DE10121255A1

DE10121255A1 - Verwendung von alpha 1-Antichymotrypsin Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren, oder einer ein ACT Polypeptid oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle, zur Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen

Info

Publication number: DE10121255A1
Application number: DE10121255A
Authority: DE
Inventors: Joern-Peter Halle; Andreas Goppelt; Peter Hof
Original assignee: Switch Biotech AG
Current assignee: Switch Biotech AG
Priority date: 2001-04-30
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2002-11-07
Also published as: US20030073657A1; DE60203172T2; US7255988B2; DE60203172D1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von alpha 1-Antichymotrypsin (ACT) Polypeptiden und/oder diese kodierende Nukleinsäuren oder einer ein ACT Polypeptid oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Diagnose, Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Expression oder Funktion von ACT beeinflussen.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von alpha 1-Antichymotrypsin (ACT) Polypeptiden und/oder diese kodierende Nukleinsäuren, oder einer ein ACT Poly peptid oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle, zur Diagnose, Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die Expression oder Funktion von ACT beeinflußen.

Hautwunden gesunder Patienten heilen normalerweise problemlos. Es sind jedoch eine Vielzahl zeitlicher und räumlicher Veränderungen der Zellzusammensetzung der Haut nötig, um eine vollständige Heilung des Gewebes zu erreichen. Dieser Prozeß kann bis zu 2 Jahre andauern und ist bei nicht-foetalem Gewebe stets mit Narbenbildung verbunden. Dies weist auf die enorme Komplexität des Wundhei lungsprozesses der Haut hin. Bei der Wundheilung können die zeitlich aufeinan derfolgenden, partiell überlappenden Phasen der Koagulation, Entzündung, Proli feration und Reorganisation unterschieden werden (The Physiology of Wound Healing, 1998, Oxford Institute for Continuing Education). Während der Koagu lation aggregieren Blutplättchen, die Wachstums- und Koagulationsfaktoren frei setzen. Es wird eine Fibrin-Matrix gebildet, die die Zellmigration in der Wunde ermöglicht. Anschließend kommt es ca. 5-7 Tage nach der Verletzung zu einer Entzündungsreaktion. Dabei wandern verschieden Zelltypen, vor allem neutrophile Granulozyten und Monozyten in die Wunde ein und setzen Mediato ren der Entzündungsreaktion frei. Die Proliferationsphase dient der Wiederher stellung der Blutgefäße, der Neubildung verletzten Gewebes und der Restrukturie rung neugebildeten Gewebes. Die dabei beteiligten Prozesse umfassen vor allem die Neovaskularisation, Fibroblastenproliferation und Reepithelisierung durch Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten. Die Fibroblasten sezernie ren mehrere Wachstumsfaktoren wie PDGF und TGF-beta, die wiederum die Synthese und Einlagerung von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), wie Fibronektin, Laminin, Glykosaminoglykane und Kollagen, regulieren. Wäh rend der Reorganisation des Gewebes kommt es zu einer Umordnung der ECM- Komponenten, insbesondere des Kollagens. Durch den ständigen Abbau von Kollagen und die Neusynthese kann die reepithelisierte Wunde reifen und es kommt innerhalb von 2 Jahren zur Bildung einer flachen Narbe. Wiederum sind eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Chemoattraktoren für den koordinier ten Umbau des Gewebes notwendig. So beeinflussen Interleukin 1, TNF-beta und Interferon-gamma die Sezernierung der ECM-Komponenten. Weiterhin sind TGF-beta, PDGF und FGF essenziell für die Reorganisation.

Neben den Prozessen, die zum Aufbau zerstörter Strukturen beitragen, sind jedoch auch proteolytische Vorgänge wichtig für die Wundheilung, da Zelldebris entfernt und intermediäre Strukturen wie Fibrinmatrix wieder abgebaut werden müssen. Eine Vielzahl von Proteasen sind beispielsweise am Wundrand aktiv (Martin et al., 1997, Science, 276: 75-81). Plasminogen wird durch Plasminogen-Aktivator und den Urokinase-Typ Plasminogenaktivator, die in wandernden Keratinozyten hochreguliert sind, aktiviert, wodurch die Keratinozyten die vor ihnen liegende Fibrinmatrix abbauen können. Dies ist konsistent mit der Beobachtung, daß Plas minogen-knock-out Mäuse nahezu keine Reepithelisierung aufweisen. Daneben spielen Metalloproteinasen (MMP) eine wichtige Rolle. MMP9 (Gelatinase B), MMP1 ("interstitial Collagenase") und MMP10 (Stromelysin-2) werden zu verschiedenen Zeitpunkten aktiviert und zeichnen sich durch unterschiedliche Sub stratspezifität aus. Auch neutrophile Granulozyten und Monozyten (Makropha gen) sezernieren Proteasen (Dorne et al., 1999, Wound Rep. Reg. 7: 433-441; Shapiro et al., J. Rheumatol. Suppl., 1991, 27: 95-98). Monozyten enthalten die intrazellulären Serinproteasen Elastase und Cathepsin G und sekretieren geringe Mengen an Metalloproteasen. In differenzierenden mononukleären Phagozyten wiederum ist die Expression von Cathepsin G supprimiert und die Expression von Kollagenase zeitlich verzögert. In reifen Makrophagen wurde beobachtet, daß die Expression von Metalloproteinasen nach Stimulation stark induziert ist (Shapiro et al., J. Rheumatol. Suppl., 1991, 27: 95-98).

Im Zusammenhang mit chronischen Wunden sind besonders die Matrix Metal loproteasen in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. So finden sich im Wund sekret chronischer Wunden im Vergleich zu chirurgischen Wunden oder offenen Hautwunden signifikant erhöhte Mengen an kollagenolytischer Aktivität (Yager et al., 1996, J. Invest. Dermatol. 107: 743-748). Beispielsweise belegen verschiedene Untersuchungen, daß die MMP-1-Menge in chronischen Wunden deutlich erhöht ist und MMP-1 die vorherrschende Kollagenase im Sekret chronischer Wunden ist. (Vaalamo et al., 1997, J. Invest. Dermatol., 109: 96-101; Nwomeh et al., 1999, J. Surg. Res., 81: 189-195). Auch MMP8 ist in chronischen Wunden verstärkt exprimiert (Yager et al., 1996, J. Invest. Dermatol. 107: 743-748; Nwomeh et al., 1999, J. Surg. Res., 81: 189-195). Zusätzlich zu den MMPs der Klasse der in terstitional collegenases wurden auch andere MMPs, nämlich die Gelatinasen MMP2 und MMP9 und die Stromelysine MMP3, MMP10 und MMP11 in er höhter Menge in chronischen Wunden nachgewiesen (Nagase und Woessner, 1999, J. Biol. Chem., 274: 21491-21494). Daneben wurde postuliert, daß auch Serinproteaseaktivität, nämlich Elastaseaktivität in chronischen Wunden vorhan den ist, die Fibrin und Fibronektin abbaut (Palolahti et al., 1993, Exp. Dermatol., 2: 29-37; Rao et al., 1995, J. Invest. Dermatol., 105: 572-578; Grinnell und Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol., 106: 335-341; Herrick et al., 1997, Lab. Invest., 77: 281-288).

Eine weitere Serinprotease, Cathepsin G, wurde im Granulationsgewebe chroni scher Dekubitusgeschwüre nachgewiesen (Rogers et al., 1995; Wound Rep. Reg., 3: 273-283). Dagegen konnten keine erhöhten Mengen an Cathepsin G in venösen Fußulzera festgestellt werden (Weckroth et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106: 1119-1124). Diese auf den ersten Blick widersprüchlichen Ergebnisse sind nur ein Hinweis darauf, daß unter chronischen Hautwunden sehr unterschiedliche Erkran kungen mit unterschiedlichem pathogenetischem Hintergrund zusammengefaßt sind. Im allgemeinen werden diabetische Ulzera, venöse Ulzera, arterielle Ulzera und Dekubitusulzera unterschieden. Dekubitusulzera sind durch längerfristige Druckeinwirkung bedingte, sehr tiefe Wunden, die mit Nekrose, Infektion und Mazeration des Gewebes einhergehen. Dagegen sind venöse Ulzera, die durch venöse Stasis hervorgerufen werden, eher oberflächlich. Arterielle Ulzera werden häufig durch arterielle Verschlußkrankheiten verursacht. Diabetische Ulzera wie derum sind Ulzera, die häufig bei Diabetes-Patienten vorkommen. Die Spätkom plikationen der Diabetes umfassen neben einer Vielzahl von Erkrankungen auch charakteristische Hautveränderungen, wie häufige Infekte, trophische Störungen und Necrobiosis lipoidica. Diese Veränderungen können sich, häufig durch mikroangiopathische Störungen bedingt, dann zu schlecht heilenden Ulzera ent wickeln. Die epidemiologische Bedeutung dieser Erkrankungen wird deutlich, betrachtet man die folgenden Erhebungen: 25% der Patienten mit Typ-II-Diabetes erkranken häufig an chronischen Ulzera ("diabetischer Fuß"), von denen etwa die Hälfte der Patienten aufwendige stationäre Behandlungen erfordern und letztlich doch schlecht heilen. Der diabetische Fuß verursacht mehr Klinikaufenthalte als jede andere mit Diabetes assoziierte Komplikation. Die Zahl dieser Fälle bei Dia betes Typ I und II ist im Steigen begriffen und repräsentiert ca. 2,5% aller Klinik einweisungen.

Es wurde postuliert, daß eine gestörte, übermäßig starke proteolytische Aktivität in chronischen Wunden für die schlechte Heilung verantwortlich ist (Yager et al., 1999, Wound Rep. Reg., 7: 433-441). Im Falle der normal verlaufenden Wund heilung wird durch die Bereitstellung verschiedenster Proteaseinhibitoren ein Gleichgewicht zwischen proteolytischer und anti-proteolytischer Aktivität herge stellt. Dies wird durch die These gestützt, daß einige Proteaseinhibitoren in chro nischen Wunden in verringerter Menge vorkommen und somit möglicherweise ein mangelnder "Antiproteaseschild" hinsichtlich einiger Proteaseinhibitoren be steht (Yager et al., supra): im Falle des Metalloproteaseinhibitors TIMP-1, des unspezifischen Proteaseinhibitors alpha2-Macroglobulin und des Elastaseinhibi tors alphal-Proteaseinhibitor wurden verminderte Mengen in chronischen Wun den beschrieben (Yager et al., 1997, Wound Rep. Reg., 5: 23-32; Grinnell et al., J. Invest. Dermatol., 110: 771-776; Bullen et al., J. Invest. Dermatol., 104: 236-240; Rao et al., 1995; J. Invest. Dermatol., 105: 572-578; Grinnell und Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol., 106: 335-341). Aufgrund des Proteaseinhibitormangels wird zuviel Kollagen abgebaut und nicht genügend für die Wundheilung erforderliches Kollagen neu synthetisiert. Diese Ergebnisse werden durch weitere Studien bestä tigt (Nwomeh et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 81: 189-195; Vaalamo et al., 1996, Br. J. Dermatol., 135: 52-59; Witte et al., 1998, Surgery, 124: 464-470). Daher wurde vorgeschlagen, den Antiproteaseschild durch Induktion der Expres sion der fehlenden oder vermindert exprimierten Proteaseinhibitoren oder durch Gabe exogener Proteaseinhibitoren erhöht werden sollte. Auf der Grundlage die ser Hypothese wurde Vielzahl von Inhibitoren der Metalloproteinasen entwickelt (z. B. WO 200073295; US 6166084; WO 200105397; WO 200063165; WO 200046189; WO 200044723; DE 198 51 184; US 6071903; EP-1004578; EP- 949246; WO 9858925; EP-878467); von denen jedoch kein Medikament zur Be handlung chronischer Hautwunden zugelassen wurde, das in das Protease- Antiproteasegleichgewicht eingreift. Zudem wurde in der Forschung bisher nur unzureichend zwischen den verschiedenen Krankheiten, die unter "chronischen Ulzera" zusammengefaßt werden, unterschieden. Daher lassen sich die Ergebnisse der Studien nicht ohne weiteres auf andere Wundheilungsstörungen übertragen.

Daher gibt es bisher keine wirksamen Therapien für chronischen Wundheilungs störungen. Etablierte Therapieformen beschränken sich auf physikalische Unter stützung der Wundheilung (z. B. Verbände, Kompressen, Gele), der Ausschabung nekrotischen Gewebes und der Transplantation von Hautgeweben, gezüchteten Hautzellen und/oder Matrixproteinen. In den letzten Jahren sind Wachstumsfakto ren zur Verbesserung der Wundheilung erprobt worden, ohne jedoch die konven tionelle Therapie entscheidend zu verbessern.

Angesichts der weltweit stark zunehmenden Zahl von Diabetes II Patienten und der großen Zahl der unter arterieller Ulzera leidenden Patienten besteht eine große Nachfrage nach neuen Wirkstoffen, die die Heilung Diabetes-assoziierter sowie arterieller schlecht heilender Wunden entscheidend verbessern. Aufgabe der vor liegenden Erfindung war es daher, einen neuen Wirkstoff zu finden, der die Hei lung diabetes-assoziierter und arterieller schlecht heilender Wunden entscheidend verbessert.

Überraschenderweise zeigt nun die vorliegende Erfindung, daß die Stärke der Ex pression des murinen ACT in Wunden diabetischer Mäuse im Vergleich zu in takter Haut nicht signifikant erhöht ausfiel, während sowohl in Wunden von nor mal heilenden Kontrolltieren als auch in schlecht heilenden Wunden von alten Tieren und von mit Dexamethason behandelten Tieren mit schlechter Wundhei lung eine starke Erhöhung der ACT Expression gegenüber intakter Haut festge stellt wurde. Dies weist auf eine für schlecht heilenden Wunden diabetischer Säu getiere und für arteriell-schlecht heilenden Wunden spezifische Fehlregulation der ACT Expression hin. In normal heilenden Kontrolltieren kommt es nach Wund setzung zu einer drastisch erhöhten Expression von ACT im Wundgewebe, die durch Stärkung des Antiproteaseschildes eine verstärkte Neusynthese von Kolla gen ermöglicht und damit eine zügige Wundheilung unterstützt. Die überraschen de Beobachtung der im Falle der schlecht heilenden Wunden diabetischer Säuge tiere und der arteriell-schlecht heilenden Wunden unveränderten Expressionsstärke des ACTs relativ zu intakter Haut eröffnete daher die Möglichkeit, die Wund heilung durch Erhöhen des ACT Menge in der Wunde zu therapieren. Ferner zei gen die Ergebnisse, daß diese Störung des ACT Proteaseinhibitorgleichgewichtes spezifische für schlecht heilende Wunden diabetischer Säugetiere und für arteriell- schlecht heilende Wunden ist. Im Falle der Wundheilungsstörungen der schlecht heilenden Wunden alter Tiere und der mit Dexamethason behandelten Tieren mit schlechter Wundheilung sind andere Faktoren für die schlechte Wundheilung ver antwortlich zu machen da in diesen Fällen keine Fehlregulation der ACT Expres sion in Wunden versus intakter Haut vorlag.

Die im Rahmen dieser Erfindung durchgeführten Experimente (z. B. Beispiel 2) demonstrieren die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verwendung von ACT Polypeptiden zur Behandlung schlecht heilender Wunden diabetischer Säugetiere und für arteriell-schlecht heilende Wunden. Durch Erhöhung von murinem ACT Homolog (mACT) in Wunden diabetischer Ratten mit arterieller Beeinträchtigung versus normal heilenden Wunden konnte eine ausgeprägte Verbesserung der Wundheilung in den schlecht heilenden Wunden der diabetischen Tiere erzielt werden, während die Wundheilung in normal heilenden Wunden durch mACT Applikation nicht beeinflußt wurde. Die verminderte Expression des ACTs ist ursächlich an der schlechten Wundheilung beteiligt und spezifisch für diabetes assoziierte und arteriell-schlecht heilende Wunden. Die Aufgabe wird daher durch die Verwendung mindestens eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder funktioneller Varianten davon oder diese kodierende Nuklein säuren oder Varianten davon oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, oder eine dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Behandlung und/oder Prävention diabetes-assoziierter und/oder arterieller schlecht heilender Wunden in Säugetieren gelöst.

ACT ist als einer von zwei bekannten endogenen Proteaseinhibitoren von Ca thepsin G bekannt, die sich von dem anderen Proteaseinhibitor SCCA2 (Squamous cell carcinoma antigen 2), dadurch unterscheidet, daß ACT spezifisch Cathepsin G inhibiert und keine meßbare Wirkung auf Elastase ausübt (Travis et al., 1978, Biochemistry, 17: 5651-5656; Schick et al., 1997, J. Biol. Chem., 272: 1849-1855), wohingegen der andere Proteaseinhibitor SCCA2 sowohl Cathepsin G als auch Elastase inhibiert. Im Menschen ist ein ACT-Gen bekannt, wobei Po lymorphismen besonders in der Signalpeptidsequenz beschrieben worden sind (Rubin, 1989, Eintrag in Datenbank). Ein in dieser Arbeit identifiziertes Allel bzw. die Sequenz eines Polypeptidfragments enthaltend das mature Protein und 4 Aminosäuren des Signalpeptids (US 5367064-A) sind in SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 4 aufgeführt, die korrespondierenden cDNAs unter SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 des Sequenzprotokolls. Für Nager gibt es Belege, daß eine Vielzahl ho mologer Gene des ACTs existieren, wobei der Serin Proteaseinhibitor 2-2 aus Maus (SEQ ID Nr. 2; trEMBL: Q62258) das zum humanen ACT Gen funktionelle Homolog darstellt, da eine weitgehende Übereinstimmung bezüglich des reakti ven Zentrums, der Gewebeverteilung und der Induzierbarkeit nach Entzündung bestehen (Inglis et al., 1991, Gene 106: 213-220). Weitere Mitglieder der Serin Proteaseinhibitor 2-2 Familie der Nagern sind spi2-2 und spi3 der Ratte und ein spi2-2 Homolog aus Adodemus sylvaticus (Inglis et al., supra). Das reaktive Zent rum ist essentiell für die Proteaseinhibitorspezifität (Rubin et al., Biochemistry, 33: 7627-7633), wobei insbesondere die Aminosäuren 356-361 des maturen Pro teins ohne Signalpeptid entscheidend für die Spezifität sind. Insbesondere die so genannte Position P1 entsprechend Aminosäure 358 des maturen Proteins ohne Signalpeptid scheint hierfür von Bedeutung zu sein, da eine Mutation an dieser Aminosäure zu einer meßbaren, wenn auch schwachen Elastaseaktivität führt. Erfindungsgemäß verwendbar sind jedoch insbesondere solche Polypeptide, deren reaktiver Loop im wesentlichen konserviert ist und die somit keine inhibitorische Wirkung auf Elastase zeigen.

Die folgenden Ausführungen belegen, daß ACT mit einer Reihe von Erkrankun gen in Zusammenhang gebracht wurde, jedoch bestand zwischen verminderter ACT Expression und schlecht heilenden diabetischen Wunden und/oder arteriel len schlecht heilenden Wunden kein Zusammenhang.

So inhibiert ACT auch Chymasen der Mastzellen, weshalb ACT im Zusammen hang mit allergischen Reaktionen beschrieben wurde (Lindmark und Wallengren, Allergy, 1992 47: 456-458). Außerdem wurde die Rolle der Chymase und seines Inhibitors ACT in psoriatischen Läsionen untersucht. Die Ergebnisse weisen dar auf hin, daß die Chymase jedoch nur eine untergeordnete Rolle bei dem Pathome chanismus der Psoriasis spielt (Harvima et al., 1999, Acta Derm. Veneorol., 79: 98-104) und die Menge an Chymotrypsininhibitor-Aktivität in nichtläsionaler Haut von Psoriasispatienten nicht verändert ist (Glinski et al., 1991, Arch. Der matol. Res., 283: 224-229). Der US 5,252,725 zufolge, könnte ACT zur Behand lung von "Hautentzündungen" (skin inflammation) eingesetzt werden, jedoch wird die erfindungsgemäße Bedeutung von "Hautentzündung" nicht ausgeführt. Üblicherweise handelt es sich dabei jedoch um inflammatorische Erkrankungen einer an sich mechanisch nicht verletzten Haut, beispielsweise Psoriasis oder Dermatitis. Dies ist klar zu unterscheiden von Erkrankungen, die auf einer me chanischen Zerstörung von Gewebe beruhen, beziehungsweise auf eines ver schlechterten Prozesses der Wiederherstellung des fehlenden Gewebes. Vererbte ACT-Defizienz ist pleiomorph und ist häufig mit chronischer Hepatitis und er höhtem Restlungenvolumen assoziiert (Eriksson et al., 1986, Acta Med. Scand., 220, 447-453). Weiterhin wird eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Alz heimer Krankheit nahegelegt, da die neurofibrillären Plaques viel ACT enthalten (Kalsheker, 1996, Int. J. Biochem. Cell Biol., 28: 961-964). Auch sind Nukleotid sequenzen des ACT bekannt (Chandra et al., 1983, Biochemistry 22: 5055-5061; Morü and Travis, 1983, J. Biol. Chem., 258: 12749-12752); ebenso wurde auf der Ebene des Proteins Zusammenhänge zwischen ACT und Krankheitsbildern vorge schlagen und/oder untersucht (beispielsweise Kozaka und Tazawa, 1976, Tohoku J Exp Med 119: 369-76; Kelly et al., Biomedicine 28: 209-15; Tegner, 1978; Acta Otolaryngol, 85: 282-9).

Obwohl dieses Enzym in der Biotechnologie seit langem bekannt ist und medizi nisch umfassend untersucht wurde, ist eine Beziehung zwischen ACT und arte riellen oder diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden bislang nicht be schrieben worden. So liegen beispielsweise keine Untersuchungen zur Expression von ACT in Wunden, insbesondere diabetes-assoziierten oder arteriellen schlecht heilenden Wunden vor.

Der Stand der Technik bewertet die Behandlung der Wunden mit Hilfe von Pro teaseinhibitoren, die spezifisch eine Protease inhibieren als nicht Erfolg verspre chend und konzentriert sich auf die Entwicklung von Proteaseinhibitoren, die mehr als eine Protease inhibieren. So gibt es eine Reihe von Mutanten u. a. des ACT, die auf mehrere Proteasen wirken: Lex032 wirkt als Kombination von ACT und Antitrypsin sowohl auf Cathepsin G als auch auf Elastase und wird bei der Behandlung von Pankreatitis eingesetzt (von Dobschuetz et al., 1999, J. Pharma col. Exp. Ther., 290: 782-8). Bifunktionale Mutanten mit Elastase- und Cathepsin G-inhibierenden Eigenschaften wurden zur Behandlung inflammatorischer Er krankungen, beispielsweise chronische Wunden und Psoriasis offenbart (WO 95/27055). Solche Hybridmutanten bergen jedoch die Gefahr unvorhersehbarer Nebenwirkungen und Wechselwirkungen, sei es mit Antikörpern, die diese Pro teine als fremd erkennen, sei es mit anderen, nicht getesteten Proteasen. Dagegen ist die Wirkung nur auf eine einzige Protease vergleichsweise einfach zu kontrol lieren und es kann daher eine spezifische Heilwirkung mit wenig Nebenwirkun gen erzielt werden.

Zusammenfassend führt also der Stand der Technik weg von der Verwendung von ACT zur Behandlung und/oder Prävention diabetes-assoziierter und/oder arteriel ler schlecht heilender Wunden und es war daher unerwartet und überraschend, daß ACT erfindungsgemäß verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer die ses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Diagnose, Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

Unter dem Begriff "Funktionelle Varianten" sind Varianten der erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide zu verstehen, die im Vergleich zu dem nativen ACT Polypeptid keine wesentlich veränderte Proteaseinhibitorspezifität bezüglich Ca thepsin G besitzen. Beispielsweise besitzen Varianten der genannten Polypeptide mindestens circa 70%, insbesondere mindestens ca. 80%, vor allem mindestens ca. 90% Sequenzidentität zu einer der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4. Funktio nelle Varianten des Polypeptids können auch Teile der erfindungsgemäß verwen deten Polypeptide sein, die verglichen mit dem nativen ACT Polypeptid keine wesentlich veränderte Proteaseinhibitorspezifität aufweisen: beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptides wesentlich verändert wird. Weiterhin umfaßt sind auch N- und/oder C-terminale und/oder interne Deletionen des Polypeptides im Bereich von ca. 1-60, vorzugs weise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäu ren, sofern Proteaseinhibitorspezifität bezüglich des nativen Polypeptids im we sentlichen unverändert bleibt. Besonders bevorzugt sind Deletionen, die das Sig nalpeptid oder Teile davon am N-terminus des Polypeptids betreffen. Beispiele solcher Varianten, die keine wesentlich veränderte Proteaseinhibitorspezifität be züglich des nativen Polypeptids besitzen, sind die zu den erfindungsgemäß ver wendeten Polypeptiden homologen Polypeptide, die insbesondere aus anderen Organismen als dem Menschen bzw. der Maus, vorzugsweise aus nicht menschlichen Säugetieren wie z. B. Affen, Schweinen und Ratten stammen. Weitere Beispiele sind Polypeptide, die durch unterschiedliche Allele des Gens, in verschiedenen Individuen oder in verschiedenen Organen kodiert werden und die, verglichen mit dem nativen Polypeptid, keine wesentlich veränderte Proteaseinhi bitorspezifität bezüglich des nativen Polypeptids in einem Organismus aufweisen. Weiterhin kann eine im nativen Zustand vorhandene posttranslationale oder cotranslationale Modifizierung der Polypeptidkette fehlen oder verändert sein. Insbesondere können kovalent gebundene Zuckerreste fehlen oder verändert sein.

Bevorzugte funktionelle Varianten sind ACT Polypeptide, bei denen das Signal peptid oder ein Teil davon deletiert ist, beispielsweise ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 4. Weiterhin kann das erfindungsgemäß verwendbare ACT glykosyliert, partiell glykosyliert oder nicht glykolysiert sein. Bevorzugt sind humane Varian ten, die einen zu SEQ ID Nr. 3 konservierten reaktiven Loop haben und eine im wesentlichen gleiche Proteaseinhibitorspezifität aufweisen wie das mature native ACT Polypeptid. Weitere bevorzugte Varianten sind Serin Proteaseinhibitor 2-2 Polypeptide, die im wesentlichen einen konservierten reaktiven Loop im Ver gleich zu SEQ ID Nr. 1 aufweisen.

Der Begriff "kodierende Nukleinsäure" bezieht sich auf eine RNA- oder DNA- Sequenz, die für ein erfindungsgemäß verwendbares ACT Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon oder eine Vorläuferstufe davon, beispielsweise ein Pro- oder ein Präpropolypeptid, davon kodiert. Das Polypeptid kann durch eine Sequenz in voller Länge oder jeden Teil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange das Polypeptid eine funktionelle Variante ist.

Mit dem Begriff "Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komple mentär zu einer DNA-Sequenz (Referenzsequenz) sind, die für erfindungsgemäß verwendete Polypeptide der SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder deren funktio nelle Varianten kodieren, und mindestens ca. 70%, insbesondere mindestens ca. 80%, vor allem mindestens ca. 90% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz aufweisen. Mit dem Begriff "Varianten" sind ferner alle DNA-Sequenzen be zeichnet, die komplementär zu Referenzsequenz sind und unter stringenten Be dingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und für ein Polypeptid kodie ren, das eine im wesentlichen gleiche Aktivität aufweist, wie das von der Refe renzsequenz kodierte Polypeptid sowie deren degenerierte Formen. Es ist bekannt, daß kleine Veränderungen in der Sequenz der erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren vorhanden sein können, zum Beispiel können diese Veränderun gen, ohne daß die Eigenschaft einer funktionellen Variante verloren geht, durch die Degenerierung des genetischen Codes, oder durch nicht translatierte am 5' und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure angehängte Sequenzen hervorgerufen werden. Diese Erfindung umfaßt deshalb auch sogenannte "Varianten" der vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren.

Unter dem Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" sind insbesondere solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung beispielsweise bei 60°C in 2,5 × SSC-Puffer gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Unter "Sequenzidentität" versteht man die Übereinstimmung (= % Positive) zwi schen zwei Sequenzen, die im Falle von Polypeptidsequenzen beispielsweise mittels BlastP 2.0.1 und im Falle von Polynukleotidsequenzen beispielsweise mit BLASTN 2.0.14 bestimmt wird, wobei der Filter = off gesetzt ist (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402).

Unter diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Hautläsionen von Säugetieren und Menschen mit Diabetes zu ver stehen. Beispiele für solche Hautläsionen sind insbesondere durch Diabetes verur sachte Ulzera, beispielsweise Ulcus cruris arteriosum, die Necrobiosis lipoidica, Ulcera arteriosa und durch arteriosklerotische Zerstörung der Blutgefäße verur sachte verlangsamte Wundheilung zu verstehen.

Unter arteriellen schlecht heilenden Wunden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Ulcera arteriosa und durch arteriosklerotische Zerstörung der Blutgefäße verursachte verlangsamte Wundheilung zu verstehen.

Unter einem "reaktiven Loop" ist das natürlich vorkommende, für die Spezifität des ACT Polypeptids verantwortliche, Sequenzmotiv in einem erfindungsgemäß verwendbaren ACT Polypeptid zu verstehen, das den Aminosäuren 356 bis 361 des humanen maturen ACT Polypeptids entspricht oder den Aminosäuren 360 bis 365 des humanen Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 4 entspricht oder den Amino säuren 381 bis 386 des humanen Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 3 entspricht und bei murinen Sequenzen den Aminosäuren 379-384 gemäß SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 entspricht.

Unter einem "konservierten reaktiven Loop" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein reaktiver Loop zu verstehen, in dem ausschließlich solche Aminosäureun terschiede vorkommen, die nicht zu einer wesentlichen Änderung in der Protea seinhibitorspezifität bezüglich der Elastase führen.

Unter einer "wesentlichen Änderung in der Proteaseinhibitorspezifität" bezüglich der Elastase ist eine Änderung zu verstehen, die einer Zunahme der Elastaseinhi bitor-Aktivität um mindestens den Faktor 100, insbesondere um mindestens den Faktor 1000, vor allem um mindestens den Faktor 10000 bezüglich der nativen ACT Sequenz besteht, oder, falls eine solche Aktivität in der nativen Sequenz nicht meßbar ist, in einer im Vergleich zum endogenen Elastaseinhibitor alpha1- Proteaseinhibitor mindestens 0,0001-fachen Elastaseinhibitor-Aktivität besteht.

Bevorzugterweise handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendbaren Nuk leinsäuren kodierend für erfindungsgemäß verwendbare ACT Polypeptide oder deren funktionelle Varianten um DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA, ins besondere eine doppelsträngige DNA. Weiterhin kann die Sequenz der Nuklein säuren dadurch gekennzeichnet sein, daß sie mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist.

Für die Expression des betreffenden Gens, sowohl zur Herstellung eines erfin dungsgemäß verwendbaren Polypeptids als auch bei einem erfindungsgemäß ver wendbaren gentherapeutischen wirksamen Vektor ist im allgemeinen eine dop pelsträngige DNA bevorzugt, wobei der für das Polypeptid kodierende DNA- Bereich besonders bevorzugt ist. Dieser Bereich beginnt mit dem ersten in einer Kozak Sequenz (Kozak, 1987, Nucleic. Acids Res. 15: 8125-48) liegenden Start- Codon (ATG) und erstreckt sich bis zum nächsten Stop-Codon (TAG, TGA bzw. TAA), das im gleichen Leseraster zum ATG liegt.

Weiterhin kann zur Durchführung der Erfindung eine Nukleinsäure verwendet werden, die synthetisch hergestellt worden ist. So kann die erfindungsgemäß ver wendete Nukleinsäure beispielsweise chemisch anhand der in Tabelle 1 beschrie benen DNA Sequenzen und/oder anhand der in dieser Tabelle ebenfalls beschrie benen Proteinsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z. B. Uhlmann, E. & Pey man, A. (1990) Chemical Revievs, 90, 543-584, No. 4).

Auch die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide können synthetisch herge stellt werden. So kann das gesamte Polypeptid oder Teile davon zum Beispiel mit Hilfe der klassischen Synthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Beson ders bevorzugt ist die Verwendung von Polypeptiden, die mittels einer der voran gehend beschriebenen Nukleinsäuren rekombinant hergestellt wurden. Weiterhin können ACT Polypeptide aus einem Organismus oder aus Gewebe oder Zellen isoliert und erfindungsgemäß verwendet werden. So ist es beispielsweise möglich, erfindungsgemäß verwendbare Polypeptide beispielsweise aus humanem Serum aufzureinigen (Abdullah et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys., 225: 306-312). Weiterhin können aus ACT exprimierende Zellen Zellinien hergestellt werden, die dann zur Isolierung von ACT verwendet werden können. So läßt sich beispiels weise aktives ACT durch rekombinante Expression in E. coli Zellen herstellen (Rubin et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 1199-1207).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist mindestens eine erfindungsgemäß verwendbare Nukleinsäure in einer Expressionskassette, in einem Vektor vorzugsweise in einem gentherapeutisch wirksamen Vektor enthal ten. Vorzugsweise enthält der gentherapeutisch wirksame Vektor gewebe-, wund- bzw. hautspezifische, zellzyklus-, zelltyp-, metabolischspezifische oder konstitu tiv aktive regulatorische Sequenzen, die funktionell mit der vorangehend be schriebenen Nukleinsäure verbunden sind.

Die Expressionsvektoren zur Herstellung eines erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptids können prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derivate und für eukaryotische Expressi onsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767- 5768), für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren wie in EP- B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säuger zellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind.

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirts zelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den Met 25, GAL 1 oder ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, für die Expression in Insektenzellen (siehe z. 13. EP-B1-0 127 839). Für die Expression in Säugetier zellen sind beispielsweise Promotoren geeignet, die eine konstitutive, regulierba re, gewebsspezifische, zelltypspezifische, zellzyklusspezifische oder metabolisch spezifische Expression in eukaryotischen Zellen erlauben. Regulierbare Elemente gemäß der vorliegenden Erfindung sind Promotoren, Aktivatorsequenzen, Enhan cer, Silencer und/oder Repressorsequenzen.

Beispiele für bevorzugte regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA Polymerase III er kannt werden oder virale Promotoren, CMV-Enhancer, CMV-Promotor (siehe auch Beispiel 2), SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232) und weitere virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, abgeleitet aus beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.

Beispiele für regulierbare Elemente, die induzierbare Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind der Tetracyclinoperator in Kombination mit einem entspre chenden Repressor (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).

Vorzugsweise erfolgt die Expression von erfindungsgemäß verwendbarer Nuk leinsäuren unter der Kontrolle von gewebespezifischen Promotoren, wobei haut spezifische Promotoren wie beispielsweise der humane K10 Promotor (Bailleul et al., 1990. Cell 62: 697-708), der humane K14 Promotor (Vassar et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1563-67) oder der bovine Cytokeratin IV Promotor (Fuchs et al., 1988; The Biology of Wool and Hair (Hrsg.: G. E. Rogers, et al.), S. 287-309. Chapman und Hall, London/New York) besonders zu bevorzugen sind.

Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die gewebsspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promo toren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden.

Beispiele für regulierbare Elemente, die zellzyklusspezifische Expression in Euka ryonten ermöglichen, sind Promotoren folgender Gene: cdc25, Cyclin A, Cyclin E, cdc2, E2F, B-myb oder DHFR (Zwicker J. und Müller R. (1997) Trends Genet. 13, 3-6).

Beispiele für regulierbare Elemente, die metabolischspezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukose mangel, durch Phosphatkonzentration oder durch Hitzeschock reguliert werden.

Ein Beispiel für ein regulierbares Element, das die Keratinozyten-spezifische Ex pression in der Haut erlaubt, ist das FiRE-Element (Jaakkola et al., 2000, Gen. Ther., 7: 1640-1647). Das FiRE Element ist AP-1-getriebenes, durch FGF- induzierbares sogenanntes Response Element des Syndecan-1 Gens (Jaakkola et al., 1998, FASEB J., 12: 959-9).

Um die Einführung von erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren und damit die Expression des Polypeptids in einer eu- oder prokaryotischen Zelle durch Transfektion, Transformation oder Infektion zu ermöglichen, kann die Nuklein säure als Plasmid, als Teil eines viralen oder nicht-viralen Vektors vorliegen. Als virale Vektoren eignen sich hierbei besonders: Baculoviren, Vakziniaviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren und Herpesviren. Als nicht-virale Vektoren eig nen sich hierbei besonders: Virosomen, Liposomen, kationische Lipide, oder po ly-Lysin konjugierte DNA.

Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, bei spielsweise Adenovirusvektoren oder retroviralen Vektoren (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58). Eukaryo tische Expressionsvektoren eignen sich in isolierter Form für die gentherapeuti sche Anwendung, da nackte DNA bei topischer Applikation in Hautzellen ein dringen kann (Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5).

Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert, da damit eine sehr hohe Transfektionseffizienz, insbesondere von Hautzellen, er reicht werden kann (Alexander und Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279- 85). Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Li piden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension herstellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem sol chen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den von Felgner et al. (1987, supra) eingesetzten Lipidmischungen DOTMA (1,2-Dioleyloxpropyl-3- trimethylammoniumbromid) und DPOE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) wur den inzwischen zahlreiche neue Lipidformulierungen synthetisiert und auf ihre Effizienz der Transfektion verschiedener Zellinien getestet (Behr, J. P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Felgner, J. H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N- [1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumethylsulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; Dioctadecylamidoglycylspermin). Als sehr gut geeignet für die Transfektion von Keratinozyten in vitro und in vivo haben sich auch die katio nischen Lipide Cytofectin GS 2888 erwiesen (US 5,777,153; Lewis et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3176-3181). Hilfsstoffe, die den Transfer von Nukleinsäuren in die Zelle erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zelle ermöglichen, sein (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Brandén et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213). Liposomen sind ein pharma zeutisch annehmbarer Träger im Sinne der vorliegenden Erfindung. Liposomen umfassen multilamellare Vesikel (MLVs), kleine unilammellare Vesikel (SUVs) oder große unilammellare Vesikel (LUVs).

Methoden zur Herstellung von Liposom-Nukleinsäure Komplexen sind dem Fachmann bekannt (z. B. Straubinger et al., 1983, in Methods of Immunology, 101: 512-527; Szoka et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194-4198). "Liposomen" umfaßt beispielsweise liposomale Zusammensetzungen offenbart in US 5,422,120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 und EP 524,968 B1. Liposomen können sowohl für die erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren als auch für die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide oder für beide als pharmazeutischer Träger verwendet werden, vorzugsweise werden sie als phar mazeutischer Träger für die erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren ver wendet. Die therapeutisch aktive Substanz kann an das Liposom konjugiert sein oder es kann an ein Hydrogelpolymer konjugiert sein, wobei das Hydrogelpoly mer (oder eine Komponente des Hydrogelpolymers) an ein Liposom konjugiert oder durch ein Liposom umschlossen sein kann. Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und die se mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" topisch appliziert indem man sie in die Haut, oder Zellen schießt (Beispiel 2; Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8).

Der Begriff "Liposomen" umfaßt beispielsweise liposomale Zusammensetzungen offenbart in US 5,422,120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 und EP 524,968 B1. Liposomen können sowohl für die erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäuren als auch für die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide oder für beide als pharmazeutischer Träger verwendet werden, vorzugsweise werden sie als pharmazeutischer Träger für die erfindungsgemäß verwendbaren Nuklein säuren verwendet. Die therapeutisch aktive Substanz kann mit dem Liposom konjugiert werden, oder es kann mit einem Hydrogelpolymer konjugiert werden, wobei das Hydrogelpolymer (oder eine Komponente des Hydrogelpolymers) mit einem Liposom konjugiert werden oder von einem Liposom umschlossen sein kann. Eine andere besonders geeignete Form von gentherapeutischen Vektoren läßt sich dadurch erhalten, indem man die erfindungsgemäß verwendeten Nuk leinsäure auf Goldpartikeln aufbringt und diese mit Hilfe der sogenannten "Gene Gun" topisch appliziert, indem die Haut, oder Zellen mit man die beladenen Parti kel beschossen wird (Beispiel 3; Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775- 81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8). Vorrichtungen zur intra dermalen Injektion mittels Druck sind beispielsweise aus US 5630796 bekannt.

Eine weitere Form eines gentherapeutisch wirksamen Vektors läßt sich durch das Einbringen von "nackten" Expressionsvektoren in eine biokompatible Matrix, beispielsweise eine Kollagenmatrix, herstellen. Diese Matrix kann beispielsweise in diabetes-assoziierte und/oder arterielle Wunden eingebracht werden, um die einwandernden Zellen mit dem Expressionsvektor zu transfizieren und die erfin dungsgemäß verwendeten Polypeptide in den Zellen zu exprimieren (Goldstein und Banadio, US 5,962,427).

Für die gentherapeutische Anwendung der vorangehend beschriebenen Nuklein säure ist es auch von Vorteil, wenn der Teil der Nukleinsäure, der für das Poly peptid kodiert, ein oder mehrere nicht kodierende Sequenzen einschließlich Intronsequenzen, vorzugsweise zwischen Promotor und dem Startcodon des Poly peptids (siehe Beispiel 2), und/oder eine polyA-Sequenz, insbesondere die natür lich vorkommende polyA-Sequenz oder eine SV40 Virus polyA-Sequenz, vor allem am 3'-Ende des Gens enthält, da hierdurch eine Stabilisierung der mRNA erreicht werden kann (Jackson, R. J. (1993) Cell 74, 9-14 und Palmiter, R. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482).

Zellen können sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sein, Bei spiele für prokaryotische Zellen sind E. coli und für eukaryotische Zellen Saccha romyces cerevisiae oder Insektenzellen. So haben sich beispielsweise E. coli Zel len als geeignete Zellen zur Expression von humanem ACT erwiesen (Rubin et al., 1990, J. Biol. chem., 265: 1199-1207). Die Verwendung von E. coli Zellen zur Herstellung erfindungsgemäß verwendbarer Polypeptide stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar. Die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide werden beispielsweise durch Expression der vorangehend beschriebenen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits dargestellt, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden hergestellt. Als Zellen eignen sich bei spielsweise die E. coli Stämme DHS, HB101 oder BL21, der Hefestamm Saccha romyces cerevisiae, die Insektenzellinie Lepidopteran, z. B. von Spodoptera fru giperda, oder die tierischen Zellen COS, Vero, 293, HaCaT, und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.

Bevorzugt ist die Behandlung und Prävention von diabetischem Ulkus und/oder von arteriellem Ulkus oder einer schlecht heilenden Wunde eines diabetischen Patienten oder einer schlecht heilenden Wunde eines unter arteriosklerotischer Zerstörung der Blutgefäße leidenden Patienten.

Ein weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß verwendbaren ACT Polypeptide in Form eines Fusionsproteins zur Prävention und/oder Behandlung von diabetes-assoziierten und/oder arteriel len schlecht heilen Wunden, hergestellt unter Verwendung einer vorangehend beschriebenen erfindungsgemäß verwendbaren Nukleinsäure.

Hergestellt werden hierbei Fusionsproteine, die die oben beschriebenen erfin dungsgemäß verwendbaren Polypeptide oder deren funktionelle Varianten ent halten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits eine funktionelle Variante eines der vorangehend beschriebenen ACT Polypeptide darstellt oder erst nach Ab spaltung des Fusionsanteils eine funktionelle Variante ist. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von ca. 1-300, vorzugsweise ca. 1-200, beson ders bevorzugt ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 fremden A minosäuren. Beispiele solcher Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidse quenzen, die z. B. aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können.

Weitere bevorzugte Beispiele für Peptidsequenzen für Fusionsproteine sind Pepti de, die die Detektion des Fusionsproteins erleichtern, hierzu zählen beispielsweise "Green-fluorescent-protein" oder Varianten davon.

Zur Aufreinigung der vorangehend beschriebenen Proteine kann mindestens ein "Polypeptidtag" angefügt sein. Geeignete Proteintags erlauben beispielsweise die hochaffine Absorption der zu reinigenden Proteine an eine Matrix. Daran schlie ßen sich beispielsweise folgende Schritte an: stringentes Waschen mit geeigneten Puffern, ohne den Komplex in nennenswertem Maße zu eluieren und anschlie ßend gezielte Elution des absorbierten Komplexes. Beispiele der dem Fachmann bekannten Proteintags sind ein (His)6-tag, ein Myc-tag, eine FLAG-tag, ein Hä magluteinin-tag, Glutathion-Transferase (GST)-tag, Intein mit einem Affinitäts- Chitin-binding-tag oder Maltose-binding protein (MBP)-tag. Diese Proteintags können sich N-, C-terminal und/oder intern befinden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer funktionellen Variante davon oder einer dieses kodierende Nukleinsäure oder eine Variante davon, oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer Variante davon oder einer diese kodierende Nukleinsäure oder ihre Variante exprimierende Zelle, gegebenenfalls zusammen oder kombiniert mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prä vention von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

Die Therapie der von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden kann auf herkömmliche Weise, z. B. durch Verbände, Pflaster, Kompres sen oder Gele erfolgen, die die erfindungsgemäß verwendbaren Arzneimittel ent halten. So ist es möglich, die geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie z. B. phy siologische Kochsalzlösung, entmineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Proteina seinhibitoren, Gelformulierungen, wie z. B. weiße Vaseline, dünnflüssiges Paraffin und/oder gelbes Wachs, etc., enthaltenden Arzneimittel topisch und lokal zu vera breichen, um die Wundheilung sofort und unmittelbar zu beeinflussen. Die topi sche Administration therapeutischer Zusammensetzungen kann beispielsweise in Form einer Creme, eines Schaums, eines Aerosol Sprays, einer Injektion, einer Gelmatrix, eines Schwamms, Tropfen oder Waschungen erfolgen. Diese Formen der Applikation sind bevorzugt für die Verwendung mindestens eines erfindungs gemäß verwendbaren ACT Polypeptids. Die Verabreichung der erfindungsgemä ßen Arzneimittel kann weiterhin gegebenenfalls in Form von Liposomenkomple xen bzw. Goldpartikelkomplexen ebenfalls topisch und lokal im Bereich der Wunde erfolgen. Diese Form der Applikation ist für gentherapeutisch wirksame Vektoren enthaltend eine erfindungsgemäß verwendbare Nukleinsäure bevorzugt.

Weiterhin kann die Behandlung mittels eines transdermalen therapeutischen Sys tems (TTS) erfolgen, das eine zeitlich gesteuerte Abgabe der erfindungsgemäßen Arzneimittel ermöglicht. TTS sind zum Beispiel aus den EP 0 944 398 A1, EP 0 916 336 A1, EP 0 889 723 A1 oder EP 0 852 493 A1 bekannt. Die Behandlung mittels der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann aber auch über orale Dosie rungsformen, wie z. B. Tabletten oder Kapseln, über die Schleimhäute, zum Bei spiel der Nase oder der Mundhöhle, oder in Form von unter die Haut implantier ten Dispositorien erfolgen.

Bevorzugt sind Arzneimittel, die eine Erhöhung der Menge sowohl an ACT Poly peptiden gemäß SEQ ID No. 1 bis 4 oder funktioneller Varianten davon herbei führen. Die Polypeptide können synthetisch oder rekombinant hergestellt worden sein, wobei die Herstellung über ein oben dargestelltes Expressionssystem, insbe sondere mittels E. coli Zellen, besonders bevorzugt ist. Die so hergestellten re kombinanten Proteine können auch als Fusionsproteine z. B. zur leichteren Reini gung oder Detektion vorliegen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Zellen enthaltend min destens eine Nukleinsäure kodierend für ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID No. 1 bis 4 oder eine funktionelle Variante davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes- assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

Bevorzugt ist auch die Verwendung mindestens einer Zelle, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zelle mindestens eine Nukleinsäure kodierend für ein ACT Po lypeptid gemäß SEQ ID No. 1 bis 4 oder eine funktionelle Variante davon enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß verwendbare Zellen, die die Nuklein säuren in Form eines oben beschriebenen Expressionsvektors oder gentherapeu tisch wirksamen Vektors enthalten. Die Zellen können dann direkt oder gegebe nenfalls mit geeigneten Trägersystemen und/oder Zusatz- und/oder Hilfsstoffen kombiniert werden und in die Wunde eingebracht werden. Geeignete Trägersys teme sind beispielsweise aus US 5,980,888, WO 92/06179, EP 0242 270 oder WO 90/02796 bekannt. Bevorzugte Zellen sind autologe oder allogene Hautzellen, insbesondere Keratinozyten, Endothelzellen und Fibroblasten.

Besonders bevorzugt sind Arzneimittel enthaltend erfindungsgemäß verwendbare Nukleinsäuren, die in einem Vektor oder einer Zelle wie oben ausgeführt enthal ten sind oder erfindungsgemäß verwendbare Polypeptide, zur gentherapeutischen Behandlung.

Ein weitere bevorzugte, erfindungsgemäß verwendbare transformierte Zelle ist eine transgene embryonale nichtmenschliche Stammzelle, die dadurch gekenn zeichnet ist, daß sie ein erfindungsgemäße Expressionskassette umfaßt. Verfahren zur Transformation von Zellen und/oder Stammzellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen zum Beispiel Elektroporation oder Mikroinjektion. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines transgenen nicht menschlichen Säugetiers, dessen Genom ein vorangehend beschriebenes Expres sionskassette umfaßt. Transgene Tiere zeigen im allgemeinen eine gewebespezi fisch erhöhte Expression der Nukleinsäuren und/oder Polypeptide und sind daher geeignet um erfindungsgemäß verwendbare Polypetide herzustellen. Wird bei spielsweise ein Milchdrüsen-spezifischer Promotor gewählt, so kann die Isolie rung der erfindungsgemäß verwendbaren, rekombinanten Polypeptide über die gemolkene Milch erfolgen (Clark, 1998, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 3: 337-350). So wurde beispielsweise die Expression des Blutgerinnungsfaktors VIII in der Milchdrüse transgener Schafe unter der Kontrolle des Beta- Lactoglobulingen-Promotors beschrieben (Niemann et al., 1999, Transgenic Res., 8: 237-247).

Weiterhin können nichtembryonale eukaryontische Zellen in einem Säugetier er findungsgemäß verwendet werden, indem geeignete Zellen oder Organe mit ei nem Expressionsvektor enthaltend die erfindungsgemäß verwendbaren Nuklein säuren, beispielsweise mittels Transfektion ausgestattet werden. So resultiert bei spielsweise die Transfektion unter Verwendung von DEAE-Dextran oder Polyi onkomplexen des Milchkanals von Meerschweinchen mit einem Expressions vektor enthaltend das hGH Gen zur anhaltenden Expression von hGH (Hens et al., Biochem. Biophys. Acta, 2000, 1523: 161-171).

Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere der Maus, sind dem Fachmann ebenfalls aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von Expressionsvekto ren (s. o.) in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Ex pressionsvektoren in embryonaler Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Produktion, Seite 15 bis 68 in Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, Seite 115 bis 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, Seite 147 bis 176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfere Technology: Alternative Techniques and Applications, Seite 177 bis 220 in Pin kert, 1994, supra).

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer funktionellen Variante davon oder ei ner diese(s) kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 eine funktionelle Variante davon oder einer dieses ko dierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden. Dabei enthält das Diagnostikums mindestens einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäß verwendbares Polypeptid oder eine funktionelle Variante davon gerichtet ist.

Erfindungsgemäß verwendbare Antikörper sind dem Fachmann bekannt (z. B. Beispiel 2, EP 0162 812; EP 585201; Deiniger et al., 1999, J. Neuroimmunol., 93: 156-63), sie können jedoch auch nach allgemein bekannten Methoden herge stellt werden: durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kanin chens, mit dem vorangehend beschriebenen ACT Polypeptid oder dessen funkti onelle Variante oder Teilen davon mit mindestens 6 Aminosäuren Länge, vor zugsweise mit mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 12 Ami nosäuren, gegebenenfalls in Anwesenheit von z. B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (siehe z. B. Diamond, B. A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349). Die im Tier aufgrund einer immunolo gischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z. B. über Säulenchromatographie reinigen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden. Unter dem Begriff Antikörper versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und gegebenenfalls modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z. B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikör per, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe z. B. EP-B1-0 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884). Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise Wundflüssigkeit leicht und schnell dahingehend untersucht wer den, ob ein erfindungsgemäß verwendbares ACT Polypeptid in der Wundflüssig keit eines Organismus im Vergleich zu einer normal heilenden Wunde in nicht deutlich erhöhter Menge vorhanden ist, um dadurch einen Hinweis auf eine mög liche Wundheilungsstörung zu erhalten. Zum Nachweis der Antikörper sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion detektiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines ACT Polypep tids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nuklein säure, oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, oder einer dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Funktion von ACT Polypeptiden beeinflußen.

Beispielsweise kann dies durch ein Testsystem zum Einfluß von potentiellen pharmakologisch aktiven Substanzen auf die Funktion von ACT in Zellen der Haut, insbesondere Keratinozyten, Monozyten, oder neutrophile Granulozyten, Fibroblasten und Endothelzellen erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein erfindungsgemäß verwendbares ACT Polypeptid von mindestens einer Zelle exprimiert und min destens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht. Dazu kann beispielsweise eine Zellkultur mit Flüssigkeit in Kontakt gebracht werden die eine zu untersuchende Substanz enthält. Dabei kann im Falle von ACT mit Signalpeptid sowohl das intra- als auch das extrazellulär lokalisierte ACT Poly peptid auf seine Aktivität hin getestet werden. Im Falle eines ACT Polypeptids ohne Signalpeptid ist die Bestimmung der Aktivität des intrazellulären ACT ge eignet. Zur Bestimmung einer extrazellulären Aktivität erfolgt die Abtrennung der Zellen vom Überstand beispielsweise durch Zentrifugation. Anschließend kann der Zellüberstand isoliert werden und auf ACT-Aktivität hin untersucht werden. Zur Bestimmung der intrazellulären ACT-Aktivität kann der Überstand entfernt werden und die Zellen lysiert werden. Anschließend kann das Zellysat auf ACT- Aktivität hin untersucht werden. Geeignet zur Bestimmung der ACT-Aktivität sind allgemein bekannte Proteaseinhibitorassays (Chase and Shaw, 1967, Bio chem. Biophys. Re. Commun., 29: 508-514), wobei die Standardisierung bei spielsweise gegen Cathepsin G erfolgen kann (Kainulainen et al., 1998, 273: 11563-11569).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein erfindungs gemäß verwendbares ACT Protein an eine Festphase gebunden und es wird min destens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht. Die Bindung an eine Festphase kann beispielsweise in Form eines Arrays erfolgen. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen sind beispielsweise aus US 5,744,305 bekannt. Ge eignete Testsysteme zur Überprüfung eine pharmakologischen Wirkung von Test substanzen auf ein an eine Festphase gebundenes ACT sind allgemein bekannt und umfassen Proteaseinhibitorassays (Chase and Shaw, 1967, Biochem. Biophys. Re. Commun., 29: 508-514), wobei die Standardisierung beispielsweise gegen Cathepsin G erfolgen kann (Kainulainen et al., 1998, 273: 11563-11569). Beson ders zu bevorzugen sind Testsysteme, die geeignet sind Substanzen zu identifizie ren, die die Aktivität von ACT erhöhen, und die die Aktivität von Kontrollprotei nen, wie beispielsweise GAPDH, möglichst wenig beeinflussen.

Weiterhin kann in einem Wundheilungs-Assay, z. B. an der Maus, geprüft werden ob die getrennte oder zusammen mit ACT Polypeptiden und/oder diese kodieren de Nukleinsäuren erfolgte Applikation von Substanzen auf eine Wunde die Wundheilung verändert. Dies kann beispielsweise durch Messung der Reepithali sierungsrate erfolgen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines ACT Polypep tids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nuklein säure, oder einer ein ACT Polypeptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, oder einer dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen, die die Expression von ACT Polypeptiden, diese kodierende mRNAs beeinflußen. Testsysteme zur Identifikation von phar makologischen Substanzen, die die Expression von Genen beeinflussen, sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe beispielsweise Sivaraja et al., 2001, US 6,183,956).

So können Zellen, die erfindungsgemäß verwendbares ACT exprimieren, bei spielsweise Neutrophile, als Testsystem zur Analyse der Genexpression in vitro kultiviert werden, wobei Hautzellen, insbesondere Keratinozyten, Fibroblasten oder Endothelzellen zu bevorzugen sind. Ein mögliches Testsystem stellt dabei die menschliche Keratinozyten-Zellinie HaCaT da, die allgemein erhältlich ist.

Die Analyse der Genexpression erfolgt beispielsweise auf der Ebene der mRNA oder der Proteine. Dabei wird die Menge an ACT mRNA oder Protein nach Zuga be einer oder mehrerer Substanzen zur Zellkultur gemessen und mit der entspre chenden Menge in einer Kontrollkultur verglichen. Dies geschieht beispielsweise mit Hilfe einer Hybridisierung einer anti-sense Sonde, mit der im Lysat der Zellen enthaltene ACT mRNA nachgewiesen werden kann. Die Hybridisierung kann beispielsweise über die Bindung eines spezifischen Antikörpers an den mRNA- Sonden Komplex quantifiziert werden (siehe Stuart and Frank, 1998, US 4,732,847). Dabei ist es möglich, die Analyse beispielsweise im Hochdurchsatz verfahren durchzuführen und sehr viele Substanzen auf ihre Eignung als Modula tor der Expression von ACT zu analysieren (Sivaraja et al., 2001, US 6,183,956).

Die zu analysierenden Substanzen können dabei aus Substanzbibliotheken (siehe z. B. DE 198 16 414, DE 196 19 373) entnommen werden, die mehrere tausend, oft sehr heterogene Substanzen enthalten können. Alternativ kann zunächst die ge samt RNA oder mRNA aus Zellen isoliert werden, und anschließend die absolute Menge oder der relative Anteil der ACT mRNA beispielsweise mit Hilfe der quantitativen RT-PCR (siehe EP 0 200 362; Wittwer et al., 1997, BioTechniques 22: 130-8; Morrison et al., 1998, BioTechniques 24: 954-62) oder des RNAse Protection Assays (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Labo ratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Kapitel 7; EP 0 063 879) bestimmt werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Analyse der Proteinmenge im Zelllysat mit Antikörpern dar, die spezifisch erfindungsgemäß verwendbare ACT Polypeptide erkennen, (siehe Beispiel 2). Hier kann die Quantifizierung beispielsweise mit Hilfe eines ELISAs oder eines Western-Blots erfolgen, die allgemein bekannt sind. Um die Spezifität der Sub stanzen auf die Expression von ACT zu bestimmen, kann der Einfluß von Sub stanzen auf die ACT Expression mit dem Einfluß auf die Expression andere Gene, wie beispielsweise Gene des Stoffwechsels wie GAPDH, verglichen werden. Dies kann entweder in separaten Analysen erfolgen, oder parallel zur Analyse des ACT. Besonders zu bevorzugen sind Testsysteme, die geeignet sind Substanzen zu identifizieren, die die Expression von ACT erhöhen, und die die Expression von einem oder mehreren Kontrollgenen, wie beispielsweise GAPDH, möglichst wenig beeinflussen.

Eine weitere Ausführung der Erfindung betrifft die pharmakologisch aktive Sub stanzen, die mit Hilfe der Screening Verfahren identifiziert werden.

Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Arzneimittel enthaltend pharmakolo gisch aktive Substanzen zur Behandlung von diabetes-assoziierten schlecht hei lenden Wunden und arteriellen schlecht heilenden Wunden In einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens ein erfindungsgemäß verwendbares ACT Polypeptid an eine Festphase gebunden und es wird mindes tens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden mindestens ein erfin dungsgemäß verwendbares ACT Polypeptid von mindestens einer Zelle expri miert und mindestens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin un tersucht wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zur Iden tifizierung pharmakologischer Substanzen mindestens zwei Substanzen, auf ihre pharmakologische Aktivität untersucht werden, wobei die Substanzen ausgewählt sind aus mindestens einer Bibliothek von Substanzen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei in einem ersten Schritt eine pharmakologisch aktive Substanz nach einem der genannten Verfahren zur Identifizierung solcher Substanzen aufgefunden wird, und in einem weiteren Schritt die aufgefundene(n) pharmakologisch akti ve(n) Substanz(en) mit geeigneten Hilfs- und/oder Zusatzstoffen in Verbindung gebracht oder kombiniert wird (werden).

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Figuren und Sequenzen Tabelle 1

Tabellarische Übersicht der erfindungsgemäß verwendbaren ACT Po lypeptide und diese kodierende cDNA, sowie deren Zugangsnummern.

Tabelle 2

Tabellarische Übersicht der mACT Expression in verschiedenen Wundheilungsmodellen der Maus

Tabelle 3

Mittelwerte der Änderungen der Zerreißfestigkeit der Wunden von normalen sowie diabetischen Ratten, die im Vergleich zur Zerreißfestigkeit von Wunden, die mit einem Kontrollvektor behandelt wurden mit mACT genthera peutisch behandelt wurden.

SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 zeigen Sequenzen erfindungsgemäß verwendbarer Polypeptide.

SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 zeigen Sequenzen erfindungsgemäß verwendbarer Nukleinsäuren.

SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 14 zeigen die Sequenzen von Oligonukleotiden, die für die Beispiele verwendet wurden.

Beispiele Beispiel 1 Analyse des Expressionsmusters von mACT in normal heilenden Wunden, gut heilenden Wunden und 3 Typen schlecht heilender Wunden mit un terschiedlichem pathogenetischem Hintergrund in der Maus mittels "TaqMan A nalyse"

Die Stärke der Expression von murinen ACT (mACT) cDNAs, gemessen in ver schiedenen Wundheilungsmodellen der Maus wurde mittels "TaqMan Analyse" im GeneAmp5700 von Applied Biosystems bestimmt, und erlaubt es den patho genetischem Hintergrund eines Wundheilungsverlaufs mit der ACT Expression zu korrelieren. Dazu wurden normal heilende Tag 1-Wunden und intakte Haut aus mit isotonischer Kochsalzlösung behandelten 10 Wochen alten BALB/c Mäusen durch Scherenschnitt gewonnen. Um Gewebe von Mäusen mit besonders guter Wundheilung zu gewinnen, wurden unbehandelte Tag 1-Wunden und intakte Hautproben von 4 Wochen alten, nicht maturen BALB/c Mäusen verwendet. Als Tiermodelle für schlechte Wundheilung wurden mit dem Glukokortikoid Dexa methason behandelte Tiere (DEX-Tiere), alte Tiere und diabetische Tiere verwen det (Davidson, 1998, Arch. Derm. Res., 290: S1-S11). Um DEX-Tieren zu erhal ten, wurden BALB/c Mäuse vor der Verwundung mit Dexamethason (0,5 mg De xamethason in isotonischer Salzlösung pro kg Körpergewicht i. p. zwei mal pro Tag für 5 Tage) behandelt. Als Kontrolle wurde intakte Haut von Mäusen ver wendet, die mit isotonischer Salzlösung wie oben beschrieben behandelt wurden. Gewebe von alten Mäusen wurde aus unbehandelten Tag 1-Wunden und intakten Hautproben 12 Monate alter BALB/c Mäuse isoliert. Wundgewebe und intakte Haut von Mäusen mit Diabetes (db/db Maus) wurde erhalten, indem unbehandelte Tag 1-Wunden und intakte Haut von 10 Wochen alten C57B/Ks-db/db/Ola Mäu sen mittels Scherenschnitt isoliert wurden. C57B/Ks Wildtyp Mäuse wurden dabei als Kontrolltiere eingesetzt. Von letzteren Tieren wurde ebenfalls intakte Haut sowie unbehandelte Tag 1-Wunden gewonnen.

Die Isolierung der RNA erfolgte durch Homogenisieren der Biopsien in RNAc- lean Puffer (AGS, Heidelberg), dem 1/100 Volumenanteil 2-Mercaptoethanol zugesetzt worden war unter Verwendung eines Dispersers. Anschließend wurde die RNA durch zweimaliges Phenolisieren mittels mit Wasser gesättigtem saurem Phenol und in Gegenwart von 1-Bromo-3-Chloro-Propan extrahiert. Anschließend wurden eine Isopropanol- und eine Ethanol-Fällung durchgeführt und die RNA mit 75% Ethanol gewaschen. Danach wurde ein DNase I Verdau der RNA durch geführt. Hierzu wurden 20 µg RNA (ad 50 µl mit DEPC-behandeltem Wasser) mit 5,7 µl Transkriptions-Puffer (Roche), 1 µl RNase Inhibitor (Roche; 40 U/µl) und 1 µl DNase I (Roche; 10 U/µl) 20 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde wie derum 1 µl DNase I zugegeben und weitere 20 min bei 37°C inkubiert. Anschlie ßend wurde die RNA phenolisiert, Ethanol-gefällt und gewaschen. Alle oben auf geführten Schritte wurden mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)-behandelten Lösun gen bzw. Flüssigkeiten durchgeführt soweit diese keine reaktiven Aminogruppen enthielten. Anschließend erfolgte die Herstellung von cDNA aus extrahierter RNA. Dies erfolgte in Gegenwart von 1 × TaqMan RT-Puffer (Perkin Elmer), 5,5 mM MgCl₂ (Perkin Elmer), je 500 µM dNTPs (Perkin Elmer), 2,5 µM Random Hexamere (Perkin Elmer), 1,25 U/µl MultiScribe Reverse Transkriptase (50 U/µl Perkin Elmer), 0,4 U/µl RNase Inhibitor (20 U/µl, Perkin Elmer), 20 µl RNA (50 ng/µl) und DEPC-behandeltem Wasser (ad 100 µl Volumen). Nach Zugabe der RNA und sorgfältiger Durchmischung wurde die Lösung auf 2 0,2 ml Gefäße verteilt (je 50 µl) und die reverse Transkription in einem Temperatur-Cycler durchgeführt (10 min bei 25°C; 30 min bei 48°C und 5 min bei 95°C). Die nach folgende Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels quantitativer PCR unter Ver wendung des "SYBR Green PCR Master Mixes" (Perkin Elmer), wobei für mACT cDNA eine Dreifachbestimmung (jeweils mit mACT-Primern (mACT- Primer-3: TCCAGTTGTG TCCCATTGTC A (SEQ ID Nr. 13); mACT-Primer-4: CTG TCC TCT GCT TCC CAG ATG (SEQ ID Nr. 14)); und GAPDH-Primern (GAPDH-Primer-1: ATC AAC GGG AAG CCC ATC A (SEQ ID Nr. 11); GAPDH-Primer-2: GAC ATA CTC AGC ACC GGC CT (SEQ ID Nr. 12:))) durchgeführt wurde. Die Stammlösung für jedes Triplett enthielt bei 57 µl Ge samtvolumen 37,5 µl 2 × SYBR Master Mix, 0,75 µl AmpErase UNG (1 U/µl) und 18,75 µl DEPC-behandeltes Wasser. Für die Dreifachbestimmung wurden zu 57 µl Stammlösung je 1,5 µl Vorwärts- und Rüchwärts-Primer in einem zuvor optimierten Konzentrationsverhältnis hinzugefügt. Je 60 µl der Stammlö sung/Primer-Mischung wurde mit 15 µl cDNA-Lösung (2 ng/µl) gemischt und auf 3 Reaktionsgefäße verteilt. Parallel dazu wurde eine Stammlösung mit Primern zur Bestimmung von GAPDH als Referenz hergestellt, mit weiteren 15 µl der gleichen cDNA-Lösung gemischt und auf 3 Reaktionsgefäße verteilt. Außerdem wurde zur Erstellung einer Standardkurve für die GAPDH-PCR verschiedene cDNA-Lösungen als Verdünnungsreihe hergestellt (4 ng/µl; 2 ng/µl; 1 ng/µl; 0,5 ng/µl und 0,25 ng/µl). Je 15 µl dieser cDNA-Lösungen wurden mit 60 µl Stammlösung/Primer-Mischung zur Bestimmung von GAPDH gemischt und auf 3 Reaktionsgefäße verteilt. Ebenso wurde eine Standardkurve für die mACT PCR erstellt; dabei wurden dieselben Verdünnungen, die auch für die GAPDH- Standardkurve zum Einsatz kamen, verwendet. Als Kontrolle diente ein PCR An satz ohne cDNA. Zu jeweils 60 µl Stammlösung/Primer-Mischung von jeweils mACT und GAPDH wurden je 15 µl DEPC-Wasser gegeben, gemischt und je weils auf 3 Reaktionsgefäße verteilt. Die Amplifikation der Ansätze wurde im GeneAmp 5700 durchgeführt (2 min bei 50°C; 10 min bei 95°C, gefolgt von 3 Zyklen mit 15 s bei 96°C und 2 min bei 60°C; danach 37 Zyklen mit 15 s bei 95°C und 1 min bei 60°C). Die Auswertung erfolgte durch die Bestimmung der relativen Abundanz von mACT in Bezug zur GAPDH Referenz. Dazu wurde zu erst eine Standardkurve erstellt, indem die C_T-Werte der Verdünnungsreihe gegen den Logarithmus der cDNA-Menge im PCR-Ansatz (in ng umgeschriebener RNA) aufgetragen wurde und die Steigung (s) der Geraden ermittelt wurde. Die Effizienz (E) der PCR ergibt sich dann wie folgt: E = 10^-1/s - 1. Die relative A bundanz (X) der mACT cDNA (Y) im Bezug auf GAPDH ist dann: X = (1 + E_GAPDH)^C _T ^(GAPDH)/(1 + E_Y)^C _T ^(Y). Anschließend wurden die Zahlenwerte nor miert, indem die cDNA Menge aus intakte Haut von 10 Wochen alten BALB/c Kontrolltieren bzw. die intakte Haut der C57B/Ks Kontrolltiere mit 1 gleichge setzt wurden.

Die relativen Änderungen der Expression in den verschiedenen Wundheilungs modellen sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Es wird deutlich, daß sowohl in den normal und gut heilenden Tiermodellen als auch 2 Tiermodellen für verschlech terte Wundheilung, nämlich in alten Tieren und mit Glukokortikoid behandelten Tieren, ein deutlicher Anstieg an mACT Expression in Tag-1 Wunden auf die 5- bis 13-fache Menge im Vergleich zu intakter Haut festgestellt wurde. Überra schenderweise wurde in diabetischen Tieren, kein signifikante differentielle Re gulation in Wunden festgestellt. Dies verdeutlicht, daß verschlechterte Wundhei lung durch eine verminderte Expression von mACT begründet ist, daß jedoch eine solche Fehlregulation vom pathogenetischen Hintergrund der Patienten abhängt, und also spezifisch für diabetes-assoziierte Wunden ist. Das Ergebnis dieses Ver suchs zeigt ferner, daß mACT überraschenderweise besonders zur Behandlung und/oder Prävention diabetes-assoziierter und/oder arterieller schlecht heilender Wunden besonders wirksam ist.

Beispiel 2 Verbesserung der Wundheilung diabetischer Ratten durch in vivo Ap plikation des murinen ACT-Homologs

Es sollte nun überprüft werden ob eine Erhöhung der mACT Menge in Wunden von Ratten tatsächlich zu einer verbesserten Wundheilung von diabetischen Tie ren führt. Dazu wurde die Wundheilung nach Applikation des murinen ACT-Gens gemäß SEQ ID Nr. 1 in männlichen diabetischen Sprague Dawley Ratten unter sucht. Zur Quantifizierung der Wundheilung wurde die Zerreißfestigkeit (tensile strength) der Wunden untersucht, wobei eine höhere Zerreißfestigkeit eine verbes serte Wundheilung widerspiegelt.

Das Tiermodell der diabetischen Ratte ist ein etabliertes Modellsystem zur Unter suchung diabetes-assoziierter schlecht heilender Wunden (Davidson, Arch. Der matol. Res. 290: S1-S11). Da Diabetes von Mikroangiopathie begleitet ist, eignet sich dieses Tiermodell ebenfalls zur Untersuchung arteriell bedingter Wundhei lungsstörungen.

Zunächst wurde ein geeigneter Expressionsvektor pMHint konstruiert, der auf der Grundlage des Vektors pMH (S. Hoffman-La Roche) hergestellt wurde, indem zwischen dem CMV Promotor und der Multiple Cloning Site in die HindIII Schnittstelle das Intron II des Insulingens aus der Ratte eingefügt wurde. Unter Verwendung der Multiple Cloning Site wurde dann die mACT cDNA in pMHint kloniert. Hierzu wurde der kodierende Bereich der mACT cDNA gemäß SEQ ID Nr. 4 mittels PCR amplifiziert (mACT-Primer 1: GAGGTACCATGGCTTTCATTGCAG (SEQ ID Nr. 9) und mACT-Primer 2: GAATCACGTGACCACCTCCTTTGGGGTTGGCTATC (SEQ ID Nr. 10)), anschließend mit KpnI und PmlI geschnitten, mit dem mit KpnI und PmlI ge schnittenen Expressionsvektor pMHint ligiert und somit das Expressionplasmid pMHintACT erhalten. Als Kontrollvektor wurde pMHint verwendet, der ein Luzi ferase-Gen enthielt (pMHIntLuc).

Zur Induktion der Diabetes wurden 4 Ratten mit einem Körpergewicht von 250- 300 g eine frisch hergestellte wäßrige Streptozotocin-Lösung (Sigma) i. p. injiziert (50 mg/kg Körpergewicht). 7-9 Tage nach Induktion wurde der Blutzucker der Tiere überprüft und im Falle eines Blutzuckerspiegelwertes von über 200 mg/dL der diabetische Zustand festgestellt.

Die 4 diabetischen Ratten sowie die 4 nicht-diabetischen Kontrolltiere wurden anschließend mit einer Mischung aus 2% O₂ (2 l/min) und 1,25% Isofluran be täubt. Der Rücken wurde enthaart und 4 Stellen pro Tier wurden auf dem Rücken für die spätere Wundsetzung markiert. Jeweils 0,5 µg auf Goldpartikeln (BioRad) immobilisierte Plasmid DNA wurden auf jede Stelle mit 500 psi unter Verwen dung der "Helios Gene Gun" (BioRad) geschossen, wobei jeweils 2 Stellen mit dem ACT-Expressionsvektor pMHIntACT und 2 Stellen mit Kontrollvektor pMHlntLuc beschossen wurden, wobei jeweils ein Beschuß mit pMHIntACT an terior und ein Beschuß posterior erfolgte. Anschließend wurden 1 cm lange Schnittwunden durch die beschossenen Stellen hindurch gesetzt und die Wunden mit Wundklammern verschlossen. Die Wundbiopsien wurden nach 10 Tagen ent nommen und die Zerreißfestigkeit der Wunden unter Verwendung des "Instron Tensiometers" nach den Angaben des Herstellers bestimmt und auf die Quer schnittsfläche der Wunden normiert. Anschließend wurde der Quotient (E/C- Wert) gebildet aus dem absoluten Wert der Zerreißfestigkeit einer mit pMHInt ACT beschossenen Wunde und dem absoluten Wert der Zerreißfestigkeit einer mit dem Kontrollvektor pMHIntLuc beschossenen Wunde desselben Tieres. Der Mittelwert der E/C-Werte wurde ermittelt und somit die Änderungen der Zerreiß festigkeit in Abhängigkeit von mACT ermittelt. Die Mittelwerte sind in Tabelle 2 dargestellt.

Es stellte sich heraus, daß die Zerreißfestigkeit der mit pMHIntACT behandelten Wunden nur in diabetischen Tieren deutlich erhöht war, während die Applikation in Kontrolltieren keinen signifikanten Einfluß hatte. Dies verdeutlicht, daß sich ACT spezifisch bei diabetes-assoziierten und/oder arteriell bedingten schlecht heilenden Wunden eine deutliche Verbesserung der Wundheilung erzielt wurde. Hingegen eignete sich diese Behandlung nicht zur Verbesserung der Wundheilung bei den Kontrolltieren, in denen durch eine Gabe an mACT keine signifikant ver besserte Wundheilung erzielt werden konnte.

Somit konnte überraschenderweise nachgewiesen werden, daß ACT sehr wirksam bei der Prävention und/oder Behandlung von diabetes-assoziierten und/oder arte riellen schlecht heilenden Wunden ist. Die Wirkung von ACT ist spezifisch für diese Wundheilungsstörungen und eignet sich nicht zur Behandlung anderer Wundheilunggstörungen, da bei letzteren keine Fehlregulation der ACT Expressi on vorliegt.

Zur Prävention und/oder Behandlung ist die Menge an ACT, vorzugsweise an funktionell aktivem ACT im Wundbereich zu erhöhen. Bevorzugt zu behandelnde Indikationen sind der diabetische und der arterielle Ulkus, insbesondere der dia betische Ulkus. Die Administration eines Medikaments enthaltend ACT erfolgt vorzugsweise topisch, vorzugsweise mittels Gentherapie. Die Administration kann weiterhin bevorzugt durch die topische Applikation eines rekombinanten, verwendungsgemäßen ACT-Polypeptids erfolgen, da der Wirkort des ACT Poly peptids extrazellulär ist und somit das Eindringen des Proteins in Zellen nicht nö tig ist.

Insbesondere können die Sequenzvarianten gemäß SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 4 zur Prävention und/oder Behandlung verwendet werden und/oder deren mature Vari anten ohne oder mit partiellem Signalpeptidanteil.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Poly peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Diagnose, Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Wunden um einen diabetischen Ulkus oder einen arteriellen Ulkus handelt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid in Form eines Fusionsprotein eingesetzt wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in Form eines Expressionsvektors, insbesondere eines gentherapeutisch wirksamen Vektors eingesetzt wird.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den genannten Zellen um autologe oder allogene Zellen handelt.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen ausgewählt sind aus Hautzellen, insbesondere aus Keratinozyten, Fibroblasten und Endothelzellen.

7. Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Poly peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4, oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, ausgewählt aus diabe tes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden.

8. Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Poly peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krankheiten, ausgewählt aus diabetes-assoziierten schlecht heilenden Wunden und/oder arteriellen schlecht heilenden Wun den.

9. Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Poly peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Identifizierung von pharmakolo gisch aktiven Substanzen, die die Funktion von ACT beeinflußen.

10. Verwendung eines ACT Polypeptids gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure, oder einer ein ACT Poly peptid gemäß SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 oder einer dieses kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle zur Identifizierung von pharmakolo gisch aktiven Substanzen, die die Expression von ACT beeinflußen.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß mindestens ein ACT Polypeptid an eine Festphase gebunden ist/sind und mindestens eine Substanz auf ihre pharmakologische Aktivität hin untersucht wird.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß mindestens ein ACT Polypeptid von mindestens einer Zelle exprimiert wird/werden und mindestens eine Substanz auf ihre pharma kologische Aktivität hin untersucht wird.