[go: up one dir, main page]

DE69133511T2 - Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression - Google Patents

Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression Download PDF

Info

Publication number
DE69133511T2
DE69133511T2 DE69133511T DE69133511T DE69133511T2 DE 69133511 T2 DE69133511 T2 DE 69133511T2 DE 69133511 T DE69133511 T DE 69133511T DE 69133511 T DE69133511 T DE 69133511T DE 69133511 T2 DE69133511 T2 DE 69133511T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
oligonucleotide
deoxy
oligonucleotides
rna
analogue according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Revoked
Application number
DE69133511T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69133511D1 (de
Inventor
Dan Philip Carlsbad COOK
Mamoto Andrew Carlsbad KAWASAKI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24265247&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69133511(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69133511D1 publication Critical patent/DE69133511D1/de
Publication of DE69133511T2 publication Critical patent/DE69133511T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Revoked legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon or a metal, e.g. chelates or vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J43/00—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J43/003—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not condensed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/333—Modified A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/336—Modified G
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3523—Allyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3531—Hydrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Diese Erfindung betrifft das Design, die Synthese und die Anwendung von Nuklease-beständigen Oligonukleotide, die für Antisense Oligonukleotid Therapeutika, Diagnostika und Forschungsreagenzien verwendbar sind. Es werden Zucker modifizierte Oligonukleotide bereitgestellt, die beständig gegenüber Nuklease Degradation sind, und die in der Lage sind, die Aktivität von DNA und RNA zu modulieren. Es werden auch Verfahren zum Modulieren der Erzeugung von Proteinen ex vivo bereitgestellt, die das erfindungsgemäße modifizierte Oligonukleotid verwenden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist gut bekannt, dass die meisten körperlichen Zustände in Säugetieren, einschließlich Zustände infektiöser Erkrankungen durch Proteine beeinflusst sind. Solche Proteine, die entweder direkt oder durch ihre enzymatischen Funktionen wirken, tragen zu großen Anteilen zu vielen Erkrankungen in Tieren und in Menschen bei.
  • Klassische Therapeutika haben sich für gewöhnlich auf Wechselwirkungen mit solchen Proteinen in Anstrengungen konzentriert, ihre erkrankungsverursachenden oder erkrankungsverstärkenden Funktionen zu mäßigen. Kürzlich wurden jedoch Versuche unternommen, die aktuelle Erzeugung solcher Proteine durch Wechselwirkungen mit Molekülen, die ihre Synthese steuern, der intrazellulären RNA, zu mäßigen. Durch das Eingreifen in die Erzeugung von Proteinen wurde gehofft, dass therapeutische Ergebnisse mit maximaler Wirkung und minimalen Nebenwirkungen bewirkt werden können. Ein Ansatz zum Inhibieren spezifischer Genexpression ist die Verwendung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga als Antisense Mittel.
  • Antisense Methodik ist die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonukleotiden an einzelsträngige mRNA oder einzelsträngige DNA, so dass die normalen essentiellen Funktionen dieser intrazellulären Nukleinsäuren zerstört werden. Hybridisierung ist die Sequenz spezifische Wasserstoffbindung von Oligonukleotiden an Watson-Crick Basenpaare von RNA oder einzelsträngiger DNA. Von solchen Basenpaaren wird angenommen, dass sie zueinander komplementär sind.
  • Es wird angenommen, dass das natürlich stattfindende Ereignis, das die Zerstörung der Nukleinsäure Funktion liefert, diskutiert von Cohen in Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1989), auf zwei Arten stattfindet. Die erste, Hybridisierungsarrest, bezeichnet das Terminationsereignis, in dem der Nukleotid Inhibitor an die Ziel Nukleinsäure bindet und dadurch, durch einfache sterische Hinderung, die Bindung von essentiellen Proteinen, am häufigsten Ribosomen, an die Nukleinsäure verhindert. Methylphosphonat Oligonukleotide; P.S. Miller & P.O.P. Ts'O, Anti-Cancer Drug Design, 2:117–128 (1987) und α-Anomer Oligonukleotide sind die zwei am intensivsten untersuchten Antisense Mittel, von denen angenommen wird, dass sie Nukleinsäure Funktion durch Hybridisierungsarrest zerstören.
  • Die zweite Art des Terminationsereignisses für Antisense Oligonukleotide schließt die enzymatische Spaltung der Ziel RNA durch intrazelluläre RNase H ein. Das Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon, das vom Desoxyribotyp sein muss, hybridisiert mit der Ziel RNA, und dieser Duplex aktiviert das RNase H Enzym, um den RNA Strang zu spalten, wodurch die normale Funktion der RNA zerstört wird. Phosphorthionat Oligonukleotide sind das bekannteste Beispiel eines Antisense Mittels, das durch diese Art von Antisense Terminationsereignis wirkt.
  • Beachtliche Forschung ist auf die Anwendung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga als Antisense Mittel für therapeutische Zwecke gerichtet. Uhlman und Payman, Chemical Reviews 90(4):543 (1990) haben Antisense Oligonukleotide und ihre Anwendung als therapeutische Mittel zusammengefasst. Alle Anwendungen von Oligonukleotiden als Diagnostika, Forschungsreagenzien und möglichen therapeutischen Mitteln erfordern, dass die Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga in großen Mengen synthetisiert, über Zellmembrane transportiert oder durch Zellen aufgenommen, in geeigneter Weise an Ziel RNA oder DNA hybridisieren und schließlich die Nukleinsäure Funktion terminiert oder zerstört werden. Diese kritischen Funktionen hängen von der anfänglichen Stabilität von Oligonukleotiden gegenüber Nuklease Degradation ab.
  • Eine ernsthafte Deffizienz von Oligonukleotiden für diese Zwecke, insbesondere Antisense Therapeutika, ist die enzymatische Degradation der verabreichten Oligonukleotide durch eine Vielzahl von ubiquitären nukleolytischen Enzymen, die intrazellulär und extrazellulär lokalisiert sind, die im Folgenden als "Nukleasen" bezeichnet werden. Es ist unwahrscheinlich, dass nicht modifizierte "Wildtyp" Oligonukleotide nützliche therapeutische Mittel sein werden, weil sie schnell durch Nukleasen degradiert werden. Deshalb ist die Modifikation von Oligonukleotiden, sie beständig gegenüber Nukleasen zu machen, gegenwärtig ein primärer Fokus der Antisense Forschung.
  • Modifikationen von Oligonukleotiden, um die Nuklease Beständigkeit zu verstärken, fanden bislang ausschließlich am Zuckerphosphat Rückgrat, insbesondere am Phosphoratom statt. Von Phosphorthionaten, Methylphosphonaten, Phosphorimidaten und Phosphortriestern (phosphatmethylierte DNA) wurde berichtet, dass sie verschiedene Beständigkeitsstufen gegenüber Nukleasen aufweisen. Während jedoch die Fähigkeit eines Antisense Oligonukleotids, spezifisch an DNA oder RNA mit Genauigkeit zu binden, fundamental in der Antisense Methodik ist, leiden modifizierte Phosphor Oligonukleotide, während sie verschiedene Grade von Nuklease Beständigkeit bereitstellen, an geringen Hybridisierungseigenschaften.
  • Die relative Fähigkeit eines Oligonukleotids an komplementäre Nukleinsäuren zu binden wird durch Bestimmen der Schmelztemperatur eines bestimmten Hybridisierungskomplexes verglichen. Die Schmelztemperatur (Tm), eine charakteristische physikalische Eigenschaft von Doppelhelizes, bezeichnet die Temperatur in Grad Celsius, bei der 50% helikale gegenüber gewundenen (nicht hybridisiert) Formen anwesend sind. Tm wird durch Verwendung des UV Spektrums gemessen, um die Bildung und den Zusammenbruch (Schmelzen) der Hybridisierung zu bestimmen. Basenstapelung, die während der Hybridisierung auftritt, wird von einer Verringerung in der UV Absorption (Hydrochromizität) begleitet. Folglich zeigt eine Verringerung in der UV Absorption einen höheren Tm an. Je höher der Tm ist, desto größer ist die Stärke der Bindung der Stränge. Nicht Watson-Crick Basenpaarung besitzt eine starke destabilisierende Wirkung auf den Tm. Folglich ist absolute Genauigkeit der Basenpaarung notwendig für eine optimale Bindung eines Antisense Oligonukleotids an seine Ziel RNA.
  • Oligonukleotide, die modifiziert sind, um Beständigkeit gegenüber Nukleasen zu zeigen, das RNase H Terminationsereignis zu aktivieren und mit geeigneter Stärke und Genauigkeit an ihre Ziel RNA (oder DNA) zu hybridisieren, sind für Antisense Oligonukleotid Therapeutika stark gewünscht.
  • M. Ikehara et al., European Journal of Biochemistry 139:447-450 (1984) berichten über die Synthese eines gemischten Octamers enthaltend eine 2'-Desoxy-2'-fluorguanosin Einheit oder eine 2'-Desoxy-2'-fluoradenin Einheit. W. Guschlbauer und K. Jankoswki, Nucleic Acid Res. 8:1421 (1980) haben gezeigt, dass der Beitrag der N Formen (3'-Endo, 2'-Exo) mit der Elektronegativität des 2'-Substituenten ansteigt. Somit enthält 2'-Desoxy-2'-fluoruridin 85% des C3'-Endo Konformers. M. Ikehara et al., Tetrahedron Letters 42:4073 (1979) haben ein lineares Verhältnis zwischen der Elektronegativität von 2'-Substituenten und der % N Konformation (3'-Endo-2'-Exo) einer Reihe von 2'-Desoxy-adenosinen gezeigt. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Research 5:1877 (1978) haben 2'-Desoxy-2'-fluor-adenosin in sein 5'-Diphosphat chemisch transformiert. Dieses wurde anschließend enzymatisch polymerisiert, um Poly(2'-Desoxy-2'-fluoradenylsäure) bereitzustellen.
  • Weiterhin wurde Beweis geliefert, der anzeigt, dass 2'-substituierte 2'-Desoxyadenosin Polynukleotide doppelsträngiger RNA anstelle von DNA gleichen. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Research 5:3315 (1978) zeigen, dass ein 2'-Fluorin Substituent in poly A, poly I und poly C, gebunden mit ihrem U, C oder I Komplement signifikant stabiler sind als die Ribo oder Desoxypoly Duplexe, wie durch Standardschmelzassays bestimmt wurde. M. Ikehara et al., Nucleic Acids Research 4:4249 (1978) zeigen, dass ein 2'-Chlor oder Brom Substituent in Poly(2'-Desoxy-adenylsäure) Nuklease Beständigkeit bereitstellt. F. Eckstein et al., Biochemistry 11:4336 (1972) zeigen, dass Poly(2'-Chlor-2'-desoxyuridylsäure) und Poly(2'-Chlor-2'-desoxycytidylsäure) gegenüber verschiedenen Nukleasen beständig sind. H. Inoue et al., Nucleic Acids Research 15:6131 (1987) beschreiben die Synthese von gemischten Oligonukleotid Sequenzen, die 2'-OMe in jeder Nukleotideinheit enthalten. Die gemischten 2-OMe substituierten Sequenzen hybridisieren mit ihrem Ribooligonukleotid Komplement (RNA) genauso stark wie der Ribo-Ribo Duplex (RNA-RNA), der signifikant stärker ist als der Ribo-Desoxyribo Heteroduplex mit gleicher Sequenz (Tms, 49,0 und 50,1 gegenüber 33,0 Grad für Nonamere). S. Shibahara et al., Nucleic Acids Research 17:239 (1989) beschreiben die Synthese von gemischten Oligonukleotid Sequenzen, die 2'-OMe in jeder Nukleotideinheit enthalten. Die gemischten 2'-OMe substituierten Sequenzen wurden entworfen, um HIV Replikation zu inhibieren. Die EP-A-O 339 842 offenbart 2'-modifizierte Oligonukleotide und ihre Anwendung als antivirale Mittel. Von den 2'-modifizierten Oligonukleotiden wird angenommen, dass sie die Proliferation des AIDS Virus inhibieren.
  • Es wird angenommen, dass die Verbindung der sterischen Wirkung der Hydroxylgruppe, seine Wasserstoff Bindungsfähigkeiten und seine Elektronegativität gegenüber den Eigenschaften des Wasserstoffatoms verantwortlich sind für die umfassenden strukturellen Unterschiede zwischen RNA und DNA. Thermische Schmelzstudien zeigen, dass die Größenordnung von Duplexstabiltität (Hybridisie rung) von 2'-Methoxy Oligonukleotiden in der Größenordnung von RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA liegt.
  • Die 2'-Desoxy-2'-halogen, azido, amino, methoxyhomopolymere von einigen natürlich vorkommenden Oligonukleosiden wurden durch Polymeraseverfahren hergestellt. Die benötigten 2'-modifizierten Nukleosid Monomere wurden in Oligonukleotide über Nukleinsäuren Synthetisiermaschinen eingebaut. Somit sind gemischte Sequenz (Sequenz spezifische) Oligonukleotide, die 2'-Modifikationen an jedem Zucker enthalten, mit Ausnahme von 2'-Desoxy-2'-Methoxyanaloga nicht bekannt. Jedoch beschreibt die WO 91/06556, die Stand der Technik unter Artikel 54 (3) EPÜ ist, Oligomere, die Substituenten an der 2' Position aufweisen.
  • ZIELE DER ERFINDUNG
  • Es ist ein prinzipielles Ziel der Erfindung, Nuklease-beständige, Zucker modifizierte Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga zur Verwendung in Antisense Oligonukleotid Diagnostika, Forschungsreagenzien und Therapeutika bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen, die beständig gegenüber Nuklease Degradation sind, aber welche die Aktivität von DNA und RNA modulieren, wie in Anspruch 1 definiert, bereitgestellt. Diese Zusammensetzungen weisen Zucker modifizierte Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga auf, deren Zielabschnitte spezifisch mit zuvor ausgewählten Nukleotidsequenzen von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA oder RNA hybridisierbar sind. Die Zucker modifizierten Oligonukleotide erkennen und bilden Doppelstränge mit einzelsträngiger DNA und RNA oder Tripletstränge mit doppelsträngiger DNA und RNA.
  • Die erfindungsgemäßen Nuklease-beständigen Oligonukleotide bestehen aus einem Einzelstrang aus Nukleinsäurebasen, die miteinander durch Verknüpfungs gruppen verknüpft sind. Der Zielabschnitt des Nuklease-beständigen Oligonukleotids kann in der Länge von ungefähr 5 bis ungefähr 50 Nukleinsäurebasen reichen. Jedoch ist in Übereinstimmung mit der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung eine Zielsequenz von ungefähr 15 Basen in der Länge optimal.
  • Die Nukleinsäurebasen können Pyrimidine, wie Thymin, Uracil oder Cytosin oder Purine, wie Guanin oder Adenin oder beides sein, die in einer spezifischen Sequenz angeordnet sind. Der Zuckerrest von solchen Basen kann vom Desoxyribose oder Ribosetyp sein. Die Gruppen, welche die Basen miteinander verknüpfen, kann das herkömmliche Zuckerphosphat Nukleinsäure Rückgrat sein, aber es kann auch als ein Phosphorthionat, Methylphosphonat oder Phosphat alkylierter Rest modifiziert sein, um die Zucker modifizierten Oligonukleotid Eigenschaften weiter zu verstärken, zusammen mit dem Entfernen einer 5'-Methylgruppe und/oder eines carbocyclischen Zuckers.
  • In Übereinstimmung mit dieser Erfindung, wie in Anspruch 1 definiert, ist der Zielabschnitt ein Analogon eines Oligonukleotids, wobei mindestens einer der 2'-Desoxyribofuranosyl Reste der Nukleotideinheit modifiziert ist. Zum Beispiel sind F, CN, CF3, OCF3, OCN, SOMe, SO2Me, ONO2, NO2, N3, NH2, OCH2CH=CH2 (Allyloxy) oder OCH=CH2, Allyloxy besonders bevorzugt.
  • Die resultierenden neuen Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga sind beständig gegenüber Nuklease Degradation und zeigen Hybridisierungseigenschaften von höherer Qualität im Vergleich zu Wildtyp (DNA-DNA und RNA-DNA) Duplizes und den Phosphor modifizierten Nukleotid Antisense Duplizes, die Phosphorthionate, Methylphosphonate, Phosphoramidate und Phosphortriester enthalten.
  • Die Erfindung ist auch auf ex vivo Verfahren zum Modulieren der Erzeugung eines Proteins durch einen Organismus gerichtet, das Inkontaktbringen des Organismus mit einer Zusammensetzung, die in Übereinstimmung mit den zuvor genannten Betrachtungen formuliert wurde, umfasst. Es ist bevorzugt, dass der RNA oder DNA Abschnitt, der moduliert werden soll, vorher ausgewählt wird, damit er den Abschnitt von DNA oder RNA umfasst, der für das Protein kodiert, dessen Bildung moduliert werden soll. Der Zielabschnitt der Zusammensetzung, die verwendet werden soll, wird somit ausgewählt, dass sie komplementär zu dem vorher ausgewählten Abschnitt von DNA oder RNA ist, was ein Antisense Oligonukleotid für diesen Abschnitt ist.
  • Diese Erfindung ist auch auf Verfahren zum Behandeln eines Organismus mit einer Erkrankung gerichtet, die durch die ungewünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren umfasst das Inkontaktbringen des Organismus mit einer Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den zuvor genannten Betrachtungen. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine, die entworfen wurde, um spezifisch an Boten RNA zu binden, die für das Protein kodiert, dessen Erzeugung inhibiert werden soll.
  • Die Erfindung ist weiterhin auf diagnostische Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von abnormalen RNA Molekülen oder abnormaler oder unzureichender Expression von normalen RNA Molekülen in Organismen oder Zellen gerichtet.
  • Die Erfindung ist auch auf Verfahren für die selektive Bindung von RNA für Forschungs- und diagnostische Zwecke gerichtet. Eine solche selektive, starke Bindung wird durch die Wechselwirkung solcher RNA oder DNA mit erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erreicht, die beständig gegenüber degradativen Nukleasen sind und stärker oder mit größerer Genauigkeit als irgendein anderes bekanntes Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon hybridisieren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Zusammensetzungen, die zum Modulieren der Aktivität eines RNA oder DNA Moleküls in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendbar sind, umfassen allgemein ein Zucker modifiziertes Oligonukleotid, das eine Zielsequenz enthält, die spezifisch mit einer vorher ausgewählten Nukleotidsequenz eines einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA oder RNA Moleküls hybridisierbar ist, und das Nuklease-beständig ist.
  • Es ist allgemein gewünscht, eine Sequenz von DNA oder RNA auszuwählen, die in die Erzeugung von Proteinen involviert ist, deren Synthese schließlich moduliert oder vollständig inhibiert werden soll. Der Zielabschnitt der Zusammensetzung ist allgemein ein Oligonukleotidanalogon. Es wird in geeigneter Weise durch Festphasensynthese bekannter Methodik synthetisiert, damit es komplementär ist zu oder mindestens spezifisch hybridisierbar ist mit der zuvor ausgewählten Nukleotidsequenz der RNA oder DNA. Nukleinsäure Synthetisiergeräte sind kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung wird allgemein vom Fachmann dahingehend verstanden, dass sie wirksam sind in der Bildung nahezu irgendeines Oligonukleotids von vernünftiger Länge, das gewünscht sein kann.
  • Im Rahmen dieser Erfindung betrifft der Begriff "Oligonukleotid" eine Vielzahl von verbundenen Nukleotideinheiten, die in einer spezifischen Sequenz aus natürlich vorkommenden Basen und Pentofuranosylgruppen, die miteinander durch eine Zuckergruppe durch native Phosphodiester Bindungen verbunden sind, gebildet wird. Diese Nukleotideinheiten können Nukleinsäure Basen, wie Guanin, Adenin, Cytosin, Thymin oder Uracil sein. Die Zuckergruppe kann Desoxyribose oder Ribose sein. Dieser Begriff betrifft sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Spezies, die aus natürlich vorkommenden Untereinheiten gebildet werden.
  • "Oligonukleotidanalogon", so wie der Begriff im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, betrifft die Einheiten, die ähnlich wie Oligonukleotide wirken, aber die nicht natürlich vorkommende Abschnitte aufweisen. Oligonukleotidanaloga können veränderte Zuckereinheiten oder Interzuckerverknüpfungen aufweisen, zum Beispiel Phosphorthionate oder andere Schwefel enthaltende Spezies, die zur Verwendung im Stand der Technik bekannt sind. Oligonukleotidanaloga können auch veränderte Baseneinheiten aufweisen, insbesondere solche Modifikatio nen, welche die Nuklease Beständigkeit der Oligonukleotid Zusammensetzung steigern kann, um die Antisense therapeutische, diagnostische oder Verwendung als Forschungsreagenz eines bestimmten Oligonukleotids zu steigern.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden im Wesentlichen nicht ionische, im Wesentlichen nicht chirale Einheiten anstelle von einigen oder allen der Phosphodiester Bindungen verwendet. Zu diesem Zweck sind kurzkettige Alkyl oder Cycloalkyl Strukturen, insbesondere C2-C4 Strukturen bevorzugt.
  • Der Zielabschnitt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind vorzugsweise Oligonukleotidanaloga mit 5 bis ungefähr 50 Baseneinheiten. Es ist weiter bevorzugt, dass solche Funktionalitäten von 8 bis ungefähr 40 Baseneinheiten aufweisen, und es ist noch weiter bevorzugt, dass von ungefähr 12 bis 20 Baseneinheiten verwendet werden. Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga mit ungefähr 15 Baseneinheiten sind für die Ausführung von bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
  • Es ist wünschenswert, dass der Zielabschnitt angepasst ist, so dass er spezifisch mit der zuvor ausgewählten Nukleotidsequenz der RNA oder DNA, die für das Modulieren ausgewählt ist, hybridisierbar ist. Die Oligonukleotidanaloga, die besonders für die Ausführung einer oder mehrerer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen 2'-Zucker modifizierte Oligonukleotide, wobei eine oder mehrere der 2'-Desoxyribofuranosyl Reste der Nukleosideinheit mit Halogen, Azido, Amino oder Thioalkoxy modifiziert ist. Zum Beispiel können die Substitutionen, die auftreten können, F, CN, CF3, OCF3, OCN, SOMe, SO2Me, ONO2, NO2, N3, NH2 oder OCH=CH2 einschließen.
  • Diese modifizierten Basen sind miteinander und mit dem Rest des Oligonukleotids oder des Oligonukleotidanalogons durch eine Zuckerverknüpfungsgruppe verknüpft. Die Verknüpfungsgruppe kann irgendeine der hier beschriebenen Strukturen sein, die in der Lage ist, Zuckerreste von Oligonukleotiden miteinander zu ver knüpfen, um den Zielabschnitt der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu bilden. Es ist bevorzugt, dass diese Zuckerverknüpfungsgruppen die Phosphodiester Struktur oder ein Derivat davon umfassen. Derivate der Phosphodiester Struktur können Substitutionen eines Schwefels, einer Alkoxygruppe, wie einer Methyl-, Methyloxy- oder Amingruppe gegen einen Sauerstoff einschließen. Das Zuckerphosphat Nukleinsäure Rückgrat kann als ein Phosphorthionat, Alkylphosphonat, wie Methylphosphonat oder Phosphat alkylierter Rest (ein Phosphotriester) modifiziert sein. Die Phosphodiester Verknüpfung kann auch durch eine Kohlenstoff- oder Etherverknüpfung ersetzt sein.
  • Diese Erfindung liefert Antisense Oligonukleotide, die durch überlegene Hybridisierungseigenschaften gekennzeichnet sind. Wir haben durch Strukturaktivitätsverhältnis Studien herausgefunden, dass ein signifikanter Anstieg in der Bindung (Tm)s von bestimmten 2'-Zucker modifizierten Oligonukleotiden an ihr RNA Ziel (Komplement) mit einem Anstieg der "A" Typ Konformation des Heteroduplex korreliert ist. Darüber hinaus wird die absolute Genauigkeit der modifizierten Oligonukleotide aufrechterhalten. Die gesteigerte Bindung unserer 2'-Zucker modifizierten sequenzspezifischen Oligonukleotide liefert überlegene Wirksamkeit und Spezifität, im Vergleich zu Phosphor modifizierten Antisense Oligonukleotiden, wie Methylphosphonaten, Phosphothionaten, Phosphattriestern und Phosphoramiditen, die in der Literatur bekannt sind.
  • Der einzige strukturelle Unterschied zwischen DNA und RNA Duplizes ist ein Wasserstoffatom in der 2'-Position der DNA Ribofuranosyl Reste gegenüber einer Hydroxylgruppe in der 2'-Position der RNA Ribofuranosyl Reste (es wird angenommen, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Methylgruppe in dem Uracil Ringsystem keine Wirkung hat). Jedoch bestehen starke konformationelle Unterschiede zwischen DNA und RNA Duplizes.
  • Es ist aus Röntgenbeugungsanalyse von Nukleinsäurefasern, Arnott und Hukins, Biochemical and Biophysical Research Communication, 47:1504–1510 (1970) und Analysen von Kristallen von doppelsträngigen Nukleinsäuren bekannt, dass DNA eine "B" Form Struktur einnimmt und dass RNA nur die sehr viel steifere "A" Form Struktur einnimmt. Der Unterschied zwischen der Zuckerfaltung (C2-Endo für "B" Form DNA und C3'-Endo für "A" Form RNA) der Nukleosid monomeren Einheiten von DNA und RNA ist der hauptkonformationelle Unterschied zwischen doppelsträngigen Nukleinsäuren.
  • Der Hauptbeitrag zu der Pentofuranosylrest Konformation ist die Natur des Substituenten in der 2'-Position. So steigt die Population der C3'-Endo Form bezüglich der 2'-Endo, wenn die Elektronegativität des 2'-Substituenten ansteigt. Zum Beispiel zeigt unter den 2'-Desoxy-2'-halogen-adenin Nukleosiden das 2'-Fluorderivat die größte Population (65%) von C3'-Endo, und die 2'-Iod zeigt die geringste (7%). Jene der Adenosin (2'-OH) und Desoxyadenosin (2'-H) betragen jeweils 36%). bzw. 19%. Darüber hinaus ist die Wirkung der 2'-Fluorgruppe von Adenindinukleotiden (2'-Desoxy-2'-fluoradenosin-2'-desoxy-2'-fluoradenosin oder -uridin) weiterhin mit der Stabilisierung der gestapelten Konformationen mehr korreliert als Ribo oder Desoxyribo modifizierte Dimere. Die Forschung zeigt, dass die Dinukleotidphosphate eine gestapelte Konformation mit einer Geometrie aufweisen, die ähnlich ist zu jener von A-A, aber mit einem größeren Ausmaß der Basen-Basen Überlappung als A-A. Es wurde angenommen, dass die hohe polare Natur der C2'-F Bindung und der extreme Vorzug für C3'-Endofaltung die gestapelte Konformation in einer "A" Struktur stabilisieren könnte.
  • Daten aus UV Hypochromizität, zirkulärem Dichromismus und 1H NMR zeigen auch, dass sich der Grad des Stapelns verringert, wenn sich die Elektronegativität von Halogen verringert. Darüber hinaus wird eine sterische Sperrigkeit in der 2'-Position besser in einer "A" Form Duplex als in einer "B" Form Duplex untergebracht.
  • Deshalb wird angenommen, dass ein 2'-Substituent an der 3'-Nukleotidyl Einheit eines Dinukleosid Monophosphats eine Anzahl von Wirkungen auf die gestapelte Konformation ausübt: sterische Repulsion, Furanosefaltungspräferenz, elektrostatische Repulsion, hydrophobe Anziehung und Wasserstoffbindungsfähigkeiten. Es wird angenommen, dass diese Substituentenwirkungen durch die molekulare Größe, Elektronegativität und Hydrophobizität des Substituenten bestimmt werden.
  • Die 2'-Iod substituierten Nukleoside besitzen die geringste C3'-Endo Population (7%) der Halogenreihe. Somit würde man aufgrund der sterischen Wirkungen alleine vorhersagen, dass 2'-Iod oder ähnliche Gruppen zu den destabilisierenden Eigenschaften durch Stapelung beitragen und somit die Bindung (Tm)s für Antisense Oligonukleotide verringern. Jedoch macht die niedrigere Elektronegativität und die höheren hydrophoben anziehenden Kräfte des Iodatoms und ähnlicher Gruppen die Fähigkeit, die Stapelungsstabilitäten und Bindungsstärken vorherzusagen, komplizierter.
  • Studien mit der 2'-OMe Modifikation von 2'-Desoxyguanosin, -cytidin und -uridin Dinukleosidphosphaten zeigen verstärkte Stapelungswirkungen bezüglich der korrespondierenden nicht methylierten Spezies (2'-OH). In diesem Fall tendieren die hydrophoben Anziehungskräfte der Methylgruppe dazu, die destabilisierende Wirkung ihrer sterischen Sperrigkeit (Hinderung) zu überwinden.
  • Es wurde bestimmt, dass 2'-Fluor-2'-desoxyadenosin eine ungewöhnlich hohe Population von 3'-Endo Faltung unter Nukleosiden aufweisen. Adenosin, 2'-Desoxyadenosin und andere Derivate weisen typischerweise Populationen unter 40% in dem 3'-Endo Konformer auf. Es ist bekannt, dass ein Nukleosid Rest in gut gestapelten Oligonukleotiden 3'-Endo Ribofuranosestapelung begünstigt.
  • Die Schmelztemperaturen (komplementäre Bindung) sind bei den 2'-substituierten Adenosindiphosphaten erhöht. Es ist nicht klar, ob die 3'-Endo Präferenz der Konformation oder die Anwesenheit des Substituenten für die erhöhte Bindung verantwortlich ist. Jedoch kann, wie angemerkt, eine größere Überlappung von benachbarten Basen (Stapelung) mit den 3'-Endo Konformationen erreicht werden.
  • Der vorliegende neue Ansatz, um stärkere Bindung zu erhalten, ist es Antisense RNA Imitatoren herzustellen, die an die Ziel RNA binden. Deshalb wurde ein zufälliger Struktur-Aktivitätsverhältnis Ansatz unternommen, um Nuklease-beständige Antisense Oligonukleotide zu enthüllen, die geeignete Hybridisierungseigenschaften behalten.
  • Eine Reihe von 2'-Desoxy-2'-modifizierten Nukleosiden von Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin und bestimmte Analoga dieser Basen wurden hergestellt und wurden als die modifizierten Nukleoside in Sequenz spezifische Oligonukleotide über Festphasen Nukleinsäure Synthese eingeführt. Die neuen Antisense Oligonukleotide wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, der Degradation durch Nukleasen zu widerstehen und Hybridisierungseigenschaften zu besitzen, die mit dem nicht modifizierten Ausgangsoligonukleotid vergleichbar sind. Zu Beginn wurden kleine elektronegative Atome oder Gruppen ausgewählt, weil es bei diesen Typen nicht wahrscheinlich ist, dass sie sterisch mit der benötigten Watson-Crick Basenpaar Wasserstoffbindung (Hybridisierung) interferieren. Jedoch können elektronische Änderungen aufgrund der Elektronegativität des Atoms oder der Gruppe in der 2'-Position tiefgreifend die Zuckerkonformation beeinflussen. Während unserer Struktur-Aktivitätsverhältnis Studien entdeckten wir, dass die Zucker modifizierten Oligonukleotide an die Ziel RNA stärker hybridisierten als die nicht modifizierten (2'-Desoxyribosyl Typ).
  • 2'-substituierte Oligonukleotide wurden durch das Standard Festphasen automatisierte Nukleinsäure Synthetisiergerät, wie den Applied Biosystems, Incorporated 380B oder MilliGen/Biosearch 7500 oder 8800 synthetisiert. Triester, Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonat Kopplungschemie (Oligonucleotides. Antisense Inhibitors of Gen Expression. M. Caruthers, S. 7–24, herausgegeben von J. S. Cohen, CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, 1989) wurden in diesen Synthetisiergeräten verwendet, um die gewünschten Oligonukleotide bereitzustellen. Das Beaucage Reagenz (Journal of American Chemical Society, 112, 1253–1255, 1990) oder elementarer Schwefel (S. Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859– 1852, 1981) wird mit Phosphoramidit oder Wasserstoffphosphonat Chemie verwendet, um 2'-subtituierte Phosphorthionat Oligonukleotide bereitzustellen.
  • Die erforderlichen 2'-substituierten Nukleoside (A, G, C, T(U) und Nukleinsäure Basenanaloga werden allgemein durch Modifikation von einigen Literaturverfahren, wie unten beschrieben, hergestellt.
  • Verfahren 1. Nukleophiler Austausch der 2'-Abgangsgruppe in Arabino Purin Nukleosiden. Nukleophiler Austausch einer Abgangsgruppe in der 2'-oben Position (2'-Desosy-2'-(Abgangsgruppe)arabinozucker) von Adenin oder Guanin oder ihren analogen Nukleosiden. Allgemeine Syntheseverfahren dieses Typs wurden beschrieben von M. Ikehara et al., Tetrahedron 34:1133–1138 (1978); ibid., 31:1369–1372 (1975); Chemistry and Pharmaceutical Bulletin, 26:2449–2453 (1978); ibid., 26:240–244 (1969); und R. Ranganathan Tetrahedron Letters, 15:1291–1294 (1977).
  • Verfahren 2. Nukleophiler Austausch von 2,2'-Anhydropyrimidinen. Die Nukleoside Thymin, Uracil, Cytosin oder ihre Analoga werden in 2'-substituierte Nukleoside über das Zwischenprodukt 2,2'-Cycloanhydronukleosid umgewandelt, wie beschrieben von J.J. Fox, et al., Journal of Organic Chemistry, 29:558–564 (1964).
  • Verfahren 3. 2-Desoxy-2-substituierte Ribosylierungen. 2-substituierte-2-Desoxyribosylierung der entsprechend geschützten Nukleinsäurebasen und Nukleinsäurebasenanaloga wurden beschrieben von E. T. Jarvi, et al., Nucleosides & Nucleotides 8:1111–1114 (1989) und L. W. Hertel, et al., Journal of Organic Chemistry 53:2406–2409 (1988).
  • Verfahren 4. Umwandlung von 2'-Substituenten in neue Substituenten. 2'-substituierte-2'-Desoxynukleoside werden in neue Substituenten über Standard chemische Manipulationen umgewandelt. Zum Beispiel beschreibt S. Chladek et al., Journal of Carbohydrates, Nucleosides & Nucleotides 7:63–75 (1980) die Um wandlung von 2'-Desoxy-2'-azidoadenosin, hergestellt aus Arabinofuranosyladenin, in 2'-Desoxy-2'-aminoadenosin.
  • Verfahren 5. Freie Radikalreaktionen. Umwandlungen von Halogen substituierten Nukleosiden in 2'-Desoxy-2'-substituierte Nukleoside über freie Radikalreaktionen wurde beschrieben von K. E. B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995–2996 (1988).
  • Verfahren 6. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden 2'-Desoxy-substituierte Guanosin Verbindungen über ein (Arabinofuranosyl)guanin Zwischenprodukt hergestellt, das über eine Oxidationsreduktionsreaktion erhalten wurde. Eine Abgangsgruppe an der 2'-Position des Arabinofuranosyl Zuckerrestes der Zwischenarabinoverbindung wird über eine SN2 Reaktion gegen ein geeignetes Nukleophil ausgetauscht. Dieses Verfahren schließt somit Prinzipien von sowohl Verfahren 1 als auch Verfahren 8 oben (Anmerkung des Übersetzers: Verfahren 8 wurde gestrichen) ein. 2'-Desoxy-2'-Fluorguanosin wird vorzugsweise über dieses Verfahren hergestellt. Die Zwischenarabinoverbindung wurde erhalten, indem eine Abwandlung des Oxidationsreduktionsverfahrens von Hansske, F., Madej, D. und Robins, M.J. (1984), Tetrahedron, 40:125, verwendet wurde. Gemäß dieser Erfindung wurde die Reduktion durch Starten bei –78°C und der exothermen Erwärmung auf ungefähr –2°C der Reduktionsreaktion bewirkt. Dies führt zu einer hohen Ausbeute der Zwischenarabinoverbindung.
  • In Verbindung mit der Verwendung einer Niedrigtemperatur Reduktion trägt die Verwendung einer Tetraisopropyldisiloxan Schutzgruppe (eine "TPDS" Gruppe) für die 3'- und 5'-Positionen der Ausgangsguanosin Verbindung zu einem verbesserten Verhältnis dieser Zwischenarabinoverbindung gegenüber der Riboverbindung nach Oxidation und Reduktion bei. Nach Oxidation/Reduktion werden die N2 Guaninaminostickstoff und die 2'-Hydroxyl Reste der Zwischenarabinoverbindung mit Isobutyryl Schutzgruppen ("Ibu" Gruppen) geschützt. Die Tetraisopropyldisiloxan Schutzgruppe wird entfernt, und die 3'- und 5'-Hydroxyle werden weiter mit einer zweiten Schutzgruppe, einer Tetrahydropyranyl Schutzgruppe (einer "THP" Gruppe) geschützt. Die Isobutyrylgruppe wird selektiv von der 2'-Hydroxylgruppe entfernt, gefolgt durch Derivation der 2'-Position mit einer Triflat (einer Trifluormethylsulfonyl) Abgangsgruppe. Der Triflat Rest wurde anschließend mit Inversion an der 2'-Position ausgetauscht, um die gewünschte 2'-Desoxy-2'-fluorguanosin Verbindung zu erhalten.
  • Zusätzlich zu der Triflat Abgangsgruppe schließen andere Abgangsgruppen ein, aber sind nicht notwendigerweise beschränkt auf Alkylsulfonyl, substituiertes Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, substituiertes Arylsulfonyl, Heterocyclosulfonyl oder Trichloracetimidat. Jeweilige Beispiele schließen p-(2,4-Dinitroanilin)benzolsulfonyl, Benzolsulfonyl, Methylsulfonyl, p-Methylbenzolsulfonyl, p-Brombenzolsulfonyl, Trichloracetimidat, Acyloxy, 2,2,2-Trichlorethansulfonyl, Imidazolsulfonyl und 2,4,6-Trichlorphenyl.
  • Die Isobutyrylgruppe, die auf der N2 heterocyclischen Aminoeinheit des Guaninrings verbleibt, kann entfernt werden, um ein vollständig entschütztes Nukleosid zu erhalten; jedoch wird vorzugsweise zum Einbau der 2'-Desoxy-2'-substituierten Verbindung in ein Oligonukleotid das Entschützen der N2 Isobutyryl Schutzgruppe verschoben, bis die Oligonukleotid Synthese vollständig ist. Normalerweise ist für die Verwendung in automatischen Nukleinsäure Synthetisiergeräten, das Schützen des N2 Guaninamino Restes mit einer Isobutyrylgruppe bevorzugt. Somit können vorteilhafterweise die N2 Isobutyryl geschützten 2'-Desoxy-2'-substituierten Guanosin Verbindungen, die von dem erfindungsgemäßen Verfahren stammen, direkt für Oligonukleotid Synthese in automatischen Nukleinsäure Synthetisiergeräten verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga können in Diagnostika, Therapeutika und als Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden. Für die therapeutische Verwendung wird das Oligonukleotid an ein Tier verabreicht, das an einer Erkrankung leidet, die durch ein Protein hervorgerufen wird. Es ist bevorzugt, an Patienten, von denen angenommen wird, dass sie an einer solchen Erkrankung leiden, Mengen an Oligonukleotiden zu verabreichen, die wirksam sind, um die Symptome dieser Erkrankung zu verringern. Es liegt innerhalb des Umfangs des fachmännischen Könnens, die optimalen Dosierungen und Behandlungspläne für solche Behandlungsschemata zu bestimmen.
  • Es ist allgemein bevorzugt, die erfindungsgemäßen therapeutischen Agenzien innerlich, wie oral, intravenös oder intramuskulär anzuwenden. Andere Formen der Verabreichung, wie transdermal, topisch oder intraläsional können auch verwendet werden. Der Einschluss in Zäpfchen kann auch verwendet werden. Die Verwendung von pharmakologisch verträglichen Trägern ist auch für eine Ausführungsformen bevorzugt.
  • Die folgenden Beispiele stellen die Durchführung dieser Erfindung dar.
  • BEISPIEL 1 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-fluor modifizierten Oligonukleotiden.
  • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diispropyl-β-cyanoethyl)phosphoramidit.
  • N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin wurde aus 9-β-D-Arabinofuranosyladenin in einer fünfstufigen Synthese unter Verwendung einer Modifikation eines Verfahrens hergestellt, das von M.Ikehara et al., Nucleosides and Nucleotides 2:373–385 (1983) beschrieben wurde. So wurde das N6-Benzoyl Derivat in guter Ausbeute durch Verwenden des Verfahrens des transienten Schutzes mit Chlortrimethylsilan erhalten. R.A. Jones, J. Am. Chem. Soc. 104:1316 (1982). Der selektive Schutz der 3'- und 5'-Hydroxylgruppen von N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin mit Tetrahydropyranyl (THP) wurde durch Modifikation eines Literaturverfahrens erreicht, G. Butke, et al., in: Nucleic Acid Chemistry, Teil 3:149–152, Townsend, L.B. und Tipson, R.S. Hrsg., (J. Wiley and Sons, New York 1986), um N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin in einer guten Ausbeute zu erhalten. Die Behandlung von N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid in Dichlormethan ergab das 2'-Triflat Derivat N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin, das aufgrund seiner Labilität nicht isoliert wurde. Der Austausch der 2'-Triflatgruppe wurde durch Reaktion mit Tetra-Butylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran bewirkt, um eine moderate Ausbeute des 2'-Fluor Derivats N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin zu erhalten. Das Entschützen der THP Gruppen von N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin wurde durch Behandlung mit Dowex-50W in Methanol erreicht, um N6-Benzoyl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin in einer moderaten Ausbeute zu erhalten. Das 1H-NMR Spektrum von 6 stimmte mit den Literatunnrerten überein. M. Ikehara und H. Miki, Chem. Pharm. Bull. 26: 2449–2453 (1978). Es wurden Standardmethodiken verwendet, um die 5-Dimethoxytrityl-3'-phosphoramidit Zwischenprodukte N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin und N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit zu erhalten. K.K. Ogilvie, Can J. Chem. 67:831–839 (1989).
  • B. N6-Benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenin
  • 9-β-D-Arabinofuranosyladenin (1,07 g, 4,00 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) und wasserfreiem Dimethylformamid (20 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und Chlortrimethylsilan (3,88 ml, 30,6 mmol) wurde langsam zu dem Reaktionsgemisch durch eine Spritze hinzugefügt. Nach Rühren des Reaktionsgemisches bei Eistemperatur für 30 Minuten wurde Benzoylchlorid (2,32 ml, 20 mmol) langsam hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Eistemperatur wurde kaltes Wasser (8 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 15 Minuten gerührt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid (8 ml) wurde langsam zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 2 M Ammoniak zu ergeben. Nachdem das kalte Reaktions gemisch für 30 Minuten gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel in vacuo (60 Torr) bei 20°C verdampft, gefolgt von Verdampfen in vacuo (1 Torr) bei 40°C, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde mit Diethylether (50 ml) titriert, um einen Feststoff zu ergeben, der gefiltert und dreimal mit Diethylether gewaschen wurde. Dieser rohe Feststoff wurde in Methanol (100 ml) bei Rückflusstemperatur dreimal titriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, um N6-Benzoyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin als einen Feststoff (1,50 g, 100%) zu erhalten.
  • C. N6-Benzoyl-9-[3'',5''-di-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin
  • N6-Benzoyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin (2,62 g, 7,06 mmol) wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (150 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst, und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (1,32 g, 6,92 mmol) wurde hinzugefügt. Diese Lösung wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und Dihydropyran (1,26 ml, 13,8 mmol) wurde über eine Spritze hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 20°C erwärmt. Über einen Zeitraum von 5 Stunden wurden insgesamt 10 Äquivalente von Dihydropyran in 2 äquivalenten Mengen in der beschriebenen Weise hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat wurde langsam bis zu einem pH von 8 hinzugefügt, anschließend wurde Wasser bis zu einem Volumen von 750 ml hinzugefügt. Das wässrige Gemisch wurde mit Methylenchlorid viermal (4 × 200 ml) extrahiert, die organischen Phasen wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert, und das Lösungsmittel wurde in vacuo (60 Torr) bei 30°C verdampft, um ein kleines Volumen einer Flüssigkeit zu ergeben, die in vacuo (1 Torr) bei 40°C verdampft wurde, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde koverdampft mit p-Xylen in vacuo bei 40°C, um ein Öl zu ergeben, das in Methylenchlorid (100 ml) gelöst wurde. Hexan (200 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das niedriger siedende Lösungsmittel wurde in vacuo bei 30°C verdampft, was einen weißen Feststoff suspendiert in Hexan zurückließ. Dieser Feststoff wurde filtriert und mit Hexan dreimal (3 × 10 ml) gewaschen, anschließend durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silica und Methylenchlorid- Methanol (93:7, v/v) als Elutionsmittel, gereinigt. Die erste Fraktion führte zu der Titelverbindung 3 als ein weißer Schaum (3,19 g, 83%), und eine zweite Fraktion ergab einen weißen Schaum (0,81 g), der als das 5'-mono-Tetrahydropyranyl Derivat von N6-Benzoyl-9-(β-D-arabinofuranosyl)adenin charakterisiert wurde.
  • D. N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin.
  • N6-Benzoyl-9-[3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin (2,65 g, 4,91 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) gelöst, und das Lösungsmittel wurde in vacuo (1 mm Hg) bei 40°C verdampft. Das resultierende Öl wurde in wasserfreiem Methylenchlorid (130 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst, und wasserfreies Pyridin (3,34 ml, 41,3 mmol) und N,N-Dimethylaminopyridin (1,95 g, 16,0 mmol) wurden hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (1,36 ml, 8,05 mmol) wurde langsam über eine Spritze hinzugefügt. Nach Rühren des Reaktionsgemisches bei Eistemperatur für 1 h wurde es in kaltes gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat (140 ml) gegossen. Das Gemisch wurde geschüttelt, und die organische Phase wurde getrennt und bei Eistemperatur gehalten. Die wässrige Phase wurde mit Methylenchlorid zwei weitere Male (2 × 140 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte, die sorgfältig kalt gehalten wurden, wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo (60 Torr) bei 20°C verdampft, anschließend in vacuo (1 Torr) bei 20°C verdampft, um N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin als ein rohes Öl zu ergeben, das nicht weiter gereinigt wurde.
  • E. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin
  • N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin (< 4,9 mmol) als ein rohes Öl wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (120 ml) gelöst, und diese Lösung wurde auf Eistemperatur unter einer Argonatmosphäre angekühlt. Tetrabutylammoniumfluorid als das Hydrat (12,8 g, 49,1 mmol) wurde in wasserfreiem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst, und die Hälfte dieses Volumens wurde langsam über eine Spritze zu dem kalten Reaktionsgemisch hinzugefügt. Nach Rühren bei Eistemperatur für 1 Stunde wurde das verbleibende Reagenz langsam hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Eistemperatur für 1 weitere Stunde gerührt, anschließend wurde das Lösungsmittel in vacuo (60 Torr) bei 20°C verdampft, um ein Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde in Methylenchlorid (250 ml) gelöst und dreimal mit Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Feststoffe wurden filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, um ein Öl zu ergeben. Die Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silica in einem gesinterten Glastrichter (600 ml) gereinigt, und Ethylacetat wurde als Elutionsmittel verwendet. N6-Benzoyl-9-[2'-desoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin wurde als ein Öl erhalten (2,03 g, 76%).
  • F. N6-Benzoyl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin
  • N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin (1,31 g, 2,42 mmol) wurde in Methanol (60 ml) gelöst, und Dowex 50W × 2–100 (4 cm3, 2,4 m.äq) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 20°C für 1 Stunde gerührt, anschließend auf Eistemperatur abgekühlt. Triethylamin (5 ml) wurde anschließend langsam zu dem kalten Reaktionsgemisch bis zu einem pH von 12 hinzugefügt. Das Harz wurde filtriert und mit 30% Triethylamin in Methanol gewaschen, bis die Waschlösung nicht länger UV absorbierendes Material enthielt. Toluol (50 ml) wurde zu den Waschlösungen hinzugefügt, und das Lösungsmittel wurde bei 24°C in vacuo (60 Torr, anschließend 1 Torr) verdampft, um einen Rückstand zu ergeben. Dieser Rückstand wurde teilweise in Methylenchlorid (30 ml) gelöst, und das Lösungsmittel wurde in einen Scheidetrichter übertragen. Der verbleibende Rückstand wurde in heißem (60°C) Wasser gelöst, und nach dem Abkühlen des Lösungsmittels wurde er auch zu dem Scheidetrichter hinzugefügt. Das biphasische System wurde extrahiert, und die organische Phase wurde getrennt, und dreimal mit Wasser (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden in vacuo (60 Torr, anschließend 1 Torr Hg) bei 40°C verdampft, um ein Öl zu ergeben, das mit wasserfreien Pyridin (50 ml) verdampft wurde. Dieses Öl wurde weiter in vacuo (1 Torr Hg) bei 20°C in der Anwesenheit von Phosphorpentoxid über Nacht getrocknet, um N6-Benzoyl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin als einen gelben Schaum (1,08 g, 100%) zu ergeben, der geringe Verunreinigungen enthielt.
  • G. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin
  • N6-Benzoyl-9-(2'-fluor-β-D-ribofuranosyl)adenin (1,08 g, 2,89 mmol), das geringe Verunreinigungen enthielt, wurde in wasserfreiem Pyridin (20 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst, und trockenes Triethylamin (0,52 ml, 3,76 mmol) wurde hinzugefügt, gefolgt durch das Hinzufügen von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,13 g, 3,32 mmol). Nach 4 Stunden Rühren bei 20°C wurde das Reaktionsgemisch in einen Scheidetrichter überführt, und Diethylether (40 ml) wurde hinzugefügt, um eine weiße Suspension zu ergeben. Dieses Gemisch wurde dreimal mit Wasser (3 × 10 ml) gewaschen, die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Triethylamin (1 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das Lösungsmittel wurde in vacuo (60 Torr Hg) bei 20°C verdampft, um ein Öl zu ergeben, das mit Toluol (20 ml) enthaltend Triethylamin (1 ml) verdampft wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silica und Ethylacetattriethylamin (99:1, v/v), gefolgt von Ethylacetat-Methanol-Triethylamin (80:19:1) gereinigt, um das Produkt in zwei Fraktionen zu ergeben. Die Fraktionen wurden in vacuo (60 Torr, anschließend 1 Torr Hg) bei 20°C verdampft, um einen Schaum zu ergeben, der weiter in vacuo (1 Torr Hg) bei 20°C in der Anwesenheit von Natriumhydroxid getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl)adenin als einen Schaum (1,02 g, 52%) zu ergeben.
  • H. N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-D-cyanoethylphosphoramidit
  • N6-Benzoyl-9-[2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-β-D-ribofuranosyl]adenin (1,26 g, 1,89 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (13 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst, Diisopropylethylamin (0,82 ml, 4,66 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Eistemperatur abgekühlt. Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,88 ml, 4,03 mmol) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, das auf 20°C erwärmt und für 3 Stunden gerührt wurde. Ethylacetat (80 ml) und Triethylamin (1 ml) wurden hinzugefügt, und diese Lösung wurde mit Salzlösung dreimal (3 × 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der Feststoffe wurde das Lösungsmittel in vacuo bei 20°C verdampft, um ein Öl zu ergeben, das durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Silica und Hexan-Ethylacetat-Triethylamin (50:49:1) als Elutionsmittel gereinigt wurde.
  • Das Verdampfen der Fraktionen in vacuo bei 20°C ergab einen Schaum, der mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) in vacuo (1 Torr) bei 26°C verdampft wurde und weiter in vacuo (1 Torr Hg) bei 20°C in der Anwesenheit von Natriumhydroxid 24 h getrocknet wurde, um N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-fluor-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N'-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit als einen Schaum (1,05 g, 63%) zu ergeben.
  • I. 2'-Desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2,2'-Cyclouridin wurde mit einer Lösung aus 70% Fluorwasserstoff/Pyridin in Dioxan bei 120°C für zehn Stunden behandelt, um nach dem Entfernen des Lösungsmittels eine 75% Ausbeute von 2'-Desoxy-2'-fluoruridin bereitzustellen. Das 5'-DMT und 3'-Cyanoethoxydiisopropylphosphoramidit derivatisierte Nukleosid wurde durch Standardliteraturverfahren, M. J. Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC, 1984) oder durch das Verfahren aus Beispiel 1A erhalten.
  • J. 2'-Desoxy-2'-fluor-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Desoxy-2'-fluoruridin wurde in das entsprechende Cytidin Analogon über ein Triazol Zwischenprodukt umgewandelt, das wiederum aminiert wurde. Der Heterocyclus wurde anschließend durch selektive N4-Benzoylierung geschützt. Das 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit) kann in Übereinstimmung mit Beispiel 1A hergestellt werden.
  • K. 9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)-guanin
  • Die 3'- und 5'-Positionen von Guanosin wurden durch das Hinzufügen einer TPDS (1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl) Schutzgruppe wie nach dem Verfahren von Robins, M.J., Wilson, J.S., Sawyer, L. und James, M.N.G. (1983) Can. J. Chem., 61:1911 geschützt. Zu einer gerührten Lösung aus DMSO (160 ml) und Essigsäureanhydrid (20,0 ml, 212 mmol) wurde das TPDS Guanosin (21,0 g, 0,040 mol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 36 Std. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend auf 0°C abgekühlt. Kaltes EtOH (400 ml, 95%) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde weiter auf –78°C in einem trockenen Eis/Acetonbad abgekühlt. NaBH4 (2,0 g, 1,32 mol.äq) wurde hinzugefügt. Die Reaktion erreichte –2°C, wurde bei –2°C für 30 min gerührt und wiederum auf –78°C abgekühlt. Dies wurde noch zweimal wiederholt. Nachdem das Hinzufügen des NaBH4 abgeschlossen war, wurde die Reaktion bei Eistemperatur für 30 min und anschließend bei RT für 1 Std. gerührt. Die Reaktion wurde in EtOAc (1 l) aufgenommen und 2X mit einer gesättigten NaCl Lösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet und bei RT verdampft. Der Rückstand wurde 2X mit Toluol koverdampft und durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von CH2Cl2-MeOH (90:10) als dem Elutionsmittel gereinigt. 6,02 g des gereinigten Produktpräzipitats aus den geeigneten Säulenfraktionen während des Verdampfens dieser Fraktion und zusätzliche 11,49 g des Produkts wurden als ein Rückstand nach dem Verdampfen der Fraktionen erhalten.
  • L. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)-guanin.
  • 9-(3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)-guanin (6,5 g, 0,01248 mol) wurde in wasserfreiem Pyridin (156 ml) unter Argon gelöst. DMAP (9,15 g) wurde hinzugefügt. Isobuttersäureanhydrid (6,12 ml) wurde langsam hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei RT über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in kalte gesättigte NaHCO3 (156 ml) gegossen und für 10 min gerührt. Die wässrige Lösung wurde 3X mit EtOAc (156 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde 3X mit gesättigter NaHCO3 gewaschen und bis zur Trockenheit bei RT verdampft. Der Rückstand wurde mit Toluol bei RT koverdampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von CH2Cl2-Aceton (85:15) gereinigt, um 5,67 g (68%) des Produkts zu ergeben.
  • M. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-isobutyryl-3',5'-[1,1,3,3-Tetraisopropyldisilox-1,3-diyl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (9,83 g, 0,01476 mol) wurde in wasserfreiem THF (87,4 ml) bei RT unter Argon gelöst. 1 M N(nBu)4F in THF (29,52 ml, 2 äq.) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde für ½ Std. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT verdampft, und der Rückstand wurde durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH (85:15) verdampft, um 4,98 g (80%) des Produkts zu ergeben.
  • N. N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-β-D-arabinofuranosyl)-guanin (4,9 g) wurde in wasserfreiem 1,4-Dioxan (98 ml) bei RT unter Argon gelöst. p-Toluolsulfonsäuremonohyrat (0,97 g, 0,44 äq.) wurde hinzugefügt, gefolgt von 3,4-Dihydro-2H-pyran, d.h. DHP (9,34 ml, 8,8 äq.). Das Gemisch wurde für 2 Std. ge rührt, anschließend auf Eistemperatur abgekühlt, und gesättigte NaHCO3 (125 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu quenschen. Das Reaktionsgemisch wurde 3X mit 125 ml Anteilen von CH2Cl2 extrahiert, und die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet. Die organische Phase wurde verdampft, und der Rückstand wurden einer minimalen, aber ausreichender Menge gelöst, um ein klares Flüssigkeits- nicht ein Sirupvolumen von CH2Cl2 zu erhalten, und er wurde in das 100-fache des CH2Cl2 Volumens von Hexan getaucht. Das Präzipitat wurde gefiltert, um 5,59 g (81,5%) des Produkts zu ergeben.
  • O. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)-guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-O-isobutyryl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)-guanin (5,58 g) wurde in Pyridin:MeOH:H2O (65:30:15, 52 ml) bei RT gelöst.
  • Die Lösung wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und 52 ml 2N NaOH in EtOH-MeOH (95:15) wurde langsam hinzugefügt, gefolgt durch Rühren für 2 Std. bei Eistemperatur. Eis AcOH wurde bis pH 6 hinzugefügt. Anschließend wurde gesättigte NaHCO3 bei pH 7 hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei RT verdampft, und der Rückstand wurde mit Toluol koverdampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (150 ml) gelöst und 3X mit gesättigter NaHCO3 gewaschen. Die organische Phase wurde verdampft, und der Rückstand wurde durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH (95:5) verdampft, um 3,85 g (78,3%) des Produkts zu ergeben.
  • P. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)-guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin (3,84 g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (79 ml), wasserfreiem Pyridin (5,0 ml) und 4-Dimethylaminopyridin (2,93 g) bei RT unter Argon gelöst. Die Lösung wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und Trifluormethansulfonsäureanhydrid (1,99 ml) wurde langsam unter Rühren hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 1 Std. gerührt, anschließend in 100 ml gesättigte NaHCO3 gegossen. Die wässrige Phase wurde 3X mit kaltem CH2Cl2 extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet, verdampft und mit wasserfreiem CH3CN bei RT verdampft, um das Rohprodukt zu erhalten.
  • Q. N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-arabinofuranosyl)guanin.
  • Das Rohprodukt aus Beispiel 1-P, d.h. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin wurde in wasserfreiem THF (113 ml) unter Argon bei Eistemperatur gelöst. 1M wasserfreies N(nBu)4F (getrocknet durch Koverdampfen mit Pyridin) in THF (36,95 ml) wurde unter Rühren hinzugefügt. Nach 1 Std. wurde ein weiteres Aliquot 1M N(nBu)4F in THF (36,95 ml) (10 mol äq. gesamt) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 5 Std. bei Eistemperatur gerührt und in einem –30°C Gefrierschrank über Nacht gelagert.
  • Das Reaktionsgemisch wurde bei RT verdampft, und der Rückstand wurde in CH2Cl2 (160 ml) gelöst und 5X mit deionisiertem H2O extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc-MeOH (95:5) gereingt, um 5,25 g des Produkts zu ergeben.
  • R. N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-β-D-ribofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-β-D-ribofuranosyl)guanin (3,85 g) wurde in wässrigem MeOH (80 ml) bei RT gelöst. 12,32 cm3 vorgewaschenes Dowex 50W Harz wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei RT für 1 Std. gerührt. Das Harz wurde gefiltert, und das Filtrat bis zur Trockenheit verdampft. Das Harz wurde mit Pyridin-Triethylamin-H2O (1:3:3) bis zur Klarheit gewaschen. Dieses Filtrat wurde zu einem Öl verdampft. Die Rückstände von den zwei Filtraten wurden in H2O (200 ml) vereinigt und 3X mit CH2Cl2 (100 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde bis zur Trockenheit verdampft, und der Rückstand wurde aus heißem MeOH rekristallisiert, um einen 0,299 g ersten Anteil des Produkts als ein weißes Pulver zu erhalten. Die verbleibende MeOH Lösung wurde durch Silicagel Säulenchromatographie gereinigt, was zu einem weiteren Anteil von 0,783 g durch Elution mit EtOH-MeOH (80:20) führte.
  • S. N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4'-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-β-D-ribofuranosyl)guanin (1,09 g) wurde in Pyridin (20 ml) und Triethylamin (0,56 ml) bei RT unter Argon gelöst. 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,20 g, 1,15 Molar äq.) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei RT für 5 Std. gerührt. Das Gemisch wurde in einen Scheidetrichter übertragen und mit Et2O (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde 3X mit gesättigter NaHCO3 (70 ml Anteile) gewaschen, und die wässrige Phase wurde 3X mit Et2O zurück extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, und Triethylamin (4 ml) wurde hinzugefügt, um die Lösung basisch zu halten. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand durch Silicagel Säulenchromatographie gereinigt. Die Säule wurde mit EtOAc-Et3N (100:1) und anschließend EtOAc-MeOH-Et3N (95:5:1) eluiert, um 1,03 g des Produkts zu erhalten. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 6,09 (dd, 1, H1', J1-2 = 2,61, J1',F = 16,2 Hz); δ 5,28 (ddd, 1, H2', J2'-F = 52,8 Hz); δ 4,38 (m, 1, H3', J3',F = 19,8 Hz).
  • T. N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4'-dimethoxytrityl])guanosin-3'-O-N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit.
  • N2-Isobutyryl-9-(2'-desoxy-2'-fluor-5'-O-[4,4'-dimethoxytrityl]-β-D-ribofuranosyl)guanin (0,587 g) wurde in wasserfreiem CH2Cl2 (31 ml) und Diisopropylethylamin (0,4 ml) bei RT unter Argon gelöst. Die Lösung wurde auf Eistemperatur abgekühlt, und Chlor(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphin (0,42 ml) wurde lang sam hinzugefügt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 3,5 Std. gerührt. CH2Cl2-Et3N (100:1, 35 ml) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 1X mit gesättigter NaHCO3 (6 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und bei RT verdampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel Säulenchromatographie unter Verwendung von Hex-EtOAc-Et3N (75:25:1) für 2 Säulenvolumina, anschließend Hex-EtOAc-Et3N (25:75:1) und schließlich EtOAc-Et3N gereinigt. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei RT verdampft. Das resultierende Öl wurde 2X mit CH3CN koverdampft und auf eine Vakuumpumpe über Nacht zum Trocknen gesetzt. Der resultierende weiße Feststoff wurde in CH2Cl2 (3 ml) gelöst und in gerührtes Hexan (300 ml) gegeben. Das resultierende Präzipitat wurde filtriert und auf einer Vakuumpumpe getrocknet, um 0,673 g (88%) des Produkts zu erhalten. 31P-NMR (CDCl3) δ 150,5, 151,5.
  • BEISPIEL 2 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-cyano modifizierte Oligonukleotide.
  • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Desoxy-2'-cyanoadenosin wurde durch den freien Radikalaustausch der 2'-Iodgruppe von 2'-Desoxy-2'-iod-3',5'-O-(disiloxytetraisopropyl)-N6-benzoyladenosin gemäß einem ähnlichen Verfahren, das von K.E.B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995–2996 (1988) beschrieben wurde, hergestellt. 2'-Desoxy-2'-iodadenosin wurde von R. Ranganathan hergestellt, wie beschrieben in Tetrahedron Letters 15:1291–1294 (1977) und disilyiert, wie beschrieben von W.T. Markiewicz und M. Wiewiorowski in Nucleic Acid Chemistry, Teil 3, S. 222–231, Townsend, L.B.; Tipson, R.S. Hrsg. (J. Wiley and Sons, New York, 1986). Dieses Material wird mit Hexamethylditin, AIBN und t-Butylisocyanat in Toluol behandelt, um geschütztes 2'-Desoxy-2'-cyanoadenosin bereitzustellen. Dieses Material wurde, nach selektiver Entschützung, in sein 5'-DMT-3'-phosphoramidit, wie in Beispiel 1A beschrieben, umgewandelt.
  • B. 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Desoxyuridin (oder 5-Methyluridin), 3',5'-disilyiert wie oben beschrieben, wird in das 2'-Iod Derivat durch Triphenylphosphoniummethyliodid Behandlung, wie von K.E.B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995–2996 (1988) beschrieben wurde, umgewandelt. Die Anwendung der freien Radikalreaktionsbedingungen, wie beschrieben von K.E.B. Parkes und K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995–2996 (1988) liefert die 2'-Cyanogruppe des geschützten Nukleosids. Entschützen dieses Materials und anschließende Umwandlung des geschützten Monomers, wie oben beschrieben, liefert das benötigte Material für das Nukleinsäure Synthetisiergerät.
  • C. 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Desoxy-2'-iodcytidin wird aus der korrespondierenden oben beschrieben Uridinverbindung über eine herkömmliche Keto in Amino Umwandlung erhalten.
  • D. 2'-Desoxy-2'-cyano-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • 2'-Desoxy-2'-cyanoguanosin wird durch den Austausch der Triflatgruppe in der 2'-oben Position (Arabinozucker) des 3',5'-disilyierten N2-Isobutrylguanosins erhalten. Standardentschützen und anschließendes erneutes Schützen liefert das Titelmonomer.
  • BEISPIEL 3 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(trifluormethyl) modifizierten Oligonukleotiden.
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-trifluormethylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C werden durch Modifikationen eines Literaturverfahrens hergestellt, das von Q.-Y. Chen und S.W. Wu im Journal of Chemical Society Perkin Transactions 2385–2387 (1989) beschrieben wurde. Standardverfahren, wie in Beispiel 1A beschrieben, werden eingesetzt, um die 5'-DMT und 3'-Phosphoramidite, wie oben aufgezählt, herzustellen.
  • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diispropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • B. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • C. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • D. 2'-Desoxy-2'-trifluormethyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 4 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy) modifizierten Oligonukleotide.
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-vinylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C werden hergestellt durch Modifikationen von Literaturverfahren, die von B.S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research 18:41–49 (1990) und N. Inoue, et al., Nucleic Acids Research 15:6131–6148 (1987) beschrieben wurden. In diesem Fall wird 1,2-Dibromethan mit dem 2'-Hydroxyl gekoppelt, und anschließende Dehydrobromierung liefert das gewünschte geschützte 2'-Vinylnukleosid. Standardverfahren, wie in Beispiel 1A beschrieben, werden eingesetzt, um die 5'-DMT und 3'-Phosphoramidite, die oben aufgezählt sind, herzustellen.
  • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • B. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • C. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • D. 2'-Desoxy-2'-(vinyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 5 – Herstellung der 2'-Desoxy-2'-(allyloxy) modifizierten Oligonukleotide.
  • Die erforderlichen 2'-Desoxy-2'-O-allylriboside der Nukleinsäurebasen A, G, U(T) und C wurden durch Modifikationen von Literaturverfahren hergestellt, die von B.S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research 18:41–49 (1990) und N. Inoue, et al., Nucleic Acids Research 15:6131–6148 (1987) beschrieben wurden. Standardverfahren, wie in Beispiel 1A beschrieben, werden eingesetzt, um die 5'-DMT und 3'-Phosphoramidite, die oben aufgezählt sind, herzustellen.
  • A. N6-Benzoyl-[2'-desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)]adenosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • B. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • C. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)cytidin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • D. 2'-Desoxy-2'-(allyloxy)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-O-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidit).
  • BEISPIEL 6 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-(methylthio), (methylsulfinyl) und (methylsulfonyl) modifizierten Oligonukleotiden
  • A. 2'-Desoxy-2'-Methylthiouridin
  • 2,2'-Anhydrouridin (15,5 g, 68,2 mmol) [Rao, T.S. und Reese, C.B. (1989) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 997], Methanthiol (15,7 g, 327 mmol), 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (39,2 g, 341 mmol) und Dimethylformamid (150 ml) wurden zusammen bei 60°C erhitzt. Nach 12 Std. wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und unter reduziertem Druck konzentriert. Das rückständige Öl wurde durch Blitzsäulenchromatographie auf Silicagel (300 g) gereinigt. Das Konzentrieren der geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2-MeOH (9:1, v/v) eluiert wurden, und Trocknen des Rückstandes unter hohem Vakuum ergab 2'-Desoxy-2'-methylthiouridin als einen blassgelben Feststoff (14,11 g, 75,4%). Versuche, die Feststoffe aus Ethanol-Hexanen zu kristallisieren (wie berichtet von Imazawa, M., Ueda, T., und Ukita, T. (1975) Chem. Pharm. Bull., 23:604) scheiterten, und das Material verwandelte sich in einen hygroskopischen Schaum.
    1H NMR (Me2SO-d6) δ 2,0 (3H, s, SCH 3), 3,34 (1H, dd, J3 ',2' = 54.Hz, 2'H), 3,59 (2H, br m, 5'CH 2), 3,84 (1H, m, 4'H), 4,2 (1H, dd, J3', 4' = 2,2 Hz, 3'H), 5,15 (1H, t, 5'OH), 5,62 (1H, t, 3'OH), 5,64 (1H, d, JC6,C5 = 8,2 Hz), 6,02 (1H, d, J1',2' = 6 Hz, 1'H), 7,82 (1H, d, JC5,C6 = 8,2 Hz, C6 H), 11,38 (1H, br s, NH).
  • B. 2,2'-Anhydro-5-methyluridin
  • Ein Gemisch aus 5-Methyluridin (16,77 g, 69,2 mmol), Diphenylcarbonat (17,8 g, 83,1 mmol) und Natriumbicarbonat (100 mg) in Hexamethylphosphoramid (175 ml) wurde auf 150°C unter Rühren erhitzt, bis das Austreten von CO2 aufhörte (ungefähr 1 Std.). Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und anschließend in Diethylether (1 l) gegossen, während es gerührt wurde, damit sich ein brauner Gummi bildete. Wiederholte Waschschritte mit Diethylether (4 × 250 ml) bildete ein strohfarbenes hygroskopisches Pulver. Der Feststoff wurde durch kurze Säulenchromatographie auf Silicagel (400 g) gereinigt. Vereinigen und Konzentrieren der geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2-MeOH (85:15, v/v) eluiert wurden, bildete die Titelverbindung als einen strohfarbenen Feststoff (12 g, 77,3%), der aus EtOH als lange Nadeln kristallisierte, Sp. 226–227°C.
  • C. 2'-Desoxy-2'-methylthio-5-methyluridin
  • 2,2'-Anhydro-5-methyluridin (17,02 g, 70,6 mmol), Methanthiol (16,3 g, 339 mmol), 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (40,6 g, 353 mmol) und Dimethylformamid (150 ml) wurden zusammen bei 60°C erhitzt. Nach 12 Std. wurden die Produkte abgekühlt und unter reduziertem Druck konzentriert. Das rückständige Öl wurde durch eine kurze Silicagel (300 g) Säulenchromatographie gereinigt. Konzentrieren der geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2-MeOH (93:7, v/v) eluiert wurden, ergab die Titelverbindung als einen weißen Schaum (15,08 g, 74,1%). Kristallisierung aus EtOH-CH2Cl2 ergab weiße Nadeln.
  • D. 2'-Desoxy-2'-methylsulfinyluridin
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-2'-methylthiouridin (1 g, 3,65 mmol) in EtOH (50 ml) wurde eine Lösung aus m-Chlorperbenzoesäure (50%, 1,26 g, 3,65 mmol in 50 ml EtOH) über einen Zeitraum von 45 min bei 0°C hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand durch kurze Silicagel (30 g) Säulenchromatographie gereinigt. Konzentrieren der geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2-MeOH (75:25, v/v) eluiert wurden, lieferte die Titelverbindung als einen weißen Feststoff (0,65 g, 61,4%). Die Kristallisierung aus EtOH bildete weiße Körnchen, Sp. 219–221°C.
    1N NMR (Me2SO-d6) δ 2,5 (3H, s, SOCH 3), 3,56 (2H, br s, 5'CH 2), 3,8 (1H, m, 4'H), 3,91 (1H, m, 2'H), 4,57 (1H, m, 3'H), 5,2 (1H, br s, 5'OH), 5,75 (1H, d, C5 H), 6,19 (1H, d, 3'OH), 6,35 (1H, d, 1'H), 7,88 (1H, d, C6 H), 11,43 (1H, br s, NH).
  • E. 2'-Desoxy-2'-methylsulfonyluridin
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-2'-methyluridin (1 g, 3,65 mmol) in EtOH (50 ml) wurde m-Chlorperbenzoesäure (50%, 3,27 g, 14,6 mmol) auf einmal bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nach 2 Std. wurde die Lösung filtriert, um ein weißes Präzipitat zu sammeln, das nach Waschen (2 × 20 ml EtOH und 2 × 20 ml Et2O) und Trocknen die Titelverbindung als ein feines Pulver (0,76 g, 68%) ergab, Sp. 227–228°C.
    1H NMR (Me2SO-d6) δ 3,1 (3H, s, SO2CH 3), 3,58 (2H, m, 5'CH 2), 3,95 (1H, m, 2'H), 3,98 (1H, m, 4'H), 4,5 (1H, br s, 3'H), 5,2 (1H, br s, 5'OH), 5,75 (1H, d, C5 H), 6,25 (1H, d, 3'OH), 6,5 (1H, d, 1'H), 7,8 (1H, d, C6 H), 11,45 (1H, br s, NH).
  • F. 2'-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiouridin
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-2'-methylthiouridin (1,09 g, 4 mmol) in trockenem Pyridin (10 ml) wurden 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,69 g, 5 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (50 mg) bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wurde für 12 Std. gerührt, und die Reaktion wurde durch Hinzufügen von MeOH (1 ml) gequenscht. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum konzentriert und der Rückstand in CH2Cl2 (100 ml) gelöst, mit gesättigter wässriger NaHCO3 (2 × 50 ml), gesättigter wässriger NaCl (2 × 50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde unter Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde durch Silicagel (30 g) Säulenchromatographie gereinigt. Die Elution mit CH2Cl2-MeOH:Triethylamin (89:1:1, v/v) lieferte die Titelverbindung als ein homogenes Material. Vereinigen und Konzentrieren der geeigneten Fraktionen bildete das 5'-O-DMT Nukleosid als einen Schaum (1,5 g, 66,5%).
    1H NMR (MeSO-d6) δ 2,02 (3H, s, SCH 3), 3,15–3,55 (1H, m, 2'CH), 3,75 (6H, s, 2OCH 3, 3,97 (1H, m, 4'H), 4,24 (1H, m, 3'H), 5,48 (1H, d, C5 H), 5,73 (1H, d, 3'-OH), 6,03 (1H, d, C1'H), 6,82–7,4 (13H, m, ArH), 6,65 (1H, d, C6 H), 11,4 (1H, br s, NH).
  • G. 2'-Desoxy-3'-O-[(N,N-diisopropyl)-O-β-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiouridin
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiouridin (1,5 g, 2,67 mmol) in trockenem THF (25 ml) wurde Diisopropylethylamin (1,4 ml, 8 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt. N,N-Diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidinchlorid (1,26 ml, 5,34 mmol) wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 15 min hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend bei Raumtemperatur 2 Std. gerührt. EtOAc (100 ml, enthaltend 1% Triethylamin) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde mit gesättigter NaCl (2 × 50 ml) gewaschen, und die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Druck entfernt und der Rückstand durch kurze Silicagel (30 g) Säulenchromatographie gereinigt. Die Elution mit CH2Cl2:MeOH:Triethylamin (98:1:1, v/v) lieferte das Produkt als Gemisch von Diastereomeren. Verdampfen der geeigneten Fraktionen lieferte die Titelverbindung als einen Schaum (1,32 g, 64,7%).
    1H NMR (CDCl3), δ 2,0 und 2,02 (3H, 2s, SCH 3), 5,3 und 5,35 (1H, 2d, C5 H), 6,23 (1H, d, 1'H), 7,8 und 7,78 (1H, 2d, C6 H) und andere Protonen. 31P NMR (CDCl3) δ 151,68 und 152,2 ppm.
  • H. 2'-Desoxy-3',5'-di-O-acetyl-2'-methylthiouridin
  • 2'-Desoxy-2'-methylthouridin (5,0 g, 18,24 mmol) und Essigsäureanhydrid (5,6 ml, 54,74 mmol) wurden zusammen in trockenem Pyridin (30 ml) bei Raumtemperatur für 12 Std. gerührt. Die Produkte wurden anschließend unter reduzierten Druck konzentriert, und der erhaltene Rückstand wurde durch kurze Silicagel Säulenchromatographie gereinigt. Die geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2:MeOH (9:1, v/v), eluiert wurden, wurden vereinigt, unter reduziertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde aus EtOH kristallisiert, um die Titelverbindung (6,0 g, 91,8%) als weiße Nadeln zu ergeben, Sp. 132°C.
    1H NMR (CDCl3) δ 2,17 (3H, s, SCH 3), 2,20 (6H, s, 2 COCH 3), 3,40 (1H, t, 2'H), 4,31–4,40 (3H, m, 4',5'H), 5,31 (1H, m, 3'H), 5,80 (1H, d, C5 H), 6,11 (1H, d, 1'H), 7,45 (1H, d, C6 H), 8,7 (1H, br s, NH).
  • I. 2'-Desoxy-3',5'-di-O-acetyl-4-(1,2,4-triazol-1-yl)-2'-methylthiouridin
  • Triethylamin (8,4 ml, 60,3 mmol) und Phosphorylchlorid (1,2 ml, 12,9 mmol) wurden zu einer gerührten Lösung von 2'-Desoxy-3',5'-di-O-acetyl-2'-methylthiouridin (4,6 g, 13 mmol) in CH3CN (50 ml) hinzugefügt. 1,2,4-Triazol (4,14 g, 59,9 mmol) wurde anschließend hinzugefügt, und die Reaktionspartner wurden zusammen bei Raumtemperatur gerührt. Nach 16 Std. wurde Tritethylamin-Wasser (6:1, v/v; 20 ml), gefolgt von gesättigter wässriger NaHCO3 (100 ml) zu den Produkten hinzugefügt, und das resultierende Gemisch wurde mit CH2Cl2 (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO4) und unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch kurze Silicagel Säulenchromatographie gereinigt. Die geeigneten Fraktionen, die mit CH2Cl2:MeOH (9:1, v/v) eluiert wurden, wurden unter Vakuum verdampft, und der Rückstand wurde aus EtOH kristallisiert, um die Titelverbindung (3,01 g, 56,4%) als blasse Nadeln zu ergeben, Sp. 127–130°C.
    1H NMR (CDCl3) δ 2,18 (6H, s, 2 COCH 2), 2,30 (3H, s, SCH 3), 3,67 (1H, m, 2'H), 4,38–4,50 (3H, m, 4',5'H), 5,17 (1H, t, 3'H), 6,21 (1H, d, 1'H), 7,08 (1H, d, C5 H), 8,16 (1H, s, CH), 8,33 (1H, d, C6 H), 9,25 (1H, s, CH).
  • J. 2'-Desoxy-2'-methylthiocytidin
  • 2'-Desoxy-3',5'-di-O-acetyl-4-(1,2,4-triazol-1-yl)-2'-methylthiouridin (3,0 g, 7,5 mmol) wurde in einer gesättigten Lösung aus Ammoniak in MeOH (70 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur in einer Druckflasche für 3 Tage gerührt. Die Produkte wurden anschließend unter reduziertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde aus EtOH:CH2Cl2 kristallisiert, um die Titelverbindung (1,06 g, 51,7%) als Kristalle zu ergeben, Sp. 201°C.
    1H NMR (Me2SO-d6) δ 1,95 (3H, s, SCH 3), 3,36 (1H, m, 2'H), 3,55 (2H, m, 5'CH 2), 3,82 (1H, m, 4'H), 4,18 (1H, dd, 3'H), 5,75 (1H, d, C5 H), 6,1 (1H, d, 1'H), 7,77 (1H, d, C6 H). Anal. berechnet für C10H15N3O4S: C, 43,94; H, 5,53; N, 15,37; S, 11,73. Gefunden C, 44,07; H, 5,45; N, 15,47; S, 11,80.
  • K. 2'-Desoxy-N4-benzoyl-2'-methylthiocytidin
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-2'-methylthiocytidin (0,86 g, 3,15 mmol) in trockenem Pyridin (20 ml) wurde Trimethylchlorsilan (2,0 ml, 15,75 mmol) hinzugefügt, und das Rühren wurde für 15 min fortgesetzt. Benzoylchlorid (2,18 ml, 18,9 mmol) wurde zu der Lösung hinzugefügt, gefolgt von Rühren für 2 Std. Das Gemisch wurde anschließend in einem Eisbad abgekühlt, und MeOH (10 ml) wurde hinzugefügt. Nach 5 min wurde NH4OH (20 ml, 30% wässrig) hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend unter Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde durch kurze Silicagel (70 g) Säulenchromatographie gereinigt. Die Elution mit CH2Cl2:MeOH (9:1, v/v), Vereinigen der geeigneten Fraktionen und Verdampfen ergab die Titelverbindung (0,55 g, 46,6%), die aus EtOH als Nadeln kristallisierte, Sp. 193–194°C.
  • L. N4-Benzoylamino-1-[2-desoxy-5-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-methylthio-β-D-ribofuranosyl]pyrimidin-3(2H)-on (oder 2'-Desoxy-N4-benzoyl-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiocytidin)
  • Zu einer gerührten Lösung aus 2'-Desoxy-N4-benzoyl-2'-methylthiocytidin (0,80 g, 2,12 mmol) in trockenem Pyridin (10 ml) wurden 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,16 g, 3,41 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (10 mg) bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt und die Produkte unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 (70 ml) gelöst, mit gesättigter NaHCO3 (50 ml), gesättigter NaCl (2 × 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch kurze Silicagel (50 g) Säulenchromatographie gereinigt. Die Elution mit CH2Cl2:Triethylamin (99:1, v/v), Ver einigen und Konzentrieren der geeigneten Fraktionen ergab die Titelverbindung (1,29 g, 90%) als einen weißen Schaum.
    1H NMR (DMSO-d6) δ 2,1 (3H, s, SCH 3), 3,5 (1H, m, 2'H), 3,75 (6H, s, OCH 3), 4,15 (1H, m, 4'H), 4,4 (1H, t, 3'H), 5,74 (1H, br d, 3'OH), 6,15 (1H, d, C1'H), 6,8–8,0 (25H, m, ArH und C5 H), 8,24 (1H, d, C6 H), 11,3 (1H, br s, NH).
  • M. 2'-Desoxy-N4-benzoyl-3-O-[(N,N-diisopropyl)-β-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiocytidin
  • 2'-Desoxy-N4-benzoyl-5'-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthiocytidin (1,41 g, 2,07 mmol) wurde mit Diisopropylethylamin (1,4 ml, 8 mmol) und N,N-Diisopropyl-β-cyanoethylphosphoramidchlorid (1,26 ml, 5,34 mmol) in trockenem THF (25 ml), wie in Beispiel 6-G oben beschrieben, behandelt. Das Rohprodukt wurde durch kurze Silicagel (50 g) Chromatographie gereinigt, um die Titelverbindung nach Elution mit CH2Cl2:Hexanen:Triethylamin (89:10:1, v/v) zu ergeben. Die geeigneten Fraktionen wurden gemischt und unter Druck verdampft, um die Titelverbindung (1,30 g, 71%) als einen weißen Schaum (Gemisch aus Diastereomeren) zu ergeben.
    1H NMR (CDCl3) δ 2,31 (3H, s, SCH 3), 3,45–3,7 (3H, m, 2'H und 5'CH 2), 3,83 (6H, s, OCH 3) 4,27–4,35 (1H, m, 4'H), 4,6–4,8 (1H, m, 3'H), 6,35 (1H, 2d, 1'H), 6,82–7,8 (25H, m, ArH und C5 H), 8,38 und 8,45 (1H, 2d, C6 H) und andere Protonen. 31P NMR δ 151,03 und 151,08 ppm.
  • N. 2'-Desoxy-2'-methylsulfinylcytidin
  • 2'-Desoxy-2'-methylcytidin aus Beispiel 6-J wurde wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-D behandelt, um die Titelverbindung als ein Gemisch von Diastereomeren mit einem komplexen 1H NMR Spektrum zu erhalten.
  • O. 2'-Desoxy-2'-methylsulfonylcytidin
  • 2'-Desoxy-2'-methylthiocytidin aus Beispiel 6-J wurde wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-E behandelt, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • P. N6-Benzoyl-3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-desoxy-2'-methylthioadenosin
  • N6-Benzoyl-9-[2'-O-trifluormethylsulfonyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-β-D-arabinofuranosyl]adenin aus Beispiel 1-D wurde durch Behandlung mit Methanthiol in der Anwesenheit von Tetramethylguanin hergestellt, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Q. N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-methylthioadenosin
  • N6-Benzoyl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-2'-desoxy-2'-methylthioadenosin aus Beispiel 8-P wurde wie in Beispiel 1-F behandelt, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • R. N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-methylsulfinyladenosin
  • N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-methylthioadenosin aus Beispiel 6-Q wurde behandelt wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-D, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • S. N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-methylsulfonyladenosin
  • N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-methylthioadenosin aus Beispiel 6-Q wurde behandelt wie nach Verfahren aus Beispiel 6-E, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • T. N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-2'-desoxy-2'-methylthioguanosin
  • N2-Isobutyryl-9-(3',5'-di-O-[tetrahydropyran-2-yl]-2'-O-trifluormethylsulfonyl-β-D-arabinofuranosyl)guanin aus Beispiel 1-P wurde mit Methanthiol in der Anwesenheit von 1,1,3,3-Tetramethylguanidin behandelt, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • U. N2-Isobutyryl-2'-desoxy-2'-methylthioguanosin
  • N2-Isobutyryl-3',5'-di-O-(tetrahydropyran-2-yl)-2'-desoxy-2'-methylthioguanosin wurde behandelt wie in Beispiel 1-R, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • V. N2-Isobutyryl-2'-desoxy-2'-methylsulfinylguanosin
  • N2-Isobutyryl-2'-desoxy-2'-methylsulfinylguanosin aus Beispiel 6-U wurde behandelt wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-D, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • W. N2-Isobutyryl-2'-desoxy-2'-methylsulfonylguanosin
  • N2-Isobutyryl-2'-desoxy-2'-methylsulfinylguanosin aus Beispiel 6-U wurde behandelt wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-E, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • X. 2'-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfinyluridin
  • 2'-Desoxy-2'-methylsulfinyluridin aus Beispiel 6-D oben wird behandelt wie nach dem Verfahren aus Beispiel 6-F, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Y. 2'-Desoxy-3'-O-[N,N-diisopropyl)-O-β-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfinyluridin
  • 2'-Desoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfinyluridin wird behandelt wie nach Beispiel 6-G, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • Z. N6-Benzoyl-2'-desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioadenosin
  • N6-Benzoyl-2'-2'-methylthioadenosin aus Beispiel 6-Q oben wird behandelt wie in Beispiel 6-F, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • AA. N6-Benaoyl-2'-desoxy-3'-O-[(N,N-diisopropyl)-O-β-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioadenosin
  • N6-Benzoyl-2'-desoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioadenosin wird behandelt wie in Beispiel 6-G, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • BB. 2'-Desoxy-N2-isobutyryl-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioguanosin
  • 2'-Desoxy-N2-isobutyryl-2'-methylthioguanosin aus Beispiel 6-U oben wird behandelt wie in Beispiel 6-F, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • CC. 2'-Desoxy-N2-isobutyryl-3'-O-[N,N-diisopropyl)-O-β-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioguanosin
  • 2'-Desoxy-N2-isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylthioguanosin wird behandelt wie in Beispiel 6-G, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • DD. 2'-Desoxy-S-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfonyluridin
  • 2'-desoxy-2'-methylsulfonyluridin aus Beispiel 6-E oben wird behandelt wie in Beispiel 6-F, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • EE. 2'-Desoxy-3'-O-[N,N-diisopropyl)-O-(3-cyanoethylphosphoramid]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfinyluridin
  • 2'-Desoxy-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-methylsulfinyluridin wird behandelt wie in Beispiel 6-G, um die Titelverbindung zu erhalten.
  • BEISPIEL 7 – Umwandlung von 2'-Desoxy-2-substituierten Thymidinen in die korrespondierenden 2'-Desoxy-2'-substituierten Cytidine (chemische Umwandlung einer Pyrimdin Typ 4-Ketogruppe in eine 4-Aminogruppe).
  • Die 3',5'-Zuckerhydroxyle der 2'-modifizierten Nukleosid Typen werden durch Acylgruppen, wie Toluoyl, Benzoyl, p-Nitrobenzoyl, Acetyl, Isobutyryl, Trifluoracetyl, etc. unter Verwendung von Standardbedingungen der Säurechloride oder Anhydride und Pyridin/Dimethylaminopyridin Lösungsmittel und Katalysator geschützt. Das geschützte Nukleosid wird jetzt mit Thionylchlorid oder Phosphorylchlorid in Pyridin oder anderen geeigneten basischen Lösungsmittel chloriert. Die Pyrimidin Typ 4-Chlorgruppen werden jetzt mit Ammoniak in Methanol ausgetauscht. Das Entschützen der Zuckerhydroxyle findet ebenfalls statt. Die Aminogruppe wird benzoyliert durch das Standard zweistufige Verfahren der vollständigen Benzylierung (Zuckerhydroxyle und Aminogruppe), und die Acyle werden selektiv durch wässrige Natriumhydroxid Lösung entfernt. Alternativ dazu kann das in situ Verfahren verwendet werden, bei dem zunächst das Nukleosid mit Chlortrimethylsilan und Base behandelt wird, um die Zuckerhydroxyle vor der anschließenden Acylierung zu schützen. K.K. Ogilvie, Can. J. Chem. 67:831–839 (1989). Ein anderer Umwandlungsansatz ist es, die Pyrimidin Typ 4-Chlorgruppe mit einer 1,2,4-Triazolgruppe zu ersetzen, die über die Oligonukleotid Synthese in dem DNA Synthetisiergerät intakt bleibt und die durch Ammonium während des Ammoniumhydroxid Schritts ersetzt wird, der das Oligonukleotid von dem CPG Träger entfernt und Entschützen der Heterocyclen. Darüber kann in vielen Fällen die Pyrimidin Typ 4-Chlorgruppe, wie gerade beschrieben, verwendet werden und am Ende der Oligonukleotid Synthese ersetzt werden.
  • BEISPIEL 8 – Verfahren für das Anheften von 2'-Desoxy-2'-substituierten 5'-Dimethoxytriphenylmethylribonukleosiden an das 5'-Hydroxyl von Nukleosiden, die an CPG Träger gebunden sind.
  • Die 2'-Desoxy-2'-substituierten Nukleoside, die in der terminalen 3'-Position von bestimmten Antisense Oligonukleotiden verbleiben werden, ist als ihr 5'-DMT (die Cytosin und Adenin exocyclischen Aminogruppen sind benzoyliert und das Guaninamino ist isobutyryliert) geschützt und werden mit Trifluoressigsäure/Bromessigsäure gemischtem Anhydrid in Pyridin und Dimethylaminopyridin bei 50°C für fünf Stunden behandelt. Die Lösung wird unter reduziertem Druck zu ei nem dünnen Sirup verdampft, der in Ethylacetat gelöst wird und durch eine Säule aus Silicagel geleitet wird. Die homogenen Fraktionen werden gesammelt und bis zur Trockenheit verdampft. Eine Lösung aus 10 ml Acetonitril, 10 Mikromol des 3'-O-Brom-Methylester modifizierten Pyrimidinnukleosids und ein ml Pyridin/Dimethylaminopyridin (1:1) wird langsam mit einer Spritze (60 bis 90 sek) durch eine ein Mikromol Säule von CPG Thymidin (Applied Biosystems, Inc.) gegeben, die zuvor mit Säure gemäß den Standardbedingungen behandelt wurde, um die freie 5'-Hydroxylgruppe zu liefern. Andere Nukleosid gebundene CPG Säulen könnten eingesetzt werden. Das Eluat wird gesammelt und erneut mit einer Spritze durch die Säule gegeben. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt. Die CPG Säule wird langsam mit 10 ml Acetonitril gewaschen und anschließend an ein ABI 380B Nukleinsäure Synthetisiergerät angeschlossen. Die Oligonukleotid Synthese wird jetzt gestartet. Die Standardbedingungen von konzentriertem Ammoniumhydroxid Entschützen, welche die Thymidinesterverknüpfung von dem CPG Träger spaltet, spaltet auch die 3',5'-Esterverknüpfung, die das Pyrimidin modifizierte Nukleosid mit dem Thymidin verbindet, das anfänglich an das CPG Nukleosid gebunden war. Auf diese Weise kann irgendein 2'-substituiertes Nukleosid oder allgemein irgendein Nukleosid mit Modifikationen im Heterocyclus und/oder Zucker an das letzte 3'-Ende einer Oligonukleotid Sequenz angeheftet werden.
  • BEISPIEL 9 – Verfahren für die Umwandlung von 2'-Desoxy-2'-substituierten Ribonukleosid-5'-DMT-3'-phosphoramiditen in Oligonukleotide.
  • Das Polyribonukleotid Festphasen Syntheseverfahren von B.S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research 17: 3373–3386 (1989) wird verwendet, um die 2'-modifizierten Oligonukleotide herzustellen.
  • Oligonukleotide mit der Sequenz CGA CTA TGC AAG TAC mit 2'-Desoxy-2'-Fluor substituierten Nukleotiden wurden an verschiedenen Positionen innerhalb dieser Sequenz eingefügt. In einem ersten Oligonukleotid wurde jedes der Adenosin Nukleotide an den Positionen 3, 6, 10, 11 und 14 (gezählt in einer 5' nach 3' Rich tung) modifiziert, um einen 2'-Desoxy-2'-fluor Rest einzuschließen. In einem weitren Oligonukleotid wurden die Adenosin und die Uridin Nukleotide an den Positionen 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13 und 14 derart modifiziert. In noch einem weiteren Oligonukleotid wurden die Adenosin, Uridin und Cytidin Nukleotide an den Positionen 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13 und 14 derart modifiziert, und in noch einem weiteren Oligonukleotid wurden die Nukleotide (Adenosin, Uridin, Cytidin und Guanosin) an jeder Position derart modifiziert. Zusätzlich wurde ein Oligonukleotid mit der Sequenz CTC GTA CCT TCC GGT CC mit Adenosin, Uridin und Cytidin Nukleotiden an den Positionen 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 und 16 ebenfalls modifiziert, um 2'-Desoxy-2'-fluor substituierte Reste zu enthalten.
  • Es wurden verschiedene Oligonukleotide hergestellt, die Nukleotide mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten einschlossen. Um die Kopplungswirksamkeiten von 2'-Desoxy-2'-methylthio tragenden Nukleotiden in Oligonukleotide sicherzustellen wurde das Trimer TCC und das Tetramer TUU U synthetisiert. In dem Trimer, TCC, schloss das zentrale Cytidin Nukleotid (das zweite Nukleotid) einen 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten ein. In dem Tetramer schloss jedes der Uridin Nukleotide einen 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten ein. In weiteren Oligonukleotiden wurden 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten tragende Nukleotide innerhalb die Oligonukleotid Sequenz an ausgewählten Sequenzpositionen eingeschlossen. Jedes der Nukleotide schloss an den verbleibenden Sequenzpositionen einen 2'-O-Methyl Substituenten in seinem Nukleotid ein. Somit enthielten alle Nukleotide innerhalb des Oligonukleotids eine Substituentengruppe darin, entweder einen 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten oder einen 2'-O-Methyl Substituenten. Diese Oligonukleotide waren: GAG CUC CCA GGC mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten an den Positionen 4, 5, 6, 7 und 8; CGA CUA UGC AAG UAC mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten an den Positionen 1, 4, 5, 7, 9 und 13; UCC AGG UGU CCG AUC mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten an den Positionen 1, 2, 3, 7, 9, 10, 11 und 14; TCC AGG CCG UUU C mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten an den Positionen 10, 11 und 12; und TCC AGG TGT CCC C mit 2'-Desoxy-2'-methylthio Substituenten an den Positionen 10, 11 und 12.
  • BEISPIEL 10 – Herstellung von 2'-Desoxy-2'-fluor modifizierten Phosphorthionat Oligonukleotiden.
  • 2'-Desoxy-2'-substituierte 5'-DMT Nukleosid 3'-Phosphoramidite, die hergestellt wurden wie in Beispiel 1–5 beschrieben, wurden in sequenzspezifische Oligonukleotid Phosphorthionate eingebaut, wie von S. Beaucage et al., Journal of American Chemical Society 112:1253–1255 (1990) und B. S. Sproat, et al., Nucleic Acids Research 17:3373–3386 (1989) beschrieben wurde.
  • Oligonukleotide mit der Sequenz CGA CTA TGC AAG TAC mit Phosphorthionat Rückgratverknüpfungen und 2'-Desoxy-2'-fluor substituierten Nukleotiden wurden an verschiedenen Positionen innerhalb dieser Sequenz eingebaut. In einem ersten Oligonukleotid war jede der Rückgratverknüpfungen eine Phosphorthionatverknüpfung, und jedes der Adenosin, Uridin und Cytidin Nukleotide an den Positionen 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13 und 14 (gezählt in einer 5' nach 3' Richtung) wurden modifiziert, so dass sie einen 2'-Desoxy-2'-fluor Rest einschlossen. In einem weiteren Oligonukleotid war jede der Rückgratverknüpfungen eine Phosphorthionatverknüpfung, und die Nukleotide (Adenosin, Uridin, Cytidin und Guanosin) an jeder Position wurden modifiziert, so dass sie einen 2'-Desoxy-2'-fluor Rest einschlossen.
  • BEISPIEL 11 – Hybridisierunganalyse.
  • A. Evaluierung der Thermodynamik der Hybridisierung von 2'-modifizierten Oligonukleotiden.
  • Die Fähigkeit der 2'-modifizierten Oligonukleotide, ein ihre komplementären RNA oder DNA Sequenzen zu hybridisieren, wurde durch thermale Schmelzanalyse bestimmt. Das RNA Komplement wurde von der T7 RNA Polymerase synthetisiert, und einem Matrizenpromotor von DNA, synthetisiert mit einem Applied Biosystems, Inc. 380B; RNA Spezies wurden durch Ionenaustausch unter Verwendung von FPLC (LKB Pharmacia, Inc.) gereinigt. Natürliche Antisense Oligonukleotide oder jene, die 2'-Modifikationen an spezifischen Orten enthielten, wurden entweder zu der RNA oder dem DNA Komplement in stöchiometrischen Konzentrationen hinzugefügt, und die Absorption (260 nm) Hyperchromizität nach Duplex zu zufälligem Verwindungsübergang wurde unter Verwendung eines Gilford Response II Spektrophotometers überwacht. Diese Messungen wurden in einem Puffer aus 10 mM Na-Phosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA und NaCl durchgeführt, um eine Ionenstärke von 10 entweder 0,1 M oder 1,0 M zu erhalten. Die Daten wurden durch eine graphische Darstellung von 1/Tm vs In[Ct] analysiert, wobei [Ct] die Gesamtoligonukleotid Konzentration war. Aus dieser Analyse wurden die thermodynamischen Parameter bestimmt. Basierend auf der Information, die betreffend die Stabilität der gebildeten Duplex oder Heteroduplex gewonnen wurde, wurde die Anordnung von Nukleotiden, die 2'-Desoxy-2'-Substituenten enthalten, in Oligonukleotide hinsichtlich ihrer Wirkungen auf Helixstabilität bewertet. Modifikationen, welche die Stabilität des Hybrids drastisch veränderten, zeigten Verringerungen in der freien Energie (Delta G), und es wurden Entscheidungen betreffend ihrer Verwendbarkeit als Antisense Oligonukleotide getroffen.
  • Wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt ist, führte der Einbau von 2'-Desoxy-2'-fluor Nukleotiden in Oligonukleotide zu signifikanter Steigerung in der Duplexstabilität des modifizierten Oligonukleotidstrangs (dem Antisense Strang) und seines komplementären RNA Strangs (des Sense Strangs). In sowohl den Oligonukleotiden mit Phosphodiester Rückgrat als auch Phosphothionat Rückgrat stieg die Stabilität des Duplex an, sobald die Zahl der 2'-Desoxy-2'-fluor enthaltenden Nukleotide in dem Antisense Strang anstieg. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, führte, ohne Ausnahme, das Hinzufügen eines 2'-Desoxy-2'-fluor tragenden Nukleotids, unabhängig von dem einzelnen Substituenten tragenden Nukleotid oder unabhängig von der Position des Nukleotids in der Oligonukleotid Sequenz, zu einem Anstieg in der Duplexstabilität.
  • In Tabelle 1 stellen die unterstrichenen Nukleotide Nukleotide dar, die einen 2'-Desoxy-2'-fluor Substituenten einschließen. Die nicht unterstrichenen Nukleotide sind normale Nukleotide. Die Oligonukleotide, welche vorne die Bezeichnung "ps" tragen, weisen ein Phosphorthionat Rückgrat auf. Unmarkierte Oligonukleotide sind normale Oligonukleotide mit Phosphodiester Rückgrat.
  • Figure 00500001
  • Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigten die Duplexe, die zwischen RNA und Oligonukleotiden, die 2'-Desoxy-2'-fluor substituierte Nukleotide enthalten, gesteigerte Bindungsstabilität, wie durch die hybridisierungsthermodynamische Stabilität gemessen wurden. Es wurden delta Tm's von größer als 20°C gemessen. Durch Modifizieren des Rückgrats in ein Phosphorthionat Rückgrat wurden sogar noch größere delta Tm's beobachtet. In diesem Fall wurden delta Tm's von größer als 31°C gemessen. Diese Fluor substituierten Oligonukleotide zeigten einen konsistenten und zusätzlichen Anstieg in der thermodynamischen Stabilität der Duplexe, die mit RNA gebildet wurden. Während wir nicht durch irgendeine Theorie gebunden sein wollen, wird gegenwärtig angenommen, dass die Anwesenheit des 2'-Fluor Substituenten zu dem Zuckerrest des 2'-Fluor substituierten Nukleotids führt, eine im Wesentlichen 3'-Ende Konformation angenommen, und dies führt zu dem Oligonukleotid-RNA Duplex, von dem eine A-Typ helikale Konformation angenommen wird.
  • B. Genauigkeit der Hybridisierung von 2'-modifizierten Oligonukleotiden.
  • Die Fähigkeit der 2'-modifizierten Antisense Oligonukleotide, mit absoluter Spezifität an die Ziel mRNA zu binden, wurde durch Northern Blot Analyse von gereinigter Ziel mRNA in der Anwesenheit von gesamtzellulärer RNA gezeigt. Ziel mRNA wurde aus einem Vektor synthetisiert, der die cDNA für die Ziel mRNA angeordnet unterhalb eines T7 RNA Polymerase Promotors enthielt. Die synthetisierte mRNA wurde in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt und auf eine geeignete Trägermembran (d.h. Nitrocellulose) übertragen. Die Trägermembran wurde geblockt und mit einer Sonde mit einem [32P]-markierten Antisense Oligonukleotid inkubiert. Die Stringenz wurde durch Replika Blots und Waschen in entweder erhöhten Temperaturen oder bei verringerten Ionenstärken des Waschpuffers bestimmt. Es wurde eine Autoradiographie durchgeführt, um die Anwesenheit von Heteroduplexbildung zu untersuchen, und das Autoradiogramm wurde durch Laserdensitometrie (LKB Pharmacia, Inc.) quantifiziert. Die Spezifität der Hybridbildung wurde durch Isolierung von gesamtzellulärer RNA durch Standardtechniken und deren Analyse durch Agarosegel Elektrophorese, Membrantransfer und Son deninkubation mit den markierten 2'-modifizierten Oligonukleotiden bestimmt. Die Stringenz wurde für die nicht modifizierten Antisense Oligonukleotide und die verwendeten Bedingungen zuvor bestimmt, so dass nur die spezifische Ziel mRNA in der Lage war, einen Heteroduplex mit dem 2'-modifizierten Oligonukleotid zu bilden.
  • C. Basenpaar Spezifität von Oligonukleotiden und RNA
  • Die Basenpaar Spezifität von 2'-Desoxy-2'-fluor modifizierten Oligonukleotiden mit dem RNA Komplement (einem "Y Strang") wurde bestimmt, indem einzelne Basenpaar Fehlpaarungen und eine Blase bewirkt wurden. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Tabelle 2 gezeigt. Ein 18 mer "X Strang" Oligonukleotid, das 14 Adenosin, Uridin und Cytidin Nukleotide mit einem 2'-Desoxy-2'-fluor Substituenten enthielt, wurde mit dem RNA Komplement "Y Strang" hybridisiert, indem die 10. Position variiert wurde. In Tabelle 2 zeigen die unterstrichenen Nukleotide Nukleotide, die einen 2'-Desoxy-2'-fluor Substituenten einschließen.
    Figure 00530001
  • Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, bildete das 2'-Desoxy-2'-fluor modifizierte Oligonukloeotid einen Duplex mit dem RNA Komplement mit größerer Spezifität als ein nicht modifiziertes Oligonukleotid mit einer ähnlichen Sequenz.
  • BEISPIEL 12 – Nuklease Beständigkeit
  • A. Evaluierung der Beständigkeit von 2'-modifizierten Oligonukleotiden gegenüber Serum und cytoplasmatischen Nukleasen.
  • Natürliche Phosphorthionate und 2-modifizierte Oligonukleotide wurden hinsichtlich ihrer Beständigkeit gegenüber Serum Nukleasen durch Inkubation der Oligonukleotide in Medium enthaltend verschiedene Konzentrationen an fötalem Kälberserum oder adultem humanem Serum untersucht. Markierte Oligonukleotide wurden für verschiedene Zeiträume inkubiert, mit Protease K behandelt und anschließend durch Gelelektrophorese auf 20% Polyacrylamin-Harnstoff denaturierenden Gelen und anschließender Autoradiographie analysiert. Die Autoradiogramme wurden durch Laserdensitometrie quantifiziert. Basierend auf der Lage der Modifikationen und der bekannten Länge der Oligonukleotide war es möglich, die Wirkung auf Nuklease Beständigkeit durch die bestimmte 2'-Modifikation zu bestimmen. Für die cytoplasmatischen Nukleasen wurde eine HL60 Zelllinie verwendet. Es wurde ein post mitochondrialer Überstand durch differenzielle Zentrifugation hergestellt, und die markierten Oligonukleotide wurden in diesem Überstand für verschiedene Zeiträume inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Oligonukleotide bezüglich Degradation, wie oben für Serum nukleolytische Degradation beschrieben, untersucht. Die Autoradiographie Ergebnisse wurden für den Vergleich der nicht modifizierten, der Phosphorthionate und der 2'-modifizierten Oligonukleotide quantifiziert.
  • Unter Verwendung dieser Testsysteme wurde die Stabilität eines 15 mer Oligonukleotids mit 2'-Desoxy-2'-fluor substituierten Nukleotiden an den Positionen 2 und 14 und einem Phosphorthionat Rückgrat untersucht. Als eine Kontrolle wurde ein nicht substituiertes Phosphodiester Oligonukleotid zu 50% innerhalb 1 Std. und zu 100% innerhalb von 20 Stunden degradiert. Im Vergleich war für das 2'-Desoxy-2'-fluor substituierte Oligonukleotid mit dem Phosphorthionat Rückgrat die Degradation auf weniger als 10% nach 20 Stunden limitiert.
  • B. Evaluierung der Resistenz von 2'-modifizierten Oligonukleotiden gegenüber spezifischen Endo- und Exonukleasen.
  • Die Evaluierung der Resistenz von natürlichen und 2'-modifizierten Oligonukleotiden gegenüber spezifischen Nukleasen (d.h. Endonukleasen, 3',5'-Exo- und 5',3'-Exonukleasen) wurden durchgeführt, um die exakte Wirkung der Modifikationen auf Degradation zu bestimmen. Modifizierte Oligonukleotide wurden in definierten Reaktionspuffern, die spezifisch für verschiedene ausgewählte Nukleasen sind, inkubiert. Nach der Behandlung der Produkte mit Proteinase K wurde Harnstoff hinzugefügt, und eine Analyse auf 20% Polyacrylamidgelen, die Harnstoff enthalten, wurde durchgeführt. Die Gelprodukte wurden durch Färben mit Stains All (Sigma Chemical Co.) sichtbar gemacht. Laserdensitometrie wurde verwendet, um das Ausmaß der Degradation zu quantifizieren. Die Wirkungen der 2'-Modifikationen wurden für spezifische Nukleasen bestimmt und mit den Ergebnissen, die aus den Serum und cytoplasmatischen Systemen erhalten wurden, verglichen.

Claims (15)

  1. Nuklease-beständiges Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon zum Hybridisieren mit einer ausgewählten Sequenz von RNA oder DNA und Modulieren der Aktivität davon, wobei das Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon eine Sequenz von Nukleotidbasen aufweist, die mit der ausgewählten Sequenz spezifisch hybridisierbar ist und mindestens eine 2'-modifizierte 2'-Deoxyfuranosyleinheit aufweist, wobei die Modifikation Substitution mit Halogen, Azido, Amino, Cyano, Halogenmethyl, Cyanato, Thioalkoxyl, Alkylsulfonat, Nitrat, Nitrit, Ammonium, Allyloxy oder Alkenoxy umfaßt.
  2. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation Substitution mit Azido, Cyano, Halomethyl, Cyanato, Thioalkoxyl, Alkylsulfonat, Nitrat, Nitrit, Ammonium, Allyloxy oder Alkenoxy umfaßt.
  3. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die Modifikation Substitution mit F umfaßt.
  4. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, das von etwa 5 bis etwa 50 Nukleotidbasen aufweist.
  5. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die 2'-Modifikation an dem 3'-Ende des Oligonukleotids ist.
  6. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei mindestens eine der Zuckerverknüpfungsgruppen mit Kohlenstoff- oder Etherverknüpfungen ersetzt ist.
  7. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 6, wobei eine 5'-Methylengruppe und carbocyclischer Zucker entfernt sind.
  8. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, weiter derart modifiziert, daß mindestens einige der Zuckerverknüpfungsgruppen ein Phosphorthiolat, Methylphosphonat oder Phosphatalkylat umfassen.
  9. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  10. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die ausgewählte Sequenz von RNA oder DNA einen Abschnitt eines HIV-Genoms umfaßt.
  11. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die ausgewählte Sequenz von RNA oder DNA einen Abschnitt eines Herpesvirus-Genoms umfaßt.
  12. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß Anspruch 1, wobei die ausgewählte Sequenz von RNA oder DNA einen Abschnitt eines Papillomavirus-Genoms umfaßt.
  13. Oligonukleotid oder Oligonukleotidanalogon gemäß einem vorhergehenden Anspruch zur Verwendung in der Therapie.
  14. Verfahren zur Modulation der Erzeugung eines Proteins durch ein biologisches System ex vivo, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des biologischen Systems mit einem Oligonukleotid gemäß einem vorhergehenden Anspruch.
  15. Verwendung des Oligonukleotids oder Oligonukleotidanalogons gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwen dung in der Behandlung einer Krankheit, gekennzeichnet durch die ungewünschte Erzeugung eines Proteins.
DE69133511T 1990-08-13 1991-08-12 Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression Revoked DE69133511T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56697790A 1990-08-13 1990-08-13
US566977 1990-08-13
PCT/US1991/005720 WO1992003568A1 (en) 1990-08-13 1991-08-12 Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69133511D1 DE69133511D1 (de) 2006-04-27
DE69133511T2 true DE69133511T2 (de) 2006-09-28

Family

ID=24265247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69133511T Revoked DE69133511T2 (de) 1990-08-13 1991-08-12 Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP0549615B1 (de)
JP (2) JPH0813274B2 (de)
AT (1) ATE318273T1 (de)
AU (1) AU661662B2 (de)
BR (1) BR9106826A (de)
CA (1) CA2089376C (de)
DE (1) DE69133511T2 (de)
DK (1) DK0549615T3 (de)
ES (1) ES2259177T3 (de)
WO (1) WO1992003568A1 (de)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5872232A (en) * 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5686592A (en) * 1990-06-11 1997-11-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to immunoglobulin E (IgE)
US5637682A (en) * 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5459015A (en) * 1990-06-11 1995-10-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US5648214A (en) * 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5587468A (en) * 1990-06-11 1996-12-24 University Research Corporation High affinity nucleic acid ligands to HIV integrase
US6759392B1 (en) 1990-06-11 2004-07-06 Gilead Sciences, Inc. High affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US6177557B1 (en) 1990-06-11 2001-01-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity ligands of basic fibroblast growth factor and thrombin
US5476766A (en) * 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5580737A (en) * 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5677437A (en) * 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5783682A (en) 1990-07-27 1998-07-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide mimics having nitrogen-containing linkages
US6087482A (en) * 1990-07-27 2000-07-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5792844A (en) * 1990-07-27 1998-08-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent nitrogen atoms
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5965722A (en) 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US7119184B2 (en) 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US5534408A (en) * 1993-09-24 1996-07-09 University Of Massachusetts Medical Center 2-deoxystreptamine aminoglycoside inhibition of HIV RRE/Rev binding
JP3495752B2 (ja) * 1992-12-11 2004-02-09 キヤノン株式会社 生標的個体の検出方法およびプローブ
DE59407895D1 (de) * 1993-05-12 1999-04-15 Novartis Ag Nukleoside und Oligonukleotide mit 2'-Ethergruppen
US6184389B1 (en) 1994-01-11 2001-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Combinatorial libraries having aminodiol monomer subunits
US6448373B1 (en) 1994-01-11 2002-09-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphate linked oligomers formed of monomeric diols and processes for preparing same
US6828427B1 (en) 1994-01-11 2004-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric aminodiol-containing compounds, libraries thereof, and process of preparing the same
US5886177A (en) * 1994-01-11 1999-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphate linked oligomers
US5646269A (en) * 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
WO1996027606A1 (en) * 1995-03-06 1996-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
DE69729179T2 (de) 1996-02-14 2004-12-30 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad Lückenhaft Zucker-modifizierte Oligonukleotide
US5856099A (en) * 1996-05-21 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
JP2000512630A (ja) 1996-06-06 2000-09-26 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト ２’―置換ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド誘導体
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6958239B2 (en) 1996-11-21 2005-10-25 Oligos Etc Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6127533A (en) 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US7148035B1 (en) 1998-11-18 2006-12-12 Oxford Biomedica (Uk) Limited Polypeptide
ATE293690T1 (de) 1998-11-18 2005-05-15 Oxford Biomedica Ltd Verwendung vom krebs-assoziierten antigen 5t4 zur immuntherapie
GB0400443D0 (en) 2004-01-09 2004-02-11 Oxford Biomedica Ltd Cascade
EP1141278B1 (de) * 1998-12-30 2008-02-27 Oligos Etc. Inc. Therapeutische pde4d phosphodiesterase inhibitoren
US6403779B1 (en) 1999-01-08 2002-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides
ATE347616T1 (de) * 1999-04-30 2006-12-15 Cyclops Genome Sciences Ltd Ribonukleinsäurederivate
US6277982B1 (en) 1999-08-20 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alkylation of alcohols, amines, thiols and their derivatives by cyclic sulfate intermediates
EP2325337A1 (de) 2000-09-26 2011-05-25 Duke University RNA-Aptamere und Verfahren zu ihrer Identifizierung
CA2453362A1 (en) 2001-07-10 2003-01-23 Oligos Etc. Inc. Oligonucleotide-containing pharmacological compositions and their use
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
JP4527984B2 (ja) 2002-02-01 2010-08-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 増強された効力を有するオリゴヌクレオチド組成物
GB0203419D0 (en) 2002-02-13 2002-04-03 Oxford Biomedica Ltd Peptide
CA2504929C (en) 2002-11-05 2014-07-22 Charles Allerson Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
JP4774676B2 (ja) * 2003-04-10 2011-09-14 セントラル硝子株式会社 ２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの製造方法
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
WO2006042112A2 (en) 2004-10-05 2006-04-20 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
CA2606287A1 (en) 2005-05-13 2006-11-16 Oxford Biomedica (Uk) Limited Peptide
JP2007077109A (ja) * 2005-09-16 2007-03-29 Tokyo Institute Of Technology ヌクレオシド誘導体及びその製造方法
AU2007211082B2 (en) * 2006-01-27 2012-09-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of microRNAs
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
DK2129680T3 (en) 2007-03-21 2015-08-10 Brookhaven Science Ass Llc COMBINED hairpin ANTISENSE COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING EXPRESSION OF
ES2439591T3 (es) * 2007-08-15 2014-01-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácido nucleico de tetrahidropirano
US8367815B2 (en) 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8865667B2 (en) 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
US8637478B2 (en) 2007-11-13 2014-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
US9029524B2 (en) 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
JP5697993B2 (ja) 2008-02-11 2015-04-08 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 修飾ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用
CA2743981C (en) 2008-09-22 2019-01-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering rnai compounds
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
CN103108642B (zh) 2010-03-24 2015-09-23 雷克西制药公司 皮肤与纤维化症候中的rna干扰
CA2794187C (en) 2010-03-24 2020-07-14 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
US9267171B2 (en) 2013-02-28 2016-02-23 New York University DNA photolithography with cinnamate crosslinkers
JP6883987B2 (ja) 2013-12-04 2021-06-09 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． 化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒の処置のための方法
EP3137119B1 (de) 2014-04-28 2020-07-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Verfahren zur behandlung von krebs mithilfe von einer nukleinsaüre gegen mdm2
CA2947619A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treatment of disorders in the front of the eye utilizing nucleic acid molecules
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
JP6836987B2 (ja) 2014-09-05 2021-03-03 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションＰｈｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ． Ｔｙｒまたはｍｍｐ１を標的とする核酸を用いて老化および皮膚障害を処置するための方法
EP3201339A4 (de) 2014-10-03 2018-09-19 Cold Spring Harbor Laboratory Gezielten erhöhung der nukleären genleistung
JP6983752B2 (ja) 2015-07-06 2021-12-17 フィオ ファーマシューティカルズ コーポレーションPhio Pharmaceuticals Corp. スーパーオキシドディスムターゼ１（ｓｏｄ１）を標的とする核酸分子
EP3359685A1 (de) 2015-10-09 2018-08-15 University Of Southampton Modulation der genexpression und screening auf deregulierte proteinexpression
CA3002744A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
EP3386544B1 (de) 2015-12-10 2020-11-25 Fibrogen, Inc. Verfahren zur behandlung von motoneuronenerkrankungen
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
SG11201804443UA (en) 2015-12-14 2018-06-28 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of autosomal dominant mental retardation-5 and dravet syndrome
KR20230166145A (ko) 2017-03-15 2023-12-06 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 방법
CN108424432B (zh) * 2017-07-13 2021-04-23 上海兆维科技发展有限公司 一种3’-氧-甲氧乙基核苷的制备方法
FI3673080T3 (fi) 2017-08-25 2023-11-23 Stoke Therapeutics Inc Antisense-oligomeerejä häiriötilojen ja sairauksien hoitoon
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
MX2020011695A (es) 2018-05-04 2021-02-26 Stoke Therapeutics Inc Métodos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad por almacenamiento de éster de colesterilo.
US20200369759A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Fibrogen, Inc. Methods of treatment of muscular dystrophies
US20230002766A1 (en) 2019-11-08 2023-01-05 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides targeting bromodomain containing protein 4 (brd4) for immunotherapy
WO2021138537A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides with improved systemic delivery
KR20230022409A (ko) 2020-05-11 2023-02-15 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환의 치료를 위한 opa1 안티센스 올리고머
WO2023015264A1 (en) 2021-08-04 2023-02-09 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer utilizing natural killer cells treated with chemically modified oligonucleotides
US20240301430A1 (en) 2021-08-04 2024-09-12 Phio Pharmaceuticals Corp. Chemically modified oligonucleotides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ209840A (en) * 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
DE68929304T2 (de) * 1988-04-27 2002-04-25 Isis Pharmaceutical, Inc. Oligoribonukleotid-Derivate und Verwendung davon als Antiviral-Arzneimittel
JPH05504552A (ja) * 1989-10-24 1993-07-15 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド ２’位が改変されたオリゴヌクレオチド
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
EP0523140A4 (en) * 1990-03-21 1993-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagents and methods for modulating gene expression through rna mimicry
ATE187771T1 (de) * 1990-05-04 2000-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation der genexpression durch eingreifen in die rna sekundärstruktur

Also Published As

Publication number Publication date
JP3585583B2 (ja) 2004-11-04
EP1443051A2 (de) 2004-08-04
EP1443051A3 (de) 2005-08-17
ES2259177T3 (es) 2006-09-16
WO1992003568A1 (en) 1992-03-05
JPH0813274B2 (ja) 1996-02-14
JPH0898700A (ja) 1996-04-16
AU661662B2 (en) 1995-08-03
EP0549615A1 (de) 1993-07-07
EP0549615B1 (de) 2006-02-22
CA2089376A1 (en) 1992-02-14
BR9106826A (pt) 1994-01-25
EP0549615A4 (en) 1997-08-27
ATE318273T1 (de) 2006-03-15
DK0549615T3 (da) 2006-07-03
CA2089376C (en) 2010-05-04
JPH06502758A (ja) 1994-03-31
AU8440391A (en) 1992-03-17
DE69133511D1 (de) 2006-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69133511T2 (de) Zuckermodifizierte oligonukleotide zum erkennen und steuern der genexpression
DE69133405T2 (de) Oligonukleotidderivate zur detektieren und modulation von rna aktivität und genexpression
US5670633A (en) Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US6307040B1 (en) Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
DE69126530T2 (de) Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
DE69838449T2 (de) Aminooxy-modifizierte oligonukleotide
AU762212C (en) Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
DE69729179T2 (de) Lückenhaft Zucker-modifizierte Oligonukleotide
US5872232A (en) 2&#39;-O-modified oligonucleotides
DE69233599T2 (de) Unterbrochene 2&#39;-modifizierte Oligonukleotide
DE69433626T2 (de) N-2 substituierte purine
US5859221A (en) 2&#39;-modified oligonucleotides
US6005087A (en) 2&#39;-modified oligonucleotides
DE60216798T2 (de) Azyklische linker enthaltende oligonukleotide und deren verwendungen
US6166197A (en) Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2&#39;and 5 substitutions
US5684143A (en) Oligo-2&#39;-fluoronucleotide N3&#39;-&gt;P5&#39; phosphoramidates
DE60038495T2 (de) Oligonukleotid n3&#39;-p5&#39; thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung
JP2002520420A (ja) 部位特異的キラルホスホロチオエート・ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド
JP2001097994A (ja) ２’−ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法
JPH10510433A (ja) 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド
EP0611373B1 (de) Oligo-2&#39;-desoxynukleotide und ihre verwendung als arzneimittel mit antiviraler wirksamkeit
AU641565C (en) Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8331 Complete revocation