生する傾向にあることがよく知られている。ここに記載した諸実験は、移植によって、拡散性産物が患者のシステムに対して有する生物学的効果により、ガンの発生または再発生を妨げることができることを示している。

本発明の考察は、イン・ヴィヴォのアプローチに焦点を当てている。本発明に対するイン・ヴィトロのアプローチも存在するということも理解されなければならない。それらのいくつかについてはここで議論する。例えば、所望の産物を生産する多くの細胞は、イン・ヴィトロで培養される場合、支持細胞の存在を必要とするということがよく知られている。そのような支持細胞について常に問題が存在する。それらは所望の細胞よりも速く増殖し、事実上、問題の物質を“絞扼(strangulation)”することになる可能性がある。更に、支持細胞層によって生産される様々な毒性の産物についての問題の可能性もある。本発明の移植可能なビーズは、組み入れた細胞を保護する一方、拡散性産物を、例えばそこにおいてそれらを収集することができる培地へと移動させるのを可能にする、細胞のインキュベーターとして作用するようなものであるといえる。

先に示したように、移植可能なビーズの調製はまず、好ましくは水溶性のコラーゲンといった溶液中に細胞を懸濁することが必要とされる。好ましくは、コラーゲンは約０．５から約２％の溶液の、アテロコラーゲン(atelocollagen)である。使用する細胞のタイプによって、所与の時間における溶液中の細胞数、従ってビーズ中の細胞数は、異なるものとなる。好ましくは使用される細胞は、ビーズ当たり約１０，０００から約２００，０００細胞であり、より好ましくは、約３０，０００から約１００，０００である。最も好ましくは、約４０，０００から約６０，０００の細胞を使用するのがよい。

コラーゲン溶液中への細胞の懸濁に続いて、アガロース溶液が添加される。好ましくは、このアガロース溶液は約０．５％から約５％の範囲であり、約１％が好ましい。この混合物を、ＴＥＦＲＯＮ（登録商標）またはミネラルオイルのような不活性物質の上または中に滴下することによって、ビーズが形成する。このビーズは半固体である。次にこの半固体のビーズを、好ましくは抗生物質を含有する、無菌培地へと移し、洗浄し、コラーゲンが重合するようにインキュベートする。コラーゲンの重合はよく研究された現象であり、これが起こるような条件はここで詳述する必要はない。

ビーズの固化後、次に好ましくはアガロース溶液中でビーズを転がすことによって、ビーズをアガロースでコーティングする。これを達成する１つの好ましい手段は、好ましくは５％から１０％の、アガロースの溶液を含有する簡単なＴＥＦＲＯＮ（登録商標）コーティングされた匙である。

また、コラーゲンを含まない点を除いて、上記に記載した要領でビーズを調製することもでき、好ましくは、細胞が制限された際に、ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産することが可能な細胞のサンプルを含有する溶液に添加する工程、アガロースおよび前記細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、前記半固体のビーズ中のアガロースを重合させて、前記細胞を含有し、それによって前記細胞を制限する、固体の、アガロースビーズを形成する工程により調製する。

上記の、拡散性生物学的産物についての議論は野生型の物質に限定されることを意味するものではない。例えば、異種起源のタンパク質を生産するように処置された、または、所望の生物学的産物の生産量を増加させるように、例えば相同的組換えによって、モディファイされた、真核細胞（例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）または原核細胞（例えば大腸菌）などの、トランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を、簡単に組み入れることができる。ハイブリドーマのような他の材料も使用することができ、この場合、拡散性生物学的産物はモノクローナル抗体である。

本発明の他の特徴および態様は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要はない。

ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用されたものであり、従って、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載された特徴構成又はその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能であると理解される。

Claims (10)

1. アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズからなる組成物であって、前記ビーズが、ビーズ内に封入された際に、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有し、前記因子が、前記コーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズを通って拡散するものである、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズからなる組成物。
2. ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法であって、請求項１の組成物を前記ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に移植することからなり、前記因子が前記組成物を通って拡散するものである、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法。
3. 前記ヒトを除く対象が前記因子によって処置可能な病的状態を患うヒトを除く対象である、請求項２の方法。
4. 前記病的状態が異常細胞増殖によって特徴づけられる、請求項３の方法。
5. ビーズ内に封入された際に、アガロースコーティングした、固体のアガロースコラーゲンビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞を除く）を含有する、アガロースコーティングした、アガロースコラーゲンビーズの製造方法であって、以下の工程：
   コラーゲン含有物質中に、ビーズ内に封入された際に前記因子を生産する細胞を懸濁する工程、
   前記コラーゲン含有物質にアガロースを添加する工程、
   前記コラーゲン、アガロース、および細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、
   前記半固体のビーズ中のコラーゲンを重合させて、前記細胞を含有する固体の、アガロース−コラーゲンビーズを形成する工程、そして、
   前記細胞を含有する前記固体の、アガロース−コラーゲンビーズをアガロースでコーティングする工程、
   を有する、アガロースコーティングした、アガロースコラーゲンビーズの製造方法。
6. 固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズからなる組成物であって、前記ビーズが、ビーズ内に封入された際に、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞ではない。）を含有し、前記因子が、前記固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズを通って拡散するものである、固体の、アガロースコーティングした、アガロース含有ビーズからなる組成物。
7. ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法であって、請求項６の組成物を前記ヒトを除く対象（但し、ガンを患う対象を除く）に移植することからなり、移植後に、前記因子が前記組成物を通って拡散するものである、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を投与する方法。
8. アガロースからなり、アガロースでコーティングした、固体のビーズの製造方法であって、前記固体のビーズが、前記ビーズ内に封入された際に、前記ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産する細胞（但し、ガン細胞ではない。）を含有するものであって、以下の工程：
   前記細胞がビーズ内に封入された際に前記ビーズを通って拡散する腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を生産することが可能な細胞のサンプルを含有する溶液を、アガロース中に添加する工程、
   前記アガロースおよび前記細胞からなる半固体のビーズを形成する工程、
   前記半固体のビーズ中のアガロースを重合させて、前記細胞を含有し、それによって前記細胞をビーズ内に封入する、固体の、アガロースビーズを形成する工程、そして、
   前記ビーズ内に封入された細胞を含有する、前記固体の、アガロース含有ビーズをアガロースでコーティングする工程、
   を有する、アガロースからなり、アガロースでコーティングした、固体のビーズの製造方法。
9. 請求項１に記載の組成物をインキュベートして得られた、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を包含する、調整培地（conditioned medium）。
10. 請求項６に記載の組成物をインキュベートして得られた、腫瘍細胞の増殖を抑制する因子を包含する、調整培地（conditioned medium）。