JPS62500435A - 真皮代替物表面の表皮化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 −ｔ−１の表１ 技１じＹ近一 本発明は生物学及び医学の分野に含まれるものであり、特にヒトのはく随したま たは損傷した皮膚の補充に用いることのできる生きた皮膚代替物の製造に関する 。

【木攻肢 １９８２年５月２６日に出願された、米国特許出願節３８１．９７８号は生きた 組織代替物を形成する方法を述べている。このような生きた組織代替物は水和コ ラーゲン格子をインビトロで形成することによって製造される。このような格子 は、格子に収縮剤を含有させることにより収縮させて、生きた組織代替物とする 。

収縮剤の例には線維芽細胞と血小板がある。

米国特許出願節３８１．９７８号に述べられている皮膚代替物は、水和コラーゲ ン格子を収縮剤によって収縮させて形成した真皮代替物をケラチン産生細胞で覆 うことによって製造される。このような皮膚代替物はその基本組織が皮膚の基本 組織と似ており、またその生きた細胞成分が移植片受容予定者によっても提供さ 本発明は、米国特許出願節３８１．９７８号に開示されている方法を変更するこ とによって、皮膚代替物を形成することができるという発見に基づくものである 。この変更した方法では、皮膚のパンチ生検材料をケラチン産生細胞の供給源と して真皮代替物に含有させる。このような方法が、ケラチン産生細胞による真皮 代替物上での良好な過増殖をもたらすことが今回発見された。

ケラチン産生細胞を供給する手段としてパンチ生検材料を用いることは、真皮代 替物をケラチン産生細胞で覆うという既に行われている方法を凌駕する利点を多 くの場合に示す。このような利点には、かなり短期間に分化した表皮が形成され うるという事実がある。さらに、例えば２ｕ程度の、皮膚の小さなパンチ生検材 料を用いて、例えば１　ｃｍ２（５０倍の倍率）のような大きな面積を覆うこと ができる。このような方法によって製造した移植片の面積は、多くのパンチ生検 材料を真皮代替物に挿入することができるため、大きくなり得る。このようなパ ンチ生検材料は真皮代替物が形成される時点で、または形成されてから挿入する ことができる。

パンチ生検材料の過増殖自体は、ケラチン産生細胞のみが真皮代替物上で過増殖 するので、選択プロセスである。過増殖は樹状突起細胞に関係なく行われる。

パンチ生検材料の使用によって形成される皮膚代替物自体もさらに別な皮膚代替 物の製造に有用な物質の供給源を提供する。

換言すると、皮膚代替物からのパンチ生検材料を他の皮膚代替物の製造に用いる ことができる。

得られた実験結果から、皮膚のパンチ生検材料を用いた皮膚代替物から発達した 角質層は正常な角質層に非常に類似しているように思われる。

多くの場合に、皮膚のパンチ生検材料を用いると真皮／表皮の接着が、すでに用 いられている被覆方法に比べて改良されるように思われる。

パンチ生検付斜方法は皮膚代替物への他の細胞の適用にも良好に適している０例 えば、パンチ生検材料から生ずるケラチン産生細胞が過増殖する前にメラノサイ トと呼ばれる色素細胞を真皮代替物の露出した表面に塗布しておくことができる 。ケラチン産生細胞は真皮代替物上に細胞の連続層を形成する際に、メラノサイ トを被覆することが実験的に判明している。メラノサイトは機能的になり、ケラ チン産生細胞層に色素に与える。

真皮代替物の表面を表皮化するためにパンチ生検材料を使用する方法によれば、 皮膚代替物を直接治療的に臨床使用することも可能になる。真皮代替物は凍結保 存することができ、表面化のためにいつでもパンチ生検材料を受け入れることが できる。

この方法は真皮／表皮相互作用の量的研究と薬理学的試験を行うためにも非常に 便利である。

図面の簡単な説明 第１図は本発明によって製造した皮膚代替物の写真であり、第２図は本発明によ る皮膚代替物の移植片受容予定者への貼布を説明する写真である。

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本発明の方法は米国特許出願節３８１，９７８号に述べられている方法による皮 膚代替物の製造に用いる基本的方法の変更である。

従って、米国特許出願節３８１，９７８号に皮膚代替物の製造に関して述べられ ていることは参照によりこの出願に含まれる。

米国特許出願節３８１，９７８号の方法を次に簡単に説明する。

ラットの尾部ｎ、ウシ皮膚コラーゲンまたはその他の材料がら得たコラーゲンを 用いて、水和コラーゲン格子を製造する。

コラーゲンの溶液を製造し、やや酸性の条件下に保存する。栄養培地と、線維素 形酸及びゲル形成を誘発し得るほどにｐＨを高める塩基と共に線維芽細胞または その他の収縮剤を加えることによって、格子が形成される。

収縮剤の１例である線維芽細胞はヒトの皮膚から、またはヒトもしくは動物の適 当な組織から得られる。細胞を含む格子を形成するための便利な方法は、酸性コ ラーゲン溶液を中和し、これにす早く細胞と栄養培地を加えることである。中和 すると、コラーゲン線維が形成され、線維芽細胞が格子ゲル中に均一に分散した 状態で格子がゲル化する。次に細胞をコラーゲン格子に付着させ、コラーゲン格 子を最初の大きさの画分に収縮させて、真皮代替物を形成するような条件下に、 細胞とコラーゲンを維持する。線維芽細胞以外に他の収縮剤も存在する。このよ うな収縮剤には、平滑筋細胞、横絞筋細胞及び心筋細胞がある。

他の収縮剤は、多くの場合に組織代替物移植予定者の血液から得られる血小板で ある。血小板は全血から血液成分を分離するための遠心分離または他の方法によ って、血液から分離される。

上述したように、ケラチン産生細胞の真皮代替物上での過増殖は、本発明による と、皮膚のパンチ生検材料を用いて達成される。このようなパンチ生検材料は例 えばマウス、ラットまたはヒトの皮膚から得られる。このような生検材料は、直 径が典型的には２１１１または４１１１の大きさである円筒状ステンレス鋼パン チを用いて得られる。パンチ生検材料は生理病理学的用途または治療用途に、現 在ヒト対象から日常的に採取されている。パンチによって採取した皮膚生検材料 は真皮代替物格子中の注入を行うときに含有させることができる。

真皮代替物の上面のレベルで表皮が拡がりながら成長するように、生検材料を配 置する。この生検材ｒ）は、周囲のコラーゲン格子が線維芽細胞または他の収縮 剤によって収縮するので、適当な位置に保持される。

真皮代替物の中央に生検材料を挿入すると、放射状に拡大増殖して真皮代替物を 被覆する。拡大増殖は、多層のケラチン産生細胞から成る円形シートとして生ず る。形態学的に正常な角質層をも含めて、表皮中にはく増殖先端に近い部位でさ えも）、ケラチン産生細胞分化の全ての相が認められる０分化した表皮の顆粒層 は、インビボの表皮に認められるような、顆粒（オドルンド（Ｏｄｌｕｎｄ）Ｗ ｉ粒）を被覆する膜を含む。正常な表皮分化は新たに形成された表皮の抽出物中 の６７にダルトンケラチンの存在によっても証明される。

ヒトまたは動物ドナーから採取したパンチ生検材料からの一次細胞が格子収縮前 の真皮代替物上で５．５ｃｍ直径に過増殖するには、典型的な場合に約１０日間 を要する。これとは対照的に、はより短期間で、例えば４〜７日間で被覆するが 、この被覆は必らずしも多層状ではなく、時には不完全である。

インビトロの皮膚代替物からパンチ生検材料を採取することによって、−次生検 材料からのケラチン産生細胞を継代培養した。これらの継代培養スターターを最 初のパンチ生検材料と同様に処理して、新たに注入した皮膚代替物中に包埋する 。Ｃａ＋濃度を０．Ｏ５Ｘ１０−３Ｍに減することによって、パンチからの表皮 増殖速度は加速されるが、分化とケラチン化をひき起すためには、１．５〜２． ０Ｘ１０−’ＭにＣａ＋濃度を高めることが必要である。

１つの実験系列では、全体で８０個の皮膚代替物をラット及びマウスの皮膚から のパンチ生検材料を用いて製造した。この半分は直径２．Ｏｘｘのパンチ生検材 料を用いて構成したものであり、他の半分は直径４ｗｘのパンチ生検材料による ものであった。

別の実験系列では、ヒト・ドナーの包皮からの２．０ｘｚパンチ生検材料を用い 、さらに他の実験系列では移植片受容予定者である、すなわち自己細胞によって 構成した皮膚代替物の受容予定者であるヒト・ドナーの大腿部位からのパンチ生 検材料を用いた。しかしながら、同種細胞を用いることもできる。

第１図は真皮代替物上に過増殖および拡大増殖するケラチン産生細胞の供給源と して役立つパンチ生検材料で構成された皮膚代替物の写真である。このパンチ生 検材料はヒト供給者から得た。各パンチ生検材料は放射状に拡大する表皮の存在 を意味する輪によって囲まれている。

第２図はヒト患者に貼布した皮膚代替物の写真である。

先１五Δ秤■１４ ここに述べた皮膚代替物はヒトまたは他の哺乳類の皮膚創傷の治療に適している 。これは特に大きい火傷の治療及び、皮膚補充物を必要とする遺伝的及びその他 の障害の治療に適切である。

均３」Ｕ肚 当業者はここに述べた特定の物質及び工程の他の均等物を認識することができる 、または全く慣用的な実験を用いて探知することができるであろう０次の請求の 範囲はこのような均等物も含むように意図するものである。

Ｆ／Ｇ、２ 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程： （ａ）コラーゲンの酸性溶液を形成する；（ｂ）収縮性細胞と栄養培地を前記コ ラーゲンの酸性溶液に加える； （ｃ）前記コラーゲン溶液のｐＨをコラーゲン線維が沈殿し得るほどのレベルに まで高めて、前記収縮性細胞を含む水和コラーゲン格子を形成させる； （ｄ）前記水和コラーゲン格子に１個以上の皮膚パンチ生検材料を加える； （ｅ）収縮性細胞が水和コラーゲン格子を収縮させて真皮代替物を形成し、前記 パンチ生検材料からのケラチン産生細胞が前記真皮代替物の表面で過増殖して皮 膚代替物を製造するために充分な条件下に、前記パンチ生検材料を含有する前記 水和コラーゲン格子を保持する； から成る皮膚代替物の製造方法。
2. ２．工程（ｂ）と（ｃ）を同時に実施する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．請求の範囲第１項または第２項記載の方法によって製造した皮膚代替物。
4. ４．次の工程： （ａ）生きた細胞からなる収縮剤を内部に含む水和コラーゲン格子を形成する； （ｂ）前記格子と前記収縮剤を収縮剤が前記コラーゲン格子を収縮させて生きた 真皮代替物を形成する条件下に維持する；（ｃ）前記真皮代替物上でケラチン産 生細胞を過増殖させる；及び （ｄ）前記真皮代替物を、前記生きた細胞からなる収縮剤と前記ケラチン産生細 胞とが増殖して、皮膚代替物を形成するために充分な条件下に維持する； を含む皮膚代替物の製造方法において、１個以上の皮膚パンチ生検材料を前記真 皮代替物中に付加し、パンチ生検材料を含む前記真皮代替物を前記皮膚生検材料 からのケラチン産生細胞が前記真皮代替物の表面上で過増殖するために充分な条 件下に維持することから成る改良を行う方法。
5. ５．次の工程： （ａ）生きた細胞からなる収縮剤を含む水和コラーゲン格子を形成する； （ｂ）提供者から１個以上のパンチ生検材料を採取する；（ｃ）提供者から採取 した前記パンチ生検材料を前記水和コラーゲン格子に加える； （ｄ）収縮剤細胞により水和コラーゲン格子を収縮させ、前記皮膚パンチ生検材 料からのケラチン産生細胞を前記水和コラーゲン格子の表面上で過増殖させて、 移植片受容予定者のための皮膚代替物を製造するために十分な条件下に、前記生 検材料を含む水和コラーゲン格子を維持する；そして（ｅ）前記皮膚代替物を前 記移植片受容予定者の創傷に貼布する； ことから成る移植片受容予定者の皮膚の創傷または疾患を治療する方法。
6. ６．前記移植片受容予定者がヒトである請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記提供者がヒトである請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記移植片受容予定者と前記提供者が同一人である請求の範囲第５項記載の 方法。
9. ９．前記収縮剤が線維芽細胞である請求の範囲第５項または第８項記載の方法。
10. １０．次の工程： （ａ）生きた細胞からなる収縮剤を内部に含む水和コラーゲン格子を形成する； （ｂ）前記収縮剤が前記コラーゲン格子を収縮させて、生きた真皮代替物を形成 するために充分な条件下に、水和コラーゲン格子と前記収縮剤を維持する； （ｃ）前記真皮代替物の表面上でケラチン産生細胞を増殖させて、皮膚代替物を 形成する； （ｄ）前記皮膚代替物から１個以上のパンチ生検材料を採取する； （ｅ）生きた細胞からなる収縮剤を含む新らたな水和コラーゲン格子に前記パン チ生検材料を加える；（ｆ）生きた細胞からなる収縮剤と前記パンチ生検材料を 含む前記の他の水和コラーゲン格子を、新らたな皮膚代替物を形成するために充 分な条件下に保持する；及び（ｇ）場合により工程（ｄ）〜（ｆ）をくり返して 、さらに別の皮膚代替物を製造する； ことから成る皮膚代替物の製造方法。