DE69934227T2

DE69934227T2 - Auf Beta-Arabinose und dessen Analoga basierte Antisense-Oligonukleotide

Info

Publication number: DE69934227T2
Application number: DE69934227T
Authority: DE
Inventors: Jose Massad St.-Hubert DAMHA; A. Michael Verdun PARNIAK; Anne M. Montreal NORONHA; Christopher Pincourt WILDS; Gadi 76910 Kfar Gibton BORKOW; Dominique Montreal ARION
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: DE69934227D1; WO1999067378A1; US20090105467A1; EP1088066B1; EP1088066A1; AU4595399A; ATE346918T1

Description

Hintergrund der Erfindung
a) Gebiet der Erfindung
Es ist das Hauptziel dieser Erfindung modifizierte Oligonukleotid-Therapeutika bereit zu stellen, um selektiv die Gentranskription und -expression in sequenz-spezifischer Art zu verhindern. Insbesondere betrifft diese Erfindung die selektive Hemmung der Proteinbiosynthese durch die Antisense-Strategie unter Verwendung von aus Arabinonukleotid- oder modifizierten Arabinonukleotid-Resten hergestellten Oligonukleotiden. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden mit Arabiose-Zuckern, um sie mit komplementärer RNS, wie zellulärer Boten-RNS, viraler RNS etc. zu hybridisieren. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung von Arabinonukleinsäure- oder modifizierten Arabinonukleinsäure-Strängen, um sie mit der komplementären RNS zu hybridisieren und das Spalten (durch RNase H-Aktivierung) zu induzieren. Andere erfindungsgemäße Anwendungen betreffen die Verwendung der auf Arabinonukleotiden oder modifizierten Arabinonukleotiden basierenden Antisense-Oligonukleotide in Kombination mit RNase H als Laborreagenzien zur sequenz-spezifischen Spaltung und Kartierung von RNS. Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung von auf Arabinonukleotiden oder modifizierten Arabinonukleotiden basierenden Oligonukleotiden, besonders solchen aus 2'F-Arabinonukleinsäure-Strängen bestehenden, um sie mit Doppelstrang-DNS zu hybridisieren, um einen Tri pelhelix-Komplex zu bilden und dabei die DNS-Transkription zu blockieren.
(b) Beschreibung des Stande der Technik
Die Antisense-Strategie
Antisense-Oligonukleotide (AON) sind neue Therapeutika, welche die spezifische Genexpression in sequenz-spezifischer Art verhindern können. Viele AON befinden sich derzeit in einer Klinikstudie zur Behandlung von Krebs und viralen Erkrankungen (zum Überblick siehe (i) Uhlmann, E.; Peyman, A. Chem. Rev. 1990, 90, 543. (ii) Cook, P.D. Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585. (iii) Crooke, S.T. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992, 32, 329. (iv) Crooke, S.T.; Lebleu, B. Antisense Research and Applications; 1993, pp.579, CRC Press, Boca Raton, FL. (v) Agrawal, S.; Iyer, R.P. Cur. Op. Biotech. 1995, 6, 12. (vi) DeMesmaeker, A.; Haner, R.; Martin, P.; Moser, H. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 366. (vii) Crooke, S.T.; Bennett, C.F Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996, 36, 107). Für eine mögliche klinische Verwendung sollten AON Stabilität gegenüber dem Abbau durch Serum- und zelluläre Nukleasen besitzen, eine geringe, unspezifische Bindung an Serum- und Zellproteine zeigen (diese Bindung würde die Menge des zur Verfügung stehenden Antisense-Oligonukleotids, das mit der Ziel-RNS Basenpaare bildet, verringern), eine verstärkte Erkennung der Ziel-RNS-Sequenz aufweisen (mit anderen Worten, bei physiologischer Temperatur eine erhöhte Stabilität der Antisense-Ziel-RNS-Doppelhelix aufweisen) und in gewissem Maße Zell-Membran-Permeabilität zeigen. Die Bildung einer Doppelhelix zwischen dem Anti sense-Oligomer und seiner Ziel-RNS blockiert die Translation dieser RNS durch einen Mechanismus namens „Translations-Arrest". Dieser Mechanismus mag allerdings ein geringer Beitrag zum Gesamt-Antisense-Effekt sein. Wichtiger ist die Fähigkeit des Antisense-Oligonukleotids die Aktivierung der Ribonuklease H (RNase H) zu induzieren, einem endogenen Enzym, das spezifisch RNS abbaut, wenn diese mit einer komplementären DNS-Oligonukleotid- (oder Antisense-Oligonukleotid-)Komponente eine Doppelhelix bildet (Walder, R.T.; Walder, J.A. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988, 85, 5011). Beispielsweise spaltet RNase H mRNS an der Stelle, an der ein Antisense-DNS-Oligonukleotid an ein mRNS-Transkript hybridisiert. Antisense-Oligomere, welche die Genexpression durch mehr als einen Wirkmechanismus modulieren, sind sehr erstrebenswert, da dies die emögliche Effektivität der Antisense-Verbindung in vivo erhöht.
Oligonukleotid-Analoga
Oligonukleotide bestehend aus natürlichen Zuckern (D-Ribose und D-2-Desoxyribose) und Phosphodiester (PO)-Bindungen werden schnell durch Serum- und intrazelluläre Nukleasen abgebaut, was ihre Verwendung als effektive Therapeutika begrenzt. Chemische Strategien zur Verbesserung der Nuklease-Stabilität umfassen Modifizierung des Zuckerrests, des Basenrests und/oder Modifizierung oder Austausch der Internukleotid-Phosphodiester-Bindung. Aktuell sind die am meisten untersuchten Analoga Phosphorothioat (PS)-Oligodesoxyonukleotide, in denen eines der nicht-brückenden Sauerstoffatome im Phosphodiester-Rück grad gegen Schwefel ausgetauscht wird (Eckstein, F. Ann. Rev. Biochem. 1985, 54, 367). Oligonukleotide, die RNase H aktivieren
(vorliegende Erfindung)
Einige Phosphorothioat-Oligonukleotid-Analoga durchlaufen die Evaluierung in einer Klinikstudie zur Behandlung von Krebs und viralen Erkrankungen und einige bewegen sich zügig in Richtung auf Einreichungen Neuer-Arzneimittel-Anwendungen (NDA) (Akhtar, S.; Agrawal, S. „In vivo studies with antisense oligonucleotides" TiPS 1997, 18, 12). Phosphorothioate erhalten die Fähigkeit RNase H-Abbau der Ziel-RNS zu induzieren und zeigen eine gute Stabilität gegenüber Abbau durch Nukleasen. Allerdings bilden die PS-Oligodesoxynukleotide weniger stabile Doppelhelices mit der Ziel-Nukleinsäure als die PO-Oligodesoxynukleotide und zeigen außerdem eine erhebliche, unspezifische Bindung an zelluläre Proteine, was die Wahrscheinlichkeit des Auffindens und Interagierens mit der Ziel-Nukleinsäure vermindern kann; diese Merkmale können die therapeutische Verwendung von PS-AON begrenzen (zum Überblick siehe: Brach, A.D. "A good antisense molecule is hard to find", TIBS, 1998, 23, 45). Weiterhin sind PS-AONs weniger effizient bei der Induzierung des RNase H-Abbaus der Ziel-RNS als die entsprechenden PO-AONs (Agrawal, S.; Mayrand, S.H.; Zamenick, P.; Pederson, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 1401).
Die Spezifität der Wirkung kann durch die Entwicklung neuer Oligonukleotid-Analoga verbessert werden. Derzeitige Strategien zur Entwicklung neuer Oligonukleotide betreffen die Änderung des Internukleotid-Phosphat-Rückgrats, der heterozyklischen Base und des Zuckerrings oder eine Kombination davon. Veränderung oder der vollständige Austausch der Internukleotid-Bindung war der am weitest verbreitete Ansatz mit über 60 untersuchten Arten modifizierter Phosphat-Rückgrate seit 1994 (Sanghvi, Y. DNA in "Altered Backbones in Antisense Applications", in Comprehensive Natural Product Chemistry, Barton, D.H.R.; Nakanishi, K.; Meth-Coth, O. (eds), 1998, Elsevier Science, Oxford, UK). Abgesehen vom Phosphorothioat-Rückgrat sind nur zwei andere beschrieben worden, die RNase H-Aktivität anzuregen, d.h.: die Phosphorodithioat (PS₂)-(Seeberger, P.H.; Yen, E.; Caruthers, M.H. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1472) und die Boranphosphonat-Rückgrate (Sergueev, D. et al., Poster 269, XIII International Round Table, Montpellier, France, Sept. 6-10, 1998; Higson, A.P. et al. Tetrahedron Letters 1998, 39, 3899). Aufgrund des höheren Schwefelgehalts der Phosphorodithioat (PS₂)-gebundenen Oligodesoxynukleotide scheinen sie Proteine fester als die Phosphorothioat (PS)-Oligomere zu binden und die RNase H vermittelte Spaltung mit verminderter Effektivität im Vergleich zu dem PS-Analogon zu aktivieren. Boranphosphonat-gebundene Oligodesoxynukleotide aktivieren die RNase H induzierte Spaltung von RNS-Zielen, allerdings weniger gut als die PO- oder PS-gebundenen Oligodesoxynukleotide.
Unter den beschriebenen Zucker-modifizierten Oligonukleotiden enthalten die meisten von ihnen einen fünfgliedrigen Ring, sehr ähnlich dem Zucker der DNS (D-2-Desoxyribose) und der RNS (D-Ribose). Ein Beispiel für diese sind die α-Oligodesoxynukleotid-Analoga, worin die Konfiguration des 1'- (oder anomeren) Kohlenstoffs, wie unten gezeigt, invertiert wurde (Morvan, F.; Rayner, B.; Imbach, J.-L., Chang, D.K.; Lown, J.W. Nucleic Acids Res. 1987, 15, 7027).
Diese Analoga sind Nuklease-resistent, bilden stabile Doppelhelices mit DNS- und RNS-Sequenzen und sind in der Lage, β-Globin-mRNS-Translation mittels eines RNase H unabhängigen Antisense-Mechanismus zu inhibieren (Boiziau, C.; Kurfurst, R.; Cazanave, C.; Roig, V.; Thuong, N.T. Nucleic Acids Res. 1991, 19, 1113). Andere Beispiele, ebenfalls unten gezeigt, sind Xylo-DNS, 2'-O-Me-RNS und 2'-F-RNS (Überblick in Sanghvi, Y.S.; Cook, P.D. in "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Sanghvi, Y. S.; Cook, P. D. (eds), ACS Symposium Series, vol. 580, pp. 1, American Chemical Society, Washington DC, 1994).
Zucker-modifizierte Oligonukleotid-Analoga, die nicht die RNase H aktivieren
Diese Analoga bilden stabile Doppelhelices mit RNS-Zielen; diese Doppelhelices sind allerdings keine Substrate für RNase H. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden Oligonukleotide mit einem gemischten Rückgrat („MBO") synthetisiert, die aus Phosphodiester (PO)- oder Phosphorothioat (PS)-Oligonukleotid-Segmenten zusammengesetzt werden, die auf beiden Seiten von Zuckermodifizierten Oligonukleotid-Segmenten flankiert werden (Zhao, G. et al., Biochem. Pharmacol. 1996, 51, 173; Crooke, S.T. et al. J. Pharmcol. Exp. Ther. 1996, 277, 923). Unter diesen MBOs ist die [2'-OMe-RNS]-[PS-DNS] – [2'OMe-RNS]-Chimäre aktuell am meisten untersucht. Das PS-Segment in der Mitte der Kette dient als RNase H-Aktivierungs-Domäne, wobei die flankierenden 2'-OMe-RNS-Regionen die Affinität des MBO-Strangs für die Ziel-RNS erhöhen. MBOs besitzen eine erhöhte Stabilität in vivo und scheinen sowohl in vitro als auch in vivo in ihrer biologischen Aktivität effektiver als Phosphorothioat-Analoga zu sein. Beispiele dieses Ansatzes umfassen 2'-OMe und andere Alkoxy-Substituenten in den flankierenden Regionen ei nes Oligonukleotids und besitzen, wie von Monia et al. gezeigt, eine erhöhte Antitumor-Aktivität in vivo (Monia, P.B.; Johnston, J.F.; Geiger, T.; Muller, M.; Fabbro D. Nature Med. 1996, 2, 668). Es finden verschiedene vorklinische Studien mit diesen Analoga statt (Akhtar, S.; Agrawal, S. "In vivo studies with antisense oligonucleotides" TiPS 1997, 18, 12).
Die Synthese von Hexopyranosen anstelle von Pentofuranose-Zuckern enthaltenden Oligonukleotiden wurde ebenfalls berichtet (Herdewijn, P. et al., in "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Sanghvi, Y.S.; Cook, P.D. (eds), ACS Symposium Series, vol. 580, pp. 80, American Chemical Society, Washington DC, 1994). Einige dieser Analoga besitzen eine erhöhte enzymatische Stabilität, leiden aber im Allgemeinen an einer verminderten Doppelhelix-Bildungfähigkeit mit der Ziel-Sequenz. Eine bemerkenswerte Ausnahme bilden die 6'→4' gebundenen aus 1,5-Anhydrohexitol-Einheiten gebildeten Oligomere, die aufgrund ihrer hoch-vororganisierten Zuckerstruktur sehr stabile Komplexe mit RNS bilden (van Aeroschot, A.C. et al., Nucleosides & Nucleotides 1997, 16, 973). Allerdings wurde für keine dieser Hexopyranose-Oligonukleotid-Analoga gezeigt, dass sie RNase H-Aktivität auslösen. Kürzlich wurden Oligonukleotide mit vollständig modifizierten Rückgraden synthetisiert. Bemerkenswerte Beispiele sind die Peptid-Nukleinsäuren („PNA") mit einem azyklischen Rückgrat (Nielsen, P.E. in "Perspectives in Drug Discovery and Design", vol. 4, pp. 76, Trainor, G.L. (ed.), ESCOM, Leiden, 1996). Diese Verbindungen besitzen außergewöhnliche Hybridisierungseigenschaften und Stabilität gegenüber Nukleasen und Proteasen. Allerdings wurden Bemühungen PNA-Oligomere als Antisense-Konstrukte zu verwenden durch eine schlechte Wasserlöslichkeit, Selbst-Aggregations-Eigenschaften, schlechte Aufnahme in die Zelle und die Unfähigkeit die RNase H zu aktivieren behindert. Kürzlich wurden PNA-[PS-DNS-PNA-Chimären konstruiert, um die RNase H vermittelte Spaltung mittels des PS-DNS-Teils der Chimäre beizubehalten (Bergman, F.; Bannworth, W.; Tam, S. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 6823; Van der Laan, A.C. et al. Trav. Chim Pays-Bas 1995, 114, 295).
Arabinonukleoside und Arabinonukleinsäuren (ANA)
Arabinonukleoside sind Stereoisomere der Ribonukleoside, die sich nur in der Konfiguration an der 2'-Position des Zuckerrings unterscheiden. Sie haben eine erhebliche Bedeutung in der Chemotherapie und als solche sind sie ausführlich als antivirale und Antikrebs-Medikamente verwendet worden (zum Überblick siehe: Wright, G.E.; Brown, N.C. Pharmacol. Ther. 1990, 47, 447). β-D-Arabinofuranosylcytosin (ara-C) ist das erfolgreichste Nukleosid-antileukemische Mittel und wird weithin in Kombinationstherapie oder in hohen Dosen als Einzelmittel verwendet, um Patienten mit akuten lymphoblastischen und myeloblastischen Leukemien zu behandeln (Kufe, D.W.; Spriggs, D.R. Semin. Oncol. 1985, 12, 34; Lauer et al. Cancer 1987, 60, 2366).
Aus Arabinonukleotiden hergestellte Oligonukleotide („Arabinonukleinsäuren" oder ANA) sind aus vielen verschiedenen Gesichtspunkten untersucht worden. ANA-Oligomere sind als Pro-Pharmaka synthetisiert worden, im Bestreben die Löslichkeit der Arabinonukleosid-Therapeutika zu verbessern. Die Aufnahme der ara-C in DNS-Stränge ist ebenfalls im Fokus der Forschung gewesen, um den Wirkmechanismus dieses Antikrebs-Arzneimittels zu verstehen (Mikita, T.; Beardsley, G.P. Biochemistry 1988, 27, 4698; Mikita, T.; Beardsley, G.P. Biochemistry 1994, 33, 9195).
Arabinonukleoside enthaltende DNS-Stränge sind auch Gegenstand einer Anzahl struktureller Studien gewesen. Im Kristall nehmen ara-C enthaltende DNS-Doppelhelices eine normale B-Typ-Doppelhelix mit nur kleinen konformativen Störungen am ara-C-dG-Basenpaar ein (Chwang, A.K.; Sundaralingam, M. Nature 1973, 243,78; Teng, M. et al. Biochemistry 1989, 28, 4923; Gao, Y.-G. et al., Biochemistry 1991, 30, 9922). Mikita und Beardsley präparierten DNS/DNS- und DNS/RNS-Doppelhelices, die ein einziges araC-G-Basenpaar enthalten, um die durch die Arabinonukleotide verursachten Strukturverformungen zu untersuchen. Sie fanden, dass sowohl die DNS-Doppelhelix als auch der DNS/RNS-Hybrid ein ara-C-dG(rG)-Basenpaar mit nur einem mäßigen und äquivalenten Verlust an Stabilität aufnehmen kann (Mikita, T.; Beardsley, G.P. Biochemistry 1994, 33, 9195). Pfleiderer und Mitarbeiter synthetisierten ein reines Arabinose-Oligonukleotid, das ein Transfer-RNS-Molekül nachahmt (Resmini, M.; Pfleiderer, W. Helv. Chim. Acta 1993, 76, 158).
Die Assoziierungs-Eigenschaften der einheitlich modifizierten Oligoarabinonukleotide (ANA) wurden von Giannaris und Damha und unabhängig davon von Watanabe und Mitarbeitern untersucht (Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909; Kois, P.; Watanabe, K.A. Nucleic Acids Symposium Series 1993, 29, 215; Kois, P. et al. Nucleosides & Nucleotides 1993, 12, 1093). Giannaris und Damha zeigten, dass Oligomere aus entweder Purin- oder Pyrimidin-β-Arabinonukleosiden üblicherweise mit komplementärer DNS und RNS mit thermischen Stabilitäten vergleichbar zu denen der korrespondierenden DNS-Stränge assoziieren (Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909). Beispielsweise zeigten sie, dass (a) die Schmelztemperatur des sich ergebenden Komplexes eines mit Poly-Ribo-U und Poly-Desoxy-T assoziiertes Octaarabinoadenylats (ara-A₈) etwas höher war, als die der aus den normalen Ribo-A₈- und Desoxy-A₈-Strängen gebildeten korrespondierenden Komplexe; (b) ara-C₈ und ara(UCU UCC CUC UCC C) mit ihrem komplementären RNS-Strang assoziierten, wenn auch mit geringerer Affinität relativ zu den korrespondierenden nicht-modifizierten Strängen; (c) ara-U₈ unter Bedingungen, unter denen Ribo-U₈ und Desoxy-U₈ einen Komplex mit Poly-rA bilden, nicht an Poly-rA bindet. Giannaris und Damha zeigten außerdem, dass der Austausch der normalen Phosphodiester (PO)-Bindung in ANA-Oligomeren mit Phosphorothioat (PS)-Bindungen ernste destabilisierende Wirkung besitzt; die Destabilisierung war größer, als die beobachtete, wenn die PO-Bindungen eines normalen DNS-Strangs mit PS-Internukleotid-Bindungen ersetzt wurden (Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909). ANA-Oligomere zeigten einige Stabilität gegenüber Spaltung durch Schlangengift-Phosphodiesterase; allerdings wurden sie zügig durch Nuklease P1, Ribonuklease S1 und Milz-Phosphodiesterase abgebaut (Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909).
Watanabe und Mitarbeiter integrierten 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinofuranosylpyrimidin-Nukleoside (2'F-ara-N, wobei N=C, U und T) an verschiedenen Positionen in eine normale DNS-Kette und beurteilten die Hybridisierungs- Eigenschaften von solchen (2'F)-ANA-DNS-Chimären gegenüber komplementärer DNS (Kois, P. et al. Nucleosides & Nucleotides 1993, 12, 1093). Sie fanden, dass Substitutionen mit 2'F-ara-U und 2'F-ara-C eine destabilisierende Wirkung auf die Stabilität der Doppelhelix haben, wohingegen die Substitution mit 2'F-ara-T verglichen mit nicht-modifizierten Oligodesoxynukleotid-Strängen stabilisierte. Die Autoren berichteten ebenfalls, dass 2'F-ara-T₁₁- und 2'F-ara-U₁₁-(DNS)-Oligomere in der Lage sind, an komplementäre DNS mit gleicher oder leicht besserer Affinität verglichen zum Kontroll-dT₁₁-(DNS) Oligomer zu binden. Marquez und Mitarbeiter bewerteten kürzlich die Selbstassoziation eines DNS-Strangs, in dem zwei interne Thymidine durch 2'F-ara-T's ersetzt worden waren (Ikeda et al. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2237). Sie bestätigten die Ergebnisse von Watanabe und Mitarbeitern, dass interne 2'F-ara-T Reste die DNS-Doppelhelix maßgeblich stabilisieren. Die Assoziation dieser (2'F)-ANA-DNS-„Chimären" mit komplementärer RNS (dem typischen Antisense-Ziel) wurde nicht berichtet.
Kürzlich untersuchten Noronha und Damha auf β-D-Arabinose basierende Oligonukleotide auf ihre Fähigkeit Doppelhelix-DNS, Doppelhelix-RNS und DNS/RNS-Hybride zu erkennen (Noronha, A.; Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2665). Es wurde gezeigt, dass ein Pyrimidin-Oligoarabinonukleotid Tripelhelix-Komplexe mit Doppelstrang-DNS und Hybrid-DNS(Purin)/RNS(Pyrimidin) bildet. Allerdings wurde gefunden, dass dieses Oligoarabinonukleotid mit einer Affinität bindet, die relativ zu den natürlichen Pyrimidin-Oligodesoxynukleotid- oder Oligoribonukleotid-Kontrollen geringer war.
Aus α-Arabinofuranosylthymin (α-ara-T) gebildete Oligomere zeigten eine große Abnahme der Schmelztemperatur gegenüber komplementärer DNS im Vergleich zum Kontroll-DNS (β-dT)-Strang (Adams, A. D.; Petrie, C. R.; Meyer Jr., R.B. Nucleic Acids Res. 1991, 19, 3647). Auf der anderen Seite besaßen die zwischen entweder α-ara-T₁₅ oder dT₁₅ und komplementärer RNS (Poly-rA) gebildeten Doppelhelices eine ähnliche Stärke. Jüngst berichteten Wengel und Mitarbeiter die Synthese und Assoziations-Eigenschaften von DNS-Oligomeren mit einem und zwei β-2'-OMe-ara-T-Einschüben (Gotfredsen, C.H.; Spielmann, P.; Wengel, J.; Jacobsen, J.P. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 680). Diese Oligomere zeigten im Vergleich zu nicht-modifizierten DNS-Kontrollen mäßig erniedrigte thermische Stabilitäten sowohl gegenüber DNS als auch RNS. Dieselben Autoren berichteten, dass aus α-2'-OMe-ara-T-Einheiten hergestellte Oligomere im Vergleich zu normalen DNS-Kontrollen eine erhöhte Affinität gegenüber den Riboadenylat(RNS)-Zielen aufweisen; allerdings zeigten α-2'-OMe-ara-T-Stränge keinen Vorteil relativ zu den bekannten α-dT-Oligomeren. Die Empfindlichkeit der obigen Doppelhelices gegenüber RNase H vermittelter Spaltung wurde nicht untersucht.
Aktivierung der RNase H durch Antisense-Oligonukleotide
Wie oben beschrieben ist ein wichtiger Wirkmechanismus von Antisense-Oligonukleotiden die Induktion zellulärer Enzyme, wie der RNase H, um die Ziel-RNS abzubauen (Walder, R.T.; Walder, J.A. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988, 85, 5011; Chiang et al. J. Biol Chem. 1991, 266, 18162; Monia et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Giles, R.V.; Spiller, D.G.; Tidd, D.M. Antisense Res. & Devel. 1994, 5, 23; Giles et al. Nucleic Acids Res. 1995, 23, 954). RNase H hydrolysiert selektiv den RNS-Strang einer DNS/RNS-Heterodoppelhelix (Hausen, P.; Stein, H. Eur. J. Biochem. 1970, 14, 279). RNase H1 aus dem Bakterium Escherichia coli ist das am leichtesten erhältliche und das am besten charakterisierte Enzym. Studien mit RNase H enthaltenden eukaryotischen Zellextrakten legen nahe, dass sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Enzyme die gleichen Spaltungseigenschaften aufweisen (Monia et al. J. Biol. Chem. 1993, 268, 14514; Crooke et al. Biochem J. 1995, 312, 599; Lima, W.F.; Crooke, S.T. Biochemistry 1997, 36, 390). Von Escherichia coli RNase H wird geglaubt, sie binde in der kleine Furche der DNS/RNS-Doppelhelix und spalte die RNS sowohl mittels Endonuklease- als auch mittels prozessiver 3'→5'-Exonuklease-Aktivitäten (Nakamura, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1991, 88, 11535; Federoff, O.Y.; Salazar, M.; Reid, B.R. J. Mol. Biol. 1993, 233, 509; Daniher, A.T. et al. Bioorg. & Med. Chem. 1997; 5, 1037). Die Effektivität des RNase H-Abbaus zeigt eine minimale Sequenz-Abhängigkeit und ist ziemlich anfällig für chemische Änderungen im Antisense-Oligonukleotid. Beispielsweise baut die RNase H in PS-DNS/RNS-Hybriden die RNS ab (Gao et al. Mol. Pharmacol. 1991, 41, 223), aber nicht in Hybriden aus Methylphosphonat-DNS, α-DNS oder 2'-OMe-RNS-Antisense-Strängen (zum Überblick siehe Sanghvi, Y.S.; Cook, P.D. (eds), ACS Symposium Series, vol. 580, pp. 1, American Chemical Society, Washington DC, 1994). Weiterhin kann E.coli RNase H, obwohl sie an RNS/RNS-Doppelhelices bindet, diese nicht spalten, trotz der Tatsache, dass die globalhelikale Konformation von RNS/RNS-Doppelhelices ähnlich der von DNS/RNS-Substrat-Doppelhelices ist („A"-Form- Helices) (Oda et al. Nucleic Acids Res. 1993, 21, 4690). Diese Ergebnisse legen nahe, dass lokale strukturelle Unterschiede zwischen DNS/RNS (Substrat)- und RNS/RNS-Doppelhelices, zumindest in Teilen, für die Substrat-Unterscheidung verantwortlich sind (Oda et al. Nucleic Acids Res. 1993, 21, 4690; Lima, W.F.; Crooke, S.T. Biochemistry 1997, 36, 390). Diesbezüglich ist es interessant zu erwähnen, dass HIV-I-Reverse-Transkriptase (RT)-assoziierte RNase H sowohl DNS/RNS als auch RNS/RNS-Doppelhelices spaltet, allerdings ist die Spaltung der letzteren 30-fach langsamer und tritt nur auf, wenn die RT künstlich angehalten wird (Gotte et al., EMBO J. 1995, 14, 838).
Arabinonukleinsäuren als Aktivatoren der RNase H-Aktivität
Eine wesentliche Anforderung an den Antisense-Ansatz ist, dass ein Oligonukleotid oder sein Analogon seine komplementäre Ziel-RNS erkennt und fest bindet. Die Fähigkeit des entstehenden Antisense-Oligomer/RNS-Hybrids als Substrat der RNase H zu dienen, besitzt wahrscheinlich therapeutischen Wert durch eine Verstärkung des Antisense-Effekts relativ zu Oligomeren, die nicht in der Lage sind dieses Enzym zu aktivieren. Abgesehen von PS-DNS (Phosphorothioaten), PS₂-DNS (Phosphorodithioaten), Boranphosphonat-gebundener-DNS und MBO-Oligonukleotiden mit einem internen PS-DNS-Segment, gibt es keine anderen Beispiele vollständig modifizierter Oligonukleotide, die RNase H-Aktivität auslösen. Aus diesem Grund und auf Grund der mit PS-Oligonukleotiden aufgetretenen Probleme (z.B. Nicht-Antisense-Effekte und das mögliche Risiko von Toxi zität) haben wir alternative Oligonukleotid-Analoga konstruiert, die selektiv die Genexpression durch die Aktivierung der RNase H-Aktiviät hemmen. Als Ausgangspunkt dachten wir, dass solche Analoga (a) die natürliche β-D-Furanose-Konfiguration behalten, (b) nicht-modifizierte Phosphatgruppen zu Löslichkeitszwecken besitzen und (c) in der Lage sein sollten, die Konformation von DNS-Strängen zu imitieren (z.B. mit in der C2'-endo-Konformation gefalteten Zuckern). Die letzte Anforderung rührt von der Tatsache her, dass der Antisense-Strang von natürlichen Substraten, wie oben gezeigt, DNS ist und seine Primärstruktur (und/oder Konformation) für die RNase H/Substrat-Spaltung notwendig zu sein scheint. Da die DNS-Zucker von DNS/RNS-Hybriden hauptsächlich die C2'-endo-Konformation annehmen (Salazar, M.; Champoux, J.J.; Reid, B.R. Biochemistry 1993, 32, 739; Salazar, M.; Federoff, O.Y.; Reid, B.R. Biochemistry 1996, 35, 8126), waren wir an einem Oligonukleotid-Analogon interessiert, das diese Konformation bevorzugte. Die RNS-Struktur imitierende Analoga (d.h. solche, die lieber die C3'-endo- als die C2'-endo-Konformation annehmen) wären nicht geeignet RNase H-Aktivität hervorzurufen, da es bekannt ist, dass RNS/RNS-Doppelhelices allgemein keine Substrate der RNase H sind. Dies veranlasste uns, aus Arabinonukleotiden hergestellte Oligomere in Betracht zu ziehen (d.h. die Arabinonukleinsäuren oder ANA). ANA ist ein Stereoisomer der RNS, das sich nur in der Stereochemie an der 2'-Position des Zuckerrings unterscheidet. ANA/RNS-Doppelhelices nehmen eine helikale Struktur an, die der von DNS/RNS-Substraten („A"-Form) sehr ähnlich ist, wie durch ähnliche Zirkulardichroismus-Spektren dieser Komplexe gezeigt wurde. Außerdem zeigten Röntgenkristallstrukturstudien an Ara-C-Nukleosiden und an Ara-C enthaltenden DNS- Doppelhelices, dass der Arabinosezucker die C1'-exo- oder die C2'-endo-Konformation annimmt; die letztere Konformation wird in DNS-Zuckern von DNS/RNS-Substraten gefunden. Ferner legte die Untersuchung von molekularen Modellen einer A-Typ-ANA/RNS-Doppelhelix nahe, dass die β-2'-OH-Gruppe des Arabinose-Strangs in der großen Furche des Hybrids positioniert ist und daher nicht bei der Bindung und den katalytischen Prozessen der RNase H stören sollte. Wir erwogen ebenfalls die β-2'-OH durch andere elektronegative Substituenten, z.B. β-2'-Fluor, zu ersetzten, da von starken stereoelektrischen Effekten erwartet wird, die C2'-endo-Form zu stabilisieren (Saenger, W. Principles of Nucleic Acids Structure, Cantor, C.R. (ed.), Springer-Verlag, N.Y., 1984; Marquez, V.E.; Lim, B.B.; Barchi, J.J., Jr.; Nicklaus, M.C. "Conformational studies of anti-HIV activity of mono- and difluorodideoxynucleosides", in Nucleosides and Nucleotides as Antitumor and Antiviral Agents, Chu, C.K.; Baker, D.C. (eds.), pp. 265-284, Plenum Press, N.Y., 1993). Die Möglichkeit eines ANA-Oligomers RNase H zu aktivieren wurde noch nicht berichtet.
Es wäre äußerst wünschenswert, mit ANA-Oligomeren und seinen Analoga zur sequenz-spezifischen Hemmung der Genexpression über Bindung an (und RNase H vermittelte Spaltung von) komplementäre(r) Boten-RNS ausgestattet zu sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist die erfindungsgemäße Aufgabe ANA-Oligomere und ihre Analoga zur sequenz-spezifischen Hemmung der Genex pression über Assoziation an (und RNase H vermittelte Spaltung von) komplementäre(r) Boten-RNS bereit zu stellen.
Die vorliegende Erfindung stellt Zucker-modifizierte Oligonukleotide bereit, die eine Doppelhelix mit ihrer Ziel-RNS-Sequenz ausbilden. Die entstehende Doppelhelix ist Substrat der RNase H, eines Enzyms, das diese Doppelhelix erkennt und den Zielteil der RNS abbaut. RNase H vermittelte Spaltung von RNS-Zielen wird als ein Hauptmechanismus der Aktivität von Antisense-Oligonukleotiden betrachtet. Die Zucker-modifizierten Oligomere werden in den Ansprüchen bestimmt.
Vor dieser Erfindung wurde berichtet, dass nur natürliche DNS (Desoxyribonukleinsäure-Phosphodiester) oder auf Phosphorothioat-(PS-DNS), -dithioat- und Boranphosphonat-Rückgraten beruhende Desoxyribonukleinsäure-Oligonukleotide RNase H-Abbau der Ziel-RNS auslösen. Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, dass bestimmte gleichmäßig Zucker-modifizierte, und zwar auf 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleotiden (z.B. 2'F-ANA-Oligomeren) beruhende Oligonukleotide RNase H-Aktivität aktivieren können, wenn sie als Doppelhelix mit den Ziel-RNS-Sequenzen vorliegen.
Ebenso werden auf 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleosiden (z.B. 2'F-ANA-Oligomeren) basierende Oligonukleotide bereit gestellt, die relativ zu nicht-modifizierten Oligodesoxynukleotiden mit einer größeren Affinität an Doppelhelix-DNS binden.
Es wurden bestimmte Sequenz-Oligoarabinonukleotide (ANA und 2'F-ANA) hergestellt und herausgefunden, dass sie die Expression einer spezifischen Ziel-mRNS hemmen, welche die Expression eines spezifischen Proteins kodiert (Luziferase). Diese Hemmung wurde beobachtet sowohl in Experimenten, welche die Hemmung der Expression eines Zielproteins bei in vitro Transkription/Translation des Zielproteins. (in Anwesenheit eines großen Überschusses an von dem in vitro Transkriptions/Translations-System beigetragenem unspezifischen exogenen Protein) beurteilten als auch in Experimenten, welche die Expression eines Zielproteins in intakten Zellen beurteilen.
Zusammengefasst begründen unsere Experimente, dass ANA-Oligomere als hervorragende Modelle für Antisense-Mittel dienen, die eine erhöhte Beständigkeit gegenüber der Aktivität von abbauenden Nukleasen besitzen, an RNS unter Bildung einer Doppelhelix binden, RNase H-Aktivität auslösen und in vitro und intrazellulär die spezifische Genexpression hemmen. Folglich besitzen ANA und seine Analoga möglichen Nutzen als Therapeutika und/oder als Werkzeuge zum Studium und zur Kontrolle spezifischer Genexpression in Zellen und Organismen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A-1B stellen die thermischen Schmelzkurven von 18-Bp Heterodoppelhelices dar;
2A-2C stellen die Zirkulardichroismus-Spektren der Doppelhelices dar;
3 stellt die thermischen Schmelzkurven tripelhelikaler Komplexe dar, gebildet durch die Assoziation des Oligoarabinonukleotids SEQ ID NO: 13 mit DNS/DNS („DD") und DNS/RNS („DR") Haarnadelschleifen-Doppelhelices;
4 stellt den Gel-Mobility-Shift-Tripelhelix-Assay unter nicht-denaturierenden Bedingungen dar;
5 stellt Oligonukleotide mit β-D-Arabinose als Zuckerkomponente dar, die RNase H-Abbau der komplementären Ziel-RNS auslösen;
6 stellt homopolymere Oligonukleotide mit 2'-F-β-D-Arabinose als Zuckerkomponente dar, die RNase H-Abbau der komplementären Ziel-RNS auslösen;
7 stellt heteropolymere Oligonukleotide mit 2'F-β-D-Arabinose als Zuckerkomponente dar, die RNase H-Abbau der komplementären Ziel-RNS auslösen;
8 stellt die Stabilität von Oligonukleotiden mit 2'F-β-D-Arabinose als Zuckerkomponente gegenüber des Abbaus durch Serum-Nukleasen dar;
9 stellt die Stabilität von Oligonukleotiden mit 2'F-β-D-Arabinose als Zuckerkomponente gegenüber des Abbaus durch Schlangengift-Phosphodiesterase I dar;
10 stellt auf β-D-Arabinose und 2'Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose basierende Oligonukleotide dar, die eine geringe unspezifische Bindung an zelluläre Proteine zeigen;
11 stellt die Oligonukleotid-Hemmung spezifischer Genexpression in einem in vitro-Protein-Translations-System dar; und
12 stellt die Oligonukleotid-Hemmung der Luziferase-Genexpression in HeLa X1/5-Zellen dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die in den Ansprüchen beanspruchten Oligonukleotide und die therapeutische Verwendung solcher Verbindungen. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Oligonukleotid-Analogon bereitzustellen, das mit komplementären Nukleinsäuren hybridisiert, die mRNS, virale RNS (umfassend retrovirale RNS) sein können. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung der in den Ansprüchen beanspruchten Oligonukleotide, um komplementäre RNS mittels RNase H-Aktivierung zu spalten. Andere erfindungsgemäße Anwendungen betreffen die Verwendung von auf Arabinonukleotiden basierenden Antisense-Oligonukleotiden in Kombination mit RNase H als Laborreagenzien zur sequenz-spezifischen Spaltung und Kartierung von RNS.
Die Oligonukleotide können durch die folgende Formel (I) dargestellt werden:
wobei B eine gewöhnliche Purin- oder Pyrimidin-Base, wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil umfasst, aber nicht notwendigerweise darauf begrenzt ist. Der Zucker ist β-D-Arabinofuranose, sein Spiegelbild Enantiomer β-L-Arabinofuranose und die korrespondierenden karbozyklischen Zucker (d.h. in denen der Ringsauerstoff an Position 4' durch eine Methylen- oder CH₂-Gruppe ersetzt wurde). Der Substituent Y an der 2'-Position des Zuckerrings an der Internukleotid-Phosphat-Bindung wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Thiol, Methyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Methoxy, und Ethoxy ausgewählt. Die ANA-Oligomere können ebenfalls modifizierte Zucker in einem Teil des Oligomers umfassen. Die Oligonukleotide können ebenfalls den 2'-Desoxy-2',2'-difluor-β-ribofuranosezucker (D- oder L-Konfiguration) in einem Teil oder im gesamten Oligomer umfassen (diese Struktur wird durch Ersetzten des 2'-H-Atoms in Formel I durch ein Fluoratom erhalten, wodurch ein Oligonukleotid mit zwei Fluoratomen am 2'-Kohlenstoff gebildet wird). Die Oligonukleotide können ebenfalls Bereiche ssDNS umfassen, die von ANA-Segmenten (z.B. ANA-DNS-ANA, 2'F-ANA-DNS-2'F-ANA-Chi-mären) oder einer Kombination von ANA und 2'F-ANA-Segmenten (z.B. ANA-2'F-ANA-Chimären) flankiert werden. Die ANA-Oligomere enthalten eine Sequenz, die komplementär zu einer spezifischen Sequenz einer mRNS oder einer genomischen viralen RNS ist, so dass das Oligonukleotid spezifisch die Proteinbiosynthese bzw. Virusreplikation (Reverse-Transkription) hemmen kann: Ein komplementäres Ziel kann auch Doppel- oder Einzelstrang-DNS sein, so dass der Arabinonukleotid-Strang spezifisch die DNS-Replikation und/oder -Transkription hemmen kann. Auf das 5'- und/oder 3'-Ende oder das Phosphatrückgrat oder die Zuckerreste gerichtete Teilmodifikationen an dem Oligonukleotid, um seine Antisense-Eigenschaften (z.B. Nuklease-Beständigkeit) zu vergrößern, liegen im erfindungsgemäßen Schutzumfang.
Eine Gruppe der erfindungsgemäß nützlichen Oligonukleotide sind solche, worin B eine natürliche Base (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil) darstellt; die Mehrheit der Zucker β-D-Arabinofuranose ist, X Fluor darstellt; Y Sauerstoff darstellt, da diese Modifikationen zu Oligomeren führen, die eine große Affinität zu Einzelstrang-RNS, Einzelstrang-DNS und Doppelstrang-DNS besitzen. Zudem wurde gezeigt, dass diese Oligomere den notwendigen Anforderungen für Antisense-Therapeutika gerecht werden. Beispielsweise aktivieren sie die RNase H-Aktivität, zeigen Beständigkeit gegenüber zellulären und Serum-Nukleasen, hemmen die Expression einer spezifischen Ziel-mRNS, welche die Expression eines spezifischen Proteins in intakten Zellen kodiert und zeigen eine geringe (wenn überhaupt) unspezifische Bindung an zelluläre Proteine, so dass sie möglicherweise in vivo effektiver sind.
Die freien β-D-Arabinose-Pyrimidin-Nukleosid-Monomere (ara-U, ara-C) können aus den entsprechenden Ribonukleosiden in guten Ausbeuten hergestellt werden und weiter zu den entsprechenden 5'-O-Monomethoxytrityl-2'-O-acetyl-3'-O-(β-cyanoethylphosphoramidit)-Derivaten aufgearbeitet werden, die für die Festphasen-Oligonukleotid-Synthese geeignet sind (Giannaris, P.A.; Damha, M. J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909). Das entsprechende ara-A-Nukleosid ist kommerziell erhältlich und kann leicht aus Riboadenosin hergestellt werden (mittels Oxidation der 2'-OH-Gruppe und Reduktion der 2'-Keto-Gruppe mit einer Hydridquelle, z.B. Robins, M.J. et al. in "Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications", Rideaut, J.L.; Henry, D.W.; Beacham III, L.M. (eds.), pp. 279, Academic Press, Inc., 1993). Das entsprechende ara-G-Monomer kann nach dem Verfahren von Pfleiderer und Mitarbeitern hergestellt werden (Resmini, M.; Pfleiderer, W. Helv. Chim. Acta 1994, 77, 429). Die 3'-O-(β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-Derivate der 5'-MMT-2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleoside (2'F-ara-C, 2'F-ara-A, 2'F-ara-G und 2'F-ara-T) können gemäß den veröffentlichten Verfahren synthetisiert werden (Tann, C.H.; Brodfuehrer, P.R.; Brundidge, S.P.; Sapino, C. Jr.; Howell, H.G. J. Org. Chem. 1985, 50, 3644; Howell; H.G.; Brodfuehrer, P.R.; Brundidge, S.P.; Benigni, D.A.; Sapino, C., Jr. J. Org. Chem. 1988, 53, 85; Kois, P.; Tocik, Z.; Spassova, M.; Ren, W.-Y.; Rosenberg, I.; Farras Soler, J.; Watanabe, K.A. Nucleosides & Nucleotides 1993, 12, 1093; Chou, T.-C.; Burchenal, J.H.; Fox, J. J.; Watanabe, K.A. Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 336).
Die geschützten Arabinonukleosid-Monomere können mittels bekannter Verfahren an das Festkörper-Trägermaterial angelagert werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Festkörper-Trägermaterial ein langkettiges Alkylamincontrolled-Pore-Glass und es wird das Verfahren nach Damha et al. zu seiner Derivatisierung verwendet (Damha et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 3813).
Die erfindungsgemäßen Oligomere (hergestellt aus 2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinose) zeigen eine Reihe von wünschenswerten Eigenschaften:

(1) Es wurde gefunden, dass sie Einzelstrang-RNS binden und mittels Aktivierung der RNase H spalten. Zirku lardichroismus-Studien in Lösung zeigten, dass DNS/RNS-Hybride (das natürliche Substrat der RNase H) und ANA/RNS-Doppelhelices eine sehr ähnliche helikale Struktur annehmen, die zur „A"-Konformationsfamilie gehört. Die Fähigkeit der RNase H RNS in den ANA:RNS-Doppelhelices abzubauen kann, zumindest in Teilen, (a) der Ähnlichkeit der Struktur der ANA/RNS- mit der der DNS/RNS-Doppelhelices und (b) der Tatsache geschuldet sein, dass der 2'-Substituent des Zuckerrings in der großen Furche lokalisiert ist, wo er nicht die Bindung der RNase H und katalytische Prozesse behindert. Es wurde gefunden, dass besonders die 2'-fluorierten ANA-Derivate verglichen mit normalen DNS- und Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotid-Strängen eine ausgezeichnete Affinität zu RNS-Zielen besitzen.
(2) Es wurde gefunden, dass auf β-D-Arabinose basierende und vier Nukleobasen (U, C, A, und G) enthaltende Oligonukleotide mit komplementärer RNS aber nicht mit komplementärer Einzelstrang-DNS hybridisieren. Diese Eigenschaft legt nahe, dass diese Oligomere nützlich sein können, retrovirale genomische RNS zu erfassen (targeting), um frühe Stadien der Virusreplikation, umfassend die Reverse-Transkription, zu hemmen. Dieser hohe Grad an RNS-Spezifität wurde kürzlich für anderer Arten von Oligonukleotid-Analoga beschrieben (z.B. 2',5'-gebundene RNS und 2',5'-gebundene DNS; Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 1993, 20, 4742; Alul, R.; Hoke, G.D. Antisense Res. Dev. 1995, 5, 3), allerdings löst keines dieser Oligonukleotide RNase H-Aktivität aus.
(3) Es wurde ebenso gefunden, dass aus 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleosid-Einheiten hergestellte Pyrimidin-Oligonukleotide mit Doppelstrang-DNS und DNS/RNS-Hybriden unter Bildung einer Tripelhelix hybridisieren. Die thermische Stabilität dieser Tripelhelices ist bedeutend größer als die der aus normalen Oligodesoxynukleotiden gebildeten. Diese Ergebnisse waren unerwartet in Anbetracht, dass die β-D-Arabinose-Reihen Tripelhelices mit nur mäßiger Stabilität ergeben (Noronha, A.; Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2665).
(4) Ergebnisse aus metabolischen Stabilitätsstudien besagen, dass die Arabinose-Modifikation, vor allem die β-D-Arabinose-(2'-OH)-Derivate, im Vergleich zu natürlichen Strängen (PO-DNS) größere Beständigkeit gegenüber des Abbaus sowohl durch Serum als auch durch zellulären Nukleasen zeigen, obwohl weniger als die Phosphorothioat (PS-DNS)-Derivate. Auf das 5'- und/oder 3'-Ende oder das Phosphatrückgrad oder die Zuckerreste gerichtete Teilmodifikationen an dem ANA- oder 2'F-ANA-Oligonukleotid, um die Nuklease-Beständigkeit weiter zu erhöhen, liegen im erfindungsgemäßen Schutzumfang.
(5) ANA und 2'F-ANA zeigen (wenn überhaupt) eine geringe unspezifische Bindung an zelluläre Proteine und Serum-Proteine. Diese Eigenschaft führt zu einer deutlich verbesserten Wechselwirkung von Arabinooligonukleotiden mit der Ziel-RNS in Anwesenheit von Zellproteinen im Vergleich zu den Phosphorothioat-Analoga.

Diese vereinigten Eigenschaften begründen, dass ANA- und 2'F-ANA-Oligomere als herausragende Modelle für Antisense-Mittel dienen, die Beständigkeit gegenüber der Aktivität von abbauenden Nukleasen besitzen, die unter Bildung eines Doppelstrangs an RNS und einzelsträngige DNS binden, die unter Bildung einer Tripelhelix an Doppelstrang-DNS binden und RNase H-Aktivität auslösen. Infolgedessen können Arabinose und ihre Analoga enthaltende Antisense-Oligonukleotid-Konstrukte als Therapeutika und/oder wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung und Kontrolle der Genexpression in Zellen und Organismen dienen.
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung bestimmt. Die Beispiel sind in keinem Falle vorgesehen, den erfindungsgemäßen Schutzumfang zu begrenzen.
Beispiel 1
Herstellung der β-D-Arabinofuranosen enthaltenden Oligonukleotide
Oligoarabinonukleotide (Formel I; X = OH, Y = O^–) wurden unter Verwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie und 3'-ara-C(Bz)-langkettigem Alkylamin-controlled-Pore-Glass-Festkörper-Trägermaterial (lcaa-CPG; 500 Å; Größenordnung 1 μmol) synthetisiert. Die erforderlichen Monomere, und zwar 5'-MMT-2'-OAc-3'-O-(β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-Derivate von ara-A(Bz), ara-C(Bz) und ara-U wurden nach dem Verfahren von Damha et al. synthetisiert (Damha, M.J.; Usman, N.; Ogilvie, K.K. Can. J. Chem. 1988, 67, 831; Giannaris, P.A.; Damha, M.J. Can. J. Chem. 1994, 72, 909). Das entsprechende ara-G (N²-i-Bu, O⁶-NPE)-Monomer wurde durch Modifikation des Verfahrens von Resmini et al. hergestellt (Resmini, M.; Pfleiderer, W. Helv. Chim. Acta 1994, 77, 429). Demnach wurden die Monomere in 0,12 M wasserfreiem Acetonitril gelöst. Vor dem Kettenaufbau wurde das Trägermaterial (1 μmol) mit den Capping-Reagentien Essigsäureanhydrid/N-Methylimidazol/4-Dimethylaminopyridin behandelt (Damha, M.J.; Ogilvie, K.K. in Methods in Molecular Biology, 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Agrawal, S. (ed.), pp. 81, The Humana Press, Inc. Totawa, N.J., 1993). Der Kettenaufbau der Sequenzen wurde unter Verwendung eines Applied-Biosystem-DNS-Synthesizer (Modell 381A) wie folgt durchgeführt: (i) Detritylierung: 3%-ige Trichloressigsäure in Dichlorethan, aufgetragen in 100 s- (+ 40 s „burst"-)Schritten. Das Eluat dieses Schrittes wurde gesammelt und die Absorption bei 478 nm (MMT+, Arabinosequenzen) vermessen, um die mittlere Ausbeute der Kopplungsreaktion zu bestimmen (ca. 60-90%); (b) Nukleosid-Phosphoramidit-Kopplungszeit von 7,5 min; (c) Capping: 1:1 (v/v) Essigsäureanhydrid/Collidin/THF 1:1:8 (Lösung A) und 1-Methyl-1H-imidazol/THF 16:84 (Lösung B), aufgetragen in 15 s + 35 s "wait"-Schritten; (d) Oxidation: 0.1 M Iod in THF/Wasser/Pyridin 7:2:1, aufgetragen als 20 s + 35 s "wait" Schritt. Die 5'-endständige Tritylgruppe wurde vom Synthetisierer getrennt und dann wurden die Oligomere vom Trägermaterial abgetrennt und mittels der Behandlung des CPG mit einer Lösung aus konzentriertem Ammoniumhydroxid/Ethanol (3:1 v/v, 1 mL) für zwei Tage bei Raumtemperatur entschützt. Die Ammoniumhydroxid/Ethanol-Lösung wurde verdampft und das Rohprodukt mittels präparativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit anschließender Gelfiltration (Entsalzung) auf ei ner Sephadex G-25-Säule aufgereinigt. Für Sequenzen mit ara-G-Einheiten war es nötig, das teilweise geschützte Oligomer einem zusätzlichen Schritt zu unterziehen; d.h. im Anschluss an die Ammoniak-Behandlung und den Verdampfungsschritt wurde das Oligomer mit einer Lösung aus 1 M Tetra-n-butylammoniumfluorid (50 μL, R.T., 16 h) in THF behandelt. Dieser Schritt spaltet die p-Nitrophenylethyl-Schutzgruppe an der 06-Position der Guaninreste ab. Diese Lösung wurde dann mit Wasser (1 mL) gestoppt und mittels Größenausschluss-Chromatographie (Sephadex G-25 Säule) entsalzt. Die Aufreinigung wurde dann mittels Gelelektrophorese wie oben beschrieben durchgeführt und das Molekulargewicht mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestimmt. Die Ausbeute, die Basensequenz, die Hybridisierungs-Eigenschaften der synthetisierten Oligomere sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Zurzeit sind nur das 5'-DMT, 2'-OAc, ara-C(Bz)-3'-Phosphoramidit-Derivat und das 3'-ara-C(Bz)-langkettige Alkylamin-controlled-Pore-Glass (lcaa-CPG) kommerziell erhältlich. Als freie (ungeschützte) Nukleoside sind nur ara-C, ara-U und ara-A kommerziell erhältlich.
Beispiel 2
Herstellung der 2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinosezucker enthaltenden Oligonukleotide
Oligoarabinonukleotid-Synthese (Formel I; X = F, Y = O^–) wurde mittels eines Applied-Biosystem-DNS-Synthetisierers (Modell 381A) unter Verwendung des Phosphoramidit-Ansatzes durchgeführt. Die Oligomere wurden in einer Größenordnung von 1 μmol unter Verwendung des lcaa-CPG-Festkörper-Trägermaterials, das 3'-terminale 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleoside trägt, hergestellt. Die als Freisetzung des MMT-Kations beobachteten Kopplungs-Ausbeuten reichten von 60 bis 100 (Mittelwert ca. 80%). Die erforderlichen 3'-O-(β-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-Derivate der 5'-MMT-2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleoside (2'F-ara-C, 2'F-ara-A, 2'F-ara-G und 2'F-ara-T) wurden gemäß der veröffentlichten Verfahren synthetisiert (Tann, C.H.; Brodfuehrer, P.R.; Brundidge, S.P.; Sapino, C. Jr.; Howell, H.G. J. Org. Chem. 1985, 50, 3644; Howell; H.G.; Brodfuehrer, P.R.; Brundidge, S.P.; Benigni, D.A.; Sapino, C., Jr. J. Org. Chem. 1988, 53, 85; Kois, P.; Tocik, Z.; Spassova, M.; Ren, W.-Y.; Rosenberg, I.; Farras Soler, J.; Watanabe, K.A. Nucleosides & Nucleotides 1993, 12, 1093; Chu, C.K.; Matulic- Adamic, J.; Huang, J.-T.; Chou, T.-C.; Burchenal, J.H.; Fox, J.J.; Watanabe, K.A. Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 336). Demnach wurden die Monomere in 0,10 M wasserfreiem Acetonitril gelöst. Vor dem Kettenaufbau wurde das Trägermaterial (1 μmol) mit den Capping-Reagentien Essigsäureanhydrid/N-Methylimidazol/4-Dimethylaminopyridin behandelt (Damha, M.J.; Ogilvie, K.K. in Methods in Molecular Biology, 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Agrawal, S. (ed.), pp. 81, The Humana Press, Inc. Totawa, N.J., 1993). Der Kettenaufbau der Sequenzen wurde wie folgt durchgeführt: (i) Detritylierung: 3%-ige Trichloressigsäure in Dichlorethan, aufgetragen in 140 s- (+ 80 s „burst"-)Schritten. (b) Nukleosid-Phosphoramidit-Kopplungszeit von 10 min; (c) Capping der 5'-Hydroxylgruppen: 1:1 (v/v) Essigsäureanhydrid/Collidin/THF 1:1:8 (Lösung A) und 1-Methyl-1H-imidazol/THF 16:84 (Lösung B), aufgetragen in 15 s- + 35 s "wait"-Schritten; (d) Oxidation der Phosphittriesterbindung: 0.1 M Iod in THF/Wasser/Pyridin 7:2:1, aufgetragen als 20 s- + 35 s "wait"-Schritt. Die 5'-terminale Tritylgruppe wurde vom Synthetisierer abgetrennt und dann wurden die Oligomere vom Trägermaterial abgetrennt und mittels der Behandlung des CPG mit einer Lösung aus konzentriertem Ammoniumhydroxid/Ethanol (3:1 v/v, 1 mL) für zwei Tage bei Raumtemperatur entschützt. Die Ammoniumhydroxid/Ethanol-Lösung wurde verdampft und das Rohprodukt mittels präparativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit anschließender Gelfiltration (Entsalzung) auf einer Sephadex G-25-Säule aufgereinigt. Das Molekulargewicht der Oligomere wurde mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestimmt. Die Ausbeute, die Basensequenz und die Hybridisierung der synthetisierten Oligomere sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Beispiel 3
Assoziations-Eigenschaften der einheitlich mit β-D-Arabinose und β-D-2-Fluor-2-Desoxy-Arabinosezuckern modifizierten Oligonukleotide bei der Bindung an einzelsträngige DNS- und RNS-Ziele
Die Fähigkeit der Oligonukleotide mit einzelsträngigen Nukleinsäuren zu hybridisieren und einen doppelhelikalen-Komplex zu bilden ist ausschlaggebend für ihre Verwendung als Antisense-Therapeutika. Die Bildung eines solchen Komplexes umfasst Stapel- und Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen den Basenchromophoren, ein Prozess der von einer Verminderung der UV-Absorption („Hypochromizität") begeleitet wird. Wenn die Temperatur der Lösung mit dem doppelhelikalen-Komplex schrittweise erhöht wird, brechen die Wasserstoffbindungen und der Doppelstrang dissoziiert in Einzelstränge. Dies reduziert die Menge der Basen-Basen-Wechselwirkungen und führt daher zu einer plötzlichen Zunahme der UV-Absorption. Die Temperatur bei welcher der doppelhelikale-Komplex dissoziiert, mehr oder weniger genau, der Punkt an dem die Hälfte der Population als Komplex und die verbleibende Hälfte als Einzelstränge vorliegt, wird „Schmelztemperatur" (T_m) genannt. Daher umfasst eine allgemeine in der Nukleinsäure-Chemie verwendete Technik, um die Doppelhelix-Bildung (und ihre Stärke) zu untersuchen, das Zusammenmischen äquimolarer Mengen des interessanten Strangs, das Inkubieren bei geringer Temperatur, um den Strängen das Annealing zu ermöglichen und dann die Beobachtung der UV-Absorption bei 260 nm (Absorptionsmaximum) als Funktion der Temperatur. Das Ergebnis ist ein Absorption gegen Temperatur-Diagramm, oder ein sigmoidales „Schmelzprofil" oder eine sigmoidale „Schmelzkurve" aus welcher der T_m (der Mittelpunkt der Steigung der Schmelzkurve) ermittelt wird (Wickstrom, E.; Tinoco, I. Jr. Biopolymers 1974, 13, 2367). Zirkulardichroismus (CD) ist eine weitere leistungsfähige optische Technik zum Studium der Nukleinsäurestruktur und -konformation. Das CD-Spektrum umfasst gewöhnlich in Bezug auf die Wellenlänge (200-350 nm Bereich) einen Bereich der raschen Änderung (Cotton-Effekte). Die Werte, die absolute Intensität und die Posititon der Cotton-Effekte sind besonders empfindlich bezüglich des chemischen Aufbaus und der dreidimensionalen Struktur der Nukleinsäure-Komplexe. CD-Messungen können daher angewendet werden, um die globale helikale Konformation (oder den Helix-Typ) zu bestimmen, genauso wie, um strukturelle Veränderungen (z.B. Helix-zu-Knäul-Übergänge) als eine Funktion der Temperatur zu untersuchen (Bloomfield, V.A.; Crothers, D.; Tinoco, Jr., I. "Physical Chemistry of Nucleic Acids", Harper and Row, N.Y., 1974; Ts'o, P.O.P. (ed.), "Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry", vol. 1 and 2, Academic Press, N.Y., 1974).
Die Bindungseigenschaften der Oligonukleotide (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6) (Basensequenzen siehe Tabellen 1 und 2) mit komplementären DNS- und RNS-Einzelsträngen wurden in einem 140 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2) enthaltenden Puffer ausgewertet, der für intrazelluläre Bedingungen repräsentativ ist (Alberts, B. Molecular Biology of the Cell, pp. 304, Garland, N.Y., 1989). Die molaren Extinktionskoeffizienten der Oligoarabinonukleotid-Stränge wurden unter Verwendung der Nächster-Nachbar-Näherung ermittelt und es wurde angenommen, dass es dieselben wie bei normalen Strängen sind (Puglisi, J.D.; Tinoco, I. Jr. Methods in Enzymology, Dahlberg, J.E.; Abelson, J.N. (eds.), 180, pp. 304, Academic Press, S.D., 1989). Thermische Denaturierungskurven wurden bei 260 nm von 5°C bis 90°C (Heizrate: 0,5°C/min) bei einer Konzentration von ungefähr 2,8 μM von jedem Strang aufgenommen. Die Schmelztemperaturen (T_m) wurden aus Diagrammen der ersten Ableitung der Absorption gegen die Temperatur ermittelt. Die thermischen Denaturierungskurven der Heterodoppelhelices sind in 1A & 1B gezeigt. ANA-(SEQ ID NO: 1), 2'F-ANA (SEQ ID NO: 6) Oligoarabinonukleotide und Kontrol-DNS-, PS-DNS- und RNS-Oligonukleotide wurden mit komplementärer Einzelstrang-RNS (1A) und mit komplementärer Einzelstrang-DNS (1B) hybridisiert.
Die Ergebnisse (1A) zeigen, dass das Arabinonukleotid der gemischten Basensequenz ANA (SEQ ID NO: 1) die Fähigkeit besitzt, mit seinem RNS-Gegenstück eine stabile Heterodoppelhelix zu bilden, die eine T_m von 44°C verglichen mit 72°C für die korrespondierende natürliche DNS/RNS-Heterodoppelhelix aufweist. Eine 1 : 1-Mischung von ANA (SEQ ID NO: 1) und seinem DNS-Gegenstück zeigte einen deutlich schwächeren und breiteren Übergang nahelegend, dass unter den verwendeten Bedingungen SEQ ID NO: 1 nicht an Einzelstrang-DNS bindet (1B). Die in 1A und Tabelle 2 gezeigten Daten zeigen ebenso, dass die Wechselwirkung von 2'F-Oligoarabinonukleotiden mit komplementärer RNS zu der Bildung von Heterodoppelhelices führt, die relativ zu den aus natürlichen (PO-DNS)- und Thioat-(PS-DNS) Strängen gebildeten Komplexen von besserer thermischer Stabilität sind. Beispielsweise beträgt der T_m der 2'F-araA₁₈ (SEQ ID NO: 8)/rU₁₈-Heterodoppelhelix 30,2°C verglichen mit 25,4°C für die natürliche dA₁₈/rU₁₈-Heterodoppelhelix. Ebenso beträgt der T_m der 2'F-araT₁₈ (SEQ ID NO: 7)/rA₁₈-Heterodoppelhelix 43,9°C, was einen Anstieg des T_m von ca. 5°C relativ zur natürlichen dT₁₈/rA₁₈-Heterodoppelhelix (T_m 39°C) darstellt. Auch die durch die Assoziierung von 2'F-ANA (SEQ ID NO: 6) und seiner Ziel-RNS-Sequenz gebildete gemischte Basen-Heterodoppelhelix ist thermisch stabiler (T_m 86°C) als die korrespondierenden PO-DNS/RNS- und PS-DNS/RNS-Doppelhelices (1A). Im Gegensatz zu dem für die ANA-Sequenz (SEQ ID. NO: 1) beobachteten Verhalten (das selektive Bindung an RNS aufweist), binden die 2'F-ANA-Oligonukleotide (z.B. SEQ ID NO: 6) stark an einzelsträngige komplementäre DNS und RNS. In der Tat bildeten die 2'F-araA₁₈ (SEQ ID NO: 8) eine stabilere Heterodoppelhelix mit einzelsträngiger komplementärer DNS (dT₁₈) als mit RNS (rU₁₈), d.h. T_m 63,3°C bzw. 30,2°C (Tabelle 2). Dies beläuft sich auf eine Bindungsselektivität von ΔT_m = + 33°C. Die selektive Bindung an einzelsträngige PO-DNS (mehr als an RNS) wurde ebenso für den natürlichen dA₁₈-Strang beobachtet, obwohl in diesem Fall die beobachtete Selektivität geringer war (ΔT_m = + 20°C).
Wie in 2A gezeigt, glichen die CD-Spektren der Heterodoppelhelices ANA (SEQ ID NO: 1)/RNS und 2'F-ANA (SEQ ID NO: 6)/RNS sehr denen der korrespondierenden DNS/RNS-Kontroll-Doppelhelices (das normale Substrat der RNase H), was nahelegt, dass alle diese Komplexe dieselbe helikale Konformation besitzen. Die beobachteten spektralen Eigenschaften sind charakteristisch für eine „A"-Typ-Helix, eine Struktur, die für die Erkennung von DNS/RNS-Substraten durch die RNase H wichtig zu sein scheint (Lima, W.F., Crooke, S.T. Biochemistry 1997, 36, 390). Die Tatsache, dass ANA/RNS- und 2'F-ANA/RNS-Heterodoppelhelices Substrate der RNase H sind, (siehe Beispiele 5 und 6) stimmt völlig mit dieser Vorstellung überein. Das CD-Spektrum einer DNS/DNS-Doppelhelix (derselben Basensequenz) ist äußerst verschieden und ist kennzeichnend für die helikale Konformation der „B"-Form. Das CD-Spektrum der A-Form RNS/RNS-Kontrol-Doppelhelix wird ebenfalls gezeigt.
2B zeigt die CD-Spektren der 2'F-araA₁₈ (SEQ ID NO: 8)/rU₁₈- und der dA₁₈/rU₁₈-Doppelhelices sowie der korrespondierenden dA₁₈/dT₁₈-Doppelhelix. Die ersten zwei Doppelhelices zeigen ein ähnliches CD-Profil (d.h. Peak-Muster und Peak-Position), das kennzeichnend für die A-Helix-Konformation ist, wobei das Spektrum der DNS/DNS- Doppelhelix (dA₁₈/dT₁₈) auf ein Muster zurückgeht, das typisch für „B"-Form-Helices ist.
Zu denselben Schlüssen kann man aus den in 2C gezeigten Spektren gelangen. Das CD-Spektrum der 2'F-araT₁₈ (SEQ ID NO: 7)/rA₁₈-Doppelhelix zeigt sehr ähnlich spektrale Merkmale des normalen dT₁₈/rA₁₈-Hybrids, ebenfalls typisch für die A-Form-Konformation. Das Spektrum der DNS/DNS-Doppelhelix dA₁₈/dT₁₈ (B-Form) wird zum Vergleich ebenfalls gezeigt.
Beispiel 4
Assoziations-Eigenschaften der 2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinosezucker aufweisenden Oligonukleotide bei der Bindung an DNS-Doppelhelices und DNS/RNS-Hybride
Um die Wechselwirkung zwischen Oligomeren der 2'-Desoxy-2'-fluor-arabinonukleotiden und DNS/DNS- und DNS/RNS-Doppelhelices zu untersuchen wurde das experimentelle Design von Roberts und Crothers übernommen (Roberts, R.W.; Crothers, D.M. Science 1992, 258, 1463). Die Ziel-Doppelhelices sind die folgenden Purin-Pyrimidin-Haarnadelschleifen:
Die Bildung einer Tripelhelix kann auftreten, wenn ein Oligonukleotid in der großen Furche der Ziel-Doppelhelices bindet (Le Doan, T. et al. Nucleic Acids Res. 1987, 238, 645; Moser; H.E.; Dervan, P.B. Science 1987, 238, 645). Der 2'-Desoxy-2'-fluorarabinosezucker enthaltende Oligopyrimidinstrang, d.h. 2'F-ara(CCT CTC CTC CCT) (SEQ ID NO: 13) wurde verwendet, um die Bildung einer Tripelhelix mit den obigen Haarnadelschleifen-Doppelhelices zu beurteilen. Zu Vergleichszwecken wurde ebenfalls die Assoziation der korrespondierenden Oligodesoxyribopyrimidin-("DNS", 2-Desoxy-β-D-ribose) und Oligoarabinopyrimidin-("ANA", β-D-arabinose) Sequenzen untersucht. Die Fähigkeit dieser Oligomere Tripelhelices auszubilden wurde aus ultraviolett-spektroskopischen Schmelzexperimenten (wie in Beispiel 3 beschrieben) und nativer Gelelektrophorese in einer 100 mM Natriumacetat und 1 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 5,5 enthaltenden Lösung bestimmt. Die molaren Extinktionskoeffizienten der Oligonukleotide wurden aus denen der Mononukleotide und Dinukleotide gemäß den Nächster-Nachbar-Näherungen berechnet (Puglisi, J.D.; Tinoco, I. Jr. Methods in Enzymology, Dahlberg, J.E.; Abelson, J.N. (eds.), 180, pp. 304, Academic Press, S.D., 1989). Es wurde angenommen, dass die Werte für die Hybrid-Haarnadelschleife die Summe ihrer DNS- plus der RNS-Komponenten ist. DNS/DNS 26,5, DNS/RNS 27,1 (Einheit = 10⁴ M^–1 cm^–1). Es wurde angenommen, dass der molare Extinktionskoeffizient des 2'-Fluorarabinonukleotid-Strangs SEQ ID NO: 13 derselbe ist, wie der eines normalen DNS-Strangs (9, 6 × 10⁴ M^–1 cm–¹ Einheiten). Durch Mischen äquimolarer Mengen der interagierenden Stränge, z.B. 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) + Haarnadelschleife DNS/DNS oder DNS/RNS wurden die Komplexe hergestellt und die sich ergebende Mischung bis zur Trockenheit lyophilisiert. Das entstehende Pellet wurde dann in 100 mM NaOAc/1 mM EDTA-Puffer (pH 5,5) wieder gelöst. Die Endkonzentration betrug 2 μM für jeden Strang. Die Lösungen wurden dann für 15 min auf 80°C erhitzt, langsam auf R.T. abgekühlt und bei 4°C über Nacht vor den Messungen gelagert. Vor dem thermischen Lauf wurden die Proben in einem Speed-Vac-Konzentrator (2 min) entgast. Die Denaturierungskurven wurden bei 260 nm bei einer Heizrate von 0,5°C/min aufgenommen. Die Schmelztemperaturen (T_m) wurden aus der ersten Ableitung der Schmelzkurven berechnet. Die Ergebnisse der Schmelzexperimente sind in 3 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass wenn 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) mit einer äquimolaren Konzentration einer Haarnadelschleifen-DNS/DNS (SEQ ID NO: 11) oder DNS/RNS (SEQ ID NO: 12) vermischt wurde, ein biphasischer Übergang während des Heizens der Lösung von 10°C auf 90°C beobachtet wurde. Der Übergang bei der niedrigen Temperatur wird der Dissoziation der 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) von der Ziel-Haarnadelschleife zugeordnet (Roberts, R.W.; Crothers, D.M. Science 1992, 258, 1463). Der Übergang bei der hohen Temperatur entspricht dem Schmelzen der Haarnadelschleifen-Doppelhelices, da er ebenfalls beobachtet wurde, wenn eine Lösung reiner Haarnadelschleifen-Doppelhelix unter identischen Bedingungen erhitzt wurde. Die Daten zeigen, dass die T_m-Werte für die Übergänge bei niedriger Temperatur, die sich aus Mischungen aus SEQ ID NO: 13 (2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinoseoligomer) + Haarnadelschleifen ergeben, erheblich höher sind, als die T_m-Werte der Übergänge der korrespondierenden ANA (β-D-Arabinoseoligomer) + Haarnadelschleife- oder DNS (2'-Desoxy-β-D-riboseoligo mer) + Haarnadelschleife-Mischungen. Beispielsweise beträgt der T_m der Dissoziation des 2'F-ANA-Strangs (SEQ ID NO: 13) von der DNS/DNS Haarnadelschleife (DD, SEQ ID NO: 11) 49°C im Vergleich zu den 34°C und 40°C für die Dissoziation der ANA-(β-D-Arabinose; nicht gezeigt) bzw. der DNS-(2'-Desoxy-β-D-ribose) Oligonukleotide, wie aus den in 3 gezeigten Schmelzkurven abgelesen werden kann. Ebenso erfolgte der erste Übergang der aus 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) und einer DNS/RNS Haarnadelschleife (SEQ ID NO: 12) gebildeten Tripelhelix bei 53°C im Vergleich zu den 43°C und 45°C für die aus ANA-(β-D-Arabinose; nicht gezeigt) bzw. DNS-(2'-Desoxy-β-D-ribose) Strängen gebildeten entsprechenden Tripelhelices.
Das Gleichgewicht zwischen einzel-, doppel- und dreifachsträngigen Spezies aus 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) + Haarnadelschleife-Mischungen wurde ebenfalls direkt mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese beobachtet (4). 4 zeigt das Bild eines Polyacrylamidgels von einzelsträngigem Oligo-2'F-arabinopyrimidin SEQ ID NO: 13 und Ziel-Haarnadelschleifen-DNS/DNS (SEQUENCE ID NO: 11) („DD") und DNS/RNS (SEQUENCE ID NO: 12) ("DR") und 1:1-Verhältnissen der SEQ ID NO: 13 : Haarnadelschleifen. Die erste Spur zeigt die Markierungsfarbstoffe Xylencyanol (XC) and Bromphenolblau (BPB). Die nächste Spur zeigt den SEQ ID NO: 13-Strang, während die „DD(–)"-Spur die DNS/DNS-Haarnadelschleife (SEQ ID NO: 11) zeigt. Die SEQ ID NO: 13 : DD-Tripelhelix ist deutlich in der „DD(+)"-Spur zu sehen, die eine molare 1 : 1-Mischung von 2F-ANA (SEQ ID NO: 13) und „DD" enthält. Die DNS/RNS-Haarnadelschleife (SEQ ID NO: 12) ist in der „DR(–)"-Spur erkennbar. Die Tripelhelix SEQ ID NO: 13 : DR-Tripelhelix, die aus einer 1 : 1-Mischung aus 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) und „DR" besteht, ist deutlich in der "DR(+)"-Spur erkennbar. Die Gele wurden durch UV-Bestrahlung sichtbar gemacht. Die Basensequenz des einzelsträngigen 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) und der Haarnadelschleifen DD (SEQ ID NO: 11) und DR (SEQ ID NO: 12) und die experimentellen Bedingungen sind oben in Beispiel 4 aufgeführt.
Dieses Verfahren stellt einen geeigneten Weg dar, die Tripelhelixbildung zu beobachten und qualitativ die Stöichiometrie der Wechselwirkung der Stränge zu prüfen (Kibler-Herzog, L. et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 3545). Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass der 2'F-ANA-Strang (SEQ ID NO: 13), Haarnadelschleifen, und tripelhelikale Komplexe mit herausragender Auflösung auf einem Polyacrylamidgel bei geringer Temperatur getrennt werden können. Wie aus den Gelergebnissen zu erkennen ist, wird der tripelhelikale Komplex nahezu vollständig aus einem molaren 1 : 1-Verhältnis von 2'F-ANA (SEQ ID NO: 13) Haarnadelschleife gebildet. Dies steht im Kontrast zu der Inkubation von ANA (D-Arabinosestrang) und einer Haarnadelschleife (molares Verhältnis 1 : 1), die unter denselben Bedingungen eine Mischung aus ANA + Haarnadelschleife + Tripelhelix ergaben (siehe Noronha, A.; Damha, M.J. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2665). Dies befindet sich in vollständiger Übereinstimmung mit den T_m-Ergebnissen, die anzeigen, dass der SEQ ID NO: 13-(2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose) Strang relativ zu dem ANA-(β-D-Arabinose) Strang eine deutlich höhere Affinität zu DNS/DNS- und DNS/RNS-Haarnadelschleifen-Doppelhelices besitzt.
Beispiel 5
Induktion der Ribonuklease H-(RNase H) Aktivität durch β-D-Arabinose als Zuckerbestandteil enthaltende Oligonukleotide
In diesen Experimenten wurden sequenz-bestimmte Oligonukleotide, 18-Einheiten in der Länge, verwendet, d.h.
5'-d(AGCTCCCAGGCTCAGATC)-3' „DNS" (SEQ ID NO: 14)
5'-ara(AGCUCCCAGGCUCAGAUC)-3' „ARA" (SEQ ID NO: 1)
5'-ribo(AGCUCCCAGGCUCAGAUC)-3' „3',5'-RNS" (SEQ ID NO: 15)
5'-ribo(AGCUCCCAGGCUCAGAUC)-3' „2',5'-RNS" (SEQ ID NO: 16)
Diese Oligomere sind komplementär zu einer Sequenz in der R-Region der genomischen RNS von HIV-1. Die verwendete Ziel-RNS war ein synthetisches 18 nt-3',5'-RNS-Oligonukleotid, identisch zu der Sequenz in der HIV-R-Region und genau komplementär zu der Sequenz der obigen Oligonukleotide.
Die Fähigkeit der obigen Oligonukleotide RNase H-Abbau der Ziel-RNS auszulösen wurde in Assays (10 μL Endvolumen) bestimmt, die 5 pmol 5'-[³²P]-Ziel-RNS und 15 pmol Test-Oligonukleotid in 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und entweder 10 mM MgCl₂ oder 0,1 mM MnCl₂ enthaltendem 60 mM Tris-HCl (pH 7,8, 25°C) umfassten. Die Reaktionen wurden mittels Zugabe von HIV-RT oder E.coli RNase H gestartet. Die Inkubationen wurden bei 25°C für verschiedene Zeiten (im Allgemeinen 20 bis 30 Minuten) durchgeführt. Die Reaktionen wurden mittels Zugabe des Ladepuffers (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) und Heizen bei 100°C für 5 Minuten gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 16%-igen, 7 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamid-Sequenziergels getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Ergebnis solcher Experimente ist in 5 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die auf 2'-Desoxyribose („DNS" (SEQ ID NO: 14) oder β-D-Arabinose („ARA" (SEQ ID NO: 1) basierenden Oligonukleotide in der Lage sind Doppelhelices mit Ziel-RNS zu bilden, die als Substrate für die RNase H-Aktivität von entweder HIV-1 RT oder E.coli RNase H dienen, wie durch die zahlreichen Abbauprodukte der Ziel-RNS von kleinerer Größe in 5 gezeigt wird. Dieser RNase H-Abbau wurde entweder mit Mn²⁺ (gezeigt) oder mit Mg²⁺ (nicht gezeigt) als Metall beobachtet. Im Gegensatz dazu waren die auf D-Ribose, entweder mit 3',5'-Bindungen (3',5'-RNS (SEQ ID NO: 15)) oder mit 2',5'-Bindungen (2',5'-RNS (SEQ ID NO: 16)) basierenden Oligonukleotide nicht in der Lage diesen RNase H-Abbau der Ziel-RNS auszulösen, selbst wenn diese Test-Oligonukleotide befähigt waren mit der Ziel-RNS Doppelhelices zu bilden. Ebenso war ein auf β-D-2'-Desoxyribose basierendes Oligonukleotid, aber mit einer zufälligen Basensequenz (Zufalls-DNS), nicht komplementär zur Ziel-RNS (und daher nicht in der Lage Doppelhelices zu bilden), ebenfalls nicht in der Lage RNase H-Aktivität auszulösen.
Beispiel 6
Induktion der Ribonuklease H-(RNase H) Aktivität durch 2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinose als Zuckerbestandteil enthaltende Oligonukleotide
Ein Satz von Experimenten (A) nutzte homopolymere Test-Octadecanukleotide mit entweder Thymin (T) oder Uracil (U) als Basenbestandteil, und zwar PO-araU₁₈ (SEQ ID NO: 3), PO-2'F-araT₁₈ (SEQ ID NO: 7), PO-dT₁₈, PS-dT₁₈, PO-2'F-riboT₁₈, PO-riboU₁₈. Die Ziel-RNS in der Experiment-Reihe A war ein synthetisches, genau zu der Sequenz der Test-Oligonukleotide komplementäres 3',5'-Phosphodiestergebundenes rA₁₈ Oligonukleotid.
Eine andere Reihe an Experimenten (B) nutzte heteropolymere Test-Octadecanukleotide der folgenden Sequenz:
5'-TTA TAT TTT TTC TTT CCC-3' (SEQ ID NO: 9) für PO-DNS-, PS-DNS- und 2'F-ANA-Oligonukleotide
5'-UUA UAU UUU UUC UUU CCC-3' für ANA-(SEQ ID NO: 4) und RNS-Oligonukleotide
Die Ziel-RNS in der Experiment-Reihe B war ein heteropolymeres, genau zur Sequenz der Test-Oligonukleotide komplementäres Octadecaribonukleotid.
Experimenten-Reihe (A):
Die Fähigkeit der homopolymeren Oligonukleotide mit 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose als Zuckerbestandteil und anderen Oligonukleotiden den RNase H-Abbau der Ziel-RNS auszulösen wurde in Assays (10 μL Endvolumen) bestimmt, die 1 pmol 5'-[³²P]-Ziel-RNS und 8 pmol Test-Oligonukleotid in 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ enthaltendem 60 mM Tris-HCl (pH 7,8, 25°C) umfassten. Die Reaktionen wurden mittels Zugabe von E.coli RNase H begonnen. Die Inkubationen wurden bei 22°C für 0, 5, 10 und 20 Minuten durchgeführt. Die Reaktionen wurden mittels Zugabe des Ladepuffers (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) und Heizen bei 100°C für 5 Minuten gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 16%-igen, 7 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamid-Sequenziergels getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 6 gezeigt.
Jedes der auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen basierenden Oligonukleotide (d.h. PO-dT₁₈, abgekürzt als „dT₁₈"), β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-dT₁₈ oder „dT₁₈-Thioat") 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose (PO-2'F-araT₁₈, SEQ ID NO: 7 oder „aFT₁₈"), β-D-Ribose (PO-rU₁₈ oder „rU₁₈") und 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-ribose (PO-2'F-rT₁₈ oder „rFT₁₈") waren in der Lage Doppelhelices mit der Ziel-RNS (rA₁₈) zu bilden. Nur Doppelhelices, die aus den „dT₁₈"-„dT₁₈-Thioat"- oder „aFT₁₈"-Oligonukleotiden gebildet wurden, dienten als Substrate für die RNase H-Aktivität entweder der HIV-1 RT oder der E.coli RNase H, wie durch die zahlreichen Abbauprodukte der Ziel-RNS von kleinerer Größe in 6 gezeigt wird. Mit rFT₁₈ oder rU₁₈ gebildete Doppelhelices konnten nicht als Substrate der RNase H-Aktivität der E.coli RNase H dienen. Unter diesen Bedingungen war ein auf β-D-Arabinosyluracil (PO-araU₁₈, SEQ ID NO: 3 oder „aU₁₈") basierendes Octadecanukleotid nicht in der Lage, eine Doppelhelix mit Ziel-rA zu bilden und war demnach nicht in der Lage RNase H-Aktivität auszulösen (diese Ergebnisse stimmen mit den von Giannaris and Damha beschriebenen überein, die herausfanden, dass araU₈ nicht in der Lage war eine Doppelhelix mit Poly-rA zu bilden; Giannaris, P.A.; Damha, M.J., Can. J. Chem. 1994, 74, 909).
Experimenten-Reihe (B):
Heteropolymere Octadecanukleotide der Sequenz 5'-TTA TAT TTT TTC TTT CCC-3' (SEQ ID NO: 9) für PO-DNS-, PS-DNS- und 2'F-ANA-Oligonukleotide und 5'-UUA UAU UUU UUC UUU CCC-3' (SEQ ID NO: 4) für ANA- und RNS-Oligonukleotide wurden mit 5'-[³²P]-markierter Ziel-RNS, die zur AON-Test-Sequenz genau komplementär ist, verbunden. Die Fähigkeit der heteropolymeren Oligonukleotide mit 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose als Zuckerbestandteil und anderen Oligonukleotiden den RNase H-Abbau der Ziel-RNS auszulösen wurde in Assays (50 μL Endvolumen) bestimmt, die 100 nM 5'-[³²P]-Ziel-RNS und 500 nM Test-Oligonukleotid in 2 mM Dithiothreitol, 60 mM KCl und 2,5 mM MgCl₂ enthaltendem 60 mM Tris-HCl (pH 7,8, 25°C) umfassten. Die Reaktionen wurden mittels Zugabe von E.coli RNase H (Endaktivität 25 U/ml) begonnen. Die Verdauungen mit RNase H wurden bei entweder 25°C oder 37°C durchgeführt. Zu verschiedenen Zeiten wurden 10 μl-Aliquots entnommen und mittels Zugabe des Ladepuffers (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) gefolgt von Heizen bei 100°C für 5 Minuten gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 16%-igen, 7 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamid-Sequenziergels getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Ergebnis eines solchen Experiments ist in 7 gezeigt. Die Empfindlichkeit von vorgeformten Oligonukleotid/RNS-Doppelhelices für den Abbau durch E.coli RNase H wurde bei 37°C (linkes Feld) und 25°C (7, rechtes Feld) beurteilt. Die Spuren entsprechen der Abwesenheit (–) oder der Anwesenheit (+) von zugegebener E.coli RNase H für jede Test-Verbindung.
Alle heteropolymeren Oligonukleotide waren in der Lage, Doppelhelices mit der Ziel-RNS (UV-Schmelzexperimente) zu bilden. Auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen (PO-DNS), β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNS), β-D-Arabinose (ANA, SEQ ID NO: 4) und 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose (2'F-ANA, SEQ ID NO: 9) basierende Oligonukleotide waren in der Lage, den Abbau der komplementären Ziel-RNS in Anwesenheit von E.coli RNase H auszulösen, wie durch die zahlreichen Abbauprodukte der Ziel-RNS von kleinerer Größe in 7 gezeigt wird. Auf β-D-Ribose (RNS) basierende Oligonukleotide konnten nicht den RNase H-Abbau der Ziel-RNS auslösen.
Beispiel 7
Nukleasestabilität der Oligoarabinonukleotide
Auf 2-'Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen (PO-DNSdT₁₈, abgekürzt als „dT") und 2'-Desoxy-2F'-β-D-ara binose (2'F-araT₁₈, SEQ ID NO: 7, oder „aFT₁₈") basierende Thyminoctadecanukleotide wurden bezüglich der Stabilität gegenüber Abbau durch Serum-Nukleasen und zelluläre Nukleasen verglichen. Die Antisense-Oligonukleotide wurden am 5'-Ende unter Verwendung von [γ³²P]-ATP und T4-Polynukleotidkinase gemäß den Standardprotokollen radioaktiv markiert (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994).
Stabilität gegenüber Serum-Nukleasen wurde beurteilt durch Zugabe von 1 pmol 5'-[³²P]-AON zu dem 90%-iges Pferdeserum enthaltenden Reaktions-Assay (10 μL Endvolumen). Die Reaktionen wurden bei 20°C für verschiedene Zeiten inkubiert (0, 5, 10, 15, 20 und 30 min), dann wurden die Aliquots entnommen und mit Gelladepuffer (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) verdünnt, für 5 Minuten gekocht, dann mittels Elektrophorese auf einem 7 M Harnstoff enthaltenden 16%-igen Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetrennt. Die aufgetrennten Produkte wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse eines solchen Experiments werden in 8 gezeigt.
Das „aFT₁₈"-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 7) war wesentlich beständiger gegenüber dem Abbau durch Serum-Nukleasen, wie durch die verringerte Anzahl an Abbauprodukten von geringerer molekularer Größe gezeigt wird, im Vergleich zu der mit normalem „dT₁₈"-Oligonukleotid beobachteten Anzahl. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden bei ähnlichen Experimenten erhalten, in denen das Pferdeserum durch humanes Serum ersetzt wurde (Daten nicht gezeigt). Unter denselben Bedingungen waren auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-dT₁₈) basierende Oligonukleotide von Serum-Nukleasen nahezu unbeeinflusst (Daten nicht gezeigt), wie vorher schon von vielen Forschern festgestellt wurde.
Unfraktionierte Mausleber-Rohhomogenisate (hergestellt durch die Homogenisierung von Mauslebern in einem gleichen Volumen an 60 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol und 12% (v/v) Glycerol enthaltendem 20 mM Tris-HCl (pH 7,9, 20°C)) wurden als Quelle für zelluläre Nukleasen verwendet. Die Stabilität gegenüber zellulären Nukleasen wurde durch Zugabe von 1 pmol 5'-[³²P]-ODN zu dem Reaktions-Assay (10 μL Endvolumen) beurteilt, der 90%-iges unfraktioniertes Mausleber-Rohhomogenisat enthält. Nach verschiedenen Inkubationszeiten (0, 10, 20, 30 und 60 min.) bei 20°C wurden Aliquots entnommen, mit Gelladepuffer (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) verdünnt, für 5 Minuten gekocht, dann mittels Elektrophorese auf einem 7 M Harnstoff enthaltenden 16%-igen Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetrennt. Die aufgetrennten Produkte wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten, dass das „aFT₁₈"-Oligonukleotid wesentlich beständiger als das korrespondierende „dT₁₈"-Oligonukleotid gegenüber des Abbaus durch zelluläre Nukleasen war (Daten nicht gezeigt).
Schlangengift-Phosphodiesterase I ist ein aggressives Enzym, dass einzelsträngige Nukleinsäuren schnell abbaut. Jedes der auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen (PO-DNS dT₁₈, abgekürzt als „dT"), β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNS dT₁₈, oder „dT₁₈-Thioat"), β-D-Arabinosyluracil (PO-araU₁₈, SEQ ID NO: 3, oder „aU₁₈"), 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose (PO-2'F-araT₁₈, SEQ ID NO: 7 oder „aFT₁₈") und 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-ribose (PO-2'F-rT₁₈, oder „rFT₁₈") basierenden Oligonukleotide wurde auf Stabilität gegenüber Abbau durch Schlangengift-Phosphodiesterase I in Assays (50 μl Endvolumen) untersucht, die 100 nM 5'-[³²P]-Oligonukleotid in 100 mM NaCl und 10 mM MgCl₂ enthaltendem 100 mM Tris-HCl (pH 8,9, 37°C) umfassten. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Schlangengift-Phosphodiesterase I (Endaktivität 0,4 U/ml) gestartet. Die Aufschlüsse wurden bei 37°C durchgeführt. Zu verschiedenen Zeiten wurden 10 μl-Aliquots entnommen und mittels Zugabe des Ladepuffers (98%-iges 10 mM EDTA und jeweils 1 mg/ml Bromphenolblau und Xylencyanol enthaltendes deionisiertes Formamid) gefolgt von Heizen bei 100°C für 5 Minuten gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 16%-igen, 7 M Harnstoff enthaltenden Polyacrylamid-Sequenziergels getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in 9 gezeigt. Sie zeigten, dass die Reihenfolge der Nuklease-Stabilität „dT₁₈-Thioat" > „aU₁₈" ≈ „aFT₁₈" >> „rFT₁₈" > „dT₁₈" ist.
Beispiel 8
Unspezifische Wechselwirkung der Oligoarabinonukleotide mit zellulären Proteinen
Die Fähigkeit von auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen (PO-DNS dT₁₈, abgekürzt als „dT₁₈"), β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNS dT₁₈, oder „dT₁₈-Thioat"), β-D-Arabinosyluracil (PO-araU₁₈, SEQ ID NO: 3 oder „aU₁₈"), 2'-Desoxy-2-fluor'-β-D-arabinose (PO-2'F-araT₁₈, SEQ ID NO: 7 oder „aFT₁₈") und 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-ribose (PO-2'F-rT₁₈, oder „rFT₁₈") basierenden Thymin-Octadecaoligonukleotiden unspezifisch an Proteine zu binden, wurde mittels des Gel-Shift-Assay-Verfahrens in Rohextrakten aus HeLa-Zellen untersucht. Die Antisense-Oligonukleotide wurden am 5'-Ende unter Verwendung von [γ³²P]-ATP und T4-Polynukleotidkinase gemäß den Standardprotokollen radioaktiv markiert (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994). Die Rohextrakte aus HeLa-Zellen wurden durch Homogenisation der Zellen in Puffer (60 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol und 12% (v/v) Glycerol enthaltendem 20 mM Tris-HCl (pH 7,9, 20°C)) hergestellt, gefolgt von einer Zentrifugation, um Membranpartikel und Zellabfall abzutrennen.
Die Bindungsexperimente umfassten 1 pmol 5'-[³²P]-markiertes-AON und 5 μg HeLa-Zellextrakt-Protein in einem Gesamtvolumen von 20 μl umfassend 100 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 5% Glycerol enthaltendem 10 mM Tris-HCl (pH 7,5, 25°C). AON und HeLa-Zellproteine wurden für 10 min bei 25°C inkubiert, dann einer Elektrophorese auf nicht-denaturierenden 6%-igen Gelen unterzogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und die Positionen der freien und der proteingebundenen Oligonukleotide mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in 10 gezeigt.
Hauptsächlich wurde jedes Phosphorothioat „dT₁₈-Thioat" an die Extraktproteine gebunden, wie durch den „Schmier" an radioaktivem Material überall im Bereich der Elektrophorese gezeigt wurde. Keines der anderen Antisense-Oligonukleotide zeigte eine nennenswerte Wechselwirkung mit den HeLa-Zellproteinen unter denselben Bedingungen.
Beispiel 9
Antisense-Oligonukleotid-Hemmung der spezifischen Genexpression
Antisense-Oligonukleotide besitzen das Potential, auf Basis der spezifischen Basensequenz der gewählten Ziel-mRNS die Expression nahezu jedes Gens zu hemmen. Wir untersuchten die Fähigkeit von auf β-D-Arabinose und 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose basierenden Antisense-Oligonukleotiden die Expression eines gut-untersuchten Markermodells, und zwar die Expression des Enzyms Luziferase, sowohl in-vitro in zellfreien Translations-Experimenten (11) als auch in stabil mit dem Luziferasegen transfizierten Zellen (12) zu behindern.
Die Fähigkeit der zu einer spezifischen Region der mRNS mit der Kodierung für Luziferase komplementären Oligonukleotide zur Hemmung der Luziferase-Proteinexpression wurde in einem in-vitro-Protein-Translationssystem untersucht. Die spezifische Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen lauteten 5'-ATA TCC TTG TCG TAT CCC-3' (SEQ ID NO: 10) für 2'F-ANA-, ANA-(SEQ ID NO: 5) und die korrespondierenden PO-DNS- und PS-DNS-Stränge, die komplementär zu den Basen 1511-1528 der kodierenden Region des Luziferasegens sind (M. Gossen, H. Bujard 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 5547-5551; W.M. Flanagan et al. 1996, Nucl.
Acids Res. 24, 2936-2941). Als Kontrolle wurden zufällig angeordnete Oligonukleotid-Sequenzen (5'-TAA TCC CTA TCG TCG CTT-3' (SEQ ID NO: 17)) für 2'F-ANA, ANA, PO-DNS und PS-DNS eingesetzt; diese Oligonukleotide sind von derselben Basenzusammensetzung wie die spezifische AON-Sequenz, sind aber zu keinem Teil des Luziferasegens komplementär. Die Translations-Reaktions-Assays (15 μl Gesamtvolumen) umfassten 0,15 pmol Luziferase mRNS, 10 μl kommerzielles Kaninchen-Retikulozytenlysat ergänzt mit einer vollständigen Aminosäuren-Mischung und Einzelstrang-RNS-Ribonuklease-Inhibitor im Überschuss. Zu dieser Mischung wurden verschiedene Mengen (0,1-5 pmol) des spezifischen oder zufällig angeordneten Oligonukleotids zugegeben, gefolgt von der Zugabe von E.coli RNase H (20 U/ml Endkonzentration). Translations-Reaktionen wurden für 60 min bei 37°C durchgeführt, dann wurde die Menge der aktiven, über die ganze Länge produzierten Luziferase mittels Luminometrie untersucht (W.M. Flanagan et al. 1996, Nucl. Acids Res. 24, 2936-2941). Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in 11 gezeigt. Feld (A) zeigt die inhibitorische Aktivität der auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphodiesterbindungen (PO-DNS) basierenden Oligonukleotide.
Feld (B) zeigt die inhibitorische Aktivität der auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNS) basierenden Oligonukleotide; Feld (C) zeigt die inhibitorische Aktivität der auf 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-Arabinose mit Phosphodiesterbindungen (2'F-ANA, SEQ ID NO: 10) basierenden Oligonukleotide; Feld (D) zeigt die inhibitorische Aktivität der auf β-D-Arabinose mit Phosphodiesterbindungen (ANA, SEQ ID NO: 5) basierenden Oligonukleotide.
Die Ergebnisse (11) zeigen, dass die 2'F-ANA und PO-DNS-Oligonukleotide bei geringen AON : mRNS-Verhältnissen wirksame und spezifische Inhibitoren der Luziferase-Genexpression im in-vitro-Proteinexpressions-Modell sind. In diesen Experimenten ist die in-vitro-inhibitorische-Stärke (IC₅₀) der auf 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinose mit Phosphodiesterbindungen (2'F-ANA, SEQ ID NO: 10) basierenden Oligonukleotide mindestens vierfach größer, als die der auf β-D-2'-Desoxyribose mit Phosphorothioatbindungen (PS-DNS) basierenden Oligonukleotide derselben Sequenz.
HeLa X1/5 Zellen exprimieren das Luziferasegen stabil (W.M. Flanagan et al. 1996, Nucl. Acids Res. 24, 2936-2941). Die Zellen wurden mit Lipofectin und Oligonukleotid (1 μM Endkonzentration) für 24 h behandelt, dann wurden die Zellen geerntet und die Zellextrakte wurden auf Luziferase-Aktivität (12, Feld A) und Toxizität (Restzellprotein, 12, Feld B) untersucht. Die chemische Beschaffenheit der Oligonukleotide wird in 12 gezeigt. Die eingesetzten spezifischen Sequenzen sind die oben beschriebenen und zwar 2'F-ANA (SEQ ID NO: 10), ANA (SEQ ID NO: 5) und ihre korrespondierenden PO-DNS- und PS-DNS-Sequenzen. Die zufällig angeordneten Sequenzen waren 2'F-ANA (SEQ ID NO: 17), ANA und korrespondierende zufällig angeordnete PO-DNS- und PS-DNS-Sequenzen.
X1/5 HeLa-Zellen wurden in 96-well-Platten ausplattiert und unter mikroskopischer Kontrolle auf 80% Konfluenz, in DMEM/10% FKS wachsen gelassen. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mehrere Male mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline) gewaschen. Die Zellen wurden mit 20 μg/ml Lipofectin enthaltendem serumfreien DMEM-Medium überschichtet, dann wurde ein kleines Volumen-Aliquot der konzentrierten Test-AON-Stocklösung unter Mischen zugegeben, um eine gute Verteilung zu gewährleisten. Nach 24 h Inkubation wurden die HeLa-Zellen geernted, homogenisiert und auf Luziferase untersucht.
Feld A der 12 zeigt, dass PS-DNS (sequenz-spezifisch) die intrazelluläre Luziferase-Genexpression vollständig unterbunden hat. Die 2'F-ANA (SEQ ID NO: 10) und ANA (SEQ ID NO: 5) sequenz-spezifischen Oligomere waren ebenfalls wirksame Inhibitoren, welche die intrazelluläre Luziferase-Genexpression um 40-50% verringerten. Diese Daten waren signifikant verschieden von der PO-DNS-Kontrolle, wie in Feld A gezeigt (statistische Signifikanz wird ebenfalls gezeigt). Feld B zeigt, dass weder 2'F-ANA noch ANA für HeLa-Zellen toxisch waren, wie über den Einfluss auf die Zellzahl (d.h. Restzellprotein nach 24 h Einwirkung) bestimmt wurde. Im Gegensatz zeigte die PS-DNS (sowohl zufällig angeordnete als auch sequenz-spezifische) eine signifikate Toxizität mit einer Verminderung der Zellzahl auf ca. 40% nach 24 h Einwirkung.
Sequenzprotokoll

Claims

Therapeutische Zusammensetzung zur selektiven Verhütung oder Modulation der Genexpression in einer sequenz-spezifischen Art in einem Wirt, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge mindestens eines Oligonukleotids umfasst, wobei das Oligonukleotid ein einheitlich zucker-modifiziertes Oligonukleotid ist, basierend auf 2'-Desoxy-2'-fluor-β-D-arabinonukleotiden, und wobei das Oligonukleotid zur Hybridisierung mit komplementärer mRNS und zur Induzierung deren durch (RNase H)-vermittelter Spaltung imstande ist.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid die Formel
aufweist, wobei: B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Uracil, Thymin, Cytosin, Inosin und 5-Methylcytosin; R an der internukleotid-phosphat-Verbindung ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy-, Thiol-, Methyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-(die Alkylgruppe weist ein bis etwa 20 Kohlenstoffatome auf), Methoxy- und Ethoxy-Gruppe.
Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei R an der internukleotid-phosphat-Verbindung eine Hydroxy-Gruppe ist.