DE68904330T2

DE68904330T2 - Hirudin-varianten, deren verwendung und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE68904330T2
Application number: DE8989400621T
Authority: DE
Inventors: Michael Courtney; Eric Degryse; Gerard Loison
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1988-03-08
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1993-05-19
Anticipated expiration: 2009-03-07
Also published as: FR2628429A1; FR2628429B1; EP0332523B1; US5087613A; PT89923A; GR3007254T3; EP0332523A1; ES2036809T3; JP2961118B2; JPH029390A; DE68904330D1; ATE84571T1; PT89923B; CA1341429C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hirudin-Varianten, ihre Verwendungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Natürliches Hirudin ist ein Gemisch von Peptiden mit 65 und 66 Aminosäuren, die in sehr geringer Menge von den Speicheldrüsen eines medizinischen Blutegels ausgeschieden werden (Markwardt 1970; Petersen et al. 1976; Chang 1983; Dodt et al. 1984, 1985, 1986; Harvey et al. 1986).
Die beschriebene erste Variante HV1 entspricht dem Hirudin, das man aus dem Körper des Blutegels isoliert; die zweite Variante HV2 (Harvey et al. 1986) unterscheidet sich von der ersten Variante durch 9 Aminosäuren, die dritte Variante (Dodt et al. 1986) ist bis auf das Serin 32 mit HV2 identisch, unterscheidet sich von diesem jedoch durch 10 Aminosäuren in dem C-terminalen Teil, der außerdem eine ergänzende Aminosäure (Ala&sup6;³) aufweist. Diese dritte Variante wird als HV3 bezeichnet. Die Strukturen dieser drei Varianten sind in der Fig. 1 dargestellt.
Die Sequenzen dieser natürlichen Varianten umfassen 65 oder 66 Aminosäuren und können als zwei Domänen angesehen werden: ein kugelförmiger N-terminaler Teil, der drei Disulfid-Brücken enthält, und ein C-terminaler Säure-Teil, der eine Homologie mit der Schnittstelle durch das Thrombin in dem Prothrombin-Molekül aufweist. Diese Homologie läßt daran denken, daß der Bereich, der die Position 47 umgibt, eine Fixierungsstelle für das Hirudin an dem Thrombin sein könnte. Deshalb hat die Anmelderin in der europäischen Patentanmeldung Nr. 87 402 696.6 bereits Hirudin-Varianten beschrieben, die eine Aminosäure aufweisen, die von der Aminosäure verschieden ist, die in der natürlichen Form in der Position 47 vorliegt. Insbesondere wurde angegeben, daß die Variante HV2 (Lys&sup4;¹) eine verbesserte Thrombin-Inhibierungskinetik und eine höhere Antithrombose-Aktivität als das nicht-modifizierte Molekül aufweist.
Ziel der vorliegenden Erfindung sind neue Hirudin-Varianten, die verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen.
Zur Verbesserung des pharmakokinetischen Profils des Hirudinmoleküls zur Verlängerung seiner Wirkung in vivo und somit zur Herabsetzung der erforderlichen therapeutischen Dosis kann man zunächst kovalente post-translatorische Modifikationen einführen, insbesondere Kohlenwasserstoff-Seitenketten, welche die Stellen des Polypeptids maskieren können, die für die Eliminierung des Zirkularisationsmoleküls verantwortlich sind.
Deshalb erzeugt man an dem Molekül eine oder mehr Glycosylierungs-Stellen, welche die Additon der Kohlenwasserstoffketten begünstigen können. Die Glycosylierung erfolgt häufig an Asn-Resten in den spezifischen Erkennungsstellen Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser und an dem Hirudin, wobei eine mögliche Modifikation darin besteht, die Aminosäure Lys³&sup5; durch die Aminosäure Thr³&sup5; zu ersetzen, was zu der Sequenz Asn³³-Gly³&sup4;-Thr³&sup5; führt.
Andererseits weist das natürliche Hirudin keine spezifischen Erkennungsstellen für die Oberflächenrezeptoren von Blutegelzellen auf. Um die Art der in vivo-Wirkung des Hirudins zu modifizieren, schien es interessant, in das Hirudin-Molekül eine Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) einzuführen, die eine bessere Wechselwirkung mit den Oberflächenrezeptoren von Zellen erlaubt. Diese Sequenz RGDS ist in dem Fibrinogen an einer Stelle vorhanden, die an der Bindung mit dem Blutplättchenrezeptor GpIIb/IIIa beteiligt ist. Neuere Arbeiten (Ruggeri et al., 1986) haben gezeigt, daß die Fibrinogen-Wechselwirkung GpIIb/IIIa erforderlich ist für die Blutplättchenaggregation und daß die Peptide, die eine Sequenz RGDS aufweisen, die Blutplättchenaggregation hemmen.
Für den Fall, daß das Hirudin nach gentechnischen Methoden hergestellt wird, insbesondere durch Expression und Sekretion aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae, wurde festgestellt, daß im Verlaufe seiner Herstellung das Hirudin unter dem Einfluß von Carboxypeptidasen unerwünschten Abbaureaktionen an dem C-terminalen Ende unterliegen kann. Um diese Abbaureaktionen zu vermindern, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, das C-terminale Ende des Moleküls zu modifizieren, indem man ihm ein oder mehrere Aminosäuren, beispielsweise das Prolin, anfügt.
Ziel der vorliegenden Erfindung sind Hirudin-Varianten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Peptid- Struktur dieser Varianten, bezogen auf die HV-Basen-Varianten eine der folgenden Modifikationen aufweist:
- in mindestens einer Stelle Asn-X-Y von HV, worin X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y ausgewählt wird aus Ser oder Thr;
- eine Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser ersetzt eine Aminosäuresequenz;
- mindestens eine ergänzende Aminosäure wird an das C- terminale Ende angefügt;
wobei die HV-Basen-Varianten ausgewählt werden aus:
HV1, HV2, HV3, HV2 (Val¹, Val²), HV1 (AA&sup6;³), HV2 (AA&sup6;³), HV3 (AA&sup6;&sup4;), HV2 (Val¹, Val², AA&sup6;³), HV2 (Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³),
und AA ausgewählt wird aus Glu und Asp.
Die Basen-Varianten können nach Verfahren erhalten werden, wie sie in der europäischen Patentanmeldung 87 402 696.6 der Anmelderin beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine Familie von Hybrid-Molekülen, in denen HV HV2 (Lys&sup4;&sup7;) ist und die über mindestens eine der vorgenannten Modifikationen hinaus oder als einzige Modifikation anstelle der Aminosäuren Ile¹-Thr² die Aminosäuren Val¹-Val² aufweisen.
Es handelt sich dabei insbesondere um die Varianten:
HV2 (Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Val¹ Val² Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³).
Eine der Stellen, die insbesondere verwendbar sind zur Durchführung der ersten Modifikation, liegt im Bereich der Aminosäuren 33 bis 35 von HV2, wobei (Lys³&sup5;) durch (Thr³&sup5;) oder (Ser³&sup5;) ersetzt wird.
Eine der Stellen, die insbesondere verwendbar sind zur Durchführung der zweiten Modifikation, liegt bei den Aminosäuren 33 bis 36 und die Varianten (Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;) sind die interessantesten, insbesondere die Variante HV2 (Lys&sup4;&sup7;).
Obgleich es möglich ist, eine beliebige Aminosäure dem C-terminalen Ende hinzuzufügen, verwendet man vorzugsweise das Prolin, beispielsweise die Variante HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;).
Zur Erzielung einer höheren Thrombin-Inhibierungsaktivität, besseren pharmakokinetischen Eigenschaften, einer größeren Stabilität und einer verbesserten antithrombotischen Wirkung, bezogen auf die Variante HV2 (Lys&sup4;&sup7;), die von der Anmelderin in der europäischen Patentanmeldung Nr. 87 402 696.6 beschrieben worden ist, sind die folgenden Varianten von großem Vorteil:
worin A-B für Ile-Thr oder Val-Val und C für Glu oder Asp stehen.
Die Sulfatierung des Tyrosins 63 stellt nämlich möglicherweise einen wichtigen Unterschied dar zwischen dem natürlichen Hirudin und dem durch genetische Rekombination erhaltenen Hirudin, wie die kinetischen Untersuchungen von Stone und Hofsteenge (1986) nahelegen.
Dies ist der Grund dafür, warum in den obengenannten Derivaten das (Tyr&sup6;³) durch Glu oder Asp ersetzt wurde.
Die obengenannten Modifikationen können sich häufen (kumulieren).
Unter den betreffenden Varianten seien vorzugsweise genannt:
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asp&sup6;³)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asn³³-Gly³&sup4;-Thr³&sup5;)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;)
sowie die Varianten:
(Val¹-Val²) HV2 (Lys&sup4;&sup7;)
(Val¹-Val²) HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asp&sup6;³)
(Val¹-Val²) HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Thr³&sup5;)
(Val¹-Val²) HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)
(Val¹-Val²) HV2 (Lys&sup4;&sup7; Pro&sup6;&sup6;).
Die verschiedenen Varianten, die das Tyr&sup6;³ beibehalten haben, können in sulfatierter Form oder in nicht-sulfatierter Form verwendet werden. Dieses Sulfatierung kann auf chemischem oder biologischem Wege erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologische und/oder chemische Verfahren, welche die Herstellung der obengenannten Varianten erlauben.
Man kann nämlich diese Varianten durch Synthese, durch Halbsynthese und/oder nach bekannten gentechnischen Verfahren herstellen.
So wurden beispielsweise die Klonierung und die Expression der für HV2 codierenden Sequenz und die Herstellung des entsprechenden Hirudins aus Hefen in der europäischen Patentpublikation EP-A-200 655 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Varianten können nach äquivalenten Verfahren erhalten werden, nachdem man die für HV2 codierende Sequenz beispielsweise durch gerichtete Mutagenese modifiziert hat.
Durch gerichtete Mutagenese in vitro wurden insbesondere Varianten HV2 hergestellt, in denen das Asparagin 47 durch ein Lysin ersetzt ist und in denen entweder das Lysin 35 durch ein Threonin ersetzt ist oder das Asparagin 33 durch ein Arginin, das Lysin 35 durch ein Aspartat und das Glycin 36 durch ein Serin ersetzt ist oder das Tyrosin 63 durch ein Aspartat ersetzt ist oder auch die Sequenz Ile¹-Thr² durch Val¹-Val² ersetzt ist.
Insbesondere ist es möglich, funktionelle Expressionsblöcke in der Hefe zu verwenden, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP-A-200 655 beschrieben sind und in denen die Hirudin-Sequenz für die obengenannten Varianten codiert; wobei diese funktionellen DNA-Blöcke von einem Plasmid-Vektor getragen werden können.
Um die Expression und die Sekretion durch die Hefe der den verschiedenen Varianten entsprechenden Gene zu steuern, werden diese in einen Hefe-Vektor integriert, der vorzugsweise die folgenden Elemente umfaßt, die bereits in der europäischen Patentanmeldung EP-A-200 655 beschrieben sind:
- den Replikationsursprung des Hefe-Plasmids 2 u,
- das Gen ura3,
- einen Replikationsursprung in E. coli und einen Marker für die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum,
- einen Transkriptions-Promotor, die "Leader"-Sequenz und die Sequenz pre-pro des Vorläufers des α-Faktors, die in Phase fusioniert sind, stromaufwärts von der codierenden Sequenz der Hirudin-Variante,
- den Transkriptions-Terminator des Gens PGK der Hefe, der stromabwärts von dem Gen der genannten Variante angeordnet ist.
Die Erfindung betrifft außerdem die Hefen, die durch diese Vektoren oder durch diesen funktionellen DNA-Block transformiert worden sind, und ihre Verwendung zur Herstellung der Hirudin-Varianten.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Hirudin-Variante durch Fermentation einer erfindungsgemäßen Hefe und Gewinnung des gebildeten Hirudins aus dem Kulturmedium in ausgereifter Form oder in Form eines Vorläufers, der in vitro ausreifen kann.
Die angewendeten Verfahren sind bereits in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-200 655 und EP-87 401 649.6 im Detail beschrieben.
Die so erhaltenen Hirudin-Varianten können sowohl in vivo als auch in vitro als Thrombin-Inhibitor verwendet werden, wie in der europäischen Patentanmeldung EP-A-200 655 beschrieben.
Insbesondere können diese Varianten in pharmazeutischen Zusammensetzungen allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen oder auch im Rahmen von Tests oder diagnostischen Verfahren in vitro oder in vivo verwendet werden. Im letztgenannten Fall kann es vorteilhaft sein, die Varianten beispielsweise durch eine radioaktive, fluoreszierende, enzymatische oder eine andere Markierung zu markieren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert unter Zuhilfenahme der Fig. 1, welche die Sequenzen der drei natürlichen Hirudin-Varianten zeigt, und unter Zuhilfenahme der Fig. 2, die den Prozentsatz der Inhibierung der proteolytischen Aktivität des Thrombins gegenüber dem Chromozym als Funktion der Volumina der überstehenden Flüssigkeiten der Hefekulturen, welche die Hirudin- Varianten HV2 (Lys&sup4;&sup7;), als HV2L bezeichnet, angibt.

Beispiel 1

Herstellung von mutierten Genen, die für Varianten des Hirudins HV2 (Lys&sup4;&sup7;) codieren, durch gerichtete Mutagenese in vitro

Um eine gerichtete in vitro-Mutagenese durchzuführen, wird das DNA-Fragment, das man modifizieren will, in der replikativen Form eines Einfachstrang-Phagen M13 kloniert; das Genom des rekombinanten Phagen wird isoliert und mit einem synthetischen Oligonucleotid hybridisiert, das die mutierte Sequenz trägt. Dieses Oligonucleotid dient zur Einleitung der Synthese des komplementären Stranges und die auf diese Weise doppelsträngig gemachte DNA wird zur Transformation eines Empfängerbakteriums verwendet, das den Phagen bildet, der die gesuchte Mutation trägt (Zoller und Smith, 1983).
Die codierende Sequenz des Hirudins HV2 wurde manipuliert, um daraus eine funktionelle "Expressionskassette in der Hefe herzustellen und um die Sekretion des synthetisierten Proteins zu gewährleisten. Zu diesem Zweck wurde ein DNA-Segment, das für die pre-pro-Sequenz des α-Pheromons von Hefe codiert, stromaufwärts von dem Gen plaziert. Diese Konstruktion nennt sich pTG1833.
Die Expressions-Kassette von Hirudin wurde in Form des Fragments PstI-BglII zurückgewonnen, um in ein Derivat des Phagen M13, das M13TG131 (Kieny et al., 1983), eingeführt zu werden, um dort die End-Mutagenesen durchzuführen.
Eine Mutagenese wurde in der pre-pro-Sequenz durchgeführt, um eine Stelle HindIII zu erzeugen, welche die Fusion der codierenden Sequenzen des Hirudins und den leichten Austausch derselben gegen die verschiedenen mutierten Sequenzen erlaubt unter Beibehaltung der Lesephase und unter Gewährleistung der richtigen Ausreifung des synthetisierten Proteins.
Die mutierte Sequenz ist die folgende: modifizierte pre-pro-Sequenz Hirudin
Eine Mutation wurde in die codierende Sequenz von HV2 eingeführt, um das Asn&sup4;&sup7; durch ein Lys&sup4;&sup7; zu ersetzen. Diese Mutagenese wurde mit dem folgenden Oligonucleotid durchgeführt:
5' CTTTCAGG CGGTGTAC 3'
Das Derivat des Phagen M13, das die Expressions-Kassette mit diesen beiden Mutationen trägt, als M13TG1945 bezeichnet, dient als Vorlage für alle folgenden Mutagenesen.
Zur Einführung von neuen Mutationen in die codierende Sequenz von HV2 wurden die folgenden Oligonucleotide verwendet:
TG1152 : 5' CTAATGGAACTGGCAACCA 3'
TG1153 : 5' TGGGTTCTAGAGGAGACAGCAACCAATG 3'
TG1154 : 5' CAGAAGAAGATTTACAATG 3'
TG1155 : 5' GATAAAAGAGTTGTTTATACAGACT 3'
TG1156 : 5' TATTTACAACCATAAATGAAAGAA 3'
Die mutierten Sequenzen entsprechen jeweils den folgenden Varianten:
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Thr³&sup5;)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asp&sup6;³)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Val¹, Val²)
HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;)
Die Mutagenese wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
120 Picomol jedes Oligonucleotids wurden in 100 ul Reaktionsmedium phosphoryliert und etwa 20 Picomol phosphoryliertes Oligonucleotid wurden mit 1 Picomol Einfachstrang-DNA des Phagen M13TG1919 in 25 Mikroliter Hybridisierungspuffer hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurde das DNA-Gemisch der Wirkung der Klenow-Polymerase und der Ligase des Phagen T4 unterworfen. Jede so behandelte Mischung diente zur Überimpfung des Stammes E. coli 71/18 (mut L) auf einen Anzeige-Bakterien-Rasen JM103 (Messing et al. 1981). Die infizierten Zellen sind nachweisbar, weil sie Bereiche mit langsamerem Wachstum bilden; die Kolonien wurden auf ein Komplett-Milieu überimpft, dann auf Whatman-Papier 540 übertragen, um die Zellen auszusortieren, die mutierte Phagen aufweisen.
Die Identifizierung der Phagen, welche die mutierte Sequenz tragen, wird durchgeführt durch in situ-Hybridisierung mit dem Oligonucleotid, das für die Mutagenese verwendet worden war. Es wurden die folgenden Phagen, welche die mutierten Sequenzen trugen, erhalten:
M13TG1946 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Thr³&sup5;)
M13TG1947 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)
M13TG1948 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asp&sup6;³)
M13TG1949 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Val¹, Val²)
M13TG1950 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;)

Beispiel 2

Übertragung der mutierten Gene auf einen Expressions- Sekretions-Vektor und Transformation der Wirts-Hefen

Der Expressions-Sekretions-Vektor pTG2835 umfaßt die folgenden Elemente:
1. Den Replikationsursprung und das Resistenzgen gegenüber Ampicillin des Plasmids pBR322, welche die Multiplikation des Plasmids und seine Selektion in E. coli erlauben.
2. Den Replicationsursprung des Hefe-Plasmids 2u und das Hefe-Gen ura3 als Selektionsmarker in einem Hefestamm ura3&supmin;.
3. Einen anderen Selektions-Marker, das Hefe-Gen leu2, das zur Vervollständigung eines defekten Gens leu2 des Wirtsstammes verwendet werden kann.
4. Den Transkriptionspromotor des Gens des α-Pheromons von Hefe und den Transkriptionsteminator des Hefe-Gens PGK.
5. Die pre-pro-Sequenz des Gens des α-Pheromons der Hefe, die manipuliert worden ist, um eine Stelle HindIII zu schaffen, welche die Fusion des Gens des Hirudins in Phase erlaubt und die richtige Ausreifung des synthetisierten Proteins zu gewährleisten.
Die codierenden Sequenzen des Hirudins, welche die selektionierten Mutationen tragen und von den Phagen M13TG1946, 1947, 1948, 1949 und 1950 getragen werden, wurden in Form der Fragmente HindIII gewonnen und in den Vektor PTG2835 wieder eingeführt, um die folgenden Plasmide zu ergeben:
pTG2982 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Thr³&sup5;)
pTG2983 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Asp&sup6;³)
pTG2988 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)
pTG2989 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Val¹, Val²)
pTG2990 T HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;)
Ein Stamm der Hefe S. cerevisiae TGY1sp4 (matα ura3.251.373.38 his03.11.15) wurde durch diese verschiedenen Plasmide transformiert.
Die Antithrombin-Aktivität der verschiedenen, durch diese Stämme gebildeten Hirudin-Varianten wurde verglichen (vgl. Fig. 2).
20 ml Kultur (YNBG + 0,5 % Casaminosäuren) mit DO&sub6;&sub6;&sub0; 0,02 wurden mit jedem Stamm geimpft. Nach 48-stündigem Rühren bei 30ºC wurden die Kulturen zentrifugiert (5 min bei 5000 UpM) und die überstehenden Flüssigkeiten wurden analysiert. Eine Kultur von TGY1sp4 pTG881 (ein Plasmid, das keine für HV2 codierende Sequenz trägt) wird als Kontrolle verwendet. Die Aktivität der rohen überstehenden Flüssigkeiten wird bestimmt anhand ihres Inhibitoreffekts auf die Aktivität des Thrombins (die proteolytische Aktivität auf ein synthetisches Substrat, das Chromozym TH - Boehringer Mannheim). Der Prozentsatz der Inhibierung als Funktion der Volumenteile der überstehenden Flüssigkeit ist in der Fig. 2 angegeben.
Diese Untersuchung zeigt eindeutig, daß die Modifikationen der Hirudin-Sequenz keinen Verlust an Antithrombin- Aktivität und auch keinen Verlust an Produktivität in der Hefe mit sich bringen.
Die Verwendung dieser neuen Moleküle in vivo als Antithrombosemittel kann daher in Betracht gezogen werden.

Literaturstellen

J.Y. Chang "FEBS Letters" 164, 307-313 (1983).
J. Dodt, H.P. Mueller, U. Seemüller und J.Y. Chang "FEBS Letters" 165, 180-184 (1984).
J. Dodt, U. Seemüller, R. Mascheler und H. Fritz "Biol. Chem. Hoppe-Seyler" 366, 379-385 (1985).
J. Dodt, W. Machleidt, U. Seemüller, R. Maschler und H. Fritz "Biol. Chem. Hoppe.Seyler" 367, 803-811 (1986).
R.P. Harvey, E. Degryse, L. Stefani, F. Schamber, J.P. Cazenave, M. Courtney, P. Tolstoshev und J.P. Lecocq, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 83, 1084-1088 (1986).
M.P. Kieny, R. Lathe und J.P. Lecocq, "Gene" 26, 91-99 (1983):
F. Markwardt "Methods Enzymol." 19, 924-932 (1970).
J. Messing, R. Crea, P.H. Seeburg, "Nucl. Acids Res." 9, 309 (1981).
T.E. Petersen, H.R. Roberts, L. Sottrup-Jensen und S. Magnusson, "Protides, Biol., Fluids, Proc Colloq." 23, 145-149 (1976).
Z.M. Ruggeri, R.A.Houghten, S.R. Russell und T.S. Zimmerman, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 83, 5708-5712 (1986)
S.R. Stone und J. Hofsteenge, "Biochem." 25, 4622-4628 (1986).
M.J. Zoller und M.N. Smith "Methods in Enzymol." 100, 469 (1983).

Claims

1. Hirudin-Varianten, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Struktur dieser Varianten, bezogen auf die HV-Basen-Varianten, eine der folgenden Modifikationen aufweist:

- in mindestens einer Stelle Asn-X-Y von HV, worin X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y ausgewählt wird aus Ser oder Thr;

- eine Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser ersetzt eine Aminosäuresequenz;

- mindestens eine ergänzende Aminosäure ist an das C- terminale Ende gebunden;

wobei die HV-Basen-Varianten ausgewählt werden aus:

HV1, HV2, HV3, HV2 (Va¹, Val²), HV1 (AA&sup6;³), HV2 (AA&sup6;³), HV3 (AA&sup6;&sup4;), HV2 (Val¹, Val², AA&sup6;³), HV2 (Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³)

und AA ausgewählt wird aus Glu und Asp.

2. Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HV ausgewählt wird aus:

HV2 (Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³), HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;)und HV2 (Val¹, Val², Lys&sup4;&sup7;, AA&sup6;³).

3. Variante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt aus aus: HV (Thr³&sup5;) und HV (Ser³&sup5;).

4. Variante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt wird aus:

HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Thr³&sup5;) und HV2 (Ser³&sup5;, Lys&sup4;&sup7;), HV2 (Val¹, Val², Tnr³&sup5;, Lys&sup4;&sup7;) und HV2 (Val¹, Val², Ser³&sup5;, Lys&sup4;&sup7;).

5. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Partialstruktur (Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;) aufweist.

6. Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei handelt um HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Arg³³, Asp³&sup5;, Ser³&sup6;)

7. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine ergänzende Aminosäure an dem C-terminalen Ende aufweist.

8. Variante nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der ergänzenden C-terminalen Aminosäure um Pro handelt.

9. Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Verbindung HV2 (Lys&sup4;&sup7;, Pro&sup6;&sup6;) handelt.

10. Variante nach Anspruch 1, die ausgewählt wird aus:

HV2 (AA&sup6;³, Lys&sup4;&sup7;) und HV2 (Val¹, Val², AA&sup6;³, Lys&sup4;&sup7;) worin AA für Glu oder Asp steht.

11. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie sulfatiert ist.

12. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidkette glycosyliert ist.

13. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Thrombin-Inhibitor.

14. Zusammensetzung, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) mindestens eine Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält, als Antikoagulans.

15. Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12 als Arzneimittel.

16. Verfahren zur Herstellung einer Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es Synthese-, Hemisynthese- und/oder genetische Manipulations-Stufen umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Fermentation einer Hefe, die vorher transformiert worden ist, entweder durch ein Plasmid, das aufweist:

- den Replikationsursprung des Hefe-Plasmids 2 u,

- das Gen ura3,

- einen Replikationsursprung in E. coli und einen Marker für die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum,

- einen Transkriptions-Promotor, die "Leader"-Sequenz und die Sequenz pre-pro des Vorläufers des α-Faktors, die in Phase fusioniert sind, stromaufwärts von der codierenden Sequenz der Hirudin-Variante,

- den Transkriptions-Terminator des Gens PGK der Hefe, der stromabwärts von dem Gen der genannten Variante angeordnet ist,

oder durch einen funktionellen DNA-Block, der für die genannte Hirudinvariante codiert.