DE69126530T2

DE69126530T2 - Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren

Info

Publication number: DE69126530T2
Application number: DE69126530T
Authority: DE
Inventors: Philip Dan Carlsbad Ca 92009 Cook; Yogesh Shantilal San Marcos Ca 92069 Sanghvi
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-01
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2011-07-02
Also published as: WO1992002258A1; AU8720591A; JPH06501389A; BR9106702A; US5614617A; ATE154246T1; EP0544824A4; EP0544824A1; CA2088258C; CA2088258A1; DE69126530D1; EP0544824B1; JPH0874B2; AU641565B2

Description

Diese Erfindung betrifft das Design, die Synthese und die Anwendung von nucleaseresistenten Oligonucleotiden, die als Antisense-Oligonucleotid-Therapeutika, Diagnostika und Forschungsreagenzien verwendbar sind. Pyrimidin-modifizierte Oligonucleotide, die gegen Nucleaseabbau resistent und imstande sind, die Aktivität von DNA und RNA zu modulieren, werden zur Verfügung gestellt. Verfahren zur Modulierung der Produktion von Proteinen, die die erfindungsgemäßen modifizierten Oligonucleotide verwenden, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist allgemein bekannt, daß die meisten körperlichen Zustände bei Säugetieren, inklusive infektiöser Krankheitszustände, durch Proteine hervorgerufen werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder über ihre enzymatischen Funktionen wirken, tragen zu einem wesentlichen Ausmaß zu vielen Krankheiten bei Tieren und Menschen bei.
Die klassischen Therapeutika waren allgemein darauf gerichtet, mit solchen Proteinen in Wechselwirkung zu treten, um deren krankheitsverursachende oder Krankheiten ermöglichende Funktionen herabzusetzen. In letzter Zeit jedoch wurden Versuche unternommen, die tatsächliche Produktion solcher Proteine durch Einfluß auf Moleküle zu verringern, die deren Synthese lenken, nämlich die intrazelluläre RNA. Durch Störung der Produktion der Proteine hat man gehofft, therapeutische Ergebnisse mit maximalem Effekt und minimalen Nebenwirkungen zu erreichen. Ein Versuch zur Inhibierung der spezifischen Genexpression ist die Verwendung von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga als Antisense-Mittel.
Die Antisense-Methode ist die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonucleotiden an einzelstrangige mRNA oder einzelstrangige DNA, sodaß die normalen essentiellen Funktionen dieser intrazellulären Nucleinsäuren unterbrochen werden. Hybridisierung ist die senquenzspezifische Wasserstoffbindung von Oligonucleotiden an Watson- Crick-Basenpaare von RNA oder einzelstrangiger DNA. Von solchen Basenpaaren sagt man, daß sie zueinander komplementär sind.
Natürlich vorkommende Ereignisse, die zur Unterbrechung der Nucleinsäurefunktionen führen, werden von Cohen in Oligonuckotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (CRC Press, Inc., Boca Raton FL, 1989) diskutiert. Diese Autoren schlagen zwei mögliche Arten von terminierenden Ereignissen vor. Das erste, der Hybridisierungsabbruch, bezeichnet ein terminierendes Ereignis, bei welchem der Oligonucleotid-Inhibitor an die Ziel-Nucleinsäure bindet und somit durch einfache sterische Hinderung verhindert, daß sich die essentiellen Proteine, am häufigsten Ribosome, an die Nucleinsäure binden. Methylphosphonat-Oligonucleotide; P.S. Miller & P.O.P. Ts'O, Anti-Cancer Drug Design, Bd. 2, S. 117-128 (1987); und α-Anomer-Oligonucleotide, Cohen J.S. Hg., Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (CRC Pfess, Inc., Boca Raton FL 1989), sind zwei der am ausführlichsten untersuchten Antisense-Mittel, von denen angenommen wird, daß sie die Nucleinsäurefunktion durch Hybridisierungsabbruch unterbrechen.
Eine zweite Art von Terminationsereignis für Antisense-Oligonucleotide bedient sich der enzymatischen Spaltung der angepeilten RNA durch intrazelluläre Rnase H. Das Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Analogon, das von der Art Deoxyribo sein muß, hybridisiert mit der Ziel-RNA und dieser Duplex aktiviert das Rnase H-Enzym zur Spaltung des RNA- Strangs, wodurch die normale Funktion der RNA zerstört wird. Phosphorthioat-Oligonucleotide sind ein prominentes Beispiel für ein Antisense-Mittel, das mit dieser Art von Antisense-Terminationsereignis arbeitet.
Es wird ein beträchtlicher Forschungsaufwand auf die Anwendung von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analoga als Antisense-Mittel für therapeutische Zwecke gerichtet. Die Anwendungen von Oligonucleotiden als Diagnostika, Forschungsreagenzien und mögliche therapeutische Mittel erfordern, daß die Oligonucleotide oder Oligonucleotid- Analoga in großen Mengen synthetisiert werden, durch Zellmembranen hindurchtransportiert oder von den Zellen aufgenommen werden, mit Ziel-RNA oder DNA in geeigneter Weise hybridisieren und anschließend die Nucleinsäurefunktion beenden oder unterbrechen. Diese kritischen Funktionen hängen von der anfänglichen Stabilität der Oligonucleotide gegenüber Nucleaseabbau ab.
Ein deutlicher Nachteil von natürlich vorkommenden Oligonucleotiden und existierenden Oligonucleotid-Analoga für diese Zwecke, insbesondere für Antisense-Therapeutika, ist der enzymatische Abbau des verabreichten Oligonucleotids durch eine Vielzahl von allgemein auftretenden nucleolytischen Enzymen, die intrazellulär oder extrazellulär vorkommen und im folgenden als "Nucleasen" bezeichnet werden. Es ist unwahrscheinlich, daß unmodifizierte Oligonucleotide als therapeutische Mittel verwendbar sind, da sie rasch durch Nucleasen abgebaut werden. Eine Modifikation der Oligonucleotide, um sie gegen Nucleasen widerstandsfähig zu machen, ist daher außerordentlich wünschenswert.
Die Modifikationen von Oligonucleotiden zur Verbesserung der Widerstandsfähigkeit gegen Nuclease haben bisher im allgemeinen an dem Zucker-Phosphat-Rückgrat, insbesondere an dem Phosphor-Atom, angesetzt. Es wurde berichtet, daß Phosphorthioate, Methylphosphonate, Phosphoramidate und Phosphotriester (Phosphat-methylierte DNA) verschiedene Grade der Widerstandsfähigkeit gegenüber Nucleasen aufweisen. Obwohl jedoch die Fähigkeit eines Antisense-Oligonucleotids zur getreuen Bindung an spezifische DNA oder RNA für die Antisense-Methodik fundamental ist, haben modifizierte Phosphor-Oligonucleotide, obwohl sie unterschiedliche Grade an Nucleaseresistenz liefern, im allgemeinen an ungenügenden Hybridisierungseigenschaften gelitten.
Ein Grund für diese ungenügende Hybridisierung kann auf die prochirale Natur des Phosphoratoms zurückzuführen sein. Die Modifikationen an den internen Phosphoratomen von modifizierten Phosphor-Oligonucleotiden führen zu Rp- und Sp-Stereoisomeren. Da eine praktische Synthese von stereoregulären Oligonucleotiden (nur Rp- oder Sp-Phosphatbindungen) unbekannt ist, haben Oligonucleotide mit modifizierten Phosphoratomen n² Isomere, wobei n gleich der Länge oder der Anzahl der Basen in dem Oligonucleotid ist. Außerdem bewirken Modifikationen am Phosphoratom eine unnatürliche Sperrigkeit im Bereich der Phosphodiesterbindung, die die Gleichförmigkeit des Zucker-Phosphat-Rückgrats und dementsprechend die Stabilität des Duplex stört. Die Wirkungen der Modifikationen am Phosphoratom verursachen minderwertige Hybridisierung an die angepeilten Nucleinsäuren im Verhältnis zu der Hybridisierung von unmodifiziertem Oligonucleotid an das gleiche Ziel.
Die relative Fähigkeit eines Oligonucleotids zur Bindung an komplementäre Nucleinsäuren kann durch Bestimmung der Schmelztemperatur eines speziellen Hybridisierungskomplexes verglichen werden. Die Schineiztemperatur (Tm), eine charakteristische physikalische Eigenschafi von Doppelhelices, stellt die Temperatur in Zentigraden dar, bei welcher 50 % helicale gegenüber spiraligen (unhybridisierten) Formen vorliegen. Tm wird durch Verwendung des UV-Spektrums zur Bestimmung der Bildung und des Zusammenbruchs (Schmelzen) der Hybridisierung gemessen. Basenpaarung, die während der Hybridisierung stattfindet, ist von einer Herabsetzung der UV-Absorption (Hypochromie) begleitet. Dementsprechend deutet eine Verminderung der UV-Absorption auf eine höhere Tm. Je höher die Tm, umso größer ist die Festigkeit der Bindung der Stränge. Eine Nicht- Watson-Crick-Basenpaarung hat einen starken destabilisierenden Effekt auf die Tm. Dementsprechend ist wahrscheinlich absoluter Gleichklang der Basenpaarung notwendig, um eine optimale Bindung eines Antisense-Oligonucleotids an seine Ziel-RNA zu erreichen.
Es wurde eine beträchtliche Verminderung der Hybridisierungseigenschalten von Methylphosphonaten und Phosphorthioaten berichtet. vgl. Cohen, J.S., Hg. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (CRC Press, Inc., Boca Raton FL, 1989). Methylphosphonate haben einen weiteren Nachteil dadurch, daß der Duplex, der mit der RNA gebildet wird, den Abbau durch Rnase H als ein Terminationsereignis nicht aktiviert, sondern durch Hybridisierungsabbruch wirkt, der aufgrund einer helicalen, auf dem Ribosom lokalisierten Schmelzaktivität umgekehrt werden kann. Phosphorthioate sind äußerst widerstandsfähig gegenüber den meisten Nucleasen. Jedoch zeigen Phosphorthioate in der Regel Nicht-Antisense-Wirkungen, insbesondere die Inhibierung verschiedener Enzymfunktionen aufgrund unspezifischer Bindung. Enzym-Inhibierung durch sequenzspezifische Oligonucleotide unterminiert die gesamte Basis der Antisense-Chemotherapie.
Daher sind Oligonucleotide, die zur Erreichung von Resistenz gegenüber Nucleasen, zur Aktivierung des RNase H Terminationsereignisses und zur Hybridisierung mit entsprechender Stärke und Treue an ihre Ziel-RNA (oder DNA) modifiziert wurden, für die Antisense-Oligonucleotid-Diagnostik, für Therapeutika und für die Forschung außerordentlich erwünscht.
E. Uhlmann et al., in Chemical Reviews Bd. 90 (4) Seiten 543-584 (1990) beschreiben modifizierte Oligonucleotide und deren Verwendung in der Therapie. Dieser Übersichtsartikel beschreibt eine Vielzahl von Antisense-Oligonucleotiden mit unterschiedlichen Zuckergruppierungen, Basenresten und Zuckerbindungen. Eine Anzahl von basenmodifizierten Nucleosiden wird beschrieben.
Die WO 89/12060 beschreibt Oligonucleotide mit Sulfoxid-Einheiten, die die natürlich vorkommenden Phosphateinheiten als Internucleotid-Bindungen ersetzen. Die Sulfoxid-gebundenen Oligonucleotide sind gegenüber enzymatischem und chemischem Abbau stabil und werden in der Antisense-Chemie eingesetzt. Diese Derivate können beliebig viele Nucleobasen, inklusive 6-Azacytidin und 6-Azauracil, enthalten.
Die WO 88/00201 beschreibt Oligonucleotide mit einer oder mehreren freien aliphatischen Aminogruppen, die an die Zuckergruppierungen der Nucleosid-Untereinheiten gebunden sind. Die aliphatischen Aminogruppen werden zur Derivatisierung der Oligonucleotide eingesetzt. Unter den verwendbaren Nucleobasen sind 4-Amino-2,6- dihydroxypyrimidin, 6-Methyluracil, 6-Azathymidin und dessen substituierte Derivate, 6- Azauracil und 5-Azacytidin zu nennen.
Es ist ein prinzipielles Ziel der vorliegenden Erfindung, Oligonucleotid-Analoga zur Verwendung in der Antisense-Oligonucleotid-Diagnostik, als Forschungsreagenzien und Therapeutika zur Verfügung zu stellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, solche Oligonucleotid-Ana[oga zur Verfügung zu stellen, die bei der Modulierung der Aktivität einer DNA oder einer RNA wirksam sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffting solcher Oligonucleotid-Analoga, die weniger leicht unerwünschte oder toxische Nebenreaktionen hervorrufen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Forschungs- und diagnostische Methoden sowie Materialien zur Untersuchung von Körperzuständen in Tieren, insbesondere von Krankheitszuständen, zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, therapeutische Methoden und Forschungsmethoden sowie Materialien für die Behandlung von Krankheiten durch Modulation der Aktivität von DNA und RNA zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Ziele werden für den durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet beim Studium der vorliegenden Beschreibung und der angeschlossenen Ansprüche ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung zur Verfügung, die eine Vielzahl kovalent gebundener Nucleosid-Einheiten umfaßt, die jeweils einen Ribose- oder Deoxyribose-Zuckerabschnitt und einen Basenabschnitt umfassen, worin:
eine Vielzahl von Basenabschnitten Pyrimidinbasen sind; und
mindestens eine der genannten Pyrimindinbasen eine modifizierte Pyrimidinbase mit der Struktur:
ist, worin X = OH oder NH&sub2;,
B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
C-Niedrigalkyl, N, C-CF&sub3;, C-F, C-Cl, C-Br, C-I, C-Halocarbon, C-NO&sub2;, C-OCF&sub3;, C-SH, C-SCH&sub3;, C-OH, C-O-Niedrigalkyl, C-CH&sub2;OH, C-CH&sub2;SH, C-CH&sub2;SCH&sub3;, C-CH&sub2;OCH&sub3;, C-NH&sub2;, C-CH&sub2;NH&sub2;, C-Alkyl-NH&sub2;, C-Benzyl, C-Aryl, C-substituiertes Aryl oder Benzyl; A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
C-H, C-CH&sub3;, N, C-CF&sub3;, C-F, C-Cl, C-Br, C-I, C-Halocarbon, C-NO&sub2;, C-OCF&sub3;, C-SH, C- SCH&sub3;, C-OH, C-O-Niedrigalkyl, C-CH&sub2;OH, C-CH&sub2;SH, C-CH&sub2;SCH&sub3;, C-CH&sub2;OCH&sub3;, C- NH&sub2;, C-CH&sub2;NH&sub2;, C-Benzyl, C-Aryl, C-substituiertes Aryl oder Benzyl und einem Carbozyklus oder Heterozyklus, der über A und B fusioniert ist; oder A und B gemeinsam Teil eines carbozyklischen oder heterozyklischen Rings sind, der über A und B an den Pyrimidinring fusioniert ist.
Die Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotide erkennen und bilden Doppeistränge mit einzelstrangiger DNA und RNA oder Tripelstränge mit doppelstrangiger DNA und RNA.
Die nucleaseresistenten Oligonucleotide bestehen aus einem Strang von Nucleinsäurebasen, die über Bindungsgruppen aneinander gebunden sind. Der Zielabschnitt der nucleaseresistenten Oligonucleotide kann im Längenbereich von etwa 5 bis etwa 50 Nucleinsäurebasen liegen. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird jedoch angenommen, daß eine Zielsequenz von 15 Basen Länge optimal ist.
Die Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotide gemäß der Erfindung haben Basen in sich eingebaut, die Pyrimidine, wie etwa Thymin, Uracil oder Cytosin, oder Purine, wie etwa Guanin oder Adenin, oder Modifikationen derselben, die in ausgewählter Sequenz angeordnet sind, enthalten. Die Zuckergruppierungen solcher Basen können entweder Deoxyribose- oder Ribosezucker sein. Die Gruppen, die die Basen aneinander binden, können das übliche Zucker-Phosphat-Nucieinsäure-Rückgrat sein, können jedoch auch als ein Phosphorthioat, Alkylphosphonate, wie etwa Methylphosphonat, Phosphotriester, Phosphoamidat oder durch andere Rückgrat-Modifikationen modifiziert sein, die zur weiteren Verstärkung der Eigenschaften des Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotids geeignet sind.
Zum Beispiel kann die Phosphodiesterbindung auch durch eine Kohlenstoff- oder Etherbindung ersetzt sein.
Übereinstimmend mit anderen bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung kann der Zielabschnitt ein Analogon eines Oligonucleotids sein, worin mindestens eine der Pyrimidinbasen Thymin, Cytosin oder Uracil durch eine modifizierte Nucleinsäurebase ersetzt ist, die den Regeln der Watson-Crick-Wasserstoffbindung von Basenpaaren genau entspricht (T an A, C an G und U an A), dennoch dem Oligonucleotid Nucleaseresistenz verleiht. Eine Modifikation der Pyrimidinbase oder der -basen tritt vorzugsweise an den Positionen 5 oder 6 des Pyrimidinrings auf. Alternativ dazu können eine oder mehrere der Pyrimidinbasen an beiden Positionen 5 und 6 des Pyrimidinrings modifiziert sein.
Die Substitutionen, die an den Positionen 5 und 6 auftreten können, können Additionen von Heteroatomen an den Kohlenstoffatomen in den Positionen 5 und 6 des Pyrimidins sein oder die Addition von Methyl-, Hydroxyl-, Ether-, Alkohol-, Benzyl- oder Phenylgruppen. Die Modifikationen können auch die Addition von Nitrogruppen, Thiolgruppen, Halogengruppen oder Halocarbongruppen, inklusive Fluorocarbongruppen, betreffen. Als Alternative kann die Modifikation ein carbozyklischer oder heterozyklischer Ring sein, der durch Fusion eines Substrats an die Positionen 5 und 6 des Pyrimidinrings gebildet wird. Die Additionen, die an den Positionen 5 und 6 auftreten, können, müssen jedoch nicht, die gleichen sein.
Die entstehenden neuen Oligonucleotide sind resistent gegenüber Nucleaseabbau und zeigen Hybridisierungseigenschaften von höherer Qualität im Verhältnis zu natürlichen (DNA-DNA und RNA-DNA) Duplices sowie gegenüber derzeit bekannten Phosphor-modifizierten Oligonucleotid-Antisense-Duplices, die Phosphorthioate, Methylphosphonate, Phosphoramidate und Phosphotriester enthalten. Die Erfindung ist auch wertvoll bei Verfahren zur Modulierung der Produktion eines Proteins durch einen Organismus, bei welchen der Organismus mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, die in Übereinstimmung mit den obigen Angaben formuliert wurde. Es wird bevorzugt, wenn der zu modulierende RNA- oder DNA-Abschnitt vorselektiert wird, um jenen Abschnitt der DNA oder RNA zu umfassen, der für das Protein codiert, dessen Bildung moduliert werden soll. Der Ziel-Abschnitt der zu vverwendenden Zusammensetzung wird somit so ausgewählt, daß er komplementär dem vorgewählten Abschnitt der DNA oder RNA ist, das heißt, daß er ein Antisense-Oligonucleotid für diesen Abschnitt darstellt.
Diese Erfindung ist auch wertvoll bei Verfahren zur Behandlung eines Organismus, der eine Krankheit hat, die durch die unerwünschte Produktion eines Proteins gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen des Organismus mit einer Zusammensetzung gemäß den obigen Angaben. Die Zuammensetzung ist vorzugsweise eine solche, die zur spezifischen Bindung mit einer Boten-RNA ausgerichtet ist, die für das Protein codiert, dessen Produktion inhibiert werden soll.
Die Erfindung ist weiters wertvoll bei diagnostischen Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit abnormaler RNA-Moleküle oder abnorma[er oder ungeeigneter Expression von nornnalen RNA-Molekülen in Organismen oder Zellen.
Diese Erfindung ist auch wertvoll bei Verfahren zur selektiven Bindung von RNA für Zwecke der Forschung und Diagnose. Eine solche selektive starke Bindung wird durch Wechselwirkung von solcher RNA oder DNA mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erreicht, die gegen abbauende Nucleasen widerstandsfähig sind und stärker und mit größerer Genauigkeit als bekannte Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Analoga hybridisieren.
Die Zusammensetzungen, die zur Modulierung der Aktivität eines RNA- oder DNA- Molekuis in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendbar sind, umfassen ein ein modifiziertes Pyrimidin enthaltendes Oligonucleotid einer Zielsequenz, das spezifisch mit einer vorher ausgewählten Nucleotidsequenz eines einzelstrangigen oder doppelstrangigen DNA- oder RNA-Moleküls hybridisierbar und nucleaseresistent ist.
Es ist im allgemeinen wünschenswert, eine Sequenz einer DNA oder RNA auszuwählen, die für die Produktion von Proteinen wirkt oder daran beteiligt ist, deren Synthese schlußendlich moduliert oder zur Gänze inhibiert werden soll. Der Zielabschnitt der Zusammensetzung ist im allgemeinen ein Oligonucleotid-Analogon. Es wird geeigneterweise durch Synthese im festen Zustand mit bekannter Verfahrensfülirung synthetisiert, um mit der vorgewählten Nucleotidsequenz der RNA oder DNA komplementär oder zumindest spezifisch hybridisierbar zu sein. Nucleinsäure-Synthesizer sind im Handel erhältlich und ihre Verwendung wird vom durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet allgemein so verstanden, daß sie zur Herstellung fast beliebiger Oligonucleotide von vernünftiger Länge, die gewünscht sein mogen, verwendbar sind.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Oligonucleotid" auf eine Vielzahl verbundender Nucleotid-Einheiten, die in einer speziellen Sequenz von natürlich vorkommenden Basen und Pentofuranosyl-Zuckergruppen gebildet sind, die über eine Internucleotid-Bindungsgruppe durch native Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Diese Nucleotid-Einheiten können Nucleinsäurebasen sein, wie etwa Guanin, Adenin, Cytosin, Thymin oder Uracil. Die Zuckergruppen können Deoxyribose-Zucker oder Ribose-Zucker sein. Dieser Ausdruck bezieht sich sowohl auf natürlich vorkommende als auch auf synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden Untereinheiten gebildet sind.
Der Ausdruck "Oligonucleotid-Analogon", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf Gruppierungen, die ähnlich wie Oligonucleotide wirken, jedoch nicht-natürlich vorkommende Abschnitte aufweisen. In Übereinstimmung mit dieser Erfindung sind manche Abschnitte einer oder mehrerer Pyrimidinbasen substituiert, um die Nucleaseresistenz der Zusammensetzung zu steigern, wobei der innere Zusammenhalt der Oligonucleotid-Bindungsfähigkeiten bewahrt wird. Wie oben angegeben, können solche Substitutionen den Positionen 5 oder 6 eines oder mehrerer Pyrimidinringe durch Substitution eines Heteroatoms für ein Kohlenstoffatom des Pyrimidinrings an diesen Positionen stattfinden. Alternativ dazu kann die Nucleaseresistenz des Oligonucleotids durch Addition einer Substituentengruppe an den Positionen 5 und 6 des Pyrimidinrings gesteigert werden.
Bevorzugt ist es, wenn einer oder beide der Gruppen A und B C-Niedrigalkyl, C-O- Niedrigalkyl, C-OH, C-Phenyl, C-Benzyl, C-Nitro, C-Thiol, C-Halocarbon oder C-Halogen sind. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen ist mindestens eine der Gruppen A und B C-Halogen oder C-Halocarbon, inklusive C-Fluorcarbon, insbesondere C-Trifluormethyl. Andere Fluorkohlenstoffe inkludieren C-C(CF&sub3;)&sub3;, C-CF&sub2;-CF&sub3; und C-CF&sub2;-CF&sub2;- CF&sub3;. Halogen inkludiert Fluor, Brom, Chlor und Jod.
Übereinstimmend mit anderen bevorzugten Ausführungsformen sind eine oder beide der Gruppen A und B Stickstoffatome. Noch bevorzugter ist es, wenn A Stickstoff ist. In anderen Ausführungsformen steht A für C-CH&sub3; oder C-CF&sub3; und B steht für Stickstoff oder A steht für C-Br und B für Stickstoff.
Bevorzugt ist es, wenn sich mindestens ein modifiziertes Pyrimidin am 3'- oder 5'- Ende des genannten Oligonucleotid-Analogons, insbesondere am 3'-Ende des genannten Oligonucleotid-Analogons, befindet. In Übereinstimmung mit anderen bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Oligonucleotid-Analoga bis zu etwa 3 modifizierte Pyrimidine, die am 3'-Ende des genannten Oligonucleotids eingebaut sind. Bei anderen Ausführungsformen sind mindestens etwa 1 % der genannten Pyrimidine modifiziert. Gemäß anderen Ausführungsformen ist es bevorzugt, größere Mengen an Modifikation vorzusehen, wie etwa mindestens etwa 10 % der genannten Pyrimidine oder sogar 25 %, 50 % oder im wesentlichen alle der genannten Pyrimidine.
Die an das modifizierte Pyrimidin gebundenen Zuckergruppierungen können entweder ein Ribose- oder ein Deoxyribose-Zucker sein. Die Zucker-Bindungsgruppen des modifizierten Pyrimidins können zu einem Phosphorthioat, Alkylphosphonat, inklusive Methylphosphonat, Phosphoamidat, Phosphotriester oder ebenso zu einer Phosphatalkylatstruktur modifiziert sein. Bei anderen Ausführungsformen können die Oligonucleotid-Analoga Zucker-Bindungsgruppen der modifizierten Pyrimidine durch Kohlenstoff oder Etherbindungen ersetzt enthalten.
Für Therapeutika ist es günstig, wenn das Oligonucleotid-Analogon in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger zubereitet wird.
In manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Pyrimidin-modifizierte Oligonucleotide zu verwenden, die noch weiter modifiziert sind. In diesem Zusammenhang beziehen sich Pyrimidin-modifizierte Oligonucleotid-Analoga auf Strukturen, die im allgemeinen ähnlich nativen Oligonucleotiden sind, jedoch auf eine oder mehrere signifikante Weisen modifiziert wurden.
Solche Modifikationen können am Zucker-Rückgrat der Erfindung stattfinden. Im allgemeinen ist es bevorzugt, die Fähigkeit der Ziel-Sequenz der Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotide, in die intrazellulären Zwischenräume der Zellen einzudringen, wo die Boten-RNA und die DNA vorliegen, die die Ziele der gesamten Zusammensetzung darstellen, zu verstärken. Daher ist es im allgemeinen bevorzugt, Modifikationen von Oligonucleotiden bereitzustellen, die im wesentlichen weniger ionisch als die nativen Formen sind, um das Eindringen des Oligonucleotids in die intrazellulären Zwischenräume zu erleichtern. Jede der bestehenden Methoden oder sogar der noch zu entdeckenden Methoden zur Erreichung dieses Ziels kann in Übereinstimmung mit der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Derzeit hat sich herausgestellt, daß es bevorzugt ist, Substitutionen der Phosphodiesterbindung zu verwenden, welche Sustitutionen nicht nur relativ weniger ionisch sind als die natürlichen Bindungen, sondern die auch im wesentlichen nichtchiral sind. Es ist ersichtlich, daß das Phosphoratom in der Phosphodiester-Bindung "prochiral" ist. Modifikationen am Phosphor, wie sie bei Oligonucleotiden vom Typ der Methylphosphonate und Phosphorthioate vorliegen, flihren zu im wesentlichen chiralen Strukturen. Chiralität flihrt zu der Anwesenheit von zwei Isomeren an jedem chiralen Zentrum, das unterschiedlich mit zellulären Molekülen in Wechselwirkung treten kann. Eine solche nicht aufgelöste Mischung von Isomeren kann den Transport der entstehenden Zusammensetzungen in die intrazellulären Zwischenräume inhibieren oder die Affinität und Spezifität der Hybridisierung an spezielle Ziel-RNA oder DNA herabsetzen. Somit ist es bevorzugt, im wesentlichen nicht-ionische, im wesentlichen nicht-chirale Einheiten anstelle mancher oder aller Phosphodiesterbindungen zu verwenden. Für diesen Zweck sind kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylstrukturen, insbesondere C2-C4-Strukturen, bevorzugt. Die Modifikation der Zuckerstruktur, inklusive der Eliminierung einer Sauerstoff-Funktion, kann das Einführen solcher im wesentlichen nicht-chiraler, nicht-ionischer Substituenten an dieser Position gestatten.
In Übereinstimmung mit den Zielen der Erfindung, werden Standard-Modifikationen des Rückgrats, wie etwa die Substitution S-P, Me-P, MeO-P oder H&sub2;N-P (das sind Phosphorthioate, Methylphosphonate, Phosphotriester oder Phsphoamidate), anstelle von O-P (Phosphodiester) in Betracht gezogen. Von diesen Substitutionen wird angenommen, daß sie in manchen Fällen die Eigenschatten des Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotids verbessern.
Die Zielabschnitte der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind vorzugsweise Oligonucleotid-Analoga mit 5 bis etwa 50 Basen-Einheiten. Bevorzugter ist es, wenn solche Funktionen 8 bis etwa 40 Basen-Einheiten aufweisen, und noch bevorzugter ist es, wenn etwa 12 bis 20 Basen-Einheiten verwendet werden. Oligonucleotid-Analoga mit etwa 15 Basen-Einheiten sind für die praktische Durchführung bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Wünschenswert ist es, wenn der Zielabschnitt so vorgerichtet wird, daß er mit der vorgewählten Nucleotidsequenz der zur Modulierung ausgewählten KNA, oder DNA spezifisch hybridisierbar ist. Oligonucleotid-Analoga, die für die praktische Durchführung einer oder mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, umfassen eine oder mehrere Untereinheiten von modifizierten Ribose- oder Deoxyribose- Pyrimidinen. Die Substitutionen, die an den Positionen 5 und 6 des Pyrimidinrings auftreten können, können Additionen von Methyl-, Hydroxyl-, Alkoxy-, Alkohol-, Benzyl- oder Phenylgruppen inkludieren. Die Modifikationen können auch die Addition von Nitrogruppen, Thiolgruppen oder Halogengruppen umfassen. Andererseits kann die Modifikation eine Addition eines Kohlenstofffings oder eines ein Heteroatom enthaltenden Rings sein, der an die Positionen 5 und 6 fusioniert ist. Die Additionen, die an den Positionen 5 und 6 auftreten, können, müssen jedoch nicht die gleichen sein.
Diese modifizierten Basen werden aneinander und an den Rest des Oligonucleotids oder des Oligonucleotid-Analogons über eine Zucker-Bindungsgruppe gebunden. Die Bindungsgruppe kann jede beliebige Struktur haben, die hierin beschrieben ist und die Zuckergruppierungen von Oligonucleotiden aneinander binden kann, um den Zielabschhitt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu bilden. Bevorzugt ist es, wenn diese Zucker- Bindungsgruppen die Phosphodiesterstruktur oder ein Derivat hievon umfassen. Derivate der Phosphodiesterstruktur können die Substitution eines Sauerstoffs durch eine Schwefel-, Methyl-, Methyloxid- oder Aminogruppe inkludieren. Das Zucker-Phosphat-Nucleinsäure- Rückgrat kann zu einer Phosphorthioat-, Methylphosphonat-, Phosphoamidat- oder Phosphotriester-Gruppierung modifiziert sein. Die Phosphodiesterbindung kann auch durch eine Kohlenstoff- oder Etherbindung ersetzt sein.
Bei anderen Ausführungsformen dieser Erfindung wurde eine Bindungsgruppierung entworfen, die eine direkte Anknüpfung eines modifizierten Pyrimidins an das terminale Ende des 3'-Endes der modifizierten Oligonucleotide erlaubt. Somit kann eine Estervorstufe, wie etwa eine Brommethylketogruppe, an das 3'-Hydroxyl eines modifizierten Pyrimidin-Nucleosids geknüpft werden, bei dem sein 5'-Hydroxyl mit einer Dimethoxytritylgruppe (einer Dimethoxytriphenylmethylgruppe) geschützt ist und dessen Pyrimidin-Heterocyclus erforderlichenfalls mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt ist, wie zum Beispiel einer Benzolat-Schutzgruppe für die Cytosin-Serie der Nucleoside. Wenn die erforderliche Zielsequenz eine terminale 3'-Thymin- oder -Cytosinbase hat, kann die gewünschte modifizierte Thymin- oder Cytosinbase, die den Brommethylketo-Linker enthält, als das erste Monomer verwendet werden, um an den festen Vergleichsträger aus Porenglas (CPG) zu binden, der ein normales Nucleosid über dessen 3'-Hydroxylgruppe gebunden enthält. Die basenempfindliche Esterbindung, die das modifizierte Pyrimidin an das Nucleosid bindet, das an dem CPG gebunden ist, kann unter den üblichen Bedingungen von konzentriertem Ammoniumhydroxid gespalten werden, die eingesetzt werden, um das Oligonucleotid von dem CPG-Träger zu entfernen. Dadurch wird es ermöglicht, daß das modifizierte Oligonucleotid ein modifiziertes Thymin oder Cytosin an seinem terminalen 3'-Ende enthält.
Die Spaltung von Oligonucleotiden durch nucleolytische Enzyme erfordert die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes oder insbesondere eines Nuclease-Oligonucleotid Komplexes. Die Nuclease-Enzyme werden im allgemeinen spezifische Bindungsstellen erfordern, die zur geeignten Anknüpfung an den Oligonucleotiden vorgesehen sind. Wenn die Oligonucleotid-Bindungsstellen entfernt oder gehindert sind, sodaß sich die Nucleasen nicht an die Oligonucleotide binden, dann werden nucleaseresistente Oligonucleotide entstehen. Im Fall von Restriktionsendonucleasen, die sequenzspezifische palindromische doppelstrangige DNA spalten, wurden bestimmte Bindungsstellen, wie etwa die Ringstickstoffatome an den Positionen 3 und 7 der Purinbasen, als erforderliche Bindungsstellen identifiziert. Die Entfernung einer oder mehrerer dieser Stellen oder die Behinderung der Nuclease-Annäherung an diese speziellen Positionen innerhalb der Erkennungssequenz lieferte verschiedene Grade von Resistenz gegen spezifische Nucleasen.
Es wurde auch ein Versuch mit nicht festliegender Beziehung von Struktur zu Aktivität unternommen, um nucleaseresistente Antisense-Oligonucleotide zu entdecken, die geeignete Hybridisierungseigenschaften beibehalten. Eine Reihe von Modifikationen an den 5'- und/oder 6'-Positionen von Thymin- und Cytosin-Ribonucleosiden und -Deoxynucleosiden wurde vorgenommen. Diese modifizierten Nucleoside wurden über eine Festphasen-Nucleinsäuresynthese in sequenzspezifische Oligonucleotide eingesetzt. Die neuen Antisense-Oligonucleotide wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, dem Abbau durch Nucleasen zu widerstehen und Hybridisierungseigenschaften aufzuweisen, die mit denen der unmodifizierten parenten Oligonucleotide vergleichbar sind. Bevorzugte Ausffihrungsformen, bei welchen die Positionen 5 und 6 der Nucleinsäure-Pyrimidin-Positionen ausgewählt wurden, weil periphere Modifikationen und Ringmodifikationen, wie etwa Aza/Deaza, in diesen Positionen eher nicht dazu neigen, die erforderlichen Wasserstoffbindungsmustern der Basenpaare nach Watson-Crick sterisch zu behindern. Es wird jedoch angenommen, daß die grundlegenden elektronischen Veränderungen in einem Ringsystem aus solchen scheinbar inkonsequenten heterocyclischen Veränderungen resultieren. Diese elektronischen Veränderungen können Dipolmomente an die aromatischen Systeme anfügen und/oder Änderungen der Richtungen oder Festigkeiten von bestehenden Dipolmomenten verursachen. Pka-Festigkeiten werden durch die elektronische Störung bewirkt. Periphere oder Ringänderungen, wie etwa Aza/Deaza, können die Elektrophilie oder Nudeophilie des Ringsystems verändern, sodaß die Nucleasen, die kovalente Bindungsbildung an eine Nucleinsäurebase eines Oligonucleotids für ihre abbauende Wirkung erfordern können, unwirksam werden.
Während unserer Untersuchungen hinsichtlich der Beziehung von Struktur und Aktivität wurde überraschenderweise entdeckt, daß periphere und Aza/Deaza-Modifikationen in den Positionen 5 und/oder 6 der Pyrimidine Thymin, Cytosin und Uracil, eine Resistenz gegen Nucleasen lieferte, die mit Phosphorthioaten vergleichbar war, die für ihre Nucleaseresistenz bekannt sind, wobei die Hybridisierungseigenschaften der modifizierten Oligonucleotide ebensogut oder besser waren als die der unmodifizierten parenten Oligonudeotide.
Bei manchen Ausführungsformen dieser Erfindung wird die Modifikation der Pyrimidin-Nucleinbasen voraussichtlich eine Modifikation von etwa 50 % der Antisense-Oligonucleotide erlauben (zwei der vier verfügbaren Basen). Modifizierte Sequenzen, bei denen alle Thymine und Cytosine durch 6-Azathymin und 6-Azacytosin ersetzt sind (acht von fünfzehn Basen) zeigten Nucleaseresistenz mit einer etwa 10%igen Absenkung der Tm im Vergleich zu der unmodifizierten Parentsequenz. Eine bevorzugte Kombination von Nucleaseresistenz und Bindungsstabilität resultiert daher, daß ein bis drei modifizierte Pyrimidine an das 3'-Ende des Oligonucleotids gesetzt sind.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotid-Analoga können als Diagnostika, Therapeutika und als Forschungsreagenzien sowie in Kits verwendet werden. Für die therapeutische Verwendung wird das Oligonucleotid-Analogon einem Tier, das an einer durch ein gewisses Protein hervorgerufenen Krankheit leidet, verabreicht. Bevorzugt ist es, wenn den Patienten, die in Verdacht stehen, an einer solchen Krankheit zu leiden, Mengen des Oligonucloetid-Analogons verabreicht werden, die zur Herabsetzung der Symptome dieser Krankheit wirksam sind. Es liegt innerhalb des Aufgabenbereichs eines durchschnittlichen Fachmanns, die optimalen Dosierungen und die Behandlungspläne für solche Behandlungsvorschriften zu erarbeiten.
Im allgemeinen wird es bevorzugt, die therapeutischen Mittel gemäß dieser Erfindung intern zu verabreichen, wie etwa oral, intravenös oder intramuskulär. Andere Formen der Verabreichung, wie etwa transdermal, topisch oder intralesional, können ebenso verwendet werden. Es kann auch der Einschluß in Suppositorien günstig sein. Die Verwendung von pharmakologisch anwendbaren Trägern ist für manche Ausführungsformen ebenfalls bevorzugt.

BEISPIELE

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Synthese von 6-Aza-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphos phoramidityl)thymidin, d.h. 6-Methyl-2-(5'-0-dimethoxytriphenylmethyl-3'-0-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl-2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1,2,4-traiazin- 3,5(2H,4H)-dion.

A. Synthese von 6-Methyl-3,5-bis(trimethylsiloxy)-1,2,4-triazin.

Eine Mischung von 6-Azathymin (gekauft von Aldrich Chemical Co.) (5,0 g, 39,4 mMol), Hexamethyldisilazan (HNDS) (15 ml) und Chlortrimethylsilan (TMSCl) (0,5 ml) in einem Rundbodenkolben (50 ml), der mit einem Rückflußkühler und einem Trockenrohr ausgestattet ist, wird durch Erhitzen in einem Ölbad (150ºC) unter Rückfluß gekocht; NH&sub4;Cl sammelt sich als weißes Pulver im Kühler. Sobald eine klare Lösung erhalten wurde ( 1 h), wurde das übersc hüsige HMDS/TMSCl durch Destillation bei 444 Pa (30ºC/torr) (Badtemperatur 100ºC) entfernt. Das zurückbleibende Öl kristallierte beim Trocknen unter Vakuum (13 Pa, 0,1 torr) und lieferte 6,57 g (61 %) 6-Methyl-3,5- bis(trimethylsiloxy)-1,2,4-triazin, Schmp. 43ºC.

B. Synthese von 2-(2-Deoxy-3,5-di-0-p-toluoyl-β-D-erythro-pentoftiranosyl)-6-methyl-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion.

Eine Mischung von 6-Methyl-3,5-bis(trimethylsiloxy)-1,2,4-triazin (4,0 g, 14,7 mMol) und 2-Deoxy-3,5-di-0-p-toluoyl-α-D-erythro-pentofüranosylchlorid (4,8 g, 12,4 mMol) in trockenem CHCl&sub3; (300 ml) wurde bei Raumtemerpatur unter wasserfreien Bedingungen gerührt. CuI (2,4 g, 12,4 mMol) wurde zu der Lösung zugesetzt und die entstehende Aufschlämmung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, zu welchem Zeitpunkt die Dünnschicht-Chromatographie (TLC) darauf hinwies, daß die Reaktion abgeschlossen war. Die Mischung wurde mit gesättigtem wässerigem NaHCO&sub3; (200 ml) behandelt, 15 Minuten gerührt und durch ein Celit-Kissen filtriert, welches mit CHCl&sub3; (2x50 ml) gewaschen worden war. Die organische Schichte wurde mit gesättigtem NaCl (200 ml) gewaschen, getrocknet (MGSO&sub4;) und eingeengt, um einen gummiartigen Rückstand zu liefern. Dieses Material war bei der TLC im wesentlichen ein Punkt. Eine rasche Filtration durch eine kurze Silicagel-Säule unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1:1) lieferte mehrere Fraktionen der gewünschten Verbindungen. Die Kristallisation des Rückstands von EtOH lieferte das Produkt als weiße Nadeln; 3,64 g (63 %), Schmp. 170ºC. Eine zweite Ausbeute wurde aus dem Filtrat gewonnen (730 mg, 12,6 %).

C. Synthese von 6-Azathymidin-[2-(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-6-methyl- 1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion].

Zu einer Mischung des blockierten Nucleosids 2-(2-Deoxy-3,5-di-0-p-toluoyl-β-D- erythro-pentofuranosyl)-6-methyl-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion, das oben beschrieben wurde, (480 mg, 1 mMol), in absolutem MeOH (15 ml) wurde trockenes NaOMe (50 mg) unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. TLC nach einer Stunde deutete auf die vollständige Entblockierung der Toluoylgruppen. Die Lösung wurde durch Zusatz von 1 ml Ionentauscherharz Dowex-50 (Wasserstoff-Form) neutralisiert. Die Suspension wurde filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (3 ml) gelöst und mit CHCl&sub3; (3x5 ml) gewaschen. Die wässerige Schichte wurde gefriergetrocknet, um einen harten Schaum zu liefern, der weiter über P&sub2;O&sub5; in einem Vakuum-Exsikkator bei 0,1 torr getrocknet wurde. Die Verbindung wurde in 96%iger Ausbeute (230 mg) erhalten und war in jeder Hinsicht im Vergleich mit den Literaturwerten ident, z.B. UV, NMR, TLC und Schmelzpunkt.

D. Synthese von 2-[2-Deoxy-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-erythro-pentoluranosyl]-6- methyl-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion. (6-Azathymidin 5'-DMT)

Zu einer gerührten Lösung von 6-Azathymidin, das gemäß obiger Beschreibung synthetisiert worden war, (2,43 g, 10 mMol) in trockenem Pyridin (100 ml) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (4,06 g, 12 mMol) und 4-Dimethylaminopyridin (120 mg, 1 mMol) bei Raumtemperatur zugesetzt. Die entstehende gelbe Lösung wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf TLC auf vollständige Reaktion hindeutete. MeOH (10 ml) wurde zugesetzt und die Lösung unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (200 ml) aufgelöst, mit gesättigtem NaHCO&sub3; (100 ml) und anschließend mit gesättigtem NaCl (100 ml) extrahiert und dann getrocknet (MgSO&sub4;). Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und eingeengt, um einen gummiartigen Rückstand zu ergeben, der durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von EtOAc/Triethylamin (99/1) als Eluiermittel gereinigt wurde. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt, um einen weißen Schaum zu ergeben (3,82 g, 70 %); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 6,56 (t, 1H, C&sub1;, H) und andere Protonen.

E. Synthese von 2-[2'-Deoxy-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-erythro-pentofuranosyl]-6- methyl-1,2,4-triazin-3,5(2H,4H)-dion 3'-0-N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl-phosphoramidit.

Zu einer gerührten Lösung von 6-Azathymidin-5'-DMT, das nach obiger Beschreibung synthetisiert worden war (1,63 g, 3 mMol), wurde in trockenem THF (50 ml) Diisopropylethylamin (1,56 ml, 9 mMol) zugesetzt und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. N,N- Diisopropyl-β-cyanoethylphosphonamidchlorid (1,42 mi, 6 mMol) wurde tropfenweise zu der obigen Lösung während eines Zeitraums von 15 Minuten zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Ethylacetat (100 ml, mit einem Gehalt von 1 % Triethylamin) wurde zugesetzt und die Lösung mit gesättigter NaCl- Lösung (2 x 100 ml) gewaschen. Die organische Schichte wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, um einen gummiartigen Rückstand zu liefern. Das Produkt wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc/Triethylamin (99/1, V/V) als Eluiermittel gereinigt. Vereinigung und Einengung der geeigneten Fraktionen lieferte einen weißen Schaum 1,41 g (66 %); ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 6,65 (m, 1, C&sub1;, H), 10,2 (brs, 1 NH) und andere Protonen.
Andere Arten von 6-Azapyrimidinen können ebenso unter Verwendung dieses Verfahrens synthetisiert werden, inklusive 6-Aza-2'-deoxycytidin (6-Aza-dC), 6-Aza-2'- deoxyuridin (6-Aza-dU), 6-Aza-5-methylcytidin (6-Aza-5-Methyl-C), 6-Aza-5-bromuridin (6-Aza-5-Brom-U), 5-Fluorcytidin (5-Fluor-C) und 5-Bromcytidin (5-Bromo-C). Zusätzlich dazu kann 5-Aza-uridin in ähnlicher Weise aus dem Ausgangsmaterial 1,3,5-Tnazin- 2,4(1H,3H)-dion (Sigma Chemical) synthetisiert werden.

BEISPIEL 2

Verfahren zur Umwandlung des 5- und/oder 6-modifizierten Thymin- und Cytosin-2'- deoxyribonucleosid-5'-DMT-3'-phosphoramidits in Oligonucleotide.

Tabelle 1 stellt das Protokoll für die Synthese von DNA auf CPG-Trägern dar. Vor der Synthese kann 5- und/oder 6-modifiziertes Thymin-, Cytosin-5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxyribonucleosid oder im wesentlichen jedes Nucleosid mit Modifikationen im Heterocyclus und/oder Zucker an das 5'-Hydroxyl von Nucleosiden, die an CPG-Träger gebunden sind, geknüpft werden, um ein solches modifiziertes Nucleosid genau an das 3'- Ende der Oligonucleotidsequenz zu binden.
Die modifizierten Thymine oder 2'-Deoxycytidine, die in der terminalen 3'-Position bestimmter Antisense-Oligonucleotide vorliegen, werden durch ihr 5'-DMT geschützt (die Cytosin 4-exocyclische Aminogruppe wird benzoyliert) und mit gemischtem Trifluoressigsäure/Bromessigsaure-Annhydrid in Pyridin und Dimethylaminopyridin bei 50ºC während 5 Stunden behandelt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf einen dünnen Sirup eingedampft, der in Ethylacetat gelöst und durch eine Silicagel-Säule hindurchgeschickt wird. Die homogenen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Eine Lösung von 10 ml Acetonitril, 10 Mikromolen des 3'-0-Brommethylester-modifizierten Pyrimidinnucleosids und 1 ml Pyridin/Dimethylaminopyridin (1:1) wird langsam (60 bis 90 sec) durch eine Mikromol-Säule von CPG-Thymidin (Applied Biosystems, Inc.), die vorher gemäß den Standardbedingungen mit Säure behandelt worden war, um die freie 5'- Hydroxylgruppe zu ergeben, mit einer Injektionsspritze eingegeben. Andere Nucleosid-gebundene CPG-Säulen können ebenso verwendet werden. Das Eluiermittel wird aufgefangen und neuerlich durch die Säule eingespritzt. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die CPG-Säule wird langsam mit 10 ml Acetonitril gewaschen und dann an einen ABI 380B Nucleinsäure-Synthesizer angeschlossen. Die Oligonucleotidsynthese gemäß der Beschreibung von Tabelle 1 wird nun begonnen. Die Standardbedingungen der Schutzgruppenentfernung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid, die die Tymidinesterbindung von dem CPG-Träger abspalten, spalten auch die 3',5'-Esterbindung, die das Pyrimidin-modifizierte Nucleosid mit dem Thymidin verbindet, das ursprünglich an das CPG-Nucleosid gebunden war.
Die DNA-Standardsynthese kann ebenfalls nach Tabelle 1 auf CPG LCAA unter Verwendung von 1-10 Mikromolen Nucleosid auf dem Träger vervollständigt werden. Polymer-gebundene Nucleoside wurden von Applied Biosystems, Inc. gekauft. Die Synthese wurde unter Verwendung eines automatischen Synthesizers (ABI 380B) mit einer kontinuierlichen Strömung (3,0 bis 3,5 ml/min) erreicht. Die Phosphoramidit-Kondensationen wurden unter trockenem Stickstoff vervollständigt. Nach Abschluß der Synthese wurde die Spaltung des Oligonucleotids und die Schutzgruppenentfernung durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55ºC während 24 Stunden vorgenommen. Die Reinheit und Größe der Endprodukte wurde durch elektrophoretische Analyse auf Polyacrylamidgelen bestätigt. TABELLE I Protokoll für die DNA-Synthese auf CPG-Trägern (Maßstab 1-10 Mikromole)
Die Synthesezyklen werden zu vier grundlegenden Schritten vereinigt: 1) Säurebehandlung zur Abtrennung der 5'-Dimethoxytrityl-Schutzgruppen; 2) Kondensation des Polymer-gebundenen Nucleosids mit einem Nucleosid-3'-Diisopropylphosphoramidit für DNA und 3) Oxidation unter Verwendung von Jod und Wasser in Acetonitril zur Umwandlung der Phosphitbindung in eine Phosphatbindung; und 4) Capping mit Essigsäureanhydrid und DMAP zur Blockierung unumgesetzter Stellen und zur Entfernung von restlicher Feuchtigkeit.
Nach dem Zusammenbau der gewünschten Sequenz durch den automatischen Synthesizer wurde das Endprodukt von dem Polymer abgespalten, die Schutzgruppen abgetrennt und das Produkt isoliert.
Die Abtrennung der Schutzgruppen erfolgte durch Behandlung des polymeren Trägers mit Ammoniumhydroxid (NH&sub4;OH) bei 55ºC während 20 Stunden. Das Rohmaterial wurde mit Trityl auf HPLC gereinigt. Detritylierung erfolgte mit 3 % Ethylacetat und anschließende Extraktionen mit Ethylacetat. Die Reinigung erfolgte durch Natriumchlorid/Ethanol-Ausfällung (2X) und HPLC. Alle oben gemischten Sequenzen wurden durch Kinasierung der Proben und Größenbestimmung derselben gekennzeichnet.

BEISPIEL 3

Die Synthese der unten aufgelisteten 6-Azathymin-modifizierten Oligonucleotide erfolgte gemäß Beispiel 2, wobei das Verfahren zum Anbinden des 5- und/oder 6-modifizierten Thymin- oder Cytosin-5'-dimethoxytriphenylmethyl-2'-deoxyribonucleosids an das 5'-Hydroxyl des an einen CPG-Träger gebundenen Nucleosids erfolgte. Die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 synthetisierten Phosphoramidite werden in die Oligonucleotide eingebaut, die die folgenden Sequenzen aufweisen, die wegen ihrer Nucleaseresistenz-Eigenschafien wertvoll sind. OLIGONUCLEOTIDE MIT 6-AZA-THYMIDIN (T') SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom
2 P der Phosphodiesterbindung wird in den Positionen 13,14 und 15 durch ein S ersetzt
3 Sequenz, ausgewählte aus den Papillom-Virus-Genomen
4 Sequenz, ausgewählt aus den Herpes Simplex-Virus-Genomen
6-Azacytidin-Substitutionen an den Positionen 2,3,9,10,15 und 19
6 Sequenz, die als ein Triplex besonders wirksam beflinden wurde

BEISPIEL 4

Die Synthese von 6-Azacytosin-modifizierten Oligonucleotiden, die weiter untenaufgelistet sind, erfolgt gemäß Beispiel 2, wobei ein Verfahren zur Umwandlung des 5- und/oder 6-modifizierten Thymin- und Cytosin-2'-deoxyribonucleosid-5-DMT-3'-Phosphoramidits in Oligonucleotide vorgesehen ist. Die Phosphoramidite, die nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren synthetisiert wurden, werden für Wildtyp-Basen der Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen substituiert, um die Nucleaseresistenz zu steigern. OLIGONUCLEOTIDE MIT 6-AZA-CYTIDIN-SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom
2 Sequenz, ausgewählt aus Papillom-Virus-Genomen
3 6-Azathymidin-Substitutionen an den Pos.8,12,14 und 17

VERGLEICHSBEISPIEL 5

Umwandlung von in 5- und/oder 6-Position modifizierten Thyminen in die entsprechenden Thymidine (Deoxyribosylierung).

Die Thymin-Analoga werden unter verschiedenen Standardbedingungen trimethylsilyliert, wie etwa mit Hexamethyldisilazan (HMDS) und einem sauren Katalysator (d.h. Ammoniumchlorid) und werden dann mit 3,5-0-Ditoluoyl-2-deoxy- -D-erythro-pentofuranosylchlorid in Anwesenheit von unterschiedlichen Lewis-Säure-Kata[ysatoren (d.h. Zinn(IV)-Chlorid, Jod, Bortetrafluorborat, etc.) behandelt. Ein spezielles Verfahren wurde in letzter Zeit beschrieben von 3. N. Freskos, Nucleosides & Nucleotides, 8:1075-1076 (1989), wobei Kupfer (I) Jodid der verwendete Katalysator ist.

BEISPIEL 6

Synthese von 6-Aza-5-brom-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin, d.h. 6-Brom-2-(5'-0-[dimethoxytriphenylmethyl]- 3-0-[β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl]-2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)- 1,2,4-triazin-3,5-(2H,4H)-dion.

Der erforderliche Heterocyclus, 6-Brom-1,2,3-triazin-3,5(2H,4H)-dion, wurde gemäß C. Cristescu, Rev. Roumaine Chim. 20:1287 (1975) hergestellt. Deoxyribosylierung dieses Materials und anschließende DMT- und Amidit-Chemie wird nach den in den Beispielen 1, 2 und 5 angegebenen Verfahrensweisen durchgeführt.

VERGLEICHSBEISPIEL 7

Umwandlung der in 5- und/oder 6-Position modifizierten Thymidine in die entsprechenden 2'-Deoxycytidine (chemische Umwandlung einer 4-Ketogruppe vom Pyrimidin-Typ in eine 4-Aminogruppe).

Die 3',5'-Zucker-Hydroxylgruppen der modifizierten Thymidine werden durch Acylgruppen geschützt, wie etwa durch Toluoyl, Benzoyl, p-Nitrobenzoyl, Acetyl, Isobutyl, Trifluoracetyl, etc., wobei die Standardbedingungen der Säurechloride oder Anhydride und das Lösungsmittel Pyridin/Dimethylaminopyridin sowie Katalysatoren verwendet wurden. Das geschützte Nucleosid wird mit Thionylchlorid oder Phosphorylchlorid in Pyridin oder anderen geeigneten basischen Lösungsmitteln chloriert. Die 4-Chlorgruppen vom Pyrimidin-Typ werden als nächstes mit Ammonium in Methanol verdrängt. Abspaltung der Schutzgruppen der Zucker-Hydroxylgruppen findet ebenfalls statt. Die Aminogruppe wird nach dem zweistufigen Standardverfahren der kompletten Benzylierung (Zuckerhydroxylgruppen und Aminogruppen) benzoyliert und die Acylgruppen werden selektiv durch wasserige Natriumhydroxid-Lösung abgespalten. Andererseits kann das in situ-Verfahren mit der zuerst erfolgten Behandlung des Nucleosids mit Chlortrimethylsilan und Base zum Schutz der Zucker-Hydroxylgruppen vor anschließender Acylierung vorgenommen werden. Ein anderer Versuch der Umwandlung besteht im Ersatz der 4-Chlorgruppe vom Pyrimidintyp durch eine 1,2,4-Triazologruppe, die über die ganze Oligonucleotidsynthese am DNA-Synthesizer hinweg intakt bleibt und während des Ammoniumhydroxid-Schritts durch Ammonium verdrängt wird, wobei das Oligonucleotid von dem CPG-Träger abgespalten wird und Entfernung der Schutzgruppen von den Heterocyclen erfolgt. Außerdem kann in vielen Fällen die 4-Chlorgruppe des Pyrimidintyps wie oben beschrieben verwendet und am Ende der Oligonucleotidsynthese ersetzt werden. 5-Azacytidin und 5-Nitro-cytidin können dementsprechend aus ihren Uridin-Analoga erhalten werden. In gleicher Weise wird 4-Chlor-5-methylmercaptocytidin gemäß dieser Beschreibung synthetisiert.

VERGLEICHSBEISPIEL 8

Synthese von 6-Aza-5-brom-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxycytidin, d.h. 5-Amino-6-brom-2-(5'-0-dimethoxytriphenylmethyl-3'-0-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl-2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1,2,4-triazin-3(2H)-on.

Dieses Monomer wird durch Umwandlung des deoxyribosylierten 6-Brom-1,2,3-triazin-3,5(2H,4H)-dions (gemäß Beispiel 7) in das 2'-Deoxycytidin-Analogon gemäß Beispiel 5 hergestellt.

BEISPIEL 9

1. Synthese von 5-Trifluoro-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin, d.h., 1-(5'-[4,4'-Dimethoxytrityl]-2'-deoxy-β-D- erythro-pentofuranosyl)5,5,5-trifluorthymin.

Trifluorthymidin (1, 2,0 g), (gekauft von PCR, Inc., Gainsville, FL) wurde zweimal gleichzeitig mit Pyridin eingedampft und dann in wasserfreiem Pyridin (100 ml) unter Argon-Atmosphäre aufgelöst. 4,4'-Dimethylaminopyridin (50 mg) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (2,74 g) wurden nacheinander zu der Lösung zugesetzt, die dann bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde mit 100 ml Wasser behandelt und dann mehrfach mit Diethylether (4 x 100 ml) extrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann im Vakuum eingedampft, um einen orangefarbenen Gummi zu liefern. Dieser Gummi wurde gemeinsam mit Toluol (3 x 25 ml) eingedampft und dann auf 120 g Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexanen/Triethylamin (49/49/2, v/v) als Eluiermittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, um 0,77 g (19 %) eines festen Schaums zu ergeben. 'H-NMR (DMSO-d6) δ 8,05 (s, 1H, H-6); 7,4-6,7 (2m, 13H, aromatisch); 6,05 (t, 1H, H-1').

2. Synthese von 1-(5'-[4,4'-Dimethoxytrityl]-2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)- 5,5,5-trifluorthymin-3'-0-N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl-phosphoramidit (3).

Zu einer gerührten Lösung von 5-Trifluor-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β- cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin, d.h.. 1-(5'-[4,4'-Dimethoxytrityl]- 2'-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5,5,5-trifluorthymin (2) (0,70 g, 1,2 mMol) in wasserfreiem THF. wurde Diisopropylethylamin (1,0 ml) unter Argon-Atmosphäre zugesetzt. Zu dieser Lösung wurde N,N-Diisopropylcyanoethylphosphoramidchlorid (0,33 ml, 1,44 mMol) tropfenweise während eines Zeitraums von 5 Minuten zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluß dieser Zeit wurde die Reaktionsmischung im Vakuum zur Trockene eingedampft und der entstehende gummiartige Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (75 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO&sub3; (2 X 35 ml) und Salzlösung (35 ml) gewaschen. Die organische Schichte wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft, um einen farblosen Gummi zu ergeben. Dieses Material wurde auf 60 g Silicagel unter Verwendung von CHCl&sub3;/Triethylamin (99/1, v/v) als Eluiermittel chromatographiert. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, um einen farblosen Schaum zu liefern (0,6 g, 67 %). 'H-NMR DMSO-d6): δ 8,15 (s, 1H, H-6); 7,4-6,8 (1m, 13H, aromatisch); 6,05 (t, 1H, H-1'). Dieses Phosphoramidit kann anschließend gemäß dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren in Oligonucleotide eingebaut werden. Einige Beispiele folgen. OLIGONUCLEOTIDE MIT 5-TRIFLUORMETHYL-2'-DEOXYURIDINSUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom
2 Sequenz, ausgewählt aus Papillom-Virus-Genomen
3 Sequenz, ausgewählt aus Herpes Simplex-Virus-Genomen

BEISPIEL 10

5-Fluor-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin wurde von Glen Research Corporation gekauft. Diese Substanz wurde vorher in Oligonucleotide eingesetzt. J. F. Habener et al., Proceedings of the NationaL Academy of Sciences of ihe USA, 85:1735-1739 (1988). Manche Beispiele sind unten aufgelistet. OLIGONUCLEOTIDE MIT 5-FLUOR-2'-DEOXYURIDIN-SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom

BEISPIEL 11

5-Brom-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin, das von Glen Research Corporation gekauff worden war, wurde während der Synthese gemäß dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren in Oligonucleotidsequenzen eingebaut. OLIGONUCLEOTIDE MIT 5'-BROM-2'-DEOXYURIDIN-SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom

BEISPIEL 12

Die Synthese von 5-Brom-2'-deoxycytidin-modifizierten Oligonucleotiden, die unten aufgelistet sind, erfolgte gemäß dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren. OLIGONUCLEOTIDE MIT 5-BROM-2'-DEOXYCYTLDIN (C')-SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom

BEISPIEL 13

Die Synthese von 5-Methyl-2'-deoxycytidin-modifizierten Oligonucleotiden, die unten angegeben sind, wurde gemäß dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren durchgeführt, wobei 5-Methyl-2'-deoxycytidin (Glen Research Corporation) anstelle der Wildtyp-Cytidinbasen verwendet wurde. OLIGONUCLEOTIDE MIT 5-METHYL-2'-DEOXYCYTIDIN (C')- SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom

BEISPIEL 14

Die Synthese von 5-Jod-2'-deoxyuridin-modifizierten Oligonucleotiden, die unten aufgelistet sind, erfolgte nach dem in Beispiel 2 dargelegten Verfahren durch Ersatz der Wildtyp-Uridinbasen durch 5-Jod-2'-deoxyuridin (Glen Research Corporation). OLIGONUCLEOTIDE MIT 5-JOD-2'-DEOXYURIDIN-SUBSTITUTIONEN
1 Sequenz, ausgewählt aus dem 5 Lipoxygenase-Genom

BEISPIEL 15

Die Synthese von S-Jod-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxycytidin) erfolgte unter Anwendung der in den Beispielen 2 und 7 dargelegten Verfahren.

BEISPIEL 16

Synthese von S-Chlor-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin.

5-Chloruracil ist im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Company. Dieses Material wird in das Titel-Phosphoramidit gemäß den in den Beispielen 1, 2 und 5 dargelegten Verfahren umgewandelt.

BEISPIEL 17

Die Synthese von 5-Chlor-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxycytidin) erfolgt nach den in den Beispielen 2 und 7 dargelegten Verfahren.

BEISPIEL 18

Synthese von 5-Nitro-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidityl)-2'-deoxyuridin.

5-Nitrouracil ist im Handel erhältlich von Aldrich Chemical Company. Dieses Material wird in das Titel-Phosphoramidit gemäß den Beispielen 1, 2 und 5 umgewandelt.

BEISPIEL 19

Synthese von 5-(2,4-Dinitrophenylmercapto-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β- cyanoethyldiisopropylarninophosphinyl)-2'-deoxyuridin.

Das 5-Mercapto-2'-deoxyuridin, das nach dem Verfahren von Fox et al., Journal of the American Chemical Society 81:178 (1959) erhalten wurde, wird durch Behandlung mit einem Äquivalent Natriumhydrid und 2,4-Dinitrophenylfluorid in das 2,4-Dinitrophenylsulfinyl-Derivat umgewandelt. Dieses Material wird seinerseits in das 5'-DMT-3'-phosphoramidit gemäß der in Beispiel 1 dargelegten Verfahrensbeschreibung umgewandelt.

VERGLEICHSBEISPIEL 20

Synthese von 4-Chlor-5-(2,4-dinitrophenylmercapto)-5'-0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0- (b-cyanoethyldiisopropylaminophosphinyl)-2'-deoxycytidin.

Das 5-Mercapto-2'-deoxyuridin, das nach dem Verfahren von Fox et al., Journal of the American Chemical Society 81:178 (1959) erhalten wurde, wird durch Behandlung mit einem Äquivalent Natriumhydrid und 2,4-Dinitrophenylfluorid in das 2,4-Dinitrophenylsulfinyl-Derivat umgewandelt. Dieses Material wird nach der Beschreibung von Beispiel 1 und 5 acetyliert, chloriert und in das 5'-DMT-3'-phosphoramidit umgewandelt.

VERGLEICHSBEISPIEL 21

Synthese von S-Methylmercapto-5-'0-(dimethoxytriphenylmethyl)-3'-0-(β-cyanoethyldiisopropylaminophosphiyl)-2'-deoxyuridin.

Das 5-Mercapto-2'-deoxyuridin, das nach den dem Vefahren von Fox et al., Journal of the American Chemical Society 81:178 (1959) erhalten wurde, wird durch Behandlung mit einem Äquivalent Natriumhydrid und Methyljodid in das Methylderivat umgewandelt. Diese Substanz wird nach der Beschreibung der in Beispiel 1 dargelegten Verfahrensweise in das 5'-DMT-3'-phosphoramidit umgewandelt.

BEISPIEL 22

Die Fähigkeit von Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotiden zur Hybridisierung an ihre komplementären RNA- oder DNA-Sequenzen wurde durch thermische Schmelzanalyse bestimmt. Das RNA-Komplement wurde aus T7 RNA-Polynnerase und einem Templat-Promotor von DNA, der mit einem Synthesizer von Applied Biosystems, Inc., 380B synthetisiert worden war, synthetisiert. Die RNA-Spezies wurde durch Ionentausch unter Verwendung von FPLC (LKB Pharmacia, Inc.) gereinigt. Es wurden entweder natürliche Antisense-Oligonucleotide oder solche, die Pyrimidin-Modifikationen an speziellen Stellen enthielten, entweder an das RNA- oder DNA-Komplement mit stöchiometrischen Konzentrationen zugesetzt und es wurde der Durchlaßgrad der Hyperchromie (260 nm) beim Übergang von Duplex zu zufälliger Spirale unter Verwendung eines Gilford Response II Spektrofotometers überwacht. Diese Messungen wurden in einem Puffer von 10 mMol Na-Phosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA und NACl vorgenommen, um eine Ionenstärke von 10 entweder bei 0,1 M oder 1,0 M zu erhalten. Die Daten wurden durch eine grafische Darstellung von 1/TM gegen 1n[Ct] analysiert, wobei [Ct] die Gesamtkonzentration des Oligonucleotids ist. Aus dieser Analyse wurden die thermodynamischen Parameter bestimmt. Die Ergebnisse ausgewählter Tests sind in Tabelle II gezeigt. TABELLE II SCHMELZTEMPERATUR (TM) DATEN VON MODIFIZIERTEN OLIGONUCLEOTIDEN 5' TCC AGG TGT CGG CAT C 3' Position 1 bis 16 abgelesen von 5' nach 3'
Basierend auf der gewonnenen Information, die die Stabilität des Duplex des gebildeten Heteroduplex betrifft, wurde die Plazierung des modifizierten Pyrimidins in die Oligonudeotide hinsichtlich deren Wirkung auf die Stabilität der Helix bestimmt. Modifikationen, die die Stabilität des Hybrids drastisch verändern, zeigen Verminderungen der freien Energie (Delta G) und es wurden Entscheidungen hinsichtlich ihrer Brauchbarkeit als Antisense-Oligonucleotide gemacht. Repräsentative Studien solcher Stabilitäten sind in Tabelle III gezeigt. TABELLE III WIRKUNGEN DER PYRIMIDIN-MODIFIKATIONEN AUF DIE DUPLEXSTABILITÄT UND SPEZIFITÄT
Die Fähigkeit der Pyrimidin-modifizierten Antisense-Oligonucleotide zur Hybridisierung mit Spezifität hinsichtlich der Ziel-mRNA wurde durch Northem Blot Analyse der gereinigten Ziel-mRNA in Anwesenheit von gesamtzellulärer RNA gezeigt. Die ZielmRNA wurde aus einem Vektor synthetisiert, der die cDNA iür die Ziel-mRNA stromabwärts eines T7 RNA Polymerase-Promotors enthält. Die synthetisierte mRNA wurde auf einem Agarosegel elektrophoretisch untersucht und auf eine geeignete Trägermembran (d.h. Nitrozellulose) übertragen. Die Trägermembran wurde blockiert und unter Verwendung von [³²P]-markierten Antisense-Oligonucleotiden sondiert.
Die Schärfe wurde durch Replikat-Blots und Waschen bei entweder erhöhten Temperaturen oder verminderter Ionenstärke des Waschpuffers bestimmt. Es wurde mit Autoradiografie gearbeitet, um das Auftreten von Heteroduplex-Bildung festzustellen und das Autoradiogramm wurde quantitativ mit einem Laser-Densitometer (LKB Pharmacia, Inc.) bestimmt.
Die Schärfe der Hybridbildung wurde durch Isolierung der gesamten zellulären RNA nach Standardverfahren und deren Analyse durch Agarose-Elektrophorese, Membrantransfer und Sondierung mit markierten Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotiden bestimmt. Für die unmodifizierten Antisense-Oligonucleotide wurde die Schärfe vorherbestimmt und solche Bedingungen verwendet, daß nur die spezifisch angepeilte mRNA imstande war, einen Heteroduplex mit dem Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotid zu bilden.

BEISPIEL 23

Natürliche, Phosphorthioat- und Pyrimidin-modifizierte Oligonucleotide wurden auf ihre Resistenz gegenüber Serumnucleasen durch Inkubation der Oligonucleotide in Medien, die verschiedene Konzentrationen von fetalem Kalbsserum (FCS) oder humanem Erwachsenenserum enthielten, umtersucht. Die markierten Oligonucleotide wurden während unterschiedlicher Zeiträume inkubiert, mit Protease K behandelt und dann durch Gel-Elektrophorese auf 20%igen denaturierenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen und anschließende Autoradiografie analysiert. Die Autoradiogramme wurden durch Laser-Densitometrie quantitativ erfaßt. Basierend auf der Stelle der Modifikationen und der bekannten Länge des Oligonucleotids war es möglich, die Wirkung auf den Nucleaseabbau durch die spezielle Pyrimidin-Modifikation festzustellen. Für die cytoplasmischen Nucleasen wurde eine HL60 Zell-Linie verwendet. Es wurde ein post-mitochondrialer Überstand durch differentielle Zentrifugierung hergestellt und die markierten Oligonucleotide wurden in diesem Überstand verschieden lang inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Oligonucleotide auf Abbau untersucht, wie oben für den serumnucleolytischen Abbau dargelegt wurde. Die Autoradiografie-Resultate wurden zum Vergleich mit den unmodifizierten, den Phosphorthioat- und den Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotiden quantitativ erfaßt.
Eine Bewertung der Resistenz gegenüber spezifischen Nucleasen (d.h. Endonucleasen, 3',5'-Exo- und 5',3'-Exonucleasen) von natürlichen und Pyrimidin-modifizierten Oligonucleotiden erfolgte zur Bestimmung der genauen Wirkung der Modifikationen auf den Abbau. Die modifizierten Oligonucleotide wurden in definierten Reaktionspuffern, die für verschiedene ausgewählte Nucleasen spezifisch sind, inkubiert. Im Anschluß an die Behandlung der Produkte mit Proteinase K wurde Harnstoff zugesetzt und es erfolgte eine Analyse auf 20%igen Polyacrylamid-Gelen, die Harnstoff enthielten. Die Gelprodukte wurden durch Färben mit Stains All (Sigma Chemical Co.) sichtbar gemacht. Zur quantitativen Bestimmung des Ausmaßes des Abbaus wurde Laser-Densitometrie verwendet. Die Wirkungen der Pyrimidin-Modifikationen wurden für spezielle Nucleasen bestimmt und mit den Ergebnissen verglichen, die aus den Serum- und cytoplasmischen Systemen erhalten worden waren.
Bei einem solchen Test wurden etwa 1 mg/ml modifizierte Pyrimidin-tragende Oligonucleotide bei 37ºC in DMEM, das mit 10 % hitzeaktiviertem FCS ergänzt war, inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden aliquote Anteile entnommen und in einem gleichen Volumen von 9M Harnstoff/1x TBE-Puffer gemischt und bei -20ºC eingefroren. Die Proben wurden durch Polyacrylamid-Elektrophorese (20 % PA/7M Harnstoff) analysiert und durch Stains A11 Reagens sichtbar gemacht und mit einem LKB-Laser-Densitometer der quantitativen Analyse unterzogen. Es erfolgten Integrationen der Peaks, die das Oligonucleotid der vollen Länge und das n-1 Oligonucleotid darstellten. Die % Abbau wurden für jeden Zeitpunkt durch Vergleich mit dem Zeitpunkt 0 der Probe berechnet. Die Daten wurden grafisch dargestellt und die grafischen Abschätzungen für T1/2 des modifizierten Oligonucleotids erfolgten durch Vergleich mit dem natürlichen unmodifizierten Oligonucleotid. Bei Verwendung von 6-Aza-T enthaltendem Oligonucleotid stellte sich heraus, daß dieses 6-Aza-T modifizierte Oligonucleotid eine größere Stabilität gegenüber nucleolytischem Abbau zeigte. Für die 6-Aza-T Verbindungen ergab ein Anstieg der Anzahl der Modifikationen eine gesteigerte Stabilität gegenüber dem Abbau in FCS. Außerdem wurden die besten Ergebnisse dann erhalten, wenn 6-Aza-T als eine 3'-Terminus-Kappe verwendet wurde. Ein Oligonucleotid, das eine derartige 3'-Terminus-Kappe enthält, lieferte Schutz vor dem 3'-5' exonucleolytischen Abbau im Vergleich zu einem natürlichen Oligonucleotid. T1/2 stieg von 20 Minuten für ein natürliches Oligonucleotid auf ein T1/2 von 4 Stunden für das modifizierte Oligonucleotid. Das bedeutete eine 12-fache Abnahme der Empfindlichkeit des Oligonucleotids gegenüber dem Abbau in Anwesenheit von FCS. Die Ergebnisse dieses Tests deuten darauf hin, daß FCS, welches dafür bekannt ist, daß es natürliche unmodifizierte Oligonucleotide vom 3'-Ende her hydrolysiert, einen Block von drei 6-Aza-T nicht als ein geeignetes Substrat erkennt. Ein derartiger Mangel an Erkennung setzt die Hydrolyse des modifizierten Oligonucleotids beträchtlich herab.

BEISPIEL 24

Ribonuclease H Aktivität

Die Spaltung der Ziel-mRNA durch RNase H steigert deutlich die inhibitorischen Wirkungen der Antisense-Oligonucleotide. Es wird derzeit angenommen, daß die E. Coli RNase H nur 3 bis 4 Bindungsstellen unmodifizierter Reste an dem DNA-Abschnitt des DNA-RNA Heteroduplex erfordert, um Spaltung der RNA hervorzurufen. Für diesen Test wurde ein Antisense-Oligonucleotid gegen 5LO mRNA (5'-AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C-3'), bei dem 6-Aza T jedes T-Nucleotid ersetzt, für die Untersuchung mit RNase H verwendet. In dem Test-Oligonucleotid waren die mit 6-Aza-T modifizierten Positionen jeweils durch nicht mehr als zwei natürliche Basen getrennt - somit sollte das Oligonucleotid Erkennung durch E. Coli RNase H zeigen. Eine natürliche komplementäre DNA (5'AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C-3') wurde zum Vergleich synthetsiert. Die 5-LO mRNA (2,5kb) wurde in vitro synthetisiert. Die natürliche DNA (AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C) und das 6-Aza-T enthaltende modifizierte Oligonucleotid (AAA TAG TGT TGC TGA TCT TGA C), die beide eine Antisense-DNA für 5-LO mRNA waren, wurden durch automatisierte DNA-Synthese synthetisiert. Die mRNA wurde 30 min bei 60ºC in Anwesenheit eines 3-fachen molaren Überschußes jeweils des natürlichen und des modifizierten Oligonucleotids erhitzt, wobei das natürliche Oligonucleotid als Vergleich diente. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Lösungen langsam auf 37ºC abgekühlt und RNase H (E. Coli) wurde zugesetzt. Die mit RNase H behandelten Lösungen wurden bei 37ºC 30 min stehengelassen. Die Abbauprodukte wurden durch 1,2 % Agarose/Formaldehyd Elektrophorese analysiert und zur quantitativen Erfassung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, daß RNase H (E Coli) imstande war, mRNA, die entweder an natürliche oder modifizierte 6-Aza-T enthaltende DNA gebunden war, mit gleicher Wirksamkeit zu erkennen und zu spalten.

Claims

1. Eine Verbindung, die eine Vielzahl kovalent gebundener Nucleosid-Einheiten umfaßt, welche jeweils einen Ribose- oder Deoxyribosezucker-Abschnitt und einen Basen- Abschnitt umfassen, worin:

eine Vielzahl von Basen-Abschnitten Pyrimidinbasen sind; und

mindestens eine der genannten Pyrimidinbasen eine modifizierte Pyrimidinbase mit der Struktur

ist, worin X = OH oder NH&sub2;,

B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

C-Niedrigalkyl, N, C-CF&sub3;, C-F, C-Cl, C-Br, C-I, C-Halocarbon, C-NO&sub2;, C-OCF&sub3;, C-SH, C-SCH&sub3;, C-OH, C-O-Niedrigalkyl, C-CH&sub2;OH, C-CH&sub2;SH, C-CH&sub2;SCH&sub3;, C-CH&sub2;OCH&sub3;, C-NH&sub2;, C-CH&sub2;NH&sub2;, C-Alkyl-NH&sub2;, C-Benzyl, C-Aryl, C-substituiertes Aryl oder Benzyl;

A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C-H, C-CH&sub3;, N, C-CF&sub3;, C-CI, C-Br, C-I, C-Halocarbon, C-NO&sub2;, C-OCF&sub3;, C-SH, C-SCH&sub3;, C-OH, C-O-Niedrigalkyl, C-CH&sub2;OH, C-CH&sub2;SH, C-CH&sub2;SCH&sub3;, C-CH&sub2;OCH&sub3;, C-NH&sub2;, C-CH&sub2;NH&sub2;, C-Benzyl, C-Aryl, C- substituiertes Aryl oder Benzyl und einem Carbozyklus oder Heterozyklus, der über A und B fusioniert ist; oder A und B gemeinsam Teil eines carbozyklischen oder heterozyklischen Rings sind, der über A und B an den Pyrimidinring fusioniert ist;

mit der Maßgabe, daß die Verbindung kein Copolyribonucleotid ist, das nur Undylsäure und 6-Azacytidilsäure enthält.

2. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher A C-O-Niedrigalkyl, C-OH, C- Phenyl, C-Benzyl, C-NO&sub2;, C-SH, C-Halocarbon oder C-Halogen bedeutet.

3. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher B C-Niedrigalkyl, C-O-Niedrigalkyl, C-OH, C-Phenyl, C-Benzyl, C-NO&sub2;, C-SH, C-Halocarbon oder C-Halogen bedeutet.

4. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens eines von A und B für C-Halogen oder C-Halocarbon steht.

5. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens eines von A und B für Stickstoff steht.

6. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens eines von A und B für C-CH&sub3; oder C-CF&sub3; steht.

7. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher A für C-CH&sub3; oder C-CF&sub3; und B für Stickstoff steht.

8. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher A für C-Br und B für Stickstoff steht.

9. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher die genannte modifizierte Pyrimidinbase an einem 3'- oder 5'-Ende der genannten Verbindung steht.

10. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher das genannte modifizierte Pyrimidin an einem 3'-Ende der genannten Verbindung steht.

11. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher bis zu etwa 3 modifizierte Pyrimidine an einem 3'-Ende der genannten Verbindung eingebaut sind.

12. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens etwa 1 % der genannten Pyrimidinbasen die genannten modifizierten Pyrimidinbasen sind.

13. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens etwa 10 % der genannten Pyrimidinbasen die genannten modifizierten Pyrimidinbasen sind.

14. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens etwa 25 % der genannten Pyrimidinbasen die genannten modifizierten Pyrimidinbasen sind.

15. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher mindestens etwa 50 % der genannten Pyrimidinbasen die genannten modifizierten Pyrimidinbasen sind.

16. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher im wesentlichen alle genannten Pyrimidinbasen die genannten modifizierten Pyrimidinbasen sind.

17. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher die Zuckergruppierung des Pyrimidins Ribose oder Deoxyribose ist.

18. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher die genannten Nucleosid-Einheiten über Phosphorothioat, Methylphosphonat oder Phosphatalkylat gebunden sind.

19. Die Verbindung nach Anspruch 1, in welcher die genannten Nucleosid-Einheiten über eine Kohlenstoff- oder Etherbindung gebunden sind.

20. Die Verbindung nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verwendbaren Träger.

21. Die Verbindung nach Anspruch 1, welche verbesserte Nuclease-Resistenz im Vergleich zu entsprechenden natürlichen Oligonucleotiden aufweist.

22. Eine Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Therapie.

23. Die Verbindung nach Anspruch 22 zur Verwendung bei der Modulation der Produktion eines Proteins durch einen Organismus.

24. Die Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 23 bei der Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Hybridisierung mit einer für ein Protein codierenden Nucleinsäuresequenz befähigt ist, zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit, gekennzeichnet durch die unerwünschte Produktion des Proteins.