CH687153A5 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung einer Zellstruktur auf einer semipermeablen Membran. - Google Patents
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Description
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Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Zellstruktur auf einer semipermeablen Membran gemäss dem Oberbegriff der Patentansprüche 1 und 8.
In der Gewebetechnologie sind Verfahren und entsprechende Vorrichtungen gefragt, welche über die Züchtung von Keratinozyten zu einer rasch wachsenden Gewebestruktur führen. Solche Gewebestrukturen finden Anwendung in der Transplantationstechnologie auf Verbrennungsstationen in Spitälern.
Nach der PS-EP 155 237 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und Mikroorganismen beschrieben. Dabei wird von einer Zellzuchtkammer, einer Mediumkammer und einer Produktkammer ausgegangen, wobei diese drei Kammern gegeneinander über je eine Membran verbunden sind. Die Zellen innerhalb der Zellzuchtkammer werden an Trägern aus netzartigen Geweben immobilisiert, wobei diese Träger die Membranen mechanisch unterstützen und die rahmenartigen Ränder dieser Träger als Dichtung und gleichzeitig als Distanzkörper dienen. Die Mediumkammer wird von einer mit Sauerstoff angereicherten Nährlösung kontinuierlich durchströmt, während das Produkt aus der Zellzuchtkammer nur diskontinuierlich abgezogen wird. Nachteilig bei diesem Verfahren ist die Tatsache, dass das Zellwachstum in einer nicht-organisierten Art und Weise erfolgt, wobei ein Schichtwachstum nicht erwartet werden kann. Das Zellmaterial ist nicht homogen verteilt, was zu Verstopfungen führt und besonders störend wirkt. Ebenfalls nachteilig erweist sich die ungenügende Sauerstoffversorgung, da diese nur durch die Nährlösung erfolgen kann. Zudem ist keine visuelle Überwachungsmöglichkeit des Inokluierungs-vorganges und des Zellwachstums möglich. Die erforderliche Dichtheit über den Träger der Membranen ist nur sehr schwierig zu erzielen. Ein weiterer Nachteil ist die Sterilisierbarkeit des ganzen Systems, da zuviel thermische Energie über die Stahlteile der Vorrichtung abgeführt werden. Zudem lassen sich die kultivierten Zellen im Sinne der vorliegenden Erfindung kaum weiterverwenden. Im weiteren ist in ein Membranreaktor zur Kultivierung von Pflanzenzellen beschrieben worden (Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451). Dieser Reaktor besteht im wesentlichen aus einem 2-Kammersystem, einer Zellwachstumskammer und einer Mediumkammer, wobei die Zellwachstumskammer von einer Gasphase, die Mediumkammer von einer Nährlösung durchströmt wird. Beide Kammern werden durch eine semipermeablen Membran getrennt, welche die Nährlösung in die Zellwachstumskammer gelangen lässt und gleichzeitig als Träger einer immobilisierten Zellschicht dient. Die Zellen dieser Zellschicht nehmen Sauerstoff auf, sowohl aus dem Nährmedium, als auch aus der über der Zellschicht befindlichen Gasphase. Ober die Gasphase und über die Nährlösung können andererseits Stoffwechselprodukte eliminiert werden. Nachteilig ist dabei, dass sich die Zellen aus dem Reaktor für die Weiterverwendung nicht entnehmen lassen und dass die Membran starr ist und sich nicht bewegen lässt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung vorzuschlagen, womit die Herstellung von humanen, wachstumsfähigen Zellschichten in einem 2-Kammersystem als Zellstruktur erzielt werden kann, und diese auf einer semipermeablen Membran zur Transplantation bereitgehalten werden.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe mit einem Verfahren gemäss dem Wortlaut des Patentanspruches 1 und einer Vorrichtung gemäss dem Wortlaut des Patentanspruches 8 gelöst. Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Flussdiagramm zur Darstellung des Verfahrens
Fig. 2 Ausführungsbeispiel für einen Membranreaktor mit Transportmitteln im Schnitt
Fig. 3 Ausführungsbeispiel für einen Transportbehälter im Schnitt.
Fig. 1 zeigt das Flussdiagramm des erfindungs-gemässen Verfahrens (Schritte I—IV) in schemati-scher Darstellung. Ausgangspunkt ist ein Membranreaktor 10, wie er etwa in Biotechnol. Prog. 1990 (6), 447-451, zur Kultivierung von Pflanzenzellen beschrieben wurde (I). Im wesentlichen besteht dieser aus einer Zellwachstumskammer 1 und einer Mediumkammer 2 und einer semipermeablen Membran M1, welche die Nährlösung in die Zellwachstumskammer gelangen lässt. Der Membranreaktor ist an eine Versorgungs- und Kontrolleinheit angeschlossen, auf die hier nicht weiter eingegangen wird. Die semipermeable Membran M1 wird nun in einem weiteren Schritt (II) mit menschlichen, wachstumsfähigen Zellen BC (Basalzellen), z.B. nach dem «Rheinwald und Green»-Verfahren (Rheinwald J. G., Green H., Cell 6, 331-344 (1975)) inokuliert. Die Zellen BC werden im weiteren kurz als Zellmaterial bezeichnet, welches nach einer bestimmten Zeit eine konfluente Zellschicht bildet. Das Zellmaterial stammt im allgemeinen vom Gewebe eines zukünftigen Transplantatempfängers. Es handelt sich also um ein autologes Transplantat. Wird der Membranreaktor nun weiter betrieben, so bilden sich weitere Schichten auf der ersten Zellschicht, wobei sich nach Tagen eine Zellstruktur ML gebildet hat, welche eine Mehrschichtstruktur, eine sogenannte Multilayer darstellt. Als Membranmaterial finden dabei alle hydrophilen oder hydrophilisier-ten semipermeablen Membranen Anwendung. Dabei befinden sich die jüngsten Zellen in der untersten, an die semipermeable Membran angrenzenden Schicht 4, und die ältesten Zellen in der obersten Schicht 6. Je nach weiterer Verwendung kann die Dicke der Zellschicht durch eine Anpassung der Bedingungen, insbesondere der Wachstumszeit, in weiten Bereichen gewählt werden. Auf die entstandene Zellstruktur ML, bzw. Multilayer, mit der semipermeablen Membran M1 wird nun in einem Schritt (III) eine zweite semipermeable Membran M2 auf der M1 gegenüberliegenden Seite angebracht und anschliessend die erste semi-
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permeable Membran M1 entfernt. Dadurch ist nun eine Zellstruktur ML mit semipermeabler Membran M2 entstanden, bei welcher die Schicht 6 der ältesten Zellen auf der semipermeabler Membran M2 anliegen und die Basalzellen BC nach aussen sehen (IV). Diese Zellstruktur kann dann steril auf das Wundbett WB1 gebracht werden (V). Auf diese Weise wird die Schicht mit den jüngsten Zellen (Basalzellen) der entstandenen Zellstruktur ML mit dem Wundbett in Kontakt gebracht, was sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat. Die Orientierung der Zellschicht entspricht dabei derjenigen der Haut.
Eine Alternative zu diesem Vorgehen bildet der Schritt (VI), bei welchem die semipermeable Membran MI mit der entstandenen Zellstruktur ML aus dem Membranreaktor entfernt wird, und unter sterilen Bedingungen direkt auf das Wundbett WB2 gebracht wird. Die Zellstruktur kann u.U. sehr dünn sein, im Grenzfall lediglich aus einer Schicht bestehen, sodass die ältesten Zellen gleichzeitig auch die jüngsten sind. Die Zellschichtorientierung ist in diesem Fall noch nicht ausgebildet.
Das beschriebene Verfahren weist einige wichtige Vorteile auf: Die semipermeable Membran kann praktisch beliebig gross gewählt werden und eine beliebige Geometrie aufweisen, was mit bisherigen Laborverfahren nicht möglich war. Dies ist im Fall von grossflächigen Verbrennungen von besonderem Interesse. Das Verfahren ist einfach zu handhaben: Die semipermeable Membran mit der darauf gewachsenen Zellstruktur kann als Bestandteil eines Transportbehälters ausgebildet werden. Dadurch werden die notwendigen Manipulationen auf ein Minimum beschränkt, was sich aus der Sicht einer sterilen, möglichst einfachen Handhabung sehr vorteilhaft erweist. Die Bedingungen können je nach Wachstumsphase und je nach vorgegebener Zielsetzung für das geplante Transplantationsvorhaben kontinuierlich angepasst und optimal gestaltet werden, z.B. durch die Zusammensetzung des Nährmediums oder der Gasphase. Die Zellschicht, bzw. die Zellschichten, werden von unten mit gelösten Nährstoffen versorgt und sind von oben in Kontakt mit Luft, was dem natürlichen Hautbildungsvorgang entspricht.
Das Verfahren eignet sich besonders im Hinblick auf das Gebiet der Gewebetransplantation, d.h. bei der Herstellung von humanen Geweben, insbesondere Keratinozyten, bei der Erzeugung einer Epidermis, wobei sich das Verfahren überraschenderweise durch einen viel geringeren Arbeitaufwand auszeichnet als dies mit bisherigen bekannten Verfahren der Fall ist.
Zur Erzielung eines raschen Wachstums können die Feeder-Zellen, d.h. die Zellen, welche die Wachstumsfaktoren enthalten und/oder die Botenstoffe (signal substances, proteins, peptides) der Nährlösung zugegeben werden und in Zirkulation belassen werden, ohne dass sie direkten Kontakt zu den Keratinozyten aufweisen. Zudem hat sich als besonders wirkungsvoll erwiesen, die semipermeable Membran gewissen Deformationen zu unterwerfen und dadurch die sich bildenden Zellschichten einem bestimmten mechanischen Stress auszusetzen. Dies kann beispielsweise durch die
Erzielung von Druckunterschieden erfolgen, indem die Druckverhältnisse in der Mediumkammer und/ oder in der Zellwachstumskammer periodisch geändert werden. Dabei können die Amplitude und die Frequenz der Pulsationen einzeln oder in Kombination geändert werden.
Zur Kontrolle des Zellwachstums wird ein Fenster im Membranreaktor vorgesehen, durch welches die Zellen laufend mit einem Video-System, beispielsweise mit einem Video-Mikroskop, überwacht werden können. Das Mikroskop wird vorteilhafterweise über einen Computer gesteuert, was unter Venwendung einer Software zur Bildanalyse eine Kontrolle über die verschiedenen Wachstumsstadien ermöglicht. Damit lassen sich die bisher üblichen Resultate bezüglich der gewünschten Qualität und Verfügbarkeit erheblich steigern.
Die in Fig. 1 beschriebene Ausführungsform geht von einer Mediumkammer, einer Zellwachstumskammer und einer semipermeablen Membran aus. Selbstverständlich kann dieses System beliebig erweitert werden, so z.B. durch die Verwendung eines Membranreaktors mit zwei oder mehr semipermeablen Membranen. Der entsprechende Transportbehälter umfasst dann mehrere Kompartimente, in welchen sich je eine Zellstruktur unter sterilen Bedingungen befindet.
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel für einen Membranreaktor mit Transportmitteln im Schnitt. Der Membranreaktor besteht aus einer Bodenplatte 1 und aus einer Deckplatte 2, welche mit der Bodenplatte dicht verbunden werden kann. Die Bodenplatte 1 weist an deren Unterseite Öffnungen für den Zulauf 3 und den Ablauf 4 der Nährlösung, welche innerhalb des Membranreaktors durch die Nährlösungskanäle 5 geführt wird. Die Deckplatte 2 weist die Öffnungen für die Zuführung 6 und die Abführung 7 der Gasphase auf. Auf der Oberseite der Deckplatte befindet sich ein Sichtfenster 8 und eine Inokulierungseinrichtung 9 mit dem Deckel 10. Im Innern des Membranreaktors befindet sich eine semipermeable Membran 11, welche ab einer Vorratsrolle 12 über die Nährlösungskanäle 5 geführt wird und durch die Öffnung 13 abgezogen werden kann. Die Transportrollenpaare 14, 14' und 15, 15' sind so angeordnet, dass damit die semipermeable Membran 11 sowohl an der richtigen Stelle über die Nährlösungskanäle 5 geführt werden, als auch dass die Membran durch die Öffnung 13 aus dem Membranreaktor gefahren werden kann. Die Transportrollenpaare 14, 14' und 15, 15' laufen paarweise im wesentlichen synchron, wodurch ein schonungvoller Transport der semipermeablen Membran mit der darauf gewachsenen Zellstruktur gewährleistet ist. Auf der semipermeablen Membran 11 findet nach dem Inokulierungsvorgang das Zellwachstum statt, wobei unter sterilen Bedingungen eine Zellstruktur 16 entsteht. Nachdem der Zellwachstumsprozess abgeschlossen ist, wird die Zellstruktur 16 auf der semipermeablen Membran 11 mittels den Transportrollen aus dem Membranreaktor entfernt, wo er-stere für eine Weiterverwendung, beispielsweise für eine Transplantation, zur Verfügung steht. Der Membranreaktor wird vorzugsweise aus eloxiertem Aluminium oder aus rostfreiem Stahl gefertigt. Er
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kann aber auch aus einem sterilisierbaren Kunststoff, wie etwa aus einem Polysulfon, gefertigt werden. Die Herstellung einer Zellstruktur kann so auf einfache Weise nicht nur durchgeführt, sondern auch wiederholt werden. Sobald eine erste Zellstruktur aus dem Membranreaktor ausgeführt worden ist, liegt gleichzeitig bereits für die nachfolgende Inokulation das neue Stück der semipermeablen Membran wieder auf den Nährlösungskanälen.
Die Verwendung der hier beschriebenen Transportrollenpaare 14, 14' und 15, 15' zum Transport der semipermeablen Membran stellt nur eine von vielen Möglichkeiten dar. So kann beispielsweise ein Antriebssystem verwendet werden, welches aus einem Rollensystem besteht und, ähnlich wie ein Förderband, mit einem feinen, engmaschigen Kunststoffgewebe umgeben ist. Dabei wird letztere über die Rollen so geführt, dass eine leichte Spannung im Kunststoffgewebe erhalten bleibt. Das Kunststoffgewebe wird direkt über die Nährlösungskanäle geführt. Über dem Kunststoffgewebe befindet sich dann die semipermeable Membran, welche nun durch das engmaschige Kunststoffgewebe mit der Nährlösung versorgt wird. Eine weitere Möglichkeit zum Transport der semipermeablen Membran besteht darin, dass diese an den Ränder mit einem Lochraster versehen wird, wie dies bei einem Printerpapier üblich ist. Die Nocken einer Antriebswalze greifen in diesen Lochraster und sorgen für die Fortbewegung. Die Antriebswalzen werden dann zweckmässigerweise mit einem Zahnriemen verbunden, um den Gleichlauf zu garantieren. Wichtig ist bei allen möglichen Antriebsarten, dass sie problemlos sterilisierbar sein müssen, was die Wahl der eingesetzten Materialien beeinflusst.
Fig. 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel für einen Transportbehälter im Schnitt. Der Membranreaktor 20 entspricht demjenigen in Fig. 2. Über die Öffnung 13 wird die semipermeable Membran 11 in den Transportbehälter 30 geführt. Dieser ist über die O-Ring-Dichtungen 21, 21' und die Haltevorrichtungen 22, 22' mit dem Membranreaktor 20 fest verbunden. Das Transportrollenpaar 23, 23' läuft mit den Transportrollenpaaren des Membranreaktors 20 synchron, sodass die Membran beim Transfer in den Transportbehälter mechanisch nicht überbeansprucht wird. Mittels einer Trennvorrichtung 24, die hier nicht näher beschrieben wird, wird nach dem Transport der semipermeablen Membran 11, welche nun die Zellstruktur enthält, die semipermeable Membran unter sterilen Bedingungen getrennt und mittels einer Schliessvorrichtung, welche hier ebenfalls nicht näher beschrieben wird, wird der Transportbehälter verschlossen. Nach Öffnen der Haltevorrichtungen 22, 22' wird der Transportbehälter 30 vom Membranreaktor 20 entfernt und steht damit steril für ein Transplantationsvorhaben bereit.
Erfindungswesentlich ist, dass mit dem beschriebenen Verfahren eine grossflächige Zellstruktur mit beliebiger Geometrie in einem Membranreaktor unter kontrolliertem Zellwachstum auf einer semipermeablen Membran hergestellt werden kann, und diese Zellstruktur unter sterilen Bedingungen in einfacher Weise für einen Transplantatempfänger in einem Transportbehälter bereitgehalten werden kann.
Damit werden die bisherigen arbeitsintensiven, manuellen Schritte weitgehend automatisiert.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung einer Zellstruktur in einem Membranreaktor, bestehend aus mindestens einer Zellwachstumskammer (1) und mindestens einer Mediumkammer (2), wobei die Zellwachstumskammer von einer Gasphase, die Mediumkammer von einer Nährlösung durchströmt wird, und aus mindestens einer semipermeablen Membran (M1), wobei diese als Träger der herzustellenden Zellstruktur dient, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellmaterial auf der semipermeablen Membran M1 inokuliert wird und sich eine erste Schicht bildet, dass das Zellmaterial von der unteren Seite der semipermeablen Membran durch die Nährlösung und von der oberen Seite der semipermeablen Membran durch die Gasphase versorgt wird, wodurch ein kontrolliertes Zellwachstum bewirkt wird, bei welchem mehrere weitere Schichten geordnet zur Zellstruktur (ML) wachsen, dass die Stoffwechselprodukte über die Nährlösung und über die Gasphase beseitigt werden, und dass dadurch auf der semipermeablen Membran eine Zellstruktur (ML) entsteht.
2. Verfahren zur Herstellung einer Zellstruktur in einem Membranreaktor, bestehend aus mindestens einer Zellwachstumskammer (1) und mindestens einer Mediumkammer (2), wobei die Zellwachstumskammer von einer Gasphase, die Mediumkammer von einer Nährlösung durchströmt wird, und aus einer semipermeablen Membrane (M1), wobei diese als Träger der herzustellenden Zellstruktur dient, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellmaterial auf der semipermeablen Membran (M1) inokuliert wird und sich eine Schicht bildet, dass das Zellmaterial von der unteren Seite der semipermeablen Membran durch die Nährlösung und von der oberen Seite der semipermeablen Membran durch die Gasphase versorgt wird, wodurch ein kontrolliertes Zellwachstum bewirkt wird, dass die Stoffwechselprodukte über die Nährlösung und über die Gasphase beseitigt werden, und dass dadurch auf der semipermeablen Membran eine Zellstruktur entsteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass an die entstandene Zellstruktur (ML) auf der gegenüberliegenden Seite der ersten semipermeablen Membran (M1) eine zweite semipermeable Membran (M2) angebracht wird und dass die Zellstruktur von der ersten semipermeablen Membran getrennt wird, wodurch ein Orientierungswechsel der Zellstruktur bewirkt wird.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Transfer der Zellstruktur (ML) in einen Transportbehälter (30) erfolgt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass für das kontrollierte Zellwachstum ein Video-System, insbesondere ein Mikroskop, welches über eine Computer-Einheit gekoppelt ist, eingesetzt wird, wodurch die Kontrolle des Zellwachstums kontinuierlich erfolgt.
6. Anwendung des Verfahren nach einem der
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Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung von humanen Geweben.
7. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das humane Gewebe aus Keratinozyten besteht.
8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Membranreaktor Mittel zum Transport der semipermeablen Membran, dass Mittel zur Deformation derselben während des Zellwachstums und dass ein Transportbehälter zum Transport der Zellkultur vorgesehen sind.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport ein Rollensystem vorgesehen ist, welches mit einem endlosen Kunststoffgewebe umgeben ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport ein Rollensystem mit Nocken vorgesehen ist, welche in den Lochraster der semipermeablen Membran greifen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zum Transport mindestens zwei paarweise synchron laufende Transportrollenpaare (14, 14'; 15, 15') vorgesehen sind.
12. Vorrichtung nach Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Deformation der semipermeablen Membran durch Druckunterschiede, durch Änderung der Amplitude und der Frequenz erfolgt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Deformation der semipermeablen Membran periodisch erfolgt.
14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Transportbehälter (30) an den Membranreaktor (10) angekoppelt wird und dass er einen integralen Bestandteil des Membran reaktors bildet.
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