DE69530409T2

DE69530409T2 - Epithelzellen enthaltendes biomaterial und ihre verwendung als transplantat

Info

Publication number: DE69530409T2
Application number: DE69530409T
Authority: DE
Inventors: Nikolaos Dimoudis; Anton Hartinger
Original assignee: Switch Biotech AG
Current assignee: Switch Biotech AG
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-24
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2015-10-25
Also published as: EP0788381A1; DE69530409D1; IL115728A0; ATE237373T1; WO1996012510A1; JPH09511673A; AU3806695A; EP0788381B1

Description

Gegenstand der Erfindung ist sowohl ein neues Biomaterial, das Epithelzellen auf Mikrocarriern (MCn) enthält, als auch die Herstellung und Verwendung dieses Biomaterials zur Herstellung eines Arzneimittels.
Die Haut besteht aus der Epidermis, der Basalmembran und der Dermis. Die Epidermis bildet die äußere Schicht. Die Epidermis besteht im Wesentlichen aus Fibroblasten mit zusätzlichen Substanzen, wie z. B. Kollagen. Die Basalmembran enthält im Wesentlichen die Keratinozyten, die nicht ausdifferenziert, sondern proliferierend sind. Die Epidermis enthält im Wesentlichen differenzierte Keratinozyten, wobei die obere Schicht verhornt ist. Es ist richtig, dass mit einem steigenden Ausmaß der Differenzierung der Zellen die Fähigkeit der Zellen zu proliferieren abnimmt. Folglich zeigen nicht differenzierte Keratinozyten die größte Proliferationspotenz.
Brandwunden und langsam heilende Wunden (Ulcera) werden für gewöhnlich mit aus autologen Keratinozyten bestehenden Hautsheets behandelt (klassische Verfahren). Hierzu wird einem Patienten ein Hautstück herausgeschnitten, die Keratinozyten werden in vitro kultiviert und die so erhaltenen gewachsenen Hautsheets transplantiert [Gallico, G. G., et al., New Engl. J. Med. 311 (1984) 448-451 (1); Cuono, C., et al., Lancet (1986) 1123-1124 (2); De Luca, M., et al., Burns 15 (5) (1989) 303-309 (3); Gallico, G. G., Clinics in Plastic Surgery 17 (3) (1990) 519- 526 (4); De Luca, M. und Cancedda, R., Burns 18 (1) (1992) 5-9 (5)]. Sowohl der Transfer der dünnen Hautsheets aus den Zellkulturflaschen auf z. B. Vaselinegaze wie auch ihr Fixieren auf der Wundoberfläche ist problematisch. Das Bedecken der Wunden auf Körperstellen, die schwierig zu erreichen sind, ist ein weiteres Problem. Außerdem können nur Keratinozyten mittels solcher klassischer Hautsheets übertragen werden. Hautsheets aus Keratinozyten haben den Nachteil, dass diese Zellen fast vollständig differenziert sind, wenn die Sheets gebildet werden, was bedeutet, dass die Sheets praktisch keine Keratinozyten mehr enthalten, die zur Proliferation in der Lage sind. Folglich bilden diese Sheets ein Transplantationsmaterial, das nach Transplantation nicht mehr wachsen oder weiter wachsen kann. Epidermale Transplantate (klassische Hautsheets) mit allogenen Keratinozyten wurden in einer Reihe von Kliniken ausgeführt, wobei keine immunologischen Abstoßungsreaktionen beobachtet wurden (Gboyse, S. T., et al., Plast. Reconst. Surg. 91 (1993) 632 (17); Burt, A. M., et al., Br. Med. J. 298 (1989) 915 (18); Hickerson, W. L., et al., Burus 20/1 (1994) 52 (19)).
Aus WO 92/06179 (6) und EP-A 0 242 270 (7) sind Biomaterialien bekannt, die Epithelzellen in einem Kollagengel enthalten. In diesem Rahmen werden Epithelzellen (Fibroblasten oder Keratinozyten) in Gelschichten eingebettet. Es ist bekannt, dass solche Gele auch Keratinozyten enthalten können. Keratinozyten werden in dem Gel allerdings immobilisiert und sind daher nach der Transplantation nicht zur Proliferation oder Differenzierung in einem deutlichen Ausmaß in der Lage. Folglich sind Keratinozyten aus solchen Gelen nicht in der Lage, eine Basalmembran und eine Epidermis zu bilden. Ein weiterer Nachteil dieses Biomaterials ist insbesondere die niedrige Migrationsrate der Epithelzellen aus dem Biomaterial in die Wunde. Darüber hinaus ist die Handhabung und das Fixieren dieses Biomaterials sehr schwierig und mühsam.
In WO 90/02796 (8) ist ein dreidimensionales Zellkultursystem auf der Basis von beispielsweise Zellulose, Polyamid, Polyester beschrieben, auf dem. Epithelzellen wachsen können. In diesem Rahmen wird ein künstliches Gewebe erhalten, das mit Epithelzellen (Fibroblasten oder Keratinozyten) bedeckt ist und von dem gesagt wird, dass es zur Transplantation geeignet ist. Auch diese künstlichen Transplantationsmaterialien zeigen keine Vorteile gegenüber Hautsheets, die in klassischen Verfahren eingesetzt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Biomaterial bereitzustellen, das die beschriebenen Nachteile nicht zeigt und das einfach und in großen Mengen hergestellt werden kann.
Der Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Biomaterials, das adhärent an Mikrocarrier gebundene Epithelzellen enthält, zum Herstellen eines Transplantationsmaterials zur Behandlung von Hautwunden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht:
1. den Transfer nicht-differenzierter und folglich potenter Keratinozyten, die zur Proliferation in der Lage sind;
2. die Bildung einer Basalmembran und einer Epidermis auf Wunden nach Transplantation (die nicht-differenzierten Keratinozyten trennen sich nach Transplantation von den Mikrocarriern und proliferieren und differenzieren).
Es war bisher nicht bekannt, dass nicht differenzierte Keratinozyten, die zur Proliferation in der Lage sind, in vitro kultiviert werden können. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung macht es möglich, solche Keratinozyten herzustellen. Daher wird von dem vorliegenden Verfahren angenommen, dass es direkt in vitro gewerblich angewendet werden kann. Nicht-differenzierte Keratinozyten produzieren Komponenten, die von solchen verschieden sind, die von ausdifferenzierten Keratinozyten produziert wurden (die nach dem Stand der Technik bisher die einzigen sind, die durch Kultivieren in vitro erhalten worden sind). Ein Beispiel einer solchen Komponente ist Kollagen IV. Folglich bietet die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Substanzen, z. B. Kollagen IV, durch Kultivieren nicht-differenzierter Keratinozyten. Die nicht-differenzierten Keratinozyten können unter Verwendung von Immunfärbung mit, den Markern Ki67, Keratin 10 und Keratin 14 selektiert werden (Slivka, S. R., et al., J. Invest. Dermatol. 100 (1993) 40-46 (15); Regnier, M., et al., Skin Pharmacol. 3 (1990) 70-85 Als Epithelzellen sind Keratinozyten geeignet. Solche Zellen sind vorzugsweise proliferierende Zellen, am meisten bevorzugt nicht-konfluente Zellen, die die Eigenschaften von Basalzellen haben. CellGenesys stellt epidermale Keratinozyten mit "universellen Eigenschaften" her, sodass sie in einem Transplantat in der vollen Dicke der Haut (Epidermis und Dermis) verwendet werden können, ohne eine Spender-Wirt-Immunantwort zu verursachen (CellGenesys, Forschungszusammenarbeit mit Advanced Tissue Sciences, SCRIP Nr. 1961, 27. Sept. 1994, S. 24).
Unter "Mikrocarriern" sollen kleine feste Partikel verstanden werden, die in der Lage sind, in einem langsam gerührten, wässerigen Medium suspendiert zu werden. Solche Mikrocarrier werden zur Kultivierung eukaryotischer Zellen verwendet, wobei die Zellen auf der Oberfläche dieser Teilchen in Form einer konfluenten Schicht wachsen. Mikrocarrier dieser Art und ihre Verwendung in Zellkulturen sind zum Beispiel in "Advances in Applied Microbiology" 31 (1986) 139-179 beschrieben.
Als Mikrocarrier können alle Mikrocarrier verwendet werden, die aus einem biokompatiblen Material (wie z. B. Kollagen, Polymere aus Hyaluronsäure oder Hyaluronanestern (z. B. Ethyl- oder Benzylestern) (Andreassi, L., et al., Wounds 3 (1991) 116-126 (28); Myers, S. R. et al., Zusammenfassung Nr. 85 in "5th Annual Meeting of the European Tissue Repair Society" (August 1995), Padua (29)) (z. B. HYAFF-11TM aus FIDIA Advanced Biopolymers, Abano T., Italien), Fibrinbindenden Polypeptiden, Dextran, Gelatine, Silikon, usw.) oder einem geeigneten Gemisch von verschiedenen biokompatiblen Materialien bestehen. Es kann zum Beispiel Cytodex3® (eine kreuzvernetzte Dextranmatrix mit einer denaturierten Kollagenschicht, 100-230 um) (Pharmacia AB, Schweden), basierend auf Dextran Cellgen (Koken Co., Japan), einem rekonstituierten und kreuzvernetzten Kollagen aus Rinderhaut, 200-500 um, oder Cultispher-G® (makroporöse Gelatine- Mikrocarrier) (Hyclone, Greiner, Deutschland), basierend auf Gelatine, verwendet werden.
Die Größe der Mikrocarrier ist nicht kritisch. Gewöhnlicherweise haben die Mikrocarrier einen Durchmesser von 50 bis 500 um. Mikrocarrier mit einem Durchmesser unter 50 um sind so klein, dass sie für gewöhnlich nicht ausreichend mit Zellen, die auf ihnen wachsen, bedeckt werden können. Mikrocarrier mit einer Größe über 500 um sind so groß, dass auf der einen Seite eine hohe Bedeckung mit Zellen schwierig zu erreichen ist; und auf der anderen Seite sind diese Partikel im Hinblick auf Transplantationen nicht optimal, weil das Ablösen der Epithelzellen und das Ausbreiten auf der Wunde im Falle solcher Partikel nicht zufrieden stellend fortschreitet.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass für ein erfindungsgemäßes epidermales Transplantat keine autologen Zellen, wie sie in den bekannten Verfahren eingesetzt werden, verwendet werden müssen, sondern vielmehr allogene Zelle alleine oder Gemische von autologen und allogenen Zellen ebenfalls geeignet sind. Das bietet den Vorteil, dass es nicht notwendig ist, für jeden Patienten in einer zeitaufwendigen Kultivierung ein vollständig autologes Transplantationsmaterial herzustellen. Das allogene Transplantationsmaterial kann standardisiert werden und wird dann in großen Mengen und zu jeder Zeit verfügbar sein. Dies ist besonders wichtig im Falle von der Verwendung zur Behandlung von großflächigen Verbrennungen, die so schnell wie möglich behandelt werden müssen.
Allogene Keratinozyten werden nach Transplantation im Wesentlichen nicht abgestoßen. Dennoch sind es nicht diese Keratinozyten selbst, die eine neue Haut bilden. Die wesentliche Funktion der nicht-differenzierten allogenen Keratinozyten ist es, jene Keratinozyten des Transplantatempfängers zu stimulieren, die noch vorhanden sind (diese nicht-differenzierten Keratinozyten werden andere Komponenten bilden als jene, die von differenzierten Keratinozyten gebildet werden). Sie sezernieren sowohl eine große Anzahl von Hormonen (Vitamin D, Steroide und andere), Zytokinen (Interleukin 1, 3, 6, PDGF, bFGF, TGF-α, TGF-β und andere) wie auch Matrixelemente (Laminin, Typ IV/-VII Kollagen, Fibronectin), die eine eschleunigte Epithelialisierung bewirken, die sowohl von den Rändern der Wunde als auch von den übrig gebliebenen Gebieten an kutanen Anhängselgebilden (die noch Reste intakter Keratinozyten enthalten) ausgehen (Brown, H., "Wound healing research through the ages", wound healing: biochemical and clinical aspects, Saunders, Philadelphia, Seite 5, Herausgeber: Cohen, I. K., Diegelman, R. F., und Lindblad, W. J., 1992 (14)). Bei Verbrennungen des IIb-Grades, zum Beispiel, wo Reste patienteneigener Keratinozyten noch vorhanden sind; wird die Verwendung eines allogenen Transplantats oder eines gemischten Transplantats enthaltend allogene und autologe Keratinozyten ausreichend sein. Die allogenen Keratinozyten stimulieren die übrig gebliebenen Keratinozyten des Empfängers und sterben selbst nach einiger Zeit ab. Bei hochgradigen Verbrennungen (dritten Grades), werden praktisch keine Keratinozyten mehr vorhanden sein. In solchen Fällen ist die Transplantation von autologen Keratinozyten notwendig.
Die Zeit bis zum Beginn der Behandlung kann beträchtlich verkürzt werden, indem auch ein Biomaterial verwendet wird, das einen reduzierten Anteil autologer Zellen enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Biomaterial 10 bis 30% autologe Zellen enthalten. Soweit der Rest von 70 bis 90% betroffen ist, kann auf geheftetes allogenes Biomaterial, das in großen Mengen verfügbar ist, zurückgegriffen werden. Hierdurch kann die Zeit zum Herstellen einer ausreichenden Menge an Transplantationsmaterial verkürzt werden, da nur eine geringe Menge autologer Zellen zur Kultivierung erhalten werden muss.
Zusätzlich hierzu bietet das erfindungsgemäße Biomaterial neue Möglichkeiten des Herstellens individueller Transplantationsmaterialien. Zum Beispiel ist es möglich, das Transplantationsmaterial unmittelbar vor der Transplantation herzustellen. Dies kann auch durch Mischen des erfindungsgemäßen Biomaterials enthaltend autologe und/oder allogene Epithelzellen und/oder verschiedene Epithelzellen (z. B. Keratinozyten oder Fibroblasten) bewerkstelligt werden. Hierdurch können die spezifischen Erfordernisse der zu behandelnden Wunde (z. B. der Grad der Verbrennung, der Brandwunde oder dem Wundtyp) optimal in Betracht gezogen werden.
Diese individuelle Anpassung der Zusammensetzung des Biomaterials an das Transplantationsproblem ist mit den aus dem Stand der Technik bekannten Transplantationsmaterialien unmöglich zu erreichen.
Um das Biomaterial herzustellen, werden die autologen und/oder allogenen Epithelzellen in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise [Rheinwald, J. G., und Green, H., Cell 6 (1975) 331-334 (9); Limat, A., et al., J. Invest. Dermatol. 92 (1989) 758-762 (10)] aus menschlichem oder tierischem Material isoliert und geeigneterweise erst adhärent vorkultiviert. Vorzugsweise werden die Zellen nach dem ersten oder zweiten Passagieren weiter zusammen mit den Mikrocarriern kultiviert. Dies wird entweder in einer gerührten Kultur (Spinner-Kultur oder -Fermenter) oder in einer ruhenden Kultur (z. B. Zellkulturflaschen) erreicht, wobei sich die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen auf die Mikrocarrier ausdehnen. Es ist auch bevorzugt, Kügelchen, denen erlaubt wurde, in Wasser zu quellen, mit Zellen über einen Zeitraum von 2 bis 5 Stunden, vorzugsweise 3 bis 4 Stunden, zu inkubieren und währenddessen die Kultur kurz (für 3 bis 5 Minuten) ein Mal pro Stunde zu rühren.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Mikrocarrier vorbeschichtet sein, um die Adhäsion der Zellen zu verbessern und den Grad der Bedeckung der Mikrocarrier zu erhöhen. Für den Überzug können zum Beispiel Proteine der extrazellulären Matrix, wie zum Beispiel Fibronectin oder Kollagen oder ganze eukaryotische Zellen (z. B. Proliferations-unfähige Fibroblasten) oder Komponenten hiervon (z. B. Membranfraktionen) verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Mikrocarrier vor der Kultivierung mit Proliferationsunfähigen Epithelzellen, wie z. B. Fibroblasten, überzogen. Geeignete Fibroblasten sind beispielsweise abgetötete Mausfibroblasten aus der Zelllinie 3T3. Ein solches Vorbeschichten nach dem Fachmann bekannten Verfahren ist zum Beispiel in DE 26 51 68S beschrieben. Es ist auch bevorzugt, die Mikrocarrier mit Substanzen vorzubeschichten, die die Adhäsion der Zellen verbessern (z. B. Kollagen). Geeigneterweise wird das Vorbeschichten nach dem Quellen der Mikrocarrier und dem Autoklavieren zur Sterilisation, aber vor der Inkubation mit den Epithelzellen ausgeführt. Hierfür werden die Mikrocarrier in einer wässerigen Lösung solcher Adhäsionsmoleküle oder der Zellsuspension (die Letzteren geeigneterweise in Zellkulturmedium) inkubiert. Danach werden die überzogenen Mikrocarrier gewaschen [vorzugsweise mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) NaCl: 8000 mg/l, KCl: 200 mg/l, Na&sub2;HPO&sub4;2H&sub2;O: 1440 mg/l, KH&sub2;PO&sub4; : 200 mg/l].
Um die Mikrocarrier mit Epithelzellen zu überziehen, wird die Kultivierung vorzugsweise in einem serumfreien Medium, gegebenenfalls unter Zugabe von Hirnanhangsdrüsenextrakt (bovin) oder fötalem Kälberserum ausgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Wachstums- bzw. Zelldifferenzierungs-fördernde Faktoren, wie zum Beispiel Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF) zugeführt, um den Grad der Bedeckung zu erhöhen.
Nachdem der gewünschte Grad der Bedeckung erreicht wurde, werden die Zellen isoliert. Dies kann zum Beispiel durch Sedimentation oder Zentrifugation bei niedrigen g-Werten (z. B. 10 bis 50 g) erreicht werden.
So isolierte Zellen werden entweder direkt in einer zur Behandlung der Wunden geeigneten galenischen Formulierung verwendet oder bis zur Behandlung konserviert. Zur Konservierung ist normalerweise die Krykonservierung geeignet. Kryokonservierung wird vorzugsweise unter Zugabe von kryoprotektiven Substanzen, wie z. B. Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerin, bei einer Temperatur von +3ºC bis -196ºC, vorzugsweise zur Langzeitlagerung (mehr als 6 Stunden) durchgeführt. In dem Fall von Kurzzeitlagerung (weniger als 6 Stunden) kann die Konservierung bei einer Temperatur von +3ºC bis +10ºC ohne Zugabe von kryoprotektiven Substanzen durchgeführt werden.
Um ein Biomaterial enthaltend an Mikrocarrier angeheftete autologen und allogene Zellen herzustellen, werden vorzugsweise autologe epidermale Zellen zuerst isoliert und in Gegenwart von Mikrocarriern kultiviert. Die Kultivierung wird für eine Zeit ausgeführt, die ausreicht, um die Menge des autologen Biomaterials zu erreichen, die als Anteil des Gemisches gewünscht wird. Darm wird allogenes Biomaterial (das adhärent an Mikrocarrier gebundene allogene Epithelzellen enthält) zugefügt und das erfindungsgemäße epidermale Transplantat als ein Gemisch hergestellt. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, kryokonserviertes allogenes Biomaterial oder allogenes Biomaterial, das bei einer Temperatur zwischen +3ºC und +10ºC geheftet wurde, einzusetzen.
Vorzugsweise beträgt der Anteil autologen Biomaterials in dem Gemisch zwischen 10 und 30%. Es ist auch möglich, autologe und allogene Zellen zusammen in Gegenwart der Mikrocarrier zu kultivieren. In einem solchen Fall wird ein Transplantationsmaterial erhalten werden, in welchem sowohl autologe Zellen als auch allogene Zellen an die einzelnen Mikrocarrier angeheftet sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Gemischverwendet, das aus Mikrocarriern besteht, wobei jedes individuelle Mikrocarrierpartikel mit nur einem Typ von Epithelzellen, wie z. B. Fibroblasten oder Keratinozyten, bedeckt ist. Es ist auch möglich, Mikrocarrier zu verwenden, auf denen verschiedene Typen von Epithelzellen (vorzugsweise Fibroblasten und Keratinozyten (fötal oder adult)) adhärent angeheftet sind. Das Mischungsverhältnis verschieden bedeckter Mikrocarner oder das Mischungsverhältnis individueller Zellen auf einem Mikrocarrier kann tatsächlich jedes gewünschte Verhältnis sein und kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung variieren (z. B. Brandwunden, senile Ulcera, diabetische Ulcera). In diesem Zusammenhang ist bevorzugt, für diabetische Wunden nur Fibroblasten, oder Fibroblasten im Überschuss, und für Brandwunden nur Keratinozyten, oder Keratinozyten im Überschuss, im Verhältnis zu den inderen Epithelzellen in dem Transplantationsmaterial zu verwenden.
Der Grad der Bedeckung der Mikrocarrier mit Epithelzellen kann stark variieren. Allerdings ist die Effizienz des Transplantats umso niedriger, je niedriger die Bedeckung ist. Daher ist es in der Praxis vorteilhaft, eine möglichst hohe Bedeckung zu verwenden.
Die Bedeckung ist zwischen 50 und 80%. Überraschenderweise wurde aber gefunden, dass eine Bedeckung zwischen 50 und 80%, vorzugsweise zwischen 60 und 70%, optimal ist.
Unter Bedeckung soll die mittlere Menge adhärent an die Mikrocarrier gebundener Zellen im Vergleich zu einer kompletten Bedeckung verstanden werden.
Diese Menge kann entweder visuell unter dem Mikroskop oder nach Ablösung der Zellen von den Mikrocarriern (zum Beispiel durch Behandlung mit Trypsin) und Färbung bestimmt werden. Geeigneterweise kann eine komplette Bedeckung am einfachsten visuell unter dem Mikroskop bestimmt werden. Typische Bilder von einer 30%-igen und 80%-igen Bedeckung der Mikrocarrier gemäß der Erfindung sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.
Für die therapeutische Verwendung wird das konservierte Biomaterial (gegebenenfalls gemischt mit frischem Biomaterial, das auch autolog sein kann) verwendet.
Hierfür wird das Biomaterial aufgetaut, gegebenenfalls die kryoprotektive Substanz durch Waschen mit Medium entfernt, und das Biomaterial mit einer Zubereitung, die das galenische Medium bildet, gemischt. Es ist essenziell für die galenische Formulierung, dass das verwendete Material die Zellen nicht dehydrieren soll. Es wurde gefunden, dass Hydrogele, vorzugsweise basierend auf Methylzellulose, besonders geeignet für diesen Zweck sind. Beispiele geeigneter Hydrogele sind die folgenden:
- Methylzellulose (vorzugsweise circa 4%, nicht-ionogene Zellulosederivate, d. h. modifizierte D-Glucoglycane, in welchen die Hydroxylgruppen der Zellulose mit Methylgruppen substituiert sind) (Keresztes, A., Kedvessy, G., Pharmacia 20 (1965)371(20); Sarkar, N., J. Appl. Polymer Sci. 24 (1979) 1073)(21);
- Alginate (Salze der Alginsäure, z. B. Natrium-, Kalzium-, Magnesium- oder Ammoniumalginat, z. B. Kelco-Alginate® der Firma Kelco) (Sellerie, R., et al., Boll. chim. farmaceut. Milano 119 (1980)41(22); Daigo, K., et al., Yakuri to Chiryo 11 (1983)401)(23);
- Agarose (Polysaccharid aus Agarobiose und Neo-Agarobiose) (Langford, J. J., Dambach, A. E., Soap. Chem. Specialities 45/5 (1969) 231) (24).
Typ I Kollagen und Typ III Kollagen in Medium kann auch geeignet sein.
Es ist auch möglich, im Kulturmedium gelöste Methylzellulose zu verwenden. Die Viskosität muss so sein, dass das Material leicht verteilt werden kann und dass die Zellen nach Transplantation getrennt werden können und zur Migration in der Lage sind, um z. B. als Keratinozyten eine Basalmembran und eine Epidermis zu bilden.
Die Basis für das galenische Medium ist geeigneterweise im Wesentlichen Kulturmedium. Es ist aber vorteilhaft, weitere Substanzen zuzufügen, die mit der Haut kompatibel sind und mit welchen die Viskosität des Biomaterials verändert werden kann. Die Optimierung der Viskosität ist insbesondere vorteilhaft zur Optimierung der Handhabung des Biomaterials bei der Anwendung auf die Wunden und zur Adhäsion auf den Wunden. Geeignete hautkompatible Substanzen zur Änderung des Grades der Viskosität sind, zum Beispiel, Verdickungsmittel, emulsifizierende Hilfsmittel, Hydrokolloide oder Geliermittel, wie z. B. Gelatine, Pektin, Alginate, Zellulosederivate, Aqualose und Polysaccharide.
Geeigneterweise werden diese Substanzen zu dem galenischen Medium in einer solchen Konzentration beigemischt, dass die Mikrocarrierzubereitung einfach zu verwenden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das galenische Medium weiter Substanzen enthalten, die die Wundheilung zusätzlich verbessern, wie z. B. NGF, TGF-β, PDGF, KGF und/oder Fibronectin oder Analoga (Schärffetter-Kochanek, K., et al., J. Invest. Dermatol. 98 (1992) 3-11 (30); Lange, T. S., et al., J. Exp. Dermatol. 4 (1995) 130-137 (31); WO 92/09200 (32) (für Fibronectinpeptide); WO 90/07577 (33); WO 91/17765 (36)), die die Adhäsion von Epithelzellen auf dem Wundbett verbessern, insbesondere nachdem die Zellen von dem Carrier abgelöst wurden. Vorzugsweise enthält das Arzneimittel zwischen 0,03 g und 0,1 g Fibronectin oder Analoga pro Gramm galenischen Mediums. Es ist weiter bevorzugt, dass das galenische Medium lebende Zellen mit Eigenschaften von Makrophagen, z. B. Makrophagen oder Langerhans'sche Zellen zum Desinfizieren der Wunden, enthält. Es ist bevorzugt, dass das Arzneimittel circa 10 bis 30% solcher Zellen enthält.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel als ein epidermales Transplantat ist zur Verwendung in der Behandlung von, zum Beispiel, Brandwunden, diabetischen Wunden, senilen Ulcera und anderen langsam heilenden Wunden geeignet. Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist auch zur Beschleunigung der Heilung normaler Wunden geeignet. Eine weitere Verwendung ist in der plastischen Chirurgie.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Biomaterials liegt in der Tatsache, dass es, im Gegensatz zu bekannten epidermalen Transplantaten, in allen Richtungen flexibel und einfach an die Körperoberfläche, sogar auf Stellen, die problematisch sind (z. B. Hautfalten, Ohr, Augenlider), anzupassen ist.
Zur Verwendung wird das erfindungsgemäße Arzneimittel geeigneterweise unter Verwendung eines in Abhängigkeit von der Art der zu behandelnden Wunde geeigneten Verbandes zum Beispiel: a) Fettgazeverband (engl. fatty gauze dressing), z. B. GRASSOLIN® der Firma Hartmann, Deutschland, b) hydrophober Polymerverband, z. B. EPI-LOCK® der Firma Merck & Co., Missouri/USA, c) hydroaktiver Verband, z. B. DUODERM® [Gelfonnelverband] der Firma Conva Tec, Princeton/USA, d) MITRAFLEX (mikroporöse Polyurethanmembran)], auf die Wunden platziert, um seine Effektivität zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Gemisch autologer und allogener Epithelzellen, insbesondere Keratinozyten, verwendet.
Als Keratinozyten werden vorzugsweise epidermale Keratinozyten (z. B. Vorhaut- Keratinozyten) verwendet.
Um ein insbesondere auf Keratinozyten basierendes Biomaterial herzustellen, ist es besonders bevorzugt, die Mikrocarner vorzubeschichten, wie dies oben beschrieben ist. Diskontinuierliches Rühren ist bei der Kultivierung der Zellen in Gegenwart von Mikrocarnern auch bevorzugt. Hierzu wird die Kultur vorzugsweise für wenige Minuten (z. B. 1 bis 5 Minuten) bei einer Geschwindigkeit zwischen 10 und 100 UpM gerührt und anschließend weiter für eine längere Zeitdauer (ungefähr 20 bis 40 Minuten) ohne Rühren kultiviert. Die diskontinuierlichen Rührbedingungen werden über die gesamte Dauer der Kultivierung beibehalten. Es wurde gefunden, dass es besonders vorteilhaft für die Kultivierung ist, wenn das Rühren für circa 2 Minuten bei circa 40 UpM, gefolgt von einer Ruhephase von circa 30 Minuten, ausgeführt wird. Diese Bedingungen können selbstverständlich bis zu einem gewissen Grad variieren. In diesem Zusammenhang muss dafür Sorge getragen werden, dass das Rühren für eine so kurze Dauer wie möglich durchgeführt wird, um dennoch ein sorgfältiges Mischen mit dem Medium zu erreichen, sodass anschließend ein so lange wie mögliches Kultivieren ohne Rühren und mit einem Zellwachstum und mit der Adhäsion der Zellen an die Mikrocarrier, das so wenig wie möglich gestört wird, durchgeführt werden kann.
Um eine hohe Bedeckung der Mikrocarrier durch Kultivierung, insbesondere Keratinozyten, zu erreichen, ist weiter bevorzugt, die Kultivierung zuerst, in einer ersten Kultivierungsphase, in einer möglichst geringen Menge an Kulturmedium durchzuführen. Diese Menge muss nur gerade groß genug sein, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht in einem beträchtlichen Ausmaß absterben und gleichzeitig in der Lage sind, an die Oberfläche der Mikrocarrier zu binden. Nur nachdem die Keratinozyten in einem beträchtlichen Grad an die Mikrocarrier gebunden sind (gewöhnlich nach 6 bis 8 Stunden), wird in einer zweiten Kultivierungsphase weiteres Medium zugefügt. Die Gesamtmenge an Medium entspricht der Menge an Medium, die optimalerweise zur Bedeckung der Mikrocarrier unter Verwendung unkritisch wachsender Epithelzellen, wie z. B. Fibroblasten, verwendet wird. Für Mikrocarrier, die als Carrier für adhärente Zellen bekannt sind, wird diese Menge für gewöhnlich vom Hersteller spezifiziert. In diesem Zusammenhang beträgt die optimale Menge an Medium 100 ml für 300 mg Cytodex® (kreuzvernetzte Dextranmatrix) und für 100 mg Cultispher® (makroporöser Gelatine-Mikrocarrier). Zur Kultivierung der Keratinozyten im ersten Kultivierungsstadium wird nur circa 40 bis 60% dieses optimalen Volumens des Zellkulturmediums zugefügt.
Einige der Beispiele, Veröffentlichungen und Figuren, die unten zur Verfügung gestellt werden, sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, deren Schutzumfang durch die Patentansprüche begründet wird. Die beschriebenen Verfahren sollen als Beispiele verstanden werden, die den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Fig. 1 stellt Cytodex 3® (kreuzvernetzte Dextranmatrix mit einer denaturierten Kollagenschicht) Mikrocarrier mit einer 30%-igen Bedeckung mit Keratinozyten dar (Beispiel 2.2).
Fig. 2 stellt das gleiche System mit einer 80%-igen Bedeckung dar.
Fig. 3 stellt die Migration der Keratinozyten auf einer künstlichen Dermis dar (Beispiel 5).

Beispiel 1

Isolierung und Kultivierung humaner Keratinozyten

1) Epidermale Keratinozyten

Epidermale Zellen (Keratinozyten) werden enzymatisch jeweils aus Stücken von Haut und Vorhaut isoliert und in eine Zellkultur platziert.
Die Isolierung wird nach im Stand der Technik bekannten Verfahren ausgeführt [Rheinwald, J. G., und Green, H., Cell 6 (1975) 331-334 (9); Limat, A., et al., 3, Invest. Dermatol. 92 (1989) 758-762 (10); Rheinwald, J. G., Methods Cell. Biol. 21A (1980) 229-254 (12)].
Die Kultivierung und Proliferation der Keratinozyten bis zur Verwendung zur Bedeckung der Mikrocarrier (MC) wird in einer statischen Kultur (Zellkulturflaschen oder Zellfabriken) mit serumfreiem Medium durchgeführt.

2) Zellen der äußeren Wurzelscheide (outer root sheath, ORS-Keratinozyten) aus Haarfollikeln

Die Etablierung von primären Kulturen von ORS-Zellen und ihre Vermehrung (Kultivierung) in vitro wird durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erreicht [Limat, A., et al., J. Invest. Dermatol. 92 (1989) 758-762 (10); Limat, A., und Noser, F., J. Invest. Dermatol. 87 (1986) 485-488 (13)].

Beispiel 2

Herstellung von Mikrocarriern und Kultivierung von Keratinozyten auf Mikrocarriern (MCn) (Bedeckung der MC)

2.1 Herstellung der MC für die Kultivierung

a) Cytodex 3® (Pharmacia - kreuzvernetzte Dextranmatrix mit einer denaturierten Kollagenschicht)

Die MC werden gewogen und in Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Kalziumionen und Magnesiumionen (PBS -/-) über Nacht bei Raumtemperatur quellen gelassen (müssen am Anfang gelegentlich aufgerührt werden). Die PBS wird dekantiert und die MC werden zusätzlich zwei Mal mit PBS gewaschen; 50 bis 100 ml PBS pro Gramm MC werden verwendet.
Die Suspension wird autoklaviert (115ºC, 15 psi, 15 Min.) und die MC werden danach in Zellkulturmedium (GIBCO, serumfreies Keratinozyten-SFM) platziert. Die MC werden ein Mal mit Kulturmedium gewaschen und im gleichen Medium bei 4ºC gehalten.

b) Cultispher® (Hyclone - makroporöser Gelatine-Mikrocarrier)

Die MC werden gewogen und in Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Kalziumionen und Magnesiumionen (PBS -/-) über Nacht bei Raumtemperatur quellen gelassen (müssen am Anfang gelegentlich aufgerührt werden). Die PBS wird dekantiert und die MC werden zusätzlich zwei Mal mit PBS gewaschen; 50 bis 100 ml PBS pro Gramm MC werden verwendet.

Vorbeschichten mit Kollagen

Die Suspension wird autoklaviert (115ºC, 15 psi, 15 Min.). Anschließend werden die MC über Nacht bei 37ºC in einer Lösung von Kollagen S Typ I (3 mg Kollagen in 10 ml 0,1% CH&sub3;COOH) gerührt; 10 ml Kollagenlösung pro 100 mg MC werden verwendet. Der Überstand wird verworfen, die MC werden einmal mit PBS -/- gewaschen und in Kulturmedium (GIBCO, serumfreies Keratinozyten- SFM) platziert. Nach einmaligem Waschen (mit Kulturmedium) werden die MC im Kulturmedium bei 4ºC gehalten.

2.2 Kultivierung der Keratinozyten auf den MC

Subkonfluente (etwa 70%) serumfreie kultivierte Keratinozyten (in Zellkulturflaschen) nach dem ersten oder zweiten Passagieren werden vom Boden des Kulturgefäßes unter Verwendung einer Trypsin/EDTA-Lösung (5 ml pro Zellkulturflasche [175 cm² Kultivierungsfläche] einer 0,05%-igen Trypsin/0,02%-igen EDTA- Lösung in PBS-/-, Dauer der Wirkung: circa 5 Min. bei 37ºC) abgelöst. Die Ablösung durch Trypsinisierung wird mit 3 ml FKS (fdtales Kälberserum) gestoppt. Diese Suspension einzelner Zellen wird durch Zentrifugation entfernt (10 Min., bei 180 g). Das Zellpellet wird sorgsam in Zellkulturmedium resuspendiert und eine Zellzählung unter Verwendung von Trypanblau durchgeführt.
Das Aussäen der Zellen mit MC wird in einer Spinnerflasche (effektives Volumen 50 ml) durchgeführt. Bis zu 1 · 10&sup7; Zellen werden zu jeweils 300 mg Cytodex 3- MC bzw. 100 mg Cultispher (circa 10 Zellen pro Carrier) zugefügt und das Flüssigkeitsvolumen auf 30 ml mit serumfreiem Kulturmedium eingestellt.
Das Rühren in der Spinnerflasche wird diskontinuierlich ausgeführt: 2 Min. bei 40 UpM, gefolgt von 30 Minuten Kultivierung ohne Rühren. Diese Rührbedingungen werden während der ganzen Dauer der Kultivierung beibehalten.
Nach 6 bis 8 Stunden wird Medium zugefügt, bis ein Volumen von 100 ml erreicht wird (möglicherweise wird die Kultur in eine Spinnerflasche mit einem effektiven Volumen von 250 ml überführt). Während der weiteren Kultivierungsdauer wird das Medium zwei Mal täglich (circa alle 12 Stunden) nach der folgenden Prozedur gewechselt: Die Carrier setzen sich am Boden der Flasche ab, das verbrauchte Medium wird in dem größtmöglichen Maß abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt.
Während der Kultivierungsdauer wird die Bedeckung der MC mikroskopisch beurteilt und fotografisch dokumentiert. Im Falle von Cytodex 3 MCn werden die Zellen ohne Färbung beurteilt. Im Falle der Cultispher MC werden die Keratinozyten mit dem Hoechst-Farbstoff 33342 (2'-[4-Ethoxyphenyl]-5-[4-1-piperazinyl]- 2,5'-bi-1H-benzimidazol) im Voraus gefärbt. Beispiele unter Verwendung von Zellen auf Cytodex 3 MC:
Fig. 1: Ungefähr 30% Bedeckung.
Fig. 2: Ungefähr 80% Bedeckung.
Nachdem die gewünschte Bedeckung erreicht wurde, wird überschüssiges Medium (nach dem Absetzen der Carrier) abgesaugt und die verbleibende Suspension durch Zentrifugation bei 10 bis 50 g für 10 Min. entfernt. Eine galenische Substanz wird zu dem Pellet zugefügt und die ganze Sache in dieser Form verwendet, oder das Pellet wird unter Zusatz eines kryoprotektiven Mittels zur späteren Verwendung eingefroren. Die unten dargestellte Tabelle zeigt der Grad der Keratinozytenbedeckung der Mikrocarrier in Abhängigkeit von optimierenden Verfahrenseigenschaften:
- diskontinuierliches Rühren
- steigendes Volumen an Medium nach 6 bis 8 Stunden
Aus Tabelle 1 wird ersichtlich, dass jede dieser aptimierungseigenschaften zu einer gesteigerten Bedeckung beiträgt. Die Kombination von diskontinuierlichem Rühren und steigendem Volumen führt zu einer entscheidenden Verbesserung der Bedeckung.

2.3 Schnelle Kultivierung der Keratinozyten (Kz) auf MCn

Die MC werden bei einer Konzentration von 1,2 · 10&sup5; MC/ml Kulturmedium mit Keratinozyten (kultiviert serumfrei oder mit Serum) bei einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Kz/ml Kulturmedium inkubiert. Das Verhältnis von MC : Kz ist mindestens 1 : 10. Die Inkubation findet in einem 13 ml Zentrifugenröhrchen in einem Inkubationsschrank (37ºC, 5% CO&sub2;, 95% rH) für mindestens 2 Stunden, nicht mehr als 6 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden statt. Die Suspension wird ein Mal pro Stunde für circa 20 Sekunden vorsichtig geschüttelt. Nach dieser Zeit hat sich die Mehrzahl der Kz an die MC angeheftet.
Nach 3 bis 4 Stunden wird ein Aliquot aus der Suspension genommen und die Bedeckung wird mikroskopisch untersucht.

Beispiel 3

Galenisehes Medium

Keratinozyten allein (ohne Kügelchen) wurden mit einigen Substanzen (aber immer mit Medium) gemischt und auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Die Ergebnisse sind wie folgt:
- in Gelatine: geringe Lebensfähigkeit;
- in einer Anzahl von gebrauchsfertigen Wundgelen/Salben: geringe oder schlechte Lebensfähigkeit;
- in Nifücin-Gel® der Firma Apogepha (Nitrofurazon und Adjuvans): gute Lebensfähigkeit

Beispiel 4

Bestimmung der Bedeckung der Mikrocarrier:

Die Bedeckung der Mikrocarrier (Bestimmung der Zellzahl) wird mittels Proteinbestimmung bestimmt. Die Proteinbestimmung wird gemäß dem BCA-Verfahren durchgeführt (Testkit der Firma Pierce, Katalognr.: 23225).

Herstellen der Proben:

1 ml einer homogenen Suspension (Mikrocarner bedeckt mit Zellen in Medium) wird in ein Eppendorf-Gefäß überführt und durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge (2 Min. bei 10.000 UpM) entfernt. Der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird in 200 ul CAT-Lysepuffer (enthaltend MOPS, NaCl und Triton X-100, pH 6,5, Produkt der Firma Boehringer Mannheim GmbH aus CAT- ELISA-Kit, Katalognr.: 1363727) resuspendiert und bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.

Herstellen der Standards (Standardreihe):

Keratinozyten aus einer konfluenten statischen Kultur wurden unter Verwendung einer Trypsin-EDTA-Lösung (0,05% Trypsin/0,02% EDTA in PBS (Ca/Mg-frei) in Suspension gebracht. Nach der Zellzählung (Trypanblau-Verfahren) wurden 5 Proben enthaltend jeweils 1 · 10&sup5;, 2,5 · 10&sup5;, 5 · 10&sup5;, 1 · 10&sup6;, 2 · 10&sup6; Zellen aus dieser Zellsuspension hergestellt. Die Proben wurden durch Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge, 2 Min. bei 10.000 UpM) entfernt und die Pellets in jedem Fall in 200 ul CAT-Lysepuffer (siehe oben) resuspendiert und bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Anschließend wurde die Proteinbestimmung der Standards und der Proben gemäß dem BCA-Verfahren (siehe oben) durchgeführt. Die OD-Werte der Standards (x-Achse) werden in einem Diagramm gegen die Zellzahlen in den Standards (y-Achse) aufgetragen. Die OD-Werte der Proben werden mit Hilfe dieser Standardkurve in Zellzahl/ml abgelesen.

Berechnung des Grads der Bedeckung:

a) Nach den theoretischen Berechnungen tragen die Mikrocarrier bei einer Bedeckung von 100% im Durchschnitt 40 Keratinozyten/Mikrocarrier.
b) Die Zahl der Mikrocarrier, die in den Proben eingesetzt wurde, ist bekannt: 4 · 10&sup4; Mikrocarrier/ml Probe.
c) Die maximal mögliche Zahl von Zellen in der Probe (bei einer 100%-igen Bedeckung der Mikrocarrier) beträgt: 1,6 · 10&sup6; Keratinozyten/ml Probe.
d) Die Zellzahl/ml in der Probe, die aus der Standardkurve (Proteinbestimmung) abgelesen wird, wird mit der maximal möglichen Zahl von Zellen (siehe oben: c) verglichen und hieraus der Grad der Bedeckung der Mikrocarrier mit Keratinozyten in Prozent berechnet.

Beispiel 5

In-vivo-Test

Die Migration der Keratinozyten von den MC wurde mittels eines leicht modifizierten "Luft-Flüssigkeits-Interface"-Modells (Noser, F. K., und Limat, A., In Vitro Cell & Dev. Biol. 23 (8)(1987) 541-545 (34)) untersucht. Kollagengele mit hierin eingebetteten inaktivierten Fibroblasten wurden als künstliche Dermis verwendet (Beil, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 1274-1278 (35)). In diese Gele wurden in jedem Fall 200 ul einer MC Keratinozytensuspension ausgesät und in einer submersen Weise mit einem FKS enthaltenden Kulturmedium für eine Dauer von 24 bis 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Gele auf ein feines Teflonnetz platziert und dieses auf einem Teflonring angeordnet. Diese Anordnung wurde in Petrischalen platziert und für eine Dauer von bis zu drei Wochen kultiviert. Das Senmi enthaltende Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag vollständig gewechselt und das Volumen gemessen, sodass es bis zum unteren Rand des Teflonnetzes reichte. Zur Durchführung der histologischen oder immunhistochemischen Untersuchungen wurden die Gele von dem Teflonnetz hochgehoben und entweder in einer 4%-igen Formalinlösung fixiert und in Paraffin eingebettet oder einer Kryokonservierung unterzogen. Die histologischen Schnitte dieser Präparate wurden histologisch mit Hämatoxylin und Eosin oder immunhistochemisch mit Antikörpern gegen CK-5, CK-10, mip (Ki67) und Kollagen IV gefärbt. Es wurde gezeigt, dass die Migration der Keratinozyten von den MCn auf die künstliche Dermis stattfindet (Fig. 3), dass die Entwicklung der mehrschichtigen Dermis auftritt und dass Keratinozyten mit Basaleigenschaften in dem Präparat vorhanden sind.

Beispiel 6

In-vivo-Tests

Das Schwein ist eine Tierspezies, die für In-vivo-Tests geeignet ist (Kangesu, T., et al., Br. J. Plastic Surgery 46 (1993) 401-409 (25); de Vries, H., et al., Wound Rep. Reg. 1 (1993) 244-252 (26); Breuing, K., et al., J. Surg. Res. 52 (1992) 50- 58 (27)).
MC: Mikrocarrier ohne jeden Überzug
MCG: Carriergel mit 4% Methylzellulose (ohne einen Mikrocarrier)
Kzy + MC: Mikrocarrier (Kügelchen) überzogen mit Keratinozyten
Die Hautwunden wurden in fünf Gruppen eingeteilt (Gruppe 1: Kontrolle, ohne eine verwendete Substanz; Gruppe 2: MC; Gruppe 3: MCG; Gruppe 4: MC + MCG; Gruppe 5: MC + MCG + Kzy). Um in der Lage zu sein, die Gewebereaktionen, die in jeder Gruppe auftreten, zu beurteilen, muss eine Zahl von sieben Präparaten histologisch beurteilt werden. Da auch der zeitliche Verlauf der Reaktion wichtig ist, wurden die Tiere nach 3, 7 und 14 Tagen untersucht. Die Zeitpunkte am 3. und 7. Tag wurden durch eine Biopsie abgedeckt, wogegen nach 14 Tagen die Tiere getötet wurden. Da jedem Tier ((25), (26), (27)) bis zu 30 Hautwunden zugefügt werden können, resultiert daraus eine Zahl von Tieren von n = 5. Jedem Tier wurden 23 (3 Mal 7 + 2 Reserve) Hautwunden zugefügt.

Anästhesie:

Sedierung mit Ketamin/Azaperon im; anfängliche Anästhesie mit Propofol iv; verlängerte Anästhesie: Isofluran, Sauerstoff, Distickstoffoxid (Intubierung).

Operation:

Unter absolut sterilen Bedingungen wurden die Hautbereiche gereinigt, von Fett befreit und desinfiziert, Hautwunden einer standardisierten Größe und Tiefe wurden zugefügt (mit einem Muster und einem Dermatom; Größe: 1,5 · 1,5 cm; Tiefe: 3 mm), die zu testenden Substanzen auf die Wunden aufgebracht, die einzelnen Wunden wurden mit wasserdichten und luftdichten Vinylkammern bedeckt (diese Kammern erlauben eine separate Beobachtung der einzelnen Wunden; solche Wundkammern werden auch in Kliniken zur Bedeckung von Hautwunden verwendet; Hersteller: P. A. Medical Co., Columbia, USA).

Postoperative Schmerztherapie:

Nachdem die am Rücken der Tiere liegenden Hautwunden und die hierauf platzierten Wundkammern den Tieren Schmerzen und/oder Unbehaglichkeitsgefiihle (z. B. Jucken) zumindest in der ersten postoperativen Phase verursachen, wird routinemäßig eine Therapie mit Metamizol für eine Dauer von 3 Tagen durchgeführt.

Liste der Literaturstellen

(1) Gallico, G. G., et al., New Engl. J. Med. 311 (1984) 448-451
(2) Cuono, C., et al., Lancet (1986) 1123-1124
(3) De Luca, M., et al., Burns 15 (5) (1989) 303-309
(4) Gallico, G. G., Clinics in Plastic Surgery 17 (3) (1990) 519-526
(5) De Luca, M., und Cancedda, R., Burns 18 (1) (1992) S-9
(6) WO 92/06179
(7) EP-A 0 242 270
(8) WO 90/02796
(9) Rheinwald, J. G., und Green, EL, Cell 6 (1975) 331-334
(10) Limat, A., et al., J. Invest. Dermatol. 92 (1989) 758-762
(11) DE 26 51 685
(12) Rheinwald, J. G., Methods Cell. Biol. 21A (1980) 229-254
(13) Limat, A., und Noser, F., J. Invest. Dermatol. 87 (1986) 485-488
(14) Brown, H., "Wound healing research through the ages", wound healing: biochemical and clinical aspects, Saunders, Philadelphia, Seite 5, Herausgeber: Cohen, I. K., Diegelman, R. F., und Lindblad, W. J., 1992
(15) Slivka, S. R., et al., J. Invest. Dermatol. 100 (1993) 40-46
(16) Regnier, M., et al., Skin Pharmacol. 3 (1990) 70-85
(17) Gboyse, S. T., et al., Plast. Reconst. Surg. 91 (1993) 632
(18) Burt, A. M., et al., Br. Med. J. 298 (1989) 915
(19) Hickerson, W. L., et al., Burns 20/1 (1994) 52
(20) Kereszies, A., Kedvessy, G., Pharmacia 20 (1965) 371
(21) Sarkar, N., J. Appl. Polymer Sci. 24 (1979) 1073
(22) Sellerie; R., et al., Boll. chim. farmaceut. Milano 119 (1980) 41
(23) Daigo, K., et al., Yakuri to Chiryo 11 (1983) 401
(24) Langford, J.J., Dambach, A. E., Soap. Chem. Specialties 45/5 (1969) 231
(25) Kangesu, T., et al., Br. J. Plastic Surgery 46 (1993) 401-409
(26) de Vries, H., et al., Wound Rep. Reg. 1 (1993) 244-252
(27) Breuing, K., et al., J. Surg. Res. 52 (1992) 50-58
(28) Andreassi, L., et al., Wounds 3 (1991) 116-126
(29) Myers, S. R., et al., Zusammenfassung Nr. 85 in "5th Annual Meeting of the European Tissue Repair Society" (August 1995), Padua
(30) Schärffetter-Kochanek, K., et al., J. Invest. Dermatol. 98 (1992) 3-11
(31) Lange, T. S., et al., J. Exp. Dermatol. 4 (1995) 130-137
(32) WO 92/09200
(33) WO 90/07577
(34) Noser, F. K., und Limat, A., In Vitro Cell & Dev. Biol. 23 (8) (1987) 541- 545
(35) Beil, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 1274-1278
(36) WO 91/17765

Claims

1. Transplantationsmaterial für die Behandlung von Hautwunden umfassend ein Biomaterial enthaltend an Mikrocarrier gebundene Keratinozyten, wobei die Mikrocarrier eine durchschnittliche Bedeckung zwischen 50 und 80 % der maximal mit Keratinozyten möglichen Bedeckung zeigen.

2. Transplantationsmaterial nach Anspruch 1, wobei die Keratinozyten ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus autologen Zellen, allogenen Zellen und einer Kombination von autologen und allogenen Zellen.

3. Transplantationsmaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Keratinozyten eine Kombination von 10-30% autologen Zellen und 70-90% allogenen Zellen sind.

4. Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Mikrocarrier mit einem Überzug ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus eukaryotischen Zellen oder Komponenten hiervon und extrazellulären Matrixproteinen vorbeschichtet werden, bevor die Keratinozyten angeheftet werden.

5. Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Biomaterial vor der Verwendung bei einer Temperatur von +3ºC bis +10ºC gelagert wird.

6. Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Biomaterial ein Gemisch von gelagertem und frisch hergestelltem Biomaterial ist.

7. Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Wunde eine Brandwunde ist.

8. Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die Keratinozyten allogene Zellen sind.

9. Verfahren zum Herstellen eines Biomaterials umfassend die Schritte:

Vorkultivieren von Keratinozyten,

dann Kultivieren der Keratinozyten in Gegenwart von Mikrocarriern, um Keratinozyten-bedeckte Mikrocarrier herzustellen, wobei die Keratinozyten diskontinuierlich gerührt werden, und

Isolieren jedwelcher Keratinozyten-bedeckter Mikrocarrier, wenn eine Bedeckung mit Keratinozyten von 50-80% erreicht ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Kultivierung der Keratinozyten in Gegenwart von Mikrocarriern zu Beginn in weniger als dem optimalen Volumen des Zellkulturmediums ausgeführt wird und eine Menge von Zellkulturmedium zum Einstellen des Volumens auf das optimale Volumen zugefügt wird, nachdem die Zellen an die Mikrocarrier angeheftet sind.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Transplantationsmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 8.

12. Verfahren zum Verwenden eines Transplantationsmaterials nach den Ansprüchen 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hautwunden.

13. Verfahren zum Verwenden nach Anspruch 12, wobei die Hautwunde ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brandwunden, diabetischen Wunden und altersbedingten Ulzera.