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DE4438015A1 - Epithelzellenhaltiges Biomaterial und dessen Verwendung als Transplantat - Google Patents

Epithelzellenhaltiges Biomaterial und dessen Verwendung als Transplantat

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Publication number
DE4438015A1
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DE
Germany
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cells
biomaterial
microcarriers
microcarrier
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE4438015A
Other languages
English (en)
Inventor
Nikolaos Dr Dimoudis
Anton Dr Dr Hartinger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
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Priority to IL11572895A priority patent/IL115728A0/xx
Priority to DE69530409T priority patent/DE69530409T2/de
Priority to AT95935961T priority patent/ATE237373T1/de
Priority to CA002201099A priority patent/CA2201099A1/en
Priority to PCT/EP1995/004164 priority patent/WO1996012510A1/en
Priority to US08/809,408 priority patent/US5980888A/en
Priority to AU38066/95A priority patent/AU3806695A/en
Priority to ZA958982A priority patent/ZA958982B/xx
Priority to EP95935961A priority patent/EP0788381B1/de
Priority to JP8513651A priority patent/JPH09511673A/ja
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Biomaterial, welches epitheliale Zellen auf Mikroträ­ gern (Microcarrier, MC) enthält, sowie dessen Herstellung und Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels.
Brandwunden und schwer heilende Wunden (Ulcera) werden üblicherweise mit Hautsheets aus autologen Keratinozyten behandelt (klassische Methode). Dazu wird dem Patienten ein Stück Haut abgenommen, die Keratinozyten in vitro gezüchtet und die so gewonnenen ver­ größerten Hautsheets transplantiert (Gallico et al. (1984) (1); Cuono et al. (1986) (2); De Luca et al. (1989) (3); Gallico et al. (1990) (4); De Luca and Cancedda (1992) (5)). Der Transfer dünner Hautsheets von Zellkulturflaschen auf beispielsweise Vaseline-Gaze als auch deren Fixierung auf der Wundfläche ist problematisch. Ein weiteres Problem ist die Ab­ deckung von Wunden an schwer zugänglichen Körperstellen. Außerdem können mit solchen klassischen Hautsheets lediglich Keratinozyten übertragen werden.
Aus WO 92/06179 (6) und EP-A 0 242 270 (7) sind Biomaterialien bekannt, welche Epithel­ zellen in einem Collagen-Gel enthalten. Dabei sind epitheliale Zellen (Fibroblasten oder Kera­ tinozyten) in Gelschichten eingebettet. Ein Nachteil dieses Biomaterials ist insbesondere die geringe Migrationsgeschwindigkeit der epithelialen Zellen aus dem Biomaterial in die Wunde. Außerdem sind die Handhabung und Fixierung dieser Biomaterialien sehr schwierig und auf­ wendig.
In WO 90/02796 (8) ist ein dreidimensionales Zellkultursystem beschrieben, auf Basis von beispielsweise Zellulose, Polyamid, Polyester, auf welchem epitheliale Zellen wachsen können. Dabei wird ein artifizielles Gewebe erhalten, das mit epithelialen Zellen (Fibroblasten oder Keratinozyten) bewachsen ist und für die Transplantation geeignet sein soll. Auch diese künst­ lichen Transplantationsmaterialien zeigen keinen Vorteil gegenüber den in der klassischen Methode verwendeten Hautsheets.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Biomaterial zur Verfügung zu stellen, welches die geschil­ derten Nachteile nicht besitzt und einfach und in großen Mengen herstellbar ist.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Biomaterials, welches epitheliale Zellen adhärent an Microcarrier gebunden enthält, zur Herstellung eines Transplantationsmaterials zur Behandlung von Wunden.
Als epitheliale Zellen sind alle epithelialen Zellen wie beispielsweise Keratinozyten, Fibro­ blasten und Endothelzellen geeignet.
Unter "Microcarriern" sind kleine, feste Partikel zu verstehen, die in einem langsam gerührten, wäßrigen Medium suspendierbar sind. Solche Microcarrier werden zur Kultivierung von eukaryontischen Zellen verwendet, wobei die Zellen in Form einer konfluenten Schicht auf der Oberfläche dieser Partikel wachsen. Derartige Microcarrier und ihre Anwendung in der Zell­ kultur sind beispielsweise beschrieben in Advances in Applied Microbiology 31 (1986) 139- 179.
Als Microcarrier sind alle Microcarrier geeignet, die aus einem biologisch verträglichen Material (wie z. B. Dextran, Gelatine, Silikon usw.) bestehen oder aus einer geeigneten Mischung mehrerer biologisch verträglicher Materialien. Geeignet sind beispielsweise Cytodex3® (Pharmacia AB, Schweden) auf Dextranbasis oder Cukispher-G® (Hyclone, Greiner, Deutschland) auf Gelatinebasis.
Die Größe der Microcarrier ist an sich unkritisch. Üblicherweise haben die Träger jedoch einen Durchmesser von 50-500 µm.
Microcarrier unter 50 µm Durchmesser sind so klein, daß sie in der Regel nicht ausreichend von Zellen bewachsen werden können. Microcarrier mit einer Größe über 500 µm sind so groß, daß zum einen ein hoher Bewachsungsgrad mit Zellen schwierig zu erreichen ist, und zum anderen sind diese Partikel im Hinblick auf Transplantationen nicht optimal, da die Ablö­ sung der epithelialen Zellen und Verteilung auf der Wunde bei solchen Partikeln nicht befrie­ digend abläuft.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß für ein erfindungsgemäßes Epidermis-Transplantat nicht wie bei den bekannten Verfahren autologe Zellen verwendet werden müssen, sondern ebenso allogene Zellen allein oder Gemische von autologen und allogenen Zellen geeignet sind. Dies hat den Vorteil, daß nicht in einer zeitaufwendigen Kultivierung für jeden Patienten ein vollständig autologes Transplantationsmaterial hergestellt werden muß. Das allogene Transplantationsmaterial kann standardisiert werden und ist dann in großen Mengen und jederzeit verfügbar. Dies ist besonders wichtig bei der Verwendung zur Behandlung großflä­ chiger Verbrennungen, die möglichst rasch behandelt werden müssen.
Auch dadurch, daß Biomaterial verwendet wird, das einen reduzierten Anteil an autologen Zellen enthält, kann die Zeit bis zum Beginn der Behandlung wesentlich verkürzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Biomaterial 10 bis 30% autologe Zellen enthal­ ten. Für die restlichen 70 bis 90% kann auf in großen Mengen verfügbares, gelagertes alloge­ nes Biomaterial zurückgegriffen werden. Damit kann die Herstellungszeit einer ausreichenden Menge von Transplantationsmaterial verkürzt werden, da nur eine geringe Menge autologer Zellen der Kultivierung gewonnen werden muß.
Darüber hinaus bietet das erfindungsgemäße Biomaterial neue Möglichkeiten zur Herstellung von individuellen Transplantationsmaterialien. Beispielsweise ist es möglich, unmittelbar vor der Transplantation das Transplantationsmaterial herzustellen. Dies kann auch durch Mischung von erfindungsgemäßem Biomaterial, welches autologe und/oder allogene epithe­ liale Zellen und/oder verschiedene epitheliale Zellen (z. B. Keratinozyten oder Fibroblasten) enthält, erfolgen. Dadurch können die speziellen Erfordernisse der zu behandelnden Wunde (z. B. Grad der Verbrennung, Verbrennungswunde oder Art der Wunde) optimal berücksich­ tigt werden.
Diese individuelle Anpassung der Zusammensetzung des Biomaterials an das Transplanta­ tionsproblem ist mit den Transplantationsmaterialien aus dem Stand der Technik nicht mög­ lich.
Zur Herstellung des Biomaterials werden die autologen und/oder allogenen epithelialen Zellen in einer dem Fachmann bekannten Weise (Rheinwald und Green (1975) (9) und Limat et al. (1989) (10)) aus humanem oder tierischem Material isoliert und zunächst zweckmäßig adhä­ rent vorkultiviert. Vorzugsweise nach der ersten oder zweiten Passage werden die Zellen zusammen mit den Microcarriern weiter kultiviert. Dies erfolgt entweder in gerührter Kultur (Spinnerkultur oder Fermenter) oder in ruhender Kultur (z. B. Zellkulturflaschen), wobei die Zellen vom Boden der Zellkulturflasche auf die Microcarrier übergreifen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können zur Verbesserung der Adhäsion der Zellen und Erhöhung des Bewachsungsgrades die Microcarrier vorbeschichtet werden. Die Beschichtung kann beispielsweise mit Proteinen der extrazellulären Matrix, wie Fibronectin oder Collagen, erfolgen oder mit ganzen eukaryontischen Zellen (z. B. nicht vermehrungsfähigen Fibroblasten) oder deren Bestandteilen (z. B. Membranfraktionen).
Vorzugsweise werden vor der Kultivierung die Microcarrier mit nicht vermehrungsfähigen epithelialen Zellen, wie z. B. Fibroblasten, beschichtet. Geeignete Fibroblasten sind beispiels­ weise abgetötete Mausfibroblasten aus der Zellinie 3T3. Eine solche Vorbeschichtung nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren ist beispielsweise in der DE 26 51 685 (11) beschrie­ ben. Ebenfalls bevorzugt ist es, die Microcarrier mit Substanzen, die die Haftung der Zellen verbessern (z. B. Collagen), vorzubeschichten. Die Vorbeschichtung erfolgt zweckmäßig nach Quellen der Microcarrier und Autoklavieren zur Sterilisation, jedoch vor der Inkubation mit den epithelialen Zellen. Dazu werden die Microcarrier mit einer wäßrigen Lösung eines sol­ chen Anhaftungsmoleküls oder der Zellsuspension (letztere zweckmäßig in Zellkulturmedium) inkubiert. Anschließend werden die beschichteten Microcarrier gewaschen (zweckmäßig mit PBS).
Zur Beschichtung der Microcarrier mit den epithelialen Zellen wird vorzugsweise in serum­ freiem Medium kultiviert, gegebenenfalls unter Zusatz von Hypophyseextrakt (Rind) oder tötalem Kälberserum.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Verbesserung des Bewachsungsgrades wachstums- bzw. zelldifferenzierungsfördernde Faktoren wie keratinocyte growth factor (KGF), nerve growth factor (NGF) oder platelet-derived growth factor (PDGF) zugesetzt.
Nachdem der gewünschte Bewachsungsgrad erreicht ist, werden die Zellen isoliert. Dies kann beispielsweise durch Sedimentation oder Zentrifugation bei geringen g-Werten (z. B. 10- 50 g) geschehen.
Die so isolierten Zellen werden entweder direkt in einer geeigneten galenischen Formulierung zur Wundbehandlung angewendet oder bis zur Behandlung konserviert. Zur Konservierung ist üblicherweise eine Kryokonservierung geeignet. Die Kryokonservierung erfolgt vorzugsweise unter Zusatz von kryoprotektiven Substanzen, wie DMSO oder Glycerol, bei einer Tempera­ tur von +3°C bis -196°C vorzugsweise für die Langzeitaufbewahrung (mehr als 6 Stunden). Bei einer Kurzzeitaufbewahrung (unter 6 Stunden) kann die Konservierung bei einer Tempera­ tur von +3°C bis +10°C auch ohne den Zusatz von kryoprotektiven Substanzen erfolgen.
Zur Herstellung eines Biomaterials, welches an Microcarrier gebundene autologe und allogene Zellen enthält, werden vorzugsweise zunächst autologe epidermale Zellen isoliert und in Gegenwart der Microcarrier kultiviert. Die Kultivierung wird solange durchgeführt, bis die Menge autologes Biomaterial erreicht ist, die als Anteil im Gemisch gewünscht ist. Dann wird allogenes Biomaterial (welches allogene epitheliale Zellen an den Microcarriern adhärent gebunden enthält) zugegeben und das erfindungsgemäße Epidermistransplantat als Mischung hergestellt. Dabei ist es bevorzugt, kryokonserviertes oder bei einer Temperatur zwischen +3°C und +10°C gelagertes allogenes Biomaterial zu verwenden. Vorzugsweise beträgt der Anteil an autologem Biomaterial in der Mischung zwischen 10 bis 30%. Ebenso ist es auch möglich, autologe und allogene Zellen zusammen in Gegenwart von Microcarriern zu kultivie­ ren. In diesem Fall erhält man ein Transplantationsmaterial, bei dem an die einzelnen Microcarrier sowohl autologe als auch allogene Zellen gebunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung verwendet, die aus Microcarriern besteht, bei denen jedes einzelne Microcarrierpartikel nur mit einer epithelialen Zellsorte, wie z. B. Fibroblasten oder Keratinozyten bewachsen ist. Ebenso ist es möglich, Microcarrier zu verwenden, auf denen mehrere epitheliale Zellsorten (vorzugsweise Fibro­ blasten und Keratinozyten) adhärent gebunden sind. Das Mischungsverhältnis der unterschied­ lich bewachsenen Microcarrier oder das Mischungsverhältnis der einzelnen Zellen auf einem Microcarrier ist an sich beliebig und kann je nach Anwendungszweck (z. B. Brandwunden, Altersulcera, diabetische Ulcera) vanieren. Dabei ist es bevorzugt, für diabetische Wunden nur Fibroblasten oder Fibroblasten im Überschuß und für Brandwunden nur Keratinozyten oder Keratinozyten im Überschuß zu den anderen epithelialen Zellen im Transplantationsmaterial zu verwenden.
Der Bewachsungsgrad der Microcarrier mit epithelialen Zellen ist in einem weiten Bereich variierbar. Je geringer der Bewachsungsgrad ist, umso geringer ist allerdings die Effizienz des Transplantats. In der Praxis ist es also vorteilhaft, einen möglichst hohen Bewachsungsgrad zu verwenden.
Der bevorzugte Bewachsungsgrad liegt zwischen 30 und 100%. Es hat sich allerdings über­ raschenderweise gezeigt, daß ein Bewachsungsgrad zwischen 50 und 80%, bevorzugt zwi­ schen 60 und 70%, ein Optimum darstellt.
Unter Bewachsungsgrad ist die durchschnittliche Menge von an den Microcarrier adhärent gebundenen Zellen in Bezug auf eine vollständige Bewachsung zu verstehen.
Diese Menge läßt sich entweder visuell mikroskopisch oder nach Ablösung der Zellen von den Microcarriern (beispielsweise durch Trypsinbehandlung) und Anfärbung bestimmen. Die voll­ ständige Bewachsung läßt sich zweckmäßig am einfachsten visuell mikroskopisch bestimmen. Typische Bilder für einen 30- und 80%igen Bewachsungsgrad der erfindungsgemäßen Microcarrier sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.
Zur therapeutischen Anwendung wird das konservierte Biomaterial (gegebenenfalls in einer Mischung mit frischem Biomaterial, das auch autolog sein kann) verwendet.
Dazu wird das Biomaterial aufgetaut, gegebenenfalls durch Waschen mit Medium die kryoprotektive Substanz entfernt und mit einer Präparation, die das galenische Medium dar­ stellt, gemischt.
Die Basis des galenischen Mediums ist zweckmäßig im wesentlichen das Kulturmedium. Es ist jedoch vorteilhaft, weitere hautverträgliche Stoffe zuzugeben, mit denen die Viskosität des Biomaterials verändert werden kann. Eine Optimierung der Viskosität ist insbesondere zur Optimierung der Handhabung des Biomaterials beim Aufstreichen und zur Haftung auf den Wunden vorteilhaft. Geeignete hautverträgliche Stoffe zur Veränderung des Viskositätsgrades sind beispielsweise Verdickungsmittel, Hilfsemulgatoren, Hydrokolloide oder Gelbildner, wie beispielsweise Gelatine, Pectin, Alginate, Zellulosederivate, Aqualose und Polysaccharide.
Diese Stoffe werden zweckmäßig dem galenischen Mittel in einer solchen Konzentration bei­ gemischt, daß die Microcarrierpräparation gut streichfähig, ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das galenische Medium noch Stoffe enthalten, die zusätzlich die Wundheilung verbessern, wie beispielsweise NGF, TGF-β, PDGF, KGF.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist als Epidermis-Transplantat geeignet zur Behandlung von beispielsweise Brandwunden, diabetischen Wunden, Altersulcera und anderen schwer heilenden Wunden. Ebenso geeignet ist das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Beschleuni­ gung der Wundheilung normaler Wunden. Eine weitere Verwendung ist in der plastischen Chirurgie gegeben.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Biomaterials ist, daß es im Gegensatz zu den bekannten Epidermis-Transplantaten in alle Richtungen flexibel ist und sich auch in einfacher Weise an schwierigen Stellen (z. B. Hautfalten, Ohr, Augenlider) der Körperoberfläche anpas­ sen läßt.
Zur Anwendung wird das erfindungsgemäße Arzneimittel zur Aufrechterhaltung der Wirk­ samkeit zweckmäßig mit einem geeigneten Verband (z. B. Fettgazeverband: Grassolin) auf die Wunden gebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung von autologen und allogenen epi­ thelialen Zellen, insbesondere Keratinozyten verwendet.
Als Keratinozyten werden vorzugsweise epidermale Keratinozyten (z. B. Vorhautkeratino­ zyten) verwendet.
Zur Herstellung eines Biomaterials auf Basis von insbesondere Keratinozyten ist es besonders bevorzugt, die Microcarrier wie bereits ausgeführt vorzubeschichten. Ebenso bevorzugt ist es, bei der Kultivierung der Zellen in Gegenwart der Microcarrier intermittierend zu rühren. Dazu wird die Kultur vorzugsweise für wenige Minuten (z. B. 1 bis 5 Minuten) bei Drehzahlen zwi­ schen 10 und 100 rpm gerührt und anschließend über einen längeren Zeitraum (ca. 20 bis 40 Minuten) ohne Rühren weiterkultiviert. Die intermittierenden Rührbedingungen werden über die gesamte Kultivierungszeit beibehalten. Als besonders vorteilhaft für die Kultivierung hat sich ca. zweiminütiges Rühren bei ca. 40 rpm mit einer anschließende Ruheperiode von ca. 30 Minuten herausgestellt. Diese Bedingungen sind selbstverständlich in gewissem Umfang vari­ abel. Es muß dabei darauf geachtet werden, daß möglichst kurz gerührt wird, aber trotzdem eine Durchmischung des Mediums erreicht wird, damit anschließend möglichst lange, ohne Rühren, bei möglichst geringer Beeinträchtigung des Zellwachstums und der Adhäsion der Zellen an die Microcarrier kultiviert werden kann.
Zur Erreichung eines hohen Bewachsungsgrads der Microcarrier bei der Kultivierung von ins­ besondere Keratinozyten ist es weiter bevorzugt, die Kultivierung zunächst in einer ersten Kultivierungsphase in einer möglichst geringen Menge des Kulturmediums durchzuführen. Diese Menge muß gerade so groß sein, daß die Zellen nicht in beträchtlichem Umfang abster­ ben und gleichzeitig an die Oberfläche der Microcarrier binden können. Erst nachdem die Keratinozyten in beträchtlichem Umfang an die Microcarrier adhärent gebunden sind (in der Regel nach 6 bis 8 Stunden), wird in einer zweiten Kultivierungsphase weiteres Medium zuge­ geben. Die Gesamtmenge des Mediums entspricht der Menge des Mediums, die optimal zur Bewachsung der Microcarrier unter Verwendung von unkritisch wachsenden epithelialen Zel­ len, wie Fibroblasten, verwendet wird. Für Microcarrier, die als Träger für adhärente Zellen bekannt sind, wird diese Menge üblicherweise vom Hersteller angegeben. Für 300 mg Cytodex 3® bzw. 100 mg Cultispher® beträgt die optimale Mediummenge dabei 100 ml. Zur Kultivierung der Keratinozyten wird in der ersten Kultivierungsphase lediglich ca. 40 bis 60% dieses optimalen Volumens des Zellkulturmediums zugegeben.
Die folgenden Beispiele, Publikationen und Abbildungen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
Fig. 1 zeigt Cytodex 3® Microcarrier mit einem Bewachsungsgrad von 30% Keratino­ zyten (Beispiel 2.2),
Fig. 2 zeigt das gleiche System mit einem Bewachsungsgrad von 80%.
Beispiel 1 Isolierung und Kultivierung humaner Keratinozyten 1) Epidermis Keratinozyten
Aus Hautstücken bzw. Vorhäuten werden enzymatisch Epidermiszellen (Keratinozyten) iso­ liert und in die Zellkultur überführt.
Die Isolierung erfolgt nach: Rheinwald und Green (1975) (9), Rheinwald (1980) (12), Limat et. al. (1989) (10).
Die Kultivierung und Vermehrung der Keratinozyten bis zur Verwendung für das Bewachs­ tum der Microcarrier (MC) erfolgt in statischer Kultur (Zellkulturflaschen oder Wannenstap­ ler-System) mit serumfreiem Medium.
2) Zellen der äußeren Wurzelscheide (ORS-Keratinozyten) aus Haarfollikeln
Das Ansetzen von Primärkulturen von ORS-Zellen und deren Expandierung (Kultivierung) in vitro erfolgt nach Limat und Noser (1986) (13), Limat et. al. (1989) (10).
Beispiel 2 Präparation der Microcarrier und Kultivierung von Keratinozyten auf Microcarrier (MC) (Bewachstum der MC) 2.1 Präparation der MC für die Kultivierung a) Cytodex 3® (Fa. Pharmacia)
Die MC werden abgewogen und in Phosphatgepufferter Saline ohne Calcium- und Magne­ siumionen (PBS -/-) bei RT über Nacht quellen gelassen (anfangs gelegentlich aufrühren). Das PBS wird dekantiert und die MC noch zweimal mit PBS gewaschen; je Gramm MC werden 50-100 ml PBS verwendet.
Die Suspension wird autoklaviert (115°C, 15 psi, 15 Min.) und anschließend werden die MC in Kulturmedium (GIBCO, Serumfrei) aufgenommen. Die MC werden einmal mit Kultur­ medium gewaschen und im selben Medium bei 4°C aufbewahrt.
b) Cultispher® (Fa. Hyclone)
Die MC werden abgewogen und in Phosphatgepufferter Saline ohne Calcium- und Magne­ siumionen (PBS -/-) bei RT über Nacht quellen gelassen (anfangs gelegentlich aufrühren). Das PBS wird dekantiert und die MC noch zweimal mit PBS gewaschen; je Gramm MC werden 50-100 ml PBS verwendet.
Vorbeschichtung mit Collagen
Die Suspension wird autoklaviert (115°C, 15 psi, 15 Min.). Anschließend werden die MC über Nacht bei 37°C in einer Lösung von Collagen 5-Typ I (3 mg Collagen S in 10 ml 0,1% CH₃COOH) gerührt; für 100 mg MC werden 10 ml Collagen-Lösung verwendet. Der Über­ stand wird verworfen, die MC einmal mit PBS-/- gewaschen und in Kulturmedium (GIBCO, Serumfrei) überführt. Nach einmaligem Waschen (mit Kulturmedium) werden die MC in Kul­ turmedium bei 4°C aufbewahrt.
2.2 Kultivierung der Keratinozyten auf die MC
Subkonfluente (ca. 70%), serumfrei kultivierte Keratinozyten (in Zellkulturflaschen) der ersten oder zweiten Passage werden mit einer Trypsin/EDTA-Lösung (5 ml pro Zellkulturflasche [175 cm² Kulturfläche] einer 0,05%iger Trypsin/0,02%iger EDTA-Lösung in PBS-/-, Wirk­ zeit: ca. 5 Min. bei 37°C) vom Boden des Kulturgefäßes abgelöst. Die Abtrypsinisierung wird mit 3 ml FKS (fötales Kälberserum) gestoppt. Diese Suspension einzelner Zellen wird abzentri­ fugiert (10 Min., bei 180 g). Das Zellpellet wird in Kulturmedium gut resuspendiert und eine Zellzählung mit Trypanblau durchgeführt.
Die Einsaat mit den MC erfolgt in eine Spinnerflasche (Effektivvolumen 50 ml). Zu etwa 1×10⁷ Zellen werden 300 mg Cytodex 3-MC bzw. 100 mg Cultispher gegeben (ca. 10 Zellen pro Carrier) und das Flüssigkeitsvolumen mit serumfreiem Kulturmedium auf 30 ml eingestellt.
Das Rühren in der Spinnerflasche erfolgt intermittierend: 2 Min. bei 40 rpm, darauf folgend 30 Min. ohne Rühren. Diese Rührbedingungen werden während der ganzen Kultivierungszeit bei­ behalten.
Nach 6-8 Stunden wird mit Medium auf ein Volumen von 100 ml aufgestockt (eventuell er­ folgt die Überführung in eine Spinnerflasche mit einem Effektivvolumen von 250 ml). Während der weiteren Kultivierungszeit wird das Medium zweimal täglich (ca. alle 12 Stunden) wie folgt gewechselt: Die Carrier setzen sich am Boden der Flasche ab, das verbrauchte Medium wird weitmöglichst abgesaugt und durch frisches ersetzt.
Während der Kultivierungszeit wird der Bewachsungsgrad der MC mikroskopisch bewertet und photographisch dokumentiert. Bei den Cytodex 3 MC werden die Zellen ohne Anfärbung bewertet. Bei den Cultispher MC werden die Keratinozyten vorher mit dem Höchst Farbstoff 33342 angefärbt. Beispiele mit Zellen auf Cytodex 3 MC:
Fig. 1: Bewachsungsgrad ca. 30%
Fig. 2: Bewachsungsgrad ca. 80%.
Nach Erreichen des erwünschten Bewachsungsgrades wird das überschüssige Medium (nach dem Absetzen der Carrier) abgesaugt und die restliche Suspension mit 10-50 g, 10 Min. abzen­ trifugiert. Dem Pellet wird eine galenische Substanz beigemischt und das Ganze kommt so zur Anwendung oder das Pellet wird unter dem Zusatz eines Kryoprotektivs zur späteren Anwen­ dung eingefroren.
Die nachfolgende Tabelle zeigt den Bewachsungsgrad von Microcarriern mit Keratinozyten in Abhängigkeit von den optimierenden Verfahrensmerkmalen:
  • - intermittierendes Rühren
  • - Volumenaufstockung des Mediums nach 6 bis 8 Stunden
Tabelle 1
Aus Tabelle 1 ergibt sich, daß jedes einzelne dieser Optimierungsmerkmale seinen Beitrag zur Steigerung des Bewachsungsgrads leistet. Die Kombination von intermittierendem Rühren und Volumenerhöhung rührt zu einer entscheidenden Verbesserung des Bewachsungsgrades.
Referenzliste
(1) Gallico, G.G., et al., NewEngl. J. Med. 311 (1984) 448-451
(2) Cuono, C., et al., Lancet (1986) 1123-1124
(3) DeLuca, M., et al., Burns 15 (5) (1989) 303-309
(4) Gallico, G.G., Clinics in Plastic Surgery 17 (3) (1990) 519-526
(5) De Luca, M., and Cancedda, R., Burns 18 (1) (1992) 5-9
(6) WO 92/06179
(7) EP-A 0 242 270
(8) WO 90/02796
(9) Rheinwald, J.G., und Green, H., Cell 6 (1975) 331-334
(10) Limat, A., et al., J. Invest. Dermatol. 92 (1989) 758-762
(11) DE26 51 685
(12) Rheinwald, J.G., Methods Cell. Biol. 21A (1980) 229-254
(13) Limat, A., und Noser, F., J. Invest. Dermatol. 87 ((1986) 485-488

Claims (20)

1. Verwendung von Biomaterial enthaltend an Microcarrier adhärent gebundene epi­ theliale Zellen zur Herstellung eines Transplantationsmaterials zur Behandlung von Wunden.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als epitheliale Zellen autologe und/oder allogene Zellen verwendet werden.
3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als epithe­ liale Zellen Keratinozyten, Fibroblasten und/oder Endothelzellen verwendet werden.
4. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Microcarrier ein biologisch verträgliches Material verwendet wird.
5. Verwendung nach den Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Microcarrier einen Durchmesser von 50-500 µm besitzen.
6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Microcarrier einen Bewachsungsgrad mit epithelialen, adhärenten und gebundenen Zellen von durchschnittlich zwischen 30 und 100% des maximal möglichen Bewach­ sungsgrads aufweisen.
7. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit eukaryontischen Zellen oder deren Bestandteilen oder mit Proteinen der extrazellu­ lären Matrix vorbeschichtete Microcarrier verwendet werden.
8. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Bio­ material gegebenenfalls unter Zusatz von kryoprotektiven Substanzen vor Verwen­ dung bei einer Temperatur von +3°C bis +10°C oder unter Zusatz von kryoprotekti­ ven Substanzen bei einer Temperatur von +3°C bis -196°C gelagert wird.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomaterial ein Gemisch aus gelagertem und frisch hergestelltem Biomaterial verwendet wird.
10. Verfahren zur Herstellung eines Biomaterials bestehend aus epithelialen Zellen, wel­ che adhärent an Microcarrier gebunden sind, durch Vorkultivierung der epithelialen Zellen, mindestens ein- oder zweimaliges Passagieren der Zellen, Weiterkultivierung der Zellen in Gegenwart von Microcarriern und Isolierung der zellbewachsenen Microcarrier, wenn ein Bewachsungsgrad von 30-100% erreicht ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in serumfreiem Medium erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung des Bewachsungsgrades wachstumsfördernde oder zelldifferenzierungstörderne Faktoren wie keratinocyte growth factor (KGF), nerve growth factor (NGF) oder platelet­ derived growth factor (PDGF) zugesetzt werden.
13. Biomaterial, welches epitheliale Zellen adhärent an Microcarrier gebunden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß mit eukarvontischen Zellen oder deren Bestandteilen oder Proteinen der extrazellulären Matrix vorbeschichtete Microcarrier verwendet werden.
14. Biomaterial, welches Keratinozyten in einem Bewachsungsgrad von über 30% adhä­ rent an Microcarrier gebunden enthält.
15. Biomaterial, welches epitheliale Zellen adhärent an Microcarrier gebunden enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Temperatur von +3 bis +100, gegebenenfalls unter Zusatz von kryoprotektiven Substanzen, oder eine Temperatur von +3 bis -196°C unter Zusatz von kryoprotektiven Substanzen besitzt.
16. Biomaterial nach den Ansprüchen 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Microcarrier einen Durchmesser von 50 bis 500 µm besitzen.
17. Biomaterial nach den Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Microcarrier einen Bewachsungsgrad mit epithelialen, adhärent gebundenen Zellen von durchschnittlich zwischen 30 und 100% des maximal möglichen Bewachsungs­ grads aufweisen.
18. Biomaterial nach den Ansprüchen 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß mit eukaryontischen Zellen oder deren Bestandteilen oder mit Proteinen der extrazellu­ lären Matrix vorbeschichtete Microcarrier verwendet werden.
19. Biomaterial nach den Ansprüchen 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mischung von Microcarrier enthält, wobei diese Microcarrier autologe und/oder allo­ gene epitheliale Zellen adhärent gebunden enthalten.
20. Biomaterial nach den Ansprüchen 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß als epithe­ liale Zellen Keratinozyten, Fibroblasten und/oder Endothelzellen verwendet werden.
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