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WO2001091821A1 - Supports a base de collagene pour l'ingenierie tissulaire et la preparation de biomateriaux - Google Patents

Supports a base de collagene pour l'ingenierie tissulaire et la preparation de biomateriaux Download PDF

Info

Publication number
WO2001091821A1
WO2001091821A1 PCT/FR2001/001631 FR0101631W WO0191821A1 WO 2001091821 A1 WO2001091821 A1 WO 2001091821A1 FR 0101631 W FR0101631 W FR 0101631W WO 0191821 A1 WO0191821 A1 WO 0191821A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
cells
membrane
origin
sponge
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/001631
Other languages
English (en)
Inventor
Nabil Abdul Malak
Valérie ANDRE
Alain Huc
Original Assignee
Coletica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/616,526 external-priority patent/US6790454B1/en
Application filed by Coletica filed Critical Coletica
Priority to DE10196234T priority Critical patent/DE10196234B4/de
Priority to JP2001587833A priority patent/JP3865635B2/ja
Priority to KR20027015963A priority patent/KR100520944B1/ko
Publication of WO2001091821A1 publication Critical patent/WO2001091821A1/fr

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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • collagen has proven to be an irreplaceable substrate for the production of artificial tissues containing living cells.
  • biomaterials obtained are increasingly used in the pharmaceutical field and their future seems very promising for the preparation of injured connective tissues or for gene therapy by allowing the introduction and survival of modified cells in a living organism. 10
  • cosmetic and dermopharmaceutical industries are making increasing use of reconstructed skin, all the more so since in these disciplines, animal tests are used less and less .
  • Document WO 99/19005 discloses a multilayer membrane comprising a predominantly collagen II matrix layer having a sponge texture covered on at least one side and preferably on both sides, with at least one barrier layer having a closed texture,
  • the barrier layer is formed by a natural animal membrane (see page 7, lines 23 to 32 and page 8, lines 10 to 30).
  • this barrier layer is to prevent the penetration and therefore the growth of native tissue cells because this membrane is dedicated to
  • cartilage cells or chondrocytes have a much slower multiplication or regeneration rate than the regeneration rate of soft tissue cells such as fibroblasts and, therefore, it is necessary to isolate them for allow them to grow by avoiding being invaded by fast-growing soft tissue cells.
  • This document leads to this solution by using a cell-tight barrier layer which protects the growth of collagen II cells which promote the growth of chondrocytes (see page 2, lines 15 to 20).
  • a bilayer material is initially prepared, each layer of which is capable of allowing the growth of human living cells, which constitutes an unobvious and totally unexpected solution in relation to the state of the technical.
  • Document WO 96/08277 relates to the use of a collagen membrane as a peritoneal regeneration prosthesis, constituting an earlier invention of the same applicant.
  • a preferred embodiment is a mixed membrane comprising a collagen sponge on which a collagen gel has been bonded, the membrane being obtained by drying the collagen gel in a non-toxic gaseous fluid, see in particular the Example II, pages 12 and 13 of this PCT application.
  • Example II it appears that the sponge obtained is compressed for 15 seconds under a pressure of 150 bars and that the mixed membrane is formed by pouring a 1% collagen gel onto this compressed sponge, this gel being then dried in the open air.
  • the mixed membrane obtained is in fact produced from two essentially compact layers, which constitutes a structure different from that which is the subject of the present invention. Furthermore, in the case of the present invention, it has been unexpectedly discovered that the claimed bilayer structure is compatible with a seeding of at least one layer with living human cells, allowing their conservation, as well as their multiplication.
  • document FR 2 679 778 constitutes another still earlier invention by the same similar applicant.
  • Document EP 0 686 402 also constitutes an earlier document by the same applicant relating to a postoperative anti-adhesion collagen membrane comprising two layers, a collagen-based support completely covered with a layer of gelatin, the mixture being in the lyophilized state.
  • the gelatin layer has the critical aim of achieving a membrane bonding effect avoiding adhesions and the gelatin has rapid resorption by dissolution at 37 ° C. in the presence of cells.
  • This document is different from the present invention in that it uses a dermis obtained by the elimination of a skin, covered with a mixture of human keratinocytes previously isolated by a conventional method, mixed with human melanocytes also previously isolated by a method. known and which is then subjected to a co-culture.
  • This document does not provide for a compact layer as provided in the context of the present invention and which can be seeded with human living cells, critically combined with a porous sub-layer which is clearly different from a de-epidermalized dermis.
  • the document WO 91/16010 describes equivalents of composite living skins consisting first of all in buying commercially a membrane of bovine collagen sponge which is inoculated with fibroblast cells (see page 8, third and fourth paragraphs).
  • the sponge After incubation, the sponge is inverted and the upper surface is laminated with non-porous collagen which can be treated with pepsin (see page 8 last paragraph) which is generally bovine collagen. It is stated that the purpose of treatment with pepsin is to remove the telopeptides (page 9, first four lines).
  • the pH of the collagen solution is adjusted to a neutral pH, which allows precipitation.
  • the collagen forms a thin film layer on the sponge and the whole is cultured at 37 ° C for 60 minutes (page 9, last sentence of the first paragraph). Then, cultured keratinocytes are inoculated on the laminated layer and a new culture is carried out again at pH 7.2 and 35 ° C for 10 days.
  • the bilayer structure is formed initially and is made up critically of a collagen sponge coated with a compact layer, this compact layer providing unexpected technical effects such as resulting from the following description.
  • the main difficulties to overcome for the production of supports intended for obtaining living artificial tissues are as follows: good mechanical resistance, low sensitivity to temperatures around 37 ° C, biological properties favorable to cell development and metabolism, low susceptibility to vis-à-vis the enzymatic degradation and, finally, for certain applications and in particular reconstructed skin, preferable presence of a bilayer structure in which one of the layers is as compact as possible and the other porous.
  • the object of the present invention is to solve these problems which remain unresolved both technically and industrially.
  • the present invention makes it possible to solve all of these technical problems in a particularly simple, inexpensive manner, usable on an industrial scale and in particular on a cosmetic, dermopharmaceutical or pharmaceutical industrial scale.
  • the present invention provides a new composite product forming a collagen support comprising at least one porous collagen layer coated on at least one face with an essentially compact collagen membrane produced either by a collagen film prepared by drying, preferably at air or in a gaseous fluid, a collagen gel, or by a very strongly compressed collagen sponge.
  • the compression of the compressed collagen sponge is carried out at a pressure at least equal to approximately 50 bars, equivalent to approximately 50.10 5 Pascals (Pa), preferably between 50 bars (50.10 5 Pa) and 200 bars (200.10 5 Pa), possibly this compression taking place at a temperature between 20 and 80 degrees C °, even better between 40 C ° and 60 C °.
  • a pressure at least equal to approximately 50 bars, equivalent to approximately 50.10 5 Pascals (Pa), preferably between 50 bars (50.10 5 Pa) and 200 bars (200.10 5 Pa), possibly this compression taking place at a temperature between 20 and 80 degrees C °, even better between 40 C ° and 60 C °.
  • this composite product is characterized in that the abovementioned collagen product is chosen from collagen and a mixture of collagen with a polysaccharide, in particular a glycosaminoglycan, chitosan, and chitosan derivatives, cellulose and derivatives cellulose, dextran and its derivatives, an alginate, an alginate derivative, a carrageenan.
  • a polysaccharide in particular a glycosaminoglycan, chitosan, and chitosan derivatives, cellulose and derivatives cellulose, dextran and its derivatives, an alginate, an alginate derivative, a carrageenan.
  • this composite product is characterized in that at least one of the two layers, respectively the porous layer and the essentially compact membrane, comprises living cells, normal or genetically modified, or malignant in particular from young or old subjects.
  • the living cells are chosen from the group consisting of fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, langerhan cells of blood origin, endothelial cells of blood origin, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, adipocytes, sebocytes , bone cells, chondrocytes, osteoblasts, Merkel cells of blood origin, normal or genetically modified or malignant.
  • the composite product is characterized in that it contains normal or genetically modified or malignant fibroblasts in the porous layer and normal or genetically modified or malignant living cells, on the surface of the compact membrane in particular chosen from keratinocytes, melanocytes, Merkel cells of blood origin, langerhan cells of blood origin, sebocytes, cells of blood origin, nerve cells.
  • the essentially compact membrane is prepared prior to combination with the porous layer, preferably comprising a collagen sponge, in particular by preparing the membrane and depositing it on a gel collagen before the whole is frozen and lyophilized to obtain said composite product.
  • the collagen sponge and / or the collagen film and / or the collagen membrane comprises collagen of mammalian origin, in particular of bovine origin.
  • the collagen sponge and / or the collagen film and / or collagen membrane comprises collagen of marine origin, preferably derived from fish skins of the family.
  • teleosts more particularly fish with areas of depigmented skin, even more particularly flat fish, even better those which are sinned industrially, such as for example sole, flounder, turbo, catfish whose non-ventral skins pigments can be easily separated by skinning.
  • the fish skin preferred as a source of collagen extraction usable according to the present invention is that of sole.
  • such a collagen sponge and / or a collagen film and / or a collagen membrane obtained from collagen of marine origin, preferably from the family of teleosts may be biocompatible with human living cells used for the manufacture of reconstructed skins and that these living human cells can not only remain alive but also be able to multiply.
  • the collagen of mammalian origin, in particular of bovine origin, or preferably of marine origin, in particular of fish skins of the teleost family can be crosslinked either chemically, or by physical crosslinking as will be described later in the context of the manufacturing process. It is particularly unexpected that such crosslinking can be used in the context of the production of a biomaterial biocompatible with human cells which are used in the rest of the process for the manufacture of reconstructed skins.
  • biocompatible is meant in the context of the present invention that the biomaterial is not toxic towards human living cells and that it also allows their growth or multiplication. It should be noted that the crosslinking generally has the effect of making the material non-biocompatible, therefore toxic to living cells and therefore cannot allow their growth.
  • the composite product according to the invention is characterized in that at least one of the two layers is produced from a collagen gel containing a mixture of soluble collagen and insoluble collagen, for example in the form of fibers.
  • the collagen can be type I and / or type III collagen.
  • the present invention also covers a process for manufacturing a composite product comprising at least one porous collagen layer coated on at least one face with an essentially compact collagen membrane, characterized in that: a) everything is prepared first the essentially compact collagen membrane, either by drying a first collagen gel, preferably by air drying or using a gaseous fluid, or by compression of a collagen sponge obtained by freezing- lyophilization of a collagen gel; b) a second collagen gel is prepared separately; c) either the essentially compact membrane is deposited on the second collagen gel, or the second collagen gel is poured onto the essentially compact membrane; and d) finally freezing-lyophilization of the assembly to obtain said composite product.
  • the compression step takes place at a temperature between 20 to 80 ° C, more preferably between 40 ° C and 60 ° C.
  • this process is characterized in that one uses for the preparation of the collagen sponge and / or the collagen film and / or the collagen membrane, either collagen or a mixture of collagen with a polysaccharide, in particular a glycosaminoglycan, chitosan, chitosan derivatives, cellulose and cellulose derivatives, dextran and its derivatives, an alginate, an alginate derivative, a carrageenan.
  • a polysaccharide in particular a glycosaminoglycan, chitosan, chitosan derivatives, cellulose and cellulose derivatives, dextran and its derivatives, an alginate, an alginate derivative, a carrageenan.
  • the method is characterized in that a crosslinking of at least one of the two layers or of both is carried out.
  • the aforementioned crosslinking is a physical crosslinking, in particular a thermal dehydration hot under vacuum or DHT, or a chemical crosslinking, in particular with diphenylphosphorylazide or DPPA, with an aldehyde such as glutaraldehyde, with carbodiimide, or succinimide.
  • a compound promoting cell development in particular a growth factor, in particular a cytokine, a chemokine, is added during manufacture.
  • the method according to the invention is characterized in that there is provided a step of introducing living cells, normal or genetically modified, or malignant in at least one of the two layers.
  • said living cells are chosen from the group consisting of fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, langerhan cells of blood origin, endothelial cells of blood origin, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, chondrocytes, bone cells, in particular osteoblasts, Merkel cells of blood origin, sebocytes, adipocytes, nerve cells.
  • the method is characterized in that fibroblasts are introduced into the porous layer.
  • the method is characterized in that living cells are deposited on the surface of the compact membrane, in particular chosen from keratinocytes, melanocytes, Merkel cells of origin blood, langerhans cells of blood origin, sebocytes, cells of blood origin, nerve cells.
  • the method is characterized in that the living cells are brought either by culture sequentially, either by concomitant culture between the different types of cells, these cells coming from culture or biopsy.
  • the present invention also covers the use of the composite product forming a collagen support as previously defined, or as obtained by the process as previously defined, or as resulting from the following description made in particular in relation with the examples for which any characteristic, which appears to be new compared to any prior art, is claimed as such in its function and in its generality, for the manufacture of artificial skins intended in particular for carrying out in vitro tests potentially active substance, or to reconstruct damaged skin areas in vivo.
  • artificial skins can be obtained either substantially exclusively from young cells, or substantially exclusively from old cells, in particular for studying the process of tissue aging and in particular for the skin and possibly testing the effectiveness of principles. active on this process.
  • reconstructed tissue capable of overcoming the deficiencies of damaged tissue: skin, cartilage, bone, tendons, corneas;
  • any characteristic, which appears new compared to any prior art, is claimed in its function and in its generality, independently of the context of the example.
  • Examples 6 to 13 constitute presently preferred embodiments of the composite products according to the invention forming a collagen support.
  • Example 14 relates to comparative tests demonstrating the advantage of the composite products according to the invention as collagen support for the manufacture of artificial skins intended in particular for carrying out in vitro tests of effectiveness of potentially active substance, or for reconstructing in vivo damaged skin areas.
  • the temperature is given in degrees Celsius
  • the pressure is atmospheric pressure
  • the percentages are given by weight unless otherwise indicated.
  • Examples 16 to 24 constitute examples of preparation of collagen-based support of aquatic origin usable for the preparation of reconstructed skins
  • Examples 25 to 27 relate to tests in particular comparative, using collagen of aquatic origin under the prepared forms in some of Examples 16 to 24, compared to collagen of bovine origin, allowing the manufacture of artificial skins.
  • FIG. 1 shows a sectional view, after marking by conventional histological staining, of a composite product according to the present invention produced from a lower porous layer of bovine collagen, surfaced on the upper face of an upper membrane essentially compact collagen produced by a collagen film prepared by air drying a collagen gel, under the conditions of Example 6,
  • FIG. 2 shows a similar section obtained with a simple porous matrix prepared with the same gel bovine collagen, but not surfaced, that is to say under the conditions of Example 1, showing the presence of inclusion of keratinocytes in depth, not limited to the surface,
  • FIG. 4 shows the inductor effect of a fermented malt extract commercially available under the trade mark ® Basaline, COLETICA, France on the production of laminins in mature reconstructed skin, the amount of laminins produced also being expressed as percent of control ,
  • FIG. 5 shows the same compensating effect of the fermented malt extract or Basaline ®, with the ordinate the amount of laminins produced as percent of control,
  • FIG. 6 shows the proliferation of normal human fibroblasts in equivalent dermis, with the time expressed in days and on the abscissa and the optical density x 1000 on the ordinate with units increasing by 100;
  • the curve with the diamonds is that obtained using a porous matrix of aquatic collagen, in this case fish, as support, and the curve with squares is obtained with bovine collagen;
  • FIG. 7 represents a similar proliferation curve of fibroblasts in equivalent dermis with the time expressed in days and in abscissa.
  • the curve with the solid diamonds represents the fluorescence obtained in the context of test 1; the curve with the square that obtained with test 2; the curve with the empty triangles being obtained with test 3 and finally the curve with the crosses being that obtained with test 4.
  • a gel is prepared from previously washed calf skins
  • the total duration of depilation is 36 hours.
  • the skins are then stubborn in a bath containing ammonium chloride (3%) and sodium metabisulfite (0.5%), at the rate of 400 g of skin for 50 ml of bath.
  • the total duration of this bath is 2 hours and thirty minutes.
  • the salts are removed by two successive washes with water (15 minutes per wash), at the rate of 200 ml of water per 100 g of tissue.
  • the ground material is then kneaded for one hour in order to obtain a paste.
  • the gel is obtained by continuously passing the dough through an ultrasonic treatment device of the UTL T / -6 type.
  • This gel has a concentration between 0.7 and 2% in collagen, the proportion of acid-soluble collagen varying from 10 to 20%, compared to insoluble collagen.
  • the collagen lyophilisate is incubated for 24 h in a solution containing 5 to 250 ⁇ l of DPPA / g of collagen contained in 100 ml of dimethyl formamide (DMF).
  • the collagen is then freed from DPPA by rinsing in 100 ml of DMF.
  • the DMF is then eliminated by rinsing in 100 ml of a borate buffer solution pH 8.9 (sodium tetraborate 0.04 M, boric acid 0.04 M).
  • the collagen is finally incubated overnight in the same borate buffer. Finally, the borate buffer is removed by rinsing with continuous permuted water for 6 h.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the collagen is crosslinked for 24 to 96 h in a solution containing 0.6 to 1% of GTA at 20 ° C. After rinsing with deionized water, the collagen is again lyophilized.
  • Porous matrix prepared with the native collagen of Example 1 in combination with chitosan and a glycosaminoglycan as described in the European patent of May 29, 1991 No. 296078.
  • Porous matrix described in Example 1 surfaced with a collagen film
  • the collagen gel whose dry matter is between 0.3 and 0.8% is dried in an oven at 30 ° C or in a hood at the rate of 0.5 g of gel / cm of tray.
  • the collagen gel it is possible to add 10 to 40% glycerol.
  • the collagen dried under these conditions forms a transparent film.
  • Porous matrix prepared with an acid-soluble collagen gel surfaced with a collagen film
  • Example 6 The process is that indicated in Example 6, the only difference being the nature of the gel cast on the film which is made of acid-soluble collagen prepared according to a technique well known to those skilled in the art.
  • EXAMPLE 8 Porous matrix prepared with an atelocollagen gel or surfaced with a collagen film
  • Example 6 The process is that indicated in Example 6, the only difference being the nature of the gel cast on the film which is made of atelocollagen, that is to say collagen without telopeptide prepared according to a technique well known in the art. skilled in the art.
  • Porous matrix consisting of collagen associated with chitosan and a glycosaminoglycan surfaced with a collagen film.
  • the process is that indicated in Example 6, but in this case, the gel cast on the collagen film consists of collagen, chitosan, a glycosaminoglycan.
  • the preparation of this gel is described in Example 5.
  • EXAMPLE 10 All the porous matrices surfaced with a collagen film described previously can be crosslinked according to the techniques described in Examples 2, 3 and 4.
  • EXAMPLE 11 Porous collagen alone matrix described in Example 1 surfaced with a compressed collagen sponge.
  • the collagen gel prepared as in Example 1 and having a dry matter of between 0.3 and 1.5% is lyophilized so as to obtain a sponge having a weight of between 0.5 and 2 g / cm 2 .
  • the lyophilisate is compressed for 5 to 60 seconds, at a temperature between 20 and 60 ° C and a pressure between 50 and 200 bars (50 to 200.10 5 Pa).
  • Example 1 The collagen gel described in Example 1 is deposited at a rate of 0.5 g per cm 2 in a lyophilization tray. The compressed sponge is then deposited on this gel and the whole is freeze-dried. A porous collagen sponge surfaced with a compressed collagen sponge is thus obtained. The whole is crosslinked by DHT as described in Example 1.
  • Porous matrix consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycan as described in Example 5 and surfaced with the compressed sponge.
  • the collagen, chitosan and glycosaminoglycan gel prepared according to the method of Example 5, is deposited at a rate of 0.5 g per cm in a freeze-drying tray, then the compressed sponge is deposited on this gel and the assembly is lyophilized. The lyophilisate is then crosslinked by DHT as described in Example 1.
  • Reconstructed skins prepared respectively either using the porous matrix crosslinked by DPPA described in example 2, or thanks to the porous matrix, crosslinked by DPPA, of example 2, surfaced by a compressed collagen sponge of which the whole is crosslinked by the DPPA, according to Example 13, in order to make a comparison between a composite product comprising a porous collagenous layer surfaced by an essentially compact membrane according to the invention and a product comprising a porous collagenous layer alone not surfaced.
  • Normal human fibroblasts are used resulting from samples taken indifferently from elderly or young subjects, which are recovered and which are developed in a conventional manner for those skilled in the art to recover them between the sixth and the tenth passage. .
  • Seeding is carried out at 250,000 cells per cm 2 of porous matrix, respectively either the comparison product comprising only the porous matrix crosslinked by the DPPA of Example 2, or the composite product according to the invention comprising the porous matrix crosslinked by the DPPA of example 2, surfaced by a compressed collagen sponge, the whole of which is crosslinked by the DPPA, according to example 13.
  • the culture medium is composed of DMEM / HAM F12 50/50 (v / v) added to 10% by weight of fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin, 25 ⁇ g / ml of gentamycin, 1 ⁇ g / ml d amphotericin B, 50 ⁇ g / ml of vitamin C.
  • a culture is carried out for three weeks by changing the medium three times a week.
  • Seeding is carried out at 250,000 cells per cm 2 of surface, ie of the surface of the porous matrix crosslinked with the DPPA of Example 2; either of the composite product according to the invention comprising the porous matrix crosslinked by the DPPA of example 2, surfaced by a compressed collagen sponge, the whole of which is crosslinked by the DPPA, according to example 13 and, in this case, the keratinocytes are sown on the surface of the essentially compact collagen membrane.
  • the culture of these products comprising both a seeding of fibroblasts and keratinocytes takes place in a Green medium composed of: DMEM supplemented with: 30% HAM F12, 10% fetal calf serum,
  • EGF Epidermal Growth factor 10 ng / ml, commercially available insulin under the brand name UMUUfNE®
  • This culture is carried out for a week by changing the media every day.
  • step b) After having carried out the culture of step b) for one week by changing media every day, the surface layer containing the keratinocytes emerges at the air-liquid interface, while the layer containing the fibroblasts remains immersed, followed a culture for three weeks in emersion medium composed of:
  • DMEM fetal calf serum
  • penicillin 100 IU / ml of penicillin
  • a reconstructed skin is obtained composed of a reconstructed dermis, the fibroblasts having colonized the three-dimensional collagen matrix, covered by a multi-layered epidermis.
  • the surfacing of porous matrices with an essentially compact layer to obtain a composite product according to the invention makes it possible to obtain, after three weeks of preparation of the equivalent dermis, a greater quantity of fibroblasts on the surface of the collagenic matrices before epidermization. .
  • the procedure is essentially as described in example 14 concerning the cultures using the same composite product according to the present invention comprising a porous collagenous layer or matrix crosslinked by the DPPA described in example 2, surfaced by a sponge of compressed collagen, the whole of which is crosslinked by the DPPA, according to Example 13, by proceeding as follows:
  • step a the porous matrices of the composite product of the invention were firstly seeded with normal human dermal fibroblasts from either pools of young cells or pools of cells mature or aged, and a culture is carried out for 21 days under the conditions described in Example 14 step a.
  • epidermal sheets prepared separately from keratinocytes originating either from pools of young cells or from pools of mature cells are seeded on the surface of the essentially compact collagen membrane of the composite product.
  • a culture is carried out for 14 days under the conditions described in Example 14b.
  • FIG. 3 shows that the reconstructed mature skins contain approximately half as much laminins as the reconstructed young skins (PRJ) serving as a 100% control.
  • COLETICA on the production of laminins in young and mature reconstructed skin
  • the laminins contained in the incubation media were quantified by ELISA.
  • the tension at 100% is made up of the level of laminins in Aged Reconstructed Skin or PRA.
  • Figure 4 shows that the active ingredient extracted from fermented malt, or BASALINE ® , was capable of stimulating the production of laminins in mature reconstructed skins. Under the same conditions, the active extract of fermented malt or Basaline ® does not alter how significant the production of laminin in skins youth rebuilt, shown in Figure 5. It is found that the active ingredient or fermented malt extract
  • BASALINE ® increases by 65% the production of laminins from mature reconstructed skin.
  • this active principle does not affect the physiological processes involved in regulating the production of laminins from young reconstructed skin.
  • FIG. 5 shows that the difference between the production of laminins from young reconstituted skins and from mature reconstituted skins can be reduced by 65% by the active ingredient, used to 0.5%.
  • a collagen gel is prepared from ground ventral sole skins then washed with a phosphate buffer pH 7.8, the composition of which is: 0.78 g / 1 of potassium dihydrogen phosphate and 21.7 g / 1 of disodium monohydrogen phosphate.
  • the washing is carried out with stirring for one hour at a rate of 5 l of buffer for 1 kg of ground material.
  • the phosphate is then removed by two successive washes with deionized water, then by continuous centrifugation at 4000 rpm (Rousselet decanter), at the rate of 5 l of water per 1 kg of ground material.
  • the ground product is then acidified with a 0.25 M acetic acid solution at a rate of 1 kg of ground material for 10 1 of solution.
  • the gel is then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes.
  • the gel which will be used consists of the supernatant obtained whose collagen concentration is between 0.5 and 2%.
  • This gel is poured into a lyophilization tray at a rate of 20 g / cm. It is then lyophilized after freezing at -30 ° C and heating to + 32 ° C. The lyophilization lasts a total of 16 hours under a pressure of 400 microbars.
  • the matrix obtained is then crosslinked by hydrothermal dehydration (DHT). This consists of heating in an oven at 110 ° C under a vacuum of 400 microbars for 16 hours.
  • DHT hydrothermal dehydration
  • the collagen matrix of Example 16 is incubated for 24 h in a solution containing 5 to 250 ⁇ l of DPPA / g of collagen contained in 100 ml of dimethylformamide (DMF).
  • the collagen is then freed from DPPA by rinsing in 100 ml of DMF.
  • the DMF is then eliminated by rinsing in 100 ml of a borate buffer solution pH 8.9 (sodium tetraborate 0.04 M, boric acid 0.04 M).
  • the collagen is finally incubated overnight in the same borate buffer.
  • the borate buffer is removed by rinsing with continuous permuted water for 6 h.
  • the aquatic collagen matrix of Example 16 is crosslinked with EDC (Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) at the concentration of 0.23 to 0.69 g / g of collagen, and with NHS (N-hydroxysuccinimide) at the concentration of 0.42 g / g of collagen.
  • EDC Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the collagen After rinsing with deionized water, the collagen is again lyophilized.
  • the porous aquatic collagen matrix of Example 16 is crosslinked for 24 to 96 h in a solution containing 0.6 to 1% of GTA at 20 ° C. After rinsing with deionized water, the collagen is again lyophilized.
  • Porous matrix prepared with the native aquatic collagen of Example 16 in combination with chitosan and a glycosaminoglycan as described in the European patent of May 29, 1991 No. 296078
  • Porous matrix described in Example 16 surfaced with a collagen film
  • the collagen gel the dry matter of which is between 0.3 and 0.8%, is dried in an oven at 30 ° C or in a hood at the rate of 0.5 g of gel / cm 2 of tray.
  • the native aquatic collagen gel of 0.5% to 2% in dry matter is deposited at the rate of 0.5 g per cm 2 in a lyophilization tray, then the collagen film is deposited on this gel and the whole is lyophilized.
  • the lyophilisate obtained is crosslinked with DHT.
  • EXAMPLE 22 Porous collagen alone matrix described in Example 16 surfaced with a compressed collagen sponge.
  • the collagen gel prepared as in Example 16 and having a dry matter of between 0.3 and 1.5% is lyophilized so as to obtain a sponge having a weight of between 0.5 and 2 g / cm 2 .
  • the lyophilisate is compressed for 5 to 60 seconds, at a temperature between 20 and 60 ° C and a pressure between 50 and 200 bars (50 to 200.10 5 Pa).
  • Example 16 The collagen gel described in Example 16 is deposited at a rate of 0.5 g per cm in a freeze-drying tray. The compressed sponge is then deposited on this gel and the whole is freeze-dried. A porous sponge from collagen surfaced with a compressed collagen sponge is thus obtained. The whole is crosslinked by DHT as described in Example 16.
  • EXAMPLE 23 Porous matrix consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycan as described in Example 20 and surfaced with the compressed sponge.
  • the collagen, chitosan and glycosaminoglycan gel prepared according to the method of Example 20, is deposited at a rate of 0.5 g per cm 2 in a lyophilization tray, then the compressed sponge is deposited on this gel and the whole is freeze-dried. The lyophilisate is then crosslinked by DHT as described in Example 16.
  • Example 17 an aquatic porous matrix crosslinked with DPPA is produced on the one hand, according to Example 17.
  • a fabricates a comparative porous matrix with collagen of bovine origin, also called bovine matrix, crosslinked with DPPA, under the same conditions as those of Example 17.
  • the culture of these aquatic and bovine matrices is carried out respectively in medium composed of DMEM / HAM F 12 in a 50/50 ratio (v / v) supplemented with 10% fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin, 25 ⁇ g / ml of gentamycin, 1 ⁇ g / ml of amphotericin B, 50 ⁇ g / ml of vitamin C.
  • This culture is carried out for 1 month by changing the culture medium 3 times a week.
  • MTT ie 3- (4- (dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the optical density of the transformation product (formazan blue) is read at 550 nm after self-dissolution in DMSO.
  • the optical density obtained is proportional to the activity of the succinate dehydrogenases which are capable of carrying out the transformation of the light yellow tetrazolium MTT salt into blue crystals of formazan.
  • the curve with the diamonds is that obtained with the aquatic matrix and the curve with the squares is that obtained with the bovine matrix. It is observed from the results that in a completely su ⁇ renant manner, the aquatic matrix not only constitutes a support allowing the survival of normal human fibroblasts but also the cellular proliferation of these normal human fibroblasts, while even constituting a much better culture support during first three weeks.
  • the aquatic collagen is, in a su ⁇ renant manner, particularly suitable for producing a tissue engineering support in particular for applications in vitro and even and especially in vivo to constitute biomaterials containing living cells and in particular and preferably living cells of human beings.
  • the assay is carried out by the Pierce microBCA method.
  • the cell density was evaluated by an MTT test under the conditions described above.
  • the relative protein content corresponds to the protein content reduced to 1 unit of cell density expressed in optical density or OD, in order to reason at equivalent cell concentration.
  • the results obtained are listed in Table II below:
  • fibroblasts could be observed in matrices of bovine and aquatic origin. In both types of matrices, we note the presence of an abundant neosynthesized extracellular matrix. The neosynthesized extracellular matrix can be differentiated by the periodic striation of the deposited collagen fibers compared to the collagen clusters forming the three-dimensional matrix of the starting sponge.
  • Test 1 For this test, a porous matrix is produced in the form of a porous sponge from an aquatic collagen gel prepared from 1.3% by weight of aquatic collagen, which is frozen at ⁇ 80. ° C and which is subjected to a standard lyophilization in accordance with Example 17 and which is then subjected to crosslinking with DPPA in a proportion of 250 ⁇ l / g of sponge in the dry state.
  • a porous support in the form of an aquatic sponge is prepared from an aquatic collagen gel comprising 0.7% by weight of aquatic collagen, which is subjected to freezing at -80 ° C., then to standard lyophilization and crosslinking with DPPA at 250 ⁇ l / g dry as in test 1.
  • a porous support comprising an aquatic collagen sponge obtained from an aquatic collagen gel comprising 1.1% by weight of aquatic collagen, which is subjected to freezing at -80 ° C., then to standard lyophilization and crosslinking with DPPA at 250 ⁇ l / g dry as in test 2, the difference residing in a proportion of 1.1% by weight of aquatic collagen.
  • the aquatic collagen is derived, as in Example 17, from the ventral sole skin.
  • Example 25 Is used as in Example 25, normal human fibroblasts but which are taken at 8 th passage. Seeding is carried out at the rate of 275,000 cells per cm.
  • the culture medium is composed of DMEM / HAM F12 50/50 (v / v) added with 10% by weight of fetal calf serum, 100 IU / ml of penicillin, 25 ⁇ g / ml of gentamycin, 1 ⁇ g / ml of amphotericin B, 50 ⁇ g / ml of vitamin C.
  • the culture is carried out for 1 month by changing the medium 3 times a week.
  • Alamar Blue is added at a rate of 2% by weight of a culture medium used, when it is desired to measure the cell viability on a sample taken from the culture medium. • After incubation at 2 h 20 at 37 ° C., the fluorescence is read, on the basis of an excitation at 530 nm and an emission at 590 nm).
  • the intensity of the fluorescence obtained is proportional to the metabolic activity of the cells.
  • the cell viability measurement is carried out on 10 samples after 1, 4 6, 11 17 days of culture.
  • the results of the table UI are also the subject of attached figure 7. They show the fibrobiastic proliferation curves in equivalent dermis.
  • the solid diamond curve is that performed with test 1; the curve in full square is that carried out with test 2; the triangle curve is that carried out with test 3 and the curve with the crosses is that carried out with test 4.
  • the various matrices prepared can allow good fibrobiastic growth after 17 days of culture.
  • the fibroblasts adhere well to their three-dimensional support and divide very quickly in order to colonize the matrix.
  • the proliferation profile is very slightly variable from one type of matrix to another, but after 17 days of culture, the fibrobiastic density is comparable whatever the manufacturing process.
  • This test is similar to that of Example 25, except that a histology with immunostaining is carried out.
  • Example 25 These are equivalent dermes from Example 25, the culture being carried out under the conditions of Example 25.
  • This culture is therefore carried out for three weeks by changing the medium three times a week, the seeding of normal human fibroblasts having taken place at 300,000 cells per cm 2 as was indicated in Example 25.
  • the fixation is carried out with paraformaldehyde at a content of 4% by weight, then a dehydration and a paraffin inclusion are carried out.
  • Haidenhain after dewaxing and rehydration Haidenhain after dewaxing and rehydration.
  • Tissue Tek OCT compound is carried out, that is to say an inclusion liquid supplied by Miles, Elkhart, Indiana, USA, and a cold cut at 7 ⁇ m. Immunostaining is performed as follows: i. With a first anti-human collagen type I antico ⁇ s of rabbit (dilution),
  • the supports constituted respectively by an aquatic matrix and a bovine matrix form more or less loose pores in which the fibroblasts adhere.
  • On the surface there is a higher proportion of fibroblasts forming a favorable surface treatment of the equivalent dermis for producing reconstructed skin.
  • the distribution of fibroblasts is homogeneous in aquatic and bovine sponges.
  • the matrix of aquatic origin is only very weakly marked by the antico ⁇ s anti-human collagen.

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Abstract

L'invention concerne un produit composite formant un support collagénique comprenant au moins une couche poreuse collagénique revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée. Avantageusement, au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés. L'invention permet de fournir un produit composite formant un support collagénique pour la fabrication de peaux artificielles destinées notamment à réaliser des essais in vitro d'efficacité de substances potentiellement actives, ou à reconstruire in vivo des zones de peaux endommagées.

Description

SUPPORTS A BASE DE COLLAGENE POUR L'INGENIERIE TISSULAIRE ET LA PREPARATION DE BIOMATERIAUX
Depuis de nombreuses années, le collagène s'est révélé être un substrat irremplaçable pour la réalisation de tissus artificiels renfermant des 5 cellules vivantes.
Les biomatériaux obtenus sont de plus* en plus utilisés dans le domaine pharmaceutique et leur avenir semble très prometteur pour la préparation des tissus conjonctifs lésés ou pour la thérapie génique en permettant l'introduction et la survie de cellules modifiées dans un organisme vivant. 10 De plus pour des tests « in vitro », les industries cosmétique et dermo- pharmaceutique font de plus en plus appel aux peaux reconstruites et ceci, d'autant plus, que dans ces disciplines, les tests sur animaux sont de moins en moins utilisés.
C'est pourquoi, plusieurs équipes de recherche dans le monde se sont
15 efforcées de mettre au point des supports à base de collagène pour la réalisation de tissus artificiels vivants, tels que des peaux, des cartilages, des os, des tendons ou des cornées reconstruites. Les domaines d'application de ces nouveaux biomatériaux sont donc nombreux.
Il est à noter que les principaux travaux réalisés dans le domaine
20 concerné par l'invention sont dus principalement aux équipes de : Yannnas L,
Collombel C, Tinois E., Boyce S., Eisenberg H., Bell E., Kuroyanagi Y.,
Maruguchi T., Hanthamrongwit M., Auger F.A., et Osborne C.S., par exemple voir brevet US 5,273,900.
Tous ces chercheurs utilisent soit des gels, soit des éponges de 25 collagène, ces dernières étant obtenues par lyophilisation.
Il est connu par le document WO 99/19005 une membrane multicouches comprenant une couche de matrice à prédominance en collagène II ayant une texture en éponge recouverte sur au moins une face et de préférence sur les deux faces, d'au moins une couche barrière ayant une texture fermée,
30 relativement imperméable.
Il ressort du texte que la couche barrière est constituée par une membrane animale naturelle (voir page 7, lignes 23 à 32 et page 8, lignes 10 à 30).
Cette couche barrière a pour but d'empêcher la pénétration et donc la croissance de cellules de tissus natives car cette membrane est dédiée à la
35 reconstruction de l'os ou surtout du cartilage, de sorte qu'il est nécessaire d'utiliser comme matériau prédominant de sa couche poreuse du collagène H obtenu à partir de cartilage, de préférence de cartilage hyalin de porc (voir page 7, lignes 14-16).
Il est à noter que les cellules de cartilage ou les chondrocytes ont une vitesse de multiplication ou de régénération beaucoup plus lente que la vitesse de régénération des cellules des tissus mous tels que les fibroblastes et, de ce fait, il est nécessaire de les isoler pour leur permettre de croître en évitant d'être envahi par les cellules à croissance rapide des tissus mous. Ce document aboutit à cette solution en utilisant une couche barrière étanche aux cellules qui protège la croissance des cellules de collagène II qui favorisent la croissance des chondrocytes (voir page 2, lignes 15 à 20).
Dans le cadre de la présente invention décrite plus loin, il est préparé initialement un matériau bicouches dont chaque couche est capable de permettre la croissance de cellules vivantes humaines, ce qui constitue une solution non évidente et totalement inattendue par rapport à l'état de la technique. Le document WO 96/08277 est relatif à l'utilisation d'une membrane collagénique comme prothèse de régénération péritonéale, constituant une invention antérieure du même déposant. Dans ce document, un mode de réalisation préféré est une membrane mixte comprenant une éponge de collagène sur laquelle a été collé un gel de collagène, la membrane étant obtenue par séchage du gel de collagène dans un fluide gazeux non toxique, voir en particulier l'exemple II, pages 12 et 13 de cette demande PCT.
Cependant, dans l'exemple II, il ressort que l'éponge obtenue est comprimée pendant 15 secondes sous une pression de 150 bars et que la membrane mixte est formée en coulant un gel de collagène à 1 % sur cette éponge comprimée, ce gel étant ensuite séché à l'air libre.
Compte tenu de la compression de l'éponge obtenue pendant 15 secondes sous une pression de 150 bars, la membrane mixte obtenue est en fait réalisée à partir de deux couches essentiellement compactes, ce qui constitue une structure différente de celle objet de la présente invention. Par ailleurs, dans le cas de la présente invention, il a été découvert de manière inattendue que la structure bicouche revendiquée était compatible avec un ensemencement d'au moins une couche avec des cellules humaines vivantes, en permettant leur conservation, ainsi que leur multiplication.
Il est à noter que le document FR 2 679 778 constitue une autre invention encore antérieure du même déposant similaire. Le document EP 0 686 402 constitue encore un document antérieur du même déposant relatif à une membrane collagénique anti-adhérence postopératoire comprenant deux couches, un support à base de collagène revêtu complètement d'une couche de gélatine, le mélange étant à l'état lyophilisé. Il est à noter qu'ici la couche de gélatine a pour but critique de réaliser un effet de collage de la membrane évitant les adhérences et la gélatine a une résorption rapide par dissolution à 37°C en présence de cellules.
Le document EP 0 789 074 de L'OREAL est relatif à un équivalent de peaux comprenant des cellules de Langerhans. II est à noter que dans cette demande, le support proprement' dit décrit à la colonne 4, page 3, est un support quelconque de l'art antérieur. Il peut être formé par des lattices mixtes collagène/fibroblaste, un derme préalablement désépidermisé, une membrane artificielle, un substitut sous-cutané à base de collagène, un plastique ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire (colonne 4, lignes 3 à 12).
Ce document est différent de la présente invention dans la mesure où il utilise un derme obtenu par délimination d'une peau, recouvert d'un mélange de kératinocytes humains préalablement isolés selon une méthode classique, mélangé à des mélanocytes humains également préalablement isolés selon une méthode connue et que l'on soumet ensuite à une co-culture. Ce document ne prévoit pas de couche compacte telle que prévue dans le cadre de la présente invention et qui peut être ensemencée de cellules vivantes humaines, combinées de manière critique avec une sous-couche poreuse qui est clairement différente d'un derme désépidermisé. Enfin, le document WO 91/16010 décrit des équivalents de peaux vivantes composites consistant tout d'abord à acheter dans le commerce une membrane d'épongé de collagène bovin que l'on inocule de cellules de fibroblastes (voir page 8, troisième et quatrième paragraphes).
Après incubation, l'éponge est inversée et la surface supérieure est laminée avec du collagène non poreux qui peut être traité à la pepsine (voir page 8 dernier paragraphe) qui est en général du collagène bovin. Il est indiqué que le traitement avec la pepsine a pour but d'enlever les télopeptides (page 9, quatre premières lignes). Le pH de la solution de collagène est ajusté à un pH neutre, ce qui permet de précipiter. Le collagène forme une couche de film mince sur l'éponge et on cultive l'ensemble à 37°C pendant 60 minutes (page 9, dernière phrase du premier paragraphe). Ensuite, des kératinocytes cultivés sont inoculés sur la couche laminée et on effectue encore une nouvelle culture à pH 7,2 et 35°C pendant 10 jours.
Dans le cadre de la présente invention, comme il résulte de la description suivante, la structure bicouches est formée initialement et est constituée de manière critique d'une éponge de collagène revêtue d'une couche compacte, cette couche compacte procurant des effets techniques inattendus comme résultant de la description suivante.
Les principales difficultés à surmonter pour la réalisation des supports destinés à l'obtention des tissus artificiels vivants sont les suivantes : bonne résistance mécanique, faible sensibilité à des températures avoisinant 37° C, propriétés biologiques favorables au développement et au métabolisme cellulaires, faible susceptibilité vis-à-vis de la dégradation enzymatique et, enfin, pour certaines applications et en particulier la peau reconstruite, présence préférable d'une structure bicouche dans laquelle l'une des couches est la plus compacte possible et l'autre poreuse.
Jusqu'à maintenant, les recherches effectuées n'avaient pas permis d'obtenir des supports collagéniques répondant de façon satisfaisante à l'ensemble des contraintes énumérées plus haut.
La présente invention a pour objet de résoudre ces problèmes restés en suspens tant sur le plan technique que sur le plan industriel.
La présente invention permet de résoudre l'ensemble de ces problèmes techniques d'une manière particulièrement simple, peu coûteuse, utilisable à l'échelle industrielle et en particulier à l'échelle industrielle cosmétique, dermo- pharmaceutique ou pharmaceutique. Selon un premier aspect, la présente invention fournit un nouveau produit composite formant un support collagénique comprenant au moins une couche poreuse collagénique revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse du produit composite selon l'invention, la compression de l'éponge collagénique comprimée est réalisée à une pression au minimum égale à environ 50 bars, équivalent à environ 50.105 Pascals (Pa), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), éventuellement cette compression ayant lieu à une température comprise entre 20 et 80 degré C°, encore mieux entre 40 C° et 60 C°. Selon une caractéristique avantageuse, ce produit composite est caractérisé en ce que le produit collagénique précité est choisi parmi du collagène et un mélange de collagène avec un polysaccharide, en particulier un glycosaminoglycanne, le chitosane, et les dérivés du chitosane, la cellulose et les dérivés de la cellulose, le dextrane et ses dérivés, un alginate, un dérivé d'un alginate, un carraghénane.
Selon encore une caractéristique avantageuse de ce produit composite, celui-ci est caractérisé en ce qu'au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés.
Selon une variante de réalisation avantageuse, les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, adipocytes, sébocytes, cellules osseuses, des chondrocytes, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales ou génétiquement modifiées ou malignes.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse, le produit composite est caractérisé en ce qu'il contient des fibroblastes normaux ou génétiquement modifiés ou malins dans la couche poreuse et des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, à la surface de la membrane compacte en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, il peut être particulièrement intéressant de préparer soit des peaux reconstruites "jeunes" en utilisant des cellules prélevées sensiblement exclusivement sur des sujets jeunes, soit des peaux reconstruites "âgées" obtenues à partir de cellules prélevées sensiblement exclusivement sur des sujets âgés. Grâce à ces modèles, il sera possible d'améliorer les connaissances sur le processus du vieillissement cutané et d'étudier l'influence d'actifs sur ce processus.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la membrane essentiellement compacte est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant la membrane et en la déposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé pour obtenir ledit produit composite.
Selon encore un autre mode de réalisation du produit composite selon l'invention, celui-ci est caractérisé en ce que l'éponge collagénique et/ou le film collagénique et/ou la membrane collagénique, comprend du collagène d'origine mammifère, en particulier d'origine bovine.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du produit composite selon la présente invention, l'éponge collagénique et/ou le film collagénique et/ou membrane collagénique, comprend du collagène d'origine marine, de préférence issu de peaux de poissons de la famille des téléostéens, plus particulièrement de poissons présentant des zones de peaux dépigmentées, encore plus particulièrement des poissons plats, encore mieux ceux qui sont péchés de façon industrielle, comme par exemple la sole, la limande, le turbo, le barbue dont les peaux ventrales non pigmentées peuvent être facilement séparées par dépeçage. La peau de poissons préférée comme source d'extraction du collagène utilisable selon la présente invention est celle de la sole. La préparation de collagène à partir de peaux de poissons est en particulier décrite dans le document précédent du déposant EP 0 592 586 = US-A-5, 420,248 auquel l'homme de l'art pourra se reporter. Il est particulièrement inattendu qu'une telle éponge collagénique et/ou un film collagénique et/ou une membrane collagénique obtenue à partir de collagène d'origine marine, de préférence de la famille des téléostéens, puisse être biocompatible avec des cellules vivantes humaines utilisées pour la fabrication de peaux reconstruites et que ces cellules humaines vivantes puissent non seulement rester vivantes mais également être capables de se multiplier. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le collagène d'origine mammifère, en particulier d'origine bovine, ou de préférence d'origine marine, en particulier de peaux de poissons de la famille des téléostéens peut être réticulé soit chimiquement, soit par réticulation physique comme cela sera décrit plus loin dans le cadre du procédé de fabrication. Il est particulièrement inattendu qu'une telle réticulation puisse être utilisée dans le cadre de la réalisation d'un biomatériau biocompatible avec des cellules humaines qui sont utilisées dans la suite du procédé pour la fabrication de peaux reconstruites.
Par "biocompatible", on entend dans le cadre de la présente invention que le biomatériau n'est pas toxique vis-à-vis des cellules vivantes humaines et qu'il permet aussi leur croissance ou multiplication. Il est à noter que la réticulation a généralement pour effet de rendre le matériau non biocompatible, donc toxique pour les cellules vivantes et ne peut alors pas permettre leur croissance.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du produit composite selon l'invention, celui-^i est caractérisé en ce qu'au moins l'une des deux couches est réalisée à partir d'un gel collagénique contenant un mélange de collagène soluble et de collagène insoluble, par exemple sous forme de fibres.
Dans le cas du produit composite selon l'invention, le collagène peut être du collagène de type I et/ou de type III. Selon un deuxième aspect, la présente invention couvre aussi un procédé de fabrication d'un produit composite comprenant au moins une couche poreuse collagénique revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique, caractérisé en ce que : a) on prépare tout d'abord la membrane essentiellement compacte collagénique, soit par séchage d'un premier gel collagénique, de préférence par séchage à l'air ou à l'aide d'un fluide gazeux, soit par compression d'une éponge collagénique obtenue par congélation- lyophilisation d'un gel collagénique ; b) on prépare séparément un deuxième gel collagénique ; c) soit on dépose la membrane essentiellement compacte sur le deuxième gel collagénique, soit on verse le deuxième gel collagénique sur la membrane essentiellement compacte ; et d) on procède enfin à une congélation-lyophilisation de l'ensemble pour obtenir ledit produit composite.
Selon une variante avantageuse de ce procédé, celui-ci est caractérisé en ce qu'on réalise une compression de l'éponge collagénique servant à préparer la membrane compacte à une pression au moins égale à 50 bars (d'environ
50.105 Pa), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars
(200.10s Pa).
Avantageusement l'étape de compression a lieu à une température comprise entre 20 à 80°C, encore de préférence entre 40°C et 60°C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ce procédé, celui-ci est caractérisé en ce qu'on utilise pour la préparation de l'éponge collagénique et/ou du film collagénique et/ou de la membrane collagénique, soit du collagène, soit un mélange de collagène avec un polysaccharide, en particulier un glycosaminoglycanne, le chitosane, les dérivés du chitosane, la cellulose et les dérivés de la cellulose, le dextrane et ses dérivés, un alginate, un dérivé d'un alginate, un carraghénane.
Selon une autre variante de réalisation, le procédé est caractérisé en ce qu'on réalise une réticulation d'au moins l'une des deux couches ou des deux. Selon une variante de réalisation avantageuse, la réticulation précitée est une réticulation physique, en particulier une déshydratation thermique à chaud sous vide ou DHT, ou une réticulation chimique, en particulier au diphénylphosphorylazide ou DPPA, avec une aldéhyde telle que glutaraldéhyde, au carbodiimide, ou au succinimide. Selon une autre variante de réalisation avantageuse de ce' procédé, celui-ci est caractérisé en ce qu'on ajoute lors de la fabrication un composé favorisant le développement cellulaire, en particulier un facteur de croissance, en particulier une cytokine, une chémiokine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, celui-ci est caractérisé en ce qu'on prévoit une étape d'introduction de cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes dans au moins une des deux couches.
Selon une variante de réalisation avantageuse, lesdites cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, des chondrocytes, cellules osseuses en particulier ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, des sébocytes, des adipocytes, des cellules nerveuses. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'on introduit des fibroblastes dans la couche poreuse.
Selon un mode de réalisation encore préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'on dépose des cellules vivantes à la surface de la membrane compacte, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses.
Selon une variante de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que les cellules vivantes sont apportées soit par culture séquentielle, soit par culture concomitante entre les différents types de cellules, ces cellules provenant de culture ou de biopsie.
Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi l'utilisation du produit composite formant un support collagénique tel que précédemment défini, ou tel qu'obtenu par le procédé tel que précédemment défini, ou tel que résultant de la description suivante notamment faite en relation avec les exemples pour lesquels toute caractéristique, qui apparaît être nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque, est revendiquée en tant que telle dans sa fonction et dans sa généralité, pour la fabrication de peaux artificielles destinées notamment à réaliser des essais in vitro d'efficacité de substance potentiellement active, ou à reconstruire in vivo des zones de peau endommagées.
Selon une caractéristique avantageuse, les peaux artificielles peuvent être obtenues soit sensiblement exclusivement à partir de cellules jeunes, soit sensiblement exclusivement à partir de cellules âgées, en particulier pour étudier le processus de vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité de principes actifs sur ce processus.
On comprend ainsi que l'invention permet de résoudre les problèmes techniques précités.
Dans le but d'obtenir les matériaux collagéniques les plus résistants, les inventeurs ont plus particulièrement mis en œuvre le procédé décrit dans le brevet US 5 331 092 délivré le 19 juillet 1994. Cette technique permet d'obtenir un mélange de collagènes de type I et de type ffl solubles et insolubles natifs, très résistants aussi bien sur le plan mécanique que vis-à-vis de la digestion enzymatique. Ces deux dernières caractéristiques pourront être éventuellement renforcées par toute technique de réticulation ou par adjonction de substances ayant de fortes interactions avec le collagène et ne présentant pas de toxicité vis-à- vis des cellules. De plus, ce procédé d'obtention du collagène permet de rendre presque inexistant le risque de contamination biologique due aux bactéries, virus ou prions. Pour le cas des supports destinés à l'obtention des peaux reconstruites, les inventeurs ont eu l'idée de préparer des matériaux bicouches en réalisant d'abord la couche la plus compacte et ensuite l'éponge poreuse. Cette méthodologie a l'avantage de conduire à l'obtention d'une couche de surface beaucoup plus compacte que toutes celles qui avaient été décrites jusqu'à maintenant. En particulier, de ce fait, des éponges compactées par de fortes compressions ou des films peuvent être ainsi fixés sur des matrices poreuses. L'utilisation des supports décrits plus haut pour des applications d'ingénierie tissulaire implique l'ensemencement des cellules vivantes ou génétiquement modifiées, le développement des cellules pouvant se faire soit à l'intérieur du support collagénique soit à sa surface. Les tissus vivants reconstruits ainsi obtenus peuvent être utilisés dans de nombreuses applications cosmétique, dermopharmaceutique ou pharmaceutique en tant que :
. modèles « in vitro » permettant de simuler les effets des ingrédients sur les métabolismes cellulaires afin d'évaluer l'efficacité et la toxicité de matières premières ou de formulations plus complexes ;
. tissus reconstruits capables de pallier les déficiences de tissus endommagés : peaux, cartilages, os, tendons, cornées ;
. implants vivants renfermant des cellules modifiées capables de pallier certaines déficiences de l'organisme, en particulier dans le domaine de la thérapie génique.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative, qui va suivre, faite en référence à divers exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration, et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Comme précédemment indiqué, dans les exemples, toute caractéristique, qui apparaît nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque, est revendiquée dans sa fonction et dans sa généralité, indépendamment du contexte de l'exemple. En outre, les exemples 6 à 13 constituent des modes de réalisation actuellement préférés des produits composites selon l'invention formant support collagénique. L'exemple 14 vise des essais comparatifs démontrant l'intérêt des produits composites selon l'invention comme support collagénique pour la fabrication de peaux artificielles destinées notamment à réaliser des essais in vitro d'efficacité de substance potentiellement active, ou à reconstruire in vivo des zones de peau endommagées. Dans les exemples, la température est donnée en degré Celsius, la pression est la pression atmosphérique, et les pourcentages sont donnés en poids sauf indication contraire.
Les exemples 16 à 24 constituent des exemples de préparation de support à base de collagène d'origine aquatique utilisable pour la préparation de peaux reconstruites, les exemples 25 à 27 sont relatifs à des essais notamment comparatifs, utilisant le collagène d'origine aquatique sous les formes préparées dans certains des exemples 16 à 24, comparés à du collagène d'origine bovine, permettant la fabrication de peaux artificielles. Dans les figures annexées :
- la figure 1 représente une vue en coupe, après marquage par coloration histologique classique, d'un produit composite selon la présente invention réalisé à partir d'une couche poreuse inférieure de collagène bovin, surfacée sur la face supérieure d'une membrane supérieure essentiellement compacte collagénique réalisée par un film collagénique préparé par séchage à l'air d'un gel de collagène, dans les conditions de l'exemple 6, - la figure 2 représente une coupe similaire obtenue avec une simple matrice poreuse préparée avec le même gel de collagène bovin, mais non surfacée, c'est-à-dire dans les conditions de l'exemple 1 , montrant la présence d'inclusion de kératinocytes en profondeur, non limitée à la surface,
- la figure 3 représente la quantité de laminines présentes dans les milieux d'incubation de peaux reconstruites, respectivement, de peaux reconstruites jeunes, obtenues à partir de cellules prélevées sur des donneurs de 25 à 35 ans ; et de peaux reconstruites matures ou âgées, obtenues à partir de cellules prélevées sur des donneurs de plus de 55 ans, afin de montrer l'influence de l'âge des donneurs, les résultats étant exprimés sous forme de "bâton", la quantité de laminines produites étant exprimée en ordonnées en pourcentage du témoin (PRJ = peaux reconstruites jeunes),
- la figure 4 représente l'effet inducteur d'un extrait de malt fermenté commercialement disponible sous la marque BASALINE®, COLETICA, France sur la production de laminines dans des peaux reconstruites matures, la quantité de laminines produites étant également exprimée en pourcentage du témoin,
- la figure 5 représente l'effet compensateur du même extrait de malt fermenté ou BASALINE®, avec en ordonnées la quantité de laminines produites en pourcentage du témoin,
- la figure 6 représente la prolifération des fibroblastes humains normaux en derme équivalent, avec le temps exprimé en jour et en abscisse et la densité optique x 1000 en ordonnées avec des unités augmentant de 100 ; la courbe avec les losanges est celle qui est obtenue en utilisant comme support une matrice poreuse de collagène aquatique, ici de poissons, et la courbe avec des carrés est obtenue avec du collagène bovin ; et - la figure 7 représente une courbe de prolifération similaire de fibroblastes en derme équivalent avec en abscisse le temps exprimé en jour et en ordonnées la fluorescence exprimée en unité internationale, commençant à 15.000 avec des unités augmentant de 10.000 ; la courbe avec les losanges pleins représente la fluorescence obtenue dans le cadre de l'essai 1 ; la courbe avec le carré celle obtenue avec l'essai 2 ; la courbe avec les triangles vides étant obtenue avec l'essai 3 et enfin la courbe avec les croix étant celle obtenue avec l'essai 4.
EXEMPLE 1
Préparation d'une matrice poreuse de collagène natif selon la technique du brevet US N°5331092
A - Obtention du collagène natif
Un gel est préparé à partir de peaux de veaux préalablement lavées
(2 heures) puis épilées par un mélange de chaux-sulfure (chaux : 3.5 %, sulfure de sodium : 2.5 %) à raison de 400g de peau (matière sèche : environ 30 %) pour 250 ml d'eau. Ce bain s'effectue sous une rotation de 4 t/mn pendant 30 minutes.
La durée totale de la dépilation est de 36 heures.
Les peaux sont ensuite déchaulées dans un bain contenant du chlorure d'ammonium (3 %) et du métabisulfite de sodium (0.5 %), à raison de 400 g de peau pour 50 ml de bain.
La durée totale de ce bain est de 2 heures et trente minutes.
Les sels sont éliminés par deux lavages successifs à l'eau (15 minutes par lavage), à raison de 200 ml d'eau pour 100 g de tissu.
Des peaux sont alors broyées, puis lavées, sous agitation pendant 1 heure, par du tampon phosphate pH 7.8 (dihydrogénophosphate de potassium
0.78g/l et monohydrogénop osphate disodique 21.7 g/1), à raison de 5 1 de tampon/ 1 kg de broyât. Le phosphate est ensuite éliminé par deux lavages successifs à l'eau permutée, puis par une centrifugation en continu à
4000 rpm (décanteuse Rousselet), à raison de 51 d'eau pour 1 kg de broyât. Le broyât est alors acidifié par une solution d'acide acétique à 10 %, la quantité d'acide acétique étant de 5 % par rapport au collagène, la molarité finale est d'environ 0.08 M.
Le broyât est alors malaxé pendant une heure afin d'obtenir une pâte.
Le gel est obtenu par passage en continu de la pâte dans un appareil de traitement aux ultra sons de type UTL T/-6. Ce gel a une concentration comprise entre 0.7 et 2 % en collagène, la proportion de collagène acido- soluble variant de 10 à 20 %, par rapport au collagène insoluble.
B - Préparation de la matrice poreuse grâce au gel de collagène obtenu comme indiqué précédemment
20 g de gel de collagène par cm2 (matière sèche = 0.75 %) sont placés dans un plateau de lyophilisation et lyophilisés : la congélation s'effectue à -30°C puis le chauffage à + 32°C. La lyophilisation dure au total 16 heures sous une pression de 400 microbars. Le lyophilisât est réticulé par réticulation physique (DHT) : le lyophilisât est placé 10 heures dans une étuve à 110° C et 400 microbars de pression.
EXEMPLE 2
Préparation d'une matrice poreuse réticulée grâce au diphénylphosphorylazide (DPPA) selon la technique décrite dans le brevet européen N° 466 829 du 24 juillet 1996
Le lyophilisât de collagène est incubé 24 h dans une solution renfermant 5 à 250 μl de DPPA/g de collagène contenu dans 100 ml de diméthyl formamide (DMF). Le collagène est ensuite débarrassé du DPPA par rinçage dans 100 ml de DMF. Le DMF est ensuite éliminé par rinçage dans 100 ml d'une solution de tampon borate pH 8.9 (tétraborate de sodium 0.04 M, acide borique 0.04 M).
Le collagène est finalement incubé pour une nuit dans le même tampon borate. Enfin le tampon borate est éliminé par rinçage à l'eau permutée en continu pendant 6 h.
EXEMPLE 3
Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le carbodiimide et le N- hydroxysuccinimide Le collagène est réticulé avec de l'EDC (Ethyl diméthyl amino-propyl carbodiimide) à la concentration de 0.23 à 0.69 g/g de collagène, et avec de
NHS (N-hydroxysuccinimide) à la concentration de 0 à 0.42 g/g de collagène.
Après rinçage à l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé. EXEMPLE 4
Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le glutaraldéhyde
Le collagène est réticulé pendant 24 à 96 h dans une solution contenant 0.6 à 1 % de GTA à 20°C. Après rinçage avec l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé.
EXEMPLE 5
Matrice poreuse préparée avec le collagène natif de l'exemple 1 en association avec du chitosane et un glycosaminoglycanne comme décrit dans le brevet européen du 29 mai 1991 N° 296078.
A 600 g de gel à 1.5 % de collagène, sont ajoutés 2.5 g de chitosane dissous dans 356 ml d'eau et 1.9 ml d'acide acétique, puis une solution renfermant 1 g de chondroïtine 4 sulfate contenu dans 400 ml d'eau permutée. Le mélange dont le pH est d'environ 4.0 est ensuite agité puis lyophilisé. L' éponge obtenue est réticulée par DHT.
EXEMPLE 6
Matrice poreuse décrite dans l'exemple 1 surfacée avec un film de collagène
A - Préparation du film
Le gel de collagène dont la matière sèche est comprise entre 0.3 et 0.8 % est séché dans une étuve à 30° C ou sous hotte à raison de 0.5 g de gel/cm de plateau.
Dans le gel de collagène il est possible d'ajouter de 10 à 40 % de glycérol. Le collagène séché dans ces conditions forme un film transparent.
B - Association du film avec la matrice poreuse décrite plus haut
0.5 g de gel de collagène en matière sèche, sont disposés par cm2 dans un plateau de lyophilisation, puis le film de collagène est déposé sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé.
Le lyophilisât obtenu est réticulé par DHT. EXEMPLE 7
Matrice poreuse préparée avec un gel de collagène acido-soluble surfacée avec un film de collagène
Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué de collagène acido-soluble préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art.
EXEMPLE 8 Matrice poreuse préparée avec un gel d'atélocollagène ou surfacée avec un film de collagène
Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, la seule différence étant constituée par la nature du gel coulé sur le film qui est constitué d'atélocollagène c'est-à-dire de collagène sans telopeptide préparé selon une technique bien connue de l'homme de l'art.
EXEMPLE 9
Matrice poreuse constituée de collagène associé avec du chitosane et un glycosaminoglycanne surfacée avec un film de collagène. Le procédé est celui indiqué dans l'exemple 6, mais dans ce cas, le gel coulé sur le film du collagène est constitué de collagène, de chitosane, d'un glycosaminoglycanne. La préparation de ce gel est décrite dans l'exemple 5.
EXEMPLE 10 Toutes les matrices poreuses surfacées avec un film de collagène décrites précédemment peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 2, 3 et 4.
EXEMPLE 11 Matrice poreuse en collagène seul décrite dans l'exemple 1 surfacée avec une éponge de collagène comprimée.
A - Préparation de l'éponge comprimée
Le gel de collagène préparé comme dans l'exemple 1 et ayant une matière sèche comprise entre 0.3 et 1.5 % est lyophilisé de façon à obtenir une éponge ayant un poids compris entre 0.5 et 2 g/cm2. Le lyophilisât est comprimé pendant 5 à 60 secondes, à une température comprise entre 20 et 60° C et une pression située entre 50 et 200 bars (50 à 200.105 Pa). B - Association de l'éponge comprimée avec la matrice poreuse
Le gel de collagène décrit dans l'exemple 1 est déposé à raison de 0.5 g par cm2 dans un plateau de lyophilisation. L'éponge comprimée est alors déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Une éponge poreuse de collagène surfacée avec une éponge comprimée de collagène est ainsi obtenue. L'ensemble est réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 12
Matrice poreuse constituée de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne telle que décrite dans l'exemple 5 et surfacée avec l'éponge comprimée.
Le gel de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne, préparé selon le procédé de l'exemple 5 est déposé à raison de 0.5 g par cm dans un plateau de lyophilisation, puis l'éponge comprimée est déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisât est alors réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 13
Toutes les matrices poreuses surfacées avec une éponge de collagène comprimée décrites plus haut peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 2, 3 et 4.
EXEMPLE 14
Peaux reconstruites préparées respectivement soit à l'aide de la matrice poreuse réticulée par le DPPA décrite dans l'exemple 2, soit grâce à la matrice poreuse, réticulée par le DPPA, de l'exemple 2, surfacée par une éponge de collagène comprimée dont l'ensemble est réticulé par le DPPA, selon l'exemple 13, afin d'effectuer une comparaison entre un produit composite comprenant une couche poreuse collagénique surfacée par une membrane essentiellement compacte selon l'invention et un produit comprenant une couche poreuse collagénique seule non surfacée. 1°. Préparation des peaux reconstruites a) Culture des fibroblaste humains normaux
On utilise des fibroblastes humains normaux résultant de prélèvements effectués indifféremment sur des sujets âgés ou jeunes, que l'on récupère et que l'on développe de manière classique pour l'homme de l'art pour les récupérer entre le sixième et le dixième passage.
On réalise un ensemencement à 250 000 cellules par cm2 de matrice poreuse, respectivement soit le produit de comparaison comprenant seulement la matrice poreuse réticulée par le DPPA de l'exemple 2, soit le produit composite selon l'invention comprenant la matrice poreuse réticulée par le DPPA de l'exemple 2, surfacée par une éponge de collagène comprimée dont l'ensemble est réticulé par le DPPA, selon l'exemple 13.
Le milieu de culture est composé de DMEM/HAM F12 50/50 (v/v) additionné à 10 % en poids de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 25 μg/ml de gentamycine, 1 μg/ml d'amphotéricine B, 50 μg/ml de vitamine C.
On réalise une culture pendant trois semaines en changeant le milieu trois fois par semaine.
b) Culture de kératinocytes humains normaux On réalise ensuite la culture de kératinocytes humains normaux obtenus indifféremment sur des sujets jeunes ou âgés, que l'on récupère et cultive pour les prélever entre le premier et le troisième passage, selon les techniques de cultures bien connues de l'homme de l'art.
On réalise un ensemencement à 250 000 cellules par cm2 de surface, soit de la surface de la matrice poreuse réticulée par le DPPA de l'exemple 2 ; soit du produit composite selon l'invention comprenant la matrice poreuse réticulée par le DPPA de l'exemple 2, surfacée par une éponge de collagène comprimée dont l'ensemble est réticulé par le DPPA, selon l'exemple 13 et, dans ce cas, l'ensemencement des kératinocytes a lieu sur la surface de la membrane essentiellement compacte de collagène.
La culture de ces produits comprenant à la fois un ensemencement de fibroblastes et de kératinocytes a lieu dans un milieu de Green composé de : DMEM additionné de : 30 % HAM F12, 10 % de sérum de veau foetal,
100 Ul/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine,
1 μg/ml d'amphotéricine B,
2 μmol/ml de L-glutamine,
EGF (Epidermal Growth factor) 10 ng/ml, insuline disponible dans le commerce sous la marque UMUUfNE®
0,12 Ul/ml, hydrocortisone 400 ng/ml, toxine cholérique 10"12 mol/ml, transferrine 5 μg/ml, triodothyronine à raison de 2 10"9 M, adenine 1,8 10"7 mol/ml, vitamine C 50 μg/ml.
On réalise cette culture pendant une semaine en changeant les milieux tous les jours.
c) Culture du produit composite selon l'invention et de la couche poreuse non surfacée de comparaison
Après avoir réalisé la culture de l'étape b) pendant une semaine en changeant de milieux tous les jours, on émerge à l'interface air-liquide la couche de surface contenant les kératinocytes, alors que la couche contenant les fibroblastes reste immergée, suivi d'une culture pendant trois semaines dans du milieu d'émersion composé de :
DMEM additionné de : 10 % de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline,
100 μg/ml de streptomycine,
1 μg/ml d'amphotéricine B,
2 μmol/ml de L-glutamine, EGF 10 ng/ml, insuline de marque UMULINE® 0,12 Ul/ml, hydrocortisone 400 ng/ml, vitamine C 50 μg/ml.
Après 7 semaines de culture au total résultant des étapes a) à c), on obtient une peau reconstruite composée d'un derme reconstruit, les fibroblastes ayant colonisé la matrice tridimensionnelle collagénique, recouvert par un épiderme pluristratifié.
A l'interface dermo-épidermique, on note la présence d'une membrane basale où l'on peut mettre en évidence la présence de laminine de type I, de laminine de type 5, de collagène de type TV et de type VII par immunomarquage.
Ainsi, le surfaçage des matrices poreuses par une couche essentiellement compacte pour obtenir un produit composite selon l'invention permet d'obtenir, après trois semaines de préparation du derme équivalent, une plus grande quantité de fibroblastes en surface des matrices collagéniques avant l'épidermisation.
Dans le cas d'une matrice poreuse seule, c'est-à-dire non surfacée, si la couche superficielle de fibroblastes n'est pas complètement jointive, des kératinocytes peuvent s'infiltrer dans le derme équivalent sous-jacent et former des îlots kératinocytaires, traits caractéristiques totalement anormaux. On constate ainsi que grâce à l'invention, qui utilise des couches plus compactes que celles qui pouvaient avoir été utilisées auparavant dans l'art antérieur, on obtient une meilleure sécurité contre la pénétration des kératinocytes.
On notera dans la description que l'abréviation DMEM signifie
Dulbecco's Modified Eagle Médium.
EXEMPLE 15
Etude comparative respectivement de peaux reconstruites à partir de cellules de donneurs jeunes et de peaux reconstruites à partir de cellules de donneurs âgés, avec les produits composites selon la présente invention pour mesurer l'efficacité de principes actifs sur la production de laminines.
Dans cet exemple, on procède essentiellement comme décrit à l'exemple 14 concernant les cultures en utilisant le même produit composite selon la présente invention comprenant une couche ou matrice poreuse collagénique réticulée par le DPPA décrite dans l'exemple 2, surfacée par une éponge de collagène comprimée, dont l'ensemble est réticulé par le DPPA, selon l'exemple 13, en procédant comme suit :
Préparation des peaux reconstruites
1) On a préparé respectivement des peaux reconstruites jeunes en procédant comme décrit à l'exemple 14, si ce n'est que les cellules respectivement de fibroblastes et de kératinocytes étaient issues de donneurs jeunes, c'est-à-dire ayant un âge compris entre 25 et 35 ans, et d'autre part des peaux reconstruites âgées ou matures obtenues par l'emploi de cellules de fibroblastes ou de kératinocytes issues de donneurs âgés, dont l'âge est de plus de 55 ans.
a) Matériel et méthode
Comme indiqué à l'exemple 14, étape a, on a tout d'abord réalisé l'ensemencement de matrices poreuses du produit composite de l'invention avec des fibroblastes dermiques humains normaux issus soit de pools de cellules jeunes, soit de pools de cellules matures ou âgées, et on réalise une culture pendant 21 jours dans les conditions décrites à l'exemple 14 étape a.
b) Après les 21 jours de culture précédents, des feuillets épidermiques préparés séparément à partir des kératinocytes issus soit de pools de cellules jeunes, soit de pools de cellules matures sont ensemencés sur la surface de la membrane essentiellement compacte de collagène du produit composite.
On réalise une culture pendant 14 jours dans les conditions décrites à l'exemple 14b.
2) Quantification des laminines Après les 14 jours de cultures de l'ensemble fibroblaste-kératinocyte, les laminines contenues dans les milieux d'incubation des peaux reconstruites respectivement jeunes ou matures, ainsi obtenues sont quantifiées à l'aide d'un kit de dosage ELISA commercialement disponible (Takara, Japon). Ces résultats sont rapportés à la figure 3. La figure 3 montre que les peaux reconstruites matures contiennent environ deux fois moins de laminines que les peaux reconstruites jeunes (PRJ) servant de témoin à 100 %.
3) Mesure de l'effet inducteur d'un principe actif, tel qu'un extrait de malt fermenté commercialisé sous la marque BASALINE® par
COLETICA, sur la production de laminines dans des peaux reconstruites jeunes et matures
Dans cet essai comparatif, on procède comme décrit ci-dessus, si ce n'est que pour les 14 jours de culture avec les kératinocytes, les peaux reconstituées jeunes ou matures sont maintenues en culture pendant 14 jours soit en l'absence (contrôle), soit en présence de 0,5 % en poids d'extraits de malt fermentes commercialement disponibles sous la marque BASALINE , COLETICA, France.
A la fin de la période d'incubation, comme dans l'exemple ci-dessus, les laminines contenues dans les milieux d'incubation étaient quantifiées par dosage ELISA.
Les résultats sont rapportés à la figure 4.
La tension à 100 % est constituée par le taux de laminines dans la Peau Reconstruites Agée ou PRA.
La figure 4 montre que le principe actif extrait de malt fermenté, ou BASALINE®, était capable de stimuler la production des laminines dans des peaux reconstruites matures. Dans les mêmes conditions, le principe actif extrait de malt fermenté ou BASALINE® ne modifie pas de façon significative la production des laminines dans des peaux reconstruites jeunes, indiquée à la figure 5. On constate ainsi que le principe actif extrait de malt fermenté ou
BASALINE® augmente de 65 % la production de laminines de peaux reconstruites matures.
De même, ce principe actif n'affecte pas les processus physiologiques impliqués dans la régulation de la production de laminines de peaux reconstruites jeunes.
Ces expériences ont permis d'évaluer la magnitude de l'effet compensateur de l'extrait de malt fermenté ou BASALINE® défini comme la capacité de ce principe actif à réduire l'écart observé entre les productions de laminines de peaux constituées jeunes relativement aux peaux reconstituées matures.
La figure 5 montre que la différence entre les productions de laminines de peaux reconstituées jeunes et de peaux reconstituées matures peut être réduite de 65 % par le principe actif, utilisé à 0,5 %.
EXEMPLE 16
Préparation d'une matrice poreuse en collagène natif aquatique
Le collagène étant obtenu selon la technique du brevet US 5331092 accordé le 19 juillet 1994 A - Obtention du collagène natif aquatique
Un gel de collagène est préparé à partir de peaux ventrales de sole broyées puis lavées avec un tampon phosphate pH 7.8 dont la composition est : 0.78 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium et 21.7 g/1 de monohydrogénophosphate disodique. Le lavage s'effectue sous agitation pendant une heure à raison de 5 1 de tampon pour 1 kg de broyât. Le phosphate est ensuite éliminé par deux lavages successifs à l'eau permutée, puis par une centrifugation en continu à 4000 t/mn (décanteur Rousselet), à raison de 5 1 d'eau pour 1 kg de broyât. Le broyât est alors acidifié par une solution d'acide acétique 0.25 M à raison de 1 kg de broyât pour 10 1 de solution. Le gel est alors centrifugé à 4000 t/mn pendant 5mn.
Le gel qui sera utilisé est constitué par le surnageant obtenu dont la concentration en collagène est comprise entre 0.5 et 2 %.
B - Préparation de la matrice poreuse à partir du gel de collagène obtenu précédemment
Ce gel est coulé dans un plateau de lyophilisation à raison de 20 g/cm . Il est alors lyophilisé après congélation à -30° C et chauffage à + 32° C. La lyophilisation dure au total 16 heures sous une pression de 400 microbars.
La matrice obtenue est alors réticulée par déshydratation hydrothermique (DHT). Celle-ci consiste en un chauffage dans une étuve à 110° C sous un vide de 400 microbars pendant 16 heures.
EXEMPLE 17
Préparation d'une matrice poreuse réticulée grâce au diphénylphosphorylazide (DPPA) selon la technique décrite dans le brevet européen N° 466 829 du 24 juillet 1996
La matrice de collagène de l'exemple 16 est incubée 24 h dans une solution renfermant 5 à 250 μl de DPPA/g de collagène contenu dans 100 ml de diméthylformamide (DMF). Le collagène est ensuite débarrassé du DPPA par rinçage dans 100 ml de DMF. Le DMF est ensuite éliminé par rinçage dans 100 ml d'une solution de tampon borate pH 8.9 (tétraborate de sodium 0.04 M, acide borique 0.04 M). Le collagène est finalement incubé pour une nuit dans le même tampon borate. Enfin le tampon borate est éliminé par rinçage à l'eau permutée en continu pendant 6 h.
EXEMPLE 18
Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le carbodiimide et le N- hydroxysuccinimide
La matrice de collagène aquatique de l'exemple 16 est réticulée avec de l'EDC (Ethyldimethylaminopropyl carbodiimide) à la concentration de 0.23 à 0.69 g/g de collagène, et avec du NHS (N-hydroxysuccinimide) à la concentration de 0.42 g/g de collagène.
Après rinçage à l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé.
EXEMPLE 19 Préparation d'une matrice poreuse réticulée par le glutaraldéhyde
La matrice poreuse de collagène aquatique de l'exemple 16 est réticulée pendant 24 à 96 h dans une solution contenant 0.6 à 1 % de GTA à 20°C. Après rinçage avec l'eau permutée, le collagène est à nouveau lyophilisé.
EXEMPLE 20
Matrice poreuse préparée avec le collagène natif aquatique de l'exemple 16 en association avec du chitosane et un glycosaminoglycanne comme décrit dans le brevet européen du 29 mai 1991 N° 296078
A 600 g de gel à 1.5 % de collagène, sont ajoutés 2.5 g de chitosane dissous dans 356 ml d'eau et 1.9 ml d'acide acétique, puis une solution renfermant
1 g de chondroïtine 4 sulfate contenu dans 400 ml d'eau permutée. Le mélange dont le pH est d'environ 4.0 est ensuite agité puis lyophilisé.
L'éponge obtenue est réticulée par DHT. EXEMPLE 21
Matrice poreuse décrite dans l'exemple 16 surfacée avec un film de collagène
A - Préparation du film
Le gel de collagène dont la matière sèche est comprise entre 0.3 et 0.8 % est séché dans une étuve à 30° C ou sous hotte à raison de 0.5 g de gel/cm2 de plateau.
Dans le gel de collagène il est possible d'ajouter de 10 à 40 % de glycérol. Le collagène séché dans ces conditions forme un film transparent. -
B - Association du film avec la matrice poreuse décrite plus haut
Le gel de collagène aquatique natif de 0.5% à 2% en matière sèche, est déposé à raison de 0.5g par cm2 dans un plateau de lyophilisation, puis le film de collagène est déposé sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisât obtenu est réticulé par DHT.
EXEMPLE 22 Matrice poreuse en collagène seul décrite dans l'exemple 16 surfacée avec une éponge de collagène comprimée.
A - Préparation de l'éponge comprimée
Le gel de collagène préparé comme dans l'exemple 16 et ayant une matière sèche comprise entre 0.3 et 1.5 % est lyophilisé de façon à obtenir une éponge ayant un poids compris entre 0.5 et 2 g/cm2.
Le lyophilisât est comprimé pendant 5 à 60 secondes, à une température comprise entre 20 et 60° C et une pression située entre 50 et 200 bars (50 à 200.105 Pa).
B - Association de l'éponge comprimée avec la matrice poreuse
Le gel de collagène décrit dans l'exemple 16 est déposé à raison de 0.5 g par cm dans un plateau de lyophilisation. L'éponge comprimée est alors déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Une éponge poreuse de collagène surfacée avec une éponge comprimée de collagène est ainsi obtenue. L'ensemble est réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 16.
EXEMPLE 23 Matrice poreuse constituée de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne telle que décrite dans l'exemple 20 et surfacée avec l'éponge comprimée.
Le gel de collagène, de chitosane et de glycosaminoglycanne, préparé selon le procédé de l'exemple 20 est déposé à raison de 0.5 g par cm2 dans un plateau de lyophilisation, puis l'éponge comprimée est déposée sur ce gel et l'ensemble est lyophilisé. Le lyophilisât est alors réticulé par DHT comme décrit dans l'exemple 16.
EXEMPLE 24
Toutes les matrices poreuses surfacées avec une éponge de collagène comprimée décrites plus haut peuvent être réticulées selon les techniques décrites dans les exemples 17, 18 et 19.
EXEMPLES 25 A 27 : Essais de comparaison du métabolisme cellulaire entre les matrices collagéniques bovines et aquatiques
EXEMPLE 25 : ESSAI DE VIABILITE CELLULAIRE DE FIBROBLASTE
I - Préparation des dermes équivalents
Pour cet essai de comparaison, on fabrique d'une part une matrice poreuse aquatique réticulée au DPPA, selon l'exemple 17. A titre de comparaison, une fabrique une matrice poreuse comparative avec du collagène d'origine bovine, dite matrice bovine, également réticulée au DPPA, dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 17.
On prend des fibroblastes humains normaux issus d'un pool de donneurs jeunes utilisé au 7eme passage et que l'on ensemence dans chacune des matrices aquatique et bovine, à raison de 250 000 cellules par cm2 dans le cas de l'étude de prolifération et de synthèse protéique, et que l'on ensemence à raison de 300 000 cellules par cm pour les matrices aquatique et bovine destinées aux études d'histologie.
On effectue la culture de ces matrices respectivement aquatique et bovine dans du milieu composé de DMEM/HAM F 12 dans un rapport 50/50 (v/v) additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 25 μg/ml de gentamycine, 1 μg/ml d'amphotéricine B, 50 μg/ml de vitamine C.
On réalise cette culture pendant 1 mois en changeant le milieu de culture 3 fois par semaine.
II - Analyses réalisées
1) Mesure de la viabilité cellulaire par réaction au MTT
On ajoute 1 % en poids de MTT (c'est-à-dire le 3-(4-(diméthylthiazol- 2-yl)2,5-diphényltétrazolium bromure) dans le milieu de culture. On réalise une incubation pendant 2,5 heures à 37°C.
Après incubation pendant cette durée, la densité optique du produit de transformation (bleu formazan) est lue à 550 nm après soiubilisation dans le DMSO.
La densité optique obtenue est proportionnelle à l'activité des succinate-déshydrogénases qui sont capables d'effectuer la transformation du sel de tétrazolium MTT jaune clair en cristaux bleus de formazan.
La viabilité cellulaire a été réalisée après 1, 5, 7, 22 jours et un mois de culture.
Pour déterminer les valeurs moyennes, on a réalisé 6 échantillons pour chaque matrice.
TABLEAU I DE RESULTATS
Figure imgf000028_0001
Ces résultats font également l'objet des courbes de la figure 6 annexée.
On notera que la courbe avec les losanges est celle obtenue avec la matrice aquatique et la courbe avec les carrés est celle obtenue avec la matrice bovine. On observe à partir des résultats que de manière totalement suφrenante, la matrice aquatique non seulement constitue un support permettant la survie de fibroblastes humains normaux mais aussi la prolifération cellulaire de ces fibroblastes humains normaux, tout en constituant même un support de culture bien meilleur pendant les trois premières semaines.
Il peut donc être conclu de ces essais que le collagène aquatique est, de manière suφrenante, particulièrement adapté pour réaliser un support d'ingénierie tissulaire en particulier pour des applications in vitro et même et surtout in vivo pour constituer des biomatériaux contenant des cellules vivantes et en particulier et de préférence des cellules vivantes d'êtres humains.
2 Mesure des synthèses protéiques
La synthèse des protéines sécrétées pendant 3 jours dans un milieu de culture sans sérum de veau foetal a été évaluée après un mois de maturation des dermes équivalents, tels qu'obtenus après le mois de culture dans les conditions rapportées ci-dessus dans la préparation des dermes équivalents.
Le dosage est réalisé par la méthode du microBCA de Pierce. Parallèlement, la densité cellulaire a été évaluée par un test au MTT dans les conditions décrites ci-dessus. La teneur en protéines relative correspond à la teneur protéique ramenée à 1 unité de densité cellulaire exprimée en densité optique ou DO, afin de raisonner à concentration cellulaire équivalente. Les résultats obtenus sont répertoriés au tableau II ci-après :
TABLEAU π RESULTATS DE SYNTHESE PROTEIQUE
Figure imgf000029_0001
* : Déviation standard moyenne Comme pour le tableau I, la moyenne résulte d'une moyenne réalisée sur 6 échantillons.
3) Histologie Les dermes équivalents obtenus après culture pendant 21 jours de culture à partir des matrices en collagène aquatique et bovin sont fixés dans une solution à 2 % en paraformaldéhyde puis post-fixes dans une solution de tétroxide d'osmium, déshydratés, inclus en Epon, coupés et observés en microscopie électronique à transmission (Jeol 1200) au CMEABG (Lyon, France).
Conclusions
Ces résultats indique une très bonne colonisation des matrices tridimensionnelles qu'elles soient aquatiques ou bovines. Après trois semaines de culture, la densité cellulaire est équivalente dans les deux types de matrices. Toutefois, il semble que la matrice aquatique permette une meilleure adhésion cellulaire en début d'expérimentation comme l'indique l'étude de prolifération lors de la première semaine de culture et ainsi une meilleure colonisation pour des temps courts de culture.
En ce qui concerne les synthèses protéiques, après un mois de culture les capacités de synthèse des fibroblastes (teneur en protéines relative) sont également équivalentes.
Ces résultats indiquent que les matrices de collagène aquatique mises au point ont permis la préparation de dermes équivalents de bonne qualité ; les résultats obtenus avec ces matrices étant comparables à ceux obtenus avec des matrices de collagène bovin.
En microscopie électronique à transmission, les fibroblastes ont pu être observés dans les matrices d'origine bovine et aquatique. Dans les deux types de matrices, on note la présence d'une abondante matrice extracellulaire néosynthétisée. On peut différencier la matrice extracellulaire néosynthétisée grâce à la striation périodique des fibres de collagène déposé comparativement aux amas collagéniques formant la matrice tridimensionnelle de l'éponge de départ. EXEMPLE 26
Influence des différents types de réticulation des matrices collagéniques aquatiques sur la viabilité cellulaire
Pour étudier l'influence des différents types de réticulation des matrices collagéniques aquatiques sur la viabilité cellulaire, on procède aux essais suivants :
I) Préparation des dermes équivalents a) Support ou matrice utilisé On prépare divers supports ou matrices de collagène en utilisant diverses proportions de collagène dans le gel de collagène servant à fabriquer la couche ou matrice poreuse et en utilisant éventuellement un agent de réticulation différent, comme suit :
1) Essai 1 Pour cet essai, on fabrique une matrice poreuse sous forme d'épongé poreuse à partir d'un gel de collagène aquatique préparé à partir de 1,3 % en poids en collagène aquatique, que l'on congèle à -80°C et que l'on soumet à une lyophilisation standard conforme à l'exemple 17 et que l'on soumet ensuite à une réticulation au DPPA à une proportion de 250 μl/g d'épongé à l'état sec.
2) Essai 2
Pour cet essai, on prépare un support poreux sous forme d'épongé aquatique à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 0,7 % en poids de collagène aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80°C, puis à une lyophilisation standard et une réticulation au DPPA à 250 μl/g sec comme dans l'essai 1.
3) Essai 3
Pour cet essai, on procède comme pour l'essai 1, si ce n'est que la réticulation a lieu avec l'EDC, selon l'exemple 18, à une proportion de 0,46 g/g d'épongé sèche.
4) Essai 4
On prépare un support poreux comprenant une éponge de collagène aquatique obtenu à partir d'un gel de collagène aquatique comprenant 1,1 % en poids de collagène aquatique, que l'on soumet à une congélation à -80°C, puis à une lyophilisation standard et à une réticulation au DPPA à 250 μl/g sec comme dans l'essai 2, la différence résidant dans une proportion de 1,1 % en poids de collagène aquatique.
Dans l'ensemble de ces essais, le collagène aquatique est issu, comme dans l'exemple 17, de la peau ventrale de sole.
b Culture des fibroblastes sur ces matrices
On utilise, comme dans l'exemple 25, des fibroblastes humains normaux mais qui sont prélevés au 8eme passage. On réalise un ensemencement à raison de 275 000 cellules par cm .
Le milieu culture est composé de DMEM/HAM F12 50/50 (v/v) additionné de 10 % en poids de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 25 μg/ml de gentamycine, 1 μg/ml d'amphotéricine B, 50 μg/ml de vitamine C.
On réalise la culture pendant 1 mois en changeant de milieu 3 fois par semaine.
Pour chaque essai, on utilise 4 matrices afin d'effectuer une moyenne pour chaque type d'essai et mesurer la déviation standard moyenne.
II) Analyses réalisées Mesure de la viabilité cellulaire par réaction à l'Alamar Blue (marqueur d'oxydoréduction)
L'Alamar Blue est ajouté à raison de 2 % en poids d'un milieu de culture utilisé, au moment où l'on souhaite mesurer la viabilité cellulaire sur un prélèvement réalisé sur le milieu culture. • Après incubation à 2 h 20 à 37°C, on lit la fluorescence, sur la base d'une excitation à 530 nm et une émission à 590 nm).
L'intensité de la fluorescence obtenue est proportionnelle à l'activité métabolique des cellules.
On effectue la mesure de la viabilité cellulaire sur 10 échantillons après 1, 4 6, 11 17 jours de culture.
Les résultats sont exprimés au tableau m ci-après.
Les résultats sont indiqués en unité internationale de fluorescence en fonction du temps. TABLEAU UI VIABILITE CELLULAIRE (u I fluorescence^)
Figure imgf000033_0001
* : Déviation standard
Les résultats du tableau UI font aussi l'objet de la figure 7 annexée. Ils montrent les courbes de prolifération fibrobiastique en derme équivalent. La courbe en losange plein est celle réalisée avec l'essai 1 ; la courbe en carré plein est celle réalisée avec l'essai 2 ; la courbe en triangle est celle réalisée avec l'essai 3 et la courbe avec les croix est celle réalisée avec l'essai 4.
Le temps est exprimé en jour en abscisse et la fluorescence en UI avec une échelle démarrant à 15 000 et augmentant par unité de 10 000 jusqu'à 55 000. Les résultats permettent d'aboutir aux conclusions suivants.
Conclusions
Les résultats indiquent les différentes matrices préparées peuvent permettre une bonne croissance fibrobiastique après 17 jours de culture. Quelle que soit la préparation des matrices collagéniques aquatiques, les fibroblastes adhèrent bien à leur support tridimensionnel et se divisent très rapidement afin de coloniser la matrice.
Le profil de prolifération est très légèrement variable d'un type de matrice à l'autre mais après 17 jours de culture, la densité fibrobiastique est comparable quel que soit le procédé de fabrication.
Les différents types de réticulation employés réalisés soit avec le DPPA ou avec l'EDC ne semblent pas influencer le renouvellement cellulaire. Après pratiquement 3 semaines de culture, la stabilité des matrices est excellente, à savoir peu de digestion, peu de contraction. '
EXEMPLE 27 :
Essai démontrant les avantages du collagène aquatique pour la mise en évidence et le dosage du collagène humain néosynthétisé
Cet essai est similaire à celui de l'exemple 25, si ce n'est que l'on effectue une histologie avec immuno-marquage.
L'essai a lieu de la manière suivante :
1) Préparation des dermes équivalents
Il s'agit de dermes équivalents de l'exemple 25, la culture étant réalisée dans les conditions de l'exemple 25.
Cette culture est donc effectuée pendant trois semaines en changeant le milieu trois fois par semaine, l'ensemencement des fibroblastes humains normaux ayant eu lieu à 300.000 cellules par cm2 comme cela était indiqué dans l'exemple 25.
2) Histologie a) Histologie classique
On réalise la fixation avec le paraformaldéhyde à une teneur de 4 % en poids , on réalise ensuite une déshydratation et une inclusion en paraffine.
On effectue ensuite des coupes à 7 μm et une coloration Mallory
Haidenhain après déparaffmage et réhydratation.
b) Immunomarquage
On fixe également avec le paraformaldéhyde à 4 % en poids, on réalise une inclusion en Tissue Tek OCT compound, c'est-à-dire un liquide d'inclusion fourni par Miles, Elkhart, Indiana, USA, et une coupe à froid à 7 μm. L'immunomarquage est effectué de la manière suivante : i. Avec un premier anticoφs anti-collagène de type I humain de lapin (dilution
1/40) ii. Un deuxième anticoφs anti-lapin conjugué FITC (Fluorescéine Iso
ThioCyanate) (dilution 1/160)
Contre coloration avec DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dilactate). 3) Résultats
On constate que les support constitués respectivement par une matrice aquatique et une matrice bovine forment des pores plus ou moins lâches dans lesquels viennent adhérer les fibroblastes. En surface, on note une proportion plus importante de fibroblastes formant un surfaçage favorable du derme équivalent pour la réalisation d'une peau reconstruite. La répartition des fibroblastes est homogène dans les éponges aquatique et bovine.
En immunomarquage, on constate que la matrice formée de collagène bovin est marquée par l'anticoφs anti-coUagène de type I humain (croisement).
Par contre, la matrice d'origine aquatique n'est que très faiblement marquée par l'anticoφs anti-collagène humain.
L'utilisation des éponges composées de collagène aquatique est donc favorable à la mise en évidence de la matrice extracellulaire néosynthétisée. Ces résultats s'expliquent par les travaux du Professeur Hartmann sur les réactions des différents antigènes par rapport aux différents anticoφs déterminés par les mesures des densités optiques après immunomarquage données au tableau TV dit de Hartmann ci-après :
TABLEAU TV Réaction croisée humain, bovin, poisson (test Elisa
Figure imgf000036_0001
(> : densité optique supérieure à 2000)
Les résultats sont exprimés en D.O. x 103 (densité optique à λ = 450 nm) Légendes : 20111 (225) : anti-collagène I humain
50121 (03) : anti-collagène I bovin
50171 (01) : anti-collagène I poisson (sole)
De ce tableau de résultats, il ressort que quel que soit l'anticoφs (anti- collagène type I humain, anti-collagène type I bovin, anti-collagène type I de sole), en immunomarquage, la différence est beaucoup plus importante entre le collagène humain et le collagène de sole qu'entre le collagène humain et le collagène bovin. Il en résulte que dans une matrice de collagène de poisson, le collagène synthétisé par les fibroblastes humains pourra être mis en évidence beaucoup plus aisément. Ceci confirme les résultats décrits précédemment obtenus par un immunomarquage par l'anticoφs anti-collagène de type I humain du collagène synthétisé dans la matrice de collagène de poisson, ce qui constitue un résultat particulièrement inattendu et avantageux de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Produit composite formant un support collagénique comprenant au moins une couche poreuse collagénique revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique réalisée soit par un film collagénique préparé par séchage, de préférence à l'air ou dans un fluide gazeux, d'un gel de collagène, soit par une éponge collagénique très fortement comprimée.
2. Produit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit collagénique précité est choisi parmi du collagène et un mélange de collagène avec un polysaccharide, en particulier un glycosaminoglycanne, chitosane, et les dérivés du chitosane, la cellulose et les dérivés de la cellulose, le dextrane et ses dérivés, un alginate, un dérivé d'un alginate, un carraghénane.
3. Produit selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins une des deux couches, respectivement la couche poreuse et la membrane essentiellement compacte, comprend des cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes, en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés.
4. Produit selon la revendication 3, caractérisant à ce que les cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, cellules de langerhans d'origine sanguine, cellules endotéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, adipocytes, sébocytes, chondrocytes, cellules osseuses, des chondrocytes, des ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, normales ou génétiquement modifiées ou malignes.
5. Produit selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il contient des fibroblastes normaux génétiquement modifiés ou malins dans la couche poreuse et des cellules vivantes normales ou génétiquement modifiées ou malignes, à la surface de la membrane compacte en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses.
6. Produit selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la compression de l'éponge collagénique comprimée est réalisée à une pression au minimum égale à environ 50 bars, équivalent à environ 50.105 Pa, de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa), éventuellement cette compression ayant lieu à une température comprise entre 20 et 80 degré C°, encore mieux entre 40 C° et 60 C°.
7. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la membrane essentiellement compacte est préparée préalablement à la combinaison avec la couche poreuse, de préférence comprenant une éponge collagénique, en particulier en préparant la membrane et en la déposant sur un gel collagénique avant que l'ensemble ne soit congelé et lyophilisé pour obtenir ledit produit composite.
8. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en que l'éponge collagénique est/ou le film collagénique est/ou la membrane collagénique, comprend du collagène d'origine mammifère, en particulier d'origine bovine.
9. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'éponge collagénique et/ou le film collagénique et/ou la membrane collagénique, comprend du collagène d'origine marine, de préférence issu de peaux de poissons de la famille des téléostéens, plus particulièrement des poissons présentant des zones de peaux dépigmentées, encore mieux des poissons plats qui sont péchés de façon industrielle comme par exemple la sole, la limande, le turbo, le barbue, de préférence la sole.
10. Produit selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins l'une des deux couches est réalisée à partir d'un gel collagénique contenant un mélange de collagène soluble et de collagène insoluble, par exemple sous forme de fibres.
11. Produit selon la revendication 7 à 9, caractérisé en ce que le collagène est du collagène de type I et/ou de type III.
12. Procédé de fabrication d'un produit composite comprenant au moins une couche poreuse collagénique revêtue sur au moins une face d'une membrane essentiellement compacte collagénique, caractérisé en ce que : a) on prépare tout d'abord la membrane essentiellement compacte collagénique, soit par séchage d'un premier gel collagénique, de préférence par séchage à l'air ou à l'aide d'un fluide gazeux, soit par compression d'une éponge collagénique obtenue par congélation- lyophilisation d'un gel collagénique ; b) on prépare séparément un deuxième gel collagénique ; c) soit on dépose la membrane essentiellement compacte sur le deuxième gel collagénique, soit on verse le deuxième gel collagénique sur la membrane essentiellement compacte ; et d) on procède enfin à une congélation-lyophilisation de l'ensemble pour obtenir ledit produit composite.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on réalise une compression de l'éponge collagénique servant à préparer la membrane compacte à une pression au moins égale à 50 bars (50.105 Pa), de préférence comprise entre 50 bars (50.105 Pa) et 200 bars (200.105 Pa).
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de compression a lieu à une température comprise entre 20 et 80°C, encore de préférence entre 40°C et 60°C.
15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'on utilise pour la préparation de l'éponge collagénique et/ou du film collagénique et/ou de la membrane collagénique, soit du collagène, soit un mélange de collagène avec un polysaccharide, en particulier un glycosaminoglycanne, le chitosane, les dérivés du chitosane, la cellulose et les dérivés de la cellulose, le dextrane et ses dérivés, un alginate, un dérivé d'un alginate, un carraghénane.
16. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'on utilise du collagène d'origine mammifère, en particulier d'origine bovine.
17. Procédé selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que l'éponge collagénique et/ou le film collagénique et/ou la membrane collagénique, comprend du collagène d'origine marine, de préférence issu de peaux de poissons de la famille des téléostéens, plus particulièrement des poissons présentant des zones de peaux dépigmentées, encore mieux des poissons plats qui sont péchés de façon industrielle comme par exemple la sole, la limande, le turbo, le barbue, de préférence la sole.
18. Procédé selon l'une des revendications 12 à 17, caractérisé en ce qu'on réalise une réticulation d'au moins l'une des deux couches ou des deux.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que la réticulation est une réticulation physique, en particulier une déshydratation thermique à chaud sous vide ou DHT, ou une réticulation chimique, en particulier au diphénylphosphorylazide ou DPPA, avec une aldéhyde telle que glutaraldéhyde, au carbodiimide et/ou succinimide.
20. Procédé selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisé en ce qu'on ajoute lors de la fabrication un composé favorisant le développement cellulaire, en particulier un facteur de croissance, en particulier une cytokine, une chémiokine.
21. Procédé selon l'une des revendications 12 à 20, caractérisé en ce qu'on prévoit une étape d'introduction de cellules vivantes, normales ou modifiées génétiquement, ou malignes dans au moins une des deux couches, en particulier provenant de sujets jeunes ou âgés.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites cellules vivantes sont choisies parmi le groupe consistant de fibroblastes, kératinocytes, mélanocytes, cellules de - langerhans d'origine sanguine, cellules endothéliales d'origine sanguine, cellules sanguines, en particulier macrophages ou lymphocytes, des chondrocytes, cellules osseuses en particulier ostéoblastes, cellules de Merkel d'origine sanguine, des sébocytes, des adipocytes, des cellules nerveuses.
23. Procédé selon l'une des revendications 12 à 22, caractérisé en ce qu'on introduit des fibroblastes dans la couche poreuse.
24. Procédé selon l'une des revendications 12 à 23, caractérisé en ce qu'on dépose des cellules vivantes à la surface de la membrane compacte, en particulier choisies parmi des kératinocytes, des mélanocytes, des cellules de Merkel d'origine sanguine, des cellules de langerhans d'origine sanguine, des sébocytes, des cellules d'origine sanguine, des cellules nerveuses.
25. Procédé selon l'une des revendications 12 à 24, caractérisé en ce que les cellules vivantes sont apportées soit par culture séquentielle, soit par culture concomitante entre les différents types de cellules, ces cellules provenant de culture ou de biopsie.
26. Utilisation du produit composite formant un support collagénique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11, ou tel qu'obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 25 pour la fabrication de peaux artificielles destinées notamment à réaliser des essais in vitro d'efficacité de substance potentiellement active, ou à reconstruire in vivo des zones de peau endommagées.
27. Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que les peaux artificielles sont obtenues soit sensiblement exclusivement à partir de cellules jeunes, soit sensiblement exclusivement à partir de cellules âgées, en particulier pour étudier le processus de vieillissement tissulaire et en particulier cutané et éventuellement tester l'efficacité de principes actifs sur ce processus.
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