DE69615549T2

DE69615549T2 - Kunsthaut, enthaltend als träger bioverträgliche materialen aus hyaluronsäurederivaten

Info

Publication number: DE69615549T2
Application number: DE69615549T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Abatangelo; Lanfranco Callegaro; Carlo Soranzo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-25
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2016-04-26
Also published as: US6110208A; DE69615549D1; ATE206058T1; EP0822839A1; EP0822839B1; AU700762B2; IT1281870B1; DK0822839T3; ES2162052T3; PT822839E; JP3646882B2; ITPD950083A1; AU5647996A; ITPD950083A0; WO1996033750A1; CA2219272A1; JPH11503946A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft:
- eine künstliche menschlich Haut, gebildet aus einer vollständig differenzierten Epidermis und Hautanhang, und enthaltend als Träger zwei bioverträgliche Materialien, basierend auf Hyaluronsäure (HA)-Derivaten
- die Verfahren zum Herstellen dieser künstlichen menschlichen Haut,
- die Verwendung dieser künstlichen Haut in der Medizin und in der Chirurgie, als ein diagnostisches Mittel, und als ein Transportmittel zum Herstellen eines Medikaments zur kontrollierten Freisetzung.

Hintergrund der Erfindung

Hautverlust aufgrund von Trauma oder Krankheit wird normalerweise durch die autogene Transplantationstechnik, d. h. durch Ersetzen der fehlenden Haut mit Stücken, die aus Donorgebieten des gleichen Patienten entnommen werden, behandelt. Ein wichtiger Schritt vorwärts in der Behandlung solcher Verletzungen durch wiederherstellende Chirurgie wird dargestellt durch in vitro-Kulturen von Keratinozyten (kc) (J. Rheinwald und H. Green, Cell, 6 : 331, 1975), wobei man die Kulturen sich in vitro ausbreiten läßt, und Membranen von Epidermiszellen erhalten werden, die potentiell nützlich sind, um Hautwunden abzudecken. Diese Technik wurde häufig in der klinischen Praxis eingesetzt, hauptsächlich für Verbrennungspatienten (G. G. Gallico et al., M. Engl. J. Med., 311-448, 1984), aber Probleme tauchten schon gleich am Anfang auf, wie die Probleme solche Gewebe zu entnehmen, die Zerbrechlichkeit der Epithelschichten und die daraus folgende Schwierigkeit für den Chirurgen sie handzuhaben.
Ein anderer Ansatz wurde von Yannas et al. (Science, 215 : 174, 1982) gewählt, der resorbierbare poröse Materialien gebildet aus Copräzipitaten von Collagen und Glycosaminoglycanen (GAG), insbesondere Chondroitin-6- sulfat, bedeckt mit einer dünnen Schicht einer Silicon-Membran verwendete. Das Merkmal solcher Materialien ist, daß sie zufällig geformte, interkommunizierende Poren, ungefähr wie ein Schwamm, zeigen.
S. Boyce und J. Hansbrough (Surgery, 103-421, 1988) beschreiben wachsende kc auf der Oberfläche von Membranen, hergestellt aus Collagen und GAG, wobei die Oberflächenporosität des Materials reduziert wird. Um die Entwicklung von Epidermiskulturen auf der Membranoberfläche einzuschränken, wurde eine zusätzliche, nicht-poröse Lage eingefügt.
Hauttransplantationstechnik muß die Wechselwirkung zwischen kc, der Basalmembran und der darunterliegenden Dermis berücksichtigen. Heute wird normalerweise angenommen, daß Autotransplantationen im Falle von Verletzungen über die volle Dicke deutlich erleichtert werden können, indem man ein Hautbett in der Wunde unterhalb der Epithelschicht anordnet.
Die Basal-kc liegen daher auf einem physiologischeren Substrat und können einen Basalmembran und dermal-epidermale Verbindungsstrukturen, die in der Lage sind, dem Transplantat die notwendige Wiederstandsfähigkeit zu verleihen, entwickeln.
Neuere klinische Studien haben vorgeschlagen, daß die Cuono-Methode (Langdon et al. J. Invest. Dermatol. 91 5: 478, 1988), bei der eine Wunde über "die volle Dicke" mit einem Transplantat aus der Haut einer Leiche behandelt wird, zu besseren Ergebnissen in bezug auf den Prozentsatz der angenommenen Transplantate und die allgemeine Qualität der Haut beim Heilen führt.
Transplantate sind jedoch schwierig zu erhalten, teuer aufzubewahren und sind potentielle Träger von pathogenen Viren.
Es gibt eindeutig ein Bedürfnis nach reuen, bioabbaubaren, künstlichen Hautersatzstoffen, die diese Nachteile nicht haben, und die folgenden Anforderungen erfüllen:
1) ihre Oberfläche muß Adhäsion und Zellwachstum erlauben;
2) weder die Polymer selbst noch ihre Abbauprodukte sollen Entzündungen oder toxische Phänomene hervorrufen, wenn sie in vivo implantiert werden;
3) das Produkt soll in seinen drei Dimensionen vollständig reproduzierbar sein;
4) seine ideale Porosität ist 50%, was zu einer großen Oberfläche für Zell-Polymer-Wechselwirkungen, ausreichendem Volumen für die Ablagerung von extrazellulärer Matrix und nur geringen oder keinen Wanderungsbehinderungen während der in vitro-Kultur führt.
5) das Träger-Polymer sollte absorbiert werden, so bald das regenerierte Gewebe es nicht länger benötigt. In der Tat stellen fremde Körper in vivo eine große Gefahr der Infektion und/oder Entzündung dar.
In der Tat zeigen die bereits auf dem Markt oder in der Entwicklung befindlichen Produkte bestimmte Nachteile: ihr Abbau ist unkontrollierbar und stört den Wundheilungsprozeß, und begünstigt so Entzündungen. Außerdem verlangen diese Ersatzstoffe, daß die Epithelzellen dick auf dem Träger ausgesät werden und man sie über lange Zeit proliferieren läßt.
Einige Beispiele von Produkten, die zur Zeit bekannt sind und allgemein zu Verwendung für die Behandlung von schweren Verbrennungen empfohlen werden, sind:
1) Dermagraft®, entwickelt durch ALS (Kalifornien), in dem heterologe menschliche Fibroblasten auf einem schwammigen, resorbierbaren Material gebildet aus Polymilch-, Polyglycol- oder Polygalactosidsäure kultiviert werden.
Autologe kc werden auf diesen Materialien gesät:
2) GraftSkin®, hergestellt durch Organogenesis Inc. (Boston, USA), in dem heterologe menschliche Fibroblasten auf einem Collagen-basierten Substrat kultiviert werden;
3) AlloDerm®, hergestellt durch Life Cell Corp. (Texas, USA) und basierend auf Menschen/oder Schweinehaut, wobei die Basalmembran und die dermale Matrix intakt bleiben. Das Gewebe wird bei niedriger Temperatur (-80ºC) solange aufbewahrt bis es mit autologen Fibroblasten und kc ausgesät und dann in den Patienten transplantiert wird.
Diese und andere Produkte erlauben die in vitro-Wiederherstellung einer völlig funktionierenden dermoepidermalen Grenzfläche jedoch nicht.
Die Verwendung von Hyaluronsäure (HA)-Derivaten wurde auch (EPA 0216953) für die Herstellung geeigneter Produkte, insbesondere Membranen zum Unterstützen von menschlich kc-Wachstum (EPA 0462426) und nicht-gewebten Geweben (WO 93/11803) beschrieben. Abatangelo et al. (Wound Repair and Regeneration, Januar-März, S. 80, 1995) berichtet die Verwendung von nicht-gewebtem Gewebe, um gemischte Kulturen von menschlichen kc/Fibroblasten zu unterstützen. Ebenso war die Epithelschicht nicht homogen aufgrund der kc, die sich in den Zwischenräumen in dem nicht- gewebten Gewebe ansäen, und ihm damit eine ungleichmäßige Dicke verleihen. Der Abbau des hier betrachtenden Polymers liefert hauptsächlich Hyaluronsäure (HA), das ein normaler Bestandteil der extrazellulären Matrix ist, und daher den Vorteil hat mittels der normalen Zellmechanismen metabolisiert zu werden.
Die chemischen Modifikationen erlauben dem Produkt, deutlich länger an der Stelle des Transplantats zu bleiben, als mit dem natürlichen Polymer möglich ist, und die Rezeptor-Wechselwirkungen bleiben während dieser Zeit erhalten. In dieser Hinsicht muß daran gedacht werden, daß der Hauptrezeptor für HA, bekannt als CD44, normalerweise im Epithelgewebe exprimiert wird, insbesondere in den Basal- und Stachelschichten der Epidermis, während die Expression des Proteins in den oberen Schichten allmählich abnimmt, bis sie in den vollständig differenzierten kc verschwindet (Carter et al., J. Cell Biol. 113207, 1991). Außerdem ist die Rolle des CD44 im HA-Abbaumechanismus gut dokumentiert (Culty et al., J. Cell. Biol. 111 : 2765, 1990; Underhill, Dev. Biol. 155 : 324, 1993).
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist eine künstliche menschliche Haut, die sowohl die Epidermis- als auch die Dermisschicht der natürlichen simuliert, in der sowohl Fibroblasten als auch Keratinozyten (kc) vorhanden sind, beide Zelltypen aktiv proliferieren und an der Grenzfläche, durch eine Protein-extrazelluläre Matrix, die die Eigenschaften einer dermoepidermalen Grenzfläche hat, getrennt sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelderin hat daher unerwarteterweise die erfindungsgemäße künstliche menschliche Haut entdeckt, die umfaßt:
a) eine mikroperforierte Membran, basierend auf einem Hyaluronsäure-Derivat, auf dem Keratinozyten gesät und kultiviert wurden,
b) einem darunterliegenden nicht-gewebten Gewebe, basierend auf einem Hyaluronsäure-Derivat, in dem Fibroblasten gesät und proliferieren gelassen wurden.
Die erfindungsgemäße künstliche Haut umfaßt im allgemeinen weiter eine extrazelluläre Protein-Matrix, enthaltend Proteine der dermoepidermalen Grenzfläche, angeordnet an der Grenzfläche zwischen Keratinozyten und Fibroblasten.
Aufgrund seiner Bioabbaubarkeit, die auch ein Ergebnis des vorher genannten Rezeptormechanismus sein kann, wird die künstliche menschliche Haut spontan innerhalb einer gegebenen Zeit absorbiert, und läßt nur das neu gebildete Gewebe an der Verletzungsstelle zurück.
Daher kann die erfindungsgemäße künstliche menschliche Haut vorteilhaft in der Medizin und Chirurgie verwendet werden.
Zusätzlich kann die künstliche menschlich Haut vorteilhaft als ein Transportmittel zum Herstellen eines Medikaments zur kontrollierten Freisetzung, enthaltend mindestens einen aktiven Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus biologisch aktiven Verbindung, Proteinen, Peptiden und Mischungen davon, wobei der aktive Wirkstoff an die Fasern des nicht- gewebten Gewebes und/oder an die mikroperforierte Membran adsorbiert wird.
Zusätzlich ist es möglich, künstliche Haut als ein diagnostisches Mittel für in vitro-Tests zum Überprüfen der möglichen toxischen Wirkungen von Produkten und/oder Substanzen, die dazu bestimmt sind, in Kontakt mit der Haut angeordnet zu werden und im chemischen, pharmazeutischen, kosmetischen und landwirtschaftlichen Gebiet eingesetzt zu werden, zu verwenden.
Die künstliche Haut kann auch vorteilhaft auf dem kosmetischen Gebiet, insbesondere für Haartransplantate verwendet werden.
Tatsächlich können dermale Haarfollikel-Fibroblasten zusammen mit aus der gleichen Region isolierten Keratinozyten verwendet werden, um eine organtypische Kultur aufzubauen, die die Merkmale des "in vivo" Herkunftsgebiets zeigt, wie in "Human Hair Follicle Germinative Epidermal Cell Culture" Amanda J. Reynolds et al. Rapid Communication, S. 634-638 beschrieben.
Letztlich ist ein weiterer Vorteil der künstlichen menschlichen Haut, daß sie bei -80ºC eingefroren oder in flüssigen Stickstoff gegeben und gelagert werden kann, so daß eine Gewebebank aufgebaut werden kann, die sofortige Transplantationen erlaubt, wann immer und wo immer sie benötigt werden, das das Produkt auf diese Weise ständig verfügbar sein kann, auch in Zentren, die nicht auf dermoepidermale Kulturen spezialisiert sind.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand liegt in den Verfahren zum Herstellen der menschlichen künstlichen Haut.
Insbesondere das erste Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
i) Ansäen von Keratinozyten-Kulturen mit einer Dichte, die sich von 1 000 bis 100 000 Zellen/cm² erstreckt, auf der mikroperforierten Membran und Ausbreiten der kc auf der Membran. Die herkömmliche Kulturtechnik, die die Verwendung von fötalem Kalbserum (FCS) umfaßt, wird befolgt bis teilweise oder vollständige Konfluens erreicht wird.
ii) Kultivieren der Fibroblasten, die aus der Epidermis oder aus anderen Bereichen mittel gewöhnlicher Techniken isoliert wurden, in DMEM enthaltend 10% fötales Kalbserum, Konditionieren dieser Fibroblasten, um zuerst zu proliferieren, indem man sie auf Plastik ansät, und dann Säen der Fibroblasten in dem nicht-gewebten Gewebe und Fortsetzen der Kultur bis zum Einfrieren, (falls die erhaltene künstliche Haut konserviert werden muß) oder bis zum Transplantieren,
iii) Legen der gebildeten Epithelschicht auf die mikroperforierte Membran auf dem nicht-gewebten Gewebe, das mit Fibroblasten kolonisiert ist, wobei man aufpaßt, daß der äußere Rand der mikroperforierten Membran nicht den Hoden der Schale berührt und daß er sich etwas über das darunterliegende nicht-gewebte Gewebe hinaus erstreckt,
iv) optional Zusammenfixieren der Epithel-Zellschicht auf der mikroperforierten Membran mit dem darunterliegenden nicht-gewebten Gewebe, das mit Fibroblasten kolonisiert ist, mittels biologischer Klebstoffe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Collagen, Fibrin, Fibrinkleber.
v) Zugeben eines ausreichenden Volumens des gleichen Mediums wie in Schritt (i) verwendet, Eingetauchtlassen der Kultur, so daß die Keratinozyten der oberen Schicht der mikroperforierten Membran an der Luft- Flüssigkeitsgrenzfläche sind, Zugeben von Ascorbinsäure mit einer Konzentration gleich 1 ug/ml bei dem ersten und folgenden Wechseln des Mediums, Fortsetzen der Kultur bis zum Transplantieren oder Einfrieren.
Es ist bekannt, daß Keratinozyten in einem Medium frei von fötalem Kalbserum und Feederschicht von murinen Fibroblasten kultiviert werden können, so daß die künstliche Haut, die der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, mittels dem simultanen Säen von menschlichen Fibroblasten in dem nicht-gewebten Gewebe und von Keratinozyten auf der Membran erhalten werden kann. In diesem Fall wird ein "chemisch definiertes" Medium verwendet, das für das Keratinozyten-Wachstum geeignet ist. In diesem Fall umfaßt das Verfahren die folgenden Sehritt:
i') Säen der Fibroblasten in dem nicht-gewebten Gewebe und Fortsetzen der Kultur bis zum Einfrieren oder Transplantieren,
ii') Legen der mikroperforierten Membran auf das nicht-gewebte Gewebe, wobei sich ihre Ränder etwas über diejenigen des darunterliegenden Gewebes heraus erstrecken und Fixieren der Membran mit den in dem vorherigen Verfahren verwendeten biologischen Klebern oder mittels mechanischer Mittel,
iii') Säen der Keratinozyten auf der mikroperforierten Membran, Ausbreiten der Keratinozyten unter Verwenden des "chemisch definierten" Mediums, das für das Keratinozyten-Wachstum auf Plastikschalen geeignet ist, bis Konfluens erreicht wird,
iv') Zugeben eines ausreichenden Volumens des in dem vorhergehenden Schritt verwendeten Mediums, Eingetauchtlassen der Kulturen, so daß die Keratinozyten auf der oberen Schicht der mikroperforierten Membran an der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche sind, Zugeben von Ascorbinsäure mit einer Konzentration gleich 1 ug/ml bei dem ersten und folgenden Wechseln des Mediums, Fortsetzen der Kultur bis zum Transplantieren.
Die obigen erfindungsgemäßen Verfahren umfassen einen weiteren Schritt bestehend aus Cryo-Konservieren der künstlichen Haut in Anwesenheit eines Cryo-Konservierungsmittels, wenn die Haut konserviert werden muß.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt Hämatoxylin- und Eosin-Färbung einer 15 Tage alten gemischten dermal-epidermalen Kultur. Kcs sind durch die Laserskin®-Membran bis zum nicht-gewebten Gewebe, in das Fibroblasten-Zellen (x 100) eingebettet sind, gewandert.
Fig. 2 zeigt die Immunhistochemie der gemischten Kultur, untersucht mit einem Antiinvolucrin-Antikörper, die äußere Epithelschicht erleidet Keratinisierung (· 200).
Fig. 3 zeigt die Immunhistochemie der gemischten Kultur, untersucht mit Anti-KL4 (Gesamtkeratin)-Antikörper, einem klassischen kc-Marker (· 200).
Fig. 4a zeigt die Immunhistochemie der gemischten Kultur, die die Expression der β4 Integrin-Untereinheit zeigt, die hauptsächlich in der Basal-kc-Zellschicht gefunden wird (· 100).
Fig. 4b zeigt die Immunhistochemie der gemischten Kultur, die die β1 Integrin-Untereinheit zeigt, die hauptsächlich an den Interzellularbrücken exprimiert werden, die die Epithel-Zellen verbinden (· 100).
Fig. 5 zeigt die Immunlokalisation der basalen kc, die den CD44- Rezeptor exprimieren (· 200).
Fig. 6 zeigt die Immunhistochemie der gemischten Kulturen, die Basis-Membran-ähnliche Zonen zeigen, wie aufgrund des Ausmaßes der Laminin- Ablagerung gesehen werden kann (· 200).

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Epithelschicht wird durch Säen von menschlichen kc auf eine mikroperforierte Membran wiederhergestellt, die gemäß US 5 326 356 hergestellt ist, die durch das Zitat eingefügt ist, während die menschlichen Fibroblasten auf einem Material kultiviert werden, das als nicht-gewebtes Gewebe bekannt ist, wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/11803 beschrieben, die hiermit durch das Zitat eingefügt ist.
Das sowohl zum Herstellen der mikroperforierten Membran als auch des nicht-gewebten Gewebes verwendete Hyaluronsäure-Derivat ist bevorzugt ein Ester von Hyaluronsäure. Bevorzugt haben diese Ester einen Prozentsatz an Veresterung zwischen 75% und 100%. Durch Variieren des Prozentsatzes an Veresterung des verwendeten Hyaluronsäureesters ist es möglich, die Abbaukinetik des Gewebeträgers zu kontrollieren und deshalb die Länge der Zeit, die die Vorrichtung in situ bleiben kann. Die bevorzugten Hyaluronsäureester sind die Benzylester von Hyaluronsäure.
Die mikroperforierten Membranen aus Hyaluronsäurebenzylester sind insbesondere bereits kommerziell erhältlich unter der Marke Laserskin®.
Sowohl Fibroblasten als auch Keratinozyten sind von menschlichem Ursprung oder von einer Spezies, die kompatibel ist, wenn sie in Menschen transplantiert wird.
Wenn beide Zellarten von menschlichen Ursprung sind, können sie heterologe, autologe oder eine Kombination dieser beiden Typen sein.
Wie vorhergehend herausgestellt, kann die erfindungsgemäße menschlich künstliche Haut vorteilhaft in der Medizin und Chirurgie eingesetzt werden.
Tatsächlich ist der endgültige Ausgang des Wundheilungsprozesses deutlich verbessert, insbesondere in Fällen von:
1) tiefen Verbrennungen II. und III. Grades.
2) verschiedenen Arten von Geschwüren: diabetische, venöse, Durchliegen;
3) plastischer Chirurgie.
In der Tat reduziert eine physiologische Abdeckung für diese Art von Verletzungen, obwohl hergestellt aus heterologen Zellen, das Risiko von Infektionen oder übermäßigem Verlust von organischen Flüssigkeiten. Außerdem sekregieren die proliferierenden Zellen in dem dermalen Bett Substanzen (noch immer teilweise unbekannte) wie Wachstumsfaktoren und Cytokine, die den Wundheilungsprozeß beschleunigen.
Außerdem kann die erfindungsgemäße Haut für die Behandlung von Krankheiten, die durch Melaninmangel gekennzeichnet sind, wie Vitiligo verwendet werden.
In diesem Fall enthält die erfindungsgemäße künstliche menschliche Haut einen Anteil an Melanozocyten, die mittels der gleichen Haut an Patienten, die durch Vitiligo befallen sind, transplantiert werden.
Die künstliche menschliche Haut kann insbesondere auch in der Gen- Therapie eingesetzt werden, wobei die Zellen eines Patienten (kc, Fibroblasten oder beide) genetisch modifiziert werden, z. B. um kongenitale Fehlbildungen und/oder metabolische Defekte zu korrigieren.
Wenn die erfindungsgemäße menschliche künstliche Haut als ein Transportmittel zum Herstellen von Medikamenten zur kontrollierten Freisetzung enthaltend Proteine verwendet wird, sind dies bevorzugt Wachstumsfaktoren, wie FGF (Fibroblasten-Wachstumsfaktor), TGF β (transformierender Wachstumsfaktor β), KGF (Keratinozyten-Wachstumsfaktor), NGF (Nerven- Wachstumsfaktor), Proteine, die an der Gerinnungskaskade beteiligt sind, wie der Koagulationsfaktor VIII und andere, Außerdem können Proteine der extrazellulären Matrix, wie Fibronectin, Laminin, Collagen, an die Fasern des nicht-gewebten Gewebes adsorbiert werden, um den Zell-Verbindungsprozeß zu verbessern.
In dem ersten erfindungsgemäßen Verfahren, liegt die Säedichte der Keratinozyten-Zellen in Schritt (i) bevorzugt zwischen 5 000 und 25 000 Zellen/cm³.
Die zum Ausbreiten dieser Keratinozyten verwendete konventionelle Technik, die die Verwendung von fötalem Kalbserum umfaßt, sind im Grunde diejenigen, die durch Rheinwald und Green (Cell. 6 : 331, 1975) beschrieben sind. Insbesondere wird CEC-Kulturmedium verwendet (Green H. et al., J. Proc. Nation. Acad. Sci. 76 : 5665, 1979) in Gegenwart einer "Feederschicht" von nicht-proliferierendem 3T3-J2-Mäuse-Fibroblasten. Die durchschnittliche Konfluenzzeit liegt im allgemeinen zwischen 7 bis 12 Tagen oder 15 bis 24 Tagen ab dem ursprünglichen Aufbau der Kultur.
In Schritt (i') des zweiten Verfahrens wird das kommerziell erhältliche Medium, genannt MCDB 153 (oder andere) bevorzugt als "chemisch definiertes" Medium zum Ausbreiten der Keratinozyten-Zellen verwendet.
Erfindungsgemäß können in beiden Verfahren primäre oder wiederaufgetaute Kulturen von Fibroblasten und Keratinozyten verwendet werden.
Der in beiden Verfahren zum Herstellen der künstlichen menschlichen Haut, wenn sie konserviert werden muß, verwendete Cryo-Konservierungsschritt wird bevorzugt in Gegenwart von Dimethylsulfoxid oder Glycerol als Cryo-Konservierungsmittel durchgeführt,
Es ist möglich, zu zeigen, daß in der erfindungsgemäßen künstlichen menschlichen Haut kc durch die Mikroporen in der Membran zu dem oberen Teil des nicht-gewebten Gewebes in direkten Kontakt mit der Membran migrieren, während die Fibroblasten eine bedeutende Menge an Protein-Extrazellulärmatrix herstellen.
Von bedeutendem Interesse ist auch die Tatsache, daß in dem nicht- gewebten Gewebe eingebettete und in Kontakt mit den Fibroblasten stehende kc das Aussehen von epithelioiden Basalzellen annehmen, wobei sie Membranmarker exprimieren, die typisch für die Zellen in der Basalschicht der Epidermis sind. Von diesen untersuchten wir die Expression von CD44 und fanden, daß das Protein in der innersten Basalschicht des Composits und insbesondere in den Epithelzellen in direktem Kontakt mit Hyaff 11 (Benzylester von HA), sowohl in der Form des nicht-gewebten Gewebes als auch in der Form von mikroperforierten Membranen, lokalisiert ist. Dies suggeriert, daß das Biomaterial neben dem Wirken als ein Träger für die Zellen auch mit den Zellen, die an ihm hängen, wechselwirkt.
Schließlich ist es möglich, die Herstellung von spezifischen Proteinen der dermoepidermalen Grenzfläche (Laminin, Collagen, Typ III, IV und VII) zu beobachten, während auf der "dermalen" Seite eine üppige Herstellung der extrazellulären Matrix, gezeigt durch die spezifischen färbungs- und immunohistologischen Verfahren (siehe Beispiel 1) gibt.
Für ausschließlich hinweisende Zwecke und ohne durch dieselben limitiert zu sein, berichten wir hier einige Beispiele, die das neugebildete Gewebe kennzeichnen.

Beispiel 1

Ein Stück von nicht-gewebten Gewebe (1,5 · 1,5 cm), gebildet aus Hyaff 11 (Benzylester von HA) wird auf den Boden einer Kulturschale gelegt und an vier Ecken mit Fibrin-Kleber am Platz gehalten. Primäre menschliche Fibroblasten werden auf dem nicht-gewebten Gewebe gesät (0,1 · 106 Zellen in 0,2 ml Medium), wobei das nicht-gewebte Gewebe langsam getränkt wird. Die Schale wird abgedeckt und für ungefähr 30 min unter einer sterilen Haube stehengelassen, wonach das Volumen auf 2 ml mit DMEM enthaltend 10% FCS gebracht wird und die Schale wird bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; inkubiert.
Menschliche kc zwischen der II. und IV. Kulturpassage werden auf eine 5 · 5 cm² messende Laserskin®-Membran (Andreassi et al., Wounds 3 : 116, 1991) gesät. Die kc können in CEC-Medium (Rheinwald und Green, Cell, 6 : 331, 1975) in Gegenwart oder in Abwesenheit einer Feederschicht aber unter Verwenden eines chemisch definierten Mediums (Andreassi et al. Wounds, 3 : 116, 1991) kultiviert werden. Sowohl in den Fibroblasten-Kulturen als auch in den kc-Kulturen werden die jeweiligen Medien alle 48 bis 72 h gewechselt.
Sobald eine gut-geschichtete Epithel-Schicht gebildet ist, wird die Laserskin®-Membran mit einem Skalpell unter sterilen Bedingungen in 1,5 · 1,5 cm messende Stücke geschnitten. Die Fibroblasten-Kultur auf dem nicht- gewebten Gewebe wird auf ein steriles Stahlnetz (ungefähr 3 mm hoch) gelegt; dieses wird dann in eine 6 cm im Durchmesser messende Petrischale gegeben. Die Epithelschicht wird auf das nicht-gewebte Gewebe gelegt, wobei aufgepaßt wird, daß in der Grenzschicht zwischen den beiden Materialien keine Luftblasen gefangen sind (in dem hier berichteten Beispiel wurden keine Kleber verwendet, um die Epithelioid-Membran an dem nicht-gewebten Gewebe zu fixieren).
Ein für kc-Wachstum geeignetes Medium, wie CEC oder MCDB 153, wird in einem Volumen, das das Level der Flüssigkeit auf gerade unterhalb der oberen Oberfläche der Epithelschicht bring, aber das nicht-gewebte Gewebe vollständig durchtränkt, zugegeben.
Das Medium wird alle 72 h gewechselt. Der erste Wechsel des Mediums wird mit Ascorbinsäure (1 ug/ml) ergänzt, um die Produktion der extrazellulären Matrix zu begünstigen. Das Auftauchen der Kultur ist um physiologische Hautbedingungen zu imitieren, indem die vollständige Differenzierung der Epithelzellen stimuliert wird, wie in der Literatur reichlich berichtet (Prunieras et al., J. Invest. Dermatol., 81 : 280, 1983; Bernstam et al. in vitro Cell. Biol., 22 : 695, 1986). Die Kultur wird 14 Tage fortgesetzt, während dieser Zeit wird sie durch Phasenkontrastmikroskopie beobachtet, um zu überprüfen, daß sich die Epithelschicht über die Ränder der Membran ausbreitet. Die Opazität des Materials macht weitere Beobachtung schwierig. Am Ende der Kulturzeit wird das Composit-Material mit einem Skalpell halbiert, wobei man aufpaßt, um seine Struktur zu erhalten. Eine Hälfte wird durch traditionelle histologische Techniken (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) behandelt, während die andere Hälfte in OCT (Medium zur Cryo-Konservierung vor. Geweben, Milestones, USA) eingetaucht wird, in flüssigen Stickstoff gefroren wird und dann bei -80ºC gelagert wird. Die letztere wird mit einem Cryostaten in 6 um dicke Scheiben geschnitten. Die Scheiben werden für die immunohistochemische Untersuchung unter Verwenden von Antikörpern gegen die Marker des Differenzierungsstatus der kc der dermal-epidermalen Grenzfläche und der extrazellulären Matrix verwendet.

Ergebnisse der histologischen Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Fig. 1 (· 100) zeigt ein gutgeschichtetes Epithel über einer mikroperforierte Laserskin®-Membran. Die obere und untere Schicht durchläuft Keratinisation. Die kc erscheinen gut auf der Unterseite der Membran verteilt zu sein, und haben das darunterliegende nicht-gewebte Gewebe in einem beträchtlichen Ausmaß kolonisiert. Die Epithelschicht ist sehr kompakt mit einer variablen Dicke, die nie weniger als 10 bis 15 Zellen ist. Die Trennlinie zwischen der Schicht von Epithelzellen und den darunterliegenden Fibroblasten kann deutlich gesehen werden. Die Querschnitte der Fasern aus dem nicht-gewebten Gewebe sind auch deutlich sichtbar, so wie es die Laserskin®-mikroperforierte Membran ist.

Immunohistochemische Charakterisierung

Untersuchungen auf die Gewebemarker wurden mit den folgenden Antikörpern durchgeführt:
1) Anti-Keratin-Antikörper KL4 (Dermatology Department, Immacolata, Rom)
2) Polyklonaler Anti-Involucrin Antikörper (Dermatology Department, Immacolata, Rom)
3) Monoklonaler Anti-Human-Integrin Antikörper β4 (Dermatology Department, Immacolata, Rom)
4) Monoklonaler Anti-Human-Integrin Antikörper β1 (Dermatology Department, Immacolata, Rom)
5) Monoklonaler Anti-Human-CD44 Antikörper (Prof. Abatangelo, Department of Histology and Embryology an der Universität von Padua)
6) Polyklonaler Anti-Collagen Antikörper III (Chemicon, CA USA),
7) Polyklonaler Anti-Collagen Antikörper IV (Sigma),
8) Polyklonaler Anti-Laminin Antikörper (Sigma),
9) Polyklonaler Anti-Fibronectin Antikörper (Sigma).
Immunohistologische Untersuchung zeigt daß:
a) die äußere Epithelschicht ist gut differenziert und durchläuft Keratinisierung, da die Immunopositivität zu Involucrin sehr deutlich ist (Fig. 2, · 200).
b) die kompakte Zellschicht auf der Oberseite des nicht-gewebten Gewebes wird durch kc gebildet, da die Antwort auf Cytokeratin hier im Vergleich zu der darunterliegenden fibroblastischen Komponente sehr stark ist (Fig. 3, · 200);
c) die Untereinheiten β4 und β1 der Intergrine sind in dem, was hauptsächlich eine Basalschicht des neugeformten Gewebes ist, vorhanden. Diese Untereinheiten und insbesondere β4 werden in der Epidermis auf der Ebene der Untergrundmembran in den Strukturen, die die Membran an die darunterliegende Dermis (Hemidesmosome) verankern, exprimiert. In der "künstlichen Haut", die hier abgebildet ist, exprimieren die positiven β4- Zellen (Fig. 4a, · 100) das Protein hauptsächlich in dem basalen Teil, während das Integrin β1 in den interzellulären Brücken, die die kc verbinden, exprimiert wird (Fig. 4b, · 100). Die hier berichteten Beobachtungen stellen ein wichtiges Anzeichen der korrekten "Polarisierung" der neugeformten Epidermis dar.
d) Die kc in direktem Kontakt mit der Fasern des nicht-gewebten Gewebes, so wie die Zellen im Kontakt mit der Ober- und Unterseite der Laserskin® zeigen eine bemerkenswerte Immunopositivität zu CD44 (Figur, 5 · 200). Es wird angenommen, daß dies ein einzelnes Merkmal der hier beschriebenen Composit-Kultur darstellt: in der Tat kann CD44 Zell-Adhäsion zu dem Material (gebildet aus modifizierter Hyaluronsäure) und gleichfalls seinen Abbau mediieren.
e) In der Untergrundmembran und daher auch der dermoepidermalen Grenzfläche kann eine typische extrazelluläre Matrix beobachtet werden, deren Komponenten hauptsächlich durch die basalen kc, die in dem Gebiet angesiedelt sind, hergestellt werden. Charakteristische Marker sind deshalb Laminin und Collagen Typ IV und VII. Eine Bestätigung dieser Beobachtungen wird durch die Tatsache, daß die drei Komponenten in der Zwischenposition zwischen der Basalschicht der in dem nicht-gewebten Gewebe eingebetteten kc und den darunterliegenden Fibroblasten exprimiert werden. Insbesondere das Ausmaß der Antwort auf Laminin (Fig. 6, · 200) ist auf das, was als eine "künstliche Untergrundmembran", bezeichnet werden kann, fokussiert.
f) Schließlich kann auf der Seite der Dermis eine starke Immunopositivität auf Fibronectin gefunden werden. Fibronectin ist ein durch die Fibroblasten, die offensichtlich in der Dermis reichlich sind, hergestelltes Protein der Matrix. Das Fehlen einer Antwort in der Epidermisschicht wiederum zeigt, daß die Bildung eines gutstrukturierten dermalen Gewebes mit der typischen natürlichen Hautstruktur künstlich induziert wurde.

Beispiel 2

Um die Möglichkeit des Cryo-Konservierens der so hergestellten künstlichen Haut zu zeigen, werden die dermal-epidermalen Kulturen in Gegenwart eines Cryo-Konservierungsmittels, wie Dimethylsulfoxid (DMSO) mit der normalen Technik eingefroren. Kurz, wird die Kultur abgehoben und auf einer 10 cm im Durchmesser messenden und 20 ml des Gefriermediums (45% DMEM, 45% FCS, 10% DMSO) enthaltende auf 4ºC gekühlte Petrischale gegeben. Sie wird ungefähr 5 min stehengelassen, um das Gleichgewicht zu erreichen, dann wird die Schale mittels eines kontinuierlichen Gefrierverfahrens mit einer Geschwindigkeit von -1ºC/min. beginnend bei 4ºC, auf eine Temperatur von -80ºC gebracht.
Nach einer Woche wird die "künstliche Haut" aufgetaut, schnell auf 37ºC erwärmt, und die Kultur wiederholt mit 10% FCS, enthaltend DMEM gewaschen, um jedes restliche DMSO vollständig zu eliminieren. Sie wird 24 h in einem Inkubator bei 37ºC (in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2;) stehengelassen, danach durchläuft das Gewebe die in Beispiel 1 beschriebene histologische und immunohistologische Untersuchung.

Ergebnisse

Im Vergleich zu vor dem Einfrieren wurden keine signifikanten morphologischen und/oder strukturellen Veränderungen in dem Material beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die hier beschriebene künstliche Haut dank ihrer Resistenz gegenüber Einfrieren zum Aufbauen von "Gewebebanken" verwendet werden kann.

Claims

1. Künstliche menschliche Haut umfassend:

a) eine mikroperforierte Membran basierend auf einem Hyaluronsäure-Derivat, auf dem Keratinozyten gesät und kultiviert wurden,

b) einem darunterliegenden nicht-gewebten Gewebe, basierend auf einem Hyaluronsäure-Derivat, in dem Fibroblasten gesät und proliferieren gelassen wurden.

2. Künstliche menschliche Haut gemäß Anspruch 1, weiter umfassend eine an der Grenzfläche zwischen Fibroblasten und Keratinozyten-Zellen angeordnete extrazelluläre Protein-Matrix, enthaltend Proteine der dermoepidermalen Grenzfläche.

3. Künstliche menschliche Haut gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, in der das zum Herstellen sowohl der mikroperforierten Membran als auch des nicht-gewebten Gewebes verwendete Hyaluronsäure-Derivat ein Ester von Hyaluronsäure ist.

4. Künstliche menschliche Haut gemäß Anspruch 3, in der der Hyaluronsäureester einen Prozentsatz an Veresterung zwischen 75% und 100% hat.

5. Künstliche menschliche Haut gemäß Anspruch 3 und 4, in der der Ester Hyaluronsäurebenzylester ist.

6. Künstliche menschliche Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, zum Verwenden in der Medizin und Chirurgie.

7. Künstliche menschliche Haut gemäß Anspruch 6 zum Verwenden für tiefe Verbrennungen II. und III. Grades, zum Verwenden bei verschiedenen Arten von Geschwüren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: diabetischen, venösen, Wundliegen, zum Verwenden in der plastischen Chirurgie und zum Verwenden bei durch Melamin-Mangel charakterisierten Krankheiten.

8. Künstliche menschliche Haut gemäß Anspruch 6 zum Verwenden in der Gen-Therapie, um genetische Fehlbildungen und/oder metabolische Krankheiten zu korrigieren.

9. Künstliche Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als ein diagnostisches Mittel für in vitro-Tests, um die möglichen toxischen Wirkungen von Produkten und/oder Substanzen, die dazu bestimmt sind in Kontakt mit der Haut angeordnet zu werden und im chemischen, pharmazeutischen, kosmetischen oder landwirtschaftlichen Bereich verwendet zu werden, zu überprüfen.

10. Künstliche Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Verwenden im kosmetischen Bereich als ein Haartransplantat.

11. Medikament zur kontrollierten Freisetzung, enthaltend die künstliche menschliche Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, als ein Transportmittel, das Medikament enthaltend mindestens einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus biologisch aktiven Verbindungen, Proteinen, Peptiden und Mischungen davon, in dem der Wirkstoff an die Fasern des nicht-gewebten Gewebes und/oder an die mikroperforierte Membran adsorbiert ist.

12. Medikament zur kontrollierten Freisetzung gemäß Anspruch 11, in dem die Proteine Wachstumsfaktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Transformations-Wachstumsfaktor β, Keratinozyten-Wachstumsfaktor, Nerven-Wachstumsfaktor, oder Proteine der extrazellulären Matrix, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibronectin, Laminin, Collagen oder Proteinen, die an der Gerinnungskaskade beteiligt sind, sind.

13. Medikament zur kontrollierten Freisetzung gemäß Anspruch 12, in dem die Proteine der extrazellulären Matrix an die Fasern der extrazellulären Matrix adsorbiert sind.

14. Verfahren zum Herstellen der künstlichen menschlichen Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte:

i) Säen von Keratinozyten-Kulturen mit einer Dichte, die sich von 1000 bis 100000 Zellen/cm² erstreckt, auf einer mikroperforierten Membran, basierend auf einem Hyaluronsäure-Derivat und Ausbreiten der Keratinozyten auf der Membran gemäß herkömmlichen Techniken, die die Verwendung von fötalem Kalbserum umfassen, bis partielle oder vollständige Konfluenz erreicht ist,

ii) Kultivieren der aus der Dermis oder aus anderen Bereichen mittels der normalen Techniken isolierten Fibroblasten in 10% fötales Kalbsserum enthaltendem DMEM, Konditionieren dieser Fibroblasten, um zu proliferieren, durch Säen auf Plastik, Säen der Fibroblasten in dem nicht-gewebten Gewebe und Fortsetzten der Kultur bis zum Einfrieren falls die erhaltene künstliche Haut konserviert werden muß, oder bis zum Transplantieren,

iii) Legen der bereits gebildeten Epithelschicht auf das durch Fibroblasten kolonisierte nicht-gewebte Gewebe, wobei man aufpaßt, daß der äußere Rand der mikroperforierten Membran den Boden der Schale nicht berührt und daß er sich geringfügig über das darunterliegende nicht-gewebte Gewebe hinaus erstreckt,

iv) optional Zusammenfixieren der Epithel-Zellschicht auf der mikroperforierten Membran an dem darunterliegenden durch Fibroblasten kolonisierten nicht-gewebten Gewebe mittels biologischer Kleber ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Collagen, Fibrin, Fibrin-Kleber,

v) Zugeben eines ausreichenden Volumens des gleichen in Schritt (i) verwendeten Mediums, Eingetauchthalten der Kultur, so daß die Keratinozyten der oberen Schicht der mikroperforierten Membran an der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche sind, Zugeben von Ascorbinsäure mit einer Konzentration gleich 1 ug/ml bei dem ersten und folgenden Wechseln des Mediums, Fortsetzten der Kultur bis zur Transplantation oder zum Einfrieren.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei in Schritt (i) die Sähdichte der Keratinozyten-Zellen zwischen 5000 und 25000 Zellen/cm² ist, und die Zellen in CEC-Kulturmedium in Gegenwart einer "Feederschicht" von nicht- proliferierenden 3T3-Mäuse-Fibroblasten vermehrt werden.

16. Verfahren zum Herstellen einer künstlichen menschlichen Haut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte:

i') Säen der Fibroblasten in dem nicht-gewebten Gewebe und Fortsetzen der Kultur bis zum Einfrieren oder Transplantieren,

ii') Legen der mikroperforierten Membran auf das nicht-gewebte Gewebe, wobei sich ihre Ränder leicht über deijenigen des darunterliegenden Gewebes hinaus erstrecken und Fixieren der Membran mit dem biologischen Kleber ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Collagen, Fibrin, Fibrin- Kleber oder durch mechanische Mittel,

iii') Säen der Keratinozyten auf der mikroperforierten Membran, Ausbreiten der Keratinozyten mittels Verwenden eines Mediums, das für Keratinozyten-Wachstum geeignet ist, auf Plastikschalen bis Konfluenz erreicht ist,

iv') Zugeben eines ausreichenden Volumens des gleichen in dem vorhergehenden Schritt verwendeten Mediums, wobei die Kultur eingetaucht ist, so daß die Keratinozyten der oberen Schicht der mikroperforierten Membran an der Luft-Flüssigkeitsgrenzfläche sind, Zugeben von Ascorbinsäure mit einer Konzentration gleich 1 ug/ml bei dem ersten und folgenden Wechseln des Mediums, Fortsetzen der Kultur bis zum Transplantieren.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 und 15, oder Verfahren gemäß Anspruch 16, das, falls die Haut konserviert werden muß, weiter den Schritt des Cryo-Konservierens der künstlichen Haut in Gegenwart eines Cryo-Konservierungsmittels umfaßt.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 und 15, oder Verfahren gemäß Anspruch 16, in dem Fibroblasten und Keratinozyten aus primären Kulturen oder aus eingefrorenen Beständen kommen.