JPH0889239A - 組織培養用基材及び組織培養法 - Google Patents
組織培養用基材及び組織培養法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 医薬品、化粧品等の毒性、刺激性、浸透性等
各種安全性試験を行うのに適した器官モデル、あるいは
臨床治療に用いる人工臓器等に適用できる組織培養用基
材及び組織培養法に関する。 【構成】 物理的性質及び／又は化学的性質の異なる二
種のスポンジからなることを特徴とする組織培養用基材
に関し、更に前記物理的性質が空孔径であり、前記化学
的性質が架橋度であり、前記スポンジが生体親和性高分
子であり、前記生体親和性高分子がコラーゲンであるこ
とに特徴を有する組織培養用基材、及び物理的性質及び
／又は化学的性質の異なる二種のスポンジからなる組織
培養用基材を用いる組織培養法であって、一方のスポン
ジ上に細胞を播種、培養した後、かかるスポンジに他方
のスポンジを重ね、更に細胞を播種、培養することを特
徴とする組織培養法。
各種安全性試験を行うのに適した器官モデル、あるいは
臨床治療に用いる人工臓器等に適用できる組織培養用基
材及び組織培養法に関する。 【構成】 物理的性質及び／又は化学的性質の異なる二
種のスポンジからなることを特徴とする組織培養用基材
に関し、更に前記物理的性質が空孔径であり、前記化学
的性質が架橋度であり、前記スポンジが生体親和性高分
子であり、前記生体親和性高分子がコラーゲンであるこ
とに特徴を有する組織培養用基材、及び物理的性質及び
／又は化学的性質の異なる二種のスポンジからなる組織
培養用基材を用いる組織培養法であって、一方のスポン
ジ上に細胞を播種、培養した後、かかるスポンジに他方
のスポンジを重ね、更に細胞を播種、培養することを特
徴とする組織培養法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品、化粧品等の毒
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
器官モデル、あるいは臨床治療に用いる人工臓器等に適
用できる組織培養用基材及び組織培養法に関する。
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
器官モデル、あるいは臨床治療に用いる人工臓器等に適
用できる組織培養用基材及び組織培養法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から薬品、食品、あるいは化粧品と
いった分野では、毎年多くのものが開発され上市されて
いるが、これらのように人体に直接適用されるものにつ
いての開発においては、安全性の確認を行うことが必須
となっている。かかる安全性の確認試験としてはこれま
で主に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、デ
ータの信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点
から動物実験の見直しが求められている。その代替法の
一つとして特定の器官の細胞や生体物質を用いてｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて器官を再構築したモデルを作製し、
その器官に特有の薬物を反応させそれを測定する方法が
試みられている。
いった分野では、毎年多くのものが開発され上市されて
いるが、これらのように人体に直接適用されるものにつ
いての開発においては、安全性の確認を行うことが必須
となっている。かかる安全性の確認試験としてはこれま
で主に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、デ
ータの信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点
から動物実験の見直しが求められている。その代替法の
一つとして特定の器官の細胞や生体物質を用いてｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて器官を再構築したモデルを作製し、
その器官に特有の薬物を反応させそれを測定する方法が
試みられている。
【０００３】一方、臨床の場においても従来から行われ
てきたプラスチックや金属類を原料とする人工臓器か
ら、これに生体由来の物質を組み合わせたもの、更には
培養細胞を組み合わせたいわゆるハイブリッド型人工臓
器の開発が進められている。
てきたプラスチックや金属類を原料とする人工臓器か
ら、これに生体由来の物質を組み合わせたもの、更には
培養細胞を組み合わせたいわゆるハイブリッド型人工臓
器の開発が進められている。
【０００４】かかる器官モデルや人工臓器等の分野で比
較的進んでいるものとして培養皮膚が挙げられる。培養
皮膚としては、ヒト繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培
養し、ゲルが収縮した時点でそのゲル上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの（Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ
Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，４８５，０９６）やナイロン
メッシュにヒト繊維芽細胞を播種、培養してメッシュの
空孔が繊維芽細胞の分泌物により埋まった時点でその上
にヒト角化細胞を播種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，
Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，
Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔ
ｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５
４４Ａ，１９９１）、あるいはヒト繊維芽細胞を加えた
スポンジメッシュ上にゲルやフィルムを貼り付け、その
上にヒト角化細胞を播種、培養したもの等がある（日形
会誌、１０：１６５〜１８０、１９９０）。
較的進んでいるものとして培養皮膚が挙げられる。培養
皮膚としては、ヒト繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培
養し、ゲルが収縮した時点でそのゲル上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの（Ｕｎｉｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ
Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，４８５，０９６）やナイロン
メッシュにヒト繊維芽細胞を播種、培養してメッシュの
空孔が繊維芽細胞の分泌物により埋まった時点でその上
にヒト角化細胞を播種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，
Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，
Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔ
ｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５
４４Ａ，１９９１）、あるいはヒト繊維芽細胞を加えた
スポンジメッシュ上にゲルやフィルムを貼り付け、その
上にヒト角化細胞を播種、培養したもの等がある（日形
会誌、１０：１６５〜１８０、１９９０）。
【０００５】上記のような培養皮膚を代表とする従来の
器官モデル、あるいは人工臓器の製造において最も問題
となるのは、臓器の複雑な三次元構造をいかに再現する
かということである。例えば、皮膚は主に表皮角化細
胞、真皮繊維芽細胞、およびコラーゲンをはじめとする
細胞間物質からなるが、かかる成分が混然と一体になっ
ているのではない。即ち、皮膚はコラーゲンの作る繊維
中に真皮繊維芽細胞が三次元的に増殖して真皮層を形作
り、この真皮層の上に表皮角化細胞が整然と何層にも積
み重なり、しかも基底層からいくつかの段階を経て角化
層に到る複雑な分化を示す表皮層を形成しているのであ
る。この複雑な構造を持つことによって初めて皮膚は皮
膚としての機能を果たすのである。
器官モデル、あるいは人工臓器の製造において最も問題
となるのは、臓器の複雑な三次元構造をいかに再現する
かということである。例えば、皮膚は主に表皮角化細
胞、真皮繊維芽細胞、およびコラーゲンをはじめとする
細胞間物質からなるが、かかる成分が混然と一体になっ
ているのではない。即ち、皮膚はコラーゲンの作る繊維
中に真皮繊維芽細胞が三次元的に増殖して真皮層を形作
り、この真皮層の上に表皮角化細胞が整然と何層にも積
み重なり、しかも基底層からいくつかの段階を経て角化
層に到る複雑な分化を示す表皮層を形成しているのであ
る。この複雑な構造を持つことによって初めて皮膚は皮
膚としての機能を果たすのである。
【０００６】しかしながら、上記従来の器官モデルや人
工臓器等においては、所望の三次元構造を持ったものが
得られず、特に上記従来の培養皮膚においては、開発が
進んでいるにもかかわらず、細胞播種から完成まで１か
月以上の時間を要し、且つ実際のヒト皮膚に比べ角化細
胞がわずか数層にしか重層化せず、分化も乏しいものし
か得られないといった問題があった。
工臓器等においては、所望の三次元構造を持ったものが
得られず、特に上記従来の培養皮膚においては、開発が
進んでいるにもかかわらず、細胞播種から完成まで１か
月以上の時間を要し、且つ実際のヒト皮膚に比べ角化細
胞がわずか数層にしか重層化せず、分化も乏しいものし
か得られないといった問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な問題を解決するためになされたもので、その目的とす
るところは、異種あるいは同種の細胞を分離して培養す
るだけでなく、それぞれに適した条件で同時に培養する
ことにより、所望の三次元構造を持つ組織培養物が短期
間で得られる組織培養用基材及び組織培養法を提供する
ことにある。
な問題を解決するためになされたもので、その目的とす
るところは、異種あるいは同種の細胞を分離して培養す
るだけでなく、それぞれに適した条件で同時に培養する
ことにより、所望の三次元構造を持つ組織培養物が短期
間で得られる組織培養用基材及び組織培養法を提供する
ことにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、物理的
性質及び／又は化学的性質の異なる二種のスポンジから
なることを特徴とする組織培養用基材に関し、更に前記
物理的性質が空孔径であり、前記化学的性質が架橋度で
あり、前記スポンジが生体親和性高分子であり、前記生
体親和性高分子がコラーゲンであることに特徴を有する
組織培養用基材に関する。更に、物理的性質及び／又は
化学的性質の異なる二種のスポンジからなる組織培養用
基材を用いる組織培養法であって、一方のスポンジ上に
細胞を播種、培養した後、かかるスポンジに他方のスポ
ンジを重ね、更に細胞を播種、培養することを特徴とす
る組織培養法に関し、更に前記細胞が互いに異なる細胞
であり、前記互いに異なる細胞が角化細胞と繊維芽細胞
であり、前記物理的性質及び／又は化学的性質の異なる
二種のスポンジの少なくとも一方が、培養中に分解消失
することに特徴を有する組織培養法に関する。
性質及び／又は化学的性質の異なる二種のスポンジから
なることを特徴とする組織培養用基材に関し、更に前記
物理的性質が空孔径であり、前記化学的性質が架橋度で
あり、前記スポンジが生体親和性高分子であり、前記生
体親和性高分子がコラーゲンであることに特徴を有する
組織培養用基材に関する。更に、物理的性質及び／又は
化学的性質の異なる二種のスポンジからなる組織培養用
基材を用いる組織培養法であって、一方のスポンジ上に
細胞を播種、培養した後、かかるスポンジに他方のスポ
ンジを重ね、更に細胞を播種、培養することを特徴とす
る組織培養法に関し、更に前記細胞が互いに異なる細胞
であり、前記互いに異なる細胞が角化細胞と繊維芽細胞
であり、前記物理的性質及び／又は化学的性質の異なる
二種のスポンジの少なくとも一方が、培養中に分解消失
することに特徴を有する組織培養法に関する。
【０００９】
【作用】前記構成において、本発明を構成するスポンジ
は多孔質の構造を有しており、前記物理的性質として
は、例えば空孔径を挙げることができる。かかるスポン
ジを組織培養の基材としてこれに細胞を播種する際、空
孔径が該細胞の直径に比して十分大きい場合には、該細
胞はスポンジ内に落ち込んでその孔内で三次元的に増殖
することができ、逆に空孔径が該細胞の直径に比して小
さい場合には、該細胞はスポンジ表面にとどまり二次元
的に増殖することができる。このように物理的性質、例
えば空孔径の異なる二種のスポンジと、適宜選択した各
種細胞を組み合わせて用いることにより、各種細胞を分
離して培養できるだけでなく、その増殖状態までコント
ロールすることができるのである。
は多孔質の構造を有しており、前記物理的性質として
は、例えば空孔径を挙げることができる。かかるスポン
ジを組織培養の基材としてこれに細胞を播種する際、空
孔径が該細胞の直径に比して十分大きい場合には、該細
胞はスポンジ内に落ち込んでその孔内で三次元的に増殖
することができ、逆に空孔径が該細胞の直径に比して小
さい場合には、該細胞はスポンジ表面にとどまり二次元
的に増殖することができる。このように物理的性質、例
えば空孔径の異なる二種のスポンジと、適宜選択した各
種細胞を組み合わせて用いることにより、各種細胞を分
離して培養できるだけでなく、その増殖状態までコント
ロールすることができるのである。
【００１０】前記スポンジの素材としては、生体親和性
高分子であるＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、ゼ
ラチン、アルギン酸ナトリウム、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、ＥＨＳマウ
ス腫瘍可溶化抽出物等が例示できるが、Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶ型コラーゲンが最も好ましい。
高分子であるＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、ゼ
ラチン、アルギン酸ナトリウム、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、ＥＨＳマウ
ス腫瘍可溶化抽出物等が例示できるが、Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉ、ＩＶ型コラーゲンが最も好ましい。
【００１１】かかるスポンジの製造方法としては、これ
までに多くの方法が開示されているが、例えば一つの方
法として特開平５−４３７３４号公報に開示されている
ように、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有
機溶媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空
凍結乾燥して得る方法等がある。なおこの方法によれ
ば、均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得
ることができる。本発明を構成するスポンジにおいて
は、かかる製造方法をはじめ、この他にも既に報告され
ているスポンジ製造方法も利用することができる。
までに多くの方法が開示されているが、例えば一つの方
法として特開平５−４３７３４号公報に開示されている
ように、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有
機溶媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空
凍結乾燥して得る方法等がある。なおこの方法によれ
ば、均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得
ることができる。本発明を構成するスポンジにおいて
は、かかる製造方法をはじめ、この他にも既に報告され
ているスポンジ製造方法も利用することができる。
【００１２】次に、前記化学的性質としては、例えば架
橋度を挙げることができる。前記スポンジに例えば生体
親和性高分子のコラーゲンを用いた場合、かかるコラー
ゲンスポンジは細胞の分泌するコラゲナーゼにより分解
作用を受け消失してしまう。しかしながら、前記コラー
ゲンスポンジに何らかの架橋を導入することにより前記
コラゲナーゼに対する耐性を付与することができ、更に
かかる耐性は架橋度によってコントロールすることがで
きる。従って、例えば空孔径の異なる二種のコラーゲン
スポンジの一方に高度の架橋を導入し、もう一方に低度
の架橋を導入した組織培養用基材を用いて培養を行う
と、一定時間後、一方のコラーゲンスポンジのみ、即ち
低度の架橋を導入した方のコラーゲンスポンジのみを分
解消失させることができる。更に、低度に架橋するコラ
ーゲンスポンジの架橋条件を適宜選択することにより、
所望の消失速度を有するコラーゲンスポンジを得ること
ができる。
橋度を挙げることができる。前記スポンジに例えば生体
親和性高分子のコラーゲンを用いた場合、かかるコラー
ゲンスポンジは細胞の分泌するコラゲナーゼにより分解
作用を受け消失してしまう。しかしながら、前記コラー
ゲンスポンジに何らかの架橋を導入することにより前記
コラゲナーゼに対する耐性を付与することができ、更に
かかる耐性は架橋度によってコントロールすることがで
きる。従って、例えば空孔径の異なる二種のコラーゲン
スポンジの一方に高度の架橋を導入し、もう一方に低度
の架橋を導入した組織培養用基材を用いて培養を行う
と、一定時間後、一方のコラーゲンスポンジのみ、即ち
低度の架橋を導入した方のコラーゲンスポンジのみを分
解消失させることができる。更に、低度に架橋するコラ
ーゲンスポンジの架橋条件を適宜選択することにより、
所望の消失速度を有するコラーゲンスポンジを得ること
ができる。
【００１３】本発明を構成する前記スポンジに架橋を導
入するには、例えば熱脱水架橋、化学架橋等により実施
される。化学架橋に用いる架橋剤としては、グルタルア
ルデヒド、ホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、
ヘキサメチレンジイソシアナート、トリレンジイソシア
ナートのようなジイソシアナート類、エチレングリコー
ルジグリシジルエーテルのようなエポキシ類、更にはカ
ルボジイミド塩酸塩等が適用できるが、好ましくはグル
タルアルデヒドである。
入するには、例えば熱脱水架橋、化学架橋等により実施
される。化学架橋に用いる架橋剤としては、グルタルア
ルデヒド、ホルムアルデヒドのようなアルデヒド類や、
ヘキサメチレンジイソシアナート、トリレンジイソシア
ナートのようなジイソシアナート類、エチレングリコー
ルジグリシジルエーテルのようなエポキシ類、更にはカ
ルボジイミド塩酸塩等が適用できるが、好ましくはグル
タルアルデヒドである。
【００１４】以上のように物理的性質及び／又は化学的
性質の異なるスポンジを適宜組み合わせることにより、
所望の構造を持つ組織培養用基材を得ることができる。
以下、ヒト皮膚モデルの作製の場合を例示して更に詳述
する。まず、一方のスポンジの孔径を５０μｍ以上、好
ましくは８０〜９５μｍ、厚みを１〜５ｍｍになるよう
に調整し、更にかかるスポンジに高度の架橋、例えば化
学架橋を導入する。これにヒト真皮繊維芽細胞を播種す
ると、かかる繊維芽細胞はスポンジ内に落ち込んでその
孔内で三次元的に増殖し、しかも高度の架橋が導入され
ているため該スポンジの分解消失も起こらない。この上
に孔径３０μｍ以下、好ましくは５〜２０μｍ、厚み１
〜２ｍｍのもう一方のスポンジに低度の架橋、例えば熱
脱水架橋を導入したものを重ね、ヒト表皮角化細胞を播
種する。かかる角化細胞はスポンジ内に落ち込むことな
くスポンジ表面で増殖する。
性質の異なるスポンジを適宜組み合わせることにより、
所望の構造を持つ組織培養用基材を得ることができる。
以下、ヒト皮膚モデルの作製の場合を例示して更に詳述
する。まず、一方のスポンジの孔径を５０μｍ以上、好
ましくは８０〜９５μｍ、厚みを１〜５ｍｍになるよう
に調整し、更にかかるスポンジに高度の架橋、例えば化
学架橋を導入する。これにヒト真皮繊維芽細胞を播種す
ると、かかる繊維芽細胞はスポンジ内に落ち込んでその
孔内で三次元的に増殖し、しかも高度の架橋が導入され
ているため該スポンジの分解消失も起こらない。この上
に孔径３０μｍ以下、好ましくは５〜２０μｍ、厚み１
〜２ｍｍのもう一方のスポンジに低度の架橋、例えば熱
脱水架橋を導入したものを重ね、ヒト表皮角化細胞を播
種する。かかる角化細胞はスポンジ内に落ち込むことな
くスポンジ表面で増殖する。
【００１５】上記のように低度に架橋を導入したスポン
ジの孔径は、かかるスポンジに播種する細胞の種類にも
よるが、孔径が１μｍより小さいと、培養液中の水分や
養分が自由に通過できなくなり、かかるスポンジ上に存
在している細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう
ため好ましくない。また、孔径が３０μｍより大きい
と、細胞はスポンジ表面に固定されない。この低架橋と
して、例えば１０５℃、２４時間の条件で熱脱水架橋を
行ったものは、ＤＭＥ＋５％血清培地で培養すると５日
目までには分解消失する。上記のように、低度に架橋さ
れる方のスポンジは、播種されたヒト角化細胞が落ち込
んでしまうのを防止すること、即ちヒト角化細胞に足場
を与えるという効果を奏することはもちろん、更に低度
に架橋されているため、ヒト角化細胞を播種する際には
その足場を与え、所望の期間ヒト角化細胞を培養して安
定した後、分解吸収され消失するという効果をも奏する
のである。このようにヒト角化細胞が安定した後、実際
の皮膚には存在しないスポンジが消失するため、実物の
皮膚により近いものが得られる。
ジの孔径は、かかるスポンジに播種する細胞の種類にも
よるが、孔径が１μｍより小さいと、培養液中の水分や
養分が自由に通過できなくなり、かかるスポンジ上に存
在している細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう
ため好ましくない。また、孔径が３０μｍより大きい
と、細胞はスポンジ表面に固定されない。この低架橋と
して、例えば１０５℃、２４時間の条件で熱脱水架橋を
行ったものは、ＤＭＥ＋５％血清培地で培養すると５日
目までには分解消失する。上記のように、低度に架橋さ
れる方のスポンジは、播種されたヒト角化細胞が落ち込
んでしまうのを防止すること、即ちヒト角化細胞に足場
を与えるという効果を奏することはもちろん、更に低度
に架橋されているため、ヒト角化細胞を播種する際には
その足場を与え、所望の期間ヒト角化細胞を培養して安
定した後、分解吸収され消失するという効果をも奏する
のである。このようにヒト角化細胞が安定した後、実際
の皮膚には存在しないスポンジが消失するため、実物の
皮膚により近いものが得られる。
【００１６】なお、本発明を構成する組織培養法では、
播種、培養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞
に限定されるものではなく、これら以外にも適宜の各種
動物細胞を播種、培養することができる。
播種、培養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞
に限定されるものではなく、これら以外にも適宜の各種
動物細胞を播種、培養することができる。
【００１７】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【実施例１】 培養皮膚の作製 （１）高架橋スポンジの作製 ３ｍｇ／ｍｌに希釈したＴｙｐｅＩコラーゲン溶液５０
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に、真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、
１０５℃で２４時間熱脱水架橋を加えた後、０．２％グ
ルタルアルデヒド溶液に２４時間浸漬することにより化
学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥して孔径９０μ
ｍ、厚さ３ｍｍの高架橋コラーゲンスポンジを得た。
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に、真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、
１０５℃で２４時間熱脱水架橋を加えた後、０．２％グ
ルタルアルデヒド溶液に２４時間浸漬することにより化
学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥して孔径９０μ
ｍ、厚さ３ｍｍの高架橋コラーゲンスポンジを得た。
【００１８】（２）低架橋スポンジの作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンをエ
タノールで希釈し、０．２８５％コラーゲン、１０％エ
タノール水溶液とした。更に、この溶液を直径９ｃｍの
シャーレに１０ｇ流し込み、−１３５℃で凍結し、真空
度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の
条件で凍結乾燥を行い、更に真空減圧下（０．０１ｍｍ
Ｈｇ）、１０５℃で２４時間熱脱水架橋して、孔径３０
μｍ、厚さ１ｍｍの低架橋コラーゲンスポンジを得た。
タノールで希釈し、０．２８５％コラーゲン、１０％エ
タノール水溶液とした。更に、この溶液を直径９ｃｍの
シャーレに１０ｇ流し込み、−１３５℃で凍結し、真空
度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の
条件で凍結乾燥を行い、更に真空減圧下（０．０１ｍｍ
Ｈｇ）、１０５℃で２４時間熱脱水架橋して、孔径３０
μｍ、厚さ１ｍｍの低架橋コラーゲンスポンジを得た。
【００１９】（３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に、（１）で作製した高
架橋コラーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）か
ら購入したヒト繊維芽細胞をＭＥＭ＋１０％血清培地に
懸濁し、このスポンジ上に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次に、このスポンジ上
に（２）で作製した低架橋コラーゲンスポンジを重ね、
クラボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ培地
に懸濁し、この低架橋コラーゲンスポンジ上に５．０×
１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全
に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次
に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレートから取り
出し、６ウェル培養プレートに移した後、培地をＤＭＥ
＋５％血清培地に変更した。ヒト角化細胞が空気中に出
るように培養液の量を調整しながら５日間培養を続けた
後、所望の培養皮膚を得た。なお、上記した高架橋コラ
ーゲンスポンジ、低架橋コラーゲンスポンジとは、それ
ぞれ高度に架橋したコラーゲンスポンジ、低度に架橋し
たコラーゲンスポンジのことである。また、培養状態を
模式的に表したものを図１に示す。図中１は高架橋コラ
ーゲンスポンジ、２はヒト繊維芽細胞、３は低架橋コラ
ーゲンスポンジ、４はヒト角化細胞、５は培地、６は培
養プレートである。
架橋コラーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）か
ら購入したヒト繊維芽細胞をＭＥＭ＋１０％血清培地に
懸濁し、このスポンジ上に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次に、このスポンジ上
に（２）で作製した低架橋コラーゲンスポンジを重ね、
クラボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ培地
に懸濁し、この低架橋コラーゲンスポンジ上に５．０×
１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全
に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次
に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレートから取り
出し、６ウェル培養プレートに移した後、培地をＤＭＥ
＋５％血清培地に変更した。ヒト角化細胞が空気中に出
るように培養液の量を調整しながら５日間培養を続けた
後、所望の培養皮膚を得た。なお、上記した高架橋コラ
ーゲンスポンジ、低架橋コラーゲンスポンジとは、それ
ぞれ高度に架橋したコラーゲンスポンジ、低度に架橋し
たコラーゲンスポンジのことである。また、培養状態を
模式的に表したものを図１に示す。図中１は高架橋コラ
ーゲンスポンジ、２はヒト繊維芽細胞、３は低架橋コラ
ーゲンスポンジ、４はヒト角化細胞、５は培地、６は培
養プレートである。
【００２０】以上のようにして得た培養皮膚をホルマリ
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、ヒト
繊維芽細胞２は高架橋コラーゲンスポンジ１中で三次元
的によく伸展していた。一方、気液界面培養開始後１日
目には低架橋コラーゲンスポンジ３はほぼ消失してヒト
角化細胞が数層に重なっていた。更に、３日目には気相
に近い面からヒト角化細胞の分化が始まり、５日目には
層数が１０程度で、よく分化した実際のヒト皮膚に非常
によく似た形態が得られた。
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、ヒト
繊維芽細胞２は高架橋コラーゲンスポンジ１中で三次元
的によく伸展していた。一方、気液界面培養開始後１日
目には低架橋コラーゲンスポンジ３はほぼ消失してヒト
角化細胞が数層に重なっていた。更に、３日目には気相
に近い面からヒト角化細胞の分化が始まり、５日目には
層数が１０程度で、よく分化した実際のヒト皮膚に非常
によく似た形態が得られた。
【００２１】
【発明の効果】本発明は、以上説明したように異種ある
いは同種の細胞を分離して培養するだけでなく、それぞ
れに適した条件で同時に培養することにより、所望の三
次元構造を持つ組織培養物が得られ、特により完全にヒ
ト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しかも短
期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺激
性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適し、更に全層
を失う火傷等の治療に用いることができる。
いは同種の細胞を分離して培養するだけでなく、それぞ
れに適した条件で同時に培養することにより、所望の三
次元構造を持つ組織培養物が得られ、特により完全にヒ
ト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しかも短
期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺激
性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適し、更に全層
を失う火傷等の治療に用いることができる。
【図１】本発明における培養状態を模式的に示した断面
図である。
図である。
１ 高架橋コラーゲンスポンジ ２ ヒト繊維芽細胞 ３ 低架橋コラーゲンスポンジ ４ ヒト角化細胞 ５ 培地 ６ 培養プレート
Claims (9)
- 【請求項１】 物理的性質及び／又は化学的性質の異な
る二種のスポンジからなることを特徴とする組織培養用
基材。 - 【請求項２】 前記物理的性質が空孔径であることを特
徴とする請求項１に記載の組織培養用基材。 - 【請求項３】 前記化学的性質が架橋度であることを特
徴とする請求項１又は請求項２に記載の組織培養用基
材。 - 【請求項４】 前記スポンジが生体親和性高分子である
ことを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の組織培
養用基材。 - 【請求項５】 前記生体親和性高分子がコラーゲンであ
ることを特徴とする請求項４に記載の組織培養用基材。 - 【請求項６】 物理的性質及び／又は化学的性質の異な
る二種のスポンジからなる組織培養用基材を用いる組織
培養法であって、一方のスポンジ上に細胞を播種、培養
した後、かかるスポンジに他方のスポンジを重ね、更に
細胞を播種、培養することを特徴とする組織培養法。 - 【請求項７】 前記細胞が互いに異なる細胞であること
を特徴とする請求項６に記載の組織培養法。 - 【請求項８】 前記互いに異なる細胞が角化細胞と繊維
芽細胞であることを特徴とする請求項７に記載の組織培
養法。 - 【請求項９】 前記物理的性質及び／又は化学的性質の
異なる二種のスポンジの少なくとも一方が、培養中に分
解消失することを特徴とする請求項６乃至請求項８に記
載の組織培養法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26304794A JP2858087B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | 組織培養用基材及び組織培養法 |
| EP20030015613 EP1361265B1 (en) | 1994-09-19 | 1995-09-19 | Method for fixing cultured tissue and artificial skin affixed thereby |
| DE1995634869 DE69534869T2 (de) | 1994-09-19 | 1995-09-19 | Matrix für Gewebekultur, Verfahren zum Züchten von Gewebe, Verfahren zur Befestigung von gezüchtetem Gewebe und befestigte Kunsthaut |
| DE69535992T DE69535992D1 (de) | 1994-09-19 | 1995-09-19 | Verfahren zum Fixieren von kultiviertem Gewebe und fixierte Kunsthaut |
| EP19950114741 EP0702081B1 (en) | 1994-09-19 | 1995-09-19 | Matrix for tissue culture, method for culturing tissue, method for fixing cultured tissue and artificial skin fixed |
| US08/858,905 US6051425A (en) | 1994-09-19 | 1997-05-19 | Method for producing tissue formation and tissue culture kit |
| US09/479,036 US6300128B1 (en) | 1994-09-19 | 2000-01-07 | Method for fixing cultured tissue and artificial skin fixed |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26304794A JP2858087B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | 組織培養用基材及び組織培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889239A true JPH0889239A (ja) | 1996-04-09 |
| JP2858087B2 JP2858087B2 (ja) | 1999-02-17 |
Family
ID=17384129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26304794A Expired - Lifetime JP2858087B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | 組織培養用基材及び組織培養法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6051425A (ja) |
| EP (2) | EP1361265B1 (ja) |
| JP (1) | JP2858087B2 (ja) |
| DE (2) | DE69534869T2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10136977A (ja) * | 1996-11-11 | 1998-05-26 | Toyobo Co Ltd | 組織付属器官様構造体を含む人工組織およびその製造方法 |
| JP2000125855A (ja) * | 1998-10-21 | 2000-05-09 | Gunze Ltd | 人工皮膚 |
| JP2004331793A (ja) * | 2003-05-07 | 2004-11-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 凹凸を有するハニカム構造体フィルム |
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