CN109771694A - 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种搭载人脐带华通胶间充质干细胞的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备。本发明还公开了一种用于搭载人脐带华通胶间充质干细胞的组织工程材料，其包含自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。本发明中的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料为RADA16‑1多肽的水凝胶。本发明的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料成分明确，性能稳定，且无毒害，生物相容性好，能够为培养人脐带华通胶间充质干细胞提供可靠的微环境，在利用组织工程材料复合人脐带华通胶间充质干细胞的研究中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学、组织工程技术领域，特别是涉及一种搭载人脐带华通胶间充质干细胞的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用。
背景技术
间充质干细胞来源于中胚层，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。其免疫源性弱，能向多种组织增殖分化，已经成为组织工程技术领域及细胞移植治疗中理想的种子细胞来源。间充质干细胞最早在人骨髓中发现，但骨髓中存在少量其他细胞，如造血细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等，而间充质干细胞含量较少，分离纯化困难，并且随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量和增殖分化能力呈现出显著下降。不能忽视的还有，获取骨髓组织对供者带来较大困苦和创伤，故广泛应用于临床面临较大困难。
人脐带华通胶间充质干细胞，来源于新生儿脐带，属于医疗废弃组织，对供者不产生困苦和损伤，且来源广泛，因此更容易得到推广应用于临床。华通胶组织是脐带动静脉之间的胶冻样间质，含有较多胶原纤维，胶原酶能够水解华通胶组织的胶原纤维结构，但不会对人脐带华通胶间充质干细胞造成损伤。
随着生物学治疗和组织工程技术的发展，大量新的治疗方法已经在科研层面取得良好的效果和广阔的前景。研究表面，利用组织工程技术构建仿髓核组织的生物支架材料，能够为部分细胞提供生长的微环境，这样若通过此种生物支架材料搭载干细胞，不仅能够保证干细胞的生存，还能够确保干细胞在指定部位稳定的最大限度的发挥干细胞的作用。目前研究发现，RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-GG-KOSSAPTQLN-CONH2)是一种可注射的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。可通过微创注射进入髓核组织。这种材料，能够快速形成大量纳米纤维，构成与细胞外基质相似，为细胞的培养提供良好的三维环境。在骨、神经、心肌等方面已经取得良好的研究成果。
本研究从构建自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料出发，探索其在搭载人脐带华通胶间充质干细胞方面的应用，填补利用组织工程方法搭载干细胞的方法发挥治疗作用的空白。
发明内容
本发明提供了一种自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用。本发明的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料成分明确，性能稳定，且无毒害，生物相容性好，能够持续对人脐带华通胶间充质干细胞提供生存支持，在利用组织工程方法搭载干细胞的方法发挥治疗作用的研究中具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一、构建自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料
1、将自组装多肽RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-GG-KOSSAPTQLN-CONH2)(纯度>90％)的多肽粉，利用超纯水将其溶解，使溶液浓度达到1％，并采用超声破碎仪探针超声，使其彻底溶解，然后将溶液利用孔径为0.22μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒，得到1％自组装多肽RADA16-I溶液备用。
2、向transwell小室每个小孔先后加入400μL培养基和100μL 1％自组装多肽RADA16-I溶液，然后于37℃培养箱内孵育1h。
3、待transwell小室内溶液形成凝胶后，再向凝胶表面缓慢加入400μL培养基，然后于37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
4、培养基的配制成分为：
5、培养基的配制方法为：将各成分混合后，搅拌充分溶解，然后利用微孔滤膜正压抽滤器(内置3张Ф0.22μm滤膜)抽滤，每90mL分装在100mL无菌瓶中，密封，4℃冷藏。并将其pH调节在6.9～7.2之间。
二、应用自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料，搭载人脐带华通胶间充质干细胞
1、获取人脐带华通胶间充质干细胞。
(1)使用的新生儿脐带，是足月产新生儿，且产妇的乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体免疫4项均为阴性的健康产妇。
(2)将脐带在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃恒温消化18h。
(3)消化后至无组织块时，采用2500rpm离心，共10min，后弃上清，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％CO2条件培养。
(4)待细胞融合达到80-90％时，弃上清，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，弃上清后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。
(5)0.2％胶原酶溶液的制备方法是：100mgⅡ型胶原酶加入50ml DMEM/F12培养基，完全溶解后，0.22μm过滤除菌。DMEM/F12完全培养基的制备方法：450ml DMEM/F12培养基内加入50ml特级胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培养基，加入青霉素及链霉素，使浓度为100u/mL青霉素、100μg/m L链霉素。
2、利用10％蔗糖水重悬法，收集人脐带华通胶间充质干细胞，将20μL中含1×105个人脐带华通胶间充质干细胞的混悬液与100μL1％自组装多肽RADA16-I溶液迅速混合。
3、将制备的细胞/1％自组装多肽RADA16-I混合溶液快速置入transwell小室内，再向其表面缓慢轻柔加入400μL完全培养基，并将transwell小室置于每个小孔加入400μL完全培养基的24孔板中，37℃培养箱内孵育10min。然后，对培养孔和水凝胶表面的完全培养基进行更换，37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
4、完全培养基的配制方法为，将前面制得的培养基，在使用前，每瓶溶液中加入10mL胎牛血清，即为完全培养基。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
制备自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料。
1、将自组装多肽RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-GG-KOSSAPTQLN-CONH2)(纯度>90％)的多肽粉10mg，利用1ml超纯水将其溶解，使溶液浓度达到1％，并采用超声破碎仪探针超声，使其彻底溶解，然后将溶液利用孔径为0.22μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒，得到1％自组装多肽RADA16-I溶液备用。
2、向transwell小室每个小孔先后加入400μL培养基和100μL 1％自组装多肽RADA16-I溶液，然后于37℃培养箱内孵育1h。
3、待transwell小室内溶液形成凝胶后，再向凝胶表面缓慢加入400μL培养基，然后于37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
4、培养基的配制成分为：
5、培养基的配制方法为：将各成分混合后，搅拌充分溶解，然后利用微孔滤膜正压抽滤器(内置3张Ф0.22μm滤膜)抽滤，每90mL分装在100mL无菌瓶中，密封，4℃冷藏。并将其pH调节在6.9～7.2之间。
实施例2
收集培养人脐带华通胶间充质干细胞。
27岁女性，经产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约20cm为材料，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存。
在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成5cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除脐动脉、脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃消化5小时，待消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上清液，再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度为20％，37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第3天开始贴壁，第5天用含20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液。以后每2～3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。
实施例3
细胞/多肽水凝胶支架材料的制备。
1、利用10％蔗糖水重悬法，收集人脐带华通胶间充质干细胞，将20μL中含1×105个人脐带华通胶间充质干细胞的混悬液与100μL1％自组装多肽RADA16-I溶液迅速混合。
2、将制备的细胞/1％自组装多肽RADA16-I混合溶液快速置入transwell小室内，再向其表面缓慢轻柔加入400μL完全培养基，并将transwell小室置于每个小孔加入400μL完全培养基的24孔板中，37℃培养箱内孵育10min。然后，对培养孔和水凝胶表面的完全培养基进行更换，37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
3、完全培养基的配制方法为，将前面制得的培养基，在使用前，每瓶溶液中加入10mL胎牛血清，即为完全培养基。
实施例4
观察自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料
1、将已经制备的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料和细胞/多肽水凝胶分别利用2.5％戊二醛固定30min。
2、利用PBS冲洗3次。
3、分别用30％、50％、70％、80％、90％和100％酒精梯度脱水，每次脱水10min。
4、利用叔丁醇进行零界点干燥。
5、对材料进行喷金。
6、使用扫描电镜对材料进行观察，放大400～25000倍，电压20kV。
试验结果
利用扫描电镜，可见自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料形成的纤维交织成错列有序的空隙样结构支架材料，纤维直径约20～40nm，孔径约10～250nm。将人脐带华通胶间充质干细胞种植入支架材料培养15天后，观察可见大量人脐带华通胶间充质干细胞，细胞通过伪足与支架内的纳米纤维紧密粘附，呈现出立体生长状态，并可见大量细胞外基质样分泌物。
Claims (10)
1.一种自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法，其特征在于，所述的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料是一种RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-GG-KOSSAPTQLN-CONH2)水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的自组装多肽RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-GG-KOSSAPTQLN-CONH2)是一种纯度>90％的多肽粉，利用超纯水将其溶解，使溶液浓度达到1％，并采用超声破碎仪探针超声，使其彻底溶解，然后将溶液利用孔径为0.22μm的一次性无菌注射式过滤膜消毒，得到1％自组装多肽RADA16-I溶液备用。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，向transwell小室每个小孔先后加入400μL培养基和100μL权利要求2所制备的1％自组装多肽RADA16-I溶液，然后于37℃培养箱内孵育1h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，待权利要求3所述transwell小室内溶液形成凝胶后，再向凝胶表面缓慢加入400μL培养基，然后于37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
5.根据权利要求3或者4所述的制备方法，其特征在于，其培养基的配制成分为：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其培养基的配制方法为：将各成分混合后，搅拌充分溶解，然后利用微孔滤膜正压抽滤器(内置3张Ф0.22μm滤膜)抽滤，每90mL分装在100mL无菌瓶中，密封，4℃冷藏。并将其pH调节在6.9～7.2之间。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将收集的人人脐带华通胶间充质干细胞和1％自组装多肽RADA16-I溶液混合，然后进行细胞/多肽水凝胶支架材料的制备。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，利用10％蔗糖水重悬法，收集人脐带华通胶间充质干细胞，将20μL中含1×105个人脐带华通胶间充质干细胞的混悬液与100μL1％自组装多肽RADA16-I溶液迅速混合。
9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求9中制备的细胞/1％自组装多肽RADA16-I混合溶液快速置入transwell小室内，再向其表面缓慢轻柔加入400μL完全培养基，并将transwell小室置于每个小孔加入400μL完全培养基的24孔板中，37℃培养箱内孵育10min。然后，对培养孔和水凝胶表面的完全培养基进行更换，37℃培养箱内孵育30min。然后每隔30min对培养孔及凝胶表面的完全培养基进行更换，共两次以平衡多肽水凝胶表面的pH值。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其完全培养基的配制方法为，根据权利要求7所制得的培养基，在使用前，每瓶溶液中加入10mL胎牛血清，即为完全培养基。
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